EP1292698A2 - Verfahren zur detektion von fungiziden - Google Patents

Verfahren zur detektion von fungiziden

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Publication number
EP1292698A2
EP1292698A2 EP01943436A EP01943436A EP1292698A2 EP 1292698 A2 EP1292698 A2 EP 1292698A2 EP 01943436 A EP01943436 A EP 01943436A EP 01943436 A EP01943436 A EP 01943436A EP 1292698 A2 EP1292698 A2 EP 1292698A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fungicides
detection
plate
suspension
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01943436A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rolf Eymann
Heinz-Emil Hauck
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1292698A2 publication Critical patent/EP1292698A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the invention relates to a bioautographic method for the detection of fungicides, wherein the growth of fungi directly on a thin-layer chromatography plate (DC plate) by fluorescence quenching or
  • Fungicides are often detected by means of thin layer chromatography. After separation, the fungicides can be detected on the basis of their chemical properties, such as staining behavior, running behavior etc. or by contacting them with fungi. The latter option is generally preferred because it allows fungicides to be recognized in complex systems because of their effects.
  • agar overlay method in which an agar plate which has been inoculated with fungi is placed on a developed chromatography plate.
  • the fungicides on the chromatography plate diffuse into the agar and prevent the growth and sporylation of the fungi there.
  • the disadvantage of the known methods is the large amount of time required. In these methods, detection takes place via the formation of colored spores (e.g. Aspergilius niger forms black spores) or in special cases via the formation of colored metabolites (Rhodoturula rubra develops a reddish color after the growth phase). In both cases, however, a mostly multi-day incubation is necessary to achieve a color effect.
  • colored spores e.g. Aspergilius niger forms black spores
  • redoturula rubra develops a reddish color after the growth phase
  • the object of the present invention was therefore to develop a method for the detection of fungicides which enables rapid and sensitive bioautographic detection.
  • the present invention therefore relates to a method for the bioautographic detection of fungicides, characterized by the following method steps: a) providing a dried developed DC plate; b) placing the mushroom suspension on the TLC plate; c) incubation of the TLC plate; d) Detection of zones of inhibition by means of fluorescence quenching and / or staining with an optical brightener.
  • the mushroom suspension in step b) contains a linear heteropolysaccharide composed of partially O-acetylated glucuronic acid, glucose and rhamnose units.
  • the TLC plate is incubated in step c) for 15 to 20 hours.
  • the mushroom suspension is pre-incubated on the TLC plate in step c) before the application.
  • the fluorescence quenching in step d) is detected at 254 nm.
  • the fluorescence of an optical brightener is detected in step d) at a wavelength between 360 and 390 nm.
  • the present invention also relates to a test kit for
  • the at least one Nutrient medium, a linear heteropolysaccharide as a gelling agent and a storage-stable test strain for the preparation of the mushroom suspension contains.
  • the test kit additionally contains at least one TLC plate with a fluorescence indicator.
  • test kit additionally contains an optical brightener.
  • the method according to the invention is suitable for the general detection of fungicides, regardless of their mode of action. By selecting the type of fungus, the growth of which is detected, the detection can be oriented towards certain fungicides. To find new fungicides against a specific fungal disease, the detection method according to the invention is therefore generally carried out with the corresponding pathogen or similar fungi.
  • fungicides in e.g. Food or feed are preferred mushrooms of risk group 1, i.e. fungi harmless to health, e.g. Aspergilius niger or preferably Rhodotorula rubra, Saccharomyces boulardii or Saccharomyces cerevisiae.
  • the sample to be examined for its fungicide content is separated by thin layer chromatography.
  • a thin-layer chromatographic separation on a TLC plate that is to say the development of the TLC plate, is carried out under known conditions.
  • a developed DC plate is therefore, according to the invention, a DC plate on which at least one sample has been applied and separated by thin layer chromatography.
  • DC plates with a sorbent layer based on SiO 2 are mostly used for this.
  • other plates for example, plates coated with cellulose, polyamide or aluminum oxide.
  • silica gel-coated plates which have a diol modification or are waterproof.
  • Such plates have the advantage that they can be wetted with the aqueous mushroom suspension without there being any risk of damage or cracking of the silica gel layer.
  • a fluorescence indicator for example HPTLC-FP KG 60, WRF 254s from Merck, Darmstadt.
  • Suitable flow agents for example acetonitrile or mixtures of acetonitrile and dichloromethane and a non-polar component such as n-hexane, are known to the person skilled in the art. The person skilled in the art is also able to adapt the flow agents to the particular separation problem.
  • the TLC plate is carefully dried to remove residues of the eluent.
  • the developed DC plate is then incubated with a mushroom suspension. This can e.g. by briefly immersing the DC plate in the mushroom suspension or by spraying the mushroom suspension. In any case, care should be taken to ensure that the mushroom suspension is applied evenly.
  • the mushroom suspension can only be a certain time before
  • a nutrient medium with a form of a test strain.
  • a form of a test strain This can be a living culture of the microorganism or a storable form of the test strain, ie for example a spore preparation or preferably a lyophilisate or granulate.
  • This mixture is preferably pre-incubated for a certain period of time, usually between 2 and 5 hours. All can be used as nutrient medium for the purpose of Fungus culture known culture media are used. The use of Sabouraud broth is preferred.
  • a gelling agent is also added to the nutrient medium or the mushroom suspension.
  • These are preferably gelling linear heteropolysaccharides, which are typically of bacterial origin. Linear heteropolysaccharides comprising of O-acetylated glucuronic acid, glucose and rhamnose as Gelrite ® from Roth, Germany are particularly preferred. Such materials form stable gels in the presence of soluble salts. It has been found that this particular type of
  • a gelling agent made of linear heteropolysaccharides from partially O-acetylated glucuronic acid-glucose and rhamnose units can be processed in contrast to agar at room temperature.
  • this gelling agent can be boiled up for sterilization and sterile filtered, so that expensive autoclaving is avoided. This is not possible when using agar as a gelling agent.
  • the gelling agent composed of linear heteropolysaccharides composed of partially O-acetylated glucuronic acid-glucose and rhamnose units are added to 200 ml of nutrient medium.
  • the Do not apply the Piiz suspension according to the application as it is too stiff or does not become sufficiently firm.
  • Fungus suspensions for the method according to the invention typically contain the test strain fungus in a number of microorganisms between 10 5 and 10 8 / ml.
  • the TLC plate After compilation and typically pre-incubation of the mixture of nutrient medium, gelling agent and test strain (e.g. in the form of a spore suspension), called mushroom suspension according to the invention, the TLC plate is wetted with it.
  • the DC plate is typically incubated at 23-30 ° C. in a moist environment.
  • the duration of the incubation is typically 13 to 30 hours, preferably 15 to 24 hours. In most cases it is
  • the zones of inhibition can be detected by means of fluorescence quenching or by staining with an optical brightener on the dried TLC plate. The latter method is somewhat more sensitive.
  • DC plates with a fluorescence indicator are used for detection by means of fluorescence quenching.
  • the DC plates are irradiated at the appropriate wavelength to excite the fluorescence.
  • magnesium tungstate in the product name in general indicated by the addition F254s, is irradiated with light of the wavelength 254 nm. It was found that with this procedure the zones of inhibition are visible as glowing spots on the dark background. With this simple principle, the detection can still be carried out during the growth phase of the fungi, ie before the formation of spores or the formation of an intrinsic color. While the resulting mushroom lawn leads to complete or partial quenching of the fluorescence, the autofluorescence of the TLC plate remains clearly visible in the zones of inhibition.
  • this method is also suitable for examining the plate several times during the incubation after different incubation times and for monitoring the formation of the inhibition zones.
  • the method of detection by fluorescence quenching can only be used to a limited extent.
  • the DC plate When using optical brighteners, the DC plate is sprayed with the staining solution, which contains an optical brightener, after incubation.
  • This staining solution typically contains 0.01 to 0.1%
  • optical brightener in a basic aqueous solution, for example 0.1 M NaOH solution or 15% potassium hydroxide solution.
  • optical brighteners such as stilbene derivatives, for example disodium 4,4'-bis ⁇ (4-anilino-6-morpholino-1, 3,5-triazin-2-yl) amino ⁇ stilbene-2, are preferred as optical brighteners , 2'-disulfonate (C 40 H 38 N ⁇ 2 O 8 S 2.
  • Blankophor ® Blankophor ® (Bayer AG), Calcofluor ® White M2R (Sigma), Tinopal ® (Sigma) or Leucophor ® (Clariant, Canada) are used.
  • the optical brightener Blankophor.RTM ® BA is particularly preferably 267% of Bayer AG, Germany, are used. After a development time of 5 minutes at room temperature, the TLC plate is irradiated.
  • the excitation wavelength depends on the optical brightener used. Wavelengths between 360 and 390 nm are often suitable. An excitation wavelength of 366 nm is well suited for Blankophor ® BA 267%.
  • optical brighteners show active fluorescence when irradiated in the presence of fungi, while there is little or no fluorescence when the optical brighteners interact with the fungicides or the DC plate in the area of the zones of inhibition.
  • the zones of inhibition therefore appear when irradiated as dark spots on a luminous background.
  • the incubated DC plate is first examined by means of fluorescence quenching and then treated with an optical brightener at a suitable time to further improve the detection sensitivity and examined for its fluorescence.
  • the detection method according to the invention enables the detection of fungicides to be carried out quickly, sensitively and with little effort.
  • linear heteropolysaccharide which is preferred according to the invention and consists of partially O-acetylated glucuronic acid-glucose and rhamnose units as gelling agents makes handling easier, since a filtering step can be carried out instead of autoclaving.
  • the fluidity of the mushroom suspension can easily be varied or adjusted. In this way, the interaction of the mushroom suspension with the TLC plate can be optimized.
  • the detection can be carried out at an earlier point in time by means of the method according to the invention, since already in the growth phase of the fungi by means of fluorescence quenching or by using optical brighteners the inhibitory areas can be represented with good contrast.
  • the formation of the inhibitory zones can already be tracked during the incubation and the incubation can be ended at a suitable time.
  • an additional optical brightener can be used for staining to increase detection sensitivity. Both staining methods enable the direct detection of fungal growth on TLC plates for the first time. As with other methods, there is no need to wait until the spores formed can be detected.
  • fungicide content of the sample can then be calculated from the size of the inhibition zones.
  • test kit is further provided according to the invention which can be used very easily in appropriately equipped laboratories.
  • the test kit preferably contains nutrient medium with the gelling agent preferred according to the invention, preferably in solid form for dissolving in water, a suitable test strain, usually either as lyophilisate, granules or spore preparation and preferably an optical brightener, typically in solid form or as a coloring reagent, and optional further constituents such as suitable DC plates, reference solutions, etc., which are required to carry out the method according to the invention.
  • a suitable test strain usually either as lyophilisate, granules or spore preparation and preferably an optical brightener, typically in solid form or as a coloring reagent, and optional further constituents such as suitable DC plates, reference solutions, etc., which are required to carry out the method according to the invention.
  • the test kit preferably contains a description in which the steps of the method according to the invention are explained.
  • TLC material HPTLC-FP KG 60, Diol F254s, Merck KGaA fungicides: - TBT 50 nl application (F1)
  • Test organism Rhodotorula rubra Chromatography: separation zone 50 mm, solvent acetonitrile, running time 6 min
  • test organism 200 ml of fully demineralized water, 10 g Sabouraud-2% glucose broth and 0.11 g Geirrte ® are boiled sterile. Then the test organism is called Lyophilisate or live culture added and preincubated at 35 ° C for 3 hours.
  • the developed DC plate is briefly immersed in the mushroom suspension and excess suspension is removed from the bottom of the plate.
  • the TLC plate is then incubated in a can, which is lined with moist paper, for 20 hours at room temperature.
  • the evaluation is carried out by quenching fluorescence at 254 nm.
  • the Hemmhof on the start line is a TBT degradation product in water.
  • TLC material HPTLC-FP KG 60, WRF254s, Merck KGaA
  • Fungicides - Fenpropimorph (A1)
  • Test organism Rhodotorula rubra Chromatography: separation zone 50 mm, solvent acetonitrile /
  • the developed DC plate is briefly immersed in the mushroom suspension and excess suspension is removed from the bottom of the plate.
  • the DC plate is then incubated in a can, which is lined with moist paper, for 20 hours at room temperature.
  • the evaluation is carried out by staining with an optical brightener (0.04%
  • the TLC plate is dried, wetted with the staining solution and then stored for 5 minutes at room temperature.
  • Evaluation takes place at 366 nm.
  • the zones of inhibition can be recognized as dark spots against a fluorescent background.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum bioautographischen Nachweis von Fungiziden, wobei eine entwickelte Dünnschichtchromatographie-Platte mit einer Pilzsuspension inkubiert wird und auftretende Hemmhöfe während des Pilzwachstums durch Fluoreszenzauslöschung oder mittels optischen Aufhellern nachgewiesen werden.

Description

Verfahren zur Detektion von Fungiziden
Die Erfindung betrifft ein bioautographisches Verfahren zur Detektion von Fungiziden, wobei das Wachstum von Pilzen direkt auf einer Dünnschicht- Chromatographieplatte (DC-Platte) durch Fluoreszenzauslöschung oder
Anfärbung mit optischen Aufhellern detektiert wird.
Das Auffinden neuer Fungizide ist sowohl im Bereich des Pflanzenschutzes wie auch zur Behandlung von Pilzerkrankungen beim Menschen von großer Bedeutung. Dazu werden empfindliche, schnelle und einfache Nachweismethoden benötigt. Neben der Suche nach neuen Fungiziden muß ebenso mittels effektiver Nachweismöglichkeiten sichergestellt werden, daß z.B. Nahrungsmittel, Futtermittel oder Trink- und Abwasser frei von Fungizid-Rückständen sind.
Die Detektion von Fungiziden erfolgt häufig mittels Dünnschichtchromatographie. Nach der Auftrennung können die Fungizide aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften, wie Anfärbeverhalten, Laufverhalten etc., nachgewiesen werden oder durch das Inkontaktbringen mit Pilzen. Die letztere Möglichkeit wird in der Regel bevorzugt, da sie es erlaubt, Fungizide auch in komplexen Systemen aufgrund ihrer Wirkung zu erkennen.
L. Rahalison et al., Phytochem. Anal. 2, Seite 199-203, 1991 , beschreiben das sogenannte Agar-Overlay Verfahren, bei dem auf eine entwickelte Chromatographie-Platte eine Agar-Platte, die mit Pilzen angeimpft ist, aufgelegt wird. Die Fungizide auf der Chromatographie-Platte diffundieren in den Agar und verhindern dort das Wachstum und das Sporylieren der Pilze.
In L. Rahalison et al. Int. J. Pharmacog., 31 , Seite 68-76, 1993, wird ein bioautographisches Verfahren beschrieben, bei dem eine Pilzsuspension auf die Dünnschichtplatte aufgegeben wird. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen wird das Pilzwachstum anhand der Sporenbildung nachgewiesen. An den Stellen, an denen sich Fungizide befinden, tritt keine Färbung auf, da in diesen Hemmhöfen keine Pilze wachsen.
Nachteil der bekannten Verfahren ist der große Zeitbedarf. Die Detektion erfolgt bei diesen Verfahren über die Bildung von farbigen Sporen (z.B. Aspergilius niger bildet schwarze Sporen) oder in speziellen Fällen über die Bildung von farbigen Stoffwechselprodukten (Rhodoturula rubra bildet nach der Wachstumsphase eine rötliche Färbung aus). In beiden Fällen ist jedoch zunächst eine zumeist mehrtägige Inkubation notwendig, um eine Farbwirkung zu erzielen.
Durch die lange Inkubationsdauer kommt es zudem häufig zu unerwünschten Nebeneffekten:
- Der bislang verwendete Agar wird von vielen Pilzstämmen angegriffen und verflüssigt sich mit der Zeit. Dadurch kommt u.a. zu Diffusionseffekten, bei denen sich die durch DC-Chromatographie erzeugten Fungizid-Spots verbreitern. - Bei längeren Inkubationszeiten kann es zu einem Überwachsen von Fungizid-Spots kommen, so dass insbesondere geringe Mengen an Fungizid oder durch Diffusion verbreiterte und verdünnte Spots nicht mehr detektiert werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Detektion von Fungiziden zu entwickeln, das einen schnellen und empfindlichen bioautographischen Nachweis ermöglicht.
Es wurde gefunden, daß eine entwickelte DC-Platte mit einer Pilzsuspension inkubiert werden kann und das Wachstums der Pilze schon nach ca. 20 Stunden mittels Fluoreszenzauslöschung oder Anfärbung mit optischen Aufhellern beobachtet und so das Vorhandensein von Fungiziden nachgewiesen werden kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum bioautographischen Nachweis von Fungiziden, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer getrockneten entwickelten DC-Platte; b) Aufgeben der Pilzsuspension auf die DC-Platte; c) Inkubation der DC-Platte; d) Nachweis von Hemmhöfen mittels Fluoreszenzauslöschung und/oder Anfärbung mit einem optischen Aufheller.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Pilzsuspension in Schritt b) ein lineares Heteropolysaccharid aus teilweise O-acetylierten Glucuronsäure-, Glucose- und Rhamnoseeinheiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DC-Platte in Schritt c) 15 bis 20 Stunden inkubiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt c) die Pilzsuspension vor der Aufgabe auf die DC-Platte vorinkubiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Fluoreszenzauslöschung in Schritt d) bei 254 nm nachgewiesen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Fluoreszenz eines optischen Aufhellers in Schritt d) bei einer Wellenlänge zwischen 360 und 390 nm nachgewiesen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Testkit zur
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der mindestens ein Nährmedium, ein lineares Heteropolysaccharid als Geliermittel und einen lagerstabilen Teststamm zur Herstellung der Pilzsuspension enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Testkit zusätzlich mindestens eine DC-Platte mit Fluoreszenzindikator.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Testkit zusätzlich einen optischen Aufheller.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zum allgemeinen Nachweis von Fungiziden, unabhängig von ihrer Wirkungsweise, geeignet. Durch die Wahl der Pilzart, deren Wachstum detektiert wird, kann eine Ausrichtung des Nachweises auf bestimmte Fungizide vorgenommen werden. Zur Auffindung von neuen Fungiziden gegen eine bestimmte Pilzerkrankung wird das erfindungsgemäße Detektionsverfahren demnach in der Regel mit dem entsprechenden Krankheitserreger oder ähnlichen Pilzen durchgeführt. Zur allgemeinen Detektion von Fungiziden in z.B. Nahrungsmitteln oder Futtermitteln werden bevorzugt Pilze der Risikogruppe 1 , d.h. gesundheitlich unbedenkliche Pilze, wie z.B. Aspergilius niger oder bevorzugt Rhodotorula rubra, Saccharomyces boulardii oder Saccharomyces cerevisiae eingesetzt.
Zunächst wird die Probe, die auf ihren Gehalt an Fungiziden untersucht werden soll, dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Die Durchführung einer dünnschichtchromatographischen Trennung auf einer DC-Platte, das heißt die Entwicklung der DC-Platte, erfolgt unter bekannten Bedingungen. Eine entwickelte DC-Platte ist demnach erfindungsgemäß eine DC-Platte, auf der mindestens eine Probe aufgetragen und dünnschichtchromatographisch aufgetrennt wurde.
Zumeist werden hierfür DC-Platten mit einer Sorbensschicht auf Basis von SiO2 verwendet. In seltenen Fällen können auch andere Platten, beispielsweise mit Cellulose, Polyamid oder Aluminiumoxid beschichtete Platten, eingesetzt werden. Bevorzugt ist die Verwendung von Kieselgel- beschichteten Platten, die eine Diol-Modifikation aufweisen oder wasserfest sind. Derartige Platten haben den Vorteil, daß sie mit der wässrigen Pilzsuspension benetzt werden können, ohne daß die Gefahr einer Beschädigung oder eines Aufspringens der Kieselgel-Schicht besteht. Zur erfindungsgemäßen Detektion durch Fluoreszenzauslöschung ist es zudem notwendig, DC-Platten mit Fluoreszenz-Indikator, beispielsweise HPTLC- FP KG 60, WRF 254s der Firma Merck, Darmstadt, einzusetzen.
Geeignete Fließmittel, beispielsweise Acetonitril oder Gemische aus Acetonitril und Dichlormethan und einer unpolaren Komponente wie n- Hexan, sind dem Fachmann bekannt. Der Fachmann ist weiterhin in der Lage, die Fließmittel dem jeweiligen Trennproblem anzupassen.
Nach der Entwicklung wird die DC-Platte sorgfältig getrocknet, um Rückstände des Fließmittels zu entfernen.
Anschließend wird die entwickelte DC-Platte mit einer Pilzsuspension inkubiert. Dies kann z.B. durch kurzes Eintauchen der DC-Platte in die Pilzsuspension erfolgen oder durch Aufsprühen der Pilzsuspension. In jedem Fall sollte darauf geachtet werden, daß ein gleichmäßiger Auftrag der Pilzsuspension erfolgt.
Natürlich kann die Pilzsuspension erst eine definierte Zeit vor dem
Auftragen auf die DC-Platte zusammengestellt werden. Dies geschieht typischerweise durch Mischen eines Nährmediums mit einer Form eines Teststamms. Dies kann eine Lebendkultur des Mikroorganismus oder eine lagerfähige Form des Teststammes, d.h. z.B. ein Sporenpräparat oder bevorzugt ein Lyophillisat oder Granulat sein. Diese Mischung wird bevorzugt für einen bestimmten Zeitraum, zumeist zwischen 2 und 5 Stunden vorinkubiert. Als Nährmedium können alle für den Zweck der Pilzkultur bekannten Nährmedien eingesetzt werden. Bevorzugt ist die Verwendung von Sabouraud Bouillon.
Dem Nährmedium bzw. der Pilzsuspension wird zusätzlich ein Geliermittel zugesetzt. Bevorzugt sind dies gelierende lineare Heteropolysaccharide, die typischerweise bakteriellen Ursprungs sind. Besonders bevorzugt sind lineare Heteropolysaccharide aus teilweise O-acetylierten Glucuronsäure- Glucose und Rhamnoseeinheiten, wie Gelrite® der Firma Roth, Deutschland. Derartige Materialien bilden in Anwesenheit von löslichen Salzen stabile Gele. Es wurde gefunden, daß diese besondere Art von
Geliermittel die Durchführung des Tests stark vereinfacht und zu sehr guten Ergebnissen führt.
Zum einen kann ein Geliermittel aus linearen Heteropolysacchariden aus teilweise O-acetylierten Glucuronsäure- Glucose und Rhamnoseeinheiten im Gegensatz zu Agar bei Raumtemperatur verarbeitet werden. Zum anderen wurde gefunden, dass dieses Geliermittel zur Sterilisierung aufgekocht und steril filtriert werden kann, so dass eine aufwendige Autoklavierung vermieden wird. Dies ist bei der Verwendung von Agar als Geliermittel nicht möglich. Von besonderer Bedeutung ist, dass mit dem erfindungsgemäß bevorzugten Geliermittel bessere Nachweisgrenzen bei der Detektion von Fungiziden erreicht werden können. Es ermöglicht eine sehr einfache und genaue Einstellung der Fließeigenschaften der Pilzsuspension. Diese kann dadurch auch in die Poren der DC-Platte eindringen. Auf diese Weise wird, der Kontakt zwischen Fungizid und Pilzen intensiviert. Dadurch führt auch eine geringe Menge an Fungizid zu einer Hemmung des Pilzwachstums.
Typischerweise werden zu 200 ml Nährmedium 0,08 bis 0,5 g, bevorzugt o,1 bis 0,15 g des Geliermittels aus linearen Heteropolysacchariden aus teilweise O-acetylierten Glucuronsäure- Glucose und Rhamnoseeinheiten zugegeben. Bei zu viel oder zu wenig Geliermittel läßt sich die Piizsuspension nicht mehr anwendungsgemäß auftragen, da sie zu steif ist, oder nicht ausreichend fest wird.
Pilzsuspensionen für das erfindungsgemäße Verfahren enthalten den Teststamm-Pilz typischerweise in einer Mikroorganismenzahl zwischen 105 und 108 /ml.
Nach Zusammenstellung und typischerweise Vorinkubation der Mischung aus Nährmedium, Geliermittel und Teststamm (z.B. in Form einer Sporensuspension), erfindungsgemäß Pilzsuspension genannt, wird die DC-Platte damit benetzt.
Man inkubiert die DC-Platte typischerweise bei 23-30°C in feuchter Umgebung. Die Dauer der Inkubation beträgt typischerweise 13 bis 30 Stunden, bevorzugt 15 bis 24 Stunden. In den meisten Fällen ist eine
Inkubation über Nacht, d.h. über 15 bis 20 Stunden ausreichend. In dieser Zeit bilden sich an den Stellen der DC-Platte, auf denen sich Fungizide befinden, sogenannte Hemmhöfe, da dort das Pilzwachstum reduziert oder vollständig unterdrückt wird. Die Dauer der Inkubation hängt von der Anzahl der aufgegebenen Pilze ab. Bei zu kurzer Inkubation ist die Ausbildung der Hemmhöfe durch zu geringes Wachstum der Pilze nicht vollständig. Bei zu langer Inkubation kann es zu einem Überwachsen der Hemmhöfe kommen.
Die Detektion der Hemmhöfe kann mittels Fluoreszenzauslöschung oder durch Anfärbung mit einem optischen Aufheller auf der getrockneten DC- Platte erfolgen. Letztere Methode ist etwas empfindlicher.
Zur Detektion mittels Fluoreszenzauslöschung werden DC-Platten mit Fluoreszenzindikator verwendet. Die DC-Platten werden bei entsprechender Wellenlänge zur Anregung der Fluoreszenz bestrahlt. Bei der Verwendung von DC-Platten mit dem üblichen Fluoreszenzindikator, Magnesium-Wolframat, bei der Produktbezeichnung im allgemeinen angezeigt durch den Zusatz F254s, wird mit Licht der Wellenlänge 254 nm bestrahlt. Es wurde gefunden, dass bei dieser Vorgehensweise die Hemmhöfe als leuchtende Flecken auf dem dunklen Untergrund sichtbar werden. Durch dieses einfache Prinzip kann die Detektion noch in der Wachstumsphase der Pilze, d.h. vor der Sporenbildung oder der Ausbildung einer Eigenfärbung vorgenommen werden. Während der entstehende Pilzrasen zu einer vollständigen oder teilweisen Fluoreszenzlöschung führt, bleibt bei den Hemmhöfen die Eigenfluoreszenz der DC-Platte gut sichtbar.
Da die Platte bei der Bestrahlung nicht verändert wird, eignet diese Methode sich auch, um die Platte während der Inkubation mehrfach nach verschiedenen Inkubationszeiten zu untersuchen und die Ausbildung der Hemmhöfe zu verfolgen. In seltenen Fällen, in denen das zu untersuchende Fungizid selbst zu einer Fluoreszenzlöschung führt, ist die Methode der Detektion durch Fluoreszenzlöschung nur bedingt anwendbar.
Bei der Verwendung von optischen Aufhellern wird die DC-Platte nach der Inkubation mit der Anfärbelösung, die einen optischen Aufheller enthält, besprüht. Diese Anfärbelösung enthält typischerweise 0,01 bis 0,1 %
(m/m), bevorzugt ca. 0,04 % eines optischen Aufhellers in einer basischen wässrigen Lösung, z.B. 0,1 M NaOH-Lösung oder 15%ige Kalilauge. Als optische Aufheller werden bevorzugt kommerziell erhältliche Aufheller wie Stilben-Derivate, z.B. Di-Natrium 4,4'-bis{(4-anilino-6-morpholino-1 ,3,5- triazin-2-yl)amino}stilbene-2,2'-disulfonat (C40H38Nι2O8S2.2Na) oder optische Aufheller, die unter den Namen Blankophor® (Bayer AG), Calcofluor® White M2R (Sigma), Tinopal® (Sigma) oder Leucophor® (Clariant, Kanada) erhältlich sind, verwendet. Besonders bevorzugt wird der optische Aufheller Blankophor® BA 267% der Bayer AG, Deutschland, eingesetzt. Nach einer Entwicklungszeit von 5 Minuten bei Raumtemperatur wird die DC-Platte bestrahlt. Die Anregungswellenlänge ist abhängig von dem verwendeten optischen Aufheller. Häufig sind Wellenlängen zwischen 360 und 390 nm geeignet. Für Blankophor® BA 267% ist eine Anregungswellenlänge von 366 nm gut geeignet. Es wurde gefunden, dass die optischen Aufheller bei Bestrahlung in Anwesenheit von Pilzen aktive Fluoreszenz zeigen, während bei Wechselwirkung der optischen Aufheller mit den Fungiziden bzw. der DC- Platte im Bereich der Hemmhöfe keine oder nur geringe Fluoreszenz auftritt. Die Hemmhöfe erscheinen daher bei Bestrahlung als dunkle Flecken auf leuchtendem Hintergrund.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die inkubierte DC-Platte zunächst mittels Fluoreszenzlöschung untersucht und dann zu einem geeigneten Zeitpunkt zur weiteren Verbesserung der Nachweis- empfindlichkeit mit einem optischen Aufheller behandelt und auf dessen Fluoreszenz hin untersucht.
Durch das erfindungsgemäße Detektionsverfahren kann der Nachweis von Fungiziden schnell, empfindlich und ohne großen Aufwand durchgeführt werden.
Durch die Verwendung des erfindungsgemäß bevorzugten linearen Heteropolysaccharids aus teilweise O-acetylierten Glucuronsäure- Glucose und Rhamnoseeinheiten als Geliermittel wird die Handhabung erleichtert, da statt Autoklavierung ein Filtrierschritt durchgeführt werden kann. Die Fließfähigkeit der Pilzsuspension kann leicht variiert bzw. eingestellt werden. Auf diese Weise kann wiederum die Wechselwirkung der Pilzsuspension mit der DC-Platte optimiert werden.
Die Detektion kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens zu einem früheren Zeitpunkt durchgeführt werden, da schon in der Wachstumsphase der Pilze mittels Fluoreszenzlöschung oder durch die Verwendung von optischen Aufhellern die Hemmhöfe mit gutem Kontrast dargestellt werden können.
Durch Fluoreszenzauslöschung kann schon während der Inkubation die Bildung der Hemmhöfe verfolgt werden und die Inkubation zu einem geeigneten Zeitpunkt beendet werden. Anschließend kann zusätzlich mittels eines optischen Aufhellers zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit angefärbt werden. Beide Färbemethoden ermöglichen erstmals die direkte Detektion von Pilz-Wachstum auf DC-Platten. Es muß nicht wie bei anderen Verfahren abgewartet werden, bis die entstandenen Sporen detektiert werden können.
Für eine quantitative Auswertung können auf die Platte zusätzlich definierte Mengen einer Lösung mit bekanntem Fungizid-Gehalt als Referenzlösung aufgetragen werden. Über die Größe der Hemmhöfe kann dann der Fungizid-Gehalt der Probe errechnet werden.
Alle wesentlichen Schritte des Verfahrens können in einem einfachen chemischen Labor ohne besondere Sterilitätsanforderungen durchgeführt werden.
Zur anwenderfreundlichen Durchführung des Verfahrens wird erfindungsgemäß weiterhin ein Testkit zur Verfügung gestellt, der in entsprechend ausgerüsteten Labors sehr leicht eingesetzt werden kann. Der Testkit enthält Nährmedium bevorzugt mit dem erfindungsgemäß bevorzugten Geliermittel, bevorzugt in fester Form zum Lösen in Wasser, einen geeigneten Teststamm, zumeist entweder als Lyophilisat, Granulat oder Sporenpräparation und bevorzugt einen optischen Aufheller, typischerweise in fester Form oder als Färbereagenz, sowie optionale weitere Bestandteile wie geeignete DC-Platten, Referenzlösungen etc., die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigt werden. Weiterhin enthält der Testkit bevorzugt eine Beschreibung, in der die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert werden.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fach- mann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der korrespondierenden Anmeldung DE 100 29 512, eingereicht am 21.06.2000, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Beispiele
1. Detektion von TBT (Tributylzinnchlorid) in Wasser
DC-Material: HPTLC-FP KG 60, Diol F254s, Firma Merck KGaA Fungizide: - TBT 50 nl Auftrag (F1)
- Probe (25 mg TBT auf 65 ml 2x abgekochtes vollentsalztes Wasser) Auftrag 200 nl (F2)und 500 nl (F3) Nährmedium: Sabouraud-2% GIucose-Bouillon Geliermittel: Geirrte®, Firma Roth
Testorganismus: Rhodotorula rubra Chromatographie: Trennstrecke 50 mm, Laufmittel Acetonitril, Laufzeit 6 min
Herstellung der Pilzsuspension:
200 ml vollentsalztes Wasser, 10 g Sabouraud-2% GIucose-Bouillon und 0,11 g Geirrte® werden steril gekocht. Dann wird der Testorganismus als Lyophillisat oder Lebendkultur zugegeben und 3 Stunden bei 35°C vorinkubiert.
Durchführung des Nachweises:
Die entwickelte DC-Platte wird kurz in die Pilzsuspension getaucht und überschüssige Suspension vom Boden der Platte entfernt. Anschließend wird die DC-Platte in einer Dose, die mit feuchtem Papier ausgelegt ist, über 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Auswertung erfolgt durch Fluoreszenzlöschung bei 254 nm.
Auf der DC-Platte sind für F1 ein Hemmhof mit Rf ca. 1 ,0, für F2 und F3 ein
Hemmhof mit Rf ca. 1,0 und ein Hemmhof auf der Startlinie (Rf = 0) zu sehen.
Ergebnis:
Der Hemmhof auf der Startlinie ist ein Abbauprodukt von TBT in Wasser.
2. Detektion verschiedener Fungizide
DC-Material: HPTLC-FP KG 60, WRF254s, Firma Merck KGaA
Fungizide: - Fenpropimorph (A1)
- Flusilazole (A2)
- Propiconazol (A3), alle von Riedel-de Haen Auftrag je 20, 50 und 200 nl Nährmedium: Sabouraud-2% GIucose-Bouillon Geliermittel: Geirrte®, Firma Roth
Testorganismus: Rhodotorula rubra Chromatographie: Trennstrecke 50 mm, Laufmittel Acetonitril /
Dichlormethan / n-Hexan (30/40/20 ml),
Laufzeit 15 min
Herstellung der Pilzsuspension: 200 ml vollentsalztes Wasser, 10 g Sabouraud-2% GIucose-Bouillon und 0,11 g Geirrte® werden steril gekocht. Dann wird der Testorganismus als Lyophilisat oder Lebendkultur zugegeben und 6 Stunden bei Raumtemperatur vorinkubiert.
Durchführung des Nachweises:
Die entwickelte DC-Platte wird kurz in die Pilzsuspension getaucht und überschüssige Suspension vom Boden der Platte entfernt. Anschließend wird die DC-Platte in einer Dose, die mit feuchtem Papier ausgelegt ist, ü er 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Auswertung erfolgt durch Anfärbung mit optischem Aufheller (0,04 %
Blankophor® BA 267% der Bayer AG, Deutschland, in 0,1 mol/l NaOH-
Lösung). Dazu wird die DC-Platte getrocknet, mit der Anfärbelösung benetzt und anschließend 5 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. Die
Auswertung erfolgt bei 366 nm. Die Hemmhöfe sind als dunkle Flecken vor einem fluoreszierenden Hintergrund zu erkennen.
Auf der DC-Platte ist für A1 bis A3 in allen drei Konzentrationen jeweils ein
Hemmhof zu sehen.
(es bedeutet: - = kein Hemmhof; + = kleiner Hemmhof; ++ = deutlich sichtbarer Hemmhof)

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum bioautographischen Nachweis von Fungiziden, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer getrockneten entwickelten DC-Platte; b) Aufgeben der Pilzsuspension auf die DC-Platte; c) Inkubation der DC-Platte; d) Nachweis von Hemmhöfen mittels Fluoreszenzauslöschung und/oder Anfärbung mit einem optischen Aufheller.
2. Verfahren zum bioautographischen Nachweis von Fungiziden nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Pilzsuspension in Schritt b) ein lineares Heteropolysaccharid aus teilweise O-acetylierten Glucuronsäure-, Glucose- und Rhamnoseeinheiten als Geliermittel enthält.
3. Verfahren zum bioautographischen Nachweis von Fungiziden nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DC- Platte in Schritt c) 15 bis 20 Stunden inkubiert wird.
Verfahren zum bioautographischen Nachweis von Fungiziden nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) die Pilzsuspension vor der Aufgabe auf die DC-Platte vorinkubiert wird.
Verfahren zum bioautographischen Nachweis von Fungiziden nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzauslöschung in Schritt d) bei 254 nm detektiert wird.
6. Verfahren zum bioautographischen Nachweis von Fungiziden nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz eines optischen Aufhellers in Schritt d) bei einer Wellenlänge zwischen 360 und 390 nm detektiert wird.
7. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, zumindest enthaltend ein Nährmedium, ein lineares
Heteropolysaccharid als Geliermittel und einen lagerstabilen Teststamm zur Herstellung der Pilzsuspension.
8. Testkit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass er zusätzlich mindestens eine DC-Platte mit Fluoreszenzindikator enthält.
9. Testkit nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet dass er zusätzlich einen optischen Aufheller enthält.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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