EP1288227A1 - Coaktivator von nukleären Rezeptoren - Google Patents

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EP1288227A1
EP1288227A1 EP02015042A EP02015042A EP1288227A1 EP 1288227 A1 EP1288227 A1 EP 1288227A1 EP 02015042 A EP02015042 A EP 02015042A EP 02015042 A EP02015042 A EP 02015042A EP 1288227 A1 EP1288227 A1 EP 1288227A1
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
cell
arap3
substances
test system
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EP02015042A
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Maik Obendorf
Siegmund Wolf
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Bayer Pharma AG
Original Assignee
Jenapharm GmbH and Co KG
Schering AG
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to comodulators of nuclear receptors and their use for Provision of new drugs.
  • the superfamily of nuclear receptors which includes about 50 different proteins, consists of a group of related transcription factors that determine the transcription of the controls the respective target gene depending on specific, specific ligands. This family can be based on certain criteria such as Dimerization status, type of ligand or structure of the DNA binding element can be divided into several subfamilies (Beato et al., 2000, Human Reproduct. Update, 6, 225-236).
  • Characteristic of the nuclear Receptors is the consistent structure of functional domains (with the Designations A to F), consisting of a highly variable, only slightly conserved N-terminal Region with autonomous constitutive activation function (AF-1), one strong conserved DNA binding domain (DBD), which is used for the detection of special DNA binding elements is responsible and consists of two zinc finger motifs, one variable Hinge domain (hinge) and a conserved multifunctional C-terminal Ligand binding domain (LBD) consisting of dimerization and ligand dependent Transactivation function (AF-2).
  • C-terminal located region the function of which is not known and which is associated with receptors such as PR (Progesterone receptor), PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) and RXR (Retinoid X receptor) is absent (Mangelsdorf & Evans, 1995; Cell, 83, 841-850; Robyr et al., 2000, Mol. Endocrinol., 14, 329-347).
  • PR Progesterone receptor
  • PPAR peroxisome proliferator-activated receptor
  • RXR Retinoid X receptor
  • Steroid hormone receptors such as Estrogen (ER), progesterone (PR), Bind glucocorticoid (GR), mineralocorticoid (MR) and androgen (AR) receptors steroidal ligands, such as the progestins, the estrogens, the glucocorticoids, the Mineralocorticoids and androgens, all derived from pregnenolone.
  • ER Estrogen
  • PR progesterone
  • GR Bind glucocorticoid
  • MR mineralocorticoid
  • AR steroidal ligands
  • the binding of the Ligands to the NR activate the receptor and control expression accordingly Target genes.
  • comodulators activation or repression
  • gene transcription as bridge molecules between the transcription initiation complex and the nuclear receptors play an important role (McKenna et al., 1999, Endocr. Rev., 20, 321-347).
  • a co-activator enhances the receptor function and interacts in the presence of an agonist - but not in the presence of an antagonist - directly with the Activation domain of nuclear receptors. He also interacts with the basal transcription apparatus and does not strengthen the basal on its own Transcriptional activity.
  • Most comodulators interact using an or several LXXLL motifs (NR boxes) in the protein sequence with the AF-2 domain of nuclear receptors.
  • A1B1 An estrogen receptor coactivator called A1B1 has been shown to function in Breast cancer and ovarian cancer cell lines are expressed at elevated levels and are believed to play an important role plays in the course of steroid hormone-dependent tumors (Anzick et al. 1997, Science 277, 965-968).
  • hybridization under stringent conditions is in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • a stringent hybridization lies, for example before if after washing for 1 h with 1 x SSC and 0.1% SDS at 50 ° C, preferably at 55 ° C, particularly preferably at 62 ° C and most preferably at 68 ° C, especially for 1h in 0.2 x SSC and 0.1% SDS at 55 ° C, preferably at 62 ° C and most a hybridization signal is preferably observed at 68 ° C.
  • the nucleic acids that under these conditions with the nucleic acids shown in Seq ID NO 1-13, 19 or one of these sequences as part of the degeneration of the genetic code hybridize corresponding nucleotide sequences are also the subject of the present Invention.
  • Nucleic acids can be single or double stranded DNA, e.g. cDNA, or RNA, e.g. mRNA, represent cRNA, pre-mRNA.
  • the invention further relates to polypeptides which are encoded by the nucleic acids according to the invention or which comprise amino acid sequences shown in Seq ID NO 14-18, 20.
  • These polypeptides according to the invention are hereinafter called ARAP3 variants or ARAP3 for short.
  • These nucleic acid variants are expressed tissue-specifically by using alternative promoters and are generated by alternative processing or splicing of the pre mRNA.
  • ARAP3 variants contain a zinc finger domain. They show homologies to other members of the zinc finger domain family such as, for example, Hairless protein (Cachon-Gonzales et al., 1994, Proc. Natl. Acad.
  • ARAP3 also contains a core localization domain. ARAP3 binds to the androgen receptor. The binding takes place to the region amino acid 325 to 919 of the androgen receptor (see FIG. 2 AR2 fragment).
  • the binding site is in the ranges of the polypeptides according to the invention, as indicated in the following table: Amino acid regions of the domains of ARAP3 polypeptides Seq ID NO Zinc finger AS Androgen receptor binding domain Core Localization Domain (NLD) jmjC domain 14 1664-1692 1732 -1841 2183 - 2193 2199-2298 15 1858 to 1886 1926 to 2035 2377 to 2385 2393 to 2492 16 1846 to 1874 1914 to 2023 2365 to 2373 2381 to 2480 17 1627 to 1655 1695 to 1804 2146 to 2154 2162 to 2261 18 390 to 418 458 to 567 909 to 917 925 to 953 part. 20 1361 to 1389 1430 to 1539 1881 to 1898 1897 to 1996
  • ARAP3 has the function of a comodulator of nuclear receptors, especially Steroid hormone receptors.
  • receptors are the androgen receptor, Estrogen receptor ⁇ , estrogen receptor ⁇ , progesterone receptor A, progesterone receptor B, glucocorticoid receptor, mineralocorticoid receptor, thyroid hormone receptor, vitamin D receptor and peroxisome proliferator-activated receptor.
  • ARAP3 binds particularly well the androgen receptor. Through this binding, the receptor function. be modulated i.e. be strengthened or weakened.
  • ARAP3 is particularly strong in the heart, liver, testicles and Expressed ovary.
  • the invention furthermore relates to vectors which contain at least one copy of a contain the nucleic acids of the invention.
  • Vectors can be prokaryotic or be eukaryotic vectors. Examples of vectors are pPRO (Clontech), pBAD (Invitrogen), pSG5 (Stratagene), pCl (Promega), pIRES (Clontech), pBAC (Clontech), pMET (Invitrogen), pBlueBac (Invitrogen).
  • the nucleic acids according to the invention are inserted.
  • the Nucleic acids according to the invention are preferably in association with Expression signals such as Promoter and enhancer on the vector.
  • the invention further relates to cells which are transfected with one of the nucleic acid sequences according to the invention or with a vector according to the invention.
  • cells which are transfected with one of the nucleic acid sequences according to the invention or with a vector according to the invention.
  • E. coli, yeast, Pichia, Sf9, COS, CV-1 or BHK can be used as cells. These cells can be used for the production of the polypeptides according to the invention or for test systems.
  • polypeptides according to the invention or partial areas thereof can be used for Antibody production can be used.
  • polyclonal antibodies the polypeptides or peptides e.g. bound to KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) and animals, e.g. Rabbit being sprayed. You can also use it to manufacture monoclonal antibodies can be used.
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • animals e.g. Rabbit being sprayed.
  • You can also use it to manufacture monoclonal antibodies can be used.
  • a inventive polypeptide or peptide or a mixture of several Peptides according to the invention can be used.
  • the antibodies are produced according to standard procedures such as in Kohler, G. and Milstein, C., Nature 1975, 256, 495-497 and Nelson, P.N. et al., Mol. Pathol. 2000, 53, 111-117.
  • the invention also relates to the antibodies which are directed against the polypeptides according to the invention.
  • the antibodies according to the invention can be used for the detection of ARAP3 and its variants. This can be done, for example, by immunohistochemistry.
  • the antibodies according to the invention can also be used in other immunoassays such as an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) or in radioimmunoassays. In this way the concentration of ARAP3 in tissue or cell extracts can be detected.
  • the detection of the expression of the polypeptides according to the invention can also be via the Detection of mRNA in the cells.
  • the invention therefore also relates to Use of a probe with nucleic acid sequences that are complementary to the Nucleic acid sequences encoding ARAP3 are for the production of a reagent for Detection of the presence of mRNA according to the invention in cells.
  • a probe is a short one DNA piece with at least 14 nucleotides.
  • the probes according to the invention can e.g. in a Northern blot analysis can be used. This method is e.g. in Sambrook, J. et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Other methods of detection the RNA are in situ hybridization, RNAse protection assay or PCR.
  • the detection of the expression of ARAP3 is especially dependent on androgen Diseases used.
  • increased androgen activability in diseases such as prostate cancer and benign prostate hyperplasia and for acne or hair loss can be attributed to an increased coactivator activity of ARAP3.
  • a diminished one Coactivator activity can help with hypogonadism, erectile dysfunction and androgen insensitive syndromes such as. testicular feminization syndrome. at In these diseases, the balance between androgen receptor and coactivator can be disturbed. Therefore, in addition to the amount of ARAP3 expressed, it is also appropriate to include the amount of to determine the expressed androgen receptor in the same tissue.
  • the Androgen receptor protein can also be obtained by immunological methods such as e.g. Radioimmunoassay, ELISA or Western blot can be determined.
  • An object of the invention is the use of ARAP3 or the coding for it Nucleic acids as target substance for the production of an agent for the treatment of Steroid-dependent disorders.
  • Such steroid hormone-dependent diseases e.g. Estrogen-dependent diseases such as Breast cancer and osteoporosis or Cardiovascular and vascular diseases.
  • ARAP3 could also be used as Target substance for the manufacture of drugs to influence the male Fertility can be used.
  • the effectors of ARAP3 can be used to treat steroid hormone-dependent Diseases are used.
  • diseases that e.g. to a strong androgen activability may be an inhibitor of the interaction of ARAP3 and the Androgen receptor are administered and for diseases that are reduced on a Based on coactivator activity, a stimulator of this interaction can be administered.
  • a vector that contains a nucleic acid according to the invention contains, designed and applied. Examples are vectors derived from adenovirus, adenovirus virus, herpes simplex virus or SV40.
  • Gene therapy can following a protocol as described by Gomez-Navarro, J. et al. (Eur. J. Cancer 1999, 35, 867-885) described.
  • the application can be local, i.e. directly into the affected Fabrics such as the tumor or systemic, i.e. via the bloodstream. this leads to to an increased expression of ARAP3.
  • ARAP3 can be applied in the form of a fusion polypeptide.
  • the fused polypeptide e.g. EGF or transferrin becomes the polypeptide according to the invention preferably to the desired tissue, e.g. transported to the tumor tissue.
  • the activity of ARAP3, which in step b. is measured, the gain is the Receptor function of the nuclear receptor used. Steroid hormone receptors are preferred the androgen receptor is particularly preferred.
  • test systems according to the invention can also be used to test environmental samples be used. Many substances in the environment come in so low Concentrations before that they only have an effect on human steroid hormone receptors who increasingly express the corresponding coactivator. By using a These substances could be identified according to the test system according to the invention. A genetic predisposition to the effects of these substances can be determined by the detection of ARAP3 according to the invention can be determined.
  • AF means Activation function
  • DBD DNA binding domain DBD DNA binding domain
  • LBD ligand binding domain S stands for amino acid.
  • the fragment of the androgen receptor (AR2) is shown, which for the two-hybrid screen was used.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the ARAP3 polypeptide Seq ID NO 20. Shown is the region that binds to the androgen receptor and the zinc finger domain.
  • FIG. 3 shows the tissue distribution of ARAP3.
  • a Northern blot analysis is shown. 2 ⁇ g human poly A + RNA were separated on a gel, transferred to a membrane and hybridized with an ARAP3 cDNA fragment. kb stands for kilobases.
  • Example 4 shows the result of a mammalian hybrid test with the ARAP3 fragment AS1430 bis 1539 of Seq ID NO 20 and the human androgen receptor. The attempt was like in Example 2 was carried out. An analog VP16 was used as a positive control Construct an SRC1 fragment binding to the androgen receptor.
  • a yeast-2-hybrid system was screened in the presence and absence of 10 -6 mol of dihydroxy testosterone (DHT) performed.
  • DHT dihydroxy testosterone
  • the number of clones screened was 3x10 6 or 2x10 7 .
  • the number of independent clones was 3.5x10 6 .
  • 800 positive clones were selected and tested with a ⁇ -galactosidase assay, with 240 being confirmed as lacZ positive clones.
  • the ARAP3 cDNA was then extended using PCR techniques found different splice variants which represent nucleic acids 1 to 13. Out 5 polypeptides with amino acid sequences 14 to 18 are derived from these.
  • the binding of the ARAP3 fragment (AS 1430-1539) to the androgen receptor (AR) was confirmed in the mammalian hybrid test ( Figure 4)
  • the ARAP3 fragment was identified as Fusion protein cloned with VP16 (CMX-VP16-ARAP3-III).
  • Human PC3 cells were made with CMX-VP16-ARAP3-III, the expression vector which contains the complete AR, (pSG5AR) and the reporter gene luciferase, which are under the control of the AR MMTV Promoters stands (pMMTV-luc), transfected. After 24 hours, the cells were with Dihydroxytestosterone (DHT) incubated. After another day, the cells were lysed and the activity of the reporter gene luciferase was determined. The results are normalized on the basis of the protein contents of the batches determined in parallel. An approach with serves as a control the empty expression vector CMX-VP16-empty.
  • a eukaryotic expression vector e.g. pCMX, which is the ARAP3 cDNA, which is the encodes complete ARAP3 protein or a functional part, contains (pCMX-ARAP3), is broken down into suitable cell lines, e.g. SH-SY5Y or PC3 transfected, together with pSG5AR and pMMTV-luc.
  • An approach with the empty expression vector pCMX serves as a control.
  • the Androgenic activity can be determined by the activity of the reporter luciferase analogous to the above Example can be determined.
  • the effect of ARAP3 on the androgenic signal can be determined by comparing the activity of the control approach.
  • a GST pulldown experiment is a test arrangement that allows one in vitro expressed GST fusion protein to an equally in vitro expressed and radioactive bind labeled protein, then separate from non-interacting proteins and detect the bound proteins and view them as a measure of binding.
  • the Experiments were carried out according to Sambrook and Russel, Molecular Cloning, Volume 3, Chapter 18, Protocol 3 (page 18.55 ff); Cold Spring Harbor Laboratory Press; New York 2001 stated, carried out:
  • an ARAP3 fragment (AS 1735 to 1840 of Seq ID NO 14) was cloned as a GST fusion protein in the vector pGEX-KG (Pharmacia) and overexpressed and prepared in bacterial cells according to the manufacturer's instructions.
  • the ARAP3 fusion protein was bound to glutathione Sepharose beads and incubated with 35S-methionine-labeled androgen receptor (pSG5AR expressed with T7 TNT reticulocyte lysate from Promega). The mixture was then centrifuged and the bound proportion of androgen receptor on the GST-ARAP3 beads was determined by SDS-PAGE and subsequent autofluography.
  • a binding ratio could be formed by comparing the blackening of the androgen receptor protein bands on the hyper film (TM Amersham) and evaluating them using density integration.
  • the validated binding values of GST-ARAP3 compared to GST-empty resulted from the protein input amounts determined by Western blot, as shown in Table 2 as the ARAP3 / GST ratio and can be regarded as evidence for the binding of ARAP3 to the androgen receptor.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Comodulatoren von nukleären Rezeptoren, die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen und ihre Verwendung zur Bereitstellung von Arzneimitteln.

Description

Die Erfindung betrifft Comodulatoren von nukleären Rezeptoren und ihre Verwendung zur Bereitstellung neuer Medikamente.
Die Superfamilie der nukleären Rezeptoren, zu der etwa 50 verschiedene Proteine gehören, besteht aus einer Gruppe verwandter Transkriptionsfaktoren, die die Transkription des jeweiligen Zielgens in Abhängigkeit bestimmter, spezifischer Liganden steuert. Diese Familie kann nach bestimmten Kriterien wie z.B. Dimerisationsstatus, Art des Liganden oder Struktur des DNA-Bindeelementes, in mehrere Subfamilien unterteilt werden (Beato et al., 2000, Human Reproduct. Update, 6, 225-236). Charakteristisches Merkmal der nukleären Rezeptoren ist die übereinstimmende Struktur von funktionellen Domänen (mit den Bezeichnungen A bis F), bestehend aus einer stark variablen, nur schwach konservierten N-terminalen Region mit autonomer konstitutiver Aktivierungsfunktion (AF-1), einer stark konservierten DNA-Bindungsdomäne (DBD), die für die Erkennung von speziellen DNA-Bindeelementen verantwortlich ist und aus zwei Zinkfinger-Motiven besteht, einer variablen Scharnierdomäne (Hinge) und einer konservierten multifunktionalen C-terminalen Ligandenbindungsdomäne (LBD) bestehend aus Dimerisations- und Liganden-abhängiger Transaktivierungsfunktion (AF-2). Im Anschluss daran folgt die am weitesten C-terminal gelegene Region, deren Funktion nicht bekannt ist und die bei Rezeptoren wie z.B. PR (Progesteron-Rezeptor), PPAR (Peroxisom proliferator-aktivierter Rezeptor) und RXR (Retinoid-X-Rezeptor) fehlt (Mangelsdorf & Evans, 1995; Cell, 83, 841-850; Robyr et al., 2000, Mol. Endocrinol., 14, 329-347). Für einige nukleäre Rezeptoren (z.B. AR) wurde nachgewiesen, dass die N-terminale Region in der Lage ist, mit der C-terminalen Region in Wechselwirkung treten kann (Brinkmann et al., 1999, J. Steroid Biochem. and Mol. Biol., 69, 307-313). Steroidhormonrezeptoren wie z.B. Estrogen- (ER), Progesteron- (PR), Glukokortikoid- (GR), Mineralokortikoid- (MR) und Androgenrezeptoren (AR) binden steroidale Liganden, wie die Progestine, die Estrogene, die Glukokortikoide, die Mineralokortikoide und Androgene, die sich alle von Pregnenolon ableiten. Die Bindung des Liganden an den NR aktiviert den Rezeptor und steuert die Expression entsprechender Zielgene.
Darüber hinaus wurde eine weitere Proteinklasse, die sog. Comodulatoren identifiziert, die entweder bei Aktivierung (Coaktivatoren) bzw. Repression (Corepressoren) der Gentranskription als Brückenmoleküle zwischen dem Transkriptionsinitiationskomplex und den nukleären Rezeptoren eine wichtige Rolle spielen (McKenna et al., 1999, Endocr. Rev., 20, 321-347). Ein Coaktivator verstärkt die Rezeptorfunktion und interagiert in Anwesenheit eines Agonisten - nicht dagegen in Anwesenheit eines Antagonisten - direkt mit der Aktivierungsdomäne von nukleären Rezeptoren. Er interagiert außerdem auch mit dem basalen Transkriptionsapparat und verstärkt dagegen nicht von allein die basale Transkriptionsaktivität. Die meisten Comodulatoren interagieren mit Hilfe eines oder mehrerer LXXLL-Motive (NR-Boxes) in der Proteinsequenz mit der AF-2-Domäne von nukleären Rezeptoren. Jedoch wurden auch einige Comodulatoren beschrieben, die mit anderen Aminosäuren mit nukleären Rezeptoren interagieren können (Ding et al., 1998, Mol. Endocrinol., 12, 302-313). Darüber hinaus wurden viele Comodulatoren identifiziert, die in ähnlicher Weise mit mehreren verschiedenen nukleären Rezeptoren interagieren.
Für einen Estrogen-Rezeptor-Coaktivator, genannt A1B1, konnte gezeigt werden, dass er in Brustkrebs- und Ovarkrebs-Zellinien erhöht exprimiert ist und vermutlich eine wichtige Rolle bei dem Verlauf von Steroidhormon-abhängigen Tumoren spielt (Anzick et al. 1997, Science 277, 965-968).
Neben der direkten Beeinflußung der Steroidhormonrezeptoren durch Hormone oder Antihormone wäre die Modulation der Wechselwirkung von Comodulatoren mit den Steroidhormonrezeptoren ein weiterer Angriffspunkt für eine Therapie von hormonabhängigen Krankheiten. Das Problem ist daher einen neuen Comodulator zu finden, mit dessen Hilfe neue Arzneimittel bereitgestellt werden können.
Das Problem wurde gelöst durch die Bereitstellung von Nukleinsäuren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
  • a. Nukleinsäuren kodierend für Polypeptide, welche die in Seq ID NO 14 - 18, 20 dargestellten Aminosäuresequenzen umfassen,
  • b. Nukleinsäuren umfassend die in Seq ID NO 1 - 13, 19 dargestellten Nukleotidsequenzen,
  • c. Nukleinsäuren mit einer mit den Sequenzen aus a. und/oder b. unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenzen, die für Polypeptide mit der biologischen Aktivität von Comodulatoren kodieren oder
  • d. Nukleinsäuren mit einer der Sequenzen aus a, b oder c im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen.
    • Teilbereiche dieser Sequenzen sind in der Datenbank GenBank unter den Accession No AB037801, AK027280 und AK024991 publiziert worden. Diesen Teilstücken wurde keine Funktion zugeordnet.
    Der Begriff "Hybridisierung unter stringenten Bedingungen" gemäß der vorliegenden Erfindung wird bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) definiert. Eine stringente Hybridisierung liegt beispielsweise vor, wenn nach dem Waschen für 1 h mit 1 x SSC und 0,1%SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1h in 0,2 x SSC und 0,1 % SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein Hybridisierungssignal beobachtet wird. Die Nukleinsäuren, die unter diesen Bedingungen mit den in Seq ID NO 1 - 13, 19 gezeigten Nukleinsäuren oder einer dieser Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen hybridisieren, sind auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
    Nukleinsäuren können einzel- oder doppelsträngige DNA, z.B. cDNA, oder RNA, z.B. mRNA, cRNA, pre-mRNA darstellen.
    Die Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden oder die in Seq ID NO 14 - 18, 20 dargestellte Aminosäuresequenzen umfassen. Diese erfindungsgemäßen Polypeptide werden im folgenden ARAP3 Varianten oder kurz ARAP3 genannt. Diese Nukleinsäurevarianten werden gewebsspezifisch durch Nutzung alternativer Promotoren exprimiert sowie durch alternatives Prozessieren bzw. Spleissen der pre mRNA erzeut. ARAP3 Varianten enthalten eine Zinkfinger-Domäne. Sie zeigen Homologien zu anderen Mitgliedern der Zinkfinger-Domänen-Familie wie z.B. Hairless -Protein (Cachon-Gonzales et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 7717-7721) und Testis Specific Protein a (Hoog et al., 1991, Mol. Reprod. Dev., 30, 173-181). Außerdem besteht für die C terminalen Aminosäuren eine signifikante Homologie zur jmjC Domäne der jumonji Familie (Balciunas and Ronne; 2000, Trends Biochem. Sci., 25, 274-76). Weiterhin enthält ARAP3 eine Kernlokalisationsdomäne. ARAP3 bindet an den Androgenrezeptor. Die Bindung erfolgt an den Bereich Aminosäure 325 bis 919 des Androgenrezeptors (s. FIG. 2 AR2-Fragment). Die Bindungstelle liegt in den Bereichen der erfindungsgemäßen Polypeptide, wie in der folgenden Tabelle angegeben:
    Aminosäurebereiche der Domänen von ARAP3 Polypeptiden
    Seq ID NO Zinkfinger AS Androgenrezeptor Bindungsdomäne Kernlokalisierungs-domäne (NLD) jmjC - Domäne
    14 1664 - 1692 1732 -1841 2183 - 2193 2199 - 2298
    15 1858 bis 1886 1926 bis 2035 2377 bis 2385 2393 bis 2492
    16 1846 bis 1874 1914 bis 2023 2365 bis 2373 2381 bis 2480
    17 1627 bis 1655 1695 bis 1804 2146 bis 2154 2162 bis 2261
    18 390 bis 418 458 bis 567 909 bis 917 925 bis 953 part.
    20 1361 bis 1389 1430 bis 1539 1881 bis 1898 1897 bis 1996
    ARAP3 hat die Funktion eines Comodulators von nukleären Rezeptoren, besonders Steroidhormon-Rezeptoren. Beispiele für Rezeptoren sind der Androgen-Rezeptor, Estrogen-Rezeptor α, Estrogen-Rezeptor β, Progesteron Rezeptor A, Progesteron Rezeptor B, Glucocorticoid-Rezeptor, Mineralocorticoid-Rezeptor, Thyroid Hormon-Rezeptor, Vitamin D-Rezeptor und Peroxisom-Proliferator-activated Rezeptor. Besonders gut bindet ARAP3 an den Androgen-Rezeptor. Durch diese Bindung kann die Rezeptorfunktion. moduliert werden, d.h. verstärkt oder geschwächt werden.
    Im gesunden Menschen wird ARAP3 besonders stark im Herz, in der Leber, im Hoden und Ovar exprimiert.
    Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung Vektoren die mindestens eine Kopie einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten. Vektoren können prokaryontische oder eukaryontische Vektoren sein. Beispiele für Vektoren sind pPRO (Clontech), pBAD (Invitrogen), pSG5 (Stratagene), pCl (Promega), pIRES (Clontech), pBAC (Clontech), pMET (Invitrogen), pBlueBac (Invitrogen). In diese Vektoren können mit den dem Fachmann bekannten Methoden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eingefügt werden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren befinden sich vorzugsweise in Verbindung mit Expressionssignalen wie z.B. Promotor und Enhancer auf dem Vektor.
    Die Erfindung betrifft ferner Zellen, die mit einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert sind. Als Zellen können z.B. E. coli, Hefe, Pichia, Sf9, COS, CV-1 oder BHK verwendet werden. Diese Zellen können für die Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide oder für Testsysteme verwendet werden.
    Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Teilbereiche davon (Peptide) können zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Zur Herstellung polyklonaler Antikörper können die Polypeptide oder Peptide z.B. an KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) gebunden werden und Tieren, z.B. Kaninchen, gespritzt werden. Sie können auch zur Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet werden. Zur Antikörperherstellung kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Peptid oder eine Mischung mehrerer erfindungsgemäßer Peptide verwendet werden. Die Herstellung der Antikörper erfolgt dabei nach Standardverfahren wie sie z.B. in Kohler, G. und Milstein, C., Nature 1975, 256, 495-497 und Nelson, P. N. et al., Mol. Pathol. 2000, 53, 111-117 beschrieben sind.
    Gegenstand der Erfindung sind auch die Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide gerichtet sind.
    Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Detektion von ARAP3 und seinen Varianten verwendet werden. Dies kann z.B. durch Immunhistochemie erfolgen. Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch in anderen Immuntests wie z.B. einem ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) oder in Radioimmunotests eingesetzt werden. So kann die Konzentration an ARAP3 in Gewebe-oder Zellextrakten nachgewiesen werden.
    Der Nachweis der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide kann auch über den Nachweis von mRNA in den Zellen erfolgen. Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung einer Sonde mit Nukleinsäuresequenzen, die komplementär zu den Nukleinsäuresequenzen sind, die für ARAP3 kodieren, zur Herstellung eines Reagenz zum Nachweis der Gegenwart von erfindungsgemäßer mRNA in Zellen. Eine Sonde ist ein kurzes DNA-Stück mit mindestens 14 Nukleotiden. Die erfindungsgemäßen Sonden können z.B. in einer Northern Blot Analyse verwendet werden. Diese Methode ist z.B. in Sambrook, J. et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben. Andere Methoden zum Nachweis der RNA sind In Situ Hybridisierung, RNAse Protection Assay oder PCR.
    Der Nachweis der Expression von ARAP3 wird vor allem bei Androgen-abhängigen Krankheiten eingesetzt. So kann z.B. eine erhöhte Androgen-Aktivierbarkeit bei Krankheiten wie Prostata-Krebs und benigner Prostata-Hyperplasie und bei Akne oder auch Haarausfall auf einer verstärkten Coaktivator-Aktivität von ARAP3 zurückzuführen sein. Eine verminderte Coaktivatoraktivität kann dagegen bei Hypogonadismus, erektiler Dysfunktion und Androgeninsensitiv-Syndromen wie z.B. dem testikulären Feminisierungssyndrom vorliegen. Bei diesen Krankheiten kann die Balance von Androgenrezeptor zu Coaktivator gestört sein. Daher ist es zweckmäßig neben der Menge an exprimiertem ARAP3 auch die Menge an exprimiertem Androgenrezeptor im gleichen Gewebe zu bestimmen. Das Androgenrezeptorprotein kann ebenfalls durch immunologische Methoden wie z.B. Radioimmunoassay, ELISA oder Westernblot bestimmt werden.
    Ein Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von ARAP3 oder der dafür kodierenden Nukleinsäuren als Zielsubstanz zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Steroidhormon-abhängigen Erkrankungen. Solche Steroidhormon-abhängigen Erkrankungen können neben den oben erwähnten Androgen-abhängigen Erkrankungen auch z.B. Estrogen-abhängige Erkrankungen wie z.B. Brustkrebs und Osteoporose oder Herzkreislauferkrankungen und Gefäßerkrankungen sein. Auch könnte ARAP3 als Zielsubstanz für die Herstellung von Medikamenten zur Beeinflussung der männlichen Fertilität verwendet werden.
    Insbesondere erfasst die Erfindung die Verwendung
  • a. einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure,
  • b. eines erfindungsgemäßen Polypeptids, oder
  • c. einer erfindungsgemäßen Zelle zur Identifizierung von Effektoren von ARAP3.
    Effektoren sind Substanzen, die auf ARAP3 inhibitorisch oder aktivierend wirken, und die in der Lage sind, die Funktionen von ARAP3 zu beeinflussen, welche aufgrund der Wechselwirkungen durch Bindung von ARAP3 an ein Zielmolekül entstehen. Bevorzugt sind solche Substanzen, die die Interaktion von ARAP3 mit dem Androgenrezeptor modulieren. Dies kann z.B. getestet werden, indem die Bindung des gereinigten ARAP3-Polypeptids an das Androgenrezeptorpolypeptid in Gegenwart von zu testenden Substanzen gemessen wird und mit dem Kontrollwert, der ohne die zu testenden Substanzen erhoben wird, verglichen wird. Die Bindung kann durch Marker, die an ARAP3 oder am Androgenrezeptor gebunden sind, bestimmt werden. Solche Marker können z.B. Fluoreszenzmarker, Biotin oder radioaktive Marker sein.
    Eine andere Möglichkeit zur Identifizierung von Effektoren ist die Verwendung einer Zelle, die cDNA von ARAP3 oder eines funktionellen Teils davon, die cDNA des Androgenrezeptors oder eines anderen nukleären Rezeptors und die cDNA eines Reportergens enthält. Als Reportergen kann z.B. Luziferase verwendet werden. Die Aktivität der Luziferase spiegelt hierbei die Aktivierung des nukleären Rezeptors wieder. Die Zellen werden in Gegenwart der zu testenden Substanzen inkubiert und die Luziferaseaktivität bestimmt. Die Inkubation kann auch zusätzlich in Gegenwart des Liganden des nukleären Rezeptors erfolgen. So können z.B. antagonistische Effekte gemessen werden. Bevorzugt ist die Verwendung des Androgenrezepors und dessen Liganden, einem Androgen.
    • Die Effektoren von ARAP3 können zur Behandlung von Steroidhormon-abhängigen Krankheiten eingesetzt werden. Bei Krankheiten, die z.B. auf zu einer starken Androgen-Aktivierbarkeit beruhen, kann ein Inhibitor der Interaktion von ARAP3 und dem Androgenrezeptor verabreicht werden und bei Krankheiten, die auf einer verminderten Coaktivator-Aktivität beruhen kann ein Stimulator dieser Interaktion verabreicht werden.
    Krankheiten, die auf einem Mangel an ARAP3 beruhen, können auch durch eine Änderung der Konzentration von ARAP3 in den betroffenen Geweben behandelt werden. Dazu kann entweder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Hilfe eines in der Gentherapie gebräuchlichen Vektors oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid in das Gewebe gebracht werden. Bei der Gentherapie wird ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, konstruiert und appliziert. Beispiele sind Vektoren, die aus Adenovirus, Adenovirusassociated virus, Herpes simplex virus oder SV40 abgeleitet sind. Die Gentherapie kann nach einem Protokoll wie von Gomez-Navarro, J. et al. (Eur. J. Cancer 1999, 35, 867-885) beschrieben durchgeführt werden. Die Applikation kann lokal, d.h. direkt in das betroffene Gewebe wie z.B. den Tumor oder systemisch, d.h. über den Blutkreislauf erfolgen. Dies führt zu einer erhöhten Expression von ARAP3.
    Die Applikation von ARAP3 kann in Form eines Fusionspolypeptids erfolgen. Durch das fusionierte Polypeptid, z.B. EGF oder Transferrin wird das erfindungsgemäße Polypeptid bevorzugt zu dem gewünschten Gewebe, z.B. dem Tumorgewebe transportiert.
    Krankheiten können auch auf einer Überexpression von ARAP3 beruhen. Dadurch werden die nukleären Rezeptoren so stark sensitiviert, dass sie nicht nur durch ihre Liganden sondern auch durch andere Substanzen, die unter physiologischen Bedingungen keine Wirkung zeigen, aktiviert werden können. In solch einem Fall ist es wünschenswert, die Expression von ARAP3 zu erniedrigen. Dies kann durch Antisense-Moleküle erfolgen. Diese Moleküle sind komplementär zu den in Seq ID NO 1 bis 13, 19 dargestellten Nukleinsäuresequenzen oder zu Teilen davon.
    Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung eines pharmazeutischen Mittels, wobei
  • a. Substanzen mit einem erfindungsgemäßen Testsystem in Kontakt gebracht werden,
  • b. die Wirkung der Substanzen auf das Testsystem im Vergleich zu Kontrollen gemessen wird,
  • c. eine Substanz, die in Schritt b. eine Modulation der Aktivität von ARAP3 zeigt, identifiziert wird
  • d. und die in Schritt c. identifizierte Substanz mit in der Pharmazie üblichen Formulierungsstoffen gemischt wird.
    • Die Aktivität von ARAP3, die in Schritt b. gemessen wird, ist die Verstärkung der Rezeptorfunktion des eingesetzten nukleären Rezeptors. Bevorzugt sind Steroidhormon-Rezeptoren, besonders bevorzugt ist der Androgenrezeptor.
    Die erfindungsgemäßen Testsysteme können auch zur Testung von Umweltproben verwendet werden. Viele Substanzen in der Umwelt kommen in so niedrigen Konzentrationen vor, dass sie nur einen Effekt auf Steroidhormon-Rezeptoren der Menschen haben, die vermehrt den entsprechenden Coaktivator exprimieren. Durch Verwendung eines erfindungsgemäßen Testsystems könnten diese Substanzen identifiziert werden. Eine genetische Prädisposition für die Wirkung dieser Substanzen kann durch den erfindungsgemäßen Nachweis von ARAP3 bestimmt werden.
    Beschreibung der Abbildungen
    FIG 1 zeigt eine schematische Darstellung des Androgenrezeptors. AF bedeutet Aktivierungsfunktion, DBD DNA-Bindungsdomäne, LBD Ligandenbindungsdomäne und AS steht für Aminosäure. Gezeigt ist das Fragment des Androgenrezeptors (AR2), welches für den Two-hybrid Screen verwendet wurde.
    FIG 2 zeigt eine schematische Darstellung des ARAP3-Polypeptids Seq ID NO 20. Gezeigt ist die Region, die an den Androgenrezeptor bindet, und die Zinkfinger-Domäne.
    FIG 3 zeigt die Gewebsverteilung von ARAP3. Gezeigt ist eine Northernblot Analyse. 2µg humane Poly A+RNA wurden auf einem Gel aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mit einem ARAP3-cDNA-Fragment hybridisiert. kb steht für kilobasen.
    FIG 4 zeigt das Ergebnis eines Säuger-Hybrid-Tests mit dem ARAP3-Fragment AS1430 bis 1539 von Seq ID NO 20 und dem humanen Androgenrezeptor. Der Versuch wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Als positive Kontrolle wurde eine analoges VP16 Konstrukt eines an den Androgenrezeptor bindendes SRC1-Fragment verwendet.
    Beispiele Beispiel 1: Two-hybrid Screen
    Unter Verwendung einer cDNA-Library aus fetalem Gehirn (Clontech MATCHMAKER) und eines humanen AR-Fragments, das für die Aminosäuren 325 bis 919 kodiert, als Sonde (Abbildung 1) wurde ein Screening mittels Hefe-2-Hybrid System in Anwesenheit und Abwesenheit von 10-6 mol Dihydroxytestosteron (DHT) durchgeführt. In Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers (Clontech) betrug die Zahl der gescreenten Klone 3x106 bzw. 2x107. Die Zahl der unabhängigen Klone betrug laut Angaben des Herstellers 3,5x106. Davon wurden 800 positive Klone ausgewählt und mit einem β-Galaktosidase-Assay getestet, wobei 240 als lacZ-positive Klone bestätigt wurden. Die Inserts dieser Klone wurden durch PCR amplifiziert. Mittels Restriktionsfragmentanalysen und Sequenzierung wurden mindestens 17 verschiedene Klone identifiziert. Einer davon war ein Klon mit einem 327 bp umfassenden Insert, das für einen Teil des ORF (Open reading frame) von KIAA1380 kodiert (Genbank-Zugangsnummer AB037801). Dieser Klon wurde beim Screenen der Bibliothek mit und ohne 10-6 mol DHT vierzig Mal identifiziert.
    Mit Hilfe von PCR Techniken wurde dann die ARAP3-cDNA verlängert Dabei wurden verschiedene Spleißvarianten gefunden, welche die Nukleinsäuren 1 bis 13 darstellen. Aus diesen leiten sich 5 Polypeptide mit den Aminosäresequenzen 14 bis 18 ab.
    Beispiel 2: Säuger-Hybrid-Test
    Die Bindung des ARAP3 Fragmentes (AS 1430-1539) an den Androgenrezeptor (AR) wurde im Säuger-Hybrid-Test bestätigt (Abbildung 4) Das ARAP3 Fragment wurde als Fusionsprotein mit VP16 kloniert (CMX-VP16-ARAP3-III). Menschliche PC3 Zellen wurden mit CMX-VP16-ARAP3-III, dem Expressionsvektor, der den vollständigen AR enthält, (pSG5AR) und dem Reportergen Luziferase, welcher unter der Kontrolle des AR abhängigen MMTV Promoters steht (pMMTV-luc), transfektiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Dihydroxytestosteron (DHT) inkubiert. Nach einem weiteren Tag wurden die Zellen lysiert und die Aktivität des Reportergens Luziferase bestimmt. Die Ergebnisse sind normalisiert, anhand der parallel ermittelten Proteingehalte der Ansätze. Als Kontrolle dient ein Ansatz mit dem leeren Expressionsvektor CMX-VP16-leer.
    Beispiel 3: Bestimmung der Comodulator-Aktivität von ARAP3
    Ein eukaryotischer Expressionsvektor, z.B. pCMX, der die ARAP3 cDNA, welche das vollständige ARAP3-Protein oder einen funktionellen Teil kodiert, enthält (pCMX-ARAP3), wird in geeignete Zelllinien, z.B. SH-SY5Y oder PC3 transfektiert, zusammen mit pSG5AR und pMMTV-luc. Als Kontrolle dient ein Ansatz mit dem leeren Expressionsvektor pCMX. Die androgene Aktivität kann anhand der Aktivität des Reporters Luziferase analog zum obigen Beispiel bestimmt werden. Der Effekt von ARAP3 auf das androgene Signal ist bestimmbar durch Vergleich der Aktivität des Kontrollansatzes.
    Beispiel 4: Bestimmung der Bindung von ARAP3 an den Androgenrezeptor mittels Pulldown Experiment
    Als GST Pulldown Experiment bezeichnet man eine Versuchsanordung, die es erlaubt, ein in-vitro exprimiertes GST Fusionsprotein an ein ebenso in-vitro exprimiertes und radioaktiv markiertes Protein zu binden, nachfolgend von nichtinteragierenden Proteinen zu trennen und die gebundenen Proteine nachzuweisen und als Maß für die Bindung anzusehen. Die Experimente wurden entsprechend wie bei Sambrook und Russel, Molecular Cloning, Volume 3, Chapter 18, Protokoll 3 (Seite 18.55 ff); Cold Spring Harbour Laboratory Press; New York 2001 angegeben, durchgeführt:
    Für die Expression wurde ein ARAP3 Fragment (AS 1735 bis 1840 der Seq ID NO 14) als GST Fusionsprotein in den Vektor pGEX-KG (Pharmacia) kloniert und nach den Vorschriften des Herstellers in Bakterienzellen überexprimiert und präpariert. Das ARAP3 Fusionsprotein wurde an Glutathion Sepharose Kügelchen gebunden und mit 35S-Methionin markiertem Androgenrezeptor (pSG5AR mit T7 TNT Retikulozytenlysat der Fa. Promega exprimiert) inkubiert. Anschließend wurde zentrifugierend gewaschen und der gebundene Anteil von Androgenrezeptor an den GST-ARAP3 Kügelchen durch SDS-PAGE und anschließender Autofluografie bestimmt. Bei gleichartiger Behandlung von nichtfusionierten GST-Kügelchen gegenüber GST-ARAP3 Kügelchen in einem Versuchsansatz konnte durch Vergleich der Schwärzungen der Androgenrezeptor Proteinbanden auf dem Hyperfilm (TM Amersham) und Auswertung mittels Dichteintegration ein Bindungsverhältnis gebildet werden. Bezogen auf die durch Western Blot bestimmten Proteineinsatzmengen ergaben sich die validierten Bindungswerte von GST-ARAP3 gegenüber GST-leer, wie sie in Tabelle 2 als Ratio ARAP3 /GST dargestellt werden und als Nachweis für die Bindung von ARAP3 an den Androgenrezeptor anzusehen sind.
    Experiment Protein, Western Bindung, Pulldown RATIO
    NO GST-leer in Vol./µl GST-ARAP3 in Vol./µl GST-leer in Vol./µl GST-ARAP3 in Vol./µl GST-ARAP3 / GST-leer
    1 445 220 160 2094 26,5
    2 833 351 10,6 ∼5000 1122
    3 4614 208 < 1 257 >> 100
    4 349 382 < 1 225 >> 100
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    Claims (17)

    1. Nukleinsäuren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
      a. Nukleinsäuren kodierend für Polypeptide, welche die in Seq ID NO14 bis 18 und 20 dargestellten Aminosäuresequenzen umfassen,
      b. Nukleinsäuren umfassend die in Seq ID NO1 bis 13 und 19 dargestellten Nukleotidsequenzen,
      c. Nukleinsäuren mit einer mit den Sequenzen aus a. und/oder b. unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenzen, die für Polypeptide mit der biologischen Aktivität von Comodulatoren kodieren oder
      d. Nukleinsäuren mit einer der Sequenzen aus a, b oder c im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen.
    2. Polypeptide kodiert von Nukleinsäuren nach Anspruch 1
    3. Polypeptide umfassend die in Seq ID NO 14 bis 18, und 20 dargestellten Aminosäuresequenzen
    4. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 enthält
    5. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder mit einem Vektor nach Anspruch 4 transfiziert ist.
    6. Verwendung einer Zelle nach Anspruch 5 zur Expression der Nukleinsäure nach Anspruch 1
    7. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 2 oder 3 oder eines Teils davon zur Herstellung von Antikörpern.
    8. Antikörper gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 oder 3 oder gegen ein Teil des Polypeptids.
    9. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 8 zur Detektion eines Polypeptids nach Anspruch 2 oder 3.
    10. Verwendung einer Sonde mit Nukleinsäuresequenzen, die komplementär zu den Nukleinsäuresequenzen sind, die für die Polypeptide nach Anspruch 2 oder 3 kodieren, zur Herstellung eines Reagenz zum Nachweis der Gegenwart von mRNA nach Anspruch 1
    11. Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder eines Polypeptids nach Anspruch 2 oder 3 als Zielsubstanz zur Herstellung eines Mittels für Steroidhormon-abhängige Erkrankungen.
    12. Verwendung
      a. einer Nukleinsäure nach Anspruch 1
      b. eines Polypeptids nach Anspruch 2 oder 3,
      c. einer Zelle nach Anspruch 5 zur Identifizierung von Effektoren eines Polypeptids nach Anspruch 2 oder 3.
    13. Testsystem zur Detektion von Effektoren eines Polypeptids nach Anspruch 2 oder 3, wobei
      a. in einer Zelle nach Anspruch 5 ein Reportergen exprimiert wird und
      b. diese Zelle, wenn sie keinen oder nur wenig eines nukleären Rezeptors enthält, zusätzlich mit einem Vektor, der die DNA des nukleären Rezeptors enthält, transfiziert wird,
      c. die Zelle in Gegenwart oder Abwesenheit der Testsubstanzen kultiviert werden und
      d. die Veränderung der Expression des Reportergens gemessen wird.
    14. Testsystem nach Anspruch 13, wobei der nukleäre Rezeptor der Androgenrezeptor ist
    15. Testsystem nach Anspruch 13, wobei die Zelle in Gegenwart oder Abwesenheit der Testsubstanzen bei gleichzeitiger Anwesenheit eines Liganden des nukleären Rezeptors kultiviert wird
    16. Testsystem nach Anspruch 15, wobei der nukleäre Rezeptor der Androgenrezeptor und der Ligand ein Androgen ist.
    17. Verfahren zur Bereitstellung eines pharmazeutischen Mittels, wobei
      a. Substanzen mit einem Testsystem nach Anspruch 13 in Kontakt gebracht werden,
      b. die Wirkung der Substanzen auf das Testsystem im Vergleich zu Kontrollen gemessen wird,
      c. eine Substanz, die in Schritt b. eine Modulation der Aktivität des Polypeptids gemäß Anspruch 2 oder 3 zeigt, identifiziert wird
      d. und die in Schritt c. identifizierte Substanz mit in der Pharmazie üblichen Formulierungsstoffen gemischt wird.
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    DE10135787 2001-07-23

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    EP1288227B1 EP1288227B1 (de) 2006-03-29

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    DE (2) DE10135787A1 (de)
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