ES2261557T3 - Co-moduladores de receptores nucleares. - Google Patents
Co-moduladores de receptores nucleares.Info
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Abstract
Ácidos nucleicos seleccionados entre el grupo que consiste en a. ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con las secuencias de aminoácidos representadas en Seq ID NO 14, 15 y 18, b. ácidos nucleicos con las secuencias representadas en Seq ID NO 1, 3 y 13, poseyendo los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos la función de un co-modulador para receptor nucleares.
Description
Co-moduladores de receptores
nucleares.
El invento se refiere a
co-moduladores de receptores nucleares, a ácidos
nucleicos que codifican éstos y a su utilización para la puesta a
disposición de nuevos medicamentos.
La superfamilia de los receptores nucleares, a
la que pertenecen aproximadamente 50 diferentes proteínas, consiste
en un grupo de factores de transcripción afines, que controlan la
transcripción del respectivo gen diana en dependencia de
determinados ligandos específicos. Esta familia se puede subdividir,
según determinados criterios, tales como, p.ej., el estado de
dimerización, el tipo del ligando o la estructura del elemento de
fijación al ADN, en varias subfamilias (Beato y colaboradores, 2000,
Human Reproduct. Update, 6, 225-236). Una
particularidad característica de los receptores nucleares es la
estructura coincidente de dominios funcionales (con las
denominaciones A hasta F), que consisten en una región terminal en N
fuertemente variable, sólo débilmente conservada, con una función de
activación constitutiva autónoma (AF-1), con un
dominio de fijación al ADN (DBD de DNA Bindung Domäne) fuertemente
conservado, que es responsable del reconocimiento de elementos
especiales de fijación a ADN, y que consiste en dos motivos de dedo
de zinc, en un dominio de bisagra (hinge) variable y en un dominio
de fijación a ligandos (LBD de Ligand Bindung Domäne) terminal en C,
multifuncional y conservado, que consiste en una función de
transactivación (AF-2) dependiente de la
dimerización y de los ligandos. A continuación de esto, sigue la
región situada más lejana en el terminal en C, cuya función no es
conocida y que falta en el caso de receptores tales como p.ej. el PR
(de Progesteron Receptor = receptor de progesterona), el PPAR (de
Peroxisom proliferator aktivierter Receptor = receptor activado por
proliferadores de peroxisomas) y el RXR (de Retinoid X Receptor =
receptor X de retinoides) (Mangelsdorf & Evans, 1995; Cell, 83,
841-850; Robyr y colaboradores, 2000, Mol.
Endocrinol., 14, 329-347). Para algunos receptores
nucleares (p.ej. el AR [de Androgen Receptor = receptor de
andrógenos]) se comprobó que la región terminal en N está en
situación de interactuar con la región terminal en C (Brinkmann y
colaboradores, 1999, J. Steroid Biochem. and Mol. Biol., 69,
307-313). Los receptores de hormonas esteroides,
tales como p.ej. los receptores de estrógenos (ER), de progesterona
(PR), de glucocorticoides (GR), de mineralocorticoides (MR) y de
andrógenos (AR), fijan a ligandos esteroideos, tales como las
progestinas, los estrógenos, los glucocorticoides, los
mineralocorticoides y andrógenos, todos los cuales se derivan de
pregnenolona. La fijación del ligando al NR (de Nuclear Receptor =
receptor nuclear) activa al receptor y controla la expresión de
correspondientes genes dianas.
Además de esto se identificó una clase adicional
de proteínas, la de los denominados co-moduladores,
que, o bien al realizar la activación
(co-activadores) o respectivamente la represión
(co-represores) de la transcripción de genes
desempeñan un importante cometido como moléculas de puente entre el
complejo de iniciación de la transcripción y los receptores
nucleares (McKenna y colaboradores, 1999, Endocr. Rev., 20,
321-347). Un co-activador refuerza
la función de los receptores y, en presencia de un agonista - pero
no, por el contrario, en presencia de un antagonista - interactúa
directamente con el dominio de activación de receptores nucleares.
Éste interactúa también con el aparato de transcripción basal, y,
por el contrario, no refuerza por sí sólo la actividad de
transcripción basal. La mayor parte de los
co-moduladores interactúan con ayuda de uno o varios
motivo(s) LXXLL (cajas de NR) en la secuencia de proteínas
con el dominio AF-2 de los receptores nucleares. Sin
embargo, se describieron también algunos
co-moduladores, que con otros aminoácidos pueden
interactuar con receptores nucleares (Ding y colaboradores, 1998,
Mol. Endocrinol., 12, 302-313). Además de esto, se
identificaron muchos co-moduladores, que
interactúan de una manera similar con varios diferentes receptores
nucleares.
Para un co-activador con
receptor de estrógenos, denominado A1B1, se pudo mostrar que éste es
expresado en grado aumentado en linajes celulares de cáncer de mama
y cáncer de ovario y presumiblemente desempeña un importante
cometido en la evolución de tumores dependientes de hormonas
esteroides (Anzick y colaboradores, 1997, Science
277,965-968).
Junto a la influencia directa sobre los
receptores de hormonas esteroides mediante hormonas o
anti-hormonas, la modulación de la interacción de
co-moduladores con los receptores de hormonas
esteroides sería un punto de aplicación adicional para una terapia
de enfermedades dependientes de hormonas. El problema es, por lo
tanto, encontrar un nuevo co-modulador, con cuya
ayuda se puedan poner a disposición nuevos medicamentos.
El problema se resolvió mediante la puesta a
disposición de ácidos nucleicos seleccionados entre el grupo que
consiste en
- a.
- ácidos nucleicos que codifican polipéptidos, los cuales abarcan las secuencias de aminoácidos representadas en Seq ID NO 14, 15 y 18, y
- b.
- ácidos nucleicos con las secuencias de nucleótidos representadas en Seq ID NO 1, 3 y 13.
Zonas parciales de estas secuencias han sido
publicados en el banco de datos GenBank bajo los números de acceso
AB037801, AK027280 y AK024991. A estos trozos parciales no se les
asignó ninguna función.
Los ácidos nucleicos pueden representar ADN
monocatenarios o bicatenarios, p.ej. ADNc, o ARN, p.ej. ARNm, ARNc,
pre - ARNm.
El invento se refiere además a polipéptidos, que
son codificados por los ácidos nucleicos conformes al invento y que
comprenden las secuencias de aminoácidos representadas en Seq ID NO
14, 15 y 18. Estos polipéptidos conformes al invento se denominan en
lo sucesivo variantes de ARAP3 o, brevemente, ARAP3. Estas variantes
de ácidos nucleicos se expresan de un modo específico para ciertos
tejidos por uso de promotores alternativos así como por tratamiento
alternativo o respectivamente empalme del pre - ARNm (mensajero).
Las variantes de ARAP3 contienen un dominio de dedo de zinc. Ellas
manifiestan homologías con respecto a otros miembros de la familia
de los dominios de dedo de zinc, tales como p.ej. la proteína sin
pelo (hairless) (Cachon-Gonzales y colaboradores,
1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 7717-7721) y la
proteína "a" específica para testículos (Hoog y colaboradores,
1991, Mol. Reprod. Dev., 30, 173-181). Además, para
los aminoácidos terminales en C existe una homología importante con
respecto al dominio jmjC de la familia jumonji (Balciunas y Ronne;
2000, Trends Biochem. Sci. 25, 274-76). El ARAP3
contiene un dominio de localización en núcleos. El ARAP3 se fija al
receptor de andrógenos. La fijación se efectúa a la región de los
aminoácidos 325 a 919 del receptor de andrógenos (véase la Fig. 2
fragmento AR2). El sitio de fijación está situado en las zonas de
los polipéptidos conformes al invento, tal como se indica en la
siguiente Tabla:
| Seq ID NO | Dedo de zinc AS | Dominio de fijación | Dominio de localización | Dominio |
| a receptores de | en núcleos (NLD) | de jmjC | ||
| andrógenos | ||||
| 14 | 1664-1692 | 1732-1841 | 2183-2193 | 2199-2298 |
| 15 | 1858 a 1886 | 1926 a 2035 | 2377 a 2385 | 2393 a 2492 |
| 18 | 390 a 418 | 458 a 567 | 909 a 917 | 925 a 953 part. |
El ARAP3 tiene la función de un
co-modulador de receptores nucleares, especialmente
receptores de hormonas esteroides. Ejemplos de receptores son el
receptor de andrógenos, el receptor \alpha de estrógenos, el
receptor \beta de estrógenos, el receptor A de progesterona, el
receptor B de progesterona, el receptor de glucocorticoides, el
receptor de mineralocorticoides, el receptor de la hormona tiroidea,
el receptor de la vitamina D y el receptor activado por
proliferadores de peroxisomas. Especialmente bien se fija el ARAP3
al receptor de andrógenos. Mediante esta fijación se puede modular,
es decir reforzar o debilitar, la función del receptor.
En un ser humano sano, el ARAP3 es expresado de
modo especialmente intenso en el corazón, en el hígado, en el
testículo y en el ovario.
Además, son objeto del invento vectores que
contienen por lo menos una copia de uno de los ácidos nucleicos
conformes al invento. Los vectores pueden ser vectores procarióticos
o eucarióticos. Ejemplos de vectores son pPRO (de Clontech), pBAD
(de Invitrogen), pSG5 (de Stratagene), pCI (de Promega), pIRES (de
Clontech), pBAC (de Clontech), pMET (de Invitrogen) y pBlueBac (de
Invitrogen). En estos vectores se pueden introducir los ácidos
nucleicos conformes al invento con los métodos conocidos para un
experto en la especialidad. Los ácidos nucleicos conformes al
invento se encuentran preferiblemente en vinculación con señales de
expresión tales como p.ej. un promotor y un intensificador en el
vector.
El invento se refiere además a células, que
están transfectadas con una de las secuencias de ácidos nucleicos
conformes al invento o con un vector conforme al invento. Como
células se pueden utilizar p.ej. las de E. coli, levadura,
Pichia, Sf9, COS, CV-1 o BHK. Estas
células se pueden utilizar para la producción de los polipéptidos
conformes al invento o para sistemas de ensayo.
Los polipéptidos conformes al invento, o zonas
parciales de ellos (péptidos), se pueden utilizar para la producción
de anticuerpos. Para la producción de anticuerpos policlonales, los
polipéptidos o péptidos se pueden unir, p.ej., a KLH (de Keyhole
Limpet Hemocyanin = hemocianina de lapa de bocallave (californiana))
y se pueden inyectar a animales, p.ej. conejos. Ellos se pueden
utilizar también para la producción de anticuerpos monoclonales.
Para la producción de anticuerpos se puede utilizar un polipéptido o
péptido conforme al invento, o una mezcla de varios péptidos
conformes al invento. La producción de los anticuerpos se efectúa en
tal caso de acuerdo con procedimientos clásicos, tal como se
describen, p.ej., en las citas de Kohler, G. y Milstein, C., Nature
1975, 256, 495-497 y Nelson, P. N. y colaboradores,
Mol. Pathol. 2000, 53, 111-117.
Son objeto del invento también los anticuerpos,
que están dirigidos contra los polipéptidos conformes al
invento.
Los anticuerpos conformes al invento se pueden
utilizar para la detección del ARAP3 y sus variantes. Esto puede
efectuarse p.ej. mediante la tecnología inmunohistoquímica. Los
anticuerpos conformes al invento se pueden emplear también en otros
ensayos inmunitarios, tales como p.ej. en un ELISA (de enzyme linked
inmunosorbent assay = ensayo de inmunosorbente enlazado a enzimas) o
en ensayos radioinmunológicos. De esta manera, se puede detectar la
concentración del ARAP3 en extractos de tejidos o células.
La detección de la expresión de los polipéptidos
conformes al invento se puede efectuar también por medio de la
detección de un ARNm (mensajero) en las células. Es objeto del
invento, por lo tanto, también la utilización de una sonda con
secuencias de ácidos nucleicos, que son complementarias con las
secuencias de ácidos nucleicos, que codifican el ARAP3, para la
preparación de un reactivo destinado a la detección de la presencia
del ARNm conforme al invento en células. Una sonda es un corto trozo
de ADN con por lo menos 14 nucleótidos. Las sondas conformes al
invento se pueden utilizar, p.ej., en un análisis de transferencia
de borrón Northern. Este método se describe, p.ej., en la cita de
Sambrook, J. y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Otros métodos para la detección del ARN son una hibridación
in situ, un ensayo de protección con RNAsa o una PCR (de
polymerase chain reaction = reacción en cadena de polimerasa).
La detección de la expresión del ARAP3 se emplea
sobre todo en el caso de enfermedades dependientes de andrógenos.
Así, p.ej. una elevada activabilidad por andrógenos puede ser
atribuida a una actividad aumentada como
co-activador del ARAP3 en el caso de enfermedades
tales como cáncer de próstata e hiperplasia benigna de próstata y en
el caso de acné o también de la caída del pelo. Una actividad
disminuida como co-activador se puede presentar, por
el contrario, también en los casos de hipogonadismo, disfunción
eréctil y síndromes insensibles a andrógenos, tales como p.ej. el
síndrome de feminización testicular. En los casos de estas
enfermedades puede ser perturbado el equilibrio del receptor de
andrógeno con el co-activador. Por lo tanto, es
conveniente determinar en el mismo tejido, junto a la cantidad del
ARAP3 expresado, también la cantidad del receptor de andrógeno
expresado. La proteína de receptor de andrógenos puede ser
determinada asimismo mediante métodos inmunológicos tales como p.ej.
un inmunoensayo radiológico, un ELISA o una transferencia de borrón
Western.
Un objeto del invento es la utilización del
ARAP3, o de los ácidos nucleicos que lo codifican, como sustancia
diana para la preparación de un agente destinado al tratamiento de
enfermedades dependientes de hormonas esteroides. Tales enfermedades
dependientes de hormonas esteroides pueden ser, junto a las
enfermedades dependientes de andrógenos, antes mencionadas, también
p.ej. enfermedades dependientes de estrógenos, tales como p.ej.
cáncer de mama y osteoporosis, o enfermedades cardiocirculatorias y
enfermedades vasculares. También se podría utilizar el ARAP3 como
sustancia diana para la preparación de medicamentos destinados a
influir sobre la fertilidad masculina.
En particular, el invento abarca la
utilización
- a.
- de un ácido nucleico conforme al invento,
- b.
- de un polipéptido conforme al invento, o
- c.
- de una célula conforme al invento,
para la identificación de efectores de
ARAP3.
Los efectores son sustancias que actúan
inhibiendo o activando sobre el ARAP3 y que están en situación de
influir sobre las funciones del ARAP3, que resultan a causa de las
interacciones por fijación del ARAP3 a una molécula diana. Son
preferidas aquellas sustancias que modulan la interacción del ARAP3
con el receptor de andrógenos. Esto se puede ensayar p.ej. midiendo
la fijación del polipéptido ARAP3 purificado al polipéptido del
receptor de andrógenos en presencia de sustancias que se han de
ensayar, y comparándola con el valor testigo, que es averiguado sin
las sustancias que se han de ensayar. La fijación puede ser
determinada mediante marcadores, que están fijados al ARAP3 o al
receptor de andrógenos. Tales marcadores pueden ser p.ej. marcadores
fluorescentes, biotina o marcadores radiactivos.
Otra posibilidad para la identificación de
efectores es la utilización de una célula, que contiene el ADNc
(cromosómico) del ARAP3 o de una parte funcional de éste, el ADNc
del receptor de andrógenos o de otro receptor nuclear, y el ADNc de
un gen reportero. Como gen reportero se puede utilizar p.ej.
luciferasa. La actividad de la luciferasa refleja en este caso la
fijación del receptor nuclear. Las células se incuban en presencia
de las sustancias que se han de ensayar, y se determina la actividad
de la luciferasa. La incubación puede efectuarse también
adicionalmente en presencia del ligando del vector nuclear. Así,
p.ej., se pueden medir efectos antagonistas. Se prefiere la
utilización del receptor de andrógenos y de su ligando, que es un
andrógeno.
Los efectores de ARAP3 se pueden emplear para el
tratamiento de enfermedades dependientes de hormonas esteroides. En
los casos de enfermedades, que se basan p.ej. en una fuerte
activabilidad por andrógenos, se puede administrar un agente
inhibidor de la interacción de ARAP3 y del receptor de andrógenos, y
en el caso de enfermedades, que se basan en una actividad disminuida
como co-activador, se puede administrar un agente
estimulador de esta interacción.
Las enfermedades, que se basan en un defecto del
ARAP3, se pueden tratar también mediante una modificación de la
concentración del ARAP3 en los tejidos afectados. Para esto, se
puede llevar, o bien un ácido nucleico conforme al invento con ayuda
de un vector habitual en la terapia génica, o un polipéptido
conforme al invento, al tejido. En el caso de la terapia génica, se
construye y aplica un vector, que contiene un ácido nucleico
conforme al invento. Son ejemplos de ellos vectores, que se derivan
de adenovirus, de virus asociados a adenovirus, de virus del herpes
simple o de SV40. La terapia génica se puede llevar a cabo también
de acuerdo con un protocolo tal como ha sido descrito por
Gómez-Navarro, J. y colaboradores (Eur. J. Cancer
1999, 35, 867-885). La aplicación puede efectuarse
por vía local, es decir directamente, en el tejido afectado, tal
como p.ej. el tumor, o por vía sistémica, es decir a través de la
circulación sanguínea. Esto conduce a un expresión aumentada del
ARAP3.
La aplicación del ARAP3 puede efectuarse en
forma de un polipéptido de fusión. Mediante el polipéptido
fusionado, p.ej. EGF o transferrina, el polipéptido conforme al
invento es transportado de manera preferente al tejido deseado,
p.ej. al tejido de tumor.
Las enfermedades pueden deberse también a una
sobre-expresión de ARAP3. De esta manera, los
receptores nucleares son sensibilizados de una manera tan intensa,
que pueden ser activados no solamente por sus ligandos sino también
por otras sustancias, que en condiciones fisiológicas no muestran
ningún efecto. En uno de tales casos, es deseable disminuir la
expresión del ARAP3. Esto puede efectuarse mediante moléculas
antisentido. Estas moléculas son complementarias con las secuencias
de ácidos nucleicos representadas en Seq ID NO 1, 3 y 13 o con
partes de las mismas.
Además, es objeto del invento un procedimiento
para la puesta a disposición de un agente farmacéutico, en el
que
- a.
- se ponen en contacto sustancias con un sistema de ensayo conforme al invento,
- b.
- se mide el efecto de las sustancias sobre el sistema de ensayo, en comparación con el de testigos,
- c.
- se identifica una sustancia, que en la etapa b. muestra una modulación de la actividad del ARAP3,
- d.
- y la sustancia identificada en la etapa c. se mezcla con sustancias para formulaciones usuales en la farmacia.
La actividad del ARAP3, que se mide en la etapa
b., es el aumento de la función como receptor del receptor nuclear
empleado. Se prefieren receptores de hormonas esteroides, y se
prefiere especialmente el receptor de andrógenos.
Los sistemas de ensayo conformes al invento se
pueden utilizar también para ensayar muestras del medio ambiente.
Muchas sustancias se presentan en el medio ambiente en unas
concentraciones tan bajas, que ellas solamente pueden tener un
efecto sobre receptores de hormonas esteroides de un ser humano, que
expresan de un modo acrecentado el co-activador
correspondiente. Mediante utilización de un sistema de ensayo
conforme al invento, se podrían identificar estas sustancias. Una
predisposición genética para el efecto de estas sustancias se puede
determinar mediante la detección conforme al invento del ARAP3.
La Fig. 1 muestra una representación esquemática
del receptor de andrógenos. AF significa función de activación, DBD
significa dominio de fijación a ADN, LBD significa dominio de
fijación a ligandos y AS significa aminoácidos. Se muestra el
fragmento del receptor de andrógenos (AR2) que se había utilizado
para el escrutinio de dos híbridos (Two-hybrid
Screen).
La Figura 2 muestra la distribución en los
tejidos del ARAP3. Se muestra un análisis por transferencia de
borrón Northern. 2 \mug de ARN poli A+ humano se separaron en un
gel, se transfirieron a una membrana y se hibridaron con un
fragmento de ADNc del ARAP3. kb representa kilobases.
Mediando utilización de una biblioteca de ADNc
procedente de un cerebro fetal (Clontech MATCHMAKER) y de un
fragmento de AR humano, que codifica los aminoácidos 325 a 919, como
sonda (Figura 1), se llevó a cabo un escrutinio mediante el sistema
de 2 híbridos de levadura, en presencia y en ausencia de 10^{-6}
moles de dihidroxi-testosterona (DHT). En
coincidencia con las instrucciones del fabricante (Clontech) el
número de los clones escrutados fue de 3x10^{6} y respectivamente
2x10^{7}. El número de los clones independientes fue de
3,5x10^{6}, de acuerdo con los datos del fabricante. De éstos se
seleccionaron 800 clones positivos y se ensayaron con un ensayo de
\beta-galactosidasa, confirmándose 240 como clones
positivos para lacZ. Los insertos de estos clones fueron
amplificados por una PCR. Mediante análisis de fragmentos de
restricción y secuenciación se identificaron por lo menos 17
diferentes clones. Uno de ellos era un clon con un inserto que
abarcaba 327 pb (pares de bases), el cual codifica una parte del ORF
(de open reading frame = marco de lectura abierto) de KIAA1380
(número de acceso al banco de genes AB037801). Este clon se
identificó cuarenta veces en el escrutinio de la biblioteca con y
sin 10^{-6} moles de DHT.
Con ayuda de técnicas de PCR se prolongó luego
el ADNc de ARAP3. En tal caso se encontraron diferentes variantes de
empalme, que representan a los ácidos nucleicos 1, 3 y 13. A partir
de éstos se pueden derivar 3 polipéptidos con las secuencias de
aminoácidos 14, 15 y 18.
Un vector de expresión eucariótico p.ej. el
pCMX, que contiene el ADNc de ARAP3, que codifica la proteína ARAP3
completa o una parte funcional de ella (pCMX-ARAP3),
se transfecta en linajes celulares apropiados, p.ej. el
SH-SY5Y o PC3, conjuntamente con los pSG5AR y
pMMTV-luc. Como testigo sirve una tanda con el
vector de expresión pCMX vacío. La actividad andrógena se puede
determinar con ayuda de la actividad del reportero luciferasa, de
una manera análoga a la del Ejemplo anterior. El efecto del ARAP3
sobre la señal andrógena es determinable por comparación de la
actividad de la tanda testigo.
Como experimento Pulldown GST se designa a una
disposición de ensayo que permite fijar una proteína de fusión de
GST, expresada en vitro, a una proteína asimismo expresada in
vitro y marcada radiactivamente, seguidamente separarla de
proteínas que no interactúan y detectar las proteínas fijadas, y
considerarlas como una medida de la fijación. Los experimentos se
llevaron a cabo de una manera correspondiente a como se indica en la
cita de Sambrook y Russel, Molecular Cloning, volumen 3, capítulo
18, protocolo 3 (páginas 18.55 y siguientes); Cold Spring Harbour
Laboratory Press; Nueva York 2001.
Para la expresión, se clonó un fragmento ARAP3
(AS de 1735 a 1840 de la Seq ID NO 14) se clonó como proteína de
fusión con GST en el vector pGEX-KG (de Pharmacia) y
se sobreexpresó y preparó de acuerdo con las prescripciones del
fabricante en células bacterianas. La proteína de fusión con ARAP3
se fijó a esferitas de Sepharose con glutatión y se incubó con un
receptor de andrógenos, marcado con 35S-metionina
(pSG5AR expresado con un material lisado de reticulocitos T7 TNT de
la entidad Promega). A continuación, se lavó centrifugando y se
determinó, mediante una SDS-PAGE y una subsiguiente
autofluografía, la proporción del receptor de andrógenos que se
había fijado a las esferitas de GST-ARAP3. En el
caso de un tratamiento del mismo tipo de esferitas de GST no
fusionadas, en comparación con el de esferitas de
GST-ARAP3, en una tanda de ensayo, por medio de una
comparación de los ennegrecimientos de las bandas de proteínas del
receptor de andrógenos en la película Hyperfilm (de TM
Amersham) y evaluación mediante integración de las densidades, se pudo formar una relación de fijaciones. Referido a las cantidades empleadas de proteínas, que se determinaron mediante una transferencia de borrón Western, resultaron los valores validados de fijación de GST-ARAP3 frente a GST-vacío, tal como se representan en la Tabla 2 como relación de ARAP3/GST y que se han de considerar como comprobación de la fijación del ARAP3 al receptor de
andrógenos.
Amersham) y evaluación mediante integración de las densidades, se pudo formar una relación de fijaciones. Referido a las cantidades empleadas de proteínas, que se determinaron mediante una transferencia de borrón Western, resultaron los valores validados de fijación de GST-ARAP3 frente a GST-vacío, tal como se representan en la Tabla 2 como relación de ARAP3/GST y que se han de considerar como comprobación de la fijación del ARAP3 al receptor de
andrógenos.
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| Experimento | Proteína, Western | Fijación, Pulldown | Relación | |||||
| Nº | GST-vacío | GST-ARAP3 | GST-vacío | GST-ARAP3 | GST-ARAP3/ | |||
| en vol/\mul | en vol/\mul | en vol/\mul | en vol/\mul | GST-vacío | ||||
| 1 | 445 | 220 | 160 | 2.094 | 26,5 | |||
| 2 | 833 | 351 | 10,6 | \sim5000 | 1.122 | |||
| 3 | 4.614 | 208 | < 1 | 257 | >> 100 | |||
| 4 | 349 | 382 | < 1 | 225 | >> 100 |
<110> Jenapharm GMBH & Co
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Co-moduladores de
receptores nucleares
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 52145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8734
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 1
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<211> 8734
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3781
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 8734
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 953
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
Claims (13)
1. Ácidos nucleicos seleccionados entre el
grupo que consiste en
- a.
- ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con las secuencias de aminoácidos representadas en Seq ID NO 14, 15 y 18,
- b.
- ácidos nucleicos con las secuencias representadas en Seq ID NO 1, 3 y 13,
poseyendo los polipéptidos
codificados por los ácidos nucleicos la función de un
co-modulador para receptor
nucleares.
2. Polipéptidos codificados por ácidos
nucleicos de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Polipéptidos que comprenden las secuencias
de aminoácidos representadas en Seq ID NO 14, 15 y 18.
4. Vector, caracterizado porque
contiene por lo menos una copia de un ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 1.
5. Célula, caracterizada está
transfectada con un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación
1 o con un vector de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Utilización de una célula de acuerdo con la
reivindicación 5 para la expresión del ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 1.
7. Utilización de un polipéptido de acuerdo
con la reivindicación 2 ó 3 para la producción de anticuerpos.
8. Utilización de un ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 1 o de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 2 ó 3 como sustancia diana para la preparación de un
agente para enfermedades dependientes de hormonas esteroides.
9. Utilización
- a.
- de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1,
- b.
- de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3,
- c.
- de una célula de acuerdo con la reivindicación 5 para la identificación de efectores de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3.
10. Sistema de ensayo para la detección de
efectores de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3,
en el que
- a.
- en una célula de acuerdo con la reivindicación 5 se expresa un gen reportero y
- b.
- esta célula, cuando no contiene ningún receptor nuclear o sólo poca cantidad de un receptor nuclear, se transfecta adicionalmente con un vector, que contiene el ADN del receptor nuclear,
- c.
- la célula se cultiva en presencia o ausencia de las sustancias de ensayo, y
- d.
- se mide la modificación de la expresión del gen reportero.
11. Sistema de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que el receptor nuclear es el receptor de
andrógenos.
12. Sistema de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que la célula se cultiva en presencia o
ausencia de la sustancia de ensayo en el caso de la presencia
simultánea de un ligando del receptor nuclear.
13. Sistema de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el receptor nuclear es el receptor de
andrógenos y el ligando es un andrógeno.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE10135787 | 2001-07-23 | ||
| DE10135787A DE10135787A1 (de) | 2001-07-23 | 2001-07-23 | Coaktivator von nukleären Rezeptoren |
Publications (1)
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|---|---|
| ES2261557T3 true ES2261557T3 (es) | 2006-11-16 |
Family
ID=7692769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02015042T Expired - Lifetime ES2261557T3 (es) | 2001-07-23 | 2002-07-05 | Co-moduladores de receptores nucleares. |
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|---|---|
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| JP (1) | JP2003144179A (es) |
| AT (1) | ATE321780T1 (es) |
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| ES (1) | ES2261557T3 (es) |
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| PT (1) | PT1288227E (es) |
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2001
- 2001-07-23 DE DE10135787A patent/DE10135787A1/de not_active Withdrawn
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2002
- 2002-07-05 ES ES02015042T patent/ES2261557T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-05 DE DE50206196T patent/DE50206196D1/de not_active Expired - Fee Related
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| PT1288227E (pt) | 2006-07-31 |
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