EP1267950A1 - Procede d'inactivation virale de solutions hydro-alcooliques - Google Patents

Procede d'inactivation virale de solutions hydro-alcooliques

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EP1267950A1
EP1267950A1 EP01921455A EP01921455A EP1267950A1 EP 1267950 A1 EP1267950 A1 EP 1267950A1 EP 01921455 A EP01921455 A EP 01921455A EP 01921455 A EP01921455 A EP 01921455A EP 1267950 A1 EP1267950 A1 EP 1267950A1
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EP
European Patent Office
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culture medium
virus
hours
starting material
hydro
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Withdrawn
Application number
EP01921455A
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Inventor
Anne-Marie Binsard
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Boiron SA
Original Assignee
Laboratoires Dolisos
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/02—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using physical phenomena
    • A61L2/04—Heat
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A61L2/0023—Heat

Definitions

  • the present invention relates to a method of viral inactivation of any hydro-alcoholic solution and in particular of homeopathic dilutions.
  • homeopathy the most often used therapeutic substances are more or less diluted solutions, which are the active principles of drugs.
  • Homeopathic dilutions are most often performed by the Hahnemann method. They are carried out in a hydroalcoholic mixture of appropriate title. They require work while avoiding any contamination or contamination of a chemical or particulate nature, given the tiny doses of active ingredient most often used.
  • Viral infections are a major public health problem; they are linked to the ingestion of contaminated food or drink, the environment or contact between people. Numerous viral inactivation methods have been implemented to fight against such infections.
  • the viral inactivation methods used must make it possible to inactivate viruses which are potentially dangerous for the patient while retaining the biological properties of the blood derivatives, and the implementation of such methods is always difficult.
  • the inventors have surprisingly found that by moderately heating the homeopathic dilutions made from a mixture of water and ethanol overloaded with virus, at temperatures compatible with their therapeutic activity, the inactivation of the virus, due to a synergy of action between the ethanol present in these dilutions and the heating maintained for a sufficient period.
  • the subject of the present invention is therefore a process for viral inactivation of any hydroalcoholic solution and in particular homeopathic dilutions, characterized in that it comprises a step of heating to a temperature between 39 ° C. and 65 ° C ⁇ 1 ° C, for at least one hour, in the presence of ethanol of alcoholic strength between 10% v / v and 75% v / v.
  • the homeopathic dilutions are chosen from the group consisting of Hahnemannian dilutions, Korsakowian dilutions and Vintage dilutions.
  • the duration of the heating is between at least 1 hour and 24 hours.
  • the temperature is between 39 ° C and 54 ° C ⁇ 1 ° C.
  • the minute mouse virus belongs to the family of Parvoviridae, genus Parvovirus. It is an unenveloped virus, icosahedral symmetry, 18 to 26 nm in diameter. The genome is a single-stranded DNA molecule with a negative polarity of 5 kb.
  • Parvoviruses are very diverse, species specific, but some of them cross the species barrier, moreover they have exceptional physicochemical properties.
  • Parvoviruses are contaminants of rodents (rats, mice, hamsters) and carnivores (cats, dogs etc.).
  • the tissues carrying Parvorivus are mainly: the kidney, the pancreas, the lung, the lymphoid tissues, the bone marrow, the testes. They can give many and varied infections: diarrhea, enteritis, hepatitis ...
  • viruses are highly resistant to high temperatures (60 to 80 ° C), dehydration, variations in pH and solvent / detergent treatments. Also it is difficult to inactivate or eliminate these viruses in products during or after the pharmaceutical production process.
  • the MNM prototype strain
  • the pellet is resuspended in aliquoted PBS buffer and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C.
  • the titer is determined by the agarose plaque method on A9 cells.
  • the virus stock used has a titer of 5.2 ⁇ 10 7 plaque-forming units per milliliter (UFP / ml).
  • A9 cells (Deutsch.es Krebsforschungtechnik, Heidelberg) from a continuous line of mouse fibroblasts. These cells are cultivated in DMEM at 4.5 g / 1 of glucose, 110 ⁇ g / 1 of sodium pyruvate and 1.1 g / 1 of sodium bicarbonate, supplemented with 4 mM of glutamine and 5% of fetal calf serum.
  • Samples were taken after 1 hour, 3 hours and 8 hours of incubation at the rate of two samples per time (A and B). These were immediately diluted in culture medium and ultracentrifuged at 95,000 rpm for 20 minutes at approximately 4 ° C. (Beckman TLA 100.4 rotor). The pellet was resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • the zero time of the experiment was counted down as soon as the temperature of the overloaded starting material reached the lower limit of the tested temperature.
  • the temperature of the experiments was monitored and recorded using calibrated probes or thermometers.
  • the average reduction factor called m (R) is obtained by calculating the difference between the logarithms of the mean titles of each sample concerned.
  • NI Stock of virus diluted in culture medium, aliquoted and frozen at - 75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • N2 Stock of virus diluted in culture medium and ultracentrifuged as described above. The pellet will be resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • L3 Stock of virus diluted in culture medium, left at room temperature (16 ° C - 26 ° C) for the duration of the experiment, then ultracentrifuged as described above. The pellet will be resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • the pellet will be resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • the first overload was used for the 1 hour, 3 hour, 8 hour and 10 hour time samples.
  • the second overload was used for the 1 hour, 4 pm and 8 pm pickups. 2.1.5. Incubation and titration
  • the overloaded starting material was incubated at 54 ° C ⁇ 1 ° C, without shaking, for 20 hours.
  • the zero time of the experiment started when the temperature of the overloaded starting material reached the lower limit of the tested temperature.
  • Samples were taken after 1 hour, 3 hours, 8 hours, 10 hours, 16 hours and 20 hours of incubation. These were immediately cooled, diluted in culture medium and ultracentrifuged at 95,000 rpm for 20 minutes at approximately 4 ° C (Beckman TLA 100.4 rotor). The pellets were resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration. The temperature of the experiments was monitored and recorded using calibrated probes or thermometers.
  • the average reduction factor called m (R) is obtained by calculating the difference between the logarithms of the mean titles of each sample concerned.
  • VI Stock of virus diluted in culture medium, aliquoted and frozen at - 75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • V2 Stock of virus diluted in culture medium and ultracentrifuged as described above. The pellet was resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • V3 Stock of virus diluted in culture medium, left at room temperature (16 ° C - 26 ° C) for the duration of the experiment, then ultracentrifuged as described previously. The pellet was resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • V4 Stock of virus diluted in the culture medium heated to 54 ° C ⁇ 1 ° C for 16 hours (V4 a) and 20 hours (V4 b), then ultracentrifuged as described above. The pellet was resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • Ll Overloaded starting material diluted 50 times in culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.
  • L3 Overloaded starting material (2nd overload) left at room temperature for 16 hours (L3a) and 20 hours (L3b) then ultracentrifuged as before. The pellet was resuspended in the culture medium, aliquoted and frozen at -75 ° C ⁇ 5 ° C until titration.

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Abstract

Procédé d'inactivation virale de toute solution hydro-alcoolique et notamment de toute dilution homéopathique réalisée en milieu hydro-alcoolique caractérisé en ce qu'on chauffe à une température comprise entre 39 °C et 65 °C + 1 °C, pendant au moins une heure, en présence d'éthanol de titre alcoolique compris entre 10 % v/v et 75 % v/v.

Description

Procédé d'inactivation virale de solutions hydroalcooliques .
La présente invention se rapporte à un procédé d' inactivation virale de toute solution hydro-alcoolique et notamment de dilutions homéopathiques.
En homéopathie, les substances thérapeutiques les plus souvent utilisées sont des solutions plus ou moins diluées, qui sont les principes actifs des médicaments. Les dilutions homéopathiques sont réalisées le plus souvent par la méthode de Hahnemann. Elles sont effectuées dans un mélange hydro-alcoolique de titre approprié. Elles nécessitent de travailler en évitant toute souillure ou contamination de nature chimique ou particulaire, étant donné les doses infimes de principe actif le plus souvent mises en jeu.
Parmi les matières premières utilisées en homéopathie, on fait appel à des substances d'origine animale (venin de serpent, venin d'abeille) et/ou d'origine biologique susceptibles d'être contaminées par des virus potentiellement pathogènes et dangereux pour les patients.
Les infections virales sont un problème important de santé publique; elles sont liées à l'ingestion d'aliments ou de boissons contaminés, à l'environnement ou aux contacts entre les personnes. De nombreux procédés d' inactivation virale ont été mis en œuvre pour lutter contre de telles infections.
Ainsi dans le cadre des collectivités (hôpitaux, écoles, maisons de retraites), afin d'éviter les épidémies de gastro-entérites dues aux virus de type Norwalk et Norwalk, Doultree J.C. et al . (Journal of Hospital Infection, 1999, 41, 51-57) ont montré que parmi les désinfectants classiquement utilisés, le glutaraldéhyde, les dérivés iodés et l'eau de javel étaient aptes à détruire le virus alors que les dérivés d'ammonium quaternaire, les détergents et l' ethanol à une concentration de 75% étaient sans effet. Ces auteurs ont également montré que la totale inactivation du virus n'est obtenue qu'après une heure de chauffage à 56°C et après 5 minutes à une température de 70°C.
Dans le cas des dérivés sanguins d'origine humaine ou animale, qui sont utilisés à des fins thérapeutiques, prophylactiques ou de diagnostiques chez l'homme et qui présentent un risque élevé d'infection pour les patients (SIDA, hépatite-C, etc.), l' inactivation virale est fondamentale .
Toutefois dans le cas de ces dérivés, les méthodes d' inactivation virale utilisées doivent permettre d' inactiver les virus potentiellement dangereux pour le patient tout en conservant les propriétés biologiques des dérivés sanguins, et la mise en œuvre de tels procédés est toujours délicate.
De plus l'ensemble des virus n'étant pas sensible aux mêmes agents, il est souvent nécessaire de combiner différentes techniques d' inactivation, ce qui complique la mise en œuvre des procédés.
Parmi les différentes méthodes d' inactivation utilisées dans ce cadre, on peut notamment citer le chauffage des dérivés sanguins en solution aqueuse ou à l'état sec, le traitement de ces dérivés par des détergents et des solvants, éventuellement suivi d'un chauffage du produit à l'état sec. Compte tenu de la nécessité d'apporter une garantie de l' inactivation virale dans les préparations à usage homéopathique, la mise au point de nouveaux procédés adaptés, rapides et économiques permettant d' inactiver un grand nombre de virus s'avère nécessaire.
Or les Inventeurs ont trouvé de manière surprenante qu'en chauffant de façon modérée les dilutions homéopathiques réalisées à partir d'un mélange d'eau et d' ethanol surchargées en virus, à des températures compatibles avec leur activité thérapeutique, on obtenait une inactivation du virus, du fait d'une synergie d'action entre l' ethanol présent dans ces dilutions et le chauffage maintenu pendant une durée suffisante.
Aussi la présente invention a-t-elle pour objet un procédé d' inactivation virale de toute solution hydro- alcooolique et en particulier des dilutions homéopathiques, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de chauffage à une température comprise entre 39°C et 65°C ± 1°C, pendant au moins une heure, en présence d' ethanol de titre alcoolique compris entre 10 % v/v et 75% v/v.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les dilutions homéopathiques sont choisies dans le groupe constitué par les dilutions Hahnemanniennes, les dilutions Korsakowiennes et les dilutions Millésimales.
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la durée du chauffage est comprise entre au moins 1 heure et 24 heures. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, la température est comprise entre 39°C et 54 °C ± 1°C. Le procédé selon l'invention est facile à mettre en œuvre et permet d' inactiver des virus particulièrement résistants à tout traitement physico-chimique, notamment les virus de la famille des Parvoviridae, du genre Parvovirus, comme le virus minute de la souris {Minute virus Mi ce ou MNM) .
Les exemples 1 et 2 qui suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Exemple 1
1.1 Matériel et méthode 1.1.1. Dilution homéopathique
Du venin de serpent à la dilution 3 CH (3ème Dilution Centésimale Hahnemannienne) réalisée dans de l' ethanol à 40 % (v/v) a été utilisé comme matériel de départ. Il est dénommé Lachesi s 3CH.
1.1.2 Virus minute de la souris (MNM)
Le virus minute de la souris appartient à la famille des Parvoviridae, genre Parvovirus. C'est un virus non enveloppé, de symétrie icosaédrique, de 18 à 26 nm de diamètre. Le génome est une molécule d'ADN simple brin, de polarité négative de 5 kb.
Les Parvovirus sont très diversifiés, spécifiques d'espèces, mais certains d'entre eux traversent la barrière des espèces, de plus ils ont des propriétés physico-chimiques exceptionnelles .
La majorité des Parvovirus sont des contaminants de rongeurs (rats, souris, hamsters) et des carnivores (chats, chiens etc.). Les tissus porteurs de Parvorivus sont principalement: le rein, le pancréas, le poumon, les tissus lymphoïdes, la moelle osseuse, les testicules. Ils peuvent donner des infections nombreuses et variées: diarrhées, entérites, hépatites...
Ces virus présentent une grande résistance, aux hautes températures (60 à 80° C) , à la déshydratation, aux variations de pH et aux traitements solvant/détergent . Aussi il est difficile d' inactiver ou d'éliminer ces virus dans les produits pendant ou après le processus de production pharmaceutique.
Le MNM (souche prototype) est obtenu à partir du surnageant de culture de cellules A9 infectées. Après clarification à 3500 rpm (Sigma 3K2) pendant 15 minutes, les cellules sont collectées et remises en suspension dans du tampon PBS (8,0 g/1 ΝaCl, 1,44 g/1 Νa2HP04, 2H20, 0,2 g/1 KC1, 0,2 g/1 KH2P04, pH=7,4), soniquées, clarifiées à 2500 rpm pendant 10 minutes, aliquotées et congelées à -75°C ± 5°C. Les surnageants sont concentrés par ultracentrifugation à 19 000 rpm pendant 15 heures
(rotor Beckman R19) . Le culot est remis en suspension en tampon PBS aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C. Le titre est déterminé par la méthode des plages en agarose sur cellules A9. Le stock de virus utilisé a un titre de 5,2.107 unités formant plages par millilitre (UFP/ml) .
1.1.3. Cellules
Il s'agit des cellules A9, (Deutsch.es Krebsforschungzentrum, Heidelberg) issues d'une lignée continue de fibroblastes de souris. Ces cellules sont cultivées en DMEM à 4,5 g/1 de glucose, 110 ιtιg/1 de pyruvate de sodium et 1,1 g/1 de bicarbonate de sodium, additionné de 4 mM de glutamine et de 5% de sérum de veau fœtal .
1.1.4 .Préparation des échantillons surchargés en virus
100 ml de matériel de départ surchargé avec du MVM à la concentration finale de 1,72.106 unités formant plages par millilitre (UFP/ml) ont été préparés à température ambiante (16°C-26°C) .
1.1.5. Incubation et titrage
Après homogénéisation, un échantillon a été prélevé pour les contrôles positifs Ll, L2 et L3. Le matériel de départ surchargé a été divisé en deux parties de 45 ml chacune. Chaque partie a été ensuite incubée soit à 39°C ± 1°C, soit à 54°C ± 1°C, sans agitation pendant 8 heures .
Des prélèvements ont été réalisés après 1 heure, 3 heures et 8 heures d'incubation à raison de deux prélèvements par temps (A et B) . Ceux-ci ont été immédiatement dilués en milieu de culture et ultracentrifugés à 95 000 rpm pendant 20 minutes à environ 4°C (rotor Beckman TLA 100.4). Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à - 75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
Le temps zéro de l'expérience a été décompté dès que la température du matériel de départ surchargé a atteint la limite inférieure de la température testée. La température des expériences a été contrôlée et enregistrée à l'aide de sondes ou de thermomètres calibrés . Le facteur de réduction moyen appelé m(R) est obtenu en calculant la différence entre les logarithmes des titres moyens de chaque échantillon concerné.
1.1.6. Témoins
NI : Stock de virus dilué en milieu de culture, aliquoté et congelé à - 75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
N2 : Stock de virus dilué en milieu de culture et ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot sera remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
N3 : Stock de virus dilué en milieu de culture, laissé à température ambiante (16°C - 26°C) pendant la durée de l'expérience, puis ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot sera remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
Ll : Matériel de départ surchargé dilué 50 fois en milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
L2 : Matériel de départ surchargé dilué en milieu de culture et ultracentrifugé comme décrit précédemment.
Le culot sera remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
L3: Matériel de départ surchargé, laissé à température ambiante (16°C - 2β°C) pendant la durée de l'expérience puis ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot sera remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage. 1.2. Résultats
1.2.1. Témoins sans chauffage
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 et exprimés en unité formant plages par millilitre (UFP/ml) . Le venin de serpent à la dilution 3CH (3eme Dilution Centésimale Hahnemannienne) réalisée dans l' ethanol à 40% v/v et ultracentrifugé n'a présenté aucune toxicité pour les cellules du titrage du MNM non dilué (témoin négatif Ν2) . Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée au cours de l'ultracentrifugation du MVM surchargé, soit dans le milieu de culture (V2 comparé à VI) , soit dans le matériel de départ (L2 comparé à Ll) . Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée lors de l'incubation à la température du laboratoire pendant la durée de l'expérience du MVM surchargé soit dans du milieu de culture (V3 comparé à V2) , soit dans le matériel de départ (L3 comparé à L2) .
1.2.2. Effet du chauffage en présence d' ethanol
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 2 et exprimés en unité formant plages par millilitre (UFP/ml) . Les résultats obtenus montrent qu'un chauffage à
39°C ± 1°C en présence d' ethanol à 40% (v/v ) ne permet pas d' inactiver le MVM, même après 8 heures d'incubation.
En revanche, le chauffage à 54°C ± 1°C dans les mêmes conditions a permis d'observer une inactivation progressive du virus MVM au cours du temps pour atteindre 2,77 log (prélèvement A) et 2,84 log (prélèvement B) après 8 heures. Tableau 1
Tableau 2
Exemple 2
2.1. Matériel et méthode
2.1.1.Dilution homéopathique
Du venin de serpent à la dilution 3DH (3ème Dilution Décimale Hahnemannienne) réalisée dans de l' ethanol à 40% v/v, a été utilisé comme matériel de départ et dénommé Lachesis 3DH (lot n° PA 482) .
2.1.2. Virus Minute de la Souris (MVM) II est obtenu selon le mode opératoire décrit en
1.1.2.
2.1.3. Cellules
Elles sont cultivées selon le mode opératoire décrit en 1.1.3.
2.1.4. Préparation des échantillons surchargés en virus
L'expérience a été réalisée en double (Expériences
A et B) à 54 °C ± 1°C sur 6 temps de contact avec une dilution 3DH (3ème Dilution Décimale Hahnemannienne) réalisée dans de l' ethanol à 40% v/v de la souche
Lachesis .
Deux surcharges indépendantes ont été réalisées à température ambiante (lβ°C - 26°C) avec le virus MVM, de manière à avoir une concentration finale en MVM de
2,26.107 UFP/ml.
La première surcharge a été utilisée pour les prélèvements aux temps 1 heure, 3 heures, 8 heures et 10 heures. La deuxième surcharge a été utilisée pour les prélèvements aux temps 1 heure, 16 heures et 20 heures. 2.1.5. Incubation et titrage
Le matériel de départ surchargé a été incubé à 54°C ± 1°C, sans agitation, pendant 20 heures.
Le temps zéro de l'expérience a débuté lorsque la température du matériel de départ surchargé a atteint la limite inférieure de la température testée.
Des prélèvements ont été réalisés après 1 heure, 3 heures, 8 heures, 10 heures, 16 heures et 20 heures d'incubation. Ceux-ci ont été immédiatement refroidis, dilués en milieu de culture et ultracentrifugés à 95 000 rpm pendant 20 minutes à environ 4°C (rotor Beckman TLA 100.4) . Les culots ont été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquotés et congelés à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage. La température des expériences a été contrôlée et enregistrée à l'aide de sondes ou de thermomètres calibrés.
Le facteur de réduction moyen appelé m (R) est obtenu en calculant la différence entre les logarithmes des titres moyens de chaque échantillon concerné.
2.1.6. Témoins
VI: Stock de virus dilué en milieu de culture, aliquoté et congelé à - 75°C ± 5°C jusqu'au titrage. V2 : Stock de virus dilué en milieu de culture et ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à - 75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
V3: Stock de virus dilué en milieu de culture, laissé à température ambiante (16°C - 26°C) pendant la durée de l'expérience, puis ultracentrifugé comme décrit précédemment . Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
V4 : Stock de virus dilué dans le milieu de culture chauffé à 54 °C ± 1°C pendant 16 heures (V4 a) et 20 heures (V4 b) , puis ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture , aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage. Ll: Matériel de départ surchargé dilué 50 fois en milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
L2 : Matériel de départ surchargé dilué en milieu de culture et ultracentrifugé comme décrit précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
L3 : Matériel de départ surchargé (2ème surcharge) laissé à la température ambiante pendant 16 heures (L3a) et 20 heures (L3b) puis ultracentrifugé comme précédemment. Le culot a été remis en suspension dans le milieu de culture, aliquoté et congelé à -75°C ± 5°C jusqu'au titrage.
2.2. Résultats 2.2.1 Témoins
*Effet du matériel de départ sur l r infectlvité des virus
Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée lorsque le virus était dilué dans le matériel de départ, Lachesis 3DH, (3eme Dilution Décimale Hahnemannienne) réalisée dans de 1' ethanol à 40% v/v puis stocké à - 75 °C ± 5°C jusqu'au titrage [Ll (3,16 ± 0,44).107 comparé à VI (3,64 ± 0,67) .107] . *Effet de 1 ' ul tracentrifugation sur l r infectivité des virus
Pour le virus MVM dilué en milieu de culture, aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée [V2 (3,64 ± 0,67).107 comparé à VI]. En revanche, une perte significative de particules infectieuses a été observée lorsque le virus dilué dans le matériel de départ a été ultracentrifugé.
Cette perte de particules infectieuses est probablement due au matériel de départ et non aux conditions d' ultracentrifugation utilisées. Toutefois, cette perte de particules infectieuses ne sera pas prise en compte dans le calcul du facteur de réduction de 1' étape.
*Effet du chauffage à 54 °C ± 1 °C du virus en milieu de culture
Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée après 20 heures de chauffage à 54 °C ± 1°C du milieu de culture surchargé avec du MVM [V4 a (8,44 ± 1,44).106 comparé à V2] et [V4 b (9,46 ± 1,52).106 comparé à V2]
*Effet de la durée de l r expérience sur l ' infectivi té du virus dilué en matériel de départ
Aucune perte significative de particules infectieuses n'a été observée après 16 heures et 20 heures d'incubation à température ambiante du matériel de départ surchargé [L3a (3,04 ± 0,86).106 comparé à L2 (1,13 ± 0,17).10°] et [L3b (1,60 ± 0,31).10° comparé à L2] .
2.2.2. Effet du chauffage en présence d' ethanol Les résultats sont rassemblés dans les tableaux 3.A et 3.B et exprimés en unité formant plages par millilitre (UFP/ml) .
Le chauffage à 54°C ± 1°C de la dilution 3DH (3ème
Dilution Décimale Hahnemannienne) réalisée dans de 1' ethanol à 40% v/v de la souche Lachesis permet
1' inactivation du MVM de façon très significative après
20 heures.
En effet, une perte de 2,90 log (Expérience A) et de 2,80 log (Expérience B) a été obtenue. Des résultats similaires ont été obtenus pour les 2 cinétiques réalisées.
Tableau 3.A
Tableau 3.B

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d' inactivation virale de toute solution hydro-alcoolique et notamment de toute dilution homéopathique réalisée en milieu hydro-alcoolique caractérisé en ce qu'on chauffe à une température comprise entre 39°C et 65°C ± 1°C, pendant au moins une heure, en présence d' ethanol de titre alcoolique compris entre 10% v/v et 75% v/v.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dilution homéopathique est choisie dans le groupe constitué par les dilutions Hahnemanniennes, les dilutions Korsakowiennes et les dilutions Millésimales .
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la durée du chauffage est comprise entre au moins 1 et 24 heures.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la température est comprise entre 39°C et 54°C ± 1°C.
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