EP1264178A2 - Anordnung und verfahren zur untersuchung von wirkstoffen zur beeinflussung intrazellulärer vorgänge - Google Patents

Anordnung und verfahren zur untersuchung von wirkstoffen zur beeinflussung intrazellulärer vorgänge

Info

Publication number
EP1264178A2
EP1264178A2 EP01925461A EP01925461A EP1264178A2 EP 1264178 A2 EP1264178 A2 EP 1264178A2 EP 01925461 A EP01925461 A EP 01925461A EP 01925461 A EP01925461 A EP 01925461A EP 1264178 A2 EP1264178 A2 EP 1264178A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fcs
fluorescence
measurement
addition
dimers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01925461A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Georg Bohnert
Juan Camacho-Gomez
Omar Steffen Kirschstein
Leonhard Kittler
Tobias Neumann
Eberhard Unger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jenoptik AG
Original Assignee
Carl Zeiss Jena GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Jena GmbH filed Critical Carl Zeiss Jena GmbH
Publication of EP1264178A2 publication Critical patent/EP1264178A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels

Definitions

  • active substances such as paciitaxel or vinblastine can be detected, which limit the viability of cells by disturbing the assembly balance or the assembly dynamics of proteins and protein complexes.
  • the method is therefore suitable for contributing to the development of cancerostatics and cytocids (fungicides, herbicides, etc.).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the binding of both proteins is detected by the simultaneous detection of both fluorescent labels in the focused volume of the microscope.
  • the detection of the binding takes place via the difference in the diffusion rate between the fluorescence-labeled protein which is not bound to the significantly larger partner protein, which has a high diffusion rate, or the fluorescence-labeled protein which is bound to the significantly larger partner protein, which is a significantly lower rate and thus has a distinguishable diffusion rate.
  • the FCS is . a modern measuring method. Fluorescence events originating from individual molecules are registered and statistically evaluated using a correlation analysis. From these ensemble statistics one can determine the diffusion speed, which allows conclusions to be drawn about the size and the binding behavior of molecular-biological reactions.
  • the FCS works via confocal imaging with a cw laser excitation. Individual molecules diffuse through the defined detection volume (femtoliter) and a photon shower is emitted by the fluorescence label, which is registered by an Avelange diode. The photon showers can only be differentiated if the concentration of the fluorescent molecules is less than 10 "8 M, which means that this method can be used to study such small amounts of molecules down to the picomole range.
  • Assemblable proteins such as. B. tubulin, actin, tau protein, are an indispensable part of the cells. Balances of these proteins between their monomeric, oligomeric and polymeric form are a necessary prerequisite for life.
  • the invention is based on influencing exchange kinetics irrf assembly equilibrium of proteins and protein complexes, the disruption of these exchange kinetics z. B. by active ingredients and the detection of these disorders. This makes it possible to detect the effects of active substances in concentration ranges close to the pharmacologically achievable conditions.
  • the special progress of this method lies in the focus on minimal changes in equilibrium due to the lowest active substance concentrations instead of the otherwise usual influencing of the assembly of proteins and protein complexes by means of pharmacologically unreachable high active substance concentrations.
  • This invention attains particular value by overcoming the problem of having to use rapid assays with drug concentrations that are too high or pharmacologically relevant drug concentrations in complex and expensive assays that are not suitable for high throughput screening (HTS).
  • This test can be carried out in microtiter format and is therefore suitable for HTS in large substance libraries.
  • the installation depends on the equilibrium and the exchange kinetics between polymer (microtubule) and dimer.
  • the assembly is, for example, in a buffer of the composition:
  • Tubuiindimeren now becomes a small amount of 10 "9 M rhodamine-labeled tubulin
  • FCS Fluorescence correlation measurement
  • a temperature control plate is advantageously provided under the sample vessel, which has a recess for the optical path of the
  • Microscope has.
  • Figure 1a shows the decrease in the proportion of "faster” dimers based on the decrease in diffusion time
  • Figure 1b shows the increase in "slow” polymers until equilibrium is reached
  • Active ingredients such as paciitaxel or vinblastine, both used against human cancers, are able to hinder this exchange between tubulin dimer and polymer in substoichiometric proportions.
  • the pharmacologically relevant potential of the above-mentioned active ingredients is therefore not to prevent or shift the equilibrium between the protein polymer and dimer at clearly substoichiometric concentrations, but rather to hinder the dynamic exchange in equilibrium in whole or in part.
  • this property of the microtubules as well as other assemblable proteins is a prerequisite for the cells to live. Cancer cells with their increased metabolism require the flexibility of the microtubules • more than somatic cells, which is one reason for the relatively selective action of the above-mentioned active substances against cancer cells.
  • the active ingredient can be added here in pharmacologically relevant concentrations.
  • the effect of substances with a known effect on the kinetics described can be followed up to concentrations of 10 "11 M.
  • a small amount of, for example, 10 "9 M rhodamine-labeled tubulin (or another fluorescence-labeled tubulin) in the tubulin assembly buffer described above is now dissolved in this solution of the adjusted equilibrium between microtubules and tubuiindimers.
  • An FCS measurement is again carried out in a microtiter plate At the beginning of the measurement, only fluorescence-labeled tubulin dimers with a fast diffusion constant are present in the solution and can be detected on the basis of the diffusion time.
  • a temperature control plate can be provided under the X / Y table, which maintains the set temperature of the assembly equilibrium and one
  • sample vessels can be combined in a microtiter plate (MTP), the pipetting and subsequent measurement in an opening of the MTP without
  • Active ingredients can be added and in further openings the measurement with added active ingredient.
  • Throw averaged and at least one second value is determined in at least one second scanning step and a time course is determined in this way.
  • the measured value or measured value course of the measurement without active ingredient is stored and in each case with measured values or value courses with the addition of
  • Actin is generally stored at -80 ° C
  • Buffer to a concentration of 1 mg / ml and let stand for at least 1 hour.
  • tau protein is stored at -80 ° C. Then thawed at 4 ° C, diluted with 10mM Tris pH 7.2, containing DTT or ß-mercaptoethanol and at
  • ATP adenosine triphosphate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Verfahren zur Untersuchung von Wirkstoffen, die zur Beeinflussung intrazellulärer Vorgänge vorgesehen sind, wobei einem Assemblierungsgleichgewicht assemblierungsfähiger Proteine mindestens ein Wirkstoff zugegeben wird und nach Zugabe von fluoreszenzmarkierten Monomeren und/oder Dimeren eine erste Fluoreszenzkorrelationsmessung (FCS) erfolgt.

Description

Anordnung und Verfahren zur Untersuchung von Wirkstoffen zur Beeinflussung intrazellulärer Vorgänge
• Problemstellung
Mittels der bisher verwendeten Testmethoden, lassen sich Wirkstoffe nachweisen, welche über Störungen des Assemblierungsgleichgewichts oder der Assemblatdynamik von Proteinen und Proteinkomplexen die Lebensfähigkeit von Zellen einschränken. Jedoch sind diese. Methoden nur bei hohen und damit pharmakologisch nicht relevanten Wirkstoffkonzentrationen durchführbar oder bei pharmakologisch relevanten Wirkstoffkonzentrationen sehr aufwendig, oder z. B. auf die Verwendung radioaktiv markierter Isotope angewiesen.
• Lösung des Problems
Mittels einer neuartigen Screeningmethode, die auf der FCS basiert, lassen sich Wirkstoffe, wie zum Beispiel Paciitaxel oder Vinblastin nachweisen, welche über Störungen des Assemblierungsgleichgewichts oder der Assemblatdynamik von Proteinen und Proteinkomplexen die Lebensfähigkeit von Zellen einschränken. Die Methode ist damit geeignet, Beiträge zur Entwicklung von Cancerostatika und Cytociden (Fungzide, Herbicide, ect.) zu leisten.
Mit Hilfe der Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) kann die Bindung von Fluoreszenz-markierten Proteinen an andere Proteine in Lösungen gemessen werden , entweder a) durch Fluoreszenzmarkierung beider Proteine mit unterschiedlichen Markierungen oder b) durch Bindung eines Fluoreszenz-markierten Proteins an ein nicht markiertes Protein, welches deutlich größer ist.
In Fall a erfolgt der Nachweis der Bindung beider Proteine durch die gleichzeitige Detektion beider Fluoreszenzmarkierungen im fokussierten Volumen des Mikroskops. In Fall b erfolgt der Nachweis der Bindung über den Unterschied in der Diffusionsgeschwindigkeit zwischen dem Fluoreszenz-markierten nicht an das deutlich größere Partnerprotein gebundene Protein, was eine hohe Diffusionsgeschwindigkeit aufweist oder dem Fluoreszenz-markierten an das deutlich größere Partnerprotein gebundene Protein, was eine deutlich niedrigere und damit unterscheidbare Diffusionsgeschwindigkeit aufweist.
Bei der FCS handelt es. sich um ein moderne Meßmethode. Fluoreszenzereignisse die von einzelnen Molekülen ausgehen, werden registriert und statistisch über eine Korrelationsanalyse ausgewertet. Aus dieser Ensemblestatistik kann man die Diffusiongeschwindigkeit ermitteln, die den Rückschluß auf Größe und das Bindungsverhalten molekular-biologischer Reaktionen erlaubt. Die FCS funktioniert über eine konfokale Abbildung mit einer cw-Laser Anregung. Einzelne Moleküle diffundieren durch das so definierte Detektionsvolumen (Femtoliter) und ein Photonenschauer wird durch die Fluoreszenzlabel emittiert, der von einer Avelange Diode registriert wird. Die Photonenschauer sind nur differenzierbar, wenn die Konzentration der fluoreszierenden Moleküle kleiner als 10"8M beträgt, wodurch man mit dieser Methode solch kleine Molekülmengen bis in den Pikomolbereich untersuchen kann.
Assemblierungsfähige Proteine, wie z. B. Tubulin, Actin, Tau-Protein, stellen einen unabdingbaren Bestandteil der Zellen dar. Gleichgewichte dieser Proteine zwischen ihrer monomeren, oligomeren als auch polymeren Form sind eine notwendige Voraussetzung für das Leben.
Die Erfindung beruht auf der Beeinflussung von Austauschkinetiken irrf Assemblierungsgleichgewicht von Proteinen und Proteinkomplexen, die Störung dieser Austauschkinetiken z. B. durch Wirkstoffe und die Detektion dieser Störungen. Dadurch ist die Detektion von Wirkstoffeinflüssen in Konzentratiohsbereichen nahe an den pharmakologisch erreichbaren Bedingungen möglich. Der besondere Fortschritt dieser Methode liegt in der Fokussierung auf minimale Gleichgewichtsänderungen durch niedrigste Wirkstoffkonzentrationen an Stelle der sonst üblichen Beeinflussung der Assemblierung von Proteinen und Proteinkomplexen mittels pharmakologisch nicht erreichbar hoher Wirkstoffkonzentrationen. Besonderen Wert erlangt diese Erfindung durch die Überwindung der Problematik schnelle Assays mit zu hohen Wirkstoffkonzentrationen oder pharmakologisch relevante Wirkstoffkonzentrationen in aufwendigen und teuren, nicht High throughput screening (HTS)-tauglichen Assays verwenden zu müssen.
Dieser Test kann im Mikrotiterformat durchgeführt werden und ist somit für ein HTS in großen Substanzbibliotheken geeignet.
• Ausführungsbeispiele:
Als Beispiel für die Suche nach. Substanzen mit Wirkung auf Polymer- Oligomergleichgewichtskinetiken wird der Einbau von rhodaminmarkiertem Tubulin, kommerziell erhältlich zum Beispiel bei der Firma Cytoskeleton, Artikelnr. T331/M, in präformierte Mikrotubuli unter quasi physiologischen Bedingungen angegeben.
Der Einbau ist vom Gleichgewicht sowie der Austauschkinetik zwischen Polymer (Mikrotubulus) und Dimer abhängig.
Zur Assemblierung der Mikrotubuli verwendet man eine Lösung von ca 1 mg/ml Tubulin (ca. 10"5M) hergestellt in bekannter Weise, beispielsweise gemäß Shelanski et al.:
Shelanski ML, Gaskin F and Gantor CR 1973 Microtubule assembly in the absence of added nucleotides Proc Natl Acad Sei USA 70 765-768
. Die Assemblierung wird beispielsweise in einem Puffer der Zusammensetzung:
20 mM Pipes 12,096 g
1 mM EGTA 0,76 g
80 mM NaCI 9,35 g
0,5 mM MgCI2 0,0952 g MgCI2 x 6 H20 0,2033 g
1 mM DTT 0,308 g auf 2 I A. dest, pH 6,8 oder anderen allgemein bekannten Testpuffern für die Tububulinassemblierung pH 5,8- 9,5 bei der physiologischen Temperatur 37°C unter Zugabe von GTP (Guanosin Triphosphat) als Energiequelle, beispielsweise in einer Küvette, durchgeführt. Hierbei stellt sich innerhalb von etwas 15-20 Minuten ein Gleichgewicht zwischen Mikrotubuli (Polymer) und dem Tubulindimer (Molmasse 110 kDa) ein. Dieses Gleichgewicht ist dynamisch, und durch einen ständigen Austausch von Tubuiindimeren zwischen Polymer und gelöster Form gekennzeichnet.
In eine Lösung des eingestellten Gleichgewichtes zwischen Mikrotubuli und
Tubuiindimeren wird jetzt eine kleine Menge 10"9M Rhodamin-markiertes Tubulin
(oder ein anderes fluoreszenz-markiertes Tubulindimer) im oben beschriebenen
Tubulinassemblierungspuffer gelöst, zugefügt.
Durch Pipettierung in ein geeignetes Gefäß, beipielsweise in eine Mikrotiterplatte , wird nunmehr eine Fluoreszenz- Korrelatiönsmessung FCS ( Carl Zeiss : Confocor) durchgeführt und der Verlauf der Diffusionszeit ermittelt.
Zur Erhaltung der eingestellten Temperatur ist vorteilhaft unter dem Probengefäß eine Temperierplatte vorgesehen, die eine Ausnehmung für den optischen Weg des
Mikroskopes aufweist.
Zu Beginn der Messung sind nur Fluoreszenz-markierte Tubulindimere mit einer schnellen Diffusionskoήszeit in der Lösung vorhanden und detektierbar. Im Laufe der
Zeit kann mit Hilfe der FCS der Einbau der Fluoreszenz-markierten Tubulindimere in die Polymere verfolgt werden, wobei es zu einer Gleichgewichtseinstellung zwischen
Fluoreszenz-markiertem Polymer und Dimer kommt.
In Abbildung 1a ist anhand der Abnahme der Diffusionszeit die Abnahme des Anteils " schneller" Dimere, in Abbildung 1b die Zunahme " langsamer" Polymere bis zum Erreichen eines Gleichgewichtes dargestellt
Wirkstoffe, wie Paciitaxel oder Vinblastin, beide in der Anwendung gegen humane Krebserkrankungen, sind befähigt, diesen Austausch zwischen Tubulindimer und Polymer in substöchiometrischen Verhältnissen zu behindern. Das pharmakologisch relevante Potential dieser o. g. Wirkstoffe liegt also darin, bei deutlich substöchiometrischen Konzentrationen nicht die Einstellung des Gleichgewichts zwischen Protein-Polymer und -Dimer zu verhindern oder zu verschieben, sondern den dynamischen Austausch im Gleichgewicht ganz oder teilweise zu behindern. In diesem Fall spricht man von der Beeinflussung der dynamischen Instabilität der Mikrotubuli. Diese Eigenschaft der Mikrotubuli als auch anderer assemblierungsfähiger Proteine stellt aber eine Lebensvoraussetzung für die Zellen dar. Krebszellen mit ihrem erhöhten Stoffwechsel benötigen die Flexibilität der Mikrotubuli •mehr als somatische Zellen, was ein Grund für die relativ selektive Wirkung der o. g. Wirkstoffe gegen Krebszellen darstellt.
Wiederholt man den oben beschriebenen Versuch (Assemblierung, Puffer) und versetzt man die Assemblierungsmischung von 10'5M Tubulin mit Wirkstoffen wie beispielsweise 10"8M bis 10"11M Paciitaxel oder 10"8M bis 10"9M Vinblastin so entstehen wiederum Mikrotubuli, welche im Gleichgewicht mit nicht polymerisiertem Tubuiindimeren vorliegen.
Besonders vorteilhaft ist, daß der Wirkstoff hier in pharmakologisch relevanten Konzentrationen beigegeben werden kann. Die Wirkung von Substanzen mit bekannter Wirkung auf die beschriebenen Kinetiken (Nocodazole, Taxol) kann bis zu Konzentrationen von 10"11 M verfolgt werden.
In diese Lösung des eingestellten Gleichgewichtes zwischen Mikrotubuli und Tubuiindimeren wird jetzt eine kleine Menge von beispielsweise 10"9M Rhodamin- markiertes Tubulin (oder ein anderes fluoreszenz-markiertes Tubulin) im oben beschriebenen Tubulinassemblierungspuffer gelöst, zugefügt. Nach Pipettierung in ein geeignetes Probengefäß, beipielsweise in eine Mikrotiterplatte wird wiederum eine FCS -Messung durchgeführt. Zu Beginn der Messung sind nur Fluoreszenz-markierte Tubulindimere mit einer schnellen Diffusionskonstanten in der Lösung vorhanden und anhand der Diffusionszeit detektierbar.
Im Laufe der Zeit kann mit Hilfe der FCS der Einbau der Fluoreszenz-markierten Tubulindimere in die Polymere verfolgt werden, wobei es durch den eingesetzten Wirkstoff zu einer Verzögerung der Gleichgewichtseinstellung zwischen Fluoreszenz-markiertem Polymer und Dimer kommen kann. In Abbildung 2 ist im Vergleich die zeitabhängige Abnahme des Anteils schneller Dimere unter Zugabe eines Wirkstoffes ( oben) im Vergleich zur vorher ( Abbildung 1 ) gemessenen Abnahme ohne Wirkstoff ( unten) dargestellt. In Abbildung 3 ist die Abnahmerate unterschiedlicher Wirkstoffe im Vergleich zur Abnahmerate ohne Wirkstoff, wie anhand Abbildung 1 erläutert, dargestellt. Deutlich wird, daß vorteilhaft in einem einfachem Testsystem die Wirkung von
Testsubstanzen auf die Austauschgeschwindigkeiten im
Assemblierungsgleichgewicht assemblierungsfähiger Proteine nachgewiesen werden.
Ein solches Testsystem kann vorteilhaft durch Modifikation eines inversen FCS -
Mikroskopes Confocor mittels eines X/Y Tisches zur Ansteuerung unterschiedlicher
Probengefäße erfolgen.
Vorteilhaft kann unter dem X/Y Tisch eine Temperierplatte vorgesehen sein, die die eingestellte Temperatur des Assemblierungsgleichgewichtes beibehält und eine
Öffnung zum Durchsatz der Meßstrahliung aufweist.
Die Probengefäße können in einer Mikrotiterplatte ( MTP) zusammengefaßt werden, wobei in einer Öffnung der MTP die Pipettierung und anschließende Messung ohne
Zugabe von Wirkstoffen erfolgen kann und in weiteren Öffnungen die Messung mit zugegebenem Wirkstoff.
Für die zeitabhängige Messung gibt es zwei Möglichkeiten:
Entweder es wird für jede Probe, der Verlauf über beispielsweise 5-10 Minuten ermittelt oder mittels Abasterung von unterschiedlicjhen Proben jeweils ein erster
Werf errnittel und in mindestens einem zweiten Abrasterschritt jeweils mindestens ein zweiter Wert ermittelt wird und auf diese Weise ein zeitlicher Verlauf bestimmt wird. .
Der Meßwert bzw. Meßwertverlauf der Messung ohne Wirkstoff wird abgespeichert und jeweils mit gemessenen Werten bzw. Wertverläufen unter Zugabe von
Wirkstoffen verglichen.
Auf diese Weise kann der Einfluß unterschiedlicher Wirkstoffe auf den dynamischen
Austauch bei Zugabe von fluoreszenzmarkierten Stoffen ermittelt und auf diese
Weise die Wirkung der Wirkstoffe auf Krebszellen beurteilt werden.
Dieses oben beschriebene Testsystem ist HTS-fähig und auf eine einfache Ja-Nein-
Entscheiduήg bezüglich der Beeinflussung der Austauschgeschwindigkeiten zwischen Protein und Proteinassemblat zurückzuführen. Gleichzeitig ist es robust und kommt mit geringen Proteinmengen aus. Weitere assemblierungsfähige Proteine für die Erzeugung eines
Assemblierungsgleichgewichtes sind :
1. Aktin:
Im allgemeinen wird Aktin bei -80°C aufbewahrt
Man taut Aktin im Wasserbad (37°C) von -S0°C auf und unmittelbar nach dem
Auftauen gibt man das Aktin in ein Eisbad oder 4°C Kühlschrank. Man verdünnt mit
Puffer bis auf eine konzentration von 1 mg/ml und läßt mindestens 1 Stunde stehen.
Danach wird 12 Stunden bei Kühlschranktemperatur gelagert. Danach wird die endgültige Konzentration von 250nM bis 2,4μM eingestellt.
2.Tau protein:
David M. Wilson and Lester I. Binder:
"Polymerization of Microtubule-associated Protein Tau under
Near-physiological Conditions" The Journal of Biological Chemistry
Vol 270, N . 41 i pp. 24306-24314. 1995 "
Conditions for Tau Polimerization-
Im allgemeinen wird Tau protein bei -80°C aufbewahrt. Dann wird bei 4°C aufgetaut, verdünnt mit 10mM Tris pH 7,2, enthaltend DTT oder ß-Mercaptoethanol und bei
37°C inkubiert. Die endgültige Proteinkonzentration beträgt 1 bis 10 μM.
Bei Verwendung von Puffern mit pH < 7 wird 10ÖmM MES verwendet.
Anmerkung:
MES: ß -Morpholino-ethansulfonsaeure
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
DTT: Dithiothreitol
Bei 1. und 2. kann neben GTP auch ATP (Adenosin Triphosphat) als Energiequelle eingesetzt werdxen

Claims

Patentansprüche
1.
Verfahren zur Untersuchung von Wirkstoffen , die zur Beeinflussung intrazellulärer
Vorgänge vorgesehen sind, wobei einem Assembiierungsgleichgewicht assemblierungsfähiger Proteine mindestens ein Wirkstoff zugegeben wird und nach Zugabe von fluoreszenzmarkierten Monomeren und/ oder Dimeren eine erste
Fluoreszenzkorrelationsmessung (FCS) erfolgt
2.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine zweite FCS Messung nach Zugabe von fluoreszenzmarkierten Monomeren und/ oder Dimeren in ein
Assemblierungsgleichgewicht ohne Wirkstoffzugabe erfolgt und die gemessenen
Werte verglichen werden.
3.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche .wobei eine
Abspeicherung und Vergleich der bei der ersten und zweiten FCS-Messung gemessenen Werte erfolgt.
4. .
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erste
FCS Messung für unterschiedliche Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen wiederholt und jeweils mit der zweiten FCS Messung verglichen wird.
5.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei der ersten und zweiten FCS Messung der zeitabhängige Verlauf der Diffusionszeit ermittelt wird.
6.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei der zeitabhängigen Ermittlung mittels mindestens der ersten FCS - Messung bei unterschiedlichen Proben nacheinander ein zeitabhängiger Verlauf ermittelt wird.
7.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mittels
Abrasterung unterschiedlicher Proben zunächst für die Proben ein erster Wert und nach Abrasterung weiterer Proben für die Proben mindestens ein weiterer Wert ermittelt wird.
8.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Messung nach der Zugabe der fluoreszenzmarkierten Substanzen erfolgt.
9.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Wirkstoffe wie z.B. Paciitaxel , Nocodazol, Vinoblastin , Colchicin untersucht werden.
10. .
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei als assemblierungsfähige Proteine z. B. Tubulin, F-actin oder Tau Protein verwendet werden.
11.
Anordnung zur Untersuchung von Wirkstoffen , die zur Beeinflussung intrazellulärer Vorgänge vorgesehen sind , wobei eine erste Fluoreszenzkorrelationsmessung (FCS) eines Assemblierungsgleichgewicht assemblierungsfähiger Proteine unter Zugabe mindestens eines Wirkstoffes und von fluoreszenzmarkierten Monomeren und/ oder Dimeren erfolgt.
12.
Anordnung nach Anspruch 11, wobei eine zweite FCS Messung eines Assemblierungsgleichgewichtes, unter Zugabe von fluoreszenzmarkierten Monomeren und/ oder Dimeren ohne Wirkstoffzugabe erfolgt und die gemessenen Werte der ersten und zweiten Messung verglichen werden.
13.
Anordnung nach Anspruch 11 oder 12, mit einer mikroskopischen Anordnung zur FCS Messung , vorzugsweise einem inversen Mikroskop, wobei eine Detektion von Probenbehältern erfolgt, in die die Substanzen gemäß Anspruch 11 oder 12ρipettiert werden.
14.
Anordfnung nach einem der Ansprüche 11-13, wobei bei der FCS Messung der zeitabhängige Verlauf der Diffusionszeit ermittelt wird.
15.
Anordnung nach einem der Ansprüche 11-14, wobei eine X/Y Verstelleinheit zur
Detektion unterschiedlicher Probengefäße vorgesehen ist.
16.
Anordnung nach einem der Ansprüche 11-15, wobei die Probengefäße temperiert werden.
EP01925461A 2000-03-17 2001-03-15 Anordnung und verfahren zur untersuchung von wirkstoffen zur beeinflussung intrazellulärer vorgänge Withdrawn EP1264178A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10013854 2000-03-17
DE10013854A DE10013854A1 (de) 2000-03-17 2000-03-17 Anordnung und Verfahren zur Untersuchung von Wirkstoffen zur Beeinflussung intrazellulärer Vorgänge
PCT/EP2001/002922 WO2001068680A2 (de) 2000-03-17 2001-03-15 Anordnung und verfahren zur untersuchung von wirkstoffen zur beeinflussung intrazellulärer vorgänge

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1264178A2 true EP1264178A2 (de) 2002-12-11

Family

ID=7635682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP01925461A Withdrawn EP1264178A2 (de) 2000-03-17 2001-03-15 Anordnung und verfahren zur untersuchung von wirkstoffen zur beeinflussung intrazellulärer vorgänge

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20040023228A1 (de)
EP (1) EP1264178A2 (de)
DE (1) DE10013854A1 (de)
WO (1) WO2001068680A2 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014011441B4 (de) * 2014-08-07 2020-03-19 Autogyro Ag Tragschrauber

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4301005A1 (de) * 1993-01-18 1994-07-21 Diagen Inst Molekularbio Verfahren und Vorrichtung zur Bewertung der Fitness von Biopolymeren
JP3517241B2 (ja) * 1993-01-18 2004-04-12 エボテック バイオシステムズ アクチェン ゲゼルシャフト 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置
DE19533092A1 (de) * 1995-09-07 1997-03-13 Basf Ag Vorrichtung zur parallelisierten Zweiphotonen-Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (TPA-FCS) und deren Verwendung zum Wirkstoff-Screening
WO1997021832A1 (de) * 1995-12-08 1997-06-19 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zur bestimmung von nukleinsäuremolekülen in niedriger konzentration
AU9541398A (en) * 1997-09-19 1999-04-12 Evotec Biosystems Gmbh Method for measuring the association of substructures of pathological protein deposits
DE19757740C2 (de) * 1997-12-23 2000-04-13 Evotec Biosystems Ag Verfahren zum Nachweis von Assoziations-, Dissoziations-, Verknüpfungs- oder Spaltreaktionen sowie Konformationsänderungen mittels Koinzidenzanalyse
US6872537B1 (en) * 1998-04-14 2005-03-29 Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
US6582907B1 (en) * 1999-12-09 2003-06-24 Pharmacia & Upjohn Company Use of fluorescence correlation spectroscopy to identify compounds that bind to target species under isothermal denaturing conditions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0168680A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001068680A2 (de) 2001-09-20
DE10013854A1 (de) 2001-09-20
WO2001068680A3 (de) 2002-08-22
US20040023228A1 (en) 2004-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60038127T2 (de) Methoden und syteme zur überwachung intrazellulärer bindereaktionen
DE69329274T2 (de) Hämatologisches Kontrollprodukt mit Leukozytenanalogen; und Methoden zu ihrer Herstellung und Anwendung
Keij et al. Staining of mitochondrial membranes with 10‐nonyl acridine orange MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs
DE69328772T2 (de) Suspensionsmedien für hämatoligische zusammensetzungen und methode für ihren gebrauch
EP0679251B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur bewertung der fitness von biopolymeren
EP1248947B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur charakterisierung einer kulturflüssigkeit
DE69022819T2 (de) Verbindungen und Reagenzien zur Bestimmung von Retikulozyten.
DE2953524A1 (de) Biologisches messverfahren
DE69905291T2 (de) Bioluminenztest für agonisten oder antagonisten eines kalzium-gekuppelten-rezeptors
EP0946855A1 (de) Verfahren und vorrichtungen zur distanzmessung zwischen objektstrukturen
Augustine Combining patch-clamp and optical methods in brain slices
EP3491364B1 (de) Kombiniertes optisch-spektroskopisches verfahren zur bestimmung von mikrobiellen erregern
EP2167940B1 (de) Verfahren zum bestimmen eines messwerts auf der basis von einzelmolekülereignissen
Patrizio et al. Counting numbers of synaptic proteins: absolute quantification and single molecule imaging techniques
DE60214561T2 (de) Fluorimetrische Multi-Parameter-Analyse in einer parallelen Multi-Fokus-Anordnung
DE60010323T2 (de) Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie zur identifizierung von verbindung-ziel-bindung
EP1264178A2 (de) Anordnung und verfahren zur untersuchung von wirkstoffen zur beeinflussung intrazellulärer vorgänge
DE102008060991A1 (de) Subtrate zur Selektion und spezifischen Beeinflussung der Funktion von Zellen
EP1024363A2 (de) Quantitative Bestimmung von Analyten in einem heterogenen System
CH675485A5 (de)
DE60301959T2 (de) Verfahren zum nachweis von änderungen in morphologischen zellparametern
O’Malley et al. Fluorescent calcium indicators: subcellular behavior and use in confocal imaging
Miyazaki et al. Synapse-to-synapse variation of calcium channel subtype contributions in large mossy fiber terminals of mouse hippocampus
EP4056990A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur respirometrischen bestimmung der antibakteriellen wirksamkeit antibiotischer substanzen mittels auf lumineszenz basierender oxymetrie
DE102007010860B4 (de) Verfahren zur Identifikation eines Partikels mit zwei oder mehr monodispers eingebetteten Fluorophoren

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20020910

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Free format text: AL;LT;LV;MK;RO;SI

17Q First examination report despatched

Effective date: 20051121

17Q First examination report despatched

Effective date: 20051121

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20080320