EP1242612A1 - Verfahren zur kontinuierlichen kultivierung von mikroorganismen der gattung eremothecium - Google Patents

Verfahren zur kontinuierlichen kultivierung von mikroorganismen der gattung eremothecium

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EP1242612A1
EP1242612A1 EP00990744A EP00990744A EP1242612A1 EP 1242612 A1 EP1242612 A1 EP 1242612A1 EP 00990744 A EP00990744 A EP 00990744A EP 00990744 A EP00990744 A EP 00990744A EP 1242612 A1 EP1242612 A1 EP 1242612A1
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EP
European Patent Office
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range
flow rates
microorganism
eremothecium
produced
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00990744A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Stephan Freyer
Henning ALTHÖFER
Klaus-Peter Stahmann
Andreas Wiesenburg
Cornelia Gaetgens
Hermann Sahm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
BASF SE
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE, Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical BASF SE
Publication of EP1242612A1 publication Critical patent/EP1242612A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungi isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a process for the continuous cultivation of microorganisms of the genus Eremothecium and products produced in this process.
  • yeasts or yeast-like fungi such as, for example, Saccharomyces or Candida species
  • Saccharomyces or Candida species have been described in large numbers in the literature. This applies to batch or fed-batch processes as well as to continuous fermentations.
  • the advantages of continuous biotechnological processes include in particular the reduction of dead times, often higher productivity and continuous product acquisition.
  • the filamentous fungus Eremothecium gossypii (synonym: Ashbya gossypii; Kurtzman, CP, J. Ind. Microbiol., 1995, 14: 523-530) has so far been of biotechnological importance due to its ability to produce riboflavin (Vandamme EJ, J. Chem. Tech Biotechnol., 1992, 53: 313-327).
  • the production of ribofiavin by fermentation of Eremothecium gossypii and the closely related fungus Eremothecium ashbyi is known (The Merck Index, Windholz et al,. Eds. Merck & Co., 1983, page 1183; Bacher A.
  • the present invention is a method for culturing a microorganism of the genus Eremothecium, wherein the cells in continuous fermentation at flow rates in the range of greater than zero are cultured to 0.8 h ".
  • the process is preferably carried out at flow rates in the range from 0.001 to 0.8 h "1.
  • Flow rates in the range from 0.01 to 0.7 h “ 1 are preferred, particularly preferably from 0.05 to 0.6 h “1 .
  • a fermentation in batch mode is characterized in a classic manner in that the microorganism, starting from a start-up phase, goes through an exponential phase, a stationary phase and a dying phase. This means that there are different cultural conditions at all times, so the cultural conditions are constantly changing.
  • continuous fermentation is characterized in that an equilibrium state (flow equilibrium) is established so that the same culture conditions prevail over the long term.
  • filamentous fungi such as, for example, Penicillium or Fusarium species
  • values in the range from 0.15 to 0.25 h "1 are described for glucose-containing medium for the maximum specific growth rate (Christensen et al., J. Biotechnol., 1995, 42: 95-107; Wiebe et al., Microbiology, 1994, 140: 3015-3021).
  • the method according to the invention is distinguished in that a maximum specific growth rate of a microorganism of the genus Eremothecium is permanent in the range from 0.5 to 0.6 h "1 , in particular from 0.55 h " 1 .
  • the present invention also relates to a method in which the flow rate is alternately set to constant higher or lower values at defined time intervals.
  • the time interval between the changes in the flow rates is to be selected in such a way that on the one hand the stability of the system (settling into steady state) and on the other hand a desired maximum productivity is ensured. However, this depends on the respective objective of the cultivation process carried out.
  • Values in the range from 0.1 to 0.8 h "1 , preferably from 0.12 to 0.5 h " 1, are to be mentioned as examples of the constantly set higher flow rates.
  • Value ranges for constantly set lower flow rates are, for example, 0.01 to 0.2 h '1 , ranges from 0.02 to 0.1 h "1 are preferred, and a flow rate of approximately 0.05 h " 1 is particularly preferred.
  • the flow rate is reduced to a value of approximately 0.05 h "1.
  • TBM dry biomass
  • the dry biomass increased from 1.63 g / l to 3.93 g / l within about 8 hours.
  • the flow rate is reduced in the same way, starting from an initial flow rate of approximately 0.20 h "1 or approximately 0.30 h " 1 .
  • this method is particularly suitable for increasing the riboflavin production during the continuous cultivation of the fungus.
  • FIG. 2 A graphic representation of the course of the dry biomass and the riboflavin concentration is shown in FIG. 2.
  • the cells are stable continuously over a period of several weeks, preferably from 2 to 8 weeks, particularly preferably from 2 to 4 weeks, in particular from more than 2.5 weeks (corresponding to more than 400 hours) be cultivated.
  • the cells predominantly grow at flow rates of greater than zero to 0.20 h "1 , preferably from 0.01 to 0.20 h " 1
  • the method according to the invention is characterized in that the microorganism predominantly grows as a hyphen-shaped mycelium at flow rates in the range of> 0.20-0.70 h -1 and / or loose aggregations of this mycelium are formed in the form of mycelial pellets Mycelial pellets with a size of 1 to 3 mm in diameter At this stage of the culture, growth-linked product formation predominantly takes place.
  • a fungus of the species Eremothecium gossypii is preferably used in the process according to the invention.
  • an ATCC 10895 genetically modified compared to the wild-type Eremothecium gossypii (synonym: Ashbya gossypii) is used.
  • genetic changes are to be understood as natural, ie spontaneously occurring or artificially generated mutations.
  • Artificially created mutations can be caused, for example, by treating the fungus with mutagenic agents or by irradiation, especially UV radiation. These mutations are also called undirected mutations.
  • the present invention also encompasses genetically modified microorganisms which are produced in a targeted manner by genetic engineering methods.
  • mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues, which can be of homologous or heterologous origin. These mutations can affect gene expression or affect the activity of the gene product, which can be weakened or enhanced.
  • the mutations can be chromosomally coded or have a multiple copy number on so-called extrachromosomal gene structures (vectors).
  • changes to several genes are simultaneously included within an organism. For example, the metabolism of the microorganism can be steered in the direction of a desired product in this way (metabolic design).
  • the present method uses the cell's own and / or non-cell products, for example polysaccharases, lipases or proteases, as well as sugars or organic acids, etc. Amino acids. It is also possible to produce heterogeneous gene products which consist of a mixture of homologous and heterologous components, such as fusion proteins.
  • the present invention further relates to a microorganism of the genus Eremothecium, which is produced in the process according to the invention.
  • the invention also relates to primary metabolic products or end products of energy metabolism, including, for example, ethanol, acetate, lactate, acetone or butanol, produced in the process according to the invention described above.
  • ethanol production takes place at flow rates in the range from 0.06 to 0.40 h " 1 , preferably from 0.09 to 0.32 h " ⁇ particularly preferably from 0.25 to 0.32 h "1 (Table 1) ,
  • the present invention allows a filamentous microorganism to experience a crabtree effect, i.e. the formation of ethanol from glucose with an excess supply of oxygen (aerobic fermentation) can be observed.
  • the present invention also relates to secondary metabolites, including e.g. antibiotics or gibberellins, intermediate metabolites, etc. e.g. amino acids, citric acid or vitamins, energy reserves, etc. for example lipids, polysaccharides, such as, for example, glycogen, dextran or xanthan or polyhydroxybutyric acid, and also extracellular or intracellular enzymes, including, for example, amylases, proteases, cellulases or ⁇ -galactosidase, which are produced by the process according to the invention.
  • secondary metabolites including e.g. antibiotics or gibberellins, intermediate metabolites, etc. e.g. amino acids, citric acid or vitamins, energy reserves, etc. for example lipids, polysaccharides, such as, for example, glycogen, dextran or xanthan or polyhydroxybutyric acid, and also extracellular or intracellular enzymes, including, for example, amylases, proteases, cellulases or
  • the present invention furthermore relates to the use of the microorganism produced by the process according to the invention or of the aforementioned metabolic products according to the invention in areas of the chemical industry, pharmacy, medicine, food and / or feed industry, as well as agriculture and / or crop protection.
  • the present invention also relates to the use of the metabolic products according to the invention for Manufacture of medicines for the treatment of diseases in the aforesaid fields.
  • culture broth was filtered (paper circular filter, Schleicher & Schuell) and the glucose content in the filtrate was determined with the UV test for the determination of D-glucose (Röche Diagnostics).
  • the method is based on the enzymatic conversion of D-glucose and ATP to D-glucose-6-phosphate and ADP, (enzyme: hexokinase).
  • the enzyme glucose-6phosphate dehydrogenase oxidizes D-glucose-6-phosphate to D-gluconate-6-phosphate.
  • NADP + to NADPH takes place.
  • the amount of NADPH formed is equivalent to the amount of D-glucose used.
  • the formation of NADPH was measured in the UV spectrometer (UV-160, Shimadzu) at 340 nm.
  • Ethanol / acetate standard 0.81 g / l ethanol 1.64 g / l sodium acetate (corresponds to 1.18 g / l acetate)
  • the oxygen partial pressure (pO 2 ) was measured with a pO electrode (Mettler Toledo) (Demain & Solomon, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Washington, DC, 1986).
  • a combined pH electrode (pH combination electrode) from Ingold was used to measure the pH.
  • the calibration was carried out with standard commercial solutions (pH 4 and pH 7) before autoclaving.
  • Nile Red staining was carried out to detect fat deposits in the hyphae (Stahmann et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42: 121-127). In contrast to an aqueous medium, this dye has good solubility in a hydrophobic environment and shows a strong fluorescence capacity under hydrophobic conditions (e.g. lipid deposits). The excitation takes place at 450 to 500 nm and the emission has a wavelength of> 528 nm.
  • Nile-Red solution 1 mg of Nile-Red in 1 ml of acetone
  • fluorescence microscope photo and fluorescence microscope, Zeiss
  • the shake flask including the medium, was sterilized by Autoclaving. Inoculation was carried out with mycelium from the stock holding plate, which was crushed intensively with the help of glass beads (diameter 5 mm). The cultivation took place overnight on a shaker at 30 ° C. and 120 rpm. To prepare the inoculum, the preculture was likewise homogenized with the aid of glass beads immediately before inoculating the fermenter or the shake flask series.
  • the LABFORS system from Infors was available for the cultivation experiments in the laboratory fermenter.
  • the glass stirred kettle had a maximum working volume of 5 liters.
  • a two-day disc stirrer with 6 blades ensured the mixing of the culture.
  • the risk of contamination, for example a mechanical seal, could be reduced by using a magnetic coupling.
  • the fermenter was provided with four baffles. It was ventilated with adjustable aeration rate with compressed air via a gassing pipe.
  • the pO 2 was controlled by varying the stirrer speed using an integrated control device.
  • the culture was tempered via the double jacket of the fermenter.
  • An exhaust air cooler (4 ° C) was used to reduce the discharge of volatile substances (e.g. ethanol) with the gas flow.
  • a standpipe was used for sampling and harvesting in continuous operation.
  • the tube opening for sampling was stored in ethanol (96% (v / v)). Due to its length, the harvesting line used in continuous operation did not require any additional measures to maintain sterility.
  • a culture sample was checked under the microscope at regular intervals for possible contamination. If necessary, an anti-foaming agent could be added using an infusion pump (PRECIDOR TYPE 5003, Infors AG, flow: 2> 0.4 ml / h).
  • PRECIDOR TYPE 5003, Infors AG, flow: 2> 0.4 ml / h The online measured values for pO 2 , pH, temperature and speed were measured with the data acquisition software MEDUSA 1.2 (Institute for Biotechnology 2, Anlagenstechnik GmbH) recorded and saved, the values of the CO 2 exhaust air analysis were recorded with a recorder.
  • FIG. 1 The experimental setup for continuous cultivation in the laboratory fermenter is shown in FIG. 1.
  • a peristaltic pump (4) (Watson Marlow) continuously pumped sterile nutrient medium from the storage bottle (2) (NALGENE, 20 liter volume) into the fermenter (1).
  • the flow rate could be set by selecting the pump output [ml / h].
  • the culture volume strictly speaking the weight of the fermenter, was kept constant by the harvesting pump (3) (B. Braun AG), which was controlled by a balance (5) (Bioengineering AG) on which the fermenter was stored.
  • the storage container (2) was mixed with a magnetic stirrer (15).
  • the fermenter system consisting of the filtration section for the medium, the storage bottle, the fermenter and the harvesting section, was sterilized by autoclaving.
  • the medium was pumped through the sterile filter (7) (SARTOBRAN-P CAPSULE, Sartorius AG) into the storage bottle (2) and the fermenter (1) was filled with 3 liters of medium.
  • Hose connections and the complete filling of the reactor jacket were tared (5) and the weight to be kept constant was determined. Inoculation was carried out with approximately 90 ml of homogenized preculture. Cultivation started in batch mode. Taking advantage of the favorable physiological state of the culture in the exponential growth phase, the system was switched to continuous operation after about 8 hours and a dry biomass content of approx. 1 g / l.
  • the cultivation conditions were: Working volume: 3 1
  • Figure 1 Schematic representation of the experimental setup for the continuous cultivation of a microorganism of the genus Eremothecium in the laboratory fermenter
  • FIG. 2 Graphical representation of the course of the dry biomass (TBM) and the riboflavin concentration of Eremothecium gossypii ATCC 10895 after lowering the flow rate (D) to 0.05 h "1 from steady state at a) 0.16 h " 1 , b) 0.2 h “1 and c) 0.3 h " 1 as a function of time (t).
  • Table 1 Overview of various parameters measured during the continuous fermentation of Eremothecium gossypii ATCC 10895
  • TBM dry biomass [g / l] nd: undetectable ( ⁇ 0.1 mg / l)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Eremothecium sowie die damit hergestellten Produkte und deren Verwendung.

Description

Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen der
Gattung Eremothecium
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen der Gattung Eremothecium sowie Produkte hergestellt in diesem Verfahren.
Verfahren zur Kultivierung von Hefen oder hefeartig wachsenden Pilzen, wie beispielsweise Saccharomyces oder Candida-Arten, sind zahlreich in der Literatur beschrieben. Dies trifft sowohl für Verfahren im Batch- oder Fed-Batch-Ansatz als auch für kontinuierliche Fermentationen zu. Als Vorteile kontinuierlicher biotechnologischer Prozesse sind hier insbesondere die Reduzierung von Totzeiten, eine oft höhere Produktivität sowie eine kontinuierliche Produktgewinnung zu nennen.
Der filamentöse Pilz Eremothecium gossypii (synonym: Ashbya gossypii; Kurtzman, C.P., J. Ind. Microbiol., 1995, 14:523-530) genießt bisher aufgrund seiner Fähigkeit zur Riboflavin-Produktion biotechnologische Bedeutung (Vandamme E. J., J. Chem. Tech. Biotechnol.,1992, 53:313- 327). So ist die Herstellung von Ribofiavin durch Fermentation von Eremothecium gossypii sowie des nah verwandten Pilzes Eremothecium ashbyi bekannt (The Merck Index, Windholz et al,. eds. Merck&Co., 1983, Seite 1183; Bacher A. et al., Angew. Chem., 1969, Seite 393). Aufgrund der besseren genetischen Stabilität des Pilzes Eremothecium gossypii gegenüber Eremothecium ashbyi wird jedoch E. gossypii zur industriellen Produktion von Stoffwechselprodukten bevorzugt (Demain, A. L., Annu. Rev. Microbiol., 1972, 26:369-388).
Die zur Kultivierung filamentöser Pilze der Gattung Eremothecium beschriebenen Verfahren sind bislang jedoch ausschließlich diskontinuierliche Kultivierungsverfahren, d.h. die Zellen werden in sogenannten Batch- oder Fed-Batch-Kulturen gezüchtet.
Allgemein ist die Anzucht von filamentösen Pilzen in kontinuierlicher Kultur sehr aufwendig und mit einer Reihe von Problemen behaftet. Beispielhaft sei hier vor allen Dingen die starke Myzelbildung während der Kultivierung angeführt. Zwar sind kontinuierliche Verfahren für Aspergillus- oder Peniciilium-Arten bei Wongwicharn et al. (Biotechnol. Bioeng., 1999, 65 (4): 416-424) und Christensen et al. (J. Biotechnol., 1995, 42 (2): 95-107) beschrieben, jedoch bleiben diese Verfahren für einen großtechnischen Produktionsprozeß ohne Relevanz. Lediglich für Fusarium graminearum ist ein industriell genutztes Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung eines filamentösen Pilzes beschrieben (Trinci, A. P., Microbiology, 1994, 140 (Pt 9): 2181-2188).
Für den filamentös wachsenden Pilz der Gattung Eremothecium ist ein solches kontinuierliches Verfahren bislang nicht verfügbar. Dies wäre jedoch insbesondere hinsichtlich des zunehmend wirtschaftlichen Interesses an diesem Pilz sehr wünschenswert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Eremothecium, wobei die Zellen in kontinuierlicher Fermentation bei Durchflußraten im Bereich von größer Null bis 0,8 h" kultiviert werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Verfahren bei Durchflußraten im Bereich von 0,001 bis 0,8 h"1 durchgeführt. Bevorzugt sind Durchflußraten im Bereich von 0,01 bis 0,7 h"1, besonders bevorzugt von 0,05 bis 0,6 h"1. Eine Fermentation im Batch-Betrieb zeichnet sich in klassischer Weise dadurch aus, daß der Mikroorganismus ausgehend von einer Anlaufphase eine exponentielle Phase, eine stationäre Phase und eine Absterbephase durchläuft. Dies bedeutet, daß zu jedem Zeitpunkt andere Kulturbedingungen herrschen, die Kulturbedingungen sich also ständig ändern. Demgegenüber zeichnet sich eine kontinuierliche Fermentation dadurch aus, daß ein Gleichgewichtszustand (Fließgleichgewicht) eingestellt wird, so daß dauerhaft gleiche Kulturbedingungen herrschen. In der Literatur sind bei kontinuierlicher Kultivierung filamentöser Pilze, wie beispielsweise Penicillium- oder Fusarium-Arten, auf Glukose-haltigem Medium für die maximale spezifische Wachstumsrate Werte im Bereich von 0,15 bis 0,25 h"1 beschrieben (Christensen et al., J. Biotechnol., 1995, 42: 95-107; Wiebe et al., Microbiology, 1994, 140: 3015-3021 ). Überraschender Weise zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß dauerhaft eine maximale spezifische Wachstumsrate eines Mikroorganismus der Gattung Eremothecium im Bereich von 0,5 - 0,6 h"1, insbesondere von 0,55 h"1 erreicht wird.
Dieses schnelle Wachstum stellt einen weiteren Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, welches insbesondere hinsichtlich einer großtechnischen Anwendung von bedeutender wirtschaftlicher Relevanz ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren, bei dem in definierten zeitlichen Abständen die Durchflußrate im Wechsel auf konstante höhere oder niedrigere Werte eingestellt wird.
Der zeitliche Abstand zwischen dem Wechsel der Durchflußraten ist dabei derart zu wählen, daß einerseits die Stabilität des Systems (Einschwingen in den Steady State) und andererseits eine gewünschte maximale Produktivität gewährleistet sind. Dies ist jedoch von der jeweiligen Zielsetzung des durchgeführten Kultivierungsprozesses abhängig. Als Beispiele für die konstant eingestellten höheren Durchflußraten sind Werte im Bereich von 0,1 bis 0,8 h"1, bevorzugt von 0,12 bis 0,5 h"1 zu nennen. Wertbereiche für konstant eingestellte niedrigere Durchflußraten sind beispielsweise 0,01 bis 0,2 h'1, bevorzugt sind Bereiche von 0,02 bis 0,1 h"1, besonders bevorzugt ist eine Durchflußrate von ca. 0,05 h"1.
In einer besonderen Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung wird bei einer Durchflußrate von ca. 0,16 h'1 nach Einstellung des Steady State die Durchflußrate auf einen Wert von ca. 0,05 h"1 abgesenkt. Während des „Einschwingprozesses" in das neue Fließgleichgewicht wird die gebildete Trockenbiomasse (TBM) bestimmt. Innerhalb von etwa 8 Stunden ist eine Zunahme der Trockenbiomasse von 1 ,63 g/l auf 3,93 g/l zu verzeichnen. Als Folge des Absenkens der Durchflußrate findet ein deutliches Überschwingen der Trockenbiomasse über den sich einstellenden Wert von 3,05 g TBM/I im Steady State statt. In weiteren Varianten des zuvor genannten Verfahrens erfolgt in gleicher Weise eine Absenkung der Durchflußrate ausgehend von einer Anfangsdurchflußrate von etwa 0,20 h"1 bzw. von etwa 0,30 h"1. Überraschender Weise ist dieses Verfahren erfindungsgemäß besonders geeignet, die Riboflavin-Produktion während der kontinuierlichen Kultivierung des Pilzes zu steigern. Eine graphische Darstellung des Verlaufs der Trockenbiomasse und der Riboflavinkonzentration ist in Figur 2 gezeigt.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Zellen kontinuierlich über einen Zeitraum von mehreren Wochen, bevorzugt von 2 bis 8 Wochen, besonders bevorzugt von 2 bis 4 Wochen, insbesondere vom mehr als 2,5 Wochen (entsprechend mehr als 400 Stunden) stabil kultiviert werden. Erfindungsgemäß wachsen die Zellen bei Durchflußraten von größer Null bis 0,20 h"1, bevorzugt von 0,01 bis 0,20 h"1 überwiegend als
Einzelzellen und/oder es werden Sporen ausgebildet. In diesem Stadium der Kultur findet überwiegend eine wachstumsentkoppelte Produktbildung statt.
Ferner zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß der Mikroorganismus bei Durchflußraten im Bereich von > 0,20 - 0,70 h"1 überwiegend als hyphenförmiges Myzel wächst und/oder lockere Zusammenballungen dieses Myzels in Form von Myzelpellets ausgebildet werden. Dabei erreichen die Myzelpellets eine Größe von 1 bis 3 mm im Durchmesser. In diesem Stadium der Kultur findet überwiegend eine wachstumsgekoppelte Produktbildung statt.
Die Ausbildung von Myzelpellets erweist sich dabei als sehr vorteilhaft, da diese Pellets relativ schnell und quantitativ sedimentieren und somit ohne größeren apparatetechnischen Aufwand und weitere Verfahrensschritte eine einfache Abtrennung der Biomasse von dem Kulturmedium ermöglichen. Dies vereinfacht folglich die sich anschließende Aufarbeitung der gewünschten Stoffwechselprodukte.
Bevorzugt wird dazu bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Pilz der Spezies Eremothecium gossypii eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung wird ein gegenüber dem Wildtyp Eremothecium gossypii (synonym: Ashbya gossypii) ATCC 10895 genetisch veränderter Mikroorganismus eingesetzt.
Unter genetischen Veränderungen sind erfindungsgemäß natürliche, d.h. spontan auftretende oder künstlich erzeugte Mutationen zu verstehen. Künstlich erzeugte Mutationen können beispielsweise durch Behandlung des Pilzes mit mutagenen Agenzien oder durch Bestrahlung, insbesondere UV-Bestrahlung hervorgerufen werden. Diese Mutationen werden auch als ungerichtete Mutationen bezeichnet.
Ferner um faßt die vorliegende Erfindung auch genetisch veränderte Mikroorganismen, die gezielt durch gentechnische Methoden erzeugt werden.
Generell umfassen Mutationen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste, die homologen oder heterologen Ursprungs sein können. Diese Mutationen können sich auf die Gen-Expression auswirken oder eine Auswirkung auf die Aktivität des Genprodukts haben, die abgeschwächt oder verstärkt sein kann. Die Mutationen können chromosomal kodiert sein oder in einer vielfachen Kopienzahl auf sogenannten extrachromosomalen Genstrukturen (Vektoren) vorliegen. Neben genetischen Veränderungen an einem einzelnen Gen sind erfindungsgemäß auch Veränderungen an mehreren Genen gleichzeitig innerhalb eines Organismus eingeschlossen. Beispielsweise kann auf diese Weise der Stoffwechsel des Mikroorganismus verstärkt in die Richtung eines gewünschten Produktes gelenkt werden (metabolic design).
Erfindungsgemäß werden mit dem vorliegenden Verfahren zelleigene und/oder zellfremde Produkte, beispielsweise Polysaccharasen, Lipasen oder Proteasen sowie Zucker oder organische Säuren, u.a. Aminosäuren, gebildet. Auch ist die Herstellung von heterogenen Genprodukten, die aus einer Mischung von homologen und heterologen Anteilen bestehen, wie beispeilsweise Fusionsproteine, möglich.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Mikroorganismus der Gattung Eremothecium, der in dem erfmdungsgemäßen Verfahren hergestellt wird. Gegenstand der Erfindung sind ebenso primäre Stoffwechselprodukte oder Endprodukte des Energiestoffwechsels, u.a. beispielsweise Ethanol, Acetat, Laktat, Aceton oder Butanol, hergestellt in dem zuvor beschriebenen erfmdungsgemäßen Verfahren. Erfindungsgemäß findet eine Ethanolproduktion bei Durchfiußraten im Bereich von 0,06 bis 0,40 h" 1, bevorzugt von 0,09 bis 0,32 h"\ besonders bevorzugt von 0,25 bis 0,32 h"1 statt (Tabelle 1).
Erstmals kann durch die vorliegende Erfindung für einen filamentös wachsenden Mikroorganismus das Auftreten eines Crabtree-Effektes, d.h. die Bildung von Ethanol aus Glukose bei einem Überangebot an Sauerstoff (aerobe Gärung), beobachtet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso sekundäre Stoffwechselprodukte, u.a. beispielsweise Antibiotika oder Gibberelline, intermediäre Stoffwechselprodukte, u.a. beispielsweise Aminosäuren, Citronensäure oder Vitamine, Energiereservestoffe, u.a. beispielsweise Lipide, Polysaccharide, wie beispielsweise Glykogen, Dextran oder Xanthan oder Polyhydroxybuttersäure sowie extrazelluläre oder intrazelluläre Enzyme, u.a beispielsweise Amylasen, Proteasen, Cellulasen oder ß-Galaktosidase, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist femer die Verwendung des mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Mikroorganismus oder der zuvor genannten erfindungsgemäßen Stoffwechselprodukte in Bereichen der chemischen Industrie, der Pharmazie, Medizin, Lebensmittel- und/oder Futtermittelindustrie sowie der Landwirtschaft und/oder des Pflanzenschutzes. Die voriiegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung der erfindungsgemäßen Stoffwechselprodukte zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krankheiten in den zuvor genannten Bereichen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind:
1. Chemikalien
Es werden Chemikalien der Firmen Merck KGaA, Darmstadt, Fluka Chemie AG, Schweiz und Sigma Chemie, München verwendet.
2. Analytische Methoden
Die Ergebnisse der im folgenden beschriebenen und während der kontinuierlichen Fermentation gemessenen Parameter sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
2.1 Ribofiavin
Zur Bestimmung der Riboflavinkonzentration in der Kultur wurden 500 μl Kulturbrühe nach der Zugabe von 50 μl Lysing-Enzyme-Lösung (50 mg/ml) zur Protoplastierung der Zellen für 1 h im Eppendorf-Schüttler bei 30 °C inkubiert und die Protoplasten durch anschließende Zugabe von 450 μl Aqua dest. zum Platzen gebracht. Das Homogenat wurde filtriert (Porengröße: 0,2 μm, Gelman Sciences) und im Filtrat mittels HPLC (Merck) der Riboflavingehalt bestimmt. Folgende Trennbedingungen wurden gewählt (Schmidt et al, Microbiology, 1996, 142: 419-426).
Säule: LiChrospher 100 RP-18 (5 μm) (Merck) Laufmittel: 50 mM NaH2PO4, 1 mM Tetramethylammoniumchlorid
12 % (v/v) Acetonitril pH 3 mit H3PO4
Fluß: 1 ml/min
Elution: isokratisch
Detektion: 270 nm
2.2 Glucose
Zur Bestimmung wurde Kulturbrühe filtriert (Papierrundfilter, Schleicher & Schuell) und der Glucosegehalt im Filtrat mit dem UV-Test zur Bestimmung von D-Glucose (Röche Diagnostics) ermittelt. Die Methode beruht auf der enzymatischen Umsetzung von D-Glucose und ATP zu D- Glucose-6-phosphat und ADP, (Enzym: Hexokinase). Das Enzym Glucose-6phosphat-Dehydrogenase oxidiert D-Glucose-6-phosphat zu D- Gluconat-6-phosphat. Gleichzeitig erfolgt die Umwandlung von NADP+ in NADPH. Die Menge des gebildeten NADPH ist zu der Menge der eingesetzten D-Glucose äquivalent. Die Bildung von NADPH wurde im UV-Spektrometer (UV- 160, Shimadzu) bei 340 nm gemessen.
2.3 Biomasse Um den Gehalt an Trockenbiomasse (TBM) zu ermitteln, wurden 30 bis 200 ml Kulturbrühe über getrocknete und ausgewogene Papierrundfilter (Schleicher & Schuell) abfiltriert. Die Filter wurden mit Aqua dest. gewaschen, bei 110 °C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und anschließend gewogen (Monschau N., Dissertation der Heinrich-Heine Universität, 1998).
2.4 Ethanol und Acetat
Die Bestimmung von Ethanol und Acetat erfolgte durch
Gaschromatographie (Schmidt, Dissertation der Heinrich-Heine Universität, 1996). Wie bei der Glucosebestimmmung wurde die
Kulturbrühe filtriert (Papierrundfilter, Schleicher & Schuell) und das Filtrat zur Analyse verwendet. Zu 500 μl Filtrat erfolgte eine Zugabe von 500 μl eines internen Standards. Dieser enthielt eine definierte Menge Methanol, auf deren Basis bei der Auswertung des Chromatogrammes Abweichungen z.B. des Injektionsvolumens korrigiert wurden. Zur Eichung wurde eine Probe aus 500 μl Ethanol/Acetat-Standardlösung + 500 μl interner Standard verwendet.
Interner Standard: 1 ,6 g/l Methanol in 0,2 M HCI
Ethanol/Acetat-Standard: 0,81 g/l Ethanol 1 ,64 g/l Natriumacetat (entspricht 1 , 18 g/l Acetat)
Die Bestimmung wurde mit HP 5890 Series 11 von Hewlett Packard bei einer Ofentemperatur von 155 °C unter Verwendung von Stickstoff als Trägergas durchgeführt.
2.5 Kohlendioxid in der Abluft
Der Bestimmung des CO2-Gehalts in der Fermenterabluft diente ein infrarotspektroskopisches Verfahren (Stanbury & Whitaker, Oxford: Pergamon Press, 1984). Verwendet wurde das lnfrarot-CO2-Meßgerät URAS 1OE der Firma Hartmann & Braun. Vor der Analyse war es notwendig, den Gasstrom zu kühlen und zu trocknen. Die Eichung erfolgte als Zweipunktkalibrierung mit Argon (0 % (v/v) CO ) und einem Eichgas mit 5 % (v/v) CO2.
2.6 Sauerstoffpartialdruck in der Kultur
Der Sauerstoffpartialdruck (pO2) wurde mit einer pO -Elektrode (Mettler Toledo) gemessen (Demain & Solomon, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Washington, D.C., 1986). Die Zweipunktkalibrierung erfolgte im temperierten Medium bei einer konstanten Rührerdrehzahl (650 rpm) direkt vor dem Inokulieren. Zur Nullpunkteinstellung wurde das Medium mit Argon bis zum Erreichen eines stabilen Elektrodensignals entgast. Der Maximalwert (pO2 = 100 %) wurde durch Begasen mit Preßluft bis zum Erreichen eines konstanten Elek-trodensignals eingestellt.
2.7 pH-Wert der Kultur
Der Messung des pH-Wertes diente eine kombinierte pH-Elektrode (pH- Einstabmeßkette) von Ingold. Die Eichung erfolgte vor dem Autoklavieren mit handelsüblichen Standardlösungen (pH 4 und pH 7).
2.8 Detektion intrazellulärer Fetttropfen
Zum Nachweis von Fetteinlagerungen in den Hyphen wurde die Nile-Red- Färbung durchgeführt (Stahmann et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42: 121-127). Dieser Farbstoff weist, im Gegensatz zu wäßrigem Milieu, in hydrophober Umgebung eine gute Löslichkeit auf und zeigt unter hydrophoben Bedingungen (z.B. Lipideinlagerungen) ein starkes Fiuoreszenzver-mögen. Die Anregung erfolgt bei 450 bis 500 nm und die Emission hat eine Wellenlänge von > 528 nm.
Zum Anfärben wurden zu 500 μl Kulturbrühe ca. 50 μl Nile-Red-Lösung (1 mg Nile-Red in 1 ml Aceton) gegeben. Unter dem Fluoreszenzmikroskop (Photo- und Fluoreszenzmikroskop, Zeiss) konnte die Fluoreszenz des in die intrazellulären Fetttröpfchen eingeschlossenen Farbstoffes überprüft werden.
3. Nährmedien HA- Vollmedium (Stahmann et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42: 121-127)
D(+)-Glucose-Monohydrat 10 g/l
Hefeextrakt (granuliert) 10 g/l
HA-Vollmedium-Agarplatten
D(+)-Glucose-Monohydrat 10 g/l Hefeextrakt (granuliert) 10 g/l Agar (granuliert) 20 g/l
Mineralsalz-Minimalmedium (Monschau N., Dissertation der Heinrich- Heine Universität, 1998, verändert)
Lösung A (1 OOfach): KH2PO4 200 g/l mit 8 M KOH auf pH 6,7
Lösung B (10fach): NH4CI 15 g/ι
L-Asparagin (Monohydrat) 5 g/ι
NaCI 2 g/ι
MgSO4 x 7H2O 4 g/i
MnSO4 x H2O 0,5 g/ι
CaCI2 x 2H2O 0,4 g/ι myo-lnosit 1 g/ι
Nicotinsäureamid 2,5 g/i
D(+)-Glucose-Monohydrat 10 g/ι
Hefeextrakt (granuliert) 1 g/ι
Glycin 15 mM
Die 10Ofach konzentrierte Lösung A wird erst abschließend zuzugeben, um das Ausfallen von schwerlöslichen Verbindungen zu vermeiden.
4. Kultivierungsmethoden
4.1 Stammhaltung und Vorkultur Die Stammhaltung des Wildtyps von Eremothecium gossypii ATCC 10895 erfolgte auf HA-Vollmedium-Agarplatten, welche bei 4 °C gelagert und alle
14 Tage auf frische Platten überimpft wurden.
Zum Herstellen von Vorkulturen wurden 500 ml-Schüttelkolben (Schott
Glaswerke), welche zur Verbesserung des Sauerstoffeintrages mit 2 Schikanen versehen waren, mit 100 ml HA- Vollmedium verwendet. Die
Sterilisation der Schüttelkolben inklusive Medium erfolgte durch Autoklavieren. Beimpft wurde mit Myzel von der Stammhaltungsplatte, welches mit Hilfe von Glasperlen (Durchmesser 5 mm) intensiv zerkleinert wurde. Die Kultivierung erfolgte über Nacht auf einem Schüttler bei 30 °C und 120 rpm. Zur Bereitstellung des Inokulums wurde die Vorkultur unmittelbar vor Beimpfen des Fermenters oder der Schüttelkolbenserie ebenfalls mit Hilfe von Glasperlen homogenisiert.
4.2 Kultivierung im Laborfermenter
Für die Kultivierungsversuche im Laborfermenter stand das LABFORS- System der Firma Infors zur Verfügung. Der Glasrührkessel hatte ein maximales Arbeitsvolumen von 5 Liter. Ein zweietagiger Scheibenrührer mit 6 Schaufeln gewährleistete die Durchmischung der Kultur. Das Kontaminationsrisiko, welches z.B. eine Gleitringdichtung in sich birgt, konnte durch den Einsatz einer Magnetkupplung verringert werden. Zusätzlich war der Fermenter mit vier Schikanen versehen. Belüftet wurde bei einstellbarer Belüftungsrate mit Preßluft über ein Begasungsrohr. Die Regelung des pO2, erfolgte über Variation der Rührerdrehzahl durch eine integrierte Regeleinrichtung. Temperiert wurde die Kultur über den Doppelmantel des Fermenters. Um den Austrag flüchtiger Substanzen (z.B. Ethanol) mit dem Gasstrom zu reduzieren, kam ein Abluftkühler (4 °C) zur Anwendung. Der Probenahme sowie der Ernte im kontinuierlichen Betrieb diente ein Steigrohr. Die Schlauchöffnung für die Probenahme lagerte in Ethanol (96 % (v/v)). Die im kontinuierlichen Betrieb genutzte Erntestrecke erforderte aufgrund ihrer Länge keine zusätzlichen Sterilitätserhaltende Maßnahmen. In regelmäßigen Abständen wurde eine Kulturprobe unter dem Mikroskop hinsichtlich möglicher Kontaminationen überprüft. Bei Bedarf konnte mit Hilfe einer Infusionspumpe (PRECIDOR- TYP 5003, Infors AG, Fluß: 2 > 0,4 ml/h) ein Antischaummittel zudosiert werden. Die online-Meßwerte für pO2, pH, Temperatur und Drehzahl wurden mit der Datenerfassungssoftware MEDUSA 1.2 (Institut für Biotechnologie 2, Forschungszentrum Jülich GmbH) aufgezeichnet und gespeichert, die Erfassung der Werte der CO2- Abluft-Analyse erfolgte mit einem Schreiber.
4.3 Kontinuierliche Kultivierung im Laborfermenter
Der Versuchsaufbau für die kontinuierliche Kultivierung im Laborfermenter ist in Figur 1 dargestellt. Im kontinuierlichen Betrieb wurde mittels einer Schlauchpumpe (4) (Watson Marlow) ständig steriles Nährmedium aus der Vorratsflasche (2) (NALGENE, 20 Liter Volumen) in den Fermenter (1) gepumpt. Über die Auswahl der Pumpleistung [ml/h] konnte die Durchflußrate eingestellt werden. Das Kulturvolumen, streng genommen das Gewicht des Fermenters, wurde durch die Erntepumpe (3) (B. Braun AG) konstant gehalten, welche von einer Waage (5) (Bioengineering AG), auf der der Fermenter gelagert war, gesteuert wurde. Um auch im Langzeitbetrieb über ein homogenes Medium zu verfügen, wurde der Vorratsbehälter (2) mit einem Magnetrührer (15) durchmischt.
Die Sterilisation des Fermentersystem, bestehend aus der Filtrationsstrecke für das Medium, der Vorratsflasche, dem Fermenter und der Erntestrecke erfolgte durch Autoklavieren. Das Medium wurde über den Sterilfilter (7) (SARTOBRAN-P CAPSULE, Sartorius AG) in die Vorratsflasche (2) gepumpt und daraus der Fermenter (1 ) mit 3 Litern Medium befüllt. Nach dem Anschluß aller Elektrodenkabel und
Schlauchverbindungen, sowie dem vollständigen Füllen des Reaktormantels, wurde die Waage (5) tariert und damit das konstantzuhaltende Gewicht festgelegt. Inokuliert wurde mit ca. 90 ml homogenisierter Vorkultur. Der Start der Kultivierung erfolgte im Batch- Betrieb. Den günstigen physiologischen Zustand der Kultur in der expo- nentiellen Wachstumsphase ausnutzend, wurde nach ungefähr 8 Stunden und einem Trockenbiomassegehalt von ca. 1 g/l auf kontinuierlichen Betrieb umgestellt. Die Kultivierungsbedingungen waren: Arbeitsvolumen: 3 1
Begasung: 5 l/min pO2: > 80 % (Regelung durch Rührerdrehzahl)
Temperatur: 28 °C pH: 6,7
Rührerdrehzahl: 650 rprn ± 350 rpm (in Abhängigkeit vom pO2)
Nährmedium: Mineralsalz-Minimalmedium
Zur Einstellung der Steady-State-Bedingungen wurden fünf Verweilzeiten abgewartet und für die Probenahme mindestens 30 ml, bei niedrigen Biomassekonzentrationen bis zu 200 ml, Kulturbrühe (20) aus der Erntestrecke aufgefangen, wobei das Sammelgefäß auf Eis gelagert ist. Die Untersuchung jedes Gleichgewichtszustandes erfolgte anhand von mindestens sechs Meßpunkten im zeitlichen Abstand von mindestens einer Stunde.
Legendenbeschreibung zu
Figur 1 : Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur kontinuierlichen Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Eremothecium im Laborfermenter
1 Fermenter
2 Vorratsbehälter Medium (steril)
3 Erntepumpe
4 Schlauch-Pumpe
5 Waage
6 Sterilfilter (Gas)
7: Sterilfilter (Flüssigkeit)
8 Kühlfalle
9 Medium (unsteril)
10 Preßluft: 5 l/min
11 Warm-/Kühlwasser
12 Kühlwasser: 4 °C
13 Abluft
14 Schlauchpumpe
15 Magnetrührer
16 Meßeinheit für Temperatur
17 Meßeinheit für pO2
18 Meßeinheit für pH
19 Meßeinheit für CO2
20 Kulturbrühe
Figur 2: Graphische Darstellung des Verlaufs der Trockenbiomasse (TBM) und der Riboflavin-Konzentration von Eremothecium gossypii ATCC 10895 nach Absenken der Durchflußrate (D) auf 0,05 h"1 aus dem Steady State bei a) 0,16 h"1, b) 0,2 h"1 und c) 0,3 h"1 im Abhängigkeit von der Zeit (t).
Tabelle 1 : Übersicht über verschiedene während der kontinuierlichen Fermentation von Eremothecium gossypii ATCC 10895 gemessene Parameter
D: Durchflußrate [h"1]
TBM: Trockenbiomasse [g/l] n.d.: nicht detektierbar (< 0,1 mg/l)
-i σ

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Eremothecium, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einer kontinuierlichen Fermentation bei Durchflußraten im Bereich von größer Null bis 0,8 h"1 kultiviert werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es bei Durchflußraten im Bereich von 0,001 bis 0,8 h"1 durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Durchflußraten im Bereich von 0,01 bis 0,7 h"1, bevorzugt von 0,05 bis 0,6 h"1 durchgeführt wird.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß in definierten zeitlichen Abständen die Durchflußrate im Wechsel auf konstante höhere oder niedrigere Werte eingestellt wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine maximale spezifische Wachstumsrate im Bereich von 0,5 - 0,6 h"1, insbesondere von 0,55 h"1 erreicht wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen kontinuierlich über einen Zeitraum von mehreren Wochen, bevorzugt von 2 bis 8 Wochen, besonders bevorzugt von 2 bis 4 Wochen, insbesondere vom mehr als 2,5 Wochen (entsprechend mehr als 400 Stunden) stabil kultiviert werden.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen bei Durchflußraten im Bereich von größer Null bis 0,20 h"\ bevorzugt 0,01 bis 0,20 h"1 überwiegend als Einzelzellen wachsen und/oder Sporen ausgebildet werden.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen bei Durchflußraten im Bereich von > 0,20 - 0,70 h"1 überwiegend als hyphenförmiges Myzel wachsen und/oder Myzelpellets ausgebildet werden.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zelleigene und/der zellfremde und/oder heterogene Genprodukte gebildet werden.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pilz der Spezies Eremothecium gossypii eingesetzt wird.
1 1 . Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein gegenüber dem Wildtyp Eremothecium gossypii ATCC 10895 genetisch veränderter Mikroorganismus eingesetzt wird.
12. Mikroorganismus der Gattung Eremothecium hergestellt in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Primäre Stoffwechselprodukte hergestellt in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
14. Sekundäre Stoffwechselprodukte hergestellt in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
15. Intermediäre Stoffwechselprodukte hergestellt in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
16. Energiereservestoffe hergestellt in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
17. Enzyme hergestellt in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
18. Verwendung des Mikroorganismus gemäß Anspruch 12 oder der
Stoffwechselprodukte gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17 in
Bereichen der chemischen Industrie, der Pharmazie, Medizin,
Lebensmittel- und/oder Futtermittelindustrie sowie der Landwirtschaft und/oder des Pflanzenschutzes.
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