EP1222282A1 - Das beta-barrel der lipidkörperlipoxygenase - Google Patents

Das beta-barrel der lipidkörperlipoxygenase

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Publication number
EP1222282A1
EP1222282A1 EP00971351A EP00971351A EP1222282A1 EP 1222282 A1 EP1222282 A1 EP 1222282A1 EP 00971351 A EP00971351 A EP 00971351A EP 00971351 A EP00971351 A EP 00971351A EP 1222282 A1 EP1222282 A1 EP 1222282A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
organism
sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00971351A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Helmut Kindl
Christian May
Ivo Feussner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1222282A1 publication Critical patent/EP1222282A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a method for targeting proteins involved in the biosynthesis of lipids or fatty acids in liposomes or lipid bodies.
  • the invention relates to a method for producing fatty acids and lipids in an oil-producing organism.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences which code for a polypeptide and which is composed of a combination of nucleic acid sequences of a biosynthetic nucleic acid sequence of the fatty acid or lipid metabolism with a nucleic acid sequence which codes for the targeting of proteins.
  • the invention further relates to nucleic acid constructs containing these nucleic acid sequences, vectors and transgenic organisms which contain the nucleic acids, nucleic acid constructs and / or vectors.
  • Triacylgycerides are stored in particularly highly specialized tissues, for example in endosperm or cotyledons. Cells of this type contain lipid bodies as compartments that store the fat [Murphy, DJ, Prog. Lipid Res. , 32, 1993: 247-280; Huang, AH C, curr. Opinion Struct.
  • PLA a patatin-like protein [May. C. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1393, 1998: 267-276]) plays a crucial role in the initiation of the mobilization process by the phospholipid monolayer Lipid body destroyed [Noll, F. et al. , J. Struct. Biol., 1999: submitted].
  • This object was achieved by a method for targeting proteins involved in the biosynthesis of lipids or fatty acids in liposomes or lipid bodies, characterized in that the nucleic acids coding for the proteins are combined with one of the following sequences in a common protein coding sequence:
  • nucleic acid sequences which are derived from the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a result of the degenerate genetic code
  • nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 which code for polypeptides with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 and have at least 60% homology at the amino acid level
  • a nucleic acid sequence with the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino terminal part of the coding region of this sequence and
  • the method according to the invention makes it possible to specifically direct proteins which are advantageously involved in the fatty acid and / or lipid metabolism to the site of the desired synthesis.
  • Proteins can be directed in the method according to the invention by introducing the nucleic acid sequence into a eukaryotic organism.
  • the organisms are grown in a suitable medium.
  • nucleic acid sequence according to the invention as described below or at least one nucleic acid construct is placed in an oil-producing organism.
  • a process for the production of fatty acids or lipids characterized in that at least one nucleic acid sequence according to the invention or at least one nucleic acid construct is placed in an oil-producing organism, this organism is attracted and that oil contained in the organism is isolated.
  • a process for the production of fatty acids characterized in that at least one nucleic acid sequence according to the invention or at least one nucleic acid construct is placed in an oil-producing organism, this organism is attracted and that oil contained in the organism is isolated and the fatty acids are released.
  • Method as described above characterized in that the organism is a plant or a eukaryotic microorganism.
  • Culturing the organism as described above means the cultivation of plants as well as the cultivation of eukaryotic microorganisms such as yeasts, fungi, ciliates, algae, animal or plant cells or cell groups.
  • eukaryotic microorganisms such as yeasts, fungi, ciliates, algae, animal or plant cells or cell groups.
  • organisms for the process are plants such as arabidopsis, barley, wheat, rye, oats, maize, soybeans, rice, cotton, sugar beet, tea, carrots, peppers, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, triticale, tobacco, tomatoes , Rapeseed, coffee, tapioca, manioc, arrowroot, tagetes, alfalfa, peanut, castor, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinetorius), lettuce and the various tree, nut and wine species, or cocoa bean, microorganisms such as yeasts such as Yarrowia or Saccharomyces; Mushrooms called Mortierella, Saprolegnia, Traustochytrium or Pythium, algae or protozoa such as dinoflagellates such as Crypthecodinium.
  • Organisms which can naturally synthesize oils in large quantities such as microorganisms such as yeasts such as Yarrowia lypolytica or Saccharomyces cereviseae, fungi such as Mortierella alpina, Pythium insidiosum or plants such as Arabidopsis thaliana, soybeans, oilseed rape (Braccica napus), coconut, oil palm, canola, are preferred.
  • Dyer safflower (Carthamus tinetorius), castor oil, calendula, flax (Linium usitatissimum), borage, peanut, cocoa bean or sunflower, soybean, rape or sunflower are particularly preferred.
  • the organisms obtained in the process according to the invention advantageously contain saturated or unsaturated fatty acids in the form of bound fatty acids, i.e. the unsaturated fatty acids are predominantly in the form of their mono-, di- or triglycerides, glycolipids, lipoproteins or phospholipids such as oils or lipids or otherwise Ester or amide bound fatty acids.
  • Free fatty acids are also contained in the organisms in the form of the free fatty acids or in the form of their salts.
  • the organisms obtained by cultivation in the process according to the invention and the saturated or unsaturated fatty acids contained in them can be used directly, for example, for the production of pharmaceutical preparations, agrochemicals, animal feeds or foods or after isolation from the organisms.
  • the bound fatty acids can be released from, for example, the oils or lipids, for example via basic hydrolysis, for example with NaOH or KOH. These free fatty acids can be used directly in the mixture obtained or after further purification for the production of pharmaceutical preparations, agrochemicals, animal feeds or foods.
  • the bound or free fatty acids can also be used for transesterification or esterification, for example with other mono-, di- or triglycerides or glycerol, in order to increase the proportion of unsaturated fatty acids in these compounds, for example in the triglycerides.
  • Microorganisms such as bacteria, fungi, ciliates, plant or animal cells are usually in a liquid medium containing a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source mostly in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, Manganese, magnesium salts and possibly vitamins contains, at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C, depending on the organism, oxygen or in the absence of oxygen.
  • the pH of the nutrient liquid can be kept at a fixed value, i.e.
  • the pH is regulated during cultivation or the pH is not regulated and changes during cultivation.
  • the cultivation can be batch-wise, semi-batch wise or continuous. Nutrients can be added at the start of the fermentation or fed semi-continuously or continuously. Cultivation on solid media is also possible.
  • Plants are generally regenerated after transformation and then grown or grown as usual. This can be done in the greenhouse or outdoors.
  • the lipids are usually obtained from the organisms.
  • the organisms can first be digested after harvesting or used directly.
  • the lipids are advantageously mixed with suitable solvents such as apolar
  • Solvents such as hexane or ethanol, isopropanol or mixtures such as hexane / isopropanol, phenol / chloroform / isoamyl alcohol extracted at temperatures between 0 ° C to 80 ° C, preferably between 20 ° C to 50 ° C.
  • the biomass is usually extracted with an excess of solvent, for example an excess of solvent to biomass of 1: 4.
  • the solvent is then removed, for example by distillation.
  • the extraction can also be done with supercritical CO 2 . After extraction, the remaining biomass can be removed, for example, by filtration.
  • the crude oil obtained in this way can then be further purified, for example by removing turbidity by adding polar solvents such as acetone or chloroform and then filtering or centrifuging. Further purification using chromatographic processes, distillation or crystallization is also possible.
  • nucleic acid sequences which code for a polypeptide and which are composed of a combination of the nucleic acid sequences of a biosynthetic nucleic acid sequence of the fatty acid or lipid metabolism with one of the following nucleic acids:
  • nucleic acid sequences according to the invention enable proteins to be targeted in the method according to the invention.
  • Derivatives are, for example, functional homologs of the proteins encoded by SEQ ID NO: 1 or their biological activity, that is to say proteins which have the same biological reactions as those controlled by SEQ ID NO: 1. These genes also enable advantageous targeting of proteins. Under biological activity, directing proteins is advantageous of proteins that are fatty acid and / or Lipid metabolism is involved to understand within the cell.
  • nucleic acid sequence (s) used in the method according to the invention can advantageously be used for the isolation of further genomic sequences via homology screening.
  • the derivatives mentioned can be isolated, for example, from other eukaryotic organisms such as fungi, yeasts or plants such as specifically mosses.
  • derivatives or functional derivatives include
  • allelic variants which have at least 60% homology at the derived amino acid level, advantageously at least 70% homology, preferably at least 80% homology, particularly preferably at least 85% homology, very particularly preferably 90% homology ,
  • amino acid sequence derived from the nucleic acids mentioned can be found in sequence SEQ ID NO: 2. Homology is to be understood as identity, i.e. the amino acid sequences are at least 60%
  • sequences according to the invention are at least 50% homologous, preferably at least 60%, particularly preferably 70%, very particularly preferably at least 80% at the nucleic acid level.
  • Allelic variants include in particular functional variants, 35 which can be obtained by deleting, inserting or substituting nucleotides from the sequence shown in SEQ ID NO: 1, the biological activity of the derived synthesized proteins being retained, that is to say these proteins still have the ability of Protein carryings. 40
  • DNA sequences can be isolated starting from the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 or parts of these sequences, for example using conventional hybridization methods or the PCR technique, from other eukaryotes such as, for example, the one mentioned above. These DNA sequences hybridize to the sequences mentioned under standard conditions. Short oligonucleotides are advantageously used for hybridization. used from 20 to 50 nucleotides in length. However, longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences can also be used for the hybridization. These standard conditions vary depending on the nucleic acid used: oligonucleotide, 5 longer fragment or complete sequence or depending on the type of nucleic acid DNA or RNA used for the hybridization. For example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA RNA hybrids, the hybridization
  • derivatives homologs of the sequence SEQ ID No: 1 are understood to mean, for example, eukaryotic homologs, shortened sequences, single-stranded DNA of the coding and non-coding DNA sequence or RNA of the coding and non-coding DNA sequence.
  • homologs of the sequence SEQ ID NO: 1 are to be understood as derivatives such as promoter variants. These variants can be changed by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), but without the functionality or effectiveness of the promoters being impaired. Furthermore, the effectiveness of the promoters can be increased by changing their sequence, or completely replaced by more effective promoters, including organisms of other species.
  • Derivatives are also advantageously to be understood as variants whose nucleotide sequence in the range -1 to -2000 before the start codon has been changed such that the gene expression and / or the protein expression is changed, preferably increased. Derivatives are also to be understood as variants that were changed at the 3 'end.
  • nucleic acid sequences which code for the proteins according to the invention can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, and can consist of different heterologous gene segments from different organisms.
  • synthetic nucleotide sequences with codons are generated which are preferred by the corresponding host organisms, for example plants. This usually leads to optimal expression of the heterologous genes.
  • plant preferred codons can be determined from the highest protein frequency codons expressed in most interesting plant species.
  • Corynebacterium glutamicum is given in: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res.
  • Functionally equivalent sequences which code for the proteins according to the invention are those derivatives of the sequence according to the invention which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions, that is to say the biological activity of the proteins.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here as well as artificial, e.g. artificial nucleotide sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon use of a plant.
  • artificial DNA sequences are suitable as long as, as described above, they have the desired property, for example targeting in the fatty acid and / or lipid metabolism. auxiliaries.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translating proteins constructed using molecular modeling, which have the biological activity, or by in vitro selection. Possible techniques for the in vitro evolution of DNA to change or improve the DNA sequences are described in Patten, PA et al. , Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997) or Moore, JC et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997). Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant are particularly suitable.
  • Biosynthesis genes of fatty acid and / or lipid metabolism may be mentioned as components of the nucleic acids according to the invention, such as advantageously a sequence which codes for proteins from the following group of proteins:
  • nucleic acids which code for one of the following proteins: fatty acid acyl transferase (s), ⁇ 4-desaturase, ⁇ 5-desaturase, ⁇ 6-desaturase, ⁇ 9-desaturase, ⁇ 12-desaturase, ⁇ 15-desaturase and / or a fatty acid elongase
  • nucleic acid sequences mentioned code for so-called fusion proteins, part of the fusion protein being a polypeptide with the sequence mentioned in SEQ ID NO: 2 or a functionally equivalent part thereof.
  • the second part of the fusion protein can e.g. be another polypeptide with enzymatic activity such as the above proteins.
  • the nucleic acids can advantageously be combined with other genes of fatty acid biosynthesis.
  • genes of fatty acid biosynthesis examples include acetyltransferases, further desaturases or elongases of unsaturated or saturated fatty acids as described in WO 00/12720.
  • acetyltransferases further desaturases or elongases of unsaturated or saturated fatty acids as described in WO 00/12720.
  • NADH cytochrome B5 reductases is advantageous, which can absorb or release reduction equivalents.
  • proteins used in the method according to the invention are to be understood as proteins which contain an amino acid sequence shown in the sequence SEQ ID NO: 2 or a sequence obtainable therefrom by substitution, inversion, insertion or deletion of one or 5 more amino acid residues, the biological activity of the protein shown in SEQ ID NO: 2 is retained or is not significantly reduced. Not significantly reduced is to be understood as meaning all proteins which are still at least 10%, preferably 20%, particularly preferred
  • amino acids can be replaced by those with similar physicochemical properties (space filling, basicity, hydrophobicity, etc.).
  • arginine residues against lysine residues valine residues against isoleucine
  • amino acids 15 residues or aspartic acid residues exchanged for glutamic acid residues.
  • one or more amino acids can also be interchanged, added or removed in their order, or several of these measures can be combined with one another.
  • Derivatives are also to be understood as functional equivalents, which in particular also include natural or artificial mutations of an originally isolated sequence coding for the proteins according to the invention, which furthermore contain the desired one
  • Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • nucleotide sequences are also included in the present invention.
  • nucleotide sequence coding for the protein comprises which is obtained by modification of the nucleotide sequence coding for the protein.
  • the aim of such a modification can e.g. further narrowing down the coding sequence contained therein or e.g. also be the insertion of further restriction enzyme interfaces.
  • nucleic acid sequences can also be introduced directly into the host organism.
  • the nucleus The acid sequence can advantageously be, for example, a DNA or cDNA sequence. Coding sequences suitable for insertion into an expression cassette are, for example, those which enable the protein targeting according to the invention. These sequences can be of homologous or heterologous origin.
  • These regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed and / or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the gene construct can also have a simpler structure, that is to say no additional regulation signals have been inserted in front of the nucleic acid sequence or its derivatives, and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural
  • the gene construct can also advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • promoters which can advantageously control the expression of foreign genes in organisms in plants or fungi are suitable as promoters in the nucleic acid construct.
  • a plant promoter or promoters which originate, for example, from a plant virus are preferably used.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacl ⁇ - T7, T5, T3 -, gal-, trc-, ara-, SP6-, ⁇ -P R - or contained in the ⁇ -P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • the expression cassette can also contain a chemically inducible promoter, by means of which the expression of the exogenous gene in the organisms can advantageously be controlled in the plants at a specific point in time.
  • Such advantageous plant promoters are, for example, the PRP1 promoter [Ward et al. , Plant.Mol. Biol .22 (1993), 361-366], a benzene sulfonamide-inducible (EP 388186), a tetracycline-inducible (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), a salicylic acid-inducible promoter ( WO 95/19443), an abscisic acid-inducible (EP335528) or an ethanol or cyclohexanone-inducible (W093 / 21334) promoter.
  • Further plant promoters are, for example, the promoter of the cytosolic FBPase from potato, the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), the promoter of the phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase from Glycine max (see also Genbank accession number U87999) or a node-specific promoter as in EP 249676 can advantageously be used.
  • Those plant promoters which express in tissues are particularly advantageous tu? a ⁇ P - H 3 0 t ⁇ r 0 C ⁇ ⁇ -_. cn FP P. S 3 P ⁇ ⁇ ⁇ SU iQ ⁇ .
  • ⁇ SU 3 3> ⁇ 3 o 13 H- o cn o rt 3 rt o 3 X 3 1 o • - 'oo 1 P F- ⁇ 3 P 13 ⁇ o ⁇ cn ⁇ oo • Ü P ⁇ - ⁇ r ⁇ i cn ⁇ H- ff.
  • Synthetic genes advantageous of fatty acid biosynthesis, which enable an increased synthesis.
  • the genes for the ⁇ 15-, ⁇ 12-, ⁇ 9-, ⁇ 6-, ⁇ 5-, ⁇ 4-desaturase, the various hydroxylases, the acyl-ACP-thioesterases, ⁇ -ketoacyl synthases or ⁇ -ketoacyl reductases may be mentioned.
  • the desaturase genes are advantageously used in the nucleic acid construct.
  • DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which is expediently read in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions can expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter can be native or homologous as well as foreign or heterologous to the host organism, for example to the host plant.
  • the expression cassette contains in the 5 '-3' transcription direction the promoter, a DNA sequence which codes for a gene used in the method according to the invention and a region for the transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) or corresponding functional equivalents.
  • a nucleic acid construct is produced by fusing a suitable promoter with a suitable nucleic acid sequence according to the invention and a polyadenylation signal according to common recombination and
  • the DNA sequence coding for a lipid body lipoxygenase from cucumber contains all the sequence features which are necessary in order to achieve a localization correct for the location of the fatty acid, lipid or oil biosynthesis. Therefore no further targeting sequences per se are necessary. However, such a location can be desirable and advantageous and can therefore be artificially changed or reinforced, so that such fusion constructs are also a preferred advantageous embodiment of the invention.
  • Sequences which ensure targeting in plastids are particularly preferred. Under certain circumstances, targeting in other compartments (ref .: Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423) can also be carried out, for example, in the vacuole, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER) , Peroxisomes, lipid bodies or due to a lack of such operative sequences to remain in the compartment of formation, the cytosol, may be desirable.
  • the nucleic acid sequences coding for proteins according to the invention are advantageously cloned together with at least one reporter gene into an expression cassette which is introduced into the organism via a vector or directly into the genome.
  • This reporter gene should enable easy detection via a growth, fluorescence, chemo, bioluminescence or resistance assay or via a photometric measurement.
  • These genes enable the transcription activity and thus the expression of the genes to be measured and quantified easily. This enables genome sites to be identified that show different levels of productivity.
  • an expression cassette comprises upstream, i.e. at the 5 'end of the coding sequence, a promoter and downstream, i.e. at the 3 'end, a polyadenylation signal and, if appropriate, further regulatory elements which are operatively linked to the DNA coding sequence in between.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • the preferred sequences for the operative linkage are targeting sequences to ensure subcellular localization.
  • An expression cassette can contain, for example, a constitutive promoter (preferably the USP or napin promoter) and the gene to be expressed.
  • the expression cassette is advantageously used for expression in a prokaryotic or eukaryotic host organism, for example a microorganism such as a fungus or a plant, in a vector such as a plasmid, for example
  • Suitable plasmids are for example in E. coli pLG338, pACYCl84, pBR series such as pBR322, pUC series such as pUC18 or pUC19, Mll3mp series, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III 113 -Bl , ⁇ gtll or pBdCI, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUBllO, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667, in mushrooms pALSl, pIL2 or pBBllzector, etc.
  • Advantageous Yeast vectors are, for example, 2 ⁇ M, pAG-1, YEp6, YEpl3 or pEM-BLYe23.
  • Examples of algae or plant vectors are pLGV23, pGHlac + , pBINl9, pAK2004, pVKH or pDH51 (see Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988)
  • the abovementioned vectors or derivatives of the abovementioned vectors represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or replicated chromosomally, chromosomal replication is preferred.
  • the expression cassette according to the invention can also advantageously be introduced into the organisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the expression cassette as a vector or the nucleic acid sequences according to the invention.
  • the nucleic acid sequence according to the invention can also be introduced into an organism on its own.
  • nucleic acid sequence according to the invention can all be introduced into the organism together with a reporter gene in a single vector or each individual gene with a reporter gene in each vector or several genes together in different vectors, the different vectors can be introduced simultaneously or successively.
  • the vector advantageously contains at least one copy of the nucleic acid sequences according to the invention and / or the expression cassette.
  • the plant expression cassette can be transformed into the transformation vector pRT ((a) Toepfer et al., 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 ff. ) to be built in.
  • pRT transformation vector
  • Fusion vectors used in prokaryotes frequently use inducible systems with and without fusion proteins or fusion oligopeptides, it being possible for these fusions to take place both N-terminally and also cterally or other usable domains of a protein.
  • Such fusion vectors generally serve: i.) To increase the expression rate of the RNA ii.) To increase the achievable protein synthesis rate, iii.) To increase the solubility of the protein, iv. ) or to simplify purification by means of a binding sequence that can be used for affinity chromatography.
  • proteolytic cleavage sites are also introduced via fusion proteins, which enables a part of the fusion protein to be split off, also for purification.
  • recognition sequences for proteases are e.g. Factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • Typical advantageous fusion and expression vectors are pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) which contains glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein, or protein A.
  • GST glutathione S-transferase
  • Further examples of E. coli expression vectors are pTrc [Amann et al.
  • yeast vectors for use in yeast are pYep-Secl (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 ( Schultz et al.,
  • insect cell expression vectors can also be used advantageously, e.g. for expression in Sf 9 cells. 20 These are e.g. the vectors of the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • plant cells or algal cells can advantageously be used for gene expression.
  • plant expression vectors can be found in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 or in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for 30 plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be expressed in mammalian cells.
  • Examples of corresponding expression vectors are pCDM8 and pMT2PC named in: Seed, B.
  • Promoters to be used are preferably of viral origin, e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or simian virus 40. Further prokaryotic and eukaryotic expression systems are mentioned in chapters 16 and
  • nucleic acids according to the invention, the expression cassette or the vector can be introduced into organisms, for example in plants, by all methods known to the person skilled in the art.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene cannon - the so-called particle bombardment method -, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, micro-injection and that by Agrobacterium mediated gene transfer.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al. , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 and in Potrykus Annu. Rev.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner for transforming plants, in particular crop plants, such as tobacco plants, for example, by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the transformation of plants with Agrobacterium tumefaciens is described, for example, by Höfgen and Willmitzer in Nucl. Acid Res.
  • Agrobacteria transformed with an expression vector as described above can also be used in a known manner to transform plants such as test plants such as Arabidopsis or crop plants such as cereals, corn, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, triticale, rice, Sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, coffee, cocoa, tea, carrot, paprika, rapeseed, tapioca, cassava, arrowroot, tagetes, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species, especially oil containing crops such as soy, peanut, castor, borage, linseed, sunflower, canola, cotton, flax, rapeseed, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinetorius) or cocoa bean are used, for example by bathing wounded leaves or pieces of leaf in an agrobacterial solution and then cultivated in suitable media.
  • test plants such as Arabidops
  • the genetically modified plant cells can be regenerated using all methods known to the person skilled in the art. Appropriate methods can be found in the above-mentioned writings by S.D. Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer can be found.
  • all organisms which are able to synthesize fatty acids, especially unsaturated fatty acids or are suitable for the expression of recombinant genes are advantageously suitable as organisms or host organisms for the nucleic acids used, the nucleic acid construct used or the vector used.
  • plants such as Arabidopsis, Asteraceae such as Calendula or crop plants such as Brassica, Linium, soybean, peanut, castor bean, sunflower, corn, cotton, flax, rapeseed, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinetorius) or cocoa bean, microorganisms such as yeasts, for example the genera Yarrowia or Saccharomyces, fungi, for example the genus Mortierella, Saprolegnia or Pythium, bacteria such as the genus Escherichia, cyano-bacteria, ciliates, algae or protozoa such as dinoflagellates such as Crypthecodinium.
  • yeasts for example the genera Yarrowia or Saccharomyces
  • fungi for example the genus Mortierella, Saprolegnia or Pythium
  • bacteria such as the genus Escherichia, cyano-bacteria, ciliates, algae or protozoa
  • transgenic animals are also suitable as host organisms, for example C. elegans.
  • Useful host cells are also mentioned in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • the expression of the nucleic acid sequences according to the invention can take place specifically in the leaves, in the seeds, in the tubers or in other parts of the plant.
  • Such fatty acids, oils or lipids overproducing transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts are a further subject of the present invention.
  • a preferred subject of the invention are transgenic plants, for example crop plants such as corn, oats, rye, wheat, barley, corn, rice, soybeans, sugar beet, canola, triticale, sunflower, flax, hemp, tobacco, tomato, coffee, cocoa, tea, carrot, Paprika, rapeseed, tapioca, cassava, arrowroot, tagetes, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species, potato, in particular oil-containing crops, such as soybean, peanut, castor bean, borage, flax, sunflower, canola, tree - wool, flax, rapeseed, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinetorius) or cocoa bean, test plants such as Arabidopsis or other plants such as moss or algae containing a functional nucleic acid sequence according to the invention or a functional expression cassette.
  • Function means that a biologically active protein is formed.
  • the expression cassette or the nucleic acid sequences according to the invention containing a nucleic acid sequence according to the invention can also be used to transform the above-mentioned organisms such as bacteria, cyanobacteria, filamentous fungi, ciliates, animals or algae with the aim of increasing the content of fatty acids, oils or lipids.
  • Preferred transgenic organisms are yeasts, fungi or plants, particularly preferably plants.
  • Transgenic organisms are understood to mean organisms which contain a foreign nucleic acid from another organism which codes for a protein used in the method according to the invention.
  • Transgenic organisms are also understood to mean organisms that contain a nucleic acid that comes from the same organism, this nucleic acid being contained as an additional gene copy or not in the natural one Nucleic acid environment of the nucleic acid sequence according to the invention is included.
  • Transgenic organisms are also organisms in which the natural 3 'and / or 5' region of the nucleic acid according to the invention has been changed by targeted genetic engineering changes compared to the starting organism.
  • Transgenic organisms in which a foreign DNA has been introduced are preferred.
  • Transgenic plants are particularly preferred.
  • Transgenic plants are understood to mean individual plant cells and their cultures, such as callus cultures on solid media or in liquid culture, parts of plants and whole plants.
  • Cucumber seeds were germinated in the dark at 26 ° C for 2 or 4 days as indicated for each preparation.
  • the cotyledons were harvested and homogenized using the method described previously [Kindl, H. et al. , Methods Enzymol., 96, 1983: 700-715] were cut with a scalpel. After removing cell debris and differential centrifugation, the sediments of centrifugation at 10,000 xg or centrifugation at 100,000 xg were sedimented in a sucrose gradient according to [Sturm, A. et al., FEBS Lett., 160, 1983: 165-168] or floats.
  • a crude lipid body fraction was obtained by subjecting the supernatant to a short (10 min) centrifugation at 2,000 x g, centrifugation for 30 min at 10,000 x g and removing the lipid layer formed in the upper section of the centrifuge tube. The further cleaning of the lipid bodies was carried out by gently suspending the lipid layer and repeated flotation [Sturm, A. et al. , Eur. J. Biochem. , 150, 1985: 461-468].
  • Tobacco plants were cultivated at 22 ° C under permanent exposure (2000 lux) in magenta boxes.
  • the media for growing transformants were according to [Horsch, R.B. et al., Science 227, 1985: 1229-1231; Jefferson, R.A. et al. , EMBO J., 6, 1987: 3901-3907].
  • CSLBLOX-221 was used in the vector pSport-1 [Höhne, M. et al. , Eur. J. Biochem., 241, 1996: 6-11].
  • An N-terminal deletion was made by digesting CSLBLOX-221 first with Smal / Ndel and then with ffaelll. After ligation in pSport-1 (Life Technologies), this construct, in which the first 80 nucleotides of pCSLBLOX-221 were deleted [Höhne, M. et al. .
  • the construct pBI121 ⁇ GUS was prepared by filling the GUS cassette with Smal and SstI was cut out and a smooth end was produced using T4 DNA polymerase.
  • LBLOX contained in the vector pSport-1 [Höhne, M. et al. , Eur. J. Biochem., 241, 1996: 6-11] was cut out with Smal / BamHI, ligated with a BamHI linker and introduced into the BamHI-cleaved dephosphorylated vector pBI121 ⁇ GUS.
  • HA label a triple hemagglutinin label (HA label), which was provided with a Sacl site, was inserted. Taking into account the 3 -YPYDVPDYA sequences and the linker, the total length of the insert was 30 amino acids.
  • Ag-ro-acterium tumefaciens LB-A4404 was transformed with pBI121 ⁇ GUS-LBLOX or pBI121 ⁇ GUS-LBLOX-HA 3 according to the freeze-thaw method. These bacteria were used to transform leaf disks from Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR-1 according to the established method of Horsch et al. [Science 227, 1985:
  • the rungs were selected on Linsmaier and Skoog medium enriched with 0.5 mg / 1 N-benzylaminopurine, 500 mg / 1 cefotaxime and 75 mg / 1 kanamycin. Kanamycin-resistant plants with increased LOX levels were propagated vegetatively.
  • Leaves of homozygous kanamycin-resistant tobacco lines containing the pBI121 ⁇ GUS-LBLOX-HA 3 construct were in 50 mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 5 mM MgCl 2 , 0.5 mM EDTA, 50 mM KCl, 2.5 homogenized mM dithiothreitol, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and 15% (w / w) sucrose (buffer A) in the presence of polyvinylpyrrolidone (25,000) (Merck). After centrifugation, the supernatant from the 100,000 xg centrifugation was desalted, concentrated and fractionated on a large Biogel A 1.5 column.
  • This mutant LBLOX protein contained an insert of 30 amino acid residues corresponding to a triple HA-5 label behind amino acid residue 68 of the wild-type enzyme and had a theoretical molecular mass of 104 kDa. This difference in size between the wild-type and the recombinant protein was clearly demonstrated by SDS-PAGE.
  • Translation was carried out using purified mRNAs, reticulocyte lysate and [ 35 S] L-methionine in the presence or absence of dog pancreatic microsomes. Alternatively 15 microsomes prepared from cucumber cotyledons were used for co-translational or post-translational transport assays.
  • Radioactive labeling experiments in vivo were performed as short pulse experiments with cotyledons of seedlings germinated for 4 days. Five g of cotyledons were cut into 2 mm pieces and incubated with 8 MBq [ 35 S] L-methionine (40 TBq / mmol) for 15 min 25. The careful homogenization and preparation of subtractions was carried out as described above.
  • the fraction containing the lipid bodies was resuspended in buffer A, adjusted to 30% (w / w) sucrose and covered with buffer A. After centrifugation at 100,000 g for 1 hour, the floated lipid bodies were collected and subjected to various washing processes.
  • Liposomes were made according to [Woodle, M C. & Papahadjopoulos, D., Methods Enzymol. 171, 1989: 193-217] from a crude soybean-5 lecithin mixture (Sigma) or from defined dilinoleoylphosphatidylcholine, with or without addition of the serine derivative, as unilamellar vesicles. Routinely, using detergent solubilization and removal, the molar ratio of dilinoleoylphosphatidylcholine to sodium cholate was
  • Trilinolein built into the liposomes, so that phospholipid-covered lipid droplets were obtained which are comparable to "black” lipid bodies. This preparation was initiated by adding 200 mg soybean lecithin and 500 mg trilinolein
  • 25 liposomes was in the range of 1 ⁇ m.
  • a liposome suspension corresponding to 1 mg lecithin in 150 mM 30 NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 was incubated for 10 min either with 4 ⁇ g unlabelled protein or with the supernatant of a reticulocyte lysate translation mixture. After adjusting to 42% (w / w) sucrose, the suspension was transferred to a 12 ml centrifuge tube. A linear sucrose density gradient of 37-26% (w / w) sucrose was layered on the sample. The flotation of the protein-covered liposomes was carried out by centrifugation for 6 hours at 100,000 g. After fractionation, protein analysis was carried out using SDS-PAGE and immune labeling.
  • Immunoprecipitation of the radioactively labeled enzymes was carried out under standard conditions (method 1) by adding 1 ⁇ g of the corresponding purified protein to the mixture with 20 ⁇ l antiserum before the precipitation. After standing for 12 hours at 20 ° C and 20 hours at 4 ° C, the precipitate was sedimented by centrifugation at 3000 x g. The sediment was washed at least 5 times and then dissolved in SDS. For the direct precipitation of other proteins (method 2), the antigen was not further diluted, but incubated for 6 hours with 2 ⁇ l antiserum and then mixed with protein A-Sepharose. After transferring the mixture to a small vessel 0 and washing extensively, the antigen was eluted together with the IgG using 100 mM acetic acid.
  • the first step was to determine which pools in the cell cross the LBLOX protein.
  • the targeting structure, sequence or domains responsible for the transfer were localized.
  • PLA mRNA obtained by in vifcro transcription from pPAT291 was also translated and the translation product, i.e. H. radiolabelled phospholipase was incubated with microsomes. After flotation in a sucrose gradient, the subtractions were analyzed by SDS-PAGE and fluorography (FIG. IC). Fluorography showed that a large part of the translation product had bound to microsome membranes.
  • Figure 2A shows that the majority of the pulse labeled LBLOX was obtained in the fraction containing the cytosol. A small but significant amount of the radioactive LBLOX was continuously found in the microsomes and also in microsome fractions which were further purified by flotation in sucrose gradients (FIG. 2A). In order to rule out the possibility that small percentages of all newly synthesized proteins contaminated the ER-containing fraction, we analyzed the amount of proteins in the microsome fraction that were either cytosolic or as an artifact in the cytosol-containing supernatant of a 100,000 g Centrifugation were released.
  • isocitrate lyase as a strongly expressed cucumber protein at this stage of development, the presence of this protein in the microsome fraction and in the soluble supernatant was determined by immunoprecipitation. 2B shows that, in contrast to LBLOX, isocitrate lyase was practically absent in the ER preparation.
  • FIG. 2A The data shown in FIG. 2A show that LBLOX crosses the cytosol as the first pool on its way to the lipid bodies. It is also evident that LBLOX has membrane binding properties and is partially protected from proteolysis when bound to the ER membrane. Despite areas in the LBLOX molecule that have affinity for membranes, a large part of the LBLOX in vitro is accessible for chemical modification and could therefore protrude into the cytosol in vivo. Part C of FIG. 2 provides an indication of the extent to which the part of LBLOX that is bound to microsome membranes is accessible for proteolytic degradation.
  • the LOX isoform which can be detected by Western blot analysis on microsomes isolated from cotyledons, is structurally identical to the LOX isoform bound to lipid bodies. This was demonstrated by comparing the fragment pattern after limited proteolysis (data not shown).
  • the type of binding of LBLOX to the microsome membrane corresponds to that of a peripherally bound membrane protein. Washing with 100 mM MgCl 2 removed more than 90% of the labeled LBLOX.
  • the binding of LBLOX to the microsomes in the presence of a low salt buffer and also under the conditions of repeated gradient centrifugation was quite stable. The stable binding was also shown by the fact that LOX on microsomes was only partially accessible for proteolysis (FIG. 2, part C).
  • LBLOX was undetectable in the glyoxysome fraction which was subjected to a final purification by sucrose gradient flotation. Soluble LBLOX thus binds to membranes, but not evenly to all membranes.
  • the affinity of LBLOX for glyoxysome membranes (Fig. 3B) is at least an order of magnitude lower than the demonstrated affinity for microsomes (Fig. 3A, lane 3).
  • the binding of LBLOX in cucumber cotyledons therefore requires a high degree of selectivity, since other organelles are not labeled with LBLOX and are not modified for degradation.
  • Cucumber LBLOX and soybean LOX-1 differ in their affinity for liposomes
  • LBLOX has an intrinsic affinity for membrane lipids regardless of specific protein-protein interactions
  • the binding studies were expanded and included liposomes as acceptor membranes.
  • the experiments were carried out using crude soybean lecithin as a source of phosphatidylcholine. Subsequently, phosphatidylcholine with different degrees of purity was also used in combination with phosphatidylserine for the production of liposomes. The size of the liposomes was checked by comparison with MonoQ beads as the standard.
  • LOX-1 has no affinity for the lipid phase.
  • Control experiments with either a typical cytosolic protein or with a mixture containing LBLOX and cytosolic proteins and prepared from cucumber cotyledons showed that the membrane affinity of LBLOX is quite unique (data not shown).
  • the N-terminal region including the ß-barrel structure is essential for the binding of LBLOX to lipid bodies
  • the lipid body fraction contained 50 kBq 45 Ca 2+ , which corresponds to approximately 1 n ol.
  • the same preparation had 2 nmol LBLOX.
  • Further treatment with 100 mM unlabeled CaCl 2 removed 90% of the radioactivity from the lipid bodies, whereas the majority of the LBLOX remained bound to the lipid bodies.
  • LBL0X-HA recombinant protein
  • the liposome experiments shown in FIG. 7 summarize the evidence that the N-terminal ß-barrel of LOX alone is sufficient for their binding to membranes and the destruction of the ß-barrel inactivates the transfer.
  • Wild-type LBLOX and the ß-barrel fusion protein (GST-LOX) bind to the liposomes practically quantitatively, the insertion of a peptide into the barrel structure removes the membrane affinity.
  • the N-terminal extension as a specific motif and the ß-barrel, which is in the amino acid sequence following the N-terminal extension, as a general means of increasing membrane affinity.
  • Targeting signals as unfolded areas of 7 amino acid residues have been found when proteins are transported in mitochondria, chloroplasts or the ER.
  • a domain that has already been folded into a certain form can bring about membrane binding.
  • Another part has to be postulated which mediates the selectivity of the binding of LBLOX to lipid bodies. If there is a large amount of LBLOX, in addition to lipid bodies, the ER and the Golgi vesicles are also covered with LBLOX. However, if the intracellular amount of LBLOX decreases, the LBLOX molecules mainly occupy the surface of lipid bodies.
  • Part A shows a comparison of the migration behavior of LBLOX (lane 1) produced by vifcro translation, LBLOX isolated from microsomes (lane 2) and LBLOX (lane 3) isolated from lipid bodies.
  • LBLOX LBLOX isolated from microsomes
  • LBLOX LBLOX isolated from lipid bodies
  • LBLOX LBLOX isolated from lipid bodies
  • LBLOX LBLOX isolated from lipid bodies
  • the membrane bound lipid body lipoxygenase (Part B) or phospholipase (Part C) obtained after flotation are shown on the left.
  • Lane 1 at B and C corresponds to the upper portion of the sucrose gradient
  • lane 12 (at B) and lane 13 (at C) correspond to the bottom and represent non-membrane-bound (non-floating) proteins that remain in place on which the incubation mixture was layered under the gradient before centrifugation.
  • Fig. 2 Results of the pulse labeling of proteins in cotyledons, which indicate a weak binding of LBLOX to microsomes, but a significant LBLOX pool in the cytosol.
  • Lane 1 (microsomes) and lane 2 (“cytosol”) show fluorograms, whereas lanes 3 and 4 show the protein stains. Lane 1 (and the corresponding protein stain in Lane 3) shows the absence of contamination of isocitrate lyase in the microsomes.
  • Part C Treatment of labeled microsomes (analyzed as in Part A, lane 1) with proteinase K. After proteolysis, phenylmethylsulfonyl fluoride and 1 ⁇ g of the corresponding cold protein were added and immunoprecipitation was carried out. Lanes 1 through 4 show fluorograms: untreated microsomes in lane 1; untreated cytosol in lane 2; treated microsomes in lane 3; treated cytosol in lane 4.
  • Part D Localization of the cucumber LBLOX on microsomes from transgenic tobacco plants. After the flotation of the membranes in a linear sucrose density gradient, subtractions were analyzed using immunoblot. Lane 1 corresponds to the upper section of the centrifuge tube (23% sucrose), lane 3 (32% sucrose), lane 5 (39% sucrose), lane 6 (41% sucrose) and lane 7 (sample filled with 43% sucrose).
  • Fig. 3 In vitro experiments showing that radioactively labeled cytosolic LBLOX weakly binds to microsome membranes (part A) but practically does not bind to glyoxysomes (part B).
  • Part A 1 g of cotyledons was incubated with 9 MBq [ 35 S] L-methionine for 3 hours. A 100,000 g supernatant containing radiolabelled cytosolic LBLOX was then prepared. This preparation was mixed with a homogenate made from untreated cotyledons. The ER / Golgi fraction was isolated by subsequent gradient centrifugation. An aliquot (1/20) of the ER / Golgi fraction (lane 1) and an aliquot (1/20) of the re-isolated cytosol (lane 2) and a large aliquot (1/2) of the ER / Golgi fraction (lane 3 ) were subjected to SDS-PAGE and fluorography.
  • Part B In a similar mixing experiment, isolated unlabeled glyoxysomes were incubated with the radioactive cytosol prepared in vivo-labeled cotyledons. The subsequent rice isolation of the glyoxysomes and glyoxysome membranes was carried out by flotation in a sucrose gradients performed. For this purpose, the incubation mixture was adjusted to 60% (w / w) sucrose. A gradient (56 to 38% sucrose) was layered on the sample. After centrifugation at 27,000 rpm for 15 hours in a Beckman SW-28 rotor, the fractions were analyzed by SDS-PAGE and fluorography. The position of the marked LBLOX in the fluorogram is indicated by an arrow.
  • the lanes correspond to the following fractions (equilibrium densities in brackets): lane 4 (48% sucrose), lane 5 (48.5% sucrose), lane 6 (49% sucrose), lane 7 (50.5% sucrose), Lane 8 (452.5% sucrose), Lane 24 (56% sucrose), Lane 25 (56.5% sucrose), Lane 26 (58% sucrose), Lane 27 (59% sucrose) and Lane 28 (59% sucrose) ).
  • the numbers of fractions 25-28 correspond to the position in the gradient at which the suspension was filled before centrifugation.
  • Lanes 4-5 encompass the glyoxysome membranes and lane 8 contains the glyoxysomes according to the protein profile.
  • Fig. 4 Affinity of LBLOX and PLA expressed in bacteria to liposomes.
  • Flotation was carried out by centrifugation at 100,000 g for 6 hours.
  • the proteins in the subtractions obtained from the gradient were analyzed by SDS-PAGE and immunoblots.
  • Appropriate antisera which had been produced either against LBLOX or against the patatin-like protein, were used for the immune labeling.
  • the rightmost traces always show the soil on which the incubation mixture was layered under the gradient before centrifugation. The flotation thus took place from right to left.
  • Fig. 5 Schematic representation of the LBLOX structure and its N-terminal section (amino acid residues 48-244), which has the ß-barrel.
  • the structure of the LBLOX was calculated based on the crystal structure data obtained for soybean LOX-1 [21] using the primary sequence of the LBLOX.
  • the N-terminus and the ß-barrel consisting exclusively of ß-leaflets are shown somewhat separately at the bottom right.
  • the main part of the LOX, which comprises the active center at the C-terminus, is dominated by ⁇ -helices.
  • the lower part of the figure represents an enlarged view of the N-terminal
  • the 40 7elsmino acid residues of the outermost N-terminus, an extension not found in other LOX structures, are not shown.
  • the broken structure marked with arrows at the bottom right shows a point at which the amino acid sequence of the LBLOX differs considerably from that of the soybean LOX-1.
  • the program used (Swiss 3D model, Expasy-Server) resulted, similar to LOX-1, in a highly flexible loop and thus an undefined structure.
  • This loop consists of 14 amino acid residues in LOX-1, but comprises 20 amino acid residues in LBLOX.
  • the two glutamyl residues E59 and E70 are unique and are only found in LBLOX and not in soybean LOX-1. This site can play a role in the Ca 2+ -coordinated membrane association.
  • the affinity-purified fusion protein GST-LBLOX244 was added to a suspension of lipid bodies in enriched cytosol. After the incubation, the lipid bodies were removed using
  • Fig. 7 Binding of LBLOX constructs and recombinant proteins with wild-type and modified ⁇ -barrel to liposomes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine isolierte Nulkleinsäuresequenz, die für ein Polypeptide codiert und die aus einer Kombination der Nukleinsäuresequenzen einer Biosynthesenukleinsäuresequenz des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels mit einer der folgenden Nukleinsäuren zusammengesetzt wird: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nuleinsäuresequenz ableiten, c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 60 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, d) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:3 dargestellten Sequenz oder des Aminoterminale Teils des kodierenden Bereichs dieser Sequenz.

Description

DAS BETA- BARREL DER LIPIDKÖRPERLIPOXYGENASE
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Targeting von an der Biosynthese von Lipiden oder Fettsäuren beteiligten Proteinen in Liposomen oder Lipidkörpern. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren und Lipiden in einem Öl produzierenden Organismus.
Außerdem betrifft die Erfindung Nukleinsauresequenzen, die für ein Polypeptid codieren und die aus einer Kombination von Nukleinsauresequenzen einer Biosynthesenukleinsäuresequenzen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels mit einer Nukleinsauresequenz, die für das Targeting von Proteinen codiert, zusammengesetzt ist. Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte enthaltend diese Nukleinsauresequenzen, Vektoren und transgene Organismen, die die Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren enthalten.
Ölfrüchte spielen eine wichtige Rolle in der menschlichen Ernährung. In keimenden Samen werden die endogenen Speicher Triacylgycerid-speichernder Pflanzen abgebaut, damit sogar in Abwesenheit von Licht die de novo-Bildung von neuem Gewebe möglich ist [Rees et al . , Biochim. Biophys . Acta, 385, 1975: 145-156; Kindl, H., Biochimie, 75, 1993: 225-230]. Triacyl- gyceride werden in besonders hoch spezialisierten Geweben, z.B. im Endosperm oder den Kotyledonen, gespeichert. Zellen dieses Typs enthalten Lipidkörper als Kompartimente, die das Fett speichern [Murphy, D. J. , Prog. Lipid Res . , 32, 1993:247-280; Huang, A. H. C, Curr. Opinion Struct. Biol., 4, 1994: 493-498]. "ZU "Beginn der Keimung werden die Lipidkörper und ihr Inhalt abgebaut und stellen Fettsäuren für die Glyoxysomen bereit, die für die ß-Oxidation der Fettsäuren verantwortlich sind [Kindl, H., Z. Naturforsch., C 52, 1997: 1-8]. In Gurken-Kotyledonen werden Phospholipase A2 (PLA) [May. C. et al . , Biochim. Biophys. Acta, 1393, 1998: 267-276] und eine bestimmte Isoform der Lipoxy- genase [Lipidkörperlipoxygenase, LBLOX) [Feussner, I. et al . , Planta, 198, 1998: 288-293; Höhne, M. et al . , Eur. J. Biochem. , 241, 1996: 6-11.] beim Schritt der Triacylglycerid-Mobilisierung synthetisiert und zu den Lipidkörpern transportiert. PLA (ein Patatin-ähnliches Protein [May. C. et al . , Biochim. Biophys. Acta, 1393, 1998: 267-276]) spielt eine entscheidende Rolle bei der Einleitung des Mobilisierungsprozesses, indem es die Phospho- lipid-Monolayer der Lipidkörper zerstört [Noll, F. et al . , J. Struct. Biol., 1999: eingereicht]. Anschließend bewirkt die Lipoxygenase die Modifizierung der Acylreste in den Triacyl- gyceriden, bei denen es sich hauptsächlich um Linoleylgruppen handelt [Feussner, I. et al . , FEBS Lett., 431, 1998: 433-436]. Schließlich wird nach Reduktion und der Einwirkung einer spezifischen von Hydroxyoctadecadienoylresten abhängigen Lipase S-13-Hydroxyoctadecadienoat aus den Lipidkörpern ins Cytosol freigesetzt [Feussner, I. et al . , Proc . Natl. Acad. Sei. USA, 92, 1995: 11849-11853] und dann durch die Glyoxysomen abgebaut [Kindl, H., Biochimie, 75, 1993: 225-230; Kindl, H., Z. Natur- forsch., C 52, 1997: 1-8].
Im Verlauf der Lipidmobilisierung wird ein Satz neu synthetisierter Proteine an die Oberfläche der Lipidkörper transportiert [Sturm, A. et al . , Eur. J. Biochem. , 150, 1985: 461-468], darun- ter LBLOX und PLA. Frühere Arbeiten [May. C. et al . , Biochim. Biophys. Acta, 1393, 1998: 267-276; Feussner, I. et al . , Planta, 198, 1998: 288-293] haben gezeigt, dass LBLOX und PLA nur während eines kurzen Zeitraums, d. h. zu Beginn der Lipidmobilisierung, transient synthetisiert werden. Die Vorgänge beim Transport dieser Proteine innerhalb der pflanzlichen Zelle sind noch völlig unklar .
Es bestand daher die Aufgabe die Signale des intrazellulären Transport zu vestehen und für das Targeting von Proteinen zu nutzen.
Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zum Targeting von an der Biosynthese von Lipiden oder Fettsäuren beteiligten Proteinen in Liposomen oder Lipidkörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man die für die Proteine kodierenden Nukleinsäuren mit einer der folgenden Sequenzen in einer gemeinsamen Protein kodierenden Sequenz kombiniert :
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 60 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, d) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder des Aminoterminale Teils des kodierenden Bereichs dieser Sequenz, und
und die erhaltene Sequenz in einen eukaryontisehen Organismus einbringt, gelöst.
In der vorliegenden Arbeit wurden Belege für einen post-trans- lationalen Transfer von LBLOX und PLA zu Lipidkörpern gefunden. Dabei zeigte sich, daß eine N-terminale Domäne der Lipidkörper- LOX, die als ß-Barrel gefaltet ist, für die Membranbindungseigen- schaften des Enzyms verantwortlich ist. Diese Domäne des Proteins codiert durch die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz, das eine Membrantargeting-Struktur aufweist, kann im erfindungsgemäßen Verfahren für das Proteintargeting von Fremdproteinen zu Lipidkörpern beispielsweise in Ölsamen verwendet werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich Proteine, die vorteilhaft am Fettsäure- und/oder Lipidstoffwechsel beteiligt sind gezielt an den Ort der gewünschten Synthese zu dirigieren.
Durch das Einbringen der Nukleinsauresequenz in einen eukaryon- tischen Organismus können im erfindungsgemäßen Verfahren Proteine dirigiert werden. Dazu werden die Organismen in einem geeigneten Medium angezogen.
Weitere Erfindungsgegenstände sind ein Verfahren zum Targeting von an der Biosynthese von Lipiden oder Fettsäuren beteiligten Proteinen in Liposomen oder Lipidkörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine wie unten beschriebene erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt.
Ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren oder Lipiden dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und daß in dem Organismus enthaltene Öl isoliert.
Ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und daß in dem Organismus enthaltene Öl isoliert und die Fettsäuren freisetzt. Verfahren wie vorgehend beschrieben, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Organismus um eine Pflanze oder einen eukaryontisehen Mikroorganismus handelt.
Unter der oben beschriebenen Anzucht des Organismus ist die Kultivierung von Pflanzen ebenso zu verstehen wie die Anzucht von eukaryontisehen Mikroorganismen wie Hefen, Pilze, Ciliaten, Algen, tierische oder pflanzliche Zellen oder Zellverbänden.
Als Organismen für das Verfahren seien beispielhaft Pflanzen wie Arabidopsis, Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Tee, Karotte, Paprika, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Triticale, Tabak, Tomate, Raps, Kaffee, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Erdnuß, Rizinus, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinetorius) , Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Hefen wie Yarrowia oder Saccharo- myces; Pilze Mortierella, Saprolegnia, Traustochytrium oder Pythium, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthe- codinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Mikroorganismen wie Hefen wie Yarrowia lypolytica oder Saccharomyces cereviseae, Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Arabidopsis thaliana, Soja, Raps (Braccica napus) , Kokosnuß, Ölpalme, Canola, Färbersaflor (Carthamus tinetorius) , Rizinus, Calendula, Lein (Linium usitatissimum) , Borretsch, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume, besonders bevorzugt werden Soja, Raps oder Sonnenblume.
Die in den im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Organismen enthalten vorteilhaft gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren in Form von gebundenen Fettsäuren, das heißt die ungesättigten Fettsäuren liegen überwiegend in Form ihrer Mono- , Di- oder Triglyceride, Glycolipide, Lipoproteine oder Phospholipide wie Öle oder Lipide oder sonstig als Ester oder Amide gebundenen Fettsäuren vor. Auch freie Fettsäuren sind in den Organsimen in Form der freien Fettsäuren oder in Form ihrer Salze enthalten. Die durch Anzucht im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Organismen und die in ihnen enthaltenen gesättigten oder unge- sättigten Fettsäuren können direkt beispielsweise zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, von Agrochemikalien, Futtermitteln oder Lebensmitteln verwendet werden oder aber nach Isolierung aus den Organismen. Dabei können alle Stufen der Auf- reinigung der gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren verwendet werden, das heißt von Rohextrakten der Fettsäuren bis zu vollständig gereinigten Fettsäuren sind für die Herstellung der vorgenannten Produkte geeignet. In einer vorteilhaften Ausführungs- form können die gebundenen Fettsäuren aus beispielsweise den Ölen bzw. Lipiden beispielsweise über eine basische Hydrolyse z.B. mit NaOH oder KOH freigesetzt werden. Diese freien Fettsäuren können direkt im erhaltenen Gemisch oder nach weiterer Aufreinigung zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, von Agro- chemikalien, Futtermitteln oder Lebensmitteln verwendet werden. Auch können die gebundenen oder freien Fettsäuren zur Umesterung oder Veresterung beispielsweise mit anderen Mono-, Di- oder Triglyceriden oder Glycerin verwendet werden, um den Anteil an ungesättigten Fettsäuren in diesen Verbindungen beispielsweise in den Triglyceriden zu erhöhen.
Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze, Ciliaten, pflanzliche oder tierische Zellen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter je nach Organismus Sauerstoffbegasung oder in Abwesenheit von Sauerstoff angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt der pH wird während der Anzucht reguliert oder der pH wird nicht reguliert und verändert sich während der Anzucht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuier- lieh nach gefüttert werden. Auch eine Anzucht auf festen Medien ist möglich.
Pflanzen werden nach Transformation in der Regel zunächst regeneriert und anschließend wie üblich angezüchtet bzw. angebaut. Dies kann im Gewächshaus oder im Freiland erfolgen.
Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicherweise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare
Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Über- schuß an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuß von Lösungmittel zu Biomasse von 1:4. Das Lösungsmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt. Die Extraktion kann auch mit superkritischem C02 erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise über Filtration entfernt werden.
Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit polaren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über chromatographische Verfahren, Destillation oder Kristallisation ist möglich.
Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden diese in üblicherweise, wie oben beschrieben, verseift.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind isolierte Nukleinsauresequenzen, die für ein Polypeptid codiert und die aus einer Kombination der Nukleinsauresequenzen einer Biosynthesenuklein- säuresequenz des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels mit einer der folgenden Nukleinsäuren zusammengesetzt wird:
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier- ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten
Nukleinsauresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dar- gestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 60 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen,
d) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder des Aminoterminale Teils des kodierenden Bereichs dieser Sequenz .
Diese erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen ermöglichen im erfindungsgemäßen Verfahren das Targeting von Proteinen.
Unter Derivate (n) sind beispielsweise funktioneile Homologe der von SEQ ID NO: 1 kodierten Proteine oder deren biologischer Aktivität, das heißt Proteine, die dieselben biologischen Reaktionen wie die von SEQ ID NO: 1 gesteuerten, zu verstehen. Diese Gene ermöglichen ebenfalls ein vorteilhaftes Targeting von Proteinen. Unter biologischer Aktivität ist das Dirigieren von Proteinen vorteilhaft von Proteinen, die am Fettsäure- und/oder Lipidstoffwechsel beteiligt sind, innerhalb der Zelle zu verstehen.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure- 5 sequenz (en) (für die Anmeldung soll der Singular den plural umfassen und umgekehrt) oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer genomischer Sequenzen über Homologie- screening verwendet werden .
10 Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen eukaryontisehen Organismen wie Pilzen, Hefen oder Pflanzen wie speziell Moosen isolieren.
Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktioneilen Derivaten der
15 in SEQ ID NO: 1 genannten Sequenz beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, vorteilhaft mindestens 70 % Homologie, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85 % Homologie, ganz besonders bevorzugt 90 % Homologie aufweisen.
20 Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE bzw. BACKTRANSLATE (= Bestandteil des Programmpaketes UWGCG, Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Deverux et al . , Nucleic. Acid Res . , 12,
25 1984: 387-395) verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al . , CABIOS, 5 1989: 151-153). Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleitete Aminosäuresequenz ist Sequenz SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Unter Homologie ist Identität zu verstehen, das heißt die Aminosäuresequenzen sind zu mindestens 60 %
30 identisch. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auf Nukleinsäure- ebene mindestens 50 % Homolog, bevorzugt mindestens 60 %, besonders bevorzugt 70 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 %.
Allelvarianten umfassen insbesondere funktioneile Varianten, 35 die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die biologische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt, das heißt diese Proteine besitzen noch immer die Fähigkeit des Proteintragetings . 40
Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von der in SEQ ID NO: 1 beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise 45 den oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide vorteil- haft von 20 bis 50 Nukleotiden länge verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure : Oligonukleotid, 5 längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
10
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in
15 Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs-
20 bedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von
25 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al . , "Molecular Cloning" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von
30 der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al . (eds) , 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids
35 Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Uni- versity Press, Oxford; Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
40 Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID No : 1 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.
45 Außerdem sind unter Homologen der Sequenz SEQ ID NO: 1 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -2000 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3 ' -Ende verändert wurden.
Die Nukleinsauresequenzen, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA- Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen Expression der heterologen Gene. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Ein Beispiel für Corynebacterium glutamicum ist gegeben in: Wada et al . (1992) Nucleic Acids Res .
20:2111-2118). Die Durchführung solcher Experimente sind mit Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekann .
Funktioneil äquivalente Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenz, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, das heißt die biologische Aktivität der Proteine besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natür- lieh vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Codon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid- Sequenzen.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise das Targeting im Fettsäure- und/oder Lipidstoffwechsel ver- mittein. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die die biologische Aktivität aufweisen, oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Mögliche Techniken zur in vitro-Evolution von DNA zur Veränderung bzw. Verbesserung der DNA-Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P.A. et al . , Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 ( 1997) oder bei Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997). Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Codon-Nutzung erhalten werden.
Als Bestandteile der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren seien Biosynthesegene des Fettsäure- und/oder des Lipidstoffwechels genannt wie vorteilhaft eine Sequenz die für Proteine aus der folgenden Gruppe von Proteinen codiert:
Acyl-CoA-Dehydrogenase (n) , Acyl-ACP[= acyl carrier protein] - Desaturase (n) , Acyl-ACP-Thioesterase (n) , Fettsäure-Acyl- Transferase (n) , Fettsäure-Synthase (n) , Fettsäure-Hydroxylase (n) , Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (n) , Acyl-Coenzym A-Oxidase(n) , Fettsäure-Desaturase (n) , Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen und/oder Fettsäure-Elongase (n) . Vorteilhaft handelt es sich dabei um Nukleinsäuren, die für eines der folgenden Proteine codieren: Fettsäure-Acyl-Transferase (n) , Δ4-Desaturase, Δ5-Desaturase, Δ6-Desaturase, Δ9-Desaturase, Δ12-Desaturase, Δ15-Desaturase und/oder eine Fettsäure-Elongase
Die genannten Nukleinsäure-Sequenzen codieren für sogenannte Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 genannten Sequenz oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität wie beispielsweise die oben genannten Proteine sein.
Vorteilhaft können die Nukleinsäuren im erfindungsgemäßen Verfahren mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese kombiniert werden. Beispiele für derartige Gene sind die Acetyltransferasen, weitere Desaturasen oder Elongasen ungesättigter oder gesättigter Fettsäuren wie in WO 00/12720 beschrieben. Für die in-vivo und speziell in-vitro Synthese ist die Kombination mit z.B. NADH- Cytochrom B5 Reduktasen vorteilhaft, die Reduktionsäquivalente aufnehmen oder abgeben können. Unter den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteine sind Proteine zu verstehen, die eine in der Sequenz SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder 5 mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die biologische Aktivität des in SEQ ID NO: 2 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird. Unter nicht wesentlich reduziert sind alle Proteine zu verstehen, die noch mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt
10 30 % der biologischen Aktivität des Ausgangsproteins aufweisen. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucin-
15 reste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht . Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden .
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Unter Derivaten sind auch funktionelle Äquivalente zu verstehen, die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für die erfindungsgemäßen Proteine codierende Sequenz beinhalten, welche weiterhin die gewünschte
25 Funktion zeigen, das heißt das deren biologische Aktivität nicht wesentlich reduziert ist. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit
30 umfaßt, welche man durch Modifikation der für das Protein codierenden Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
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Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt (= nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist (= biologische Aktivität ist stärker als die Aktivität des Aus- 0 gangsprotein, das heißt Aktivität ist höher als 100 %, bevorzugt höher als 110 %, besonders bevorzugt höher als 130 %) .
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten oben genannten Nukleinsauresequenzen werden vorteilhaft zum Einbringen in einen 5 Wirtsorganismus in eine Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt) inseriert. Die Nukeinsäuresequenzen können jedoch auch direkt in den Wirtsorganismus eingebracht werden. Die Nuklein- Säuresequenz kann dabei vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete codierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die das erfindungsgemäße Proteintargeting ermöglichen. Diese Sequenzen können homologen oder heterologen Ursprungs sein.
Unter einer Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt oder -fragment) ist die in SEQ ID NO: 1 genannte Sequenz, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktioneilen oder nicht funktioneilen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktioneil verknüpft wurden und welche die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsauresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regula- tion wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche
Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsauresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Auch eventuell mit exprimierte weitere Gene, die vorteilhaft an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind, können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette vorhanden sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Als Promotoren im Nukleinsäurekonstrukt sind grundsätzlich alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organismen vorteilhaft in Pflanzen oder Pilzen steuern können. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder Promotoren, die beispielsweise aus einem Pflanzenvirus entstammen. Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacl^-- T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02 , in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFOC, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al . , Cell 21(1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in den Organismen vorteilhaft in den Pflanzen zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der PRP1- Promotor [Ward et al . , Plant.Mol. Biol .22 (1993 ) , 361-366], ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186) , ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (W093/21334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245) , der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amido- transferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzlichen Promotoren, die die Expression in Geweben tu ?a Ω P - H 3 0 t ω r0 CΛ ^-_. cn F P P. S 3 P Ω Ω Ω SU iQ Φ . . << > iQ (Q P. < ,—_ < d 13 13 cn P Z 03 o φ Φ Φ F- 0 3 O > tr αi G Φ H- P- Φ F- Φ O Φ Φ Φ d Φ rt S p P Φ Φ P- o ω Φ 3 P P Ό φ Φ (D: Pi
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synthesegene vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese, die eine gesteigerte Synthese ermöglichen. Beispielsweise seien die Gene für die Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ6-, Δ5-, Δ4-Desaturase, die verschiedenen Hydroxylasen, die Acyl-ACP-Thioesterasen, ß-Ketoacyl-Synthasen oder ß-Ketoacyl-Reductasen genannt. Vorteilhaft werden die Desaturasegene im Nukleinsäurekonstrukt verwendet.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungs- gemäße Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie oben beschrieben, verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Es können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung gelesen wird und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist . Für die Verbindung der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. hetero- log zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5 ' -3 ' -Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für ein im erfindungsgemäßen Verfahren verwendetes Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Ter inationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vifcro-Mutagenese, -primer- repair-, Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, -chewing-back- oder Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u.a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al . , Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte PolyadenylierungsSignale sind pflanzliche Poly- adenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti- Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al . , EMBO J.3 (1984), 835 ff) oder entsprechende funktioneile Äquivalente.
Die Herstellung eines Nukleinsäurekonstruktes erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz sowie einem Poly- adenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und
Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc . and Wiley-Interscience (1987) beschrieben werden.
Die DNA Sequenz codierend für eine Lipidkörperlipoxygenase aus Gurke beinhaltet alle Sequenzmerkmale, die notwendig sind, um eine dem Ort der Fettsäure-, Lipid- oder Ölbiosynthese korrekte Lokalisation zu erreichen. Daher sind keine weiteren Targetingsequenzen per se notwendig. Allerdings kann eine solche Lokali- sation wünschenswert und vorteilhaft sein und daher künstlich verändert oder- verstärkt werden, so daß auch solche Fusions- konstrukte eine bevorzugte vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sind.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in Piastiden gewährleisten. Unter bestimmten Umständen kann auch ein Targeting in andere Kompartimente (referiert: Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423) z.B. in in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER) , Peroxisomen, Lipidkörper oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen ein Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, wünschenswert sein.
Vorteilhafterweise werden die für erfindungsgemäßen Proteine kodierenden Nukleinsauresequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika-oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das ß-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6- phosphat-Phosphatasegen, das ß-Glucuronidase-Gen, ß-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphospho- transferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz) -Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Meßbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressions- kassette stromaufwärts, d.h. am 5 ' -Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Poly- adenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz DNA sequenz operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Ver- knüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation.
Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den USP- oder Napin-Promotor) und das zu exprimierende Gen enthalten.
Die Expressionskassette wird zur Expression in einem prokaryon- tischen oder eukaryontisehen Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafter- weise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem
Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYCl84, pBR-Serie wie z.B. pBR322, pUC-Serie wie pUC18 oder pUC19, Mll3mp-Serie, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2 , pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, λgtll oder pBdCI, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBllO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBBllδ, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos, M.A. et al . , [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review" , Yeast 8: 423-488] und von van den Hondel, C.A.M.J.J. et al . [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi] sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al . , eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte Hefevektoren sind beispielsweise 2μM, pAG-1, YEp6, YEpl3 oder pEM- BLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenvektoren sind pLGV23, pGHlac+, pBINl9, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al . Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden, bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Expressionskassette auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus der Expressionskassette als Vektor oder den erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen bestehen. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor oder mehrere Gene zusammen in verschiedenen Vektoren in den Organismus ein- gebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen und/oder der Expressions- kassette.
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Transformationsvektor pRT ( (a) Toepfer et al . , 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al . 1987, Nucl. Acids. Res . 15: 5890 ff.) eingebaut werden.
Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor) auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. durch Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.
In Prokaryoten verwendete Expressionsvektoren nutzen häufig induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteinen bzw Fusions- oligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C- ter inal oder anderen nutzbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen in der Regel dazu: i.) die Expressionsrate der RNA zu erhöhen ii.) die erzielbare Proteinsyntheserate zu erhöhen, iii.) die Löslichkeit des Proteins zu erhöhen, iv. ) oder die Reinigung durch einen für die Affinitätschromatographie nutzbare Bindesequenz zu vereinfachen. Häufig werden auch proteolytische Spaltstellen über Fusionsproteine eingeführt, was die Abspaltung eines Teils des Fusionsproteins auch der Reinigung ermöglicht. Solche ErkennungsSequenzen für Proteasen erkennen sind z.B. Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase .
Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST) , Maltose Bindeprotein, oder Protein A. Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc [Amann et al . , (1988) Gene 69:301-315] und pET Vektoren [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, 5 Amsterdam, Niederlande] .
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYep- Secl (Baldari, et al . , (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al . ,
10 (1987) Gene 54:113-123) , and pYES-Derivate (Invitrogen
Corporation, San Diego, CA) . Vektoren für die Nutzung in fila- mentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi,
15 J.F. Peberdy, et al . , eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge .
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressions- vektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf 9 Zellen. 20 Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al . (1983) Mol . Cell Biol . 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170 : 31-39) .
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzen- 25 zellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al . (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol . Biol . 20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for 30 plant transformation" , Nucl . Acid. Res . 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B.
35 (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al . (1987) EMBO J. 6:
187-195) . Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cyto- megalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und
40 17 in Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
45 Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispielsweise in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al . (1994) Current protocols in molecular bio- logy, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning
Vol.l, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al .
(1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory
Press oder Guthrie et al . Guide to Yeast Genetics and Molecular
Biology, Methods in Enzymology, 1994, Acade ic Press entnehmen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnähme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode -, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro- injektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res . 12 (1984) 8711) . Mit einem solchen Vektor transformierte Agro- bakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Trans- formation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Mit einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Triticale, Reis, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Kaffee, Kakao, Tee, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, insbesondere von Öl-haltigen Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Borretsch, Lein, Sonnenblume, Canola, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinetorius) oder Kakaobohne verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterien- lösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, das verwendete Nukleinsäurekonstrukt oder den verwendeten Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Brassica, Linium, Soja, Erdnuß, Rizinus, Sonnen- blume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinetorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Hefen beispielsweise die Gattungen Yarrowia oder Saccharo- myces, Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Cyano- bakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Hefen wie Saccharomyces cereviseae oder Yarrowia lypolytica, Pilze der Gattungen Mortierella, Traustochytrium oder Pythium wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Brassica napus, Linium usitatissimum, Soja, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Rizinus, Mortierella oder Pythium. Prinzipiell sind als Wirts- Organismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans . Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) .
Verwendbare Expressionsstämme z.B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen spezifisch in den Blättern, in den Samen, den Knollen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche Fettsäuren, Öle oder Lipide überproduzierenden transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile, sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Gegenstand sind transgene Pflanzen beispielsweise Kulturpflanzen wie Mais, Hafer, Roggen, Weizen, Gerste, Mais, Reis, Soja, Zuckerrübe, Canola, Triticale, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Tabak, Tomate, Kaffee, Kakao, Tee, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, Kartoffel, insbesondere Öl-haltige Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Borretsch, Lein, Sonnenblume, Canola, Baum- wolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinetorius) oder Kakaobohne, Testpflanzen wie Arabidopsis oder sonstige Pflanzen wie Moose oder Algen enthaltend eine erfindungsgemäße funktionelle Nukleinsauresequenz oder eine funktioneile Expressionskassette. Funktionen bedeutet hierbei, daß ein biologisch aktives Protein gebildet wird.
Die Expressionskassette oder die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz kann darüber hinaus auch zur Transformation der oben beispielhaft genannten Organismen wie Bakterien, Cyanobakterien, filamentösen Pilzen, Ciliaten, Tiere oder Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden eingesetzt werden. Bevorzugte transgene Organismen sind Hefen, Pilze oder Pflanzen, besonders bevorzugt Pflanzen.
Unter transgenen Organismen sind Organismen zu verstehen, die eine Fremde aus einem anderen Organismus stammende Nukleinsäure, die für ein im erfindungsgemäßen Verfahren verwendetes Protein kodiert, enthalten. Unter transgenen Organismen sind auch Organismen zu verstehen, die eine Nukleinsäure, die aus demselben Organismus stammt, enthält, wobei diese Nukleinsäure als zusätzliche Genkopie enthalten ist oder nicht in der natürlichen Nukleinsäureumgebung der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz enthalten ist. Transgene Organismen sind auch Organismen bei denen die natürliche 3'- und/oder 5 ' -Region der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch gezielte gentechnologische Veränderungen gegenüber dem Ausgangsorganismus verändert wurde. Bevorzugt sind transgene Organismen bei denen eine Fremd-DNA eingebracht wurde. Besonders bevorzugt sind transgene Pflanzen. Unter transgenen Pflanzen sind einzelne Pflanzenzellen und deren Kulturen wie beispielsweise Kalluskulturen auf Festmedien oder in Flüssig- kultur, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu verstehen.
Beispiele :
Pflanzenmaterial und Zellfraktionierung
Gurkensamen wurden im Dunkeln bei 26°C 2 oder 4 Tage, wie für jede einzelne Präparation angegeben, keimen gelassen. Die Kotyledonen wurden geerntet und homogenisiert, indem sie wie zuvor beschrieben [Kindl, H. et al . , Methods Enzymol., 96, 1983: 700-715] mit einem Skalpell zerschnitten wurden. Nach der Entfernung von Zelltrümmern und differentieller Zentrifugation wurden die Sedimente der Zentrifugation bei 10 000 x g oder der Zentrifugation bei 100 000 x g in einem Saccharosegradienten gemäß [Sturm, A. et al., FEBS Lett., 160, 1983: 165-168] sedimentiert oder flotiert. Eine rohe Lipidkörperfraktion wurde erhalten, indem der Überstand einer kurzen (10 min) Zentrifugation bei 2000 x g einer Zentrifugation für 30 min bei 10 000 x g unterworfen und die im oberen Abschnitt des Zentrifugenröhrchens gebildete Lipidschicht entnommen wurde. Die weitere Reinigung der Lipidkörper erfolgte durch leichtes Suspendieren der Lipidschicht und wiederholtes Flotieren [Sturm, A. et al . , Eur. J. Biochem. , 150, 1985: 461-468] .
Tabakpflanzen wurden bei 22°C unter Dauerbelichtung (2000 lux) in Magenta-Kästen kultiviert. Die Medien zur Züchtung von Trans- formanten waren gemäß [Horsch, R. B. et al., Science 227, 1985: 1229-1231; Jefferson, R. A. et al . , EMBO J., 6, 1987: 3901-3907].
Plasmidkonstruktionen und Präparation von Proteinen
Zur Herstellung von Deletionsformen der LBLOX wurde CSLBLOX-221 im Vektor pSport-1 [Höhne, M. et al . , Eur. J. Biochem., 241, 1996: 6-11] verwendet. Eine N-terminale Deletion wurde hergestellt, indem CSLBLOX-221 zuerst mit Smal/Ndel und anschließend mit ffaelll gespalten wurde. Nach der Ligation in pSport-1 (Life Technologies) wurde dieses Konstrukt, bei dem die ersten 80 Nukleotide von pCSLBLOX-221 deletiert waren [Höhne, M. et al . ,
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T7-Promotors erhalten [May. C.et al . , Biochim. Biophys. Acta 1393, 1998: 267-276] .
Transfektion von Tabak
Unter Verwendung des Vektors pBI121 (Clontech) , der den 35S-KNA- Promotor des Blumenkohlmosaikvirus, die kodierende Region des ß-Glucuronidase-Gens und den NOS-Terminator enthält, wurde das Konstrukt pBI121ΔGUS hergestellt, indem die GUS-Kassette mit Smal und SstI ausgeschnitten und unter Verwendung von T4-DNA-Poly- merase ein glattes Ende hergestellt wurde. Im Vektor pSport-1 enthaltenes LBLOX [Höhne, M. et al . , Eur. J. Biochem., 241, 1996: 6-11] wurde mit Smal/BamHI ausgeschnitten, mit einem BamHI-Linker ligiert und in den BamHI-gespaltenen dephosphorylierten Vektor pBI121ΔGUS eingebracht. Das Produkt, pBI121ΔGUS-LBL0X, wurde entweder für die Transformation in Agrobacterium tumefaciens verwendet oder weiter zu pBI121ΔGUS-LBLOX-HA modifiziert. Die Konstruktion des letzteren Plas ids wurde durchgeführt, indem eine einzige Sacl-Stelle hinter dem Nukleotid 252 von pCSLBLOX-221 verwendet wurde. Nach der Spaltung mit Sacl und
Dephosphorylierung wurde eine dreifache Hämagglutinin-Markierung (HA-Markierung) , die mit einer Sacl-Stelle ausgestattet war, inseriert . Unter Berücksichtigung der 3 -YPYDVPDYA-Sequenzen und der Linker betrug die Gesamtlänge des Inserts 30 Aminosäuren.
Ag-ro-acterium tumefaciens LB-A4404 wurde mit pBI121ΔGUS-LBLOX oder pBI121ΔGUS-LBLOX-HA3 nach dem Gefrier-Auftau-Verfahren transformiert. Diese Bakterien wurden zur Transformation von Blattscheiben von Nicotiana tabacum cv. Petit Havanna SR-1 gemäß dem etablierten Verfahren von Horsch et al . [Science 227, 1985:
1229-1231] verwendet. Die Sprosse wurden auf Linsmaier-und-Skoog- Medium, das mit 0,5 mg/1 N-Benzylaminopurin, 500 mg/1 Cefotaxim und 75 mg/1 Kanamycin angereichert war, selektiert. Kanamycin- resistente Pflanzen mit erhöhten LOX-Spiegeln wurden vegetativ vermehrt.
Präparation von HA-markiertem LBLOX durch Expression in Tabak
Blätter homozygoter Kanamycin-resistenter Tabaklinien, die das pBI121ΔGUS-LBLOX-HA3-Konstrukt enthielten, wurden in 50 mM Hepes- NaOH, pH 7,4, 5 mM MgCl2 , 0 , 5 mM EDTA, 50 mM KCl, 2 , 5 mM Dithiothreitol, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 15% (Gew./ Gew.) Saccharose (Puffer A) in Anwesenheit von Polyvinyl- pyrrolidon (25 000) (Merck) homogenisiert. Nach den Zentri- fugationen wurde der Überstand der 100 000 x g Zentrifugation entsalzt, eingeengt und auf einer großen Biogel-A-1, 5-Säule fraktioniert. Fraktionen, die dem 100 kDa-Bereich entsprachen und mittels Western-Blots unter Verwendung von anti-HA-Antiserum analysiert worden waren, wurden gesammelt. Dieses mutierte LBLOX- Protein enthielt hinter dem Aminosäurerest 68 des Wildtyp-Enzyms eine Insertion von 30 Aminosäureresten, die einer dreifachen HA- 5 Markierung entsprach, und hatte eine theoretische Molekülmasse von 104 kDa. Dieser Größenunterschied zwischen dem Wildtyp- und dem rekombinanten Protein wurde mittels SDS-PAGE eindeutig nachgewiesen.
10 Radioaktive Markierung von Proteinen mittels in vitro-Synthese
Die Translation wurde unter Verwendung von gereinigten mRNAs , Retikulozytenlysat und [35S] L-Methionin in Anwesenheit oder Abwesenheit von Hundepankreas-Mikrosomen durchgeführt. Alternativ 15 wurden aus Gurken-Kotyledonen präparierte Mikrosomen für co-translationale oder post-translationale Transportassays verwendet .
Markierung von Proteinen mittels in vivo-Proteinsynthese
20
Experimente zur radioaktiven Markierung in vivo wurden als kurze Puls-Experimente mit Kotyledonen von 4 Taqe lang gekeimten Keimlingen durchgeführt. Fünf g Kotyledonen wurde in Stücke von 2 mm geschnitten und mit 8 MBq [35S] L-Methionin (40 TBq/mmol) 15 min 25 inkubiert. Die vorsichtige Homogenisierung und Herstellung von Subtraktionen wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Verabreichung von 45Ca2+ und Analyse der Lipidkörperfraktion
30 Zwei g Kotyledonen, die von 2,5 Tage (= T) im Dunkeln bei 26°C gewachsenen Gurkenkeimlingen gesammelt worden waren, wurden in Stücke geschnitten und im Dunkeln 3 Std. mit 6 MBq 45Ca2+ (8 GBq/ mmol) inkubiert. Nach der Homogenisierung durch Zerkleinern mit einem Skalpell in Anwesenheit von Puffer A wurde das Homogenat
35 25 min bei 2000 x g zentrifugiert . Nach dem Entfernen der obersten Schicht, die Lipidkörper enthielt, und Dekantieren vom Sediment wurde der Extrakt einer Zentrifugation für 1 Std. bei 100 000 x g unterworfen.
40 Die Fraktion, die die Lipidkörper enthielt, wurde in Puffer A resuspendiert, auf 30% (Gew. /Gew.) Saccharose eingestellt und mit Puffer A überschichtet. Nach Zentrifugation bei 100 000 g für 1 Std. wurden die flotierten Lipidkörper gesammelt und verschiedenen Waschverfahren unterworfen.
45 Präparation von Liposomen
Liposomen wurden gemäß [Woodle, M C. & Papahadjopoulos , D., Methods Enzymol . 171, 1989: 193-217] aus einem rohen Sojabohnen- 5 lecithin-Gemisch (Sigma) oder aus definiertem Dilinoleoyl- phosphatidylcholin, mit oder ohne Zugabe des Serinderivates , als unilamellare Vesikel hergestellt. Routinemäßig betrug unter Verwendung von Detergenzsolubilisierung und -entfernung das Molverhältnis von Dilinoleoylphosphatidylcholin zu Natriumcholat
10 0,6:1,0. Die Effizienz der Dergenzentfernung mittels Dialyse in der mit einer PMIO-Membran ausgerüsteten Amicon-Kammer wurde kontrolliert [Yamazaki, N. et al . , Methods Enzymol. 242, 1994: 56-65] . Die Größe der Vesikel wurde unter dem Mikroskop durch Vergleich mit der Größe (10 ± 0,5 μm) von MonoQ-Perlen (Pharmacia)
15 bestimmt. Für bestimmte Experimente wurden Triacylglyceride
(Trilinolein) in die Liposomen eingebaut, so dass Phospholipid- bedeckte Lipidtröpfchen erhalten wurden, die mit "schwarzen" Lipidkörpern vergleichbar sind. Diese Präparation wurde eingeleitet, indem 200 mg Sojabohnenlecithin und 500 mg Trilinolein in
20 10 ml Methanol/Chloroform (1:1) gelöst wurden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand in Dialysepuffer gemäß [Yamazaki, N. et al . , Methods Enzymol. 242, 1994: 56-65] resuspendiert. In jedem Fall wurden die durch Flotation gewonnenen Vesikel mittels DSC analysiert. Der Durchmesser der
25 Liposomen war im Bereich von 1 μm.
Bindungsexperimente in Kombination mit dem Flotierungsassay
Eine Liposomensuspension, die 1 mg Lecithin entsprach, in 150 mM 30 NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, wurde 10 min entweder mit 4 μg unmarkiertem Protein oder mit dem Überstand eines Retikulozyten- lysat-Translationsgemischs inkubiert. Nach dem Einstellen auf 42 % (Gew. /Gew.) Saccharose wurde die Suspension in ein 12-ml- Zentrifugenröhrchen überführt. Ein linearer Saccharose-Dichte- 35 gradient von 37-26% (Gew. /Gew.) Saccharose wurde auf die Probe geschichtet. Die Flotierung der Protein-bedeckten Liposomen erfolgte durch Zentrifugation für 6 Std bei 100 000 g. Nach der Fraktionierung erfolgte die Proteinanalyse mittels SDS-PAGE und Immunmarkierung .
40
Bindungsexperimente mit Lipidkörpern oder Mikrosomen wurden auf analoge Weise durchgeführt . Alle Dichten in den Saccharosegradienten sind in Korrelation mit der Saccharosekonzentration (Gew. /Gew. ) angegeben .
45 Immunologische Verfahren
Die Antiseren gegen LBLOX [Sturm, A. et al . , Eur. J. Biochem. 150, 1985: 461-468], PLA [May. C. et al . , Biochim. Biophys. Acta 5 1393, 1998: 267-276] und Isocitratlyase [Frevert, J. & Kindl, H. Eur. J. Biochem., 92, 1978: 35-43] wurden in Kaninchen hergestellt. Außerdem wurden monoklonale Antikörper gegen GST (Pharmacia) und das Epitop aus dem Hämagglutininprotein des menschlichen Influenzavirus (Boehringer) verwendet. Immunfällungen der radio- 0 aktiv markierten Enzyme wurden unter Standardbedingungen (Verfahren 1) durchgeführt, indem 1 μg des entsprechenden gereinigten Proteins vor der Fällung mit 20 μl Antiserum zum Gemisch gegeben wurde. Nach Stehenlassen für 12 Std. bei 20°C und 20 Std. bei 4°C wurde das Präzipitat durch Zentrifugation bei 3000 x g sedimen- 5 tier . Das Sediment wurde mindestens 5mal gewaschen und dann in SDS gelöst. Für die direkte Fällung anderer Proteine (Verfahren 2) wurde das Antigen nicht weiter verdünnt, sondern 6 Std. mit 2 μl Antiserum inkubiert und anschließend mit Protein-A-Sepharose gemischt. Nach dem Überführen des Gemischs in ein kleines Gefäß 0 und ausgiebigem Waschen wurde das Antigen zusammen mit den IgG unter Verwendung von 100 mM Essigsäure eluiert.
Weitere Assays
5 Zum Vergleich der Proteinstrukturen wurde eine eingeschränkte Proteolyse im Gel durchgeführt [Höhne, M. et al . , Eur. J. Biochem. 241, 1996: 6-11]. Die DSC-Analyse des Lipids erfolgte auf Silica-Gel G (Merck) unter Verwendung von Methanol-Chloroform-Wasser, 65:25:4, als Lösungsmittelsystem. 0
ERGEBNIISE
Zur Untersuchung der Abfolge von Schritten, die für den Transfer von LBLOX vom Ribosom zu seinem endgültigen zellulären 5 Bestimmungsort erforderlich sind, wurden zunächst untersucht, welche Pools in der Zelle das LBLOX-Protein durchquert. Zweitens wurden die für den Transfer verantwortliche Targeting-Struktur, -sequenz oder -domänen lokalisiert.
0 Untersuchungen mit LBLOX in vivo und in vi tro zur Unterscheidung zwischen co-translationalem Transport in das ER und post-trans- lationalem Transport zu Lipidkörpern
Es wurden keine Unterschiede zwischen der Molekülmasse von in 5 vitro-translatiertem LBLOX und den am ER oder an Lipidkörpern membrangebundenen zellulären Formen beobachtet (Fig. 1A) . Dies zeigt, dass der Transport zu den Membranen ohne sichtbare chemische Modifikationen erfolgt. Sowohl ein co-translationaler Transport zum ER und der anschließende Transfer in die Lipidkörper als auch ein post-translationaler Transport zu den Lipidkörpern über einen cytosolischen Pool waren wahrscheinliche Mechanismen, mit denen LBLOX seine endgültige Stelle in der Zelle erreichen kann. Zuerst wurde eine in vitro-Translation von LBLOX-mRNA unter co-translationalen Transportbedingungen in Anwesenheit von Mikrosomen aus Hundepankreas oder Mikrosomen aus Gurkenkotyledonen durchgeführt. Als zweites wurde ein ähnliches Protokoll verwendet, um zu testen, ob radioaktiv markiertes LBLOX-Translatat auch zu den Membranen transportiert wurde, wenn die Translation und die Zugabe von Mikrosomen nacheinander erfolgten (Fig. 1B) . Im letzteren Fall wurden die Ribosomen vor der Zugabe von Mikrosomen mittels Zentrifugation vom neu synthetisierten Protein entfernt. Nach erneuter Isolierung von an ER angereicherten Membranen mittels Flotation verblieb nur ein Teil des translatierten Proteins an der Position, an der die Suspension im Gradienten eingefüllt worden war (Fr. Nr. 12 ) . Etwas LBLOX wanderte zu Dichten, die 33% Saccharose (Fr. Nr. 11) oder 30% Saccharose (Fr. Nr. 9) entsprachen. Kleine Mengen LBLOX wurden an der Position des glatten ER angetroffen (Fr. Nr. 5-7) .
Der Vergleich der Menge an LBLOX-Radioaktivität in den Membranen, die mittels Gradientenzentrifugation reisoliert worden waren, in einer Reihe von Experimenten verdeutlichte, dass die Verwendung der Anordnung für den post-translationalen Transport zu Mikrosomen die gleichen oder etwas höhere Mengen an membrangebundener LBLOX ergab als die Verwendung des Protokolls für den co-translationalen Transport (Daten nicht gezeigt) . Beim genauen Ver- gleich des Wanderungsverhaltens des LBLOX-Primärtranslatats und der von den Membranen nach Flotation reisolierten LBLOX wurden keine erkennbaren Unterschiede in der Molekülmasse gefunden.
PLA-mRNA, die mittels in vifcro-Transkription von pPAT291 erhalten worden war, wurde ebenfalls translatiert , und das Translationsprodukt, d. h. radioaktiv markierte Phospholipase, wurde mit Mikrosomen inkubiert. Nach der Flotierung in einem Saccharosegradienten wurden die Subtraktionen mittels SDS-PAGE und Fluoro- graphie analysiert (Fig. IC) . Die Fluorographie ergab, dass ein großer Teil des Translationsproduktes an Mikrosomenmembranen gebunden hatte .
Die durch die Untersuchung des in viüro-Transfers von LBLOX zu Mikrosomen erhaltenen Ergebnisse (Fig. 1B) wurden durch die Analyse der in vivo-Situation bestätigt, indem die Abfolge der Ereignisse, die beim Transfer von LBLOX zu Lipidkörpern erfolgt, verfolgt wurde. Durch Anwendung von Pulse-Chase-Experimenten bestimmten wir die Pools, die von der neu synthetisierten LBLOX auf ihrem Weg zu den Lipidkörpern durchquert wurden. So wollten wir herausfinden, ob die Fraktion der ER-Membranen oder des Cytosols der Pool war, in dem die markierte LBLOX zuerst erschien.
Die Fig. 2A (Spur 2) zeigt, dass der Hauptteil der pulsmarkierten LBLOX in der Fraktion erhalten wurde, die das Cytosol enthielt. Eine kleine, aber signifikante Menge der radioaktiven LBLOX wurde kontinuierlich in den Mikrosomen und auch in Mikrosomen- fraktionen, die mittels Flotation in Saccharosegradienten weiter gereinigt wurden, gefunden (Fig. 2A) . Um die Möglichkeit auszuschließen, dass kleine prozentuale Anteile aller neu synthetisierten Proteine die ER-haltige Fraktion kontaminierten, analy- sierten wir in der Mikrosomenfraktion die Menge an Proteinen, die entweder cytosolisch waren oder als Artefakt in den cytosol- haltigen Überstand einer 100 000 g-Zentrifugation freigesetzt wurden. Unter Verwendung von Isocitratlyase als stark exprimier- tes Gurkenprotein auf dieser Entwicklungsstufe wurde das Vor- liegen dieses Proteins in der Mikrosomenfraktion und im löslichen Überstand mittels Immunfällung bestimmt. Die Fig. 2B zeigt, dass Isocitratlyase im Gegensatz zu LBLOX in der ER-Präparation praktisch fehlte.
Die in Fig. 2A dargestellten Daten zeigen, dass LBLOX das Cytosol als ersten Pool auf ihrem Weg zu den Lipidkörpern durchquert . Es ist auch offensichtlich, dass LBLOX membranbindende Eigenschaften besitzt und partiell vor Proteolyse geschützt ist, wenn sie an die ER-Membran gebunden ist. Trotz Bereichen im LBLOX-Molekül, die Affinität zu Membranen aufweisen, ist ein großer Teil des LBLOX in vi tro für chemische Modifikation zugänglich und könnte daher in vivo ins Cytosol ragen. Teil C der Fig. 2 liefert einen Hinweis darauf, in welchem Ausmaß der Teil von LBLOX, der an Mikrosomenmembranen gebunden ist, für proteolytischen Abbau zugänglich ist.
Die LOX-Isoform, die mittels Western-Blot-Analyse an aus Kotyledonen isolierten Mikrosomen nachweisbar ist, ist unseren Befunden zufolge strukturell identisch mit der an Lipidkörper gebundenen LOX-Isoform. Dies wurde durch Vergleich des Fragmentmusters nach eingeschränkter Proteolyse nachgewiesen (Daten nicht gezeigt) . Die Art der Bindung von LBLOX an die Mikrosomenmembran entspricht der eines peripher gebundenen Membranproteins . Waschen mit 100 mM MgCl2 entfernte mehr als 90% der markierten LBLOX. Es sollte jedoch betont werden, dass die Bindung von LBLOX an die Mikrosomen in Anwesenheit eines Niedrigsalz-Puffers und auch unter den Bedingungen einer wiederholten Gradientenzentrifugation recht stabil war. Die stabile Bindung wurde auch dadurch gezeigt, dass LOX an Mikrosomen nur partiell für Proteolyse zugänglich war (Fig. 2, Teil C) .
Die Kapazität der Bindung an Mikrosomenmembranen wurde für LBLOX auch unter einer weiteren in vivo-Bedingung gezeigt. In einem heterologen System, d. h. grünen Tabakblättern, die LBLOX aus Gurkenkotyledonen exprimierten, führte die hohe Expression von LBLOX zur Bindung erheblicher Mengen LBLOX an Mikrosomen. Durch Subfraktionierung des 100 000 x g-Sediments, wobei eine Saccharose-Dichtegradienten-Flotation angewendet wurde, zeigten wir, dass praktisch die gesamte zuvor durch Zentrifugation bei 100 000 x g sedimentierte LBLOX an die flotierten Membranen gebunden blieb. Der Peak der membrangebundenen LBLOX (Fig. 2, Teil D) stimmte mit den Markerproteinen für ER-Membranen überein.
Um unsere Beweiskette für einen direkten post-tr nslationalen Transfer von LBLOX zu den Membranen von Lipidkörpern auszudehnen, untersuchten wir die Affinität von löslicher LBLOX zu Mikrosomen- membranen in vi tro . In einem Mischexperiment gaben wir ein Gemisch von radioaktiven cytosolischen Proteinen, die aus Kotyledonen nach Pulsmarkierung isoliert worden waren, (Präp. A) zu einem Überstand eines Extrakts, der aus unmarkierten Kotyledonen präpariert und bei 2000 x g zentrifugiert worden war (Präp. B) . Durch dieses Verfahren sollte es der radioaktiven LBLOX, die als Vorstufe in der cytosolischen und membranfreien Präparation (Präp. A) enthalten war, möglich sein, post-trans- lational an Mikrosomen-, Lipidkörper und andere Membranen, die im nicht-radioaktiven Extrakt zugegen waren, (Präp. B) zu binden. Nach einer kurzen Inkubation isolierten wir Mikrosomen als potentielle Akzeptormembranen für radioaktive LBLOX (Fig. 3A) und Glyoxysomen als Kontrolle (Fig. 3B) . Die elektrophoretische Analyse zeigte, dass die cytosolische LBLOX auch unter diesen Bedingungen, die der in vivo-Situation ähnelten, an Mikrosomen gebunden wurde. LBLOX war in der Glyoxysomenfraktion, die einer abschließenden Reinigung durch Saccharosegradienten-Flotation unterworfen wurde, nicht nachweisbar. Somit bindet lösliche LBLOX an Membranen, aber nicht gleichmäßig an alle Membranen. Z.B. ist die Affinität von LBLOX zu Glyoxysomenmembranen (Fig. 3B) mindestens eine Größenordnung niedriger als die nachgewiesene Affinität zu Mikrosomen (Fig. 3A, Spur 3). Daher erfordert die Bindung von LBLOX in Gurkenkotyledonen eine hochgradige Selektivität, da andere Organellen nicht mit LBLOX markiert und nicht für den Abbau modifiziert werden. Gurken-LBLOX und Sojabohnen-LOX-1 unterscheiden sich in ihrer Affinität zu Liposomen
Um zu testen, ob LBLOX unabhängig von spezifischen Protein- Protein-Wechselwirkungen eine intrinsische Affinität zu Membran- lipiden besitzt, wurden die BindungsStudien ausgedehnt und schlössen Liposomen als Akzeptormembranen ein. Zuerst wurden die Experimente mit rohem So abohnenlecithin als Quelle für Phosphatidylcholin durchgeführt. Anschließend wurde Phosphatidyl- cholin mit unterschiedlichem Reinheitsgrad auch in Kombination mit Phosphatidylserin zur Herstellung von Liposomen verwendet . Die Größe der Liposomen wurde durch Vergleich mit MonoQ-Perlen als Standard kontrolliert.
Die Ergebnisse des Liposomenexperiments (Fig. 4) zeigen den deutlichen Unterschied zwischen der Membranaffinität von Gurken- LBLOX und derjenigen von Sojabohnen-LOX-1. Während die beiden zuvor den Gurken-Lipidkörpern zugewiesenen Proteine, nämlich LBLOX und PLA, fast quantitativ an die Liposomen gebunden wurden, besaßen die cytosolischen LOX-Formen der Gurke und Sojabohnen-
LOX-1 keine Affinität für die Lipidphase. In Kontrollexperimenten mit entweder einem typischen cytosolischen Protein oder mit einem Gemisch, das LBLOX und cytosolische Proteine enthielt und aus Gurkenkotyledonen präpariert worden war, konnte gezeigt werden, dass die Membranaffinität von LBLOX recht einzigartig ist (Daten nicht gezeigt) .
Der N-terminale Bereich einschließlich der ß-Barrel-Struktur ist wesentlich für die Bindung von LBLOX an Lipidkörper
Unter Berücksichtigung der fehlenden proteolytischen Prozessierung und der mit den Bindungsstudien erhaltenen Daten lässt sich die Hypothese aufstellen, dass Domänen eines gefalteten Proteins für den Transfer zu den Membranen verantwortlich sind. Eine solche Domäne wurde wahrscheinlich, als die Aminosäuresequenz von LBLOX in eine Struktur auf der Basis der Kristallstrukturdaten, die für Sojabohnen-LOX-1 bei einer Auflösung von 1,4 Ä erhalten worden waren [Frevert, J. & Kindl, H. , Eur. J. Biochem. 92, 1998: 35-43], eingepasst wurde. Im Gegensatz zu Soj bohnen-LOX-1 zeigte Gurken-LBLOX nicht nur eine ß-Barrel-Struktur kurz stromabwärts des N-terminalen Abschnittes, sondern besaß in dieser Domäne auch eine recht einzigartige Anordnung von Glutamylresten, die zur Koordination von Ca2+ verwendet werden könnten (Fig. 5) . Dies kann wiederum auf eine Verwandtschaft zwischen dem LBLOX-ß-Barrel und den Mitgliedern Ca2+-abhängiger membranbindender Domänen hindeuten.
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Indem diese Art der in vi tro-Experimente ausdehnten wurde, wurde gefunden, dass der Transfer zu den Lipidkörpern auf Ca2+-unabhängige Weise erfolgt (Daten nicht gezeigt) . Trotz dieses Ergebnisses wurde die Möglichkeit untersucht, dass die Ca2+-abhängige Bindung von Proteinen an die Lipidkörperoberflache schließlich zur Bildung einer Ca2+-angereicherten Proteinschicht führen könnte, die die Lipidkörper umgibt. Um die Aufnahme von Ca2+ zusammen mit Proteinen, wie LBLOX und PLA, zu untersuchen, untersuchten wir die Bildung von Ca2+-bedeckten Lipidkörpern durch Verabreichung von 5CaCl2 an Kotyledonen und anschließende Isolation von Zellstrukturen. Die Lipidkörperfraktion enthielt nach Reflotation, Waschen und Behandlung mit 100 mM Na2C0 50 kBq 45Ca2+, was etwa 1 n ol entspricht. Die gleiche Präparation wies 2 nmol LBLOX auf. Bei weiterer Behandlung mit 100 mM unmarkiertem CaCl2 wurden 90% der Radioaktivität von den Lipidkörpern entfernt, wohingegen der Großteil der LBLOX an die Lipidkörper gebunden blieb. Diese Daten stimmen nicht mit der Hypothese überein, dass Ca2+ eine Voraussetzung für die Bindung von LBLOX an die Lipidkörperoberflache ist.
Eine erhebliche Veränderung des ß-Barrels von LBLOX beseitigt seine Fähigkeit zur Bindung an Liposomen
Zur weiteren Charakterisierung der Art der Wechselwirkung zwischen der Lipidkörperoberflache und der N-terminalen ß-Barrel- Struktur von LBLOX wurde untersucht, ob eine modifizierte ß-Barrel-Struktur auch an Liposomen bindet. Dazu wurde ein rekombinantes Protein (LBL0X-HA ) hergestellt, das im Vergleich zu Wildtyp-LBLOX eine dreifache Hämagglutininmarkierung, inseriert zwischen Aminosäurerest 70 und 71 der LBLOX, enthielt. Diese Konstruktion unterbricht das ß-Barrel durch einen Abschnitt von 30 Aminosäureresten.
Die in der Figur 7 gezeigten Liposomenexperimente fassen die Beweise dafür zusammen, dass das N-terminale ß-Barrel von LOX allein für ihre Bindung an Membranen ausreicht und die Zerstörung des ß-Barrels den Transfer inaktiviert. Wildtyp-LBLOX und das ß-Barrel-Fusionsprotein (GST-LOX) binden praktisch quantitativ an die Liposomen, die Insertion eines Peptids in die Barrel-Struktur beseitigt die Membranaffinität.
DISKUSSION
Wenige Isoformen der Lipoxygenase binden an oder integrieren in die Membranen verschiedener Organellen. In diesen Fällen kann die Funktion der Lipoxygenase auf die Modifikation der entsprechenden Membran zielen. Die Expression von 15-LOX in Retikulozyten Z Φ
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ob die LBLOX-Bindung aufgrund ihrer Wechselwirkung mit einem integralen Membranprotein als Partner, z. B. mit dem Oleosin als Anker, erfolgt oder ob die Funktion des LBLOX-ß-Barrels mit der Funktion einer an die Phospholipidmembran bindenden C2-Domäne, 5 wie für Synaptotagmin [Rizo, J. & Sudhof, T. C. J. Biol. Chem. 273, 1998: 15879-15882] und cytosolische Phospholipase C-Delta [Perisic, 0. et al . , J. Biol. Chem. 273, 1998: 1596-1604] oder Phospholipase A2 [Xu, G. Y. et al . , J. Mol. Biol. 280, 1998: 485-500] gezeigt, vergleichbar ist. Diese Art des Vergleichs mit
10 C2-Domänen erfordert eine gründliche Untersuchung einer möglichen Wirkung von Ca2+ entweder auf die Membranbindungseigenschaften von LBLOX oder auf die Struktur von LBLOX, wie sie für 5-Lipoxygenase gefunden wurde [Hammarberg, T. & Radmark, 0., Biochem. 38, 1999: 4441-4447] . Bei unseren Experimenten mit Lipidkörpern wurde eine
15 45Ca2+-Beschichtung von Lipidkörpern gefunden, aber es wurde keine Ca2+-Abhängigkeit der Bindung von LBLOX-Konstrukten beobachtet. Für einen unzweideutigen Nachweis des Vorliegens oder Fehlens einer Ca +-vermittelten Bindung müssen die experimentellen Protokolle für zukünftige Studien in verschiedener Hinsicht ver-
20 feinert werden. Frühere Experimente [Busch, M. B. et al . , Eur. J. Cell Biol. 60, 1993: 88-100] mit Wurzelgewebe unter Verwendung von Energiefilter-Elektronenmikroskopie wiesen nach, dass die Lipidkörperoberfläche von einer Zone mit hohem Ca2+-Gehalt bedeckt ist.
25
Wir sollten uns erinnern, dass der Vergleich der primären Aminosäuresequenzen und der putativen SekundärStrukturen von LOX- Formen zeigt, dass sich LBLOX nicht nur durch die Ausbildung einer ß-Barrel-Struktur, die mit exponierten Glutamylresten aus-
30 gestattet ist, sondern auch durch eine N-terminale Verlängerung von 30 Aminosäureresten, die in cytosolischen LOX-Isoformen nicht vorliegt [Höhne, M. et al . , Eur. J. Biochem., 241, 1996: 6-11; Rosahl, S., Z. Naturforsch. C 51, 1996: 123-138], auszeichnet. Es ist somit wahrscheinlich, dass beide Arten der Wechselwirkung
35 eine entscheidende Rolle spielen, die N-terminale Verlängerung als spezifisches Motiv und das ß-Barrel, das sich in der auf die N-terminale Verlängerung folgenden Aminosäuresequenz befindet, als allgemeines Mittel zur Steigerung der Membranaffinität.
0 Unser Experiment mit dem mutanten LBLOX-Protein, das sich vom Wildtyp nur durch eine erhebliche Änderung im ß-Barrel, d.h. durch die Insertion von drei Wiederholungen einer HA-Markierung, unterscheidet, zeigten den Verlust der Bindung an Lipidkörper oder Membranen. Dies bedeutet, dass das intakte ß-Barrel als
45 wesentlich für die Bindung an Lipidkörper angesehen werden muss, ungeachtet dessen, ob der am weitesten N-terminal gelegene Bereich zu einer weiteren Selektivität beiträgt.
Targetingsignale als entfaltete Bereiche von 7Aminosäureresten sind festgestellt worden, wenn Proteine in Mitochondrien, Chloro- plasten oder das ER transportiert werden. Hier, im Fall der Bindung eines Proteins an bereits existierende Lipidkörper, kann eine bereits in eine bestimmte Form gefaltete Domäne die Membranbindung bewirken. Es muss ein weiterer Teil postuliert werden, der die Selektivität der Bindung von LBLOX an Lipidkörper vermittelt. Liegt eine große Menge an LBLOX vor, werden außer Lipidkörpern auch das ER und die Golgi-Vesikel mit LBLOX bedeckt . Nimmt jedoch die intrazelluläre Menge an LBLOX ab, besetzen die LBLOX-Moleküle hauptsächlich die Oberfläche von Lipidkörpern.
Figurlegenden
Teil A (Fluorogramm) zeigt einen Vergleich des Wanderungsverhaltens von mittels in vifcro-Translation hergestellter LBLOX (Spur 1) , aus Mikrosomen isolierter LBLOX (Spur 2) und aus Lipidkörpern isolierter LBLOX (Spur 3) . Für die Spuren 2 und 3 wurden die entsprechenden zellulären Subtraktionen aus Kotyledonen nach Proteinmarkierung in vivo unter Verwendung von [35S] -Methionin präpariert. Teil B und C zeigen Fluorogramme, die die post-trans- lationale Bindung an isolierte Gurkenmikrosomen zeigen. Gurken- mikrosomen wurden mit den in Retikulozytenlysaten unter Verwendung von entweder LBLOX-mRNA oder PLA-mRNA hergestellten, radioaktiv markierten Proteinen inkubiert und anschließend durch Flotation in einem Dichtegradienten gereinigt. Die membrange- bundene Lipidkörperlipoxygenase (Teil B) oder Phospholipase (Teil C) , die nach Flotation erhalten wurden, sind auf der linken Seite dargestellt. Spur 1 bei B und C entspricht dem oberen Abschnitt des Saccharosegradienten, wohingegen Spur 12 (bei B) und Spur 13 (bei C) dem Boden entsprechen und die nicht an Membranen ge- bundenen (nicht flotierten) Proteine darstellen, die an der Position verbleiben, an der das Inkubationsgemisch vor der Zentrifugation unter den Gradienten geschichtet wurde.
Fig. 2. Ergebnisse der Pulsmarkierung von Proteinen in Koty- ledonen, die auf eine schwache Bindung von LBLOX an Mikrosomen, aber einen erheblichen LBLOX-Pool im Cytosol hinweisen.
Nach einem kurzen Zeitraum (15 min) , der zur Verabreichung der radioaktiven Aminosäure als Vorstufe an die Kotyledonen verwendet wurde, wurde eine Zeilfraktionierung durchgeführt, und zwei
Proteine wurden aus den zellulären Subtraktionen mittels Immunfällung isoliert. Die Isolation der radioaktiven Proteine aus den solubilisierten Subtraktionen erfolgt nach der Zugabe von 1 μg des entsprechenden kalten Proteins (LBLOX oder Isocitratlyase, ICL) als Träger mittels Zugabe von Antiserum und direkter Fällung (s. Methoden). Nach Elektrophorese und Proteinfärbung (Spur 3: Mikrosomen; Spur 4: Cytosol) zeigte das Fluorogramm (Spuren 1 und 2) in Teil A, dass LOX im Cytosol stark (Spure 2) und wesentlich schwächer in den Mikrosomen (Spur 1) markiert war. Teil B: Als Kontrolle wurde die Verteilung der Isocitratlyase zwischen diesen beiden Fraktionen bestimmt. Die Spur 1 (Mikrosomen) und Spur 2 ("Cytosol") zeigen Fluorogramme, wohingegen die Spuren 3 und 4 die Proteinfärbungen darstellen. Spur 1 (und die entsprechende Proteinfärbung in der Spur 3) zeigt das Fehlen einer Kontamination von Isocitratlyase in den Mikrosomen. Teil C: Behandlung markierter Mikrosomen (analysiert wie im Teil A, Spur 1) mit Proteinase K. Nach der Proteolyse wurden Phenylmethylsulfonyl- fluorid und 1 μg des entsprechenden kalten Proteins zugegeben, und eine Immunfällung wurde durchgeführt. Die Spuren 1 bis 4 zeigen Fluorogramme: unbehandelten Mikrosomen in Spur 1; unbe- handeltes Cytosol in Spur 2; behandelte Mikrosomen in Spur 3; behandeltes Cytosol in Spur 4. Teil D: Lokalisierung der Gurken- LBLOX an Mikrosomen aus transgenen Tabakpflanzen. Nach der Flotation der Membranen in einem linearen Saccharosedichtegradienten wurden Subtraktionen mittels Immunblot analysiert . Spur 1 entspricht dem oberen Abschnitt des Zentrifugenröhrchens (23 % Saccharose) , Spur 3 (32 % Saccharose) , Spur 5 (39 % Saccharose) , Spur 6 (41 % Saccharose) und Spur 7 (Probe bei 43 % Saccharose eingefüllt) .
Fig. 3: In vitro-Experimente, die zeigen, dass radioaktiv markierte cytosolische LBLOX schwach an Mikrosomenmembranen bindet (Teil A) aber praktisch nicht an Glyoxysomen bindet (Teil B) .
Teil A: 1 g Kotyledonen wurde mit 9 MBq [35S] L-Methionin 3 Std. inkubiert. Dann wurde ein 100 000 g-Überstand, der radioaktiv markierte cytosolische LBLOX enthielt, hergestellt. Diese Präparation wurde mit einem aus unbehandelten Kotyledonen hergestellten Homogenat gemischt . Die ER/Golgi-Fraktion wurde durch anschließende Gradientenzentrifugation isoliert. Ein Aliquot (1/20) der ER/Golgi-Fraktion (Spur 1) und ein Aliquot (1/20) des reisolierten Cytosols (Spur 2) sowie ein großes Aliquot (1/2) der ER/Golgi-Fraktion (Spur 3) wurden einer SDS-PAGE und Fluoro- graphie unterworfen. Teil B: In einem ähnlichen Mischexperiment wurden isolierte unmarkierte Glyoxysomen mit dem aus in vivo- markierten Kotyledonen präparierten radioaktiven Cytosol inkubiert. Die anschließende Reisolation der Glyoxysomen und Glyoxysomenmembranen wurde mittels Flotation in einem Saccharose- gradienten durchgeführt. Dazu wurde das Inkubationsgemisch auf 60% (Gew. /Gew.) Saccharose eingestellt. Ein Gradient (56 bis 38 % Saccharose) wurde auf die Probe geschichtet. Nach einer Zentrifugation bei 27000 U/min für 15 Std. in einem Beckman-SW-28- Rotor wurden die Fraktionen mittels SDS-PAGE und Fluorographie analysiert. Die Position der markierten LBLOX im Fluorogramm ist durch einen Pfeil angezeigt. Die Spuren entsprechen den folgenden Fraktionen (Gleichgewichtsdichten in Klammern) : Spur 4 (48 % Saccharose), Spur 5 (48,5 % Saccharose), Spur 6 (49 % Saccha- rose), Spur 7 (50,5 % Saccharose), Spur 8 (452,5 % Saccharose), Spur 24 (56 % Saccharose), Spur 25 (56,5 % Saccharose), Spur 26 (58 % Saccharose), Spur 27 (59% Saccharose) und Spur 28 (59 % Saccharose) . Die Nummern der Fraktionen 25-28 entsprechen der Position im Gradienten, an der die Suspension vor der Zentri- fugation eingefüllt wurde. Die Spuren 4-5 umfassen die Glyoxy- somenmembranen, und die Spur 8 enthält dem Proteinprofil zufolge die Glyoxysomen.
Fig. 4. Affinität von in Bakterien exprimierter LBLOX und PLA zu Liposomen.
In 200 μl Puffer wurde 1 μg der entsprechenden Proteine mit einer Menge an Liposomen inkubiert, die 1 mg Phosphatidylcholin entsprach. Nach 30 min wurde das Gemisch auf 42% Saccharose ein- gestellt und in einen Saccharosegradienten geschichtet. Die
Flotation erfolgte durch Zentrifugation bei 100000 g für 6 Std. Die Proteine in den aus dem Gradienten erhaltenen Subtraktionen wurden mittels SDS-PAGE und Immunblots analysiert. Zur Immunmarkierung wurden entsprechende Antiseren, die entweder gegen LBLOX oder gegen das Patatin-ähnliche Protein hergestellt worden waren, verwendet. Die ganz rechten Spuren zeigen immer den Boden, an dem das Inkubationsgemisch vor der Zentrifugation unter den Gradienten geschichtet wurde. Somit erfolgte die Flotation von rechts nach links .
Fig. 5. Schematische Darstellung der LBLOX-Struktur und ihres N-terminalen Abschnitts (Aminosäurereste 48-244) , die das ß-Barrel aufweist.
Die Struktur der LBLOX wurde auf der Grundlage der für Soja- bohnen-LOX-1 erhaltenen Kristallstrukturdaten [21] unter Verwendung der Primärsequenz der LBLOX berechnet. Im oberen Teil der Figur sind der N-Terminus und das ausschließlich aus ß-Falt- blättern bestehende ß-Barrel unten rechts etwas gesondert dar- gestellt. Der Hauptteil der LOX, der das aktive Zentrum am C-Terminus umfasst, wird von α-Helices dominiert. Der untere Teil der Figur stellt eine vergrößerte Ansicht des N-terminalen ß-Barrels dar. Die 40 7Λminosäurereste des äußersten N-Terminus, eine in anderen LOX-Strukturen nicht gefundene Verlängerung, sind nicht dargestellt. Die unten rechts mit Pfeilen markierte unterbrochene Struktur zeigt eine Stelle, an der die Aminosäuresequenz der LBLOX erheblich von derjenigen der Sojabohnen-LOX-1 abweicht. Das angewendete Programm (Swiss 3D model, Expasy-Server) ergab hier, ähnlich wie bei LOX-1, eine hochflexible Schleife und somit eine Undefinierte Struktur. Diese Schleife besteht in LOX-1 aus 14 Aminosäureresten, umfasst bei LBLOX aber 20 Aminosäurereste. Die beiden Glutamylreste E59 und E70 sind einzigartig und werden nur in LBLOX und nicht in Sojabohnen-LOX-1 gefunden. Diese Stelle kann eine Rolle bei der Ca2+-koodinierten Membranassoziation spielen.
Fig. 6. In vi tro-Bindung des GST-LBLOX244-Fusionsproteins an isolierte Lipidkörper.
Das affinitätsgereinigte Fusionsprotein GST-LBLOX244 wurde zu einer Suspension von Lipidkörpern in angereichertem Cytosol gegeben. Nach der Inkubation wurden die Lipidkörper mittels
Flotation von den löslichen Proteinen abgetrennt. Aliquote beider Fraktionen sowie der ursprünglichen rohen Lipidkörperfraktion (Spuren 3 und 6) wurden mittels SDS-PAGE und anschließendem Immunblot unter Verwendung von anti-LBLOX-Antiserum analysiert. Spuren 2 und 5: durch Flotation gewonnene Lipidkörper: Spuren 1 und 4: reisolierte lösliche Proteine. Der auf die Bande bei 51 kDa deutende Pfeil zeigt das Fusionsprotein, das zusätzlich zur endogenen LBLOX an Lipidkörper gebunden hat . Spuren 1-3 : Proteinfärbung; Spuren 4-6: Immunmarkierung.
Fig. 7. Bindung von LBLOX-Konstrukten und rekombinanten Proteinen mit Wildtyp- und verändertem ß-Barrel an Liposomen.
Nach der Inkubation der gereinigten rekombinanten Proteine mit Liposomen wurden die Liposomen aus dem Inkubationsgemisch mittels Flotation in einem Saccharosegradienten reisoliert. Das Verhalten von Wildtyp-Lipidkörper-LOX (LBLOX) wurde verglichen mit dem eines Fragmentes, das die N-terminale Hälfte von LBLOX enthielt (LBLOX-Δ504) , mit dem Fusionsprotein mit dem ß-Barrel (GST-LOX) sowie mit einer LBLOX, deren N-terminales ß-Barrel erheblich verändert worden war (LBLOX-HA3) . Die Figur zeigt die Analyse von Gradientenfraktionen mittels SDS-PAGE und Immunmarkierung unter Verwendung von anti-LBLOX-Antiserum. Abkürzungen. Hämagglutinin, HA; Glutathion-S-transferase, GST; Lipidkörperlipoxygenase, LBLOX; Lipoxygenase, LOX; Phospholipase A2, PLA.
Enzyme . Glutathion-S-transferase (EC 2.5.1.18); Isocitratlyase (EC 4.1.3.1); Lipoxygenase (EC 1.13.11.12); Phospholipase A2 (EC 3.1.4.3) .

Claims

Patentansprüche
1. Isolierte Nukleinsauresequenz, die für ein Polypeptid codiert und die aus einer Kombination der Nukleinsauresequenzen einer
Biosynthesenukleinsäuresequenz des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels mit einer der folgenden Nukleinsäuren zusammengesetzt wird:
a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 60 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen,
d) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder des Aminoterminale Teils des kodierenden Bereichs dieser Sequenz .
2. Isolierte Nukleinsauresequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Biosynthesegen-Nukleinsäuresequenz des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels eine Sequenz der folgenden Protein-Gruppen verwendet wird: Acyl-CoA-Dehydrogenase (n) , Acyl-ACP[= acyl carrier protein] - Desaturase (n) , Acyl-ACP-Thioesterase (n) , Fettsäure-Acyl- Transferase (n) , Fettsäure-Synthase (n) , Fettsäure-Hydroxy- lase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (n) , Acyl-Coenzym A- Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase (n) , Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase (n) .
3. Isolierte Nukleinsauresequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Biosynthesegen-Nukleinsäuresequenz des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels eine Sequenz der folgenden Protein-Gruppen verwendet wird:
Fettsäure-Acyl-Transferase (n) , Δ4-Desaturase, Δ5-Desaturase,
Δ6-Desaturase, Δ9-Desaturase, Δ12-Desaturase, Δ15-Desaturase oder eine Fettsäure-Elongase.
4. Isolierte Nukleinsauresequenz nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die unter (c) genannten Derivate auf Aminosäureebene eine Homologie von 70 %, bevorzugt 80 %, besonders bevorzugt von 90 % über den gesamten Bereich der in
5 SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz haben (Programm PileUp, J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al . , CABIOS, 5 1989: 151 - 153).
5. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsauresequenz 10 gemäß Anspruch 1.
6. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsauresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
15
7. Verwendung einer Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 6 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
20 8. Vektor enthaltend eine Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 6.
9. Vektor nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Vektor um lineare oder zirkuläre DNA, Phagen, Viren, Transposons,
25 IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide oder Plasmide handelt.
10. Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß
30 Anspruch 6 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 8.
11. Organismus nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Organismus um einen eukaryontisehen Organismus handelt .
35 12. Organismus nach Anspruch 10 oder 11, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, einen eukaryontisehen Mikroorganismus oder ein Tier handelt.
13. Organismus nach den Ansprüchen 10 bis 12, wobei es sich bei 40 dem Organismus um eine Pflanze, einen Pilz oder eine Hefe handelt.
14. Organismus nach den Ansprüchen 10 bis 13, wobei es sich bei dem Organismus um Yarrowia lypolytica, Saccharomyces
45 cereviseae, Traustochytrium, Arabidopsis thaliana, Brassica napus oder Linium usitatissimum handelt.
15. Transgene Pflanze enthaltend eine Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 6.
16. Verfahren zum Targeting von an der Biosynthese von Lipiden 5 oder Fettsäuren beteiligten Proteinen in Liposomen oder
Lipidkörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man die für die Proteine kodierenden Nukleinsäuren mit einer der folgenden Sequenzen in einer gemeinsamen Protein kodierenden Sequenz kombiniert : 10 a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des
15 degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO : 2 dar-
20 gestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens
60 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen,
d) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder des Aminoterminale Teils des
25 kodierenden Bereichs dieser Sequenz, und
und die erhaltene Sequenz in einen eukaryontisehen Organismus einbringt .
30 17. Verfahren zum Targeting von an der Biosynthese von Lipiden oder Fettsäuren beteiligten Proteinen in Liposomen oder Lipidkörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 6 in einen Öl
35 produzierenden Organismus bringt.
18. Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren oder Lipiden dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt 40 gemäß Anspruch 6 in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und daß in dem Organismus enthaltene Öl isoliert.
19. Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsauresequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 6 in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und daß in dem Organismus enthaltene Öl isoliert und die Fettsäuren freisetzt.
20. Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Organismus um eine Pflanze oder einen eukaryontischen Mikroorganismus handelt.
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