EP1216305A1 - Souche de lactobacillus delbrueckii et son utilisation pour le criblage de plasmides - Google Patents

Souche de lactobacillus delbrueckii et son utilisation pour le criblage de plasmides

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EP1216305A1
EP1216305A1 EP00964296A EP00964296A EP1216305A1 EP 1216305 A1 EP1216305 A1 EP 1216305A1 EP 00964296 A EP00964296 A EP 00964296A EP 00964296 A EP00964296 A EP 00964296A EP 1216305 A1 EP1216305 A1 EP 1216305A1
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EP
European Patent Office
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plasmid
derivatives
plasmids
strain
delbrueckii
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EP00964296A
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EP1216305B1 (fr
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Pascale Serror
Christophe Fremaux
Laurent Benbadis
Emmanuelle Maguin
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Institut National de la En Gervais Danon Cie
Original Assignee
Gervais Danone SA
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Rhodia Food SAS
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to the introduction of plasmids into Lactobacillus delbruecku.
  • LANGELLA and CHOPIN [FEMS Microbiol. Lett. , 51, 149-52, (1989)] described the introduction by conjugation of foreign DNA (conjugative plasmid pIP501 from Streptococcus agalactiae) in Lb. delbruckii subsp. bulgaricus; PCT Application
  • WO 93/18164 describes the introduction to Lb. delbruckii subsp. bulgari cus of plasmids which comprise the replication system of the mutant replicon pVE6002 (CNCM 1-1179) also called pG + host, thermosensitive derivative (Ts) of the plasmid pWVO1;
  • Application EP 0603416 in the name of MEIJI MILK PRODUCTS CO LTD describes the use of the plasmid conjugative pAM ⁇ 1 to integrate a heterologous gene into the Lb chromosome. delbruckii. BOIZET et al. [Appl. About. Microbiol.
  • delbrueckii by electroporation using plasmids derived from pBUL1, or from the plasmid pSYE originating from Lactococcus lactis; 1 electroporation is performed after an intermediate Lb culture step.
  • delbrueckii at 42 ° C for 2 to 3 hours in an LCMG medium whose initial pH is between 5 and 5.5 and containing formic acid (5 to 5.5 mg / ml). This step is followed by washing and heat treatment at temperatures ranging from 0 to 50 ° C, for 10 minutes to 24 hours.
  • SASAKI et al. Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; FEMS Microbiol. Rev.
  • Lb strains. delbrueckii more easily transformable, in order to use them as hosts allowing the replication and the expression of foreign DNA, as well as as models, to test plasmids in order to then use them to transform other strains of Lb. delbrueckii, especially industrial strains.
  • a single strain of Lb. bulgaricus is currently known to allow high transformation rates using plasmid DNA whose preparation was not carried out from Lb. delbrueckii; it is the mutant strain T-ll mentioned above, which is deficient in a restriction / modification system.
  • Such a strain does not, however, constitute a good model for testing plasmids intended to be introduced into strains having an intact restriction / modification system.
  • the inventors have succeeded in obtaining, from a representative strain of Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, strain ATCC11842, a mutant strain whose restriction / modification systems appear similar to those of the wild strain ATCC11842 and which can be transformed much more easily and in a more reproducible manner than the latter.
  • the use of this mutant strain enabled them to identify plasmids that could potentially be used to transform Lb. delbrueckii.
  • the present invention relates to the Lb strain. delbrueckii subsp. bulgaricus, hereinafter referred to as VI104, deposited under the Budapest Treaty on September 17, 1999, under number 1-2316, with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms), 25 rue du Dondel Roux, in Paris.
  • VI104 Lb strain. delbrueckii subsp. bulgaricus
  • the present invention also relates to a method for screening for plasmids capable of transforming bacteria of the Lb species. delbrueckii, characterized in that one proceeds to 1 electroporation of the strain VI104 in the presence of a plasmid to be tested, and to the detection of transformed bacteria.
  • the plasmid in transformed bacteria, can be present in free form, in the case of a replicative plasmid, or in integrated form in the case of an integrative plasmid.
  • copies of said plasmid can be recovered from said transformed bacteria, in order to be used to transform VI104 or other strains of Lb. delbrueckii, in particular strains whose restriction systems are barriers to transformation.
  • strain VI104 can be carried out according to techniques known from the prior art for the electroporation of Lb. delbrueckii, for example that described in Application JP 5-176777.
  • the inventors have observed that a better transformation yield is obtained if the intermediate stage of culture used in this method is omitted, and if the electroporation is carried out on cultures at the start of the stationary phase, and after a heat treatment at 45 ° C between 10 and 30 min.
  • the present invention also relates to the use of a plasmid capable of being selected by the above method, with the exception of the plasmid pBUL1 described in Application EP 529088 and its derivatives, heat-sensitive derivatives of the plasmid pWVOl , containing the mutant replicon pVE6002, described in PCT Application WO 93/18164, and the plasmid pSYE described in Application JP 5-176777 and its derivatives, for transforming a bacterium of the Lb species. delbrueckii.
  • said plasmid is chosen from: the plasmid pWS58 and its derivatives; - the plasmid pLEM7 and its derivatives; the plasmid pLP1 and its derivatives; the plasmid pLC2 and its derivatives; the plasmid pGT633 and its derivatives; the plasmid pWVO1 and its derivatives, with the exception of the heat-sensitive derivatives containing the mutant replicon pVE6002; the plasmid pSH71 and its derivatives; non-conjugative plasmids derived from pIP501; non-conjugative plasmids derived from pAM ⁇ l - the integrative plasmid pMCl and its derivatives.
  • plasmid derived from a plasmid X means any plasmid which can be obtained from said plasmid X by insertion and / or deletion of a nucleotide sequence and / or mutation (s) of the initial sequence, provided that said plasmid retains functional elements allowing its replication at Lb. delbrueckii. These functional elements can be identical to those of the initial plasmid, or they can differ from these by the introduction of mutation (s), in particular of mutation (s) leading to a conditional activity of the replication and / or stability functions.
  • Plasmids derived from a plasmid X can also be obtained, for example, by insertion into said plasmid X of one or more sequences such as genes of interest which it is desired to express in the host bacterium transformed by said plasmid , multisite linkers allowing the insertion of said genes, transcription and / or translation control sequences, reporter genes, selection markers and in particular markers compatible with food use, mobile elements, chromosomal fragments (s) or plasmid (s), sequences controlling the number of copies of the plasmid. These sequences can be inserted in addition to plasmid sequences already present, or in replacement of some of them. Derived plasmids which can be used as shuttle vectors can also be constructed by inserting sequences making it possible to broaden the host spectrum, in particular sequences allowing replication and maintenance in host bacteria belonging to other species.
  • the plasmids selected in accordance with the invention can advantageously be used to test whether a given nucleotide sequence (gene, control sequence, mobile element, etc.) is functional in Lb. delbrueckii.
  • Table I below shows that the strains ATCC11842 and VT104 restrict in an equivalent manner 3 phages (C5h2, C5, 11) propagated on the strains CNRZ448 or CNRZ327.
  • the VI104 bacteria are grown in MRS medium, 0.1% glycine (DIFCO) until the start of the stationary phase. They are then centrifuged and washed in electroporation buffer (0.4 M sucrose, 1 raM MgCl 2 , 5 mM KH 2 P0 4 , pH 6.0) and suspended in this same buffer at a concentration corresponding to a OD 50 of approximately 50. The suspension is incubated for 20 min at 45 ° C. and then cooled on ice. An 80 ⁇ l aliquot of the suspension is mixed with the plasmid DNA (-1.5 ⁇ g) and the mixture is transferred to a 0.2 cm electroporation tank. The electroporation is carried out at 1 kV, 800 ⁇ , and 25 ⁇ F.
  • electroporation buffer 0.4 M sucrose, 1 raM MgCl 2 , 5 mM KH 2 P0 4 , pH 6.0
  • the mixture is diluted in 2 ml of expression medium (0.2 M sucrose, 5% skimmed milk powder, 0.1% yeast extract, 1% casamino acids, 25 mM MgCl 2 ).
  • expression medium 0.2 M sucrose, 5% skimmed milk powder, 0.1% yeast extract, 1% casamino acids, 25 mM MgCl 2 .
  • the cells are spread on dishes of selective medium (MRS Agar with 10 ⁇ g / ml of erythromycin or 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol according to the selection marker carried by the plasmid to test) ; the dishes are incubated in an anaerobic jar at 37 ° C. for 48 h, and the colonies resistant to erythromycin or to chloramphenicol are selected to confirm the presence of plasmid DNA.
  • VI104 The transformation of VI104 with different types of plasmids was carried out according to the protocol described in Example 2 above.
  • Figure 1 Results of the electrophoretic analysis of total DNA of transformants of L. bulgaricus VI104.
  • Total DNA was prepared from the transformants of pJK650 (A), pLEM415 (B) and pGT633 (C).
  • wells 1 and 2 correspond, respectively, to the plasmid DNA representative of that used during the transformation and to the total DNA of a transformant.
  • Figure 2 Results of total DNA analysis of an L transformant. bulgaricus VI104 by pULP8.
  • Wells 1 and 2 correspond, respectively, to the electrophoretic analysis of the plasmid DNA representative of that used during the transformation and to the total DNA of a transformant.
  • Wells 4 and 5 correspond, respectively, to the hybridization of a pULP8 probe against the plasmid DNA representative of that used during the transformation and against the total DNA of a transformant after digestion with the enzyme .EcoRI.
  • Figure 3 Hybridization results of total DNA of L transformants. bulgaricus VI104 by pCU1882.
  • Total DNA was prepared from the transformants of pCU1882.
  • Wells 1 and 3 contain the plasmid DNA representative of that used during the transformation and wells 2 and 4 contain the total DNA of a transformant.
  • the DNA is in native form in wells 1 and 2, and digested with the enzyme SalI in wells 3 and 4.
  • the probe used is pCU1882.
  • Figure 4 Results of hybridization of the total DNA of two L transformants. bulgaricus VI104 by pNZ12.
  • Wells 1 and 4 contain the plasmid DNA representative of that used during the transformation and wells 2, 3, 5 and 6 contain the total DNA of the transformants.
  • the DNA is in native form in wells 1 to 3, and digested with the enzyme Nco I in wells 4 to 6.
  • the probe used is pNZ12.
  • Plasmid of homologous origin The plasmid pJK650 (8.96 kb, KLEIN et al.,
  • Rolling circle replication plasmids. Different plasmids derived from replicons
  • transformants were obtained with the following plasmids: - pLEM7 [FONS et al. , Plasmid, 37, 199-203,
  • the plasmid pGT633 (9.8 kb), isolated from Lactobacillus reuteri, is naturally Ery R [TANNOCK et al. , Plasmid., 31, 60-71, (1994)]. Analysis of transformants allowed the detection of free molecules (Fig. 1C).
  • - pIL253 (Ery R ), is a non-conjugative derivative of pAM ⁇ 1 [SIMON and CHOPIN, Biochemistry, 70, 559-566, (1988)]. Several transformants were obtained with VI104. Plasmid DNA extraction detects free plasmid with low copy numbers.
  • the plasmid pMCl contains the attachment site attP (overlapping the tRNA ser gene) and the integrase gene (int) of the bacteriophage mv4 of L. delbrueckii [DUPONT et al. , J. Bacteriol. , 177, 586-595,
  • This vector integrates into the tRNA ser gene of a wide variety of lactic acid bacteria such as L. plantarum, L. casei, L. lactis, E. faecalis and Streptococcus pneumonia [AUVRAY et al. , J. Bacteriol., 179, 1837-1845, (1997)]. With VI104, integrants are obtained; structural analysis of their chromosomal DNA shows that pMCl integrates specifically.
  • EXAMPLE 4 TRANSFORMATION OF OTHER STRAINS OF L. DELBRUECKII.
  • transformants of pJK650 and pGB305 ⁇ are obtained with the strains ATCC11842 and CNRZ327
  • transformants of pLEM415 are obtained with the strain CNRZ327.

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Description

SOUCHE DE LACTOBACILLUS DELBRUECKU ET SON UTILISATION POUR LE CRIBLAGE DE PLASMIDES
La présente invention est relative à l'introduction de plasmides dans Lactobacillus delbruecku .
La transformation de bactéries lactiques pour leur permettre d'exprimer des gènes d'intérêt, notamment dans le but d'améliorer les propriétés de ces bactéries dans le cadre de leurs utilisations agroalimentaires , ou de leur conférer la capacité de produire des substances d'intérêt thérapeutique, fait l'objet de nombreuses recherches .
Cependant, les résultats obtenus varient largement selon l'espèce bactérienne concernée. Certaines espèces sont en effet dites « réfractaires » à la transformation, ce qui limite considérablement les possibilités d'introduction et d'expression d'ADN étranger. Parmi les bactéries lactiques réfractaires à la transformation, on mentionnera l'espèce Lactobacillus delbruecku , qui comprend notamment les sous-espèces Lb . delbruecku subs . bulgaricus, Lb . delbrueckii subsp . lactis, et Lb . delbruecku subsp. delbruecku .
Jusqu'à présent, les essais de transfert de gènes chez Lb . delbrueckii n'ont donné que peu de résultats ; seuls quelques plasmides capables de s'établir dans cette espèce ont été identifiés. LANGELLA et CHOPIN, [FEMS Microbiol . Lett . , 51, 149-52, (1989)] ont décrit l'introduction par conjugaison d'ADN étranger (plasmide conjugatif pIP501 de Streptococcus agalactiae) chez Lb . delbruckii subsp. bulgaricus ; la Demande PCT
WO 93/18164 décrit l'introduction chez Lb . delbruckii subsp. bulgari cus de plasmides qui comprennent le système de réplication du réplicon mutant pVE6002 (CNCM 1-1179) également dénommé pG+host, dérivé thermosensible (Ts) du plasmide pWVOl ; la Demande EP 0603416 au nom de MEIJI MILK PRODUCTS CO LTD décrit l'utilisation du plasmide conjugatif pAMβl pour intégrer un gène hétérologue dans le chromosome de Lb . delbruckii . BOIZET et al. [Appl . Environ. Microbiol . , 54, 3014-3018 (1984)], ont décrit l'introduction d'ADN de bactériophages par transfection de protoplastes de Lb . delbrueckii subsp. bulgaricus . Dans le cas de la transformation par de l'ADN plasmidique nu, la Demande EP 529088, au nom de MEIJI MILK PRODUCTS CO LTD décrit un plasmide dénommé pBULl, originaire de la souche M-878 de Lb . delbrueckii subsp. bulgaricus et ses dérivés, utilisables pour transformer Lb . delbrueckii ; la Demande JP 5-176777 décrit l'obtention de transformants de Lb. delbrueckii par électroporation, en utilisant des plasmides dérivés de pBULl, ou du plasmide pSYE originaire de Lactococcus lactis ; 1 ' électroporation est effectuée après une étape intermédiaire de culture de Lb . delbrueckii à 42 °C pendant 2 à 3 heures dans un milieu LCMG dont le pH initial est compris entre 5 et 5,5 et contenant de l'acide formique (5 à 5,5 mg/ml) . Cette étape est suivie de lavages et d'un traitement thermique à des températures variant de 0 à 50 °C, pendant 10 minutes à 24 heures. SASAKI et al. [Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus ; FEMS Microbiol. Rev. 12, 8 (1993)], rapportent la transformation de la souche ATCC11842 et d'une souche dérivée de M-878 de Lb . delbrueckii subsp. bulgaricus selon la méthode décrite dans la Demande JP 5-176777 ; la fréquence de transformation dans ces conditions est de 1 à 10 transformants par μg d'ADN plasmidique. Elle augmente jusqu'à 6 x 104 transformants par μg d'ADN plasmidique lorsqu'un sous-clone de M-878 (nommé par la suite T-ll) , déficient dans un système de restriction, est utilisé. La transformation de cette souche (T-ll) avec un plasmide dérivé de PSYE1 portant un gène d'α- amylase est également décrite par SATOH et al . [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4593-4596, (1997)]. L'identification d'autres plasmides utilisables pour transformer Lb . delbrueckii est entravée par le caractère « réfractaire » de cette espèce ; en effet, même dans le cas des plasmides capables de transformer Lb . delbrueckii qui sont mentionnés ci- dessus, le taux de transformation demeure généralement faible et la reproductibilité des résultats est irrégulière .
Pour tester la capacité d'autres plasmides à se maintenir sous forme libre ou intégrée chez Lb . delbrueckii , il est donc souhaitable de disposer d'une souche transformable, et d'une procédure de préparation de cellules compétentes permettant de limiter les échecs dus au caractère réfractaire de Lb . delbrueckii . La présente invention s'est donc fixé pour but l'obtention de souches de Lb . delbrueckii plus facilement transformables, afin de les utiliser comme hôtes permettant la réplication et l'expression d'ADN étranger, ainsi que comme modèles, pour tester des plasmides dans le but de les utiliser ensuite pour transformer d'autres souches de Lb . delbrueckii , notamment des souches industrielles .
Une seule souche de Lb . bulgaricus est actuellement connue pour permettre des taux de transformation élevés en utilisant de l'ADN plasmidique dont la préparation n'a pas été effectuée à partir de Lb . delbrueckii ; il s'agit de la souche mutante T-ll mentionnée ci -dessus, qui est déficiente dans un système de restriction/modification. Une telle souche ne constitue toutefois pas un bon modèle pour tester des plasmides destinés à être introduits dans des souches possédant un système de restriction/modification intact.
Les Inventeurs sont parvenus à obtenir, à partir d'une souche représentative de Lb . delbrueckii subsp. bulgaricus , la souche ATCC11842, une souche mutante dont les systèmes de restriction/modification apparaissent similaires à ceux de la souche sauvage ATCC11842 et qui peut être transformée beaucoup plus facilement et de manière plus reproductible que celle-ci. L'utilisation de cette souche mutante leur a permis d'identifier des plasmides potentiellement utilisables pour transformer Lb . delbrueckii .
La présente invention a pour objet la souche de Lb . delbrueckii subsp. bulgaricus, dénommée ci -après VI104, déposée selon le Traité de Budapest le 17 septembre 1999, sous le numéro 1-2316, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) , 25 rue du Docteur Roux, à Paris.
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de plasmides capables de transformer des bactéries de l'espèce Lb . delbrueckii , caractérisé en ce que l'on procède à 1 ' électroporation de la souche VI104 en présence d'un plasmide à tester, et à la détection de bactéries transformées.
Dans les bactéries transformées, le plasmide peut être présent sous forme libre, dans le cas d'un plasmide réplicatif, ou sous forme intégrée dans le cas d'un plasmide intégratif.
Avantageusement, des copies dudit plasmide peuvent être récupérées à partir desdites bactéries transformées, afin d'être utilisées pour transformer VI104 ou d'autres souches de Lb . delbrueckii , notamment des souches dont les systèmes de restriction sont des barrières à la transformation.
L' électroporation de la souche VI104 peut être effectuée selon les techniques connues de l'art antérieur pour 1 ' électroporation de Lb . delbrueckii , par exemple celle décrite dans la Demande JP 5-176777. Cependant, les Inventeurs ont observé que l'on obtenait un meilleur rendement de transformation si l'on supprime l'étape intermédiaire de culture mise en œuvre dans cette méthode, et si 1 ' électroporation est effectuée sur des cultures en début de phase stationnaire, et après un traitement thermique à 45°C entre 10 et 30 min.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un plasmide susceptible d'être sélectionné par le procédé ci-dessus, à l'exception du plasmide pBULl décrit dans la Demande EP 529088 et de ses dérivés, des dérivés thermosensibles du plasmide pWVOl, contenant le réplicon mutant pVE6002, décrits dans la Demande PCT WO 93/18164, et du plasmide pSYE décrit dans la Demande JP 5-176777 et de ses dérivés, pour transformer une bactérie de l'espèce Lb . delbrueckii .
Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ledit plasmide est choisi parmi : le plasmide pWS58 et ses dérivés ; - le plasmide pLEM7 et ses dérivés ; le plasmide pLPl et ses dérivés ; le plasmide pLC2 et ses dérivés; le plasmide pGT633 et ses dérivés ; le plasmide pWVOl et ses dérivés, à l'exception des dérivés thermosensibles contenant le réplicon mutant pVE6002 ; le plasmide pSH71 et ses dérivés ; les plasmides non-conjugatifs dérivés de pIP501 ; les plasmides non-conjugatifs dérivés de pAMβl - le plasmide intégratif pMCl et ses dérivés.
On entend par « plasmide dérivé d'un plasmide X » tout plasmide pouvant être obtenu à partir dudit plasmide X par insertion et/ou délétion d'une séquence nucléotidique et/ou mutation (s) de la séquence initiale, à condition que ledit plasmide conserve des éléments fonctionnels permettant sa réplication chez Lb . delbrueckii . Ces éléments fonctionnels peuvent être identiques à ceux du plasmide initial, ou bien ils peuvent différer de ceux-ci par l'introduction de mutation(s), notamment de mutation(s) conduisant à une activité conditionnelle des fonctions de replication et/ou de stabilité.
Des plasmides dérivés d'un plasmide X peuvent aussi être obtenus, par exemple, par insertion dans ledit plasmide X d'une ou plusieurs séquences telles que des gènes d'intérêt que l'on souhaite exprimer dans la bactérie-hôte transformée par ledit plasmide, des lieurs multisite permettant l'insertion desdits gènes, des séquences de contrôle de la transcription et/ou de la traduction, des gènes rapporteurs, des marqueurs de sélection et notamment des marqueurs compatibles avec une utilisation alimentaire, des éléments mobiles, des fragments chromosomique (s) ou plasmidique (s) , des séquences contrôlant le nombre de copies du plasmide. Ces séquences peuvent être insérées en supplément de séquences plasmidiques déjà présentes, ou en remplacement de certaines d'entre elles. Des plasmides dérivés utilisables comme vecteurs navettes peuvent également être construits par insertion de séquences permettant d'élargir le spectre d'hôte, notamment des séquences permettant la replication et le maintien dans des bactéries hôtes appartenant à d'autres espèces.
Les plasmides sélectionnés conformément à l'invention peuvent avantageusement être utilisés pour tester si une séquence nucléotidique donnée (gène, séquence de contrôle, élément mobile, etc.) est fonctionnelle chez Lb . delbrueckii .
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'utilisation de la souche VI104 pour la sélection de plasmides utilisables pour transformer d'autres souches de Lb . delbrueckii . EXEMPLE 1 : COMPARAISON DES PROPRIETES DE RESTRICTION/MODIFICATION DE LA SOUCHE VI104 ET DE LA SOUCHE ATCC11842
Le tableau I ci -dessous montre que les souches ATCC11842 et VT104 restreignent de manière équivalente 3 phages (C5h2, C5 , 11) propagés sur les souches CNRZ448 ou CNRZ327.
TABLEAU I
D'autre part, aucune restriction de la part de ATCC11842 ou de VI104 n'est observée pour les phages propagés sur ces souches. Ces résultats indiquent que les systèmes de restriction et de modification mis en jeu dans ces expériences sont comparables dans les deux souches ATCC11842 et VI104. EXEMPLE 2 : CONDITIONS DE CULTURE ET DE TRANSFORMATION
Les bactéries VI104 sont cultivées en milieu MRS, 0,1% glycine (DIFCO) jusqu'en début de phase stationnaire . Elles sont ensuite centrifugées et lavées dans du tampon d' électroporation (0,4 M sucrose, 1 raM MgCl2, 5 mM KH2P04, pH 6,0) et mises en suspension dans ce même tampon à une concentration correspondant à une DOsoo d'environ 50. La suspension est incubée 20 min à 45 °C puis refroidie sur de la glace. Une aliquote de 80 μl de la suspension est mélangée avec l'ADN plasmidique (-1,5 μg) et le mélange est transféré dans une cuve d' électroporation de 0,2 cm. L' électroporation est effectuée à 1 kV, 800 Ω, et 25 μF.
Immédiatement après 1 ' électroporation, le mélange est dilué dans 2 ml de milieu d'expression (0,2 M sucrose, 5% lait écrémé en poudre, 0,1% extrait de levure, 1% casaminoacides, 25 mM MgCl2) . Après incubation pendant 3 h à 37°C dans ce milieu, les cellules sont étalées sur des boites de milieu sélectif (MRS Agar avec 10 μg/ml d' érythromycine ou 10 μg/ml de chloramphénicol selon le marqueur de sélection porté par le plasmide à tester) ; les boites sont incubées en jarre d' anaérobiose à 37°C pendant 48 h, et les colonies résistantes à 1 ' érythromycine ou au chloramphénicol sont sélectionnées pour confirmer la présence d'ADN plasmidique.
EXEMPLE 3 : CRIBLAGE DE PLASMIDES FONCTIONNELS DANS LA SOUCHE VI104
La transformation de VI104 par différents types de plasmides a été effectuée selon le protocole décrit à l'exemple 2 ci -dessus. La présence de formes plasmidiques libres dans les transformants a été établie par extraction d'ADN total [FOUET et SONENSHEIN, J. Bacteriol . , 172, 835-44, (1990)], électrophorèse et éventuellement, hybridation de SOUTHERN avec une sonde plasmidique. De l'ADN représentatif de celui utilisé pour la transformation est analysé en parallèle et permet de confirmer l'identité de taille des plasmides.
Les résultats sont illustrés par les Figures 1 à 4 : Légendes des figures :
Figure 1 : Résultats de l'analyse électrophorétique d'ADN total de transformants de L. bulgaricus VI104. L'ADN total a été préparé à partir des transformants de pJK650 (A) , de pLEM415 (B) et de pGT633 (C) . Dans chaque cas, les puits 1 et 2 correspondent, respectivement, à l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et à l'ADN total d'un transformant.
Figure 2 : Résultats de l'analyse d'ADN total d'un transformant de L . bulgaricus VI104 par pULP8. Les puits 1 et 2 correspondent, respectivement, à l'analyse électrophorétique de l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et à l'ADN total d'un transformant. Les puits 4 et 5 correspondent, respectivement, à l'hybridation d'une sonde pULP8 contre l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et contre l'ADN total d'un transformant après digestions par 1 ' enzyme .EcoRI . Figure 3 : Résultats d'hybridation de l'ADN total des transformants de L . bulgaricus VI104 par pCU1882.
L'ADN total a été préparé à partir des transformants de pCU1882. Les puits 1 et 3 contiennent l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et les puits 2 et 4 contiennent l'ADN total d'un transformant. L'ADN est sous forme native dans les puits 1 et 2 , et digéré par l'enzyme Sali dans les puits 3 et 4. La sonde utilisée est pCU1882. Figure 4 : Résultats d'hybridation de l'ADN total de deux transformants de L . bulgaricus VI104 par pNZ12.
Les puits 1 et 4 contiennent l'ADN plasmidique représentatif de celui utilisé lors de la transformation et les puits 2, 3, 5 et 6 contiennent l'ADN total des transformants. L'ADN est sous forme native dans les puits 1 à 3, et digéré par l'enzyme Nco I dans les puits 4 à 6. La sonde utilisée est pNZ12.
1) Plasmide d' origine homologue. Le plasmide pJK650 (8,96 kb, KLEIN et al . ,
System. Appl. Microbiol. 18, 493-503, 1995) est un dérivé du plasmide pWS58 isolé d'une souche de Lb . delbrueckii subsp. lactis . Ce plasmide • qui porte le gène de résistance à l' érythromycine de pE194 [HORINOUCHI et WEISBLUM, J. Bacteriol . , 150, 804-814, (1982)], transforme la souche VI104. La présence de formes libres du plasmide dans les transformants indique que ce plasmide est réplicatif dans VI104 (Figure 1A) .
2) Plasmides d'origine hétéroloσue.
Plasmides à replication de type « cercle roulant ». Différents plasmides dérivés de réplicons
« cercle roulant » ont été testés pour leur capacité à transformer et à se maintenir dans VI104.
Aucun transformant n'a été observé avec les plasmides suivants : - pE194, plasmide naturellement EryR originaire de S . aureus [HORINOUCHI et WEISBLUM, 1982, publication précitée] .
En revanche, des transformants ont été obtenus avec les plasmides suivants : - pLEM7 [FONS et al . , Plasmid, 37, 199-203,
(1997)] naturellement EryR et son dérivé pLEM415 (Fig. 1B) .
- pULP8 (6,6 kb) [BRINGEL et al . , Plasmid, 22, 193-202, (1989)], dérivés EryR (gène de pVA891, [MACRINA et al . , Gène, 25, 145-50, (1983)] du plasmide pLPl de Lactobacillus plantarum [BOUIA et al . , Plasmid, 22, 185- 192, (1989)], donnent des transformants avec VI 104.L' analyse de transformants de pULPδ (Fig. 2) a permis de visualiser de formes libres par hybridation avec une sonde radioactive spécifique de pULP8.
- Le plasmide pCU1882 (6,7 kb) , dérivé CmR (gène de pC194) de pLC2 de L. curvatus LTH683 [KLEIN et al . , 1993, publication précitée] a conduit à l'obtention de transformants CmR dans VI104. L'analyse des transformants a permis de visualiser des formes libres par hybridation avec une sonde radioactive spécifique de pCU1882 (Fig. 3) .
Le plasmide pGT633 (9,8 kb) , isolé de Lactobacillus reuteri , est naturellement EryR [TANNOCK et al . , Plasmid., 31, 60-71, (1994)]. L'analyse des transformants a permis la détection de molécules libres (Fig. 1C) .
- pNZ12 et pNZ121, dérivés CmR (gène CmR de pC194) du plasmide pSH71 de L. lactis [DE VOS, FEMS Microbiol. Rev. , 46, 281-295, (1987)] transforment VI104. L'analyse de transformants de chaque plasmide permet la détection de molécules libres. La Figure 4 illustre les résultats de l'analyse pour pNZ12.
Plasmides à replication thêta. LANGELLA et CHOPIN [1989, publication précitée] ont montré que le plasmide conjugatif pIP501
(30 kb, originaire de Streptococcus agalactiae) se réplique à très faible nombre de copies dans L. bulgaricus (CNRZ431) . Du fait de la grande taille de ce plasmide, il n'est pas envisageable de l'utiliser pour électrotransformer VI104. Les Inventeurs ont testé des dérivés de pIP501 non-conjugatifs et de plus petite taille dont pGB305Δ (EryR, [LE CHATELIER et al . , Plasmid, 29, 50-56, (1995)]). Ce plasmide transforme VI104 et se retrouve sous forme libre détectable par analyse de l'ADN total .
- pIL253 (EryR) , est un dérivé non-conjugatif de pAMβl [SIMON et CHOPIN, Biochimie, 70, 559-566, (1988)] . Plusieurs transformants ont été obtenus avec VI104. L'extraction d'ADN plasmidique permet de déceler du plasmide libre à faible nombre de copies.
Vecteur d'intégration site-spécifique.
Le plasmide pMCl contient le site d'attachement attP (chevauchant le gène tRNAser) et le gène de l'intégrase ( int) du bactériophage mv4 de L. delbrueckii [DUPONT et al . , J. Bacteriol . , 177, 586-595,
(1995)] . Ce vecteur s'intègre dans le gène tRNAser d'une grande variété de bactéries lactiques telles que L. plantarum, L . casei , L . lactis, E. faecalis et Streptococcus pneumonia [AUVRAY et al . , J. Bacteriol., 179, 1837-1845, (1997)]. Avec VI104, des intégrants sont obtenus ; l'analyse structurale de leur ADN chromosomique montre que pMCl s'intègre de manière spécifique.
Ces résultats montrent que divers types de plasmides réplicatifs (plasmides d'origine homologue, plasmides d'origine héterologue à replication cercle roulant, plasmides d'origine héterologue à replication thêta), ainsi qu'un vecteur mtégratif peuvent transformer VI104.
EXEMPLE 4 : TRANSFORMATION D'AUTRES SOUCHES DE L. DELBRUECKII .
Les plasmides pJK650, pGB305Δ, et pLEM415, qui transforment VI104, ont également été utilisés pour transformer la souche ATCC11842 de L. delbrueckii subsp. bulgaricus et la souche CNRZ327 de L . delbrueckii subsp. lactis, selon le protocole décrit à l'exemple 2 ci- dessus .
Dans ces conditions, des transformants de pJK650 et de pGB305Δsont obtenus avec les souches ATCC11842 et CNRZ327, des transformants de pLEM415 sont obtenus avec la souche CNRZ327.

Claims

REVENDICATIONS 1) Souche de Lb . delbrueckii subsp. bulgari cus , dénommée VI104, déposée le 17 septembre 1999, sous le numéro 1-2316, auprès de la CNCM. 2) Procédé de criblage de plasmides capables de transformer des bactéries de l'espèce Lb . delbrueckii , caractérisé en ce que l'on procède à 1 ' électroporation de la souche VI104 selon la revendication 1, en présence du plasmide à tester, et à la détection de bactéries transformées comprenant ledit plasmide.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la récupération de copies dudit plasmide à partir desdites bactéries.
4) Utilisation d'un plasmide susceptible d'être sélectionné par le procédé selon une quelconque des revendications 2 ou 3 , à l'exception des plasmides pBULl, et pSYEl, et de leur dérivés, et des dérivés thermosensibles du plasmide pWVOl, contenant le réplicon mutant pVE6002, pour transformer une bactérie de l'espèce Lb . delbrueckii .
5) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit plasmide est choisi parmi : le plasmide pWS58 et ses dérivés ; le plasmide pLEM7 et ses dérivés ; - le plasmide pLPl et ses dérivés ; le plasmide pLC2 et ses dérivés , - le plasmide pGT633 et ses dérivés ; le plasmide pWVOl et ses dérivés, à l'exception des dérivés thermosensibles contenant le réplicon mutant pVE6002 ; le plasmide pSH71 et ses dérivés ; les plasmides non-conjugatifs dérivés de pIP501 ; le plasmide intégratif pMCl et ses dérivés.
6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit plasmide est choisi parmi pJK650, pGB305Δ, et pLEM415.
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