EP1214978A2 - Labortemperiereinrichtung zur Temperierung auf unterschiedliche Temperaturen - Google Patents

Labortemperiereinrichtung zur Temperierung auf unterschiedliche Temperaturen Download PDF

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EP1214978A2
EP1214978A2 EP01125514A EP01125514A EP1214978A2 EP 1214978 A2 EP1214978 A2 EP 1214978A2 EP 01125514 A EP01125514 A EP 01125514A EP 01125514 A EP01125514 A EP 01125514A EP 1214978 A2 EP1214978 A2 EP 1214978A2
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EP
European Patent Office
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groups
samples
steps
temperature control
temperature
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EP01125514A
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EP1214978B1 (de
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Ernst Tennstedt
Lars Dr. Peters
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Eppendorf SE
Original Assignee
Eppendorf SE
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/54—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices using spatial temperature gradients
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation

Definitions

  • the invention relates to a laboratory temperature control device in the preamble of Claim 1 and claim 11 mentioned type.
  • Such devices are used for tempering reaction samples, which in steps of a step sequence at temperatures in different Temperature ranges are brought.
  • the sequence of steps is in one pass repeated cyclically.
  • Such facilities are suitable for carrying out special chemical reactions, especially enzyme reactions.
  • the main area of application is PCR (Polymerase Chain Reaction). In doing so usual three-step process of denaturation at about 90 ° C, the Go through the annealing step at around 50 ° C and the elongation step at around 60 ° C.
  • reaction samples are according to the prior art arranged in a surface array in rows and columns.
  • a temperature gradient in the direction of the rows created. This leads to the first groups of samples from the Columns are formed, with the same temperatures, between however, the gaps have different temperatures.
  • the optimal temperature of this step e.g. B. of the annealing step.
  • the temperature gradient is applied to the annealing step and is included the temperature range e.g. at 50 ° -60 ° C, you can e.g. B. in ten Split the temperatures differently one degree and thus the optimal Determine temperature.
  • FIG. 5 is a generic type of claim 11 Laboratory temperature control described in two steps of the sequence of steps Gradients in different directions (X, Y) on the array of reaction samples invests. This makes it possible to run in two temperature ranges in just one pass to determine the optimal temperature.
  • the main area of application of the generic laboratory temperature control devices is in the field of PCR. This usually uses three steps. It would be very beneficial to easily do all three steps in one To optimize the temperature control run. There are also processes with more than known three steps with the same problems. It is therefore a task the present invention to provide a laboratory temperature control device, which the work and equipment involved in determining the optimal temperatures all steps of the sequence of steps are reduced.
  • the invention is based on the knowledge that in most of the feasible on generic laboratory temperature control devices Processes and especially in the usual three-step PCR process the temperature changes in the individual steps are not always the same Influence evaluation parameters. Affect in the usual PCR process Temperature changes in the annealing step and in the elongation step in essentially the same parameter, namely the specificity, i.e. the ratio from correctly amplified DNA strands of the correct length to incorrectly amplified Strands of different lengths. Temperature changes in the denaturation step but essentially affect another parameter the yield, that is the amount of amplified DNA material obtained. This Both parameters can be determined independently of one another on the reaction product.
  • the invention is not based on two-dimensional array arrangements of the reaction samples limited in row and column alignment.
  • the reaction samples can also be provided in a three-dimensional arrangement. Then leave optimize three steps in different gradient directions.
  • the Invention then gives the advantage, even with more than three-step sequences, if an independent parameter influences at least one of the steps will be able to optimize all steps in one pass.
  • the invention is also not limited to the usual arrangement of the reaction samples in a heat-conducting temperature control block, e.g. on opposite Ends are heated and cooled and this way over the block generated a temperature gradient.
  • a heat-conducting temperature control block e.g. on opposite Ends are heated and cooled and this way over the block generated a temperature gradient.
  • Any, even random, arrangement is available for all reaction samples reaction samples and the individual gradients possible.
  • temper the first groups of reaction samples accordingly in the first step and in the second step second groups of reaction samples accordingly to temper the regulation of claim 1.
  • These groups can be any Arrangement of the reaction samples and / or the temperature steps randomly be distributed over the sample arrangement. With today's computer technology, the resulting complex linking of the samples to the first and second Groups are not a problem.
  • the samples can the third groups can be chosen completely arbitrarily because of the group composition in the other steps because of the independent parameter evaluation no consideration has to be taken.
  • the first groups at least two of the samples different second Belong to groups.
  • This enables very simple, coarsely screened optimizations perform the z. B. only two different temperatures per step investigate.
  • the features of claim 3 are advantageously provided, after which z. B. also with larger groups all samples of the second groups belong to different first groups.
  • a flat array with Rows and columns would mean that e.g. B. in the first step, the temperatures are different between the columns and in the second step between the rows are different, i.e. all samples of a column in different Lines (second groups).
  • the invention can also be implemented with a very complex arrangement run the reaction samples.
  • the features of the claim are advantageous 4 provided. This allows the formation of the invention Laboratory temperature control device in the usual standard design, such as. B. from one of the fonts mentioned at the beginning.
  • the features are also advantageous of claim 5 provided, so the usual clear orthogonal Arrangement used, which has the advantage that of the orthogonal edges a block ago gradients are generated in the row and column direction can.
  • the groups are advantageous according to claim 6, the lines and Assigned to columns.
  • Generic laboratory temperature control devices are not only used for optimization the temperatures of the individual steps, but in particular are also after Determination of the optimal temperatures for mass processing of samples provided. They therefore take up a very large number of reaction samples, e.g. B. 384 samples in 24 columns and 16 rows.
  • a special device can also be used has only one sample column and one sample line and specifically only for optimization is provided and not for mass throughput.
  • more than one occupied row can be used per direction, e.g. two parallel rows directly next to each other or at a distance.
  • the third groups can be chosen arbitrarily. You can also according to claim 2 with the first Groups collapse. You can also choose advantageously according to claim 9 become.
  • the third groups are in a two-dimensional array Arrangement of the reaction samples divided into contiguous areas, which are only occupied with samples from one group at a time. This enables a special easy evaluation.
  • the samples are arranged in the temperature control unit in rows and columns the third groups can differ of the rows and columns in areas, e.g. B. arranged in four sectors be, provided that the temperature control device allows by their design.
  • the reaction samples are heated individually, the third groups can assigned areas can be chosen arbitrarily. One can for example For thermal reasons, warmer groups inside the array and colder ones Lay groups to the edge.
  • the invention can only be applied to a few of the steps, z. B. applied to two of three steps, then the third Step without temperature optimization with the same temperature of all reaction samples is carried out.
  • the features of claim 10 are advantageous intended.
  • the temperature optimization in all Steps of a process are a significant advantage.
  • reaction samples are first, second and assigned to third groups, each for one of the steps in the associated Temperature range between the groups different temperatures however, have the same temperatures within the groups.
  • All three can be processed in one run Steps of the usual PCR process the optimal temperatures are determined.
  • the samples can be arranged in three dimensions, which creates three dimensions, i.e. with regular arrangement e.g. Form columns, rows and levels, which can be grouped in a clear manner.
  • regular arrangement e.g. Form columns, rows and levels, which can be grouped in a clear manner.
  • Irregular 3-dimensional arrangements are also mentioned above for claim 1 with correspondingly more complicated group subdivision possible if Individual heaters of the reaction samples are provided.
  • reaction samples are arranged in a surface.
  • partial areas which have the usual X-Y arrangement of samples and which have the planes of one 3-dimensional arrangement correspond to several e.g. side by side in be arranged on a surface.
  • the laboratory temperature control device Computer can be the somewhat confusing 2-dimensional for illustration purposes Arrangement in the three-dimensional, well-ordered with three coordinates Arrangement can be converted.
  • reaction samples 1 shown are therefore different in the first groups tempered, the first groups the columns of the arrangement shown correspond. Within each first group (column) all reaction samples show 1 same temperature, there are different temperatures between the columns.
  • FIG. 2 shows the temperature control device of FIG. 1 in the elongation step.
  • the bottom line is on 70 °, the top line to 76 °.
  • the intermediate lines have corresponding intermediate temperatures. So here are the reaction samples in second groups held at different temperatures, the second group being the rows correspond. From a comparison of Figures 1 and 2 it can be seen that in the two 1 and 2 steps shown all samples of a first group (Column) belong to different second groups (rows) and vice versa. In the flat representation, this means that the groups and also the temperature gradients are orthogonal to each other.
  • Fig. 3 shows the same temperature control device in the execution of a third Step, namely the denaturing step.
  • This step should also focus on the cheapest temperature can be optimized in a temperature range, which is 90 ° -96 ° in the example shown.
  • the temperature gradient is here created in the Y direction.
  • the three steps of annealing, elongation and denaturation form a sequence of steps, which is repeated several times for exponential amplification.
  • Different annealing temperatures essentially influence the specificity of the reaction result. With specificity, the ratio of the correct amplified DNA pieces of correct length to incorrectly amplified DNA pieces of different lengths.
  • the elongation temperature affects essentially the same evaluation parameter, namely the specificity. However, the denaturation temperature in the step according to FIG. 3 essentially influences the yield, that is the amount of the reaction material obtained.
  • the temperature control device is therefore designed so that it is in the two steps Annealing (Fig 1) and elongation (Fig. 2), the same evaluation parameter influence that creates temperature gradients in independent directions X and Y.
  • the step according to FIG. 3 denaturation
  • the one deviating Evaluation parameter namely affects the yield
  • the temperature gradient be placed in any direction. In the embodiment shown in Fig. 3 it lies in the Y direction. However, it can also lie in the X direction.
  • FIGS. 1-3 shows an embodiment of the device of FIGS. 1-3 in the denaturing step, in the temperature range between 90 ° -96 °.
  • the third groups of different temperatures are not row by row or arranged in columns, but in the form of the three surface areas shown, which are at the three temperatures 90 °, 93 ° and 96 °. The surface areas are divided by the range limits shown.
  • Fig. 4 requires a slightly different construction.
  • the invention is not restricted to the embodiment shown in FIGS. 1-4.
  • FIG. 5 again shows a planar array arrangement of FIG Reaction samples arranged in rows and columns. Every reaction sample is shown with a number / letter combination. The numbers mean the columns and the letters the rows. A reaction test in the second Row and in the third column is therefore shown with 3b.
  • FIG. 6 shows the same reaction samples shown in FIG. 5, but in FIG another, e.g., random arrangement. Even with such an arrangement, which, however, presupposes individual tempering of the reaction samples, can Laboratory temperature control device work according to the invention. You must z. B. with computer support determine the first groups (e.g. the numbers 1-4) and with one first step differently but temperate in itself and it must be in one second step second groups (letters) differ in groups but temper at the same temperature. If with the two In the two steps, the evaluation parameters are different Form any group of steps and temper them accordingly.
  • first groups e.g. the numbers 1-4
  • second groups letters
  • the reaction samples are flat Arrays sorted in rows and columns. This facilitates in particular the use of conventional temperature control blocks, which are only used for the formation of Temperature gradients in the orthogonal direction, namely in the direction of the columns or lines are suitable. With other training of the facility, in particular, if equipped with individual temperature control for the individual reaction samples completely arbitrary arrangements can deviate from the line and column pattern can be selected.
  • the invention is not applicable to devices with a two-dimensional arrangement Reaction samples limited.
  • the reaction samples can also be three-dimensional be arranged, e.g. B. in a three-dimensional grid.
  • three Optimize steps simultaneously in terms of their temperature all three the same Influence evaluation parameters. Is it a tempering process, which has more than three steps, so with additional steps the directions already used are used again, provided the evaluation parameters are independent.
  • the three-dimensional arrangement mentioned can with individual heating of the samples, as in the two-dimensional example in the 5 and 6 are explained, resorted. There is also an arrangement in one Level possible on which the three-dimensional arrangement is mapped.
  • an array of samples 1 is shown, which forms 5 rows and 7 columns, i.e. has a total of 35 samples. In order to determine the optimal temperatures for the three steps in one pass, 35 expensive samples must therefore be used.
  • the resulting cross arrangement enables the impact of the applied Temperature gradients both in the X direction and in the Y direction a series of samples.
  • the unoccupied sample places can stay empty.
  • the laboratory temperature device can only be used in a special version be designed for the purpose of temperature optimization and then only those in the Figures 1 to 3 have underlined sample places.
  • FIG. 7 shows a further embodiment of a laboratory temperature control device, in of the reaction samples in an orthogonally ordered 3-dimensional arrangement with six columns, four rows and three levels.
  • the three Levels that actually lie one above the other are shown side by side in FIG. 7, to simplify the overview.
  • reaction samples are provided, which in Figure 7 with three-digit numbers are shown.
  • the first digit means the column, the second digit the line and the third digit the level.
  • Figure 7 Level all numbers end with 3 because this is the third level.
  • the samples are made in a 3-dimensional block arranged thermally conductive material.
  • gradients can be made in the X direction, Y direction or Z direction. If a gradient is created in the X direction, then samples with a lower number of columns are lower and samples with a higher number Column number at a higher temperature. If the gradient is applied in the Y direction, so it lies across the lines, bringing them to different temperatures. If the gradient is in the Z direction, the levels become different Brought temperature. The rows, columns or levels are that are at right angles to the respective gradient created.
  • FIG. 8 shows an embodiment variant in which all the samples shown in FIG. 7 are used are arranged in the flat array shown. You can see, that here the three levels shown individually in Figure 7 side by side in one Are arranged, namely in the first six columns one above the other 7 and 8 column and the lowest 7 in rearrangement. With individual heating of the reaction samples or e.g. suitable subdivision of larger, not shown heating devices to the samples of the arrangement according to FIG. 8 gradually the same gradients be created, as explained for the embodiment of Figure 7.
  • FIGS. 9 to 11 show a further embodiment of the laboratory temperature control device in three steps of a three-step sequence. It shows 9 the annealing step, FIG. 10 the elongation step and FIG. 11 the Denaturation.
  • the temperatures indicated in the figures correspond the associated temperature ranges, which are already based on FIGS. 1 to 4 have been explained.
  • FIGS. 9 to 11 there is the same flat array arrangement of reaction samples, each indicated with circles, shown.
  • the reaction samples in six columns and four rows in orthogonal alignment arranged.
  • the array surface is perpendicular first center line in two first partial areas (left and right of the center line) divided. Arrows are shown in the two partial areas formed in this way Temperature gradients created that correspond to those indicated with the numbers Temperature distribution.
  • the columns on the right and left are on the outside at 40 °, the gaps near the first center line are at 60 °. It are the same gradients but with the opposite direction.
  • Figure 11 shows the denaturation step.
  • the two become four quadrants each formed from center lines shown in FIGS. 9 and 10 different temperature from 90 ° to 96 ° applied, i.e. in the temperature range required for denaturation.
  • the optimal temperature in the step according to FIG. 9 were 50, according to FIG. 10 at 75 °, but different according to FIG. 11, for example at 96 °, would be so the sample for which all three temperatures are optimal, in the second column and the third line. Note that when in Fig. 9 the optimal temperature as mentioned at 50 °, then in the fifth line as well as in the second Line the optimal temperature prevails. In the selected example of FIG. 10 the optimal temperature is on the second line and also on the third line.
  • Temperature control block worked according to the type of construction used in the DE 196 46 115 C2 is shown in Figures 1 to 3, then the temperature control block z. B. on its underside facing away from the samples with nine Peltier elements 3x3 arrangement. Thereby lie in both directions the middle Peltier elements under the center lines and heat each two neighboring quadrants from the edge. With this arrangement can be in different current applied to the Peltier elements alternately Achieve gradient temperature control according to FIG. 9 and FIG. 10.
  • the heating that differs in quadrants according to FIG. 11 could be the underside of the temperature block additionally with heating foils covering the quadrants be provided in the step of FIG. 11 and when turned off Peltier elements individually bring the quadrants to the desired temperature.
  • the Gradients can also be created in a different way. As shown in FIG. 9 the top right and bottom right quadrants with the same gradient acted in the same direction. The gradient could be in either of these Quadrants can also be created in the opposite direction. The same applies also for the quadrants at the top left and bottom. It can e.g. B in the upper left Quadrants the gradient with arrow to the left and bottom left the gradient with Right arrow. This consideration also applies to FIG. 10.
  • this embodiment holds that in the four through the quadrants formed partial areas in the first and second step gradients in different Directions are created and all in the third step (Fig. 11) Samples of a partial area are at the same temperature. In the third step not four, as shown in Fig. 11, but e.g. six different temperatures accordingly, there are six in the manner described above Sub-areas to be treated required.
  • a different temperature is and is present in each partial area in the other two steps, gradients are created over each partial area. Because it for each combination of different temperatures the different Steps gives a sample that has been treated with this temperature combination, with this arrangement, all interactions between the steps considered.

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Abstract

Eine Labortemperiereinrichtung zur gemeinsamen Temperierung von Reaktionsproben in mindestens zwei Schritten in jeweils zugeordneten bestimmten Temperaturbereichen, welche als Schrittfolge wiederholt nacheinander ausgeführt werden, wobei die Labortemperiereinrichtung in einem beliebig ausgewählten ersten Schritt der Schrittfolge mehrere jeweils wenigstens eine Probe enthaltende erste Gruppen von Proben auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem ersten Schritt zugeordneten ersten Temperaturbereiches bringt, ist dadurch gekennzeichnet, daß in einem beliebig ausgewählten zweiten Schritt der Schrittfolge, wenn das Reaktionsprodukt bei den beiden Schritten hinsichtlich gleicher Auswertparameter beeinflußt wird, bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigstens zwei der Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht sind, und wobei, wenn die Auswertparameter unterschiedlich sind, wenigstens zwei beliebige der Proben unterschiedlichen dritten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Labortemperiereinrichtung der im Oberbegriff des Anspruches 1 bzw. des Anspruches 11 genannten Art.
Derartige Einrichtungen werden zum Temperieren von Reaktionsproben verwendet, die in Schritten einer Schrittfolge auf Temperaturen in unterschiedlichen Temperaturbereichen gebracht werden. Die Schrittfolge wird in einem Durchlauf zyklisch wiederholt. Solche Einrichtungen eignen sich zur Durchführung spezieller chemischer Reaktionen, insbesondere von Enzymreaktionen. Das Hauptanwendungsgebiet ist die PCR (Polymerase Chain Reaction). Dabei werden in dem üblichen dreischrittigen Verfahren der Denaturierungschritt bei zirka 90°C, der Annealingschritt bei zirka 50°C und der Elongationsschritt bei zirka 60°C durchlaufen.
Ein Problem ist dabei, insbesondere beim Annealingschritt, aber auch bei den anderen Schritten stets die Ermittlung der optimalen Temperatur. Dazu werden Versuche bei unterschiedlichen Temperaturen benötigt.
Um diese Versuche zur Auffindung der optimalen Temperatur eines Schrittes zu vereinfachen, wurden die gattungsgemäßen Labortemperiereinrichtungen entwikkelt, wie sie z. B. in US 6 054 263 sowie in DE 196 46 115 A1 beschrieben sind.
Beim gattungsgemäßen Stand der Technik wird in einem der Schritte, zumeist im Annealingschritt mit unterschiedlichen Temperaturen gearbeitet. Bei den anderen Schritten werden gleiche Temperaturen verwendet. Die Reaktionsproben sind nach dem Stand der Technik in einem Flächenarray in Reihen und Spalten angeordnet. In dem Schritt, der unterschiedliche Temperaturen verwendet, wird in einer Richtung des Arrays, also beispielsweise in Richtung der Zeilen ein Temperaturgradient angelegt. Dies führt dazu, das erste Gruppen von Proben von den Spalten gebildet werden, wobei innerhalb der Spalten gleiche Temperaturen, zwischen den Spalten jedoch unterschiedliche Temperaturen anliegen.
Bei der Auswertung der Proben nach abgeschlossenem Temperierungsdurchlauf kann ermittelt werden, in welcher der Spalten das optimale Ergebnis vorliegt. Die zugehörige Temperatur ist dann die optimale Temperatur dieses Schrittes, z. B. des Annealingschritt.
Wird der Temperaturgradient auf den Annealingschritt angewendet und liegt bei diesem der Temperaturbereich z.B. bei 50°-60°C, so kann man z. B. in zehn Spalten die Temperaturen je ein Grad unterschiedlich anlegen und somit die optimale Temperatur ermitteln.
Will man auch bei den anderen Schritten der Schrittfolge die Temperaturen optimieren, so muß derselbe Durchlauf wiederholt werden, wobei nun aber der Gradient in einem anderen der Schritte angelegt wird. Will man bei dem üblichen dreischrittigen PCR-Verfahren alle drei Schritte optimieren, so müssen drei komplette Temperierdurchläufe nacheinander durchgeführt werden. Dazu ist ein erheblicher Zeitaufwand von zirka 1,5 h pro Durchlauf und ein erheblicher Verbrauch an zum Teil extrem teuren Proben erforderlich. Da die optimalen Temperaturen der einzelnen Schritte in unterschiedlichen Durchläufen ermittelt werden, werden eventuelle Wechselwirkungen zwischen den Temperaturen der Schritte nicht berücksichtigt. Dies kann zur Ermittlung nichtoptimaler Temperaturen führen.
In der DE 196 46 115 A1 ist zu Fig. 5 eine zu Anspruch 11 gattungsgemäße Labortemperiereinrichtung beschrieben, die bei zwei Schritten der Schrittfolge Gradienten in unterschiedlichen Richtungen (X, Y) an das Array der Reaktionsproben anlegt. Damit ist es möglich, in nur einem Durchlauf in zwei Temperaturbereichen die optimale Temperatur zu ermitteln.
Auch bei der letztgenannten Einrichtung ist ein weiter Durchlauf zur Optimierung der dritten Temperatur erforderlich. Bei einer flächigen Arrayanordnung von Reaktionsproben stehen aber nur zwei Richtungen X und Y zur Verfügung. Für eine dritte Temperatur wäre eine dritte Richtung Z erforderlich, die bei einer zweidimensionalen Anordnung nicht vorhanden ist.
Dabei wurde es nach dem Stand der Technik für unabdingbar erforderlich gehalten, Gradienten bei unterschiedlichen Schritten in unterschiedlichen Richtungen anzulegen, also z. B. beim einen Schritt in Richtung der Spalten und beim anderen Schritt in Richtung der Zeilen, um bei der Ermittlung der Reaktionsergebnisse, die sich ergebenden Unterschiede eindeutig den Temperaturvariationen im einen Schritt und im andern Schritt zuordnen zu können.
Das Hauptanwendungsgebiet der gattungsgemäßen Labortemperiereinrichtungen liegt auf dem Gebiet der PCR. Diese verwendet üblicherweise drei Schritte. Es wäre sehr vorteilhaft, alle drei Schritte auf einfache Weise in einem einzigen Temperierdurchlauf optimieren zu können. Es sind auch Prozesse mit mehr als drei Schritten bekannt, bei denen dieselben Probleme bestehen. Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Labortemperiereinrichtung zu schaffen, die den Arbeits- und Geräteaufwand bei der Ermittlung der optimalen Temperaturen aller Schritte der Schrittfolge verringert.
Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des Anspruches 1 sowie des Anspruches 11 gelöst.
Bei der Lösung des Anspruches 1 geht die Erfindung von der Erkenntnis aus, daß bei den meisten auf gattungsgemäßen Labortemperiereinrichtungen durchführbaren Prozessen und insbesondere bei dem üblichen dreischrittigen PCR-Prozess die Temperaturänderungen bei den einzelnen Schritten nicht immer denselben Auswertparameter beeinflussen. Bei dem üblichen PCR-Prozess beeinflussen Temperaturänderungen beim Annealingschritt und beim Elongationsschritt im wesentlichen denselben Parameter, nämlich die Spezifität, also das Verhältnis von korrekt amplifizierten DNA-Strängen der richtigen Länge zu falsch amplifizierten Strängen abweichender Länge. Temperaturänderungen beim Denaturierungschritt beeinflussen aber im wesentlichen einen anderen Parameter nämlich die Ausbeute, also die Menge gewonnenen amplifizierten DNA-Materiales. Diese beiden Parameter sind voneinander unabhängig am Reaktionprodukt bestimmbar. Wenn man beim einfachen Beispiel einer Temperiereinrichtung mit flächig in Zeilen und Spalten angeordneten Reaktionsproben bleibt, legt die Labortemperiereinrichtung also bei zwei Schritten, die denselben Parameter beeinflussen (z.B. Annealingschritt und Elongationsschritt), die Gradienten in unterschiedlichen Richtungen an und bei zwei Schritten (z.B. Annealingschritt und Denaturierungschritt), die unterschiedliche Parameter beeinflussen, Gradienten in beliebiger Richtung an. Im letztgenannten Fall können die Temperaturgradienten sogar in beiden Schritten derselben Richtungen angelegt werden. Da hierbei die Auswertparameter bei den beiden Schritten unterschiedlich sind und unabhängig bestimmbar sind, können die optimalen Temperaturen für beide Schritte getrennt ermittelt werden. Es ergibt sich der enorme Vorteil, daß bei der mit Gradienten in X- und Y-Richtung arbeitenden Konstruktion der DE 196 46 115 A1 entgegen der bisherigen Erwartungen der Fachwelt doch alle drei Schritte des Standard PCR-Prozesses in einem Temperierdurchlauf optimiert werden können. Da die Temperaturen mehrerer Schritte in einem gemeinsamen Durchlauf ermittelt werden, werden auch Wechselwirkungen zwischen den Schritten (Crosstalk) berücksichtigt, was z.B. bei Annealingschritt und Elongationsschritt der Fall ist.
Die Erfindung ist nicht auf zweidimensionale Array-Anordnungen der Reaktionsproben in Zeilen- und Spaltenausrichtung beschränkt. Die Reaktionsproben können auch in einer dreidimensionalen Anordnung vorgesehen sein. Dann lassen sich drei Schritte in unterschiedlichen Gradientenrichtungen optimieren. Die Erfindung gibt dann den Vorteil, auch bei mehr als dreischrittigen Schrittfolgen, sofern bei wenigsten einem der Schritte ein unabhängiger Parameter beeinflußt wird, alle Schritte in einem Durchlauf optimieren zu können.
Bei der Optimierung eines Reaktionsprozesses, wie z.B. des PCR-Prozesses, kommt es nicht allein auf die Temperaturoptimierung bei den einzelnen Schritten an, sondern es kann auch erforderlich sein, die Reaktionsproben hinsichtlich anderer Parameter z.B. hinsichtlich der Verdünnung zu optimieren. Der Vorteil der Erfindung, Temperaturoptimierungen in mehr Schritten durchführen zu können als unabhängige Richtungen in der Probenanordnung vorhanden sind, bietet auch hierfür eine Lösung. In einer 3-dimensionalen Anordnung können z.B. mehrere Flächen in Ebenen übereinander gelegt werden, in denen Proben unterschiedlicher Verdünnung angeordnet sind. Da sich die Verdünnung auf dieselben Auswertparameter auswirken kann, ist es vorteilhaft, die Richtung, in der unterschiedliche Verdünnungen vorliegen, nicht zum Anlegen unterschiedlicher Temperaturen zu verwenden. Daher werden die Temperaturgradienten in den Ebenen angelegt. Es können also in einem Durchlauf alle drei Schritte des PCR-Prozesses hinsichtlich der Temperaturen und auch der Verdünnung optimiert werden.
Die Erfindung ist auch nicht beschränkt auf die übliche Anordnung der Reaktionsproben in einem wärmeleitenden Temperierblock, der z.B. an gegenüberliegenden Enden beheizt und gekühlt wird und auf diese Weise über den Block hinweg einen Temperaturgradienten erzeugt. Bei Verwendung von Einzeltemperiereinrichtungen für alle Reaktionsproben sind beliebige, auch zufällige Anordnungen der Reaktionsproben und der einzelnen Gradienten möglich. Es sind dann im ersten Schritt erste Gruppen von Reaktionsproben entsprechend zu temperieren und im zweiten Schritt zweite Gruppen von Reaktionsproben entsprechend der Vorschrift des Anspruch 1 zu temperieren. Diese Gruppen können bei beliebiger Anordnung der Reaktionsproben und/oder der Temperaturschritte zufällig über die Probenanordnung verteilt sein. Bei heutiger Computertechnik stellt die sich ergebende komplizierte Verknüpfung der Proben zu ersten und zweiten Gruppen kein Problem dar.
Sind die Auswertparameter zumindest weitgehend voneinander unabhängig, was wie erwähnt beim üblichen PCR-Prozeß z. B. bei dem Annealingschritt und dem Denaturierungsschritt der Fall ist, dann können, wie bereits erwähnt, die Proben der dritten Gruppen völlig beliebig gewählt werden, weil auf die Gruppenzusammenstellung bei den anderen Schritten wegen der unabhängigen Parameterauswertung keine Rücksicht genommen werden muß.
Vorteilhaft sind dann die Merkmale des Anspruches 2 vorgesehen. Hierbei können für die dritte Gruppenbildung das Schema der Gruppenbildung für die ersten Gruppen verwendet werden. Das vereinfacht die Temperiereinrichtung erheblich.
Bei dem bereits erwähnten Standardanwendungsfall einer flächigen Arrayanordung in Zeilen und Spalten können also z. B. die ersten Gruppen aus Zeilen bestehen und die dritten wiederum ebenfalls aus Zeilen. Es kann also für den zweiten Schritt die Ansteuerungsgeometrie des ersten Schrittes übernommen werden. Wird mit einem Temperaturgradienten in einem wärmeleitfähigem Block gearbeitet, so kann die Richtung des Gradient des zweiten Schrittes mit der des Gradienten des ersten Schrittes parallel oder antiparallel zusammenfallen. Unter anderem bedeutet dies, daß bei einer einfachen Labortemperiereinrichtung, die einen Gradienten in nur einer Richtung erzeugen kann, dennoch bei einem zweischrittigen Verfahren beide Schritte optimiert werden können, sofern bei diesen beiden Schritten die Auswertparameter unterschiedlich sind.
Nach der Erfindung ist es ganz allgemein nur erforderlich, daß bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigsten zwei der Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören. Damit lassen sich sehr einfache grob gerasterte Optimierungen durchführen, die z. B. nur zwei unterschiedliche Temperaturen pro Schritt untersuchen. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des Anspruches 3 vorgesehen, wonach z. B. auch bei größeren Gruppen jeweils alle Proben der zweiten Gruppen zu unterschiedlichen ersten Gruppen gehören. Bei einem flächigen Array mit Zeilen und Spalten würde dies bedeuten, daß z. B. im ersten Schritt die Temperaturen zwischen den Spalten unterschiedliche sind und im zweiten Schritt zwischen den Zeilen unterschiedlich sind, also alle Proben einer Spalte in unterschiedlichen Zeilen (zweiten Gruppen) liegen.
Wie bereits erwähnt, läßt sich die Erfindung auch mit sehr komplexer Anordnung der Reaktionsproben ausführen. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des Anspruches 4 vorgesehen. Dies erlaubt die Ausbildung der erfindungsgemäßen Labortemperiereinrichtung in üblicher Standardbauweise, wie z. B. aus einer der eingangs genannten Schriften bekannt. Vorteilhaft sind dabei auch die Merkmale des Anspruches 5 vorgesehen, wird also die übliche übersichtliche orthogonale Anordnung verwendet, die den Vorteil hat, daß von den orthogonalen Kanten eines Blockes her Gradienten in Zeilen- und Spaltenrichtung erzeugt werden können. Dann sind vorteilhaft die Gruppen gemäß Anspruch 6 den Zeilen und Spalten zugeordnet.
Gattungsgemäße Labortemperiereinrichtungen dienen nicht nur der Optimierung der Temperaturen der einzelnen Schritte, sondern sind insbesondere auch nach Ermittlung der optimalen Temperaturen zur Massenverarbeitung von Proben vorgesehen. Sie nehmen daher eine sehr große Zahl von Reaktionsproben auf, z. B. 384 Proben in 24 Spalten und 16 Zeilen.
Dabei sind vorteilhaft die Merkmale des Anspruches 7 vorgesehen. Wenn hiernach z. B. nur eine der ersten Gruppen mehrere Proben enthält, und auch nur eine der zweiten Gruppen mehrere Proben enthält, ergibt sich im Falle der Anordnung in einem zweidimensionalen Array mit Zeilen und Spalten z. B. nur bei einer Zeile und nur einer Spalte eine vollständige Besetzung mit Proben, also pro Richtung nur eine besetzte Reihe. Werden bei den Schritten Gradienten in Zeilen- und Spaltenrichtung angelegt, so kann die Temperaturoptimierung mit sehr wenigen Proben, also mit sehr sparsamem Verbrauch der teuren Proben erfolgen. Dabei kann die Labortemperiereinrichtung durchaus zur Aufnahme einer sehr großen Probenzahl, z. B. 384 Proben ausgebildet sein. Die übrigen Probenplätze bleiben unbesetzt. Es kann jedoch auch ein Spezialgerät verwendet werden, das nur eine Probenspalte und ein Probenzeile aufweist und das speziell nur zur Optimierung vorgesehen ist und nicht für den Massendurchsatz. Selbstverständlich können pro Richtung auch mehr als eine besetzte Reihe verwendet werden, z.B. zwei parallele Reihen direkt nebeneinander oder auch im Abstand.
Dabei sind vorteilhaft die Merkmale des Anspruches 8 vorgesehen. Durch dieses Merkmal ist sichergestellt, daß jede Gruppe bei Schritten, bei denen ihre Proben auf gleicher Temperatur liegen, im mittleren Bereich des zugeordneten Temperaturbereiches liegen. Es wird also z.B. beim Annealingschritt mit unterschiedlichen Temperaturen nach der optimalen Temperatur gesucht. Bei den anderen Schritten werden aber die mittleren Temperaturen des Temperaturbereiches verwendet, um aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten.
Wenn bei zwei Schritten unterschiedliche Auswertparameter beeinflußt werden, die ausgewerteten Ergebnisse also unabhängig sind, so können die dritten Gruppen beliebig gewählt werden. Sie können auch gemäß Anspruch 2 mit den ersten Gruppen zusammenfallen. Vorteilhaft können Sie auch gemäß Anspruch 9 gewählt werden. Danach sind die dritten Gruppen bei einer zweidimensionalen Array Anordnung der Reaktionsproben in zusammenhängende Flächen unterteilt, die nur mit jeweils Proben einer Gruppe besetzt sind. Dies ermöglicht eine besonders einfache Auswertung. Bei einer Anordnung der Proben in der Temperiereinrichtung in Zeilen und Spalten können die dritten Gruppen also abweichend von den Zeilen und Spalten in Flächen, z. B. in vier Sektoren, angeordnet sein, vorausgesetzt, daß die Temperiereinrichtung ihrer Bauart nach dies zuläßt. Bei Einzeltemperierung der Reaktionsproben können die den dritten Gruppen zugeordneten Flächen beliebig gewählt werden. Man kann beispielsweise aus thermischen Gründen wärmere Gruppen in das Innere des Arrays und kältere Gruppen zum Rand hin legen.
Die Erfindung kann bei mehrschrittigen Schrittfolgen nur auf wenige der Schritte, z. B. auf zwei von drei Schritten angewendet werden, wobei dann der dritte Schritt ohne Temperaturoptimierung mit gleicher Temperatur aller Reaktionsproben durchgeführt wird. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des Anspruches 10 vorgesehen. Wie bereits erwähnt stellt die Temperaturoptimierung bei allen Schritten eines Prozesses einen erheblichen Vorteil dar.
Bei der Erfindung gemäß Anspruch 11 werden Reaktionsproben ersten, zweiten und dritten Gruppen zugeordnet, die jeweils für einen der Schritte in dem zugehörigen Temperaturbereich zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen, innerhalb der Gruppen jedoch gleiche Temperaturen aufweisen. Hiermit kann bei jedem Schritt in unterschiedlicher Gruppenaufteilung mit unterschiedlichen Temperaturen gearbeitet werden. In einem Durchlauf können somit bei allen drei Schritten des üblichen PCR-Prozesses die optimalen Temperaturen ermittelt werden.
Die Proben können 3-dimensional angeordnet sein, wodurch sich drei Dimensionen, also bei regelmäßiger Anordnung z.B. Spalten, Zeilen und Ebenen ausbilden, nach denen in übersichtlicher Weise gruppiert werden kann. Wie bereits oben zu Anspruch 1 erwähnt, sind auch unregelmäßige 3-dimensionale Anordnungen mit entsprechend komplizierterer Gruppenunterteilung möglich, wenn Einzelheizungen der Reaktionsproben vorgesehen sind.
Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 12 vorgesehen. Bei dieser sehr einfachen Anordnung mit Temperaturgradienten in X-, Y- und Z-Richtung kann in einem üblichen wärmeleitenden Block gearbeitet werden, in dem die Reaktionsproben angeordnet sind. Gegenüber der bekannten Anordnung muß hier allerdings der Temperierblock 3-dimensional und beheizbar ausgebildet sein.
Vorteilhaft sind auch die Merkmale des Anspruches 13, wonach die Reaktionsproben in einer Fläche angeordnet sind. Es können beispielsweise Teilflächen, die die übliche X-Y-Anordnung von Proben aufweisen und die den Ebenen einer 3-dimensionalen Anordnung entsprechen, zu mehreren z.B. nebeneinander in einer Fläche angeordnet sein. In dem die Labortemperiereinrichtung steuernden Computer kann zu Darstellungszwecken die etwas unübersichtliche 2-dimensionale Anordnung in die mit drei Koordinaten wohlgeordnete 3-dimensionale Anordnung umgerechnet werden.
Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 14 vorgesehen. In zwei Schritten werden jeweils in Teilflächen Gradienten entgegengesetzter Richtung angelegt, wobei sich die Teilflächen der beiden Schritte in Quadranten überlappen. Im dritten Schritt werden die gebildeten Quadranten auf unterschiedliche Temperaturen gebracht. Auf diese Weise ist es ebenfalls sehr einfach möglich, in einer flächigen Anordnung von Reaktionsproben in drei Schritten die Temperatur für alle Schritte in einem Durchgang zu optimieren.
Die Merkmale der Ansprüche 1 bis 10 sowie 11 bis 14 können in vorteilhafter Weise auch kombiniert werden.
In den Zeichnungen ist die Erfindung beispielsweise und schematisch dargestellt.
Es zeigen:
Fig. 1
eine stark schematisierte erfindungsgemäße Labortemperiereinrichtung in Draufsicht auf ein nach Zeilen und Spalten geordnetes zweidimensionales Array von Reaktionsproben mit einem in X-Richtung angelegten Temperaturgradienten für den Annealingschritt eines Standard PCR-Prozesses,
Fig. 2
die Ansicht nach Fig. 1 für den Elongationsschritt mit einem Temperaturgradient in Y-Richtung,
Fig. 3
eine Ansicht nach Fig. 1 für den Denaturierungsschritt mit einem Temperaturgradienten ebenfalls in Y-Richtung,
Fig. 4
eine Ansicht nach Fig. 1 für den Denaturierungsschritt mit einer Aufteilung des Arrays in drei flächig gestaltete Gruppen,
Fig. 5
die schematische Darstellung eines nach Zeilen und Spalten geordneten Arrays von Reaktionsproben, die ersten Gruppen (Zahlen) und zweiten Gruppen (Buchstaben) zugeordnet sind,
Fig. 6
eine Darstellung entsprechend Fig. 5 mit anderer Anordnung der Reaktionsproben,
Fig. 7
eine stark schematisierte erfindungsgemäße Labortemperiereinrichtung mit 3-dimensionaler Anordnung von Reaktionsproben, wobei drei Ebenen der 3-dimensionalen Anordnung in der Figur übereinander dargestellt sind,
Fig. 8
die Darstellung einer Anordnung der Proben der Ausführungsform der Figur 7 in einem Flächenarray und
Fig. 9-11
zeigen eine weitere Ausführungsform der Labortemperiereinrichtung mit den jeweils eingestellten Temperaturen bei drei Schritten.
Fig. 1 zeigt eine Draufsicht auf ein Array von insgesamt 35 Reaktionsproben 1, die in einem zweidimensionalen Array in orthogonalen Zeilen und Spalten angeordnet sind. Das Feld ist mit einem gestrichelt dargestellten Rand 2 umgrenzt. Es kann sich beispielsweise um einen üblichen, mit dem Rand 2 begrenzten Temperierblock 3 handeln, wie er z. B. in der DE 196 46 115 A1 zu Fig. 5 erläutert ist, mit der Möglichkeit, in Richtung der Zeilen oder in Richtung der Spalten einen Temperaturgradienten anzulegen. Zu den technischen Einzelheiten dazu wird auf die genannte Schrift ausdrücklich Bezug genommen.
In Fig. 1 ist die dargestellte Labortemperiereinrichtung zur Ausführung des Annealingschrittes des Standard PCR-Prozesses betrieben. Es ist in X-Richtung der mit in Zeilenrichtung laufendem Pfeil dargestellte Temperaturgradient angelegt, der dafür sorgt, daß alle Reaktionsproben 1 der ersten Spalte auf 40° liegen, alle Proben der letzten Spalte auf 60° und die der mittleren Spalte auf 50°. Die übrigen Spalten weisen dazwischen liegende Temperaturen auf.
Die dargestellten Reaktionsproben 1 sind somit in ersten Gruppen unterschiedlich temperiert, wobei die ersten Gruppen den Spalten der dargestellten Anordnung entsprechen. Innerhalb jeder ersten Gruppe (Spalte) weisen alle Reaktionsproben 1 gleiche Temperatur auf, zwischen den Spalten herrschen unterschiedliche Temperaturen.
Fig. 2 zeigt die Temperiereinrichtung der Fig. 1 beim Elongationsschritt. Hier ist mit geeigneten, nicht dargestellten Einrichtungen ein Temperaturgradient im Sinne des dargestellten Pfeiles in Y-Richtung angelegt. Die unterste Zeile liegt auf 70°, die oberste Zeile auf 76°. Die Zwischenzeilen haben entsprechende Zwischentemperaturen. Hier sind also die Reaktionsproben in zweiten Gruppen auf unterschiedlichen Temperaturen gehalten, wobei die zweiten Gruppen den Zeilen entsprechen. Aus Vergleich der Figuren 1 und 2 ist ersichtlich, daß bei den beiden in Fig. 1 und 2 dargestellten Schritten jeweils alle Proben einer ersten Gruppe (Spalte) unterschiedlichen zweiten Gruppen (Zeilen) angehören und umgekehrt. In der flächigen Darstellung bedeutet dies, daß die Gruppen und ebenso die Temperaturgradienten orthogonal zueinander stehen.
Fig. 3 zeigt dieselbe Temperiereinrichtung bei der Ausführung eines dritten Schrittes, nämlich des Denaturierungsschrittes. Auch dieser Schritt soll auf die günstigste Temperatur optimiert werden und zwar in einem Temperaturbereich, der im dargestellten Beispiel bei 90°-96° liegt. Der Temperaturgradient wird hier in Y-Richtung angelegt.
Die drei Schritte Annealing, Elongation und Denaturierung bilden eine Schrittfolge, die mehrfach wiederholt wird zur exponentiellen Amplifizierung.
Wie die Figuren 1-3 zeigen, wird bei allen Schritten in dem jeweils dem Schritt zugeordneten Temperaturbereich die Temperatur variiert. Gemäß Fig. 1 sind unterschiedliche erste Gruppen (Spalten) auf unterschiedlichen Temperaturen zwischen 40°-60° gehalten. Gemäß Fig. 2 sind zweite Gruppen (Zeilen) auf unterschiedlichen Temperaturen im Temperaturbereich zwischen 70°-76° gehalten. Gemäß Fig. 3, beim Denaturierungsschritt, sind unterschiedliche dritte Gruppen (wiederum Zeilen) auf unterschiedlichen Temperaturen zwischen 90°-96° gehalten. Bei allen drei Schritten werden unterschiedliche Temperaturen angelegt. Durch Auswertung des Reaktionsergebnisses nach abgeschlossenem Durchlauf kann ermittelt werden, welche Temperatur in welchem Schritt optimal ist. Das Reaktionsergebnis kann auch während des Durchlaufes laufend verfolgt werden (Onlinemonitoring).
Diese Auswertung stellt bei den beiden Schritten gemäß Fig. 1 und Fig. 2 kein Problem dar, da die Gradienten in X- und Y-Richtung, also orthogonal zueinander stehen. Man braucht nur auszuwerten in welcher Reaktionsprobe das beste Ergebnis vorliegt und kann dann nach Zeile und Spalte ersehen, welches die beste Annealingtemperatur (Fig. 1) und welches die beste Elongationstemperatur (Fig. 2) ist. Bei dem Denaturierungsschritt gemäß Fig. 3 fallen die dort unterschiedlich temperierten dritten Gruppen mit den in Fig. 2 unterschiedlich temperierten zweiten Gruppen zusammen. Bei beiden Gruppen handelt es sich um Zeilen.
Unterschiedliche Annealingtemperaturen beeinflussen im wesentlichen die Spezifität des Reaktionsergebnisses. Mit Spezifität wird das Verhältnis der korrekt amplifizierten DNA-Stücke mit korrekter Länge zu nicht korrekt amplifizierten DNA-Stücken abweichender Länge bezeichnet. Die Elongationstemperatur beeinflußt im wesentlichen denselben Auswertparameter, nämlich die Spezifität. Die Denaturierungstemperatur im Schritt gemäß Fig. 3 beeinflußt jedoch im wesentlichen die Ausbeute, also die Menge des erhaltenen Reaktionsmateriales.
Die Temperiereinrichtung ist daher so ausgebildet, daß sie bei den beiden Schritten Annealing (Fig 1) und Elongation (Fig. 2), die den selben Auswertparameter beeinflussen, die Temperaturgradienten in unabhängiger Richtung X und Y anlegt. Bei dem Schritt gemäß Fig. 3 (Denaturierung), der einen abweichenden Auswertparameter nämlich die Ausbeute beeinflußt, kann der Temperaturgradient in beliebiger Richtung gelegt werden. In dem in Fig. 3 dargestellten Ausführungsfall liegt er in Y-Richtung. Er kann jedoch auch in X-Richtung liegen.
Fig. 4 zeigt in einer Ausführungsvariante die Einrichtung der Fig. 1-3 beim Denaturierungsschritt, also im Temperaturbereich zwischen 90°-96°. Die dritten Gruppen unterschiedlicher Temperatur sind hier jedoch nicht zeilenweise oder spaltenweise angeordnet, sondern in Form der drei dargestellten Flächenbereiche, die auf den drei Temperaturen 90°, 93° und 96° liegen. Die Flächenbereiche sind durch die dargestellten Bereichsgrenzen unterteilt.
Die Ausführungsform der Fig. 4 setzt eine etwas andere Konstruktion voraus. Ein gut wärmeleitender Block, der sich zur Anlegung von Temperaturgradienten in X- und Y-Richtung eignet, wie er für die Ausführungsform der Figuren 1-3 verwendbar ist, wäre zur Ausbildung gut abgegrenzter in sich gleichmäßig temperierter Flächen gemäß Fig. 4 nur schlecht geeignet. Sonderkonstruktionen können dies jedoch leisten, insbesondere Einrichtungen mit individueller Temperierung der einzelnen Reaktionsproben 1. Eine solche Konstruktion der Labortemperiereinrichtung kann dann selbstverständlich auch die in den Figuren 1-3 dargestellten Temperaturgradienten erzeugen.
Die Erfindung ist nicht beschränkt auf die in den Figuren 1-4 dargestellte Ausführungsform.
Fig. 5 zeigt noch einmal stark schematisiert eine flächige Arrayanordnung von Reaktionsproben, die in Zeilen und Spalten angeordnet sind. Jede Reaktionsprobe ist mit einer Zahl/Buchstabe-Kombination dargestellt. Dabei bedeuten die Zahlen die Spalten und die Buchstaben die Zeilen. Eine Reaktionsprobe in der zweiten Zeile und in der dritten Spalte ist also mit 3b dargestellt.
Fig. 6 zeigt dieselben Reaktionsproben, die in Fig. 5 dargestellt sind, jedoch in einer anderen, z.B, zufälligen Anordnung. Auch mit einer solchen Anordnung, die allerdings Einzeltemperierung der Reaktionsproben voraussetzt, kann eine Labortemperiereinrichtung erfindungsgemäß arbeiten. Sie muß z. B. mit Computerunterstützung erste Gruppen (z. B. die Zahlen 1-4) ermitteln und bei einem ersten Schritt unterschiedlich aber in sich gleich temperieren und sie muß in einem zweiten Schritt zweite Gruppen (Buchstaben) gruppenweise unterschiedlich aber mit in sich gleichen Temperaturen temperieren. Wenn bei den beiden Schritten die Auswertparameter unterschiedlich sind, kann sie in den beiden Schritten beliebige Gruppen bilden und entsprechend temperieren.
In den dargestellten Ausführungsformen sind die Reaktionsproben in flächigen Arrays in Zeilen- und Spaltenanordnung sortiert. Dies erleichtert insbesondere die Verwendung herkömmlicher Temperierblocks, die nur zur Ausbildung von Temperaturgradienten in orthogonaler Richtung und zwar in Richtung der Spalten bzw. Zeilen geeignet sind. Bei anderer Ausbildung der Einrichtung, insbesondere, wenn diese mit Einzeltemperierung für die einzelnen Reaktionsproben ausgerüstet ist, können auch völlig willkürliche Anordnungen abweichend vom Zeilen- und Spaltenmuster gewählt werden.
Die Erfindung ist nicht auf Einrichtungen mit zweidimensionaler Anordnung der Reaktionsproben beschränkt. Die Reaktionsproben können auch dreidimensional angeordnet sein, z. B. in einem dreidimensionalen Gitter. Dann lassen sich drei Schritte gleichzeitig hinsichtlich ihrer Temperatur optimieren, die alle drei denselben Auswertparameter beeinflussen. Handelt es sich um einen Temperierungsprozeß, der mehr als drei Schritte aufweist, so können bei zusätzlichen Schritten die bereits verwendeten Richtungen erneut verwendet werden, sofern die Auswertparameter unabhängig sind. Die erwähnte dreidimensionale Anordnung kann bei Einzelheizung der Proben auch, wie am zweidimensionalen Beispiel in den Fig. 5 und 6 erläutert, umsortiert werden. Dabei ist auch eine Anordnung in einer Ebene möglich, auf die die dreidimensionale Anordnung abgebildet ist.
Im Ausführungsbeispiel der Figuren 1 bis 3 ist ein Array von Proben 1 dargestellt, das 5 Zeilen und 7 Spalten ausbildet, also insgesamt 35 Proben aufweist. Um in einem Durchlauf die optimalen Temperaturen für die drei Schritte zu ermitteln, müssen somit 35 teure Proben eingesetzt werden.
Es ist eine Einsparung möglich, indem, wie in den Figuren 1 bis 3 dargestellt, nur eine Spalte und nur eine Zeile mit Proben besetzt wird. In den Figuren 1 bis 3 ist dies durch Unterstreichung der Proben in der 5. Spalte und in der 4. Zeile dargestellt.
Die sich ergebende Kreuzanordnung ermöglicht, die Auswirkung der angelegten Temperaturgradienten sowohl in X-Richtung als auch in Y-Richtung jeweils an einer Reihe von Proben zu ermitteln. Die nicht besetzten Probenplätze können leer bleiben. Die Labortemperatureinrichtung kann auch in Spezialausführung nur zu Zwecken der Temperaturoptimierung ausgebildet sein und dann nur die in den Figuren 1 bis 3 unterstrichen dargestellten Probenplätze aufweisen.
Figur 7 zeigt eine weitere Ausführungsform einer Labortemperiereinrichtung, bei der die Reaktionsproben in einer orthogonal geordneten 3-dimensionalen Anordnung mit sechs Spalten, vier Zeilen und drei Ebenen angeordnet sind. Die drei Ebenen, die tatsächlich übereinander liegen, sind in Figur 7 nebeneinander dargestellt, um die Übersicht zu vereinfachen. An den Plätzen der dargestellten Anordnung sind Reaktionsproben vorgesehen, die in Figur 7 mit dreistelligen Zahlen dargestellt sind. Dabei bedeutet jeweils die erste Ziffer die Spalte, die zweite Ziffer die Zeile und die dritte Ziffer die Ebene. In der in Figur 7 ganz unten liegenden Ebene enden daher alle Zahlen mit 3, weil dies die dritte Ebene ist.
Im Ausführungsbeispiel sind die Proben in einem 3-dimensionalen Block aus wärmeleitfähigem Material angeordnet. Nach aus dem Stand der Technik bekannter Weise können an diesem Block Gradienten in X-Richtung, Y-Richtung oder Z-Richtung angelegt werden. Wird ein Gradient in X-Richtung angelegt, so liegen Proben mit niedriger Spaltenzahl auf niedrigerer und Proben mit höherer Spaltenzahl auf höherer Temperatur. Wird der Gradient in Y-Richtung angelegt, so liegt er quer zu den Zeilen, bringt also diese auf unterschiedliche Temperaturen. Liegt der Gradient in Z-Richtung an, so werden die Ebenen auf unterschiedliche Temperatur gebracht. Dabei liegen jeweils die Zeilen, Spalten oder Ebenen, die quer zum jeweils angelegten Gradienten stehen, auf gleicher Temperatur.
Bei einem Prozeß mit einer dreischrittigen Schrittfolge können mit der dargestellten Labortemperiereinrichtung mit zyklisch wiederholter Schrittfolge, z.B. immer wieder im ersten Schritt ein Gradient in X-Richtung, in jedem zweiten Schritt ein Gradient in Y-Richtung und in jedem dritten Schritt ein Gradient in Z-Richtung angelegt werden.
Die in Figur 7 dargestellt 3-dimensionale Anordnung mit orthogonal geordneter Anordnung der Reaktionsproben zeichnet sich durch gute Übersichtlichkeit aus. Werden die Proben nicht in einen wärmeleitfähigen Block sondern mit Einzelheizung temperiert, so können auch abweichende 3-dimensionale Anordnungen verwendet werden, bei denen die Proben z.B. beliebig vertauscht angeordnet sind, analog zur Vertauschung zwischen den Figuren 5 und 6.
Figur 8 zeigt eine Ausführungsvariante, bei der alle in Figur 7 dargestellten Proben in dem dargestellten flächigen Array angeordnet sind. Man kann erkennen, daß hier die in Figur 7 einzeln dargestellten drei Ebenen nebeneinander in einer Fläche angeordnet sind, und zwar in den ersten sechs Spalten übereinander die obere und mittlere Fläche gemäß Fig. 7 und in der 7 und 8 Spalte die unterste Fläche der Fig. 7 in Umordnung. Mit Einzelheizung der Reaktionsproben oder z.B. geeigneter Unterteilung größerer, nicht dargestellter Heizeinrichtungen können an die Proben der Anordnung gemäß Figur 8 schrittweise dieselben Gradienten angelegt werden, wie zur Ausführungsform der Figur 7 erläutert.
Die Figuren 9 bis 11 zeigen eine weitere Ausführungsform der Labortemperiereinrichtung in drei Schritten einer dreischrittigen Schrittfolge. Dabei zeigt Figur 9 den Annealingschritt, Figur 10 den Elongationsschritt und Figur 11 den Denaturierungsschritt. Die in den Figuren angegebenen Temperaturen entsprechen den zugehörigen Temperaturbereichen, die anhand der Figuren 1 bis 4 bereits erläutert wurden.
In allen drei Figuren 9 bis 11 ist dieselbe flächige Arrayanordnung von Reaktionsproben, jeweils mit Kreisen angedeutet, dargestellt. Im Ausführungsbeispiel sind die Reaktionsproben in sechs Spalten und vier Zeilen in orthogonaler Ausrichtung angeordnet.
Beim Annealingschritt der Figur 9 ist die Arrayfläche mit einer lotrecht stehenden ersten Mittellinie in zwei erste Teilflächen (links bzw. rechts der Mittellinie) unterteilt. In den beiden so gebildeten Teilflächen sind die mit Pfeilen dargestellten Temperaturgradienten angelegt, die zu der mit den Zahlen angegebenen Temperaturverteilung führen. Die rechts und links außen liegenden Spalten liegen auf 40 °, die nahe der ersten Mittellinie liegenden Spalten liegen auf 60 °. Es handelt sich also um gleiche Gradienten jedoch mit umgekehrter Richtung.
Beim Elongationsschritt der Figur 10 wird eine entsprechende Temperaturverteilung jedoch innerhalb des für den Elongationsschritt benötigten Temperaturbereiches von 70° bis 76 ° angelegt. Hier liegt allerdings die zweite Mittellinie senkrecht zur ersten Mittellinie, also waagerecht. Es sind wiederum gegenläufige gleiche Gradienten in den so gebildeten zweiten Teilflächen angelegt.
Figur 11 zeigt den Denaturierungsschritt. Bei diesem wird in den aus den beiden aus Figur 9 und 10 ersichtlichen Mittellinien gebildeten vier Quadranten jeweils unterschiedliche Temperatur von 90° bis 96° angelegt, also im Temperaturbereich der für die Denaturierung erforderlich ist.
Betrachtet man die unterstrichen gekennzeichnete Reaktionsprobe die in Spalte 5, Zeile 2 liegt, und verfolgt man diese durch die drei in den Figuren 9, 10 und 11 dargestellten Schritte, so erkennt man, daß diese Probe eindeutig hinsichtlich der optimalen Temperaturen in den drei Schritten identifiziert werden kann. Sie benötigt für den Annealingschritt gemäß Figur 9 etwa 50°, für den Elongationsschritt gemäß Figur 10 etwa 75° und für den Denaturierungsschritt gemäß Figur 11 etwa 92°.
Läge die optimale Temperatur bei dem Schritt gemäß Fig. 9 bei 50, gemäß Fig. 10 bei 75°, gemäß Fig. 11 jedoch anders, und zwar beispielsweise bei 96°, so läge die Probe, für die alle drei Temperaturen optimal sind, in der zweiten Spalte und der dritten Zeile. Es ist zu beachten, daß, wenn in Fig. 9 die optimale Temperatur wie erwähnt bei 50° liegt, dann sowohl in der fünften Zeile als auch in der zweiten Zeile die optimale Temperatur herrscht. Beim gewählten Beispiel der Fig. 10 liegt die optimale Temperatur in der zweiten Zeile und auch in der dritten Zeile.
Es wird nur angemerkt, daß in den Figuren 9 bis 11 eine sehr kleine Arrayfläche mit wenigen Reaktionsproben dargestellt ist, um die zeichnerische Darstellung zu erleichtern. Dadurch ergibt sich beim Elongationsschritt in Figur 10 für die Reaktionsproben nur eine Differenzierung in zwei Temperaturen. Wird die Anzahl der Zeilen und Spalten deutlich erhöht, so lassen sich wesentlich feinere Temperaturunterschiede auswerten.
Wird anstelle der in den Figuren 9 bis 11 dargestellten Arrayfläche mit 24 Proben in sechs Spalten und vier Zeilen die übliche, wesentlich größere Anzahl von 384 Proben in vierundzwanzig Spalten und sechzehn Zeilen verwendet und wird, wie in den Figuren 9 bis 11 dargestellt, mit Teilflächen in Form von Quadranten gearbeitet, so ergeben sich vier Quadranten mit je zwölf Spalten und acht Zeilen. Sollen Temperaturübergangsprobleme im Bereich der Mittellinien zwischen den Quadranten vermieden werden, so können beispielsweise jeweils die beiden den Mittellinien in jedem Quadranten benachbarten Zeilen bzw. Spalten frei gelassen werden. Es verbleiben dann noch in den vier Ecken des Arrays angeordnete, mit Proben besetzte Bereiche, die jeweils in zehn Spalten und sechs Zeilen sechzig Proben aufnehmen und in denen mit hoher Temperaturauflösung die optimale Temperatur gesucht werden kann.
Wird bei einer solchen Labortemperiereinrichtung mit einem durchgehend wärmeleitfähigen Temperierblock nach Art der Konstruktion gearbeitet, die in der DE 196 46 115 C2 in den Figuren 1 bis 3 dargestellt ist, dann kann der Temperierblock z. B. an seiner den Proben abgewandten Unterseite mit neun Peltierelementen in 3x3 Anordnung großflächig besetzt sein. Dabei liegen in beiden Richtungen die mittleren Peltierelemente unter den Mittellinien und beheizen jeweils vom Rand her zwei benachbarte Quadranten. Mit dieser Anordnung läßt sich in unterschiedlicher Strombeaufschlagung der Peltierelemente abwechselnd die Gradiententemperierung nach Fig. 9 und nach Fig. 10 erzielen. Zur Erzeugung der quadrantenweise unterschiedlichen Beheizung gemäß Fig. 11 könnte die Unterseite des Temperieblockes zusätzlich mit die Quadranten bedeckenden Heizfolien versehen sein, die bei dem Schritt gemäß Fig. 11 und bei ausgeschalteten Peltierelementen die Quadranten einzeln auf die gewünschte Temperatur bringen.
Anders als bei der in den Fig. 9 bis 11 dargestellten Ausführungsform können die Gradienten auch in anderer Weise angelegt werden. Gemäß Darstellung in Fig. 9 werden der rechte obere und der rechte untere Quadrant mit dem selben Gradienten in der selben Richtung beaufschlagt. Der Gradient könnte in diesen beiden Quadranten auch mit entgegengesetzter Richtung angelegt sein. Dasselbe gilt auch für die Quadranten links oben und unten. Es kann z. B im linken oberen Quadranten der Gradient mit Pfeil nach links und links unten der Gradient mit Pfeil nach rechts angelegt sein. Diese Überlegung gilt auch für die Fig. 10.
Allgemein gilt für diese Ausführungsform, daß in den vier durch die Quadranten gebildeten Teilflächen jeweils im ersten und zweiten Schritt Gradienten in verschieden Richtungen angelegt sind und im dritten Schritt (Fig. 11) jeweils alle Proben einer Teilfläche auf gleicher Temperatur liegen. Werden im dritten Schritt nicht, wie in Fig. 11 dargestellt, vier sondern z.B. sechs unterschiedliche Temperaturen benötigt, so sind dementsprechend sechs auf die vorbeschriebene Weise zu behandelnde Teilflächen erforderlich.
In jeder Teilfläche liegt im dritten Schritt eine andere Temperatur an, und werden in den beiden anderen Schritten Gradienten über jede Teilfläche angelegt. Da es für jede Kombination der unterschiedlichen Temperaturen der unterschiedlichen Schritte eine Probe gibt, die mit dieser Temperaturkombination behandelt wurde, werden mit dieser Anordnung auch alle Wechselwirkungen zwischen den Schritten berücksichtigt.

Claims (14)

  1. Labortemperiereinrichtung zur gemeinsamen Temperierung von Reaktionsproben in mindestens zwei Schritten in jeweils zugeordneten bestimmten Temperaturbereichen, welche als Schrittfolge wiederholt nacheinander ausgeführt werden, wobei die Labortemperiereinrichtung in einem beliebig ausgewählten ersten Schritt der Schrittfolge mehrere jeweils wenigstens eine Probe enthaltende erste Gruppen von Proben auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem ersten Schritt zugeordneten ersten Temperaturbereiches bringt, dadurch gekennzeichnet, daß in einem beliebig ausgewählten zweiten Schritt der Schrittfolge, wenn das Reaktionsprodukt bei den beiden Schritten hinsichtlich gleicher Auswertparameter beeinflußt wird, bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigstens zwei der Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht sind, und wobei, wenn die Auswertparameter unterschiedlich sind, wenigstens zwei beliebige der Proben unterschiedlichen dritten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht sind.
  2. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei Schritten mit unterschiedlichen Auswertparametern alle Proben einer dritten Gruppe in einer ersten Gruppe enthalten sind oder alle Proben einer ersten Gruppe in einer dritten Gruppe enthalten sind.
  3. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei Schritten mit gleichen Auswertparametern bei allen zweiten Gruppen jeweils alle Proben unterschiedlichen ersten Gruppen angehören.
  4. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben in einem Array in Zeilen und Spalten angeordnet sind.
  5. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeilen und Spalten orthogonal zueinander angeordnet sind.
  6. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß alle Proben einer Gruppe in einer Zeile oder in einer Spalte liegen.
  7. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nur je eine der ersten und/oder zweiten und/oder dritten Gruppen mehrere Proben enthalten.
  8. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mehrere Proben enthaltenden Gruppen Proben derjenigen anderen Gruppen enthalten, die in ihrem jeweils zugeordneten Temperaturbereich in der Nähe der mittleren Temperatur liegen.
  9. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die dritten Gruppen Teilbereiche des Arrays ausbilden, welche mit ihren Bereichsgrenzen nur jeweils Proben derselben dritten Gruppe umschließen.
  10. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei allen Schritten der Schrittfolge die Proben auf gruppenweise unterschiedliche Temperaturen im Bereich des zugeordneten Temperaturbereiches gebracht sind.
  11. Labortemperiereinrichtung zur gemeinsamen Temperierung von Reaktionsproben in mindestens drei Schritten in jeweils zugeordneten bestimmten Temperaturbereichen, welche als Schrittfolge wiederholt nacheinander ausgeführt werden, wobei die Labortemperiereinrichtung in einem beliebig ausgewählten ersten Schritt der Schrittfolge mehrere jeweils wenigstens eine Probe enthaltende erste Gruppen von Proben auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem ersten Schritt zugeordneten ersten Temperaturbereiches bringt, und wobei in einem beliebig ausgewählten zweiten Schritt der Schrittfolge bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigstens zwei Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht werden, dadurch gekennzeichnet, daß in einem beliebig ausgewählten dritten Schritt der Schrittfolge bei mindestens einer der ersten Gruppen und mindestens einer der zweiten Gruppen wenigstens jeweils zwei Proben verschiedenen dritten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem dritten Schritt zugeordneten dritten Temperaturbereiches gebracht werden.
  12. Labortemperiereinrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsproben 3-dimensional angeordnet sind und zur Erzeugung der unterschiedlichen Temperaturen für drei Schritte Temperaturgradienten in X-, Y- und Z-Richtung angelegt werden.
  13. Labortemperiereinrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsproben in einer Fläche angeordnet sind.
  14. Labortemperiereinrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß in dem ersten Schritt die Fläche mit einer ersten Mittellinie in zwei erste Teilflächen geteilt ist, in denen jeweils gleiche Temperaturgradienten mit entgegengesetzter Richtung senkrecht zur Mittellinie angelegt sind, und daß in dem zweiten Schritt die Fläche mit einer zweiten Mittellinie, die senkrecht zur ersten Mittellinie steht, in zwei zweite Teilflächen geteilt ist, in denen jeweils gleiche Temperaturgradienten mit entgegengesetzter Richtung senkrecht zur Mittellinie angelegt sind, und daß in dem dritten Schritt in den durch die beiden Mittellinien gebildeten vier Quadranten der Fläche unterschiedliche Temperaturen angelegt sind.
EP01125514A 2000-12-12 2001-10-25 Verfahren zur Temperierung von Proben auf unterschiedliche Temperaturen in einer Labortemperiereinrichtung Expired - Lifetime EP1214978B1 (de)

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