EP1208133A1 - Copolymere für den transport von nukleinsäuren in die zelle - Google Patents

Copolymere für den transport von nukleinsäuren in die zelle

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EP1208133A1
EP1208133A1 EP00947874A EP00947874A EP1208133A1 EP 1208133 A1 EP1208133 A1 EP 1208133A1 EP 00947874 A EP00947874 A EP 00947874A EP 00947874 A EP00947874 A EP 00947874A EP 1208133 A1 EP1208133 A1 EP 1208133A1
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EP
European Patent Office
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dna
peptide
copolymer
complexes
pei
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Withdrawn
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EP00947874A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Christian Plank
Dirk Finsinger
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Original Assignee
Individual
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
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    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33396—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen having oxygen in addition to nitrogen

Definitions

  • the invention relates to the field of gene transfer, in particular to non-viral vectors.
  • Organism to the target cell (the extracellular aspect) and 2) transfer of the agent to be transferred from the cell surface into the cytoplasm or the cell nucleus (the cellular aspect).
  • An essential prerequisite for receptor-mediated gene transfer is
  • DNA complexes With a suitable composition of the DNA complexes, specific uptake and efficient gene transfer in cells can be achieved by receptor-ligand interaction (Kircheis et al., 1997, Zanta et al., 1997). Complexes of DNA with cationic peptides are also particularly suitable for receptor-mediated gene transfer (Gottschalk et al., 1996; Wadhwa et al., 1997; Plank et al., 1999).
  • biodegradable synthetic polymers are used to package pharmaceuticals in a form that ensures increased residence time in the organism and leads to the desired bioavailability in the target organ ("controlled release").
  • the surface modification of colloidal particles with polyethylene glycol is designed in such a way that the undesired opsonization is suppressed.
  • biodegradable polymers for use in a large number of medical applications (Coombes et al., 1997).
  • the chemical bonds in the polymer backbone are varied. By suitable positioning of ester, amide, peptide or urethane bonds, the desired lability can be achieved in a physiological environment, the
  • Sensitivity to the attack of enzymes is specifically varied. Combinatorial synthesis principles have proven effective for the fast and efficient synthesis of biologically active substances (Balkenhohl et al., 1996). By systematically varying a few parameters, a large number of connections are obtained which have the desired basic structure (Brocchini et al., 1997). With a suitable, meaningful biological selection system, those who show the desired properties can be selected from this pool of compounds.
  • branched cationic peptides are suitable for efficient binding to DNA and for the formation of particulate DNA complexes (Plank et al., 1999). c) Polycation-DNA complexes go strong
  • the object of the present invention was to provide a new, improved non-viral gene transfer system based on nucleic acid-polycation complexes.
  • the starting point was the idea of enveloping the nucleic acid or nucleic acid complexes with a charged polymer which physically stabilizes the complexes and protects them from opsonization.
  • the present invention relates to a charged copolymer of the general formula I
  • R is an amphiphilic polymer or a homo- or heterobifunctional derivative thereof
  • X i) is an amino acid or an amino acid derivative, a peptide or a peptide derivative or a spermine or spermidine derivative;
  • Ci-Cß-alkyl is, where a is H or, optionally halogen- or dialkylamino-substituted, Ci-Cß-alkyl;
  • b, c and d are the same or different, optionally halogen- or dialkylamino-substituted Ci-C ⁇ -alkylene; or
  • a is H or, optionally halogen- or dialkylamino-substituted, Ci-C ⁇ -alkyl, and wherein b and c mean the same or different, optionally halogen- or dialkylamino-substituted Ci-C ⁇ -alkylene; or
  • W 1 Y 1 Z 1 is a substituted aromatic compound with three functional groups W 1 Y 1 Z 1 , where W, Y and Z have the meanings given below;
  • W, Y or Z are identical or different radicals CO, NH, 0 or S or a linker group capable of reacting with SH, OH, NH or NH 2 ;
  • n and n are independently 0, 1 or 2;
  • 1 is 1 to 5, preferably 1.
  • the unit XZ m -E n may be the same or different.
  • aromatic means a monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon radical having 6 to 10 ring atoms which, in addition to the substituents mentioned at the outset, optionally independently with one or more further substituents, preferably with one, two or three substituents selected from the group Ci-C ⁇ - Alkyl, -0- (-C 6 alkyl), halogen - preferably fluorine, chlorine or bromine - cyano, nitro, amino, mono- (Ci-C ⁇ -alkyl) amino, di- (Ci-C ⁇ -alkyl) amino may be substituted.
  • the phenyl radical is preferred.
  • Aromatics in the sense of the present invention can also be used for a heteroraryl radical, i.e. : are a monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon radical having 5 to 10 ring atoms, which contains one, two or three ring atoms selected from the group N, 0 or S independently of one another, the remaining ring atoms being C.
  • alkylamino or dialkylamino stands for an amino group which is substituted by one or two C 1 -C 6 -alkyl radicals, where - in the case of two alkyl radicals - the two alkyl groups can also form a ring.
  • C ⁇ _-Cg-alkyl generally represents a branched or unbranched hydrocarbon radical having 1 to 6 carbon atoms, which may optionally be substituted by one or more halogen atoms, preferably fluorine, which are identical to one another J or can be different.
  • halogen atoms preferably fluorine
  • lower alkyl radicals having 1 to 4 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl,
  • alkylene means a branched or unbranched double-bonded hydrocarbon bridge with 1 to 6 carbon atoms, which may optionally be substituted by one or more halogen atoms, preferably fluorine, which may be identical or different from one another.
  • amphiphilic polymer R is preferably a polyalkylene oxide, polyvinyl pyrollidone, polyacrylamide, iO
  • polyalkylene oxides examples include polyethylene glycols (PEG), polypropylene glycols, polyisopropylene glycols, polylbutylene glycols.
  • polyalkylene oxides in particular PEG.
  • the polyalkylene oxide can be present in the copolymer as such, or as a thio, carboxy or amino derivative.
  • the polymer R preferably has a molecular weight of 500-10,000, preferably 1000-10,000.
  • X is an amino acid
  • an amino acid with three functional groups can be used for the synthesis of the copolymer, two of these groups being capable of copolymerization with the polymer and one being able to couple the effector molecule E; in this case Z can be omitted.
  • the natural amino acids glutamic acid, aspartic acid, lysine, ornithine and tyrosine are preferred.
  • synthetic amino acids can be used instead of natural amino acids (e.g. corresponding spermine and spermidine derivatives).
  • linker groups are pyridylthiomercaptoalkylcarboxylates (see FIG. 1) or maleimidoalkane carboxylates.
  • X can also be a peptide (derivative).
  • E is coupled to it directly or via Z.
  • X is a positively or negatively charged peptide or peptide derivative or a spermine or spermidine derivative
  • the peptide in this case consists of a linear sequence of two or more identical or different natural or synthetic amino acids, the amino acids being chosen so that the peptide as a whole is either positively or negatively charged.
  • Suitable anionic peptide derivatives X have the general formula (peptide) n -B-spacer- (Xaa).
  • the peptide is a sequence of amino acids or amino acid derivatives with an overall negative charge.
  • the peptide preferably consists of three to 30 amino acids, preferably it consists exclusively » ⁇ from glutamic acid and / or aspartic acid residues.
  • n represents the number of branches depending on the functional groups contained in B.
  • B is a branching molecule, preferably lysine or a molecule of type X in the case of ii) to iv).
  • the spacer is a peptide consisting of 2 to 10 amino acids or an organic aminocarboxylic acid with 3 to 9 carbon atoms in the carboxylic acid skeleton, for example 6-aminohexanoic acid.
  • the spacer serves to spatially separate the charged effector molecule from the
  • Xaa is preferably a trifunctional amino acid, in particular glutamic acid or aspartic acid and can generally be a compound of type X, case i) - iv).
  • X may be a peptide derivative, the modification of the peptide being a charged moiety other than an amino acid; Examples of such groups are sulfonic acid groups or charged ones
  • Carbohydrate residues such as neuraminic acids, or sulfated glycosaminoglycans.
  • the modification of the peptide can be carried out according to standard methods, either directly in the course of the peptide synthesis or subsequently on the finished peptide.
  • the effector molecule E can be a polycationic or polyanionic peptide or peptide derivative or a spermine or spermidine derivative.
  • the peptide also represents a linear sequence of two or more identical or different natural or are synthetic amino acids, the amino acids being chosen so that the peptide as a whole is either positively or negatively charged.
  • the peptide can be branched. Examples of suitable branched cationic peptides have been described by Plank et al., 1999.
  • Suitable anionic molecules E have the general formula (peptide) n -B-spacer- (Xbb), where Xbb is preferably an amino acid with a reactive group which can be coupled to X directly or via Z.
  • the coupling of the effector peptide E to Z or directly to X takes place via a reactive group which is present in the peptide from the outset or is subsequently introduced, e.g. a thiol group (in a cysteine or through
  • the coupling can also take place via amino or carboxylic acid groups which are already present or have been introduced subsequently.
  • E can be a peptide derivative, the modification of the peptide consisting of a charged group other than an amino acid.
  • groups are sulfonic acid groups or charged ones
  • Carbohydrate residues such as neuraminic acids, or sulfated carbohydrate residues.
  • the coupling to X takes place directly or via Z.
  • the copolymer is modified with a cellular ligand for the target cell (receptor ligand L). In this case, the majority are
  • Linker positions Z are occupied by E; in between, a cellular ligand is coupled to individual positions of linker Z instead of cationic or anionic effector E. Alternatively, the ligand is coupled to individual positions of the effector molecule E.
  • the ratio E: L is preferably approximately 10: 1 to 4: 1.
  • the receptor ligand can be of biological origin (e.g. transferrin, antibodies, carbohydrate residues) or synthetic (e.g. RGD peptides, synthetic peptides, derivatives of synthetic
  • copolymers according to the invention can be prepared according to the following process scheme:
  • the copolymerization partner X or XZ m -E n is, if it is a peptide or peptide analog, after Standard methods, for example on the solid phase (solid phase peptide synthesis, SPPS) synthesized according to the Fmoc protocol (Fields et al., 1990).
  • the amino acid derivatives are activated with TBTU / HOBt or with HBTU / HOBt (Fields et al., 1991).
  • the following derivatives are used in their N-terminal Fmoc-protected form for the ionic amino acid positions:
  • Fmoc-K (Fmoc) -OH are used.
  • the peptides are cleaved from the resin using TFA / DCM.
  • the polymerization partner X is a peptide of the general structure (peptide) n -B-spacer- (Xaa) in the subsequent copolymerization, glutamic acid or aspartic acid is used at position Xaa, which is provided with a benzyl protective group at a carboxyl position. This is selectively removed by hydrogenolysis (Felix et al., 1978). The N-terminal amino acid positions of the peptide chain are occupied by Boc-protected amino acids in order to be able to carry out the deprotection after copolymerization of the peptide with PEG in one step. If the polymerization partner X is an amino acid derivative that contains a linker grouping (e.g.
  • Peptide chemistry can be obtained.
  • Mercaptopropionic acid is reacted with 2, 2 '-dithiodipyridine and purified by chromatography.
  • the reaction product is reacted with carboxyl-protected glutamic acid (O-t.butyl) with HOBt / EDC activation (see FIG. 1).
  • 6-Fn ⁇ oc-aminohexanoic acid is reacted analogously.
  • Carboxyl protecting groups are removed in TFA / DCM, the resulting glutamic acid derivative is purified using chromatographic methods.
  • Copolymers illustrates:
  • poly (PEG-0- OC-) matrix (“polyester”): the copolymerization of the ionic, partially side-chain-protected peptide dicarboxylic acids or
  • the p (PEG-peptide) copolymers are made according to established methods, e.g. with dicyclohexylcarbodiimide / DMAP, preferably in a strictly alternating sequence (Zalipsky et al., 1984;
  • the PEG macromonomer is put together 7 mixed with a side-chain protected peptide or glutamine or aspartic acid derivative in dichloromethane solution with DCC / DMAP. After the urea derivative formed has been separated off, the polymer can be obtained by precipitation with cold ether. The remaining side chain protecting groups can be split off with TFA in dichloromethane (the PEG ester bond is also stable under these conditions (Zalipsky et al., 1984)). The ionic polymer is obtained by precipitation and a final chromatography step. The conduct of the reaction enables the degree of polymerization and the amount of charge per PEG unit in the polymer to be checked.
  • polyamide poly (PEG -HN- 0C-) matrix
  • polyamide poly (PEG -HN- 0C-) matrix
  • Polymer matrix can be built up if, when using a copolymer-DNA complex in a gene therapy application, hydrolyzability that is too fast and therefore too high instability in systemic application is to be expected.
  • diamino-PEG derivatives are used instead of those of the PEG macromonomers which are copolymerized with the ionic peptides or glutamine or aspartic acid derivatives in analogy to the synthesis described above. In this synthesis, a hydrolysis-stable A skeleton is obtained.
  • Diamino-modified polyethylene glycols are commercially available as raw materials in defined molar mass ranges between 500 and 20,000 (eg Fluka).
  • the remaining acid-labile side chain protective groups of the peptide components are cleaved off, for example with TFA / DCM, and the polymers are purified by means of chromatographic methods.
  • Copolymers of glutamine or aspartic acid derivatives are reacted in a further step with anionic or cationic peptides which contain a suitable reactive group.
  • copolymers of 3- (2'-thio-pyridyl) mercaptopropionyl-glutamic acid are reacted with peptides which contain a free cysteine thiol group.
  • the Fmoc protective group is removed from copolymers which have arisen from 6-Fmoc-aminohexanoyl-glutamic acid under basic conditions.
  • the product is reacted with a carboxy-activated, protected peptide.
  • the peptide protective groups (t-Boc or Ot.butyl) are removed in DCM / TFA, the end product is purified by chromatography.
  • the amino group of Ahx (6-aminohexanoic acid) can be derivatized with bifunctional linkers and then reacted with a peptide.
  • the ligand L can be coupled directly by activating carboxyl groups on the effector E (preferably in the case of anionic copolymers) or on the ligand or by interposing bifunctional linkers such as succinimidylpyridyldithioproprionate (SPDP; Pierce or Sigma) and similar compounds.
  • SPDP succinimidylpyridyldithioproprionate
  • the purification of the reaction product can be carried out by gel filtration and ion exchange chromatography.
  • Type is the most selectable variable 13 and the molecular weight (degree of polymerization) of the polymer R, the identity of the polymerization partner XZ m -E n or the effector molecule E (for example a series of anionic peptides with an increasing number of glutamic acids) and the total degree of polymerization p.
  • a multi-parameter system is created which enables the rapid parallel construction of a homologous series of different copolymers and subsequently, after complexation with the nucleic acid, different non-viral vectors.
  • the synthesis concept is implemented on a cell culture plate scale (eg 96 wells per plate). For this purpose, the chemical synthesis is adapted to the required micro scale (reaction volumes in the range of 500 ⁇ l).
  • the copolymers are, for example, mixed with DNA complexes and then subjected to tests which permit an assessment of the polymer properties with regard to the intended application (for example gene transfer).
  • the same selection procedures can be used for copolymer-coated nanoparticles.
  • Screening and selection methods can serve, for example, complement activation tests in 96-well plate format (Plank et al., 1996), turbidometric measurements of the aggregation induced by serum albumin or salt in the same format or in vitro
  • Such examinations give e.g. Information about which copolymers from a combinatorial synthetic approach are suitable for modifying the surface of DNA complexes so that their solubility is sufficient for gene transfer applications in vivo, their interaction with blood and
  • Tissue components is restricted so that their residence time and duration of action in the blood circulation is increased sufficiently to enable receptor-mediated gene transfer in target cells.
  • copolymers according to the invention are preferably used for the transport of nucleic acids into higher eukaryotic cells.
  • the present invention thus relates to complexes containing one or more nucleic acid molecules and one or more charged copolymers of the general formula I.
  • the nucleic acid molecule is preferably condensed with an organic polycation or a cationic lipid.
  • the invention thus relates to complexes of nucleic acid and an organic polycation or a cationic lipid, which are characterized in that they have bound on their surface a charged copolymer of the general formula I via ionic interaction.
  • the nucleic acids to be transported into the cell can be DNAs or RNAs, with no restrictions on the nucleotide sequence and size.
  • the nucleic acid contained in the complexes according to the invention is primarily defined by the biological effect to be achieved in the cell, for example in the case of use in the context of gene therapy by the gene to be expressed or the gene segment, or by the intended substitution or repair of a gene defective gene or any target sequence (Yoon et al., 1996; Kren et al. 1998), or by the target sequence of a gene to be inhibited (eg in the case of the use of antisense oligoribonucleotides or ribozymes).
  • the nucleic acid to be transported into the cell is preferably plasmid DNA which contains a sequence coding for a therapeutically active protein.
  • the sequence codes, for example, for one or more cytokines, such as interleukin-2, IFN- ⁇ , IFn- ⁇ , TNF- ⁇ , or for a suicide gene that is used in combination with the substrate.
  • the complexes contain DNA coding for one or more Tumor antigens or fragments thereof, optionally in combination with DNA, coding for one or more cytokines.
  • therapeutically active nucleic acids are given in WO 93/07283.
  • the copolymer according to the invention has the property of sterically stabilizing the nucleic acid-polycation complex and reducing or suppressing its undesired interaction with components of body fluids (e.g. with serum proteins).
  • Suitable organic polycations for complexing nucleic acid for transport into eukaryotic cells are known; due to its interaction with the negatively charged nucleic acid, it is compacted and brought into a form suitable for absorption into the cells.
  • polycations that have been used for the receptor-mediated gene transfer such as homologous linear cationic polyamino acids (such as polylysine, polyarginine, polyornithine) or heterologous linear mixed cationic-neutral polyamino acids (consisting of two or more cationic and neutral amino acids), branched and linear cationic peptides (Plank et al., 1999; Wadhwa et al.
  • non-peptide polycations such as linear or branched polyethyleneimines, polypropyleneimines), dendrimers (spheroidal polycations with a well-defined diameter and a exact number of terminal amino groups can be synthesized; (Haensler and Szoka, 1993; Tang et al., 1996; WO 95/02397), cationic carbohydrates, e.g. chitosan (Erbacher et al. 1998).
  • the polycations can also be modified with lipids (Zhou et al. 1994; WO 97/25070).
  • cationic lipids (Lee et al. 1997), some of which are commercially available (e.g. lipofectamine, transfectam).
  • polycation is used below to represent both polycations and cationic lipids.
  • Polycations preferred in the context of the present invention are polyethyleneimines, polylysine and dendrimers, e.g. Polyamidoamine dendrimers ("PAMAM" dendrimers).
  • PAMAM Polyamidoamine dendrimers
  • the size or charge of the polycations can vary over a wide range; it is chosen so that the complex formed with nucleic acid does not dissociate at physiological salt concentration, which can be determined in a simple manner by the ethidium bromide displacement assay (Plank et al, 1999).
  • a defined amount of nucleic acid is incubated with increasing amounts of the selected polycation, the complex formed is applied to the cells to be transfected and the gene expression (generally using a reporter gene construct, e.g. luciferase) is measured using standard methods.
  • the nucleic acid complexes are built up via electrostatic interactions.
  • the DNA can be in excess in relation to the polycation, so that such complexes have a negative surface charge exhibit; conversely, when the polycation condensing the nucleic acid is in excess, the complexes have a positive surface charge.
  • the polycation is preferably present in excess in the context of the present invention.
  • the ratio of polycation: nucleic acid in the case of a positive charge excess is preferably set so that the zeta potential is approximately +20 to +50 mV, in the case of the use of certain polycations, e.g. Polylysine, it can be above that too.
  • the zeta potential is approximately -50 to -20mV.
  • the zeta potential is measured using established standard methods, e.g. by Erbacher et al. 1998.
  • the polycation is optionally conjugated to a cellular ligand or antibody; suitable ligands are described in WO 93/07283.
  • suitable ligands are described in WO 93/07283.
  • Tumor therapy prefers ligands or antibodies for tumor cell-associated receptors (e.g. CD87; uPA-R) that are able to increase the gene transfer in tumor cells.
  • tumor cell-associated receptors e.g. CD87; uPA-R
  • the nucleic acid In the preparation of the complexes, the nucleic acid, generally plasmid DNA, is incubated with the polycation (possibly derivatized with a receptor ligand), which is present in excess charge. Particles are formed, which are absorbed by receptor-mediated endocytosis Cells can be included.
  • the complexes are then incubated with a negatively charged copolymer according to the invention, preferably polyethylene glycol copolymer.
  • the effector E in the copolymer is preferably a polyanionic peptide.
  • the copolymer is first mixed with nucleic acid and then incubated with polycation, or, as a third variant, first mixed with polycation and then incubated with nucleic acid.
  • the nucleic acid is incubated with a polycation present in electrostatic deficit and then a cationic copolymer is added.
  • the order of the mixing steps can also be varied here, as described above for anionic copolymers.
  • the relative proportions of the individual components are chosen so that the resulting DNA complex has a weakly positive, neutral or weakly negative zeta potential (+10 mV to -10 mV).
  • positively charged copolymers they can be used as the sole nucleic acid binding and condensing polycationic molecules; the proportion of a polycation or cationic lipid can thus be omitted.
  • the relative proportions of the individual components are chosen so that the resulting DNA complex has a weakly positive, neutral or weakly negative zeta potential (+10 mV to -10 mV).
  • polycation and / or copolymer may have been modified with the same or different cellular ligands.
  • nucleic acid complexes according to the invention which are stabilized in size by the electrostatically bound copolymer of the general formula I and are thus protected against aggregation, have the advantage that they can be stored in solution for longer periods (weeks). In addition, they have the advantage that, due to the protective effect of the bound copolymer, there is less or no interaction with components of body fluids (e.g. with serum proteins).
  • the invention relates to a pharmaceutical composition containing a therapeutically active nucleic acid, the copolymer according to the invention and optionally an organic polycation or cationic lipid.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is preferably in the form of a lyophilisate, optionally with the addition of sugar, such as sucrose or dextrose, in an amount which gives a physiological concentration in the ready-to-use solution.
  • the composition can also be in the form of a cryoconcentrate.
  • composition according to the invention can also be frozen (cryopreserved) or as a chilled solution.
  • the positively or negatively charged copolymers according to the invention serve to colloidal particles ("nanoparticles"), as they are for Application of classic drugs are developed to stabilize sterically and to reduce or suppress their undesirable interaction with components of body fluids (eg with serum proteins).
  • the copolymers according to the invention modified with receptor ligands can be used to provide such nanoparticles with receptor ligands on their surface in order to transfer drugs with increased specificity to target cells (“drug targeting”).
  • Fig. 1 Preparation of the copolymer frameworks from 3- (2'-thio-pyridyl) mercaptopropionyl-glutamic acid and 0, 0 'bis (2-aminoethyl) poly (ethylene glycol) 6000 or 0.0'-bis (2-aminoethyl ) poly (ethylene glycol) 3400
  • Fig. 2 Coupling of charged peptides to the copolymer backbone
  • Fig. 5 Erythrocyte lysis test
  • Fig. 9 Gene transfer in K562 cells with PEI (25 kD) DNA complexes in the presence and absence of the copolymer P3YE5C
  • Fig. 10 Transfection of the breast cancer cell line MDA-MB435S with polylysine-DNA complexes in the presence and absence of the envelope polymer P3INF7
  • Fig. 11 Lipofection in NIH3T3 cells in the presence and absence of the copolymer P3YE5C
  • Fig. 12 Transfection of HepG2 cells with
  • Fig. 13 Transfection of HepG2 cells with PEI-DNA complexes in the presence of different amounts of copolymer at different charge ratios
  • Fig. 14 Dependence of the transfection efficiency on the amount of copolymer, on the complex cleaning and on the presence of salt
  • Fig. 15 Intravenous gene transfer in vivo using DNA / polycation complexes with a copolymer shell ⁇ 5
  • Fig. 16 Gene transfer with copolymer-protected PEI-DNA
  • Fig. 17 Gene transfer with copolymer-protected PEI-DNA vectors in vivo - PYE5C-PEI-DNA in
  • Fig. 18 P6YE5C enhances the transport of DNA-PEI complexes into the tumor (tumor targeting)
  • Fig. 19 Interaction of PEI-DNA complexes and human serum components
  • X 3-mercaptopropionyl-glutamic acid, that is, an amino acid derivative according to case i), which was obtained by coupling the linker group 3- (2 '-Thiopyridyl) - mercaptopropionic acid to glutamic acid;
  • Ice cooling was carried out in succession in a 50 ml polypropylene tube (from Peske) one mmol of di-t-butyl ester of glutamic acid (Glu (OtBu) OtBu, Bachern), 1-hydroxybenzotriazole (Aldrich), N-ethyl-N'- ( dimethylaminopropyl) carbodiimide (Aldrich) and
  • Product 2b was dissolved in 3 ml of dimethylformamide (Fluka) and made up to 20 ml with dichloromethane. 5 ml of this solution (67.5 ⁇ mol) were sequentially treated with 506 mg diamino-PEG-6000 (84 ⁇ mol, corresponds to 1.25 equivalents; Fluka), 30 mg dicyclohexylcarbodiimide (135 ⁇ mol, 2 equivalents, 135 ⁇ l of a 1 M solution in DMF) and 2 mg
  • Product 4 was obtained using the same batch and purification as product 3.
  • the main fraction (54% of the product fractions) after gel filtration was a product which eluted with an apparent molecular weight of 22,800 Da (secondary fractions are a product with 64 kD, 14% of the Total, and a product with 46 kD, 32% of the total).
  • the peptides were prepared according to the FastMoc TM protocol on an Applied Biosystems 431A peptide synthesizer.
  • Peptide YE5C (sequence [Ac-YEEEEE] 2 -ahx-C) was used using 330 mg of cysteine-loaded chlortrityl resin (0.5 mmol / g; Bachern) with the protecting groups trityl- (Cys), di-Fmoc (Lys) and Ot - Butyl (Glu) manufactured. 1 mmol each of the protected amino acids was used. Double couplings were carried out continuously after the branch point (Lys).
  • the acetylation of the N-termini was carried out on the peptide-resin with 2 mmol acetic anhydride in 2 ml N-methylpyrrolidone in the presence of 2 mmol diisopropylethylamine.
  • the peptide was obtained as a crude product after cleavage from the resin (500 ul water, 500 ul thioanisole, 250 ul ethanedithiol in 10 ml trifluoroacetic acid) and precipitation with diethyl ether.
  • the crude product was dissolved in 100 mM HEPES pH 7.9 and purified by means of perfusion chromatography (Porös 20 HQ, Boehringer Mannheim, filled in a 4 x 100 mm PEEK column. 0-0.5 M NaCl in 8 min, flow rate 10 ml / min).
  • the extinction coefficient of the peptide in 50 mM sodium phosphate buffer in 6 M guanidinium hydrochloride at 280 nm is 2560 M "1 cm " 1 (Gill and von Hippel 1989).
  • Peptide INF7 (sequence GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC) was synthesized according to the same procedure on 500 mg chlortrityl resin (0.5 mmol / g) as described for YE5C and cleaved from the resin and with Diethyl ether like. The crude product was dried in vacuo. Aliquots of 20 mg each were dissolved in 500 ⁇ l of 1 M triethylammonium hydrogen carbonate buffer pH 8 and purified by gel filtration (Sephadex G-10 from Pharmacia filled into an HR 10/30 column from Pharmacia. Flow rate 1 ml / min.
  • Peptide SF029-ahx (sequence K 2 K-ahx-C) was synthesized in an analogous manner (500 mg Fmoc-Cys (Trt) - chlorotrityl resin from Bachern; 0.5 mmol / g) and purified by standard methods (Sephadex G10 with 0.1% TFA as eluent; reverse phase HPLC, 0.1% TFA - acetonitrile gradient).
  • the lysine at the branch point was alpha, epsilon-di-Fmoc-L-lysine, the following lysines were alpha-Fmoc-epsilon-Boc-L-lysine.
  • Peptide E4E (sequence [EEEE] 2 KGGE) was synthesized analogously. Batch size 0.25 mmol Fmoc-Glu (OBzl) - chlorotrityl resin. The resin was coated by suspending appropriate amounts
  • O-chlorotrityl chloride resin Alexis
  • FmocGlu OBzl
  • diisopropylethylamine After shaking for several hours, the mixture was filtered and washed several times with dimethylformamide, methanol, isopropanol, dichloromethane and diethyl ether.
  • a modified Fmoc protocol is used.
  • the N-terminal amino acid carries a Boc protective group in order to turn the solid phase synthesis into a fully protected base stable Peptide derivative of the sequence (E (Boc) [E (tBu)] 3 ) ⁇ KGGE (OBzl) OH (E4E PR0T ).
  • Glutamic acid was split off selectively with H 2 / palladium on activated carbon according to the standard procedure.
  • the peptide masses were determined by means of electrospray mass spectroscopy and the identity of the peptides was thus confirmed.
  • the available thiopyridyl binding sites are determined by adding a dilute solution of the polymer with 2-mercaptoethanol and then measuring the absorbance of the released 2-thiopyridone at a wavelength of 342 nm, the concentration of the free thiol functions of the cysteine-containing peptide
  • Ellman reagent determined at a wavelength of 412 nm according to Lambert-Beer. After the reaction, the completeness of which was determined by the absorption of the released thiopyridone at 342 nm, the mixture was concentrated and the product was fractionated by gel filtration (Superdex 75 material, Pharmacia).
  • Copolymer P6YE5C was prepared from fraction 3 (40,200 Da) of the product (3) and purified peptide. A product with an apparent molecular weight of 55,800 Da was obtained. The degree of polymerization is approx. 7.
  • the endosomolytic peptide INF7 was used, which is linked to the 3-mercapto-propionyl-glutamic acid group via a disulfide bridge of the cysteine thiol.
  • a) Copolymer P3INF7 was prepared from fraction 3 (22,800 Da) of product (4) and purified influenza peptide.
  • Copolymer P6INF7 was prepared from fraction 3 (40,200 Da) of product (3) and purified influenza peptide INF7.
  • lactosylated peptide SF029-ahx 9 parts of the branched peptide YE5C, which are linked to the 3-mercaptopropionyl-glutamic acid group via a disulfide bridge of the cysteine thiol, were used.
  • the reaction scheme for coupling the charged peptides to the copolymer structure according to 1.3 is shown in FIG. 2: peptides with free thiol groups are coupled to product 3 or 4, for example the peptide INF7 (left) or the peptide YE5C.
  • product 3 or 4 for example the peptide INF7 (left) or the peptide YE5C.
  • X is an amino acid derivative which was obtained by coupling Fmoc-6-aminohexanoic acid to glutamic acid.
  • Z can be omitted or a bifunctional linker such as SPDP or EMCS.
  • An effector E suitable for coupling to this polymer structure can be a peptide of the type E4E PR0T (Z omitted) or of the type YE5C, which reacts with the linker molecule Z (for example SPDP or EMCS) via the cysteine thiol.
  • Di-t-butyl-protected derivative (5) was dissolved in 30 ml dichloromethane / trifluoroacetic acid 2: 1 and stirred for one hour at room temperature. After the reaction was complete (reaction control with reversed phase HPLC), the solvent was reduced to about 5% of the initial volume and the product (6) was obtained by precipitation from diethyl ether. Final cleaning was carried out by RP-HPLC with an acetonitrile / water / 0.1% TFA gradient.
  • the copolymer can be conjugated to any peptide with a free C-terminus using standard peptide coupling chemistry.
  • trifluoroacetic acid with addition of up to 5% scavenger (preferably ethanedithiol, triethylsilane, thioanisole) was added, as described in the literature, and the mixture was stirred at room temperature for two hours.
  • scavenger preferably ethanedithiol, triethylsilane, thioanisole
  • the crude product was isolated by precipitation from diethyl ether.
  • the final purification was carried out as described above using gel filtration (Superdex75, Pharmacia).
  • Fig. 3 shows the reaction scheme:
  • Benzyl protective group on carboxylate 1 of the C-terminal glutamic acid of the fully protected peptide E4E PR0T is selectively cleaved with H 2 / palladium on activated carbon.
  • the product is activated with DCC with 0.0 'bis (2-aminoethyl) poly (ethylene glycol) 6000 or with 0.0'-
  • Polylysine (average chain length 170; Sigma) - DNA was prepared as a stock solution by adding 64 ⁇ g pCMVLuc (corresponding to pCMVL, described in WO 93/07283) in 800 ⁇ l HBS to 256 ⁇ g pL in 800 ⁇ l HBS and mixing by pipetting were, this corresponds to a calculated charge ratio of 6.3. From this suspension (hereinafter the DNA-polycation complexes are also referred to as “polyplexes”), 50 ⁇ l each in column 1 A-F were used as positive controls
  • PEI (25 kD, Aldrich) - DNA complexes were combined by combining equal volumes of a DNA solution (80 ⁇ g / ml in 20 mM HEPES pH 7.4) and a PEI solution (83.4 ⁇ g / ml in 20 mM HEPES pH 7.4 ) manufactured.
  • a DNA solution 80 ⁇ g / ml in 20 mM HEPES pH 7.4
  • a PEI solution 83.4 ⁇ g / ml in 20 mM HEPES pH 7.4
  • DNA complexes were centrifuged three times for 15 min at 350 xg in Centricon-100 filter tubes (Millipore) to remove excess, unbound PEI, filling to the original volume in each case with 20 mM HEPES pH 7.4 between centrifugations. After the last centrifugation step, a stock solution of DNA complex was obtained which corresponded to a DNA concentration of 300 ⁇ g / ml. 182 ⁇ l of this solution were diluted to 2520 ⁇ l with 20 mM HEPES pH 7.4. Each 610 ⁇ l of this solution (corresponding to 13.2 ⁇ g DNA) was pipetted into solutions of P6YE5C in 277.6 ⁇ l 20 mM HEPES pH 7.4 each.
  • the resulting solutions were brought to a salt concentration of 150 mM with 5 M NaCl.
  • 150 ⁇ l each of the resulting solutions were transferred in column 1, A to F, of a 96-well plate.
  • the dilution series in GVB 2+ buffer was carried out as described (Plank et al. 1996).
  • CH50 max denotes the CH50 value that is obtained with untreated human serum.
  • human serum was incubated with gene vectors.
  • CH50 values obtained with serum treated in this way are lower than CH50 max when the vectors activate the complement cascade.
  • the data are shown in percent of CHSO max .
  • Polylysine-DNA complexes have been observed, can be completely prevented by coating polymer P6INF7.
  • copolymer P6YE5C completely protects against complement activation even in small amounts added.
  • the test is used to examine the ability of peptides to lyse natural membranes depending on the pH.
  • the erythrocytes used in this example were obtained as follows: 10 ml of fresh blood was obtained from
  • the concentration of the erythrocytes was determined with an "extinction coefficient" of 2,394 x 10 8 ml / cells determined at 541 nm. To derive the extinction coefficient, the cell number was determined in an aliquot with a Neubauer chamber and the extinction of this solution was then determined after adding 1 ⁇ l of 1% Triton X-100 at 541 nm.
  • DOTAP / cholesterol-DNA complexes were prepared from DOTAP / cholesterol (1: 1 mol / mol) liposomes in 330 ⁇ l 20 mM HEPES pH 7.4 and DNA in the same volume at a charge ratio of 5.
  • the lipoplexes were with 0, 1, 2, 3 and 5 equivalents of the copolymer P3YE5C incubated in 330 ul buffer.
  • the final DNA concentration of the complex was 10 ⁇ g / ml.
  • the size of the DNA complexes was determined on the one hand by dynamic light scattering (Zetamaster 3000, Malvern Instruments) immediately after addition of polymer and then at different times over several hours, on the other hand by electron microscopy as in Erbacher et al., 1998, and Erbacher et al., 1999.
  • the particle size is 20 to 30 nm.
  • Copolymer-protected DNA complexes remain stable and do not aggregate, in contrast to unprotected PEI-DNA complexes, which precipitate immediately under these conditions (not shown).
  • the zeta potentials were determined on the same samples as in Example 6 using the Malvern instrument, the parameters refractive index, viscosity and dielectric constant being set to the values of deionized water, which can only be approximate.
  • FIG. 7A shows the zeta potential of PEI and DOTAP / cholesterol-DNA complexes as a function of the amount of copolymer P3YE5C added.
  • the zeta potential as a measure of the surface charge of the complexes decreases from strongly positive to neutral to slightly negative with increasing amount of added copolymer. This shows that the copolymer binds to the DNA complexes and balances or shields their electrostatic charge.
  • Figure 7B shows the zeta potential of purified PEI-DNA complexes.
  • Excess PEI was removed as described in Example 4B. Aliquots corresponding to a DNA amount of 40 ⁇ g each were taken from the PEI-DNA stock solution, which resulted from the purification, and made up to 666 ⁇ l each with 20 mM HEPES pH 7.4.
  • the resulting PEI-DNA suspensions were combined with solutions of P3YE5C in 333 ⁇ l 20 mM HEPES pH 7.4 and mixed by pipetting.
  • the solutions of P3YE5C contained polymer amounts corresponding to 1, 2, 3 and 5 charge equivalents relative to the amount of DNA used.
  • the zeta potentials were determined as described in Example 7A.
  • Adherent cells become 20,000 - 30,000 cells per day in flat-bottom plates the day before the transfection
  • the confluence should be about 70-80%).
  • Medium is aspirated before transfection. For transfection, 150 ⁇ l of medium are added to the cells and then 50 ⁇ l of DNA complexes are added.
  • composition of the DNA complexes preferably 1 ⁇ g DNA / well final concentration; Calculation for 1.2 times the amount; 20 ⁇ l volume per component (DNA, PEI, polymer). Finally 50 ⁇ l DNA complex are used for the transfection.
  • PEI Polyethyleneimine
  • Envelope polymer If you want e.g. for the specified amount of DNA and PEI shell polymer in an amount of
  • ⁇ l (envelope pol.) 1000 xÜ £ - ⁇ ⁇ x charge equ. ⁇ '330 c (envelope pol. [ ⁇ mol / ml])
  • DNA is vortexed to PEI. After 15 minutes, shell polymer is again added to the prefabricated PEI-DNA complex with vortexing. After a further 30 min, 50 ⁇ l DNA complexes are added to the cells, which are each in 150 ⁇ l medium.
  • the vessels used depend on the calculated total volume.
  • PEI is conveniently placed in a 14 ml polypropylene tube (e.g. Falcon 2059), the other two components in 6 ml tubes (e.g. Falcon 2063).
  • the components can also be mixed in a 96-well plate. If the final total volume of the DNA complexes is 1 - 1.5 ml, Eppendorf tubes are suitable. To mix, pipette up and down with the micropipette instead of vortexing.
  • Fig. 8 shows schematically the formulation of
  • the copolymer can be modified with receptor ligands, symbolized by asterisks (right).
  • the protein content of the lysates was determined using the Bio-Rad Protein Assay (Bio-Ra): 150 ⁇ l (or 155 ⁇ l) of dest were added to 10 ⁇ l (or 5 ⁇ l) of the lysate. Water and 40 ⁇ l of Bio-Rad protein assay dye concentrate are placed in a well of a transparent 96-well plate (type "flat botto", from Nunc, Denmark) and at 630 nm with the absorbance reader "Biolumin 690" and the computer program “Xperiment” (both from Molecular Dynamics, USA) measured the absorption.
  • Bio-Rad Protein Assay Bio-Ra
  • BSA Bovine serum albumin
  • K562 cells (ATCC CCL 243) were cultivated in RPMI-1640 medium with the addition of 10% FCS, 100 units / l penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 2 mM glutamine at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2 , Desferoxamine was added to the cells to a final concentration of 10 ⁇ M the evening before the transfection. The medium was changed immediately before the transfection. 50,000 cells each in 160 ⁇ l medium were placed in the wells of a 96-well plate.
  • Transferrin-PEI (hTf-PEI 25 kD) was essentially as described by Kircheis et al. described (Kircheis et al., 1997) prepared by reductive amination. A product was obtained which coupled an average of 1.7 transferrin molecules per PEI molecule.
  • DNA complexes without hTf were produced with the equivalent amount of PEI (40 ⁇ g DNA + 42 ⁇ g PEI + shell polymer). 60 ⁇ l of the resulting mixtures (corresponding to an amount of 1 ⁇ g DNA / well) were in each
  • Tris pH 7.8; 0.1% Triton X-100 was added. After 15 minutes of incubation, the mixture was mixed by pipetting and 10 .mu.l samples were transferred to the black plate (Costar) for the luciferase test in 96-well plate format and 100 .mu.l luciferin substrate buffer were added. The resultant light emission was measured by means of a microplate scintillation & luminescence counter "Top Count" (Canberra-Packard, Dreieich).
  • the copolymer does not interfere with gene transfer and even increases it when a receptor ligand is in the DNA complex is present.
  • the expression of the reporter gene luciferase is shown based on the amount of total protein in the cell extract (mean values and standard deviations from triplicates).
  • MDA-MB435S cells (ATCC 45526; human breast cancer cell line) were in DMEM medium with the addition of 10% FCS, 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 2 mM glutamine at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2 cultivated. The evening before the transfection, the cells became 20,000 cells each
  • the DNA complexes were prepared as follows:
  • DNA complexes were mixed as indicated in the following table, with DNA first being added to polylysine and then again after 15 min to polymer P3INF7 or to the buffer. The experiments were carried out in triplicate. 60 ⁇ l DNA complexes were added to cells covered by 150 ⁇ l medium. After 4 h the medium was changed, after 24 h after washing with PBS and adding 100 ⁇ l lysis buffer, the luciferase test and the protein test were carried out as described in Example 9. Q
  • 10A shows the result of the gene transfer experiments with polylysine-DNA complexes in the human breast cancer cell line MDA-MB435S in the presence and absence of the copolymer P3INF7. No measurable reporter gene expression occurs in the absence of the copolymer. The pH-dependent membrane-destroying and thus endosomolytic activity of the copolymer results in efficient gene transfer. 5 nmol and 10 nmol P3INF7 refer to the amount of the polymer-bound peptide INF7 used.
  • NIH3T3 cells (ATCC CRL 1658) were cultivated in DMEM medium with the addition of 10% FCS, 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 2 mM glutamine at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2 .
  • DNA complexes were added to the cells which were in 800 ul fresh medium; this corresponds to 2 ⁇ g DNA per well.
  • the experiments were carried out in triplicate.
  • HepG2 cells (ATCC HB 8065) were cultivated in DMEM medium with the addition of 10% FCS, 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 2 mM glutamine at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2 .
  • DOTAP / cholesterol was done exactly as described above for NIH3T3 cells, this time using polymer P6YE5C. Furthermore 7 ⁇ g DNA were dissolved in 105 ⁇ l HEPES buffer to 7.3 ⁇ g PEI 25 kD in the same L ⁇
  • Figure 12 shows gene transfer in HepG2 cells in the presence and absence of the copolymer P6YE5C (designated P6 in the figure). Transfection by DOTAP / cholesterol DNA is not significantly inhibited. The transfection by PEI-DNA complexes is reduced (3 charge equivalents of the copolymer).
  • Example 14 The complexes were prepared in 20 mM HEPES pH 7.4, as indicated in Example 14, using unpurified complexes and adjusted to a concentration of 5% glucose before addition to the cells.
  • Fig. 14 shows the dependence of
  • mice 75 ul 50% glucose added. 100 ⁇ l of this solution was injected into the tail vein of mice (corresponding to a dose of 20 ⁇ g DNA per animal).
  • DOTAP cholesterol liposomes were produced according to standard instructions (Barron et al., 1998). In this case, liposomes with a molar DOTAP to cholesterol ratio of 1: 1 and a final concentration of DOTAP of 5 mM in 5% glucose. 130 ⁇ g DNA in 91.1 ⁇ l 20 mM HEPES pH 7.4 were added to 393.5 ⁇ l liposome suspension. After 15 minutes, 65 ul 50% glucose was added. 100 ⁇ l of this solution was injected into the tail vein of mice (corresponding to a dose of 20 ⁇ g DNA per animal).
  • DOTAP / cholesterol DNA (5: 1) with a copolymer shell: 393.9 ⁇ l liposome suspension were pipetted directly into a solution of 130 ⁇ g DNA in 65.3 ⁇ l water. After 15 min, 3 charge equivalents of P3YE5C in 216.9 ⁇ l HEPES buffer were added and after a further 30 min 75 ⁇ l 5% glucose. 115.5 ⁇ l of this solution were injected into the tail vein of mice (corresponding to a dose of 20 ⁇ g DNA per animal). G
  • the size of the complexes was determined by means of dynamic light scattering and was 20 to 30 nm.
  • mice were injected into the mice (age 5 weeks) intradermally on day 0, as described (Kruger et al. 1994). On day 21, the animals were injected via the tail vein with 200 ⁇ l DNA complex, each containing 50 ⁇ g DNA (p55pCMV-IVS-luc +, supplied by Dr. Andrew Baker, Bayer Corp., USA).
  • DNA complexes DNA (250 ⁇ g in 700 ⁇ l 20 mM HEPES pH7.4) was mixed with PEI (260.6 ⁇ g in 700 ⁇ l of the same buffer) by pipetting. After 15 minutes of incubation, the DNA complexes were pipetted into 400 ⁇ l of the shell polymer solution which contained 5 charge equivalents P3YE5C. After a further 15 min incubation, 200 ul 50% glucose (in water) was added. The complexes were purified from excess PEI using ultrafiltration as described in Example 4b. The vector suspension was finally made up to a volume of 1 ml at 20 mM ln
  • HEPES replenished.
  • the test animals were injected with 200 ⁇ l each via the tail vein. After 24 hours, the animals were sacrificed and reporter gene expression in the organs was determined: the animals were given general anesthesia by means of an intraperitoneal injection of 100 mg of ketamine and 5 mg of xylazine per kg of body weight.
  • the abdominal cavity was then opened and perfused with 20 ml of isotonic sodium chloride solution via the vena cava caudalis.
  • the organs were transferred to 2 ml screw cap tubes containing 500 ⁇ l lysis buffer (0.1% Triton X-100 in 250 mM Tris-HCl pH 7.8) and zirconium beads (2.5 mm diameter; Biospec Products, Bartlesville, USA).
  • the tissue samples were homogenized 2 x 20 sec using a mini bead bead heater (Biospec Products). 50 ⁇ l each
  • Tissue homogenates were used in the luciferase test (Promega Luciferase Assay Kit); the result is shown in Fig. 16.
  • DNA complexes 350 ⁇ g DNA in 420 ⁇ l 20 mM HEPES pH 7.4 were mixed with 364 ⁇ g PEI in the same volume of the same buffer. After 5 min. Incubation was either 420 ul 20 mM HEPES or 3 charge equivalents P6YE5C in 420 ul 20 mM HEPES pH 7.4 and mixed. Ultimately, 140 ul
  • Tissue homogenate was used. The result is shown in Fig. 17.
  • P6YE5C enhances the transport of DNA-PEI complexes into the tumor (tumor targeting)
  • tumors were set by placing lxlO 6 murine melanoma M3 cells (ATCC No. CCL 53.1) in 100 ⁇ l Ringer's solution subcutaneously in DBA / 2 mice.
  • Amount of P6YE5C ( ⁇ l) [1000 * ( ⁇ g of DNA) * charge equivalent of P6YE5C] /330*19.3; where the charge equivalent is the one defined above (3) and 19.3 is the concentration in mM of the solution of P6YE5C used.
  • glucose was added prior to administration of the complexes to provide an isotonic solution for in vivo injection.
  • mice were treated 20 days after tumor placement - the tumors had an average size of 15mm x 15mm at this point in time. 250 ⁇ l polyplexes per mouse were injected strictly iv (into the lateral tail vein). There were two groups consisting of 3 mice treated, the first group receiving unprotected DNA-PEI complexes and the second group of complexes encased with P6YE5C.
  • the animals were euthanized and the organs (liver, spleen, kidneys, heart and lungs) and the respective tumor were removed.
  • the further treatment of the organs and the measurement of the luciferase activity were carried out as described in the previous examples; the result of the tests is shown in Fig. 18.
  • Sensor chip is shown by an increasing measurement signal (resonance units, RU, y-axis).
  • the time axis over the entire experiment (x-axis) was 1200 seconds.

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  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

Copolymere aus einem amphiphilen Polymer, vorzugsweise Polyethylenglykol, und einem geladenen Effektormolekül, insbesondere einem Peptid oder Peptidderivat. Nukleinsäurekomplexe, in denen Nukleinsäure mit einem Polykation kondensiert und die an der Oberfläche das geladene Copolymer gebunden enthalten, als nichtvirale Vektoren für die Gentherapie.

Description

Copolymere für den Transport von Nukleinsäuren in die Zelle.
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet des Gentransfers, insbesondere auf nichtvirale Vektoren.
Die Verfügbarkeit stabiler, effizienter Genvektoren ist Voraussetzung für die klinische Umsetzbarkeit gentherapeutischer Strategien. Allerdings sind die meisten bekannten Gentransfer-Vehikel bei der systemischen Anwendung mit dem Ziel der somatischen Gentherapie noch mit Problemen behaftet.
Für effizienten Gentransfer in vivo sind grundsätzlich folgende zwei Transportprobleme zu lösen: 1) Transfer des zu transferierenden Agens (z.B. Plasmid-DNA, Oligonukleotide) von der Applikationsstelle im
Organismus zur Zielzelle (der extrazelluläre Aspekt) und 2) Transfer des zu transferierenden Agens von der Zelloberfläche in das Zytoplasma bzw. den Zellkern (der zelluläre Aspekt) . Eine wesentliche Voraussetzung für den rezeptorvermittelten Gentransfer ist die
Kompaktierung von DNA zu Partikeln von Virusgröße und Freisetzung der DNA aus internen Vesikeln nach endozytotischer Aufnahme in die Zellen. Diese Voraussetzung wird durch Kompaktierung von DNA mit bestimmten kationischen Polymeren erfüllt, deren chemische Beschaffenheit die Freisetzung von DNA-Komplexen aus internen Vesikeln (Endosomen, Lysosomen) nach endzytotischer Aufnahme in Zellen gewährleistet (Boussif et al., 1995; Ferrari et al., 1997; Haensler & Szoka, 1993; Tang et al., 1996). Solch ein Effekt wird auch durch den Einbau von pH-abhängigen membranzerstörenden Peptiden in DNA-Komplexe erzielt (Plank et al., 1994; WO 93/07283). Bei geeigneter Zusammensetzung der DNA-Komplexe kann eine spezifische Aufnahme und effizienter Gentransfer in Zellen durch Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung erzielt werden (Kircheis et al., 1997, Zanta et al., 1997). Besonders geeignet für den rezeptorvermittelten Gentransfer sind auch Komplexe von DNA mit kationischen Peptiden (Gottschalk et al., 1996; Wadhwa et al., 1997; Plank et al., 1999) .
Die klinische Umsetzung der vielversprechenden Forschungsergebnisse, die im Gentransfer mit nichtviralen Vektoren erzielt werden, wird unter anderem dadurch erschwert, daß der extrazelluläre Aspekt des Transportproblems nur unvollständig gelöst ist. Eine der Ursachen für dieses Problem ist die chemisch-physikalische Beschaffenheit der nichtviralen Gentransfervektoren, aufgrund derer sie bei systemischer Anwendung starke Wechselwirkungen mit Blut- und Gewebekomponenten eingehen (z.B. durch
Opsonisierung, das Anheften von Serumprotein) , wodurch insbesondere der auf bestimmte Zielzellen ausgerichtete rezeptorvermittelte Gentransfer eingeschränkt wird. Es wurde gezeigt, daß die Oberflächenmodifikation von DNA-Komplexen mit Poly (ethylenglykol) deren
Blutprotein-bindende Eigenschaften entscheidend vermindert (Plank et al., 1996; Ogris, 1998; WO 98/59064) . Eine weitere Einschränkung des Einsatzes nichtviraler Vektoren besteht in der unzureichenden Löslichkeit (bzw. Stabilität) von DNA-Komplexen in vivo. Mit den bekannten Methoden war es bisher nicht möglich, DNA in ausreichend hohen Konzentrationen für intravenöse Anwendungen (z.B. im Bereich von 1 mg/ml) mit einem Polykation zu komplexieren, weil die DNA- Komplexe unter physiologischen Salzkonzentrationen aggregieren und aus der Lösung ausfallen.
Ähnliche Probleme treten auch bei der Applikation niedermolekularer chemischer Verbindungen auf. Auf dem Gebiet der "klassischen" Arzneimittel werden biologisch abbaubare synthetische Polymere dazu verwendet, Pharmazeutika in solch einer Form zu verpacken, die erhöhte Verweildauer im Organismus gewährleistet und zur gewünschten biologischen Verfügbarkeit im Zielorgan führt ("controlled release" ) . Dafür wird die Oberflächenmodifikation von kolloidalen Partikeln mit Polyethylenglykol derart gestaltet, daß die unerwünschte Opsonisierung unterdrückt wird. Über die Synthese und Charakterisierung biologisch abbaubarer Polymere für den Einsatz bei einer Vielzahl medizinischer Anwendungen existiert umfangreiche Literatur (Coombes et al., 1997). Je nach Substanz und Applikation werden die chemischen Bindungen im Polymerrückgrat variiert. Durch geeignete Positionierung von Ester-, Amid-, Peptid- oder Urethanbindungen kann die gewünschte Labilität in physiologischem Milieu erreicht werden, wobei die
Sensitivität gegenüber den Angriff von Enzymen gezielt variiert wird. Für eine schnelle und effiziente Synthese von biologisch wirksamen Substanzen haben sich kombinatorische Syntheseprinzipien bewährt (Balkenhohl et al., 1996). Durch systematische Variation weniger Parameter gelangt man zu einer großen Anzahl von Verbindungen, welche die gewünschte Grundstruktur aufweisen (Brocchini et al . , 1997). Mit einem geeigneten, aussagekräftigen biologischen Selektionssystem können aus diesem Pool von Verbindungen diejenigen herausgesucht werden, welche die gewünschten Eigenschaften zeigen.
In dem US-Patent Nr. 5,455,027 werden Polymere beschrieben, die aus alternierenden Einheiten eines Polyalkylenoxids und eines funktionalisierten Alkans bestehen, wobei an die funktionelle Seitengruppe des Alkans ein pharmokologischer Wirkstoff kovalent gekoppelt ist.
Im Laufe der letzten Jahre haben sich bei der Anwendung nichtviraler Gentransfersysteme folgende wesentliche Erkenntnisse herauskristallisiert :
a) Komplexe aus Plasmid-DNA und kationischen Polymeren eignen sich zum Gentransfer in vitro und in vivo, wobei Komplexen mit Polymeren mit sekundären und tertiären Aminogruppen auch eine inhärente endosomolytische Aktivität zugesprochen werden kann, die zu effizientem Gentransfer führt (Boussif et al., 1995; Tang et al., 1996) .
b) Verzweigte kationische Peptide eignen sich ab einer gewissen Kettenlänge des kationischen Anteils zur effizienten Bindung an DNA und zur Bildung von partikulären DNA-Komplexen (Plank et al., 1999). c) Polykation-DNA-Komplexe gehen starke
Wechselwirkungen mit Blutkomponenten ein und aktivieren das Komplementsystem (Plank et al., 1996).
d) Starke Wechselwirkungen von partikulären Strukturen mit Blutkomponenten können durch Modifikation mit Polyethylenglykol vermindert oder verhindert werden; dies gilt auch für Polykation-DNA-Komplexe (Plank et al., 1996; Ogris et al., 1999).
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neues, verbessertes nichtvirales Gentransfersystem auf der Grundlage von Nukleinsäure-Polykation-Komplexen bereitzustellen.
Bei der Lösung der im Rahmen der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe wurde von der Überlegung ausgegangen, die Nukleinsäure bzw. Nukleinsäure- Komplexe mit einem geladenen Polymer zu umhüllen, welches die Komplexe physikalisch stabilisiert und sie vor Opsonisierung schützt.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein geladenes Copolymer der allgemeinen Formel I
l wobei R amphiphiles Polymer oder ein homo- oder hetero- bifunktionelles Derivat davon ist,
und worin X i) eine Aminosäure oder ein Aminosäurederivat, ein Peptid oder ein Peptidderivat oder ein Spermin- oder Spermidinderivat ist; oder
ii) worin X
ist, wobei a H oder, gegebenenfalls halogen- oder dialkylamino- substituiertes, Ci-Cß-Alkyl bedeutet;
und wobei b, c und d gleiches oder verschiedenes, gegebenfalls halogen- oder dialkylamino-substituiertes Ci-Cε- Alkylen bedeutet; oder
iii) worin X
/N\
ist, wobei a H oder, gegebenenfalls halogen- oder dialkylamino- substituiertes, Ci-Cε-Alkyl bedeutet, und wobei b und c gleiches oder verschiedenes, gegebenenfalls halogen- oder dialkylamino-substituiertes Ci-Cε- Alkylen bedeuten; oder
iv) worin X
eine substituierte aromatische Verbindung mit drei funktioneilen Gruppierungen W1Y1Z1 ist, wobei W, Y und Z die unten angegebenen Bedeutungen haben;
wobei
W, Y oder Z gleiche oder verschiedene Reste CO, NH, 0 oder S oder eine zur Reaktion mit SH, OH, NH oder NH2 befähigte Linkergruppierung sind;
und wobei das Effektormolekül E ein kationisches oder anionisches Peptid oder
Peptidderivat oder ein Spermin- oder Ξpermidinderivat oder ein Glykosaminoglycan oder ein nichtpeptidisches Oligo/Poly-kation oder -anion; worin
m und n unabhängig voneinander 0, 1 oder 2 sind; worin
p vorzugsweise 3 bis 20; und worin
1 1 bis 5, vorzugsweise 1 ist.
Für den Fall, daß 1 >1 ist, kann die Einheit X-Zm-En gleich oder verschieden sein. s
Aromat bedeutet im Sinne der Erfindung einen monocyclischen oder bicyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 10 Ringatomen, der - neben den eingangs genannten Substituenten - gegebenenfalls unabhängig mit einem oder mehreren weiteren Substituenten, vorzugsweise mit einem , zwei oder drei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe Ci-Cε- Alkyl, -0- ( Cι-C6-Alkyl) , Halogen - vorzugsweise Fluor, Chlor oder Brom - Cyano, Nitro, Amino, mono- (Ci-Cε- Alkyl)amino, di- (Ci-Cε-Alkyl) amino substituiert sein kann. Bevorzugt ist der Phenylrest.
Aromat im Sinne der vorliegenden Erfindung kann auch für einen Heterorarylrest, d.h. : einen monocyclischen oder bicyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 5 bis 10 Ringatomen stehen , der ein, zwei oder drei Ringatome ausgewählt aus der Gruppe N, 0 oder S unabhängig von einander enthält, wobei die restlichen Kringatome C bedeuten.
Alkylamino, bzw. Dialkylamino steht - sofern nicht anders angegeben für eine Aminogruppe, die mit einem oder zwei C -Cg-Alkylresten substituiert ist, wobei - im Fall von zwei Alkylresten - die beiden Alkylgruppen auch einen Ring bilden können.
Cτ_-Cg-Alkyl steht im allgemeinen - sofern nicht anders angegeben - für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en) , der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom (en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich J oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl (Isopropyl), n-Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, Pentyl, 1-Methylbutyl,
2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 1, 1-Dimethylpropyl,
1, 2-Dimethylpropyl, 2, 2-Dimethylpropyl,
1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-Methylpentyl,
2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1, 2-Dimethylbutyl,
1, 3-Dimethylbutyl, 2,2, -Dimethylbutyl,
2,3-Dimethylbutyl, 3, 3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl,
2-Ethylbutyl, 1, 1, 2-Trimethylpropyl,
1, 2, 2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-l-methylpropyl und l-Ethyl-2-methylpropyl.
Bevorzugt sind - sofern nicht anders angegeben - Niederalkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, n-Butyl,
1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl oder 1,1-Dimethylethyl.
Entsprechend bedeutet Alkylen eine verzweigte oder unverzweigte zweibindige Kohlenwasserstoffbrücke mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom (en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können.
Das amphiphile Polymer R ist bevorzugt ein Polyalkylenoxid, Polyvinylpyrollidon, Polyacrylamid, iO
Polyvinylalkohol , oder ein Copolymer dieser
Polymere.
Beispiele für geeignete Polyalkylenoxide sind Polyethylenglykole (PEG) , Polypropylenglykole, Polyisopropylenglykole, Polylbutylenglykole.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Polyalkylenoxide, insbesondere PEG.
Das Polyalkylenoxid kann im Copolymer als solches vorliegen, oder als Thio-, Carboxy- oder Aminoderivat .
Das Polymer R weist bevorzugt ein Molekulargewicht von 500- 10 000 auf, vorzugsweise 1000 - 10 000.
Für den Fall i) , in dem X eine Aminosäure ist, kann für die Synthese des Copolymeren eine Aminosäure mit drei funktioneilen Gruppen eingesetzt werden, wobei zwei dieser Gruppen zur Copolymerisation mit dem Polymer und eine zur Ankoppelung des Effektorsmoleküls E befähigt sind; in diesem Fall kann Z entfallen. Bevorzugt sind die natürlichen Aminosäuren Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin, Ornithin und Tyrosin. Prinzipiell können statt der natürlichen Aminosäuren auch synthetische verwendet werden (z.B. entsprechende Spermin- und Spermidinderivate) .
Im Fall i) kann ein für die Synthese auch ein Aminosäurederivat verwendet werden, das zwei funktionelle Gruppen zur Copolymerisation mit dem Polymeren enthält und durch Modifikation einer Aminosäure (Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin oder Ornithin) mit einer Linkergruppierung zur Ankoppelung des Effektormoleküls erhalten wurde, womit Z entfällt (m = 0) ; Beispiele für Linkergruppierungen sind Pyridylthiomercaptoalkylcarboxylate (siehe Fig. 1) oder Maleimidoalkancarboxylate .
Im Fall i) kann X auch ein Peptid (derivat) sein. Im Fall eines ungeladenen Peptids oder Peptidderivats ist daran E direkt oder über Z gekoppelt.
Für den Fall, daß X ein positiv oder negativ geladenes Peptid oder Peptidderivat oder ein Spermin- oder Spermidinderivat ist, stellt X selbst das Effektormolekül dar (Z und E entfallen, m=n=0) . Im einfachsten Fall besteht das Peptid in diesem Fall aus einer linearen Abfolge aus zwei oder mehreren identischen oder verschiedenen natürlichen oder synthetischen Aminosäuren dar, wobei die Aminosäuren so gewählt werden, daß das Peptid insgesamt entweder positiv oder negativ geladen ist. Alternativ kann das Peptid verzweigt sein. In diesen Fällen stellt das Peptid als solches den Effektor dar, Z und E entfallen (m = n = 0) . Beispiele für einen Typ geeigneter verzweigter kationischer Peptide wurden von Plank et al., 1999, beschrieben.
Geeignete anionische Peptidderivate X weisen die allgemeine Formel (Peptid) n-B-Spacer- (Xaa) auf. Das Peptid ist eine Abfolge von Aminosäuren oder Aminosäurederivaten mit insgesamt negativer Ladung. Bevorzugt besteht das Peptid aus drei bis 30 Aminosäuren, vorzugsweise besteht es ausschließlich »<ό aus Glutaminsäure- und/oder Asparaginsäureresten. n stellt die Anzahl der Verzweigungen in Abhängigkeit der in B enthaltenen funktionellen Gruppen dar. B ist ein Verzweigungsmolekül, vorzugsweise Lysin oder ein Molekül des Typs X im Fall von ii) bis iv) . Der Spacer ist ein Peptid, bestehend aus 2 bis 10 Aminosäuren oder eine organische Aminocarbonsäure mit 3 bis 9 Kohlenstoffatomen im Carbonsäuregerüst, z.B. 6-Aminohexansäure. Der Spacer dient zur räumlichen Trennung des geladenen Effektormoleküls vom
Polymergerüst. Xaa ist bevorzugt eine trifunktionelle Aminosäure, insbesondere Glutaminsäure oder Asparaginsäure und kann im allgemeinen eine Verbindung des Typs X, Fall i) - iv) sein.
Alternativ kann X im Fall i) ein Peptidderivat sein, wobei die Modifikation des Peptids in einer geladenen Gruppierung besteht, die von einer Aminosäure verschieden ist; Beispiele für derartige Gruppierungen sind Sulfonsäuregruppierungen oder geladene
Kohlenhydratreste, wie Neuraminsäuren, oder sulfatierte Glycosaminoglycane. Die Modifikation des Peptids kann nach Standardmethoden durchgeführt werden, entweder direkt im Zuge der Peptidsynthese oder, nachträglich am fertigen Peptid.
Das Effektormolekül E kann, wie X im Fall i) , ein polykationisches oder polyanionisches Peptid oder Peptidderivat oder ein Spermin- oder Spermidinderivat sein. Im einfachsten Fall stellt das Peptid auch in diesem Fall eine lineare Abfolge aus zwei oder mehreren identischen oder verschiedenen natürlichen oder synthetischen Aminosäuren dar, wobei die Aminosäuren so gewählt werden, daß das Peptid insgesamt entweder positiv oder negativ geladen ist. Alternativ kann das Peptid verzweigt sein. Beispiele für geeignete verzweigte kationische Peptide wurden von Plank et al., 1999, beschrieben. Geeignete anionische Moleküle E weisen die allgemeine Formel (Peptid) n-B-Spacer- (Xbb) auf, wobei Xbb vorzugsweise eine Aminosäure mit einer reaktiven Gruppe ist, welche direkt oder über Z an X koppelbar ist.
Die Koppelung des Effektorpeptids E an Z oder direkt an X erfolgt über eine im Peptid von vornherein vorhandene oder nachträglich eingeführte reaktive Gruppe, z.B. eine Thiolgruppe (in einem Cystein oder durch
Einführung einer Mercaptoalkansäuregruppe) . Alternativ, in Abhängigkeit von Z, kann die Koppelung auch über bereits vorhandene oder nachträglich eingeführte Amino- oder Carbonsäuregruppen erfolgen.
Alternativ kann E, wie X im Fall i) , ein Peptidderivat sein, wobei die Modifikation des Peptids in einer geladenen Gruppierung besteht, die von einer Aminosäure verschieden ist, Beispiele für derartige Gruppierungen sind Sulfonsäuregruppierungen oder geladene
Kohlenhydratreste, wie Neuraminsäuren, oder sulfatierte Kohlenhydratreste. Die Koppelung an X erfolgt auch in diesem Fall direkt oder über Z. »H
Das Copolymer der allgemeinen Formel I
ist bevorzugt als streng alternierendes Block-Copolymer aufgebaut.
Gegebenenfalls ist das Copolymer mit einem zellulären Liganden für die Zielzelle (Rezeptorligand L) modifiziert. In diesem Fall ist die Mehrzahl der
Linkerpositionen Z mit E besetzt, dazwischen ist an einzelne Positionen des Linkers Z an Stelle des kationischen bzw. anionischen Effektors E ein zellulärer Ligand gekoppelt. Alternativ liegt der Ligand an einzelne Positionen des Effektormoleküls E gekoppelt vor. Bevorzugt beträgt das Verhältnis E:L ca. 10:1 bis 4:1. Der Rezeptorligand kann biologischen Ursprungs sein (z.B. Transferrin, Antikörper, Kohlenhydratreste) oder synthetisch (z.B. RGD-Peptide, synthetische Peptide, Derivate von synthetischen
Peptiden) ; Beispiele für geeignete Liganden sind in der WO 93/07283 angegeben.
Die erfindungsgemäßen Copolymeren können nach folgendem Verfahrensschema hergestellt werden:
Der Copolymerisationspartner X bzw. X-Zm-En wird, sofern er ein Peptid oder Peptidanalog ist, nach Standardmethoden, z.B. an der festen Phase (solid phase peptide synthesis, SPPS) nach Fmoc-Protokoll synthetisiert (Fields et al., 1990). Die Aktivierung der Aminosäurederivate erfolgt dabei mit TBTU/HOBt oder mit HBTU/HOBt (Fields et al., 1991). Verwendet werden für die ionischen Aminosäurepositionen folgende Derivate in ihrer N-terminal Fmoc-geschützten Form:
(a) kationische Seitenketten:
R(Pbf), K(Boc,Trt), Ornithin (Boc) , Caboxyspermin oder - spermidin (Boc) .
(b) anionische Seitenketten:
D(O-tert.Bu) , E (O-tert .Bu) .
Für die Verzweigungsstelle B des Moleküls ( Peptid) n-B- Spacer- (Xaa) oder (Peptid) n-B-Spacer- (Xbb) kommt
Fmoc-K(Fmoc) -OH zum Einsatz. Die Peptide werden mit TFA/DCM vom Harz gespalten.
Wenn der Polymerisationspartner X ein Peptid der allgemeinen Struktur (Peptid) n-B-Spacer- (Xaa) in der nachfolgenden Copolymerisation ist, so wird an der Position Xaa Glutaminsäure oder Asparaginsäure verwendet, die an einer Carboxyl-Position mit einer Benzylschutzgruppe versehen ist. Diese wird selektiv durch Hydrogenolyse (Felix et al., 1978) entfernt. Die N-terminal gelegenen Aminosäurepositionen der Peptidkette werden mit Boc-geschützten Aminosäuren belegt, um die Schutzgruppenabspaltung nach Copolymerisation des Peptids mit PEG in einem Schritt durchführen zu können. Ist der Polymerisationspartner X ein Aminosäurederivat, das eine Linkergruppierung enthält (z.B.
3-Mercaptopropionsäure, 6-Aminohexansäure) , so kann dieses in Flüssigphase nach klassischen Methoden der
Peptidchemie erhalten werden. Mercaptopropionsäure wird mit 2, 2 ' -Dithiodipyridin umgesetzt und chromatographisch gereinigt. Das Reaktionsprodukt wird mit Carboxyl-geschützter Glutaminsäure (O-t.butyl) unter HOBt/EDC-Aktivierung umgesetzt (siehe Fig. 1) .
Analog wird 6-Fnαoc-Aminohexansäure umgesetzt. Die
Carboxylschutzgruppen werden in TFA/DCM entfernt, das resultierende Glutaminsäurederivat wird mittels chromatographischer Methoden gereinigt.
Die Herstellung der Copolymeren ist nach folgenden
Prinzipien möglich und wird anhand eines PEG-Peptid-
Copolymeren veranschaulicht:
(1) poly(PEG -0- OC-) Matrix („Polyester"): Die Copolymerisation der ionischen, partiell seitenkettengeschützten Peptid-Dicarbonsäuren bzw.
Glutamin- oder Asparaginsäurederivate mit PEG-
Macromonomeren in definierten Molmassenbereichen
(MW 400-20000 in Handel erhältlich, z.B. Fluka) liefert eine Matrix auf PEG-Esterbasis. Diese stellt ein in physiologischer Umgebung hydrolyselabiles System dar
(Ulbrich et al. , 1985) .
Die p (PEG-Peptid) -Copolymere werden dabei nach etablierten Methoden, z.B. mit Dicyclohexylcarbodiimid/DMAP, vorzugsweise in streng alternierender Folge aufgebaut (Zalipsky et al., 1984;
Nathan, A. , 1992). Das PEG-Macromonomer wird zusammen 7 mit einem seitenkettengeschützten Peptid bzw. Glutamin- oder Asparaginsäurederivat in Dichlormethanlösung mit DCC / DMAP versetzt. Nach Abtrennung des entstandenen Harnstoffderivates kann das Polymer durch Fällung mit kaltem Äther erhalten werden. Die Abspaltung der noch verbliebenen Seitenkettenschutzgruppen gelingt mit TFA in Dichlormethan (unter diesen Bedingungen ist auch die PEG-Ester-Bindung stabil (Zalipsky et al., 1984)). Das ionische Polymer wird durch Ausfällen und abschließenden Chromatographieschritt erhalten. Die Reaktionsführung ermöglicht eine Kontrolle des Polymerisationsgrades und des Ladungsanteils pro PEG-Einheit im Polymer.
(2) poly(PEG -HN- 0C-) Matrix („Polyamid") Alternativ zum Polyester kann eine amidische
Polymermatrix aufgebaut werden, falls, bei Verwendung eines Copolymer-DNA-Komplexes in einer gentherapeutischen Anwendung, eine zu schnelle Hydrolysierbarkeit und daher eine zu hohe Instabilität bei systemischer Applikation zu erwarten ist. In diesem Fall werden Diamino-PEG-Derivaten anstelle der der PEG-Macromonomere verwendet, die in Analogie zur oben beschriebenen Synthese mit den ionischen Peptiden bzw. Glutamin- oder Asparaginsäurederivaten copolymerisiert werden. Bei dieser Synthese wird ein hydrolysestabiles A idgerüst erhalten. Diamino-modifizierte Polyethylenglykole sind als Grundstoffe in definierten Molmassenbereichen zwischen 500 und 20000 im Handel erhältlich (z.B. Fluka) . Die verbliebenen säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen der Peptidkomponenten werden, z.B. mit mit TFA/DCM abgespalten, und die Polymere werden mittels chromatographischer Methoden gereinigt. Copolymere aus Glutamin- oder Asparaginsäurederivaten werden in einem weiteren Schritt mit anionischen oder kationischen Peptiden umgesetzt, die eine geeignete reaktive Gruppe enthalten. Z.B. werden Copolymere der 3- (2' -thio-pyridyl) -mercaptopropionyl-glutaminsäure mit Peptiden umgesetzt, die eine freie Cystein-Thiolgruppe enthalten. Von Copolymeren, die aus 6-Fmoc- aminohexanoyl-glutaminsäure hervorgegangen sind, wird unter basischen Bedingungen die Fmoc-Schutzgruppe entfernt. Das Produkt wird mit einem carboxylaktivierten, geschützten Peptid umgesetzt. Die Peptidschutzgruppen (t-Boc bzw. O-t.butyl) werden in DCM/TFA entfernt, das Endprodukt wird chromatographisch gereinigt. Alternativ kann die Aminogruppe von Ahx (6-Aminohexansäure) mit bifunktionellen Linkern derivatisiert werden und anschließend mit einem Peptid umgesetzt werden.
Die Kopplung des Liganden L kann direkt durch Aktivierung von Carboxylgruppen am Effektor E (bevorzugt bei anionischen Copolymeren) bzw. am Liganden erfolgen oder über Zwischenschaltung bifunktioneller Linker wie Succinimidyl-pyridyl- dithioproprionat (SPDP; Pierce oder Sigma) und ähnlicher Verbindungen. Die Reinigung des Reaktionsprodukts kann durch Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie durchgeführt werden.
Die Umsetzung dieses Copolymerisationsansatzes kann auch nach kombinatorischen Prinzipien erfolgen. Als selektierbare Variable treten dabei vor allem der Typ 13 und das Molekulargewicht (Polymerisationsgrad) des Polymeren R, die Identität des Polymerisationspartners X-Zm-En bzw. des Effektormoleküls E (z.B. eine Serie von anionischen Peptiden mit einer zunehmenden Anzahl von Glutaminsäuren) und der Gesamtpolymerisationsgrad p auf.
Durch Variation von Molmassen der PEG-Macromonomere, der Art der verwendeten ionischen Spezies sowie deren Anteil am Copolymer und des Polymerisationsgrades der Polymermatrix ist ein Mehrparametersystem geschaffen, welches die schnelle Parallelkonstruktion einer homologen Reihe unterschiedlicher Copolymerer und in der Folge, nach Komplexierung mit der Nukleinsäure, verschiedener nichtviraler Vektoren ermöglicht. Das Synthesekonzept wird hierfür im Maßstab einer Zellkulturplatte (z.B. 96 wells per plate) umgesetzt. Dazu wird die chemische Synthese an den benötigten Mikromaßstab angepaßt (Reaktionsvolumina im Bereich von 500 μl) . Dies ermöglicht die direkte Übertragung der parallel synthetisierten Polymere in den biologischen Assay und trägt so zu einem schnellen "screening" einer Vielzahl von Systemen und zum schnellen Auffinden geeigneter Verbindungen beitragen. Für die Durchführung des biologischen Auswahlverfahrens im Hinblick auf die bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Copolymeren für den Gentransfer werden die Copolymere z.B. mit DNA- Komplexen versetzt und dann Tests unterzogen, die eine Beurteilung der Polymereigenschaften bezüglich der beabsichtigten Anwendung (z.B. Gentransfer) zulassen. Ebensolche Auswahlverfahren können für Copolymer- umhüllte Nanopartikel angewandt werden. Solche Screening- und Selektionsverfahren können z.B. Komplementaktivierungstests im 96-Well-Plate-Format dienen (Plank et al., 1996), turbidi etrische Messungen der durch Serumalbumin oder Salz induzierten Aggregation im gleichen Format oder in vitro
Gentransferstudien im gleichen Format (Plank et al., 1999) oder fluoreszenzoptische Verfahren im gleichen Format sein.
Solche Untersuchungen geben z.B. Auskunft darüber, welche Copolymere aus einem kombinatorischen synthetischen Ansatz sich dazu eignen, die Oberfläche von DNA-Komplexen so zu modifizieren, daß deren Löslichkeit ausreichend für Gentransferapplikationen in vivo ist, deren Wechselwirkung mit Blut- und
Gewebekomponenten eingeschränkt wird, sodaß deren Verweil- und Wirkdauer im Blutkreislauf ausreichend erhöht wird, um rezeptorvermittelten Gentransfer in Zielzellen zu ermöglichen.
Die erfindungsgemäßen Copolymere werden bevorzugt für den Transport von Nukleinsäuren in höhere eukaryotische Zellen verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt Komplexe, enthaltend ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle und ein oder mehrere geladene Copolymere der allgemeinen Formel I.
Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül mit einem organischen Polykation oder einem kationischen Lipid kondensiert . In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung somit Komplexe aus Nukleinsäure und einem organischen Polykation oder einem kationischen Lipid, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie an ihrer Oberfläche ein geladenes Copolymer der allgemeinen Formel I über ionische Wechselwirkung gebunden haben.
Bei den in die Zelle zu transportierenden Nukleinsäuren kann es sich um DNAs oder RNAs handeln, wobei hinsichtlich der Nukleotidsequenz und Größe keine Beschränkungen bestehen. Die in den erfindungsgemäßen Komplexen enthaltene Nukleinsäure wird vor allem durch den in der Zelle zu erzielenden biologischen Effekt definiert, z.B. im Falle der Anwendung im Rahmen der Gentherapie durch das zur Expression zu bringende Gen bzw. den Genabschnitt, oder durch die beabsichtigte Substitution oder Reparatur eines defekten Gens oder einer beliebigen Zielsequenz (Yoon et al., 1996; Kren et al. 1998), oder durch die Zielsequenz eines zu inhibierenden Gens (z.B. im Fall der Anwendung von Antisenseoligoribonukleotiden oder Ribozymen) . Vorzugsweise handelt es sich bei der in die Zelle zu transportierenden Nukleinsäure um Plasmid-DNA, die eine für ein therapeutisch wirksames Protein kodierende Sequenz enthält. Für die Anwendung im Rahmen einer Krebstherapie kodiert die Sequenz z.B. für ein oder mehrere Zytokine, wie Interleukin-2, IFN-α, IFn-γ, TNF-α, oder für ein Selbstmordgen, das in Kombination mit dem Substrat zur Anwendung kommt. Für die Anwendung bei der sog. genetischen Tumorvakzinierung enthalten die Komplexe DNA, kodierend für ein oder mehrere Tumorantigene oder Fragmente davon, gegebenenfalls in Kombination mit DNA, kodierend für ein oder mehrere Zytokine. Weitere Beispiele für therapeutsich wirksame Nukleinsäuren sind in der WO 93/07283 angegeben.
Das erfindungsgemäße Copolymer hat die Eigenschaft, den Nukleinsäure-Polykation-Komplex sterisch zu stabilisieren und dessen unerwünschte Wechselwirkung mit Komponenten von Körperflüssigkeiten (z.B. mit Serumproteinen) zu vermindern oder zu unterdrücken.
Geeignete organische Polykationen für die Komplexierung von Nukleinsäure für den Transport in eukaryotische Zellen sind bekannt; aufgrund ihrer Wechselwirkung mit der negativ geladenen Nukleinsäure wird diese kompaktiert und in eine für die Aufnahme in die Zellen geeignete Form gebracht. Beispiele sind Polykationen, die für den rezeptorvermittelten Gentransfer verwendet wurden (EP 0388 758; WO 93/07283), wie homologe lineare kationische Polyaminosäuren (wie Polylysin, Polyarginin, Polyornithin) oder heterologe lineare gemischt kationisch-neutrale Polyaminosäuren (bestehend aus zwei oder mehreren kationischen und neutralen Aminosäuren) , verzweigte und lineare kationische Peptide (Plank et al., 1999; Wadhwa et al. 1997), nichtpeptidische Polykationen (wie lineare oder verzweigte Polyethylenimine, Polypropylenimine) , Dendrimere (sphäroidale Polykationen, die mit einem gut definierten Durchmesser und einer exakten Anzahl von endständigen Aminogruppen synthetisiert werden können; (Haensler und Szoka, 1993; Tang et al., 1996; WO 95/02397), kationische Kohlenhydrate, z.B. Chitosan (Erbacher et al. 1998). Die Polykationen können auch mit Lipiden modifiziert sein (Zhou et al. 1994; WO 97/25070).
Weitere geeignete Kationen sind kationische Lipide (Lee et al. 1997), die zum Teil im Handel erhältlich sind (z.B. Lipofectamin, Transfectam) .
Im folgenden wird, wenn nicht anders angegeben, der Begriff „Polykation" stellvertretend sowohl für Polykationen als auch für kationische Lipide verwendet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte Polykationen sind Polyethylenimine, Polylysin und Dendrimere, z.B. Polyamidoamindendrimere ("PAMAM"- Dendrimere) .
Die Größe bzw. Ladung der Polykationen kann über einen weiten Bereich schwanken; sie wird so gewählt, daß der mit Nukleinsäure gebildete Komplex bei physiologischer Salzkonzentration nicht dissoziiert, was durch den Ethidiumbromidverdrängungsassay (Ethidiumbromide Displacement Assay) auf einfache Weise bestimmt werden kann (Plank et al, 1999) . In einem weiteren Schritt wird eine definierte Menge an Nukleinsäure mit steigenden Mengen des ausgewählten Polykations inkubiert, der gebildete Komplex auf die zu transfizierenden Zellen aufgebracht und die Genexpression (im allgemeinen mit Hilfe eines Reportergenkonstrukts, z.B. Luciferase) nach Standardmethoden gemessen.
Der Aufbau der Nukleinsäure-Komplexe erfolgt über elektrostatische Wechselwirkungen. Die DNA kann im Verhältnis zum Polykation im Überschuß vorliegen, so daß derartige Komplexe eine negative Oberflächenladung aufweisen; im umgekehrten Fall, wenn das die Nukleinsäure kondensierende Polykation im Überschuß vorliegt, haben die Komplexe eine positive Oberflächenladung. Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt das Polykation im Überschuß vor.
Bevorzugt wird das Verhältnis Polykation: Nukleinsäure im Falle eines positiven Ladungsüberschusses so eingestellt, daß das Zeta-Potential etwa +20 bis +50 mV beträgt, im Falle der Verwendung bestimmter Polykationen, z.B. Polylysin, kann es auch darüber liegen.
Im Falle eines negativen Ladungsüberschusses beträgt das Zetapotential etwa -50 bis -20mV.
Die Messung des Zeta-Potentials erfolgt nach etablierten Standardmethoden, wie z.B. von Erbacher et al. 1998, beschrieben.
Das Polykation ist gegebenfalls mit einem zellulären Liganden oder Antikörper konjugiert; geeignete Liganden sind in der WO 93/07283 beschrieben. Für den zielzellgerichteten Gentransfer im Rahmen einer
Tumortherapie werden Liganden oder Antikörper für tumorzellassoziierte Rezeptoren (z.B. CD87; uPA-R) bevorzugt, die in der Lage sind, den Gentransfer in Tumorzellen zu erhöhen.
Bei der Herstellung der Komplexe wird die Nukleinsäure, im allgemeinen Plasmid-DNA, mit dem Polykation (ggf. derivatisiert mit einem Rezeptorliganden) , das im Ladungsüberschuß vorliegt, inkubiert. Dabei bilden sich Partikel, die über rezeptorvermittelte Endzytose in Zellen aufgenommen werden können. Anschließend werden die Komplexe mit einem erfindungesgemäßen negativ geladenen Copolymer, vorzugsweise Polyethylenglykol- Copolymer, inkubiert. Der Effektor E im Copolymer ist bevorzugt ein polyanionisches Peptid. Alternativ wird zuerst das Copolymer mit Nukleinsäure gemischt und dann mit Polykation inkubiert, oder, als dritte Variante, zuerst mit Polykation gemischt und dann mit Nukleinsäure inkubiert.
Alternativ wird die Nukleinsäure mit einem Polykation, das im elektrostatischen Unterschuß vorliegt, inkubiert und dann ein kationisches Copolymer zugefügt. Auch hier kann die Reihenfolge der Mischungsschritte variiert werden, wie oben für anionische Copolymere beschrieben. Die relativen Anteile der einzelnen Komponenten werden so gewählt, daß der resultierende DNA-Komplex ein schwach positives, neutrales oder schwach negatives Zeta-Potential aufweist (+10 mV bis -10 mV) .
Im Fall der Verwendung positiv geladener Copolymerer können diese als alleinige Nukleinsäure-bindende und -kondensierende polykationische Moleküle verwendet werden; der Anteil eines Polykations oder kationischen Lipids kann somit entfallen. Die relativen Anteile der einzelnen Komponenten werden auch in diesem Fall so gewählt, daß der resultierende DNA-Komplex ein schwach positives, neutrales oder schwach negatives Zeta- Potential aufweist (+10 mV bis -10 mV) .
In den Komplexen sind gegebenfalls Polykation und/oder Copolymer mit gleichen oder verschiedenen zellulären Liganden modifiziert. z
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Komplexe, die durch das elektrostatisch gebundene Copolymer der allgemeinen Formel I in ihrer Größe stabilisiert und somit vor Aggregation geschützt sind, haben den Vorteil, in Lösung über längere Zeiträume (Wochen) lagerbar zu sein. Darüberhinaus haben sie den Vorteil, auf Grund der Schutzwirkung des gebundenen Copolymers eine verminderte bzw. keine Wechselwirkung mit Komponenten von Körperflüssigkeiten (z.B. mit Serumproteinen) einzugehen.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure, das erfindungsgemäße Copolymer und gegebenenfalls ein organisches Polykation oder kationische Lipid.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung liegt bevorzugt als Lyophilisat vor, gegebenfalls unter Zusatz von Zucker, wie Saccharose oder Dextrose, in einer Menge, die in der gebrauchsfertigen Lösung eine physiologische Konzentration ergibt. Die Zusammensetzung kann auch in Form eines Kryokonzentrats vorliegen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch tiefgefroren (kryokonserviert) oder als gekühlte Lösung vorliegen.
In einem weiteren Aspekt dienen die erfindungsgemäßen, positiv oder negativ geladenen Copolymere dazu, kolloidale Partikel ("Nanopartikel" ) , wie sie für die Applikation klassischer Arzneimittel entwickelt werden, sterisch zu stabilisieren sowie deren unerwünschte Wechselwirkung mit Komponenten von Körperflüssigkeiten (z.B. mit Serumproteinen) zu vermindern oder zu unterdrücken. Weiters können die erfindungsgemäßen mit Rezeptorliganden modifizierten Copolymere dazu verwendet werden, solche Nanopartikel an ihrer Oberfläche mit Rezeptorliganden zu versehen, um Arzneimittel mit erhöhter Spezifität an Zielzellen zu transferieren ("Drug Targeting").
Figurenübersicht
Fig. 1: Herstellung der Copolymergerüste aus 3-(2'- thio-pyridyl) -mercaptopropionyl-glutaminsäure und 0, 0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000 oder 0,0'-Bis(2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400
Fig. 2: Ankoppelung von geladenen Peptiden an das Copolymergerüst
Fig. 3: Herstellung des Copolymergerüsts aus dem geschützten Peptid E4EPR0T und 0,0' -Bis (2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000
Fig. 4: Komplementaktivierungstests
Fig. 5: Erythrozyten-Lysetest
Fig. 6: Elektronenmikroskopischen Aufnahmen von
PEI-DNA-Komplexen (N/P = 8) in Gegenwart des Copolymers P3YE5C Fig. 7: Zetapotential von PEI- und DOTAP/Cholesterin- DNA-Komplexen in Abhängigkeit von der Menge zugesetzten Copolymers P3YE5C bzw. P6YE5C
Fig. 8: Herstellung DNA/Polykation/Copolymer-Komplexen
Fig. 9: Gentransfer in K562-Zellen mit PEI (25 kD) -DNA- Komplexen in Gegenwart und Abwesenheit des Copolymers P3YE5C
Fig. 10: Transfektion der Brustkrebszellinie MDA-MB435S mit Polylysin-DNA-Komplexen in Gegenwart und Abwesenheit des Hüllpolymers P3INF7
Fig. 11: Lipofection in NIH3T3-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit des Copolymers P3YE5C
Fig. 12: Transfektion von HepG2-Zellen mit
DOTAP/Cholesterin-DNA und PEI-DNA in Gegenwart und Abwesenheit von P6YE5C
Fig.13: Transfektion von HepG2-Zellen mit PEI-DNA- Komplexen in Gegenwart von verschiedenen Mengen Copolymer bei verschiedenen Ladungsverhältnissen
Fig. 14: Abhängigkeit der Transfektionseffizienz von der Menge an Copolymer, von der Komplexreinigung und von der Anwesenheit von Salz
Fig. 15: Intravenöser Gentransfer in vivo mittels DNA/Polykation-Komplexen mit Copolymerhülle ~5
Fig. 16: Gentransfer mit copolymer-geschützten PEI-DNA-
Vektoren in vivo . P3YE5C-PEI-DNA in einem T-Zell-Lymphommodell in DBA2-Mäusen
Fig. 17: Gentransfer mit copolymer-geschützten PEI-DNA- Vektoren in vivo - PYE5C-PEI-DNA in
DBA2-Mäusen
Fig.18: P6YE5C verstärkt den Transport von DNA-PEI- Komplexen in den Tumor (Tumor-Targeting)
Fig. 19: Interaktion von PEI-DNA-Komplexen und humanen Serumbestandteilen
Beispiel 1
Herstellung von geladenen Copolymeren der allgemeinen Formel I
1.1. Herstellung der Copolymergerüste aus 3-(2'-thio- pyridyl) -mercaptopropionyl-glutaminsäure und 0,0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000 oder 0,0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400 (Diamino-PEG-3400; Fluka) In diesem Fall ist in der allgemeinen Formel I:
W=Y=NH;
X=3-mercaptopropionyl-glutaminsäure, das heißt, ein Aminosäurederivat gemäß Fall i) , das durch Ankoppelung der Linkergruppierung 3- (2' -Thiopyridyl) - mercaptopropionsäure an Glutaminsäure erhalten wurde;
daher entfällt Z(m=0).
a) Umsetzung von 3-Mercaptopropionsäure mit 2,2'-Dithiodipyridin (1):
1 g DTDP (Fluka) wurde in 4 ml absolutem Ethanol (Merck) gelöst. Nach Zugabe von 100 μl Triethylamin (Aldrich) wurden 87 μl (lmmol) 3-Mercaptopropionsäure zugesetzt. Nach 1 h wurde das Reaktionsgemisch in Aliquots mittels RP-HPLC gereinigt: Präparative
C18-Säule (Vydac, 218TP1022), Flußrate 25 ml/min, 0.1 % Trifluoressigsäure, 0-40 % Acetonitril in 24 min, 40-100 % Acetonitril in 5 min, 100 % Acetonitril in 5 min. Der Produktpeak eluierte bei ca. 20 % Acetonitril. Die Produktfraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet .
In einer Abwandlung dieser Synthese wird vor der Reinigung mittels RP-HPLC überschüssiges DTDP durch langsame Zugabe von Wasser unter Rühren ausgefällt. Der Niederschlag wird zweimal in Ethanol aufgenommen und erneut durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Die vereinigten wässrigen Phasen werden wie oben mittels RP-HPLC gereinigt. Z\
b) Synthese von 3- (2' -thio-pyridyl) - mercaptopropionyl-glutaminsäure (2b) :
Das in a) erhaltene Produkt 1 (s.Fig.l; 0.5 mmol) wurde in 25 ml Dichlormethan gelöst. Unter Rühren und
Eiskühlung wurden in einem 50 ml Polypropylenröhrchen (Fa. Peske) der Reihe nach je ein mmol Glutaminsäure- di-t-butylester (Glu (OtBu) OtBu, Bachern), 1-Hydroxybenzotriazol (Aldrich) , N-Ethyl-N'- (dimethylaminopropyl) -carbodiimid (Aldrich) und
Diisopropylethylamin (Aldrich) zugesetzt. Nach 48 h Reaktion wurde das Gemisch am Rotationsverdampfer bis auf einen öligen Rückstand eingeengt, der in 20 ml Ethylacetat aufgenommen wurde. Diese Lösung wurde je zweimal mit 0.5 M Salzsäure, gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer bis auf einen öligen Rückstand eingeengt und über Nacht am Hochvakuum getrocknet (Produkt 2a; s. Fig. 1). Produkt 2a wurde ohne weitere Aufreinigung zur Entfernung der t-Butylschutzgruppen in 30 ml
Dichlormethan:Trifluoressigsäure (2:1) aufgenommen und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Am Rotationsverdampfer wurde bis auf einen öligen
Rückstand eingeengt, der mit eiskaltem Ether gewaschen wurde. Nach Trocknung am Hochvakuum wurde das Produkt in 100 mM Hepes pH 7.4 gelöst und in Aliquots mittels RP-HPLC (gleiche Bedingungen wie für Produkt 1) gereinigt. Die Produktfraktionen wurden vereinigt. Produkt 2b (s. Fig.l) wurde in einer Ausbeute von 270 μ ol erhalten (27 % über alle Stufen) . Theoretisches Molekulargewicht: 344.05. Gefunden: 345,0 (MH+) .
cl) Copolymerisation von Pyridyl- (2-dithiopropionyl) - gluta insäure (2b) mit 0,0' -Bis (2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000 (Diamino- PEG-6000; Fluka) :
Produkt 2b wurde in 3 ml Dimethylformamid (Fluka) gelöst und mit Dichlormethan auf 20 ml aufgefüllt. 5 ml dieser Lösung (67.5 μmol) wurden der Reihe nach mit 506 mg Diamino-PEG-6000 (84 μmol, entspricht 1.25 Äquivalenten; Fluka), 30 mg Dicyclohexylcarbodiimid (135 μmol, 2 Äquivalente, 135 μl einer 1 M Lösung in DMF) und 2 mg
Dimethylaminopyridin (0.25 Äquivalente, 1 M Lösung in DMF) versetzt. Nach 2 h wurden 10 μl für einen Ninhydrintest entfernt, der nur noch schwache Blaufärbung zeigte. Rohprodukt 3 (s. Fig. 1) wurde nach Kühlung auf -20 °C durch Fällung aus dem
Reaktionsgemisch mit t-Butyl-methylether unter Rühren erhalten. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet. Aliquots wurden in Wasser aufgenommen, und nach Entfernung von unlöslichem Rückstand durch Filtration (Ultra-Free MC, Millipore) wurde mittels Gelfiltration gereinigt. Dazu wurde eine XK 16/40-Säule (Pharmacia) mit Superdex 75 (Pharmacia) nach den Vorgaben des Herstellers gefüllt. Aliquots von je 20 mg Rohprodukt 3 wurden bei einer Flußrate von 1 ml/min mit 20 mM Hepes pH 7.3 als Eluens gereinigt. Die Hauptfraktion eluierte bei einem scheinbaren Molekulargewicht von 40.000 Da nach höhermolekularen, deutlich abgetrennten Vorfraktionen, die getrennt gesammelt wurden.
c2) Copolymerisation von Pyridyl- (2-dithiopropionyl) - glutaminsäure (2b) mit 0,0' -Bis (2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400 (Diamino- PEG-3400; Fluka) (Produkt 4; s. Fig.l):
Produkt 4 wurde nach gleichem Ansatz und gleicher Aufreinigung erhalten wie Produkt 3. Als Hauptfraktion (54 % der Produktfraktionen) nach Gelfiltration wurde ein Produkt erhalten, das bei einem scheinbaren Molekulargewicht von 22.800 Da eluierte (Nebenfraktionen sind ein Produkt mit 64 kD, 14 % der Gesamtmenge, und ein Produkt mit 46 kD, 32 % der Gesamtmenge) .
Das Reaktionsschema der Syntheseschritte a) bis c) , die das Copolymergerüst ergeben, ist in Fig. 1 dargestellt: 3-Mercaptopropionsäure wird mit 2, 2' -Dithiodipyridin umgesetzt, das Produkt (1) wird an carboxylgeschützte Glutaminsäure gekoppelt (Produkt 2a) . Nach Abspaltung der t-Butyl-Schutzgruppen erhält man 3-(2'-thio- pyridyl) -mercaptopropionyl-glutaminsäure (2b), die unter DCC-Aktivierung mit 0,0' -Bis (2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000 oder mit 0,0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400 copolymerisiert wird. Erhalten werden die Produkte 3 bzw. 4. 1.2. Peptidsynthese
Die Peptide wurden nach dem FastMoc™-Protokoll auf einem Applied Biosystems 431A Peptidsynthesizer hergestellt .
i) Peptid YE5C (Sequenz [Ac-YEEEEE] 2-ahx-C) wurde unter Verwendung von 330 mg cysteinbeladenem Chlortritylharz (0.5 mmol/g; Bachern) mit den Schutzgruppen Trityl- (Cys) , di-Fmoc (Lys) und O-t- Butyl- (Glu) hergestellt. Es wurde je 1 mmol der geschützten Aminosäuren eingesetzt. Nach dem Verzweigungspunkt (Lys) wurden durchgehend Doppelkopplungen durchgeführt. Die Acetylierung der N-Termini wurde am Peptidharz mit 2 mmol Acetanhydrid in 2 ml N-Methylpyrrolidon in Gegenwart von 2 mmol Diisopropylethylamin durchgeführt. Das Peptid wurde als Rohprodukt nach Spaltung vom Harz (500 μl Wasser, 500 μl Thioanisol, 250 μl Ethandithiol in 10 ml Trifluoressigsäure) und Fällung mit Diethylether gewonnen. Das Rohprodukt wurde in 100 mM HEPES pH 7.9 gelöst und mittels Perfusionschromatographie gereinigt (Porös 20 HQ, Boehringer Mannheim, gefüllt in eine 4 x 100 mm PEEK-Säule. 0 - 0.5 M NaCl in 8 min, Flußrate 10 ml/min) . Der Extinktionskoeffizient des Peptids in 50 mM Natriumphosphatpuffer in 6 M Guanidiniumhydrochlorid beträgt bei 280 nm 2560 M"1cm"1 (Gill und von Hippel 1989) .
ii) Peptid INF7 (Sequenz GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC) wurde nach der gleichen Prozedur an 500 mg Chlortritylharz (0.5 mmol/g) synthetisiert, wie für YE5C beschrieben vom Harz gespalten und mit Diethylether gefällt. Das Rohprodukt wurde im Vakuum getrocknet. Aliquots von je 20 mg wurden in 500 μl 1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer pH 8 gelöst und durch Gelfiltration gereinigt (Sephadex G-10 von Pharmacia gefüllt in eine HR 10/30-Säule von Pharmacia. Flußrate 1 ml/min. Als Eluent dienten 20 mM HEPES pH 7.3 / 150 mM NaCl oder 100 mM TEAB oder 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat) . Extinktionskoeffizienten: 278 nm 12600; 279 nm 12665; 280 nm 12660 M^cm"1.
iii) Peptid SF029-ahx (Sequenz K2K-ahx-C) wurde auf analoge Weise synthetisiert (500 mg Fmoc-Cys (Trt) - Chlortritylharz von Bachern; 0.5 mmol/g) und nach Standardmethoden gereinigt (Sephadex G10 mit 0.1 % TFA als Eluens; Reverse Phase HPLC, 0.1 % TFA - Acetonitril-Gradient) . Das Lysin am Verzweigungspunkt war alpha,epsilon-di-Fmoc-L-Lysin, die folgenden Lysine alpha-Fmoc-epsilon-Boc-L-Lysin.
iv) Peptid E4E (Sequenz [EEEE]2KGGE) wurde analog synthetisiert. Ansatzgröße 0.25 mmol Fmoc-Glu (OBzl) - Chlortritylharz. Die Belegung des Harzes erfolgte durch Suspendieren entsprechender Mengen
O-Chlorotritylchloridharz (Alexis) in absolutiertem Dichlormethan und Versetzten mit je 2 eq. FmocGlu (OBzl)OH und Diisopropylethylamin. Nach mehrstündigem Schütteln wurde abfiltriert und mehrfach mit Dimethylformamid, Methanol, Isopropanol, Dichlormethan und Diethylether gewaschen. Zum Einsatz kommt ein modifiziertes Fmoc-Protokoll. Die N-terminale Aminosäure trägt eine Boc-Schutzgruppe, um aus der Festphasensynthese ein vollgeschütztes basenstabiles Peptidderivat der Sequenz (E (Boc) [E (tBu) ] 3) ∑KGGE (OBzl) OH (E4EPR0T) zu erhalten.
Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit Dichlormethan / Essigsäure / Trifluorethanol 8:1:1 bei Raumtemperatur. Die Benzylester-Schutzgruppe der C-terminalen
Glutaminsäure wurde selektiv mit H2 / Palladium auf Aktivkohle nach Standardvorschrift abgespalten.
Die Peptidmassen wurden mittels Elektrospray Massenspektroskopie bestimmt und damit die Identität der Peptide bestätigt.
1.3. Ankoppelung der Peptide an das Copolymergerüst (4) bzw. (5)
Die Lösungen von je 1,2 Äquivalenten C-terminal cysteinhaltigem Peptid und Copolymergerüst, erhalten in 1.1 (bezogen auf die Thiopyridyl-Gruppen am Polymer), in 20 mM Hepes, pH 7.4 werden vereinigt und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt oder geschüttelt.
Zur Bestimmung der einzusetzenden Äquivalente werden die verfügbaren Thiopyridyl-Bindungsstellen durch Versetzen einer verdünnten Lösung des Polymers mit 2-Mercaptoethanol und anschließender Messung der Extinktion des freigesetzten 2-Thiopyridons bei einer Wellenlänge von 342 nm, die Konzentration der freien Thiolfunktionen des cysteinhaltigen Peptides mit
Ellman-Reagenz bei einer Wellenlänge von 412 nm nach Lambert-Beer bestimmt. Nach Ablauf der Reaktion, deren Vollständigkeit durch die Absorption des freigesetzten Thiopyridons bei 342 nm bestimmt wurde, wurde eingeengt und das Produkt mittels Gelfiltration (Superdex 75-Material, Pharmacia) fraktioniert.
1.3.1 Herstellung des Copolymer P3YE5C
Es wurde das verzweigte Peptid YE5C, Sequenz (YEEEEE) 2K(ahx) C, verwendet, das über eine Disulfidbrücke des Cystein-Thiols mit der 3-Mercaptopropionyl-glutaminsäure-Gruppierung verknüpft ist.
a) Copolymer P3YE5C wurde aus Fraktion 3 (22.800 Da) des Produktes (4) und gereinigtem Peptid hergestellt. Als Produkt wurde eine Verbindung mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 35.000 Da erhalten. Unter
Berücksichtigung des Molekulargewichts des Peptides und des Ausgangspolymers bedeutet dies einen Polymerisationsgrad p = 6 (6 sich wiederholende Einheiten) .
b) Copolymer P6YE5C wurde aus Fraktion 3 (40.200 Da) des Produktes (3) und gereinigtem Peptid hergestellt. Als Produkt wurde eine Verbindung mit scheinbarem Molekulargewicht 55.800 Da erhalten. Der Polymerisationsgrad ist ca. 7.
1.3.2 Herstellung des Copolymer P3INF7
Es wurde das endosomolytische Peptid INF7 verwendet, das über eine Disulfidbrücke des Cystein-Thiols mit der 3-Mercapto-propionyl-glutaminsäure-Gruppierung verknüpft ist. a) Copolymer P3INF7 wurde aus Fraktion 3 (22.800 Da) des Produktes (4) und gereinigtem Influenzapeptid hergestellt.
b) Copolymer P6INF7 wurde aus Fraktion 3 (40.200 Da) des Produktes (3) und gereinigtem Influenzapeptid INF7 hergestellt .
1.3.3 Herstellung eines Rezeptorligand-modifizierten ("lactosylierten" ) Copolymer
Es wurden ein Teil des lactosylierten Pepitds SF029-ahx und 9 Teile des verzweigten Peptids YE5C, die über eine Disulfidbrücke des Cystein-Thiols mit der 3-Mercaptopropionyl-glutaminsäure-Gruppierung verknüpft sind, verwendet.
Jeweils 3.32 μmol Copolymer (4) bzw (5) (bezogen auf die enthaltenen Thiopyridyl-Gruppen) gelöst in 1 ml 20 M HEPES pH 7.4 wurden mit einer Mischung von 500 nmol lactosyliertem SF029-ahx und 4,48 μmol Peptid YE5C in 1.1 ml HEPES-Puffer versetzt. Dies entspricht einem 1.5-fachen Überschuß an freien Thiolgruppen der Peptide über die zu Verfügung stehenden
Thiopyridylgruppen, und der Anteil des lactosylierten Peptids an Gesamtpeptid ist 10 %. Die Reaktion verlief über Nacht vollständig. Die Produkte wurden wie beschrieben mittels Gelfiltration (Superdex 75) gereinigt.
Das Reaktionsschema zur Ankoppelung der geladenen Peptide an das Copolymergerüst gemäß 1.3 ist in Fig. 2 dargestellt: An Produkt 3 bzw. 4 werden Peptide mit freien Thiolgruppen gekoppelt, z.B. das Peptid INF7 (links) oder das Peptid YE5C. Es werden die Produkte P3INF7 (aus 0, 0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400), P6INF7 (aus 0,0' -Bis (2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000) und analog P3YE5C und P6YE5C erhalten.
Beispiel 2
Herstellung des Copoylymergerüsts aus Fmoc-6- Aminohexanoyl-glutaminsäure und 0, 0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000 (Diamino-PEG-6000; Fluka) oder
0,0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400 (Diamino-PEG-3400; Fluka) .
In diesem Fall gilt für die allgemeine Formel I:
W=Y=NH; X=Fmoc-6-Aminohexanoyl-glutaminsäure .
Das heißt, X ist gemäß i) ein Aminosäurederivat, das durch Ankoppelung von Fmoc-6-Aminohexansäure an Glutaminsäure erhalten wurde. Für die Ankoppelung des Effektormoleküls E kann Z entfallen oder ein bifunktioneller Linker wie SPDP oder EMCS sein.
Ein zur Ankoppelung an dieses Polymergerüst geeigneter Effektor E kann ein Peptid des Typs E4EPR0T (Z entfällt) oder des Typs YE5C sein, wobei dieses über das Cystein- Thiol mit dem Linkermolekül Z (z.B. SPDP oder EMCS) reagiert. Ho a) Synthese des Dipeptids Fmoc-6-Aminohexansäure- GluOH (6)
1 g Fmoc-geschützte 6-Aminohexansäure (2.82 mmol), 1.2 eq. Glu (OtBu) OtBu und 1.2 eq. 1-Hydroxybenzotriazol werden in 200 ml Dichlormethan gelöst. Die Mischung wurde nach Kühlen auf 0°C mit 1.2 eq. N-Ethyl-N'- (dimethylaminopropyl) -carbodiimid und 1.7 ml Diisopropylethylamin versetzt (pH = 8) . Nach einer Stunde bei 0°C wurde noch 18 Std bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde nun vollständig abdestilliert, der Rückstand mit Ethylacetat aufgenommen und mit 0.5 N Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurde Fmoc-6-Aminohexansäure-
Glu (OtBu) OtBu (5) nach Gefriertocknung erhalten.
Di-t-butyl-geschützes Derivat (5) wurde in 30 ml Dichlormethan/Trifluoressigsäure 2:1 gelöst und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach vollständiger Reaktion (Reaktionskontrolle mit reversed phase-HPLC) wurde das Lösungsmittel auf ca. 5% des Ausgangsvolumen reduziert und das Produkt (6) durch Präzipitation aus Diethylether erhalten. Abschließende Reinigung erfolgte durch RP-HPLC mit einem Acetonitril/ Wasser/ 0.1%TFA Gradienten.
b) Copolymerisation von Fmoc-6-Aminohexansäure-GluOH (6) mit 0,0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400' (Diamino-PEG-3400, Fluka), Produkt (7)
10 mg (6), 1.5 eq. 0,0'-Bis(2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400', 2 eq. Dicyclohexylcarbodiimid und 0.25 eq. 4- (Dimethylamino) - pyridin werden in 5 ml Dichlormethan gelöst. Nach 30 minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung nach Aufkonzentrieren filtriert und das Lösungsmittel danach vollständig abdestilliert. Der Rückstand wurde in 500 μl Wasser suspendiert und gefriergetrocknet.
Nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe (20% Piperidin in Dimethylformamid oder Dichlormethan) vom Polymer kann das Copolymer unter Verwendung gängiger Peptid- Kupplungschemie mit beliebigen Peptiden mit freiem C-Terminus conjugiert werden.
Beispiel 3
Herstellung des Copolymergerüsts aus dem geschützten Peptid E4EPR0T und 0,0' -Bis (2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000 (Diamino-PEG-6000; Fluka oder 0,0' -Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400 (Diamino-PEG-3400; Fluka)
In diesem Fall ist in der allgemeinen Formel I
W=Y=NH; X = das verzweigte Peptid E4EPR0T.
In diesem Beispiel stellt ein polyanionisches Peptid X gemäß i) selbst den Effektor dar; daher entfallen Z und E (m = n = 0)
Coolymerisation von E4EPR0T mit 0,0' -Bis (2-aminoethyl) - poly- (ethylenglykol) 6000' (Diamino-PEG-6000, Fluka) (8); HZ
50 μmol E4EPR0T, 1.5 eq. 0, 0' -Bis (2-aminoethyl) - poly (ethylenglykol) 6000', 2 eq.
Dicyclohexylcarbodiimid und 0.25 eq. 4- (Dimethylamino- )pyridin wurden in 10 ml Dichlormethan gelöst. Nach vierstündigem Rühren bei 4°C wurde die Lösung nach Aufkonzentrieren filtriert und das Lösungsmittel vollständig abdestilliert. Der Rückstand wurde in 500 μl Wasser suspendiert und gefriergetrocknet.
Zur Abspaltung der verbliebenen säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen wurde wie in der Literatur beschrieben mit Trifluoressigsäure unter Zusatz von bis zu 5% Scavenger (bevorzugt Ethandithiol, Triethylsilan, Thioanisol) versetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Isolierung des Rohproduktes erfolgte durch Präzipitation aus Diethylether. Die endgültige Reinigung erfolgte wie oben beschrieben mittels Gelfiltration (Superdex75, Pharmacia) .
Fig. 3: zeigt das Reaktionsschema: Die
Benzylschutzgruppe an Carboxylat 1 der C-terminalen Glutaminsäure des vollgeschützten Peptids E4EPR0T wird selektiv mit H2/Palladium auf Aktivkohle abgespalten.
Das Produkt wird unter DCC-Aktivierung mit 0,0' -Bis (2- aminoethyl) poly (ethylenglykol) 6000 oder mit 0,0'-
Bis (2-aminoethyl) poly (ethylenglykol) 3400 copolymerisiert . Im letzten Schritt werden die
Schutzgruppen der N-terminal gelegenen Glutaminsäuren mit TFA in DCM abgespalten. Beispiel 4
KomplementaktivierungsStudien
Der Test wurde im wesentlichen wie in Plank et al., 1996, beschrieben durchgeführt.
a) Polylysin-DNA-Komplexe mit und ohne Copolymer P6INF7
Polylysin (durchschn. Kettenlänge 170; Sigma) - DNA wurde als Stammlösung hergestellt, indem 64 μg pCMVLuc (entspricht pCMVL, beschrieben in der WO 93/07283) in 800 μl HBS zu 256 μg pL in 800 μl HBS gegeben wurden und durch Pipettieren gemixt wurden, dies entspricht einem berechneten Ladungsverhältnis von 6.3. Von dieser Suspension (im folgenden werden die DNA-Polykation- Komplexe auch als „Polyplexe" bezeichnet) , wurden als Positivkontrolle je 50 μl in Spalte 1 A-F einer
96-Kalottenplatte gegeben und mit 100 μl GVB2+-Puffer versetzt. Alle anderen Vertiefungen enthielten 50 μl GVB2+-Puffer. 100 μl wurden von Spalte 1 in Spalte 2 transferiert, gemixt usw. wie in Plank et al. 1996 beschrieben.
Desweiteren wurden je 350 μl der Polylysin-DNA Stammlösung versetzt mit 35, 70 und 105 nmol (bezogen auf Anteil INF7) des Polymers P6INF7 und nach 15 min Inkubation mit GVB+-Puffer auf 1050 μl aufgefüllt. Je 150 μl der resultierenden Suspension wurden auf die Reihen A bis F der Spalte 1 einer 96-Kalottenplatte aufgefüllt. Eine 1.5-fache Verdünnungsreihe in GVB2+- Puffer und der weitere Komplementaktivierungstest wurden wie oben und in Plank et al . 1996 ausgeführt. Die Endkonzentrationen der Komponenten in Spalte 1 sind für DNA 2/3 μg, für pL 8/3 μg und für das Polymer 0, 5, 10, 15 nmol (bezogen auf INF7) pro 200 μl Gesamtvolumen.
b) Komplementaktivierung durch PEI-DNA-Komplexe mit und ohne Copolymerhülle
Der Test wurde wie beschrieben durchgeführt.
PEI (25 kD, Aldrich) - DNA-Komplexe wurden durch Vereinigung gleicher Volumina einer DNA-Lösung (80 μg/ml in 20 mM HEPES pH 7.4) und einer PEI-Lösung (83,4 μg/ml in 20 mM HEPES pH 7.4) hergestellt. Die
DNA-Komplexe wurden zur Entfernung von überschüssigem, ungebundenen PEI drei mal 15 min bei 350 x g in Centricon-100-Filterröhrchen (Millipore) zentrifugiert, wobei zwischen Zentrifugationen jeweils mit in 20 mM HEPES pH 7.4 auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt wurde. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde eine Stammlösung an DNA-Komplex erhalten, die einer DNA-Konzentration von 300 μg/ml entsprach. 182 μl dieser Lösung wurden mit 20 mM HEPES pH 7.4 auf 2520 μl verdünnt. Je 610 μl dieser Lösung (entsprechend je 13,2 μg DNA) wurden zu Lösungen von P6YE5C in je 277,6 μl 20 mM HEPES pH 7.4 pipettiert. Die resultierenden Lösungen wurden mit 5 M NaCl auf eine Salzkonzentration von 150 mM gebracht. Je 150 μl der resultierenden Lösungen wurden in Spalte 1, A bis F, einer 96-Well-Platte transferiert. Die Verdünnungsreihe in GVB2+-Puffer wurde wie beschrieben durchgeführt (Plank et al . 1996) .
Ebenso wurden je 610 μl PEI-DNA-Komplex höherer Konzentration (86 ng DNA pro μl) mit je 277,6 μl von H£
Lösungen des Polymers P3YE5C inkubiert. Die Lösungen enthielten 0, 1, 2 ,3 Ladungsäquivalente bezüglich der eingesetzten DNA an Peptid YE5C. Nach 15 min wurden je 27,45 μl 5 M NaCl zugefügt (resultierendes Gesamtvolumen 915 μl) . Je 150 μl der resultierenden Lösung wurden in Spalte 1, Reihen A bis F einer 96-Kalottenplatte transferiert (dies entspricht jeweils 8.6 μg DNA und 9 μg PEI). Die Verdünnungsreihe in GVB2+ und der weitere Versuchsvorgang wurde wie oben für pL-DNA beschrieben durchgeführt.
Das Ergebnis des Komplementaktivierungstests ist in Fig. 4 dargestellt:
A) Komplementaktivierung durch Polylysin-DNA-Komplexe in Anwesenheit und Abwesenheit des Copolymers P6INF7. Der CH50-Wert bezeichnet eine bestimmte
Serumverdünnung, die zur Lyse von 50 % der Schaferythrozyten in diesem Versuchsaufbau führt. Der Wert CH50max bezeichnet jenen CH50-Wert, der mit unbehandeltem Humanserum erhalten wird. Im beschriebenen Versuchsaufbau wurde Humanserum mit Genvektoren inkubiert. Die CH50-Werte, die mit so behandeltem Serum erhalten werden, sind niedriger als CH50max, wenn die Vektoren die Komplementkaskade aktivieren. Die Daten sind in Prozent von CHSOmax gezeigt. Die starke Komplementaktivierung, die mit
Polylysin-DNA-Komplexen beobachtet wurde, kann durch Hüllpolymer P6INF7 gänzlich unterbunden werden.
B) Das Peptid INF7 selbst, in freier Form oder polymergebunden, ist ein schwacher Komplement- Aktivator. Eingebaut in einen Polylysin-DNA-Komplex verschwindet diese Komplementaktivierung.
C) Komplementaktivierung durch PEI-DNA-Komplexe (N/P = 8) in Gegenwart des Copolymers P3YE5C. Der ungeschützte DNA-Komplex ist ein starker Aktivator des KomplementSystems. Das Copolymer P3YE5C vermindert die Komplementaktivierung in Abhängigkeit von der zugesetzten Menge an Copolymer, führt jedoch im untersuchten Bereich nicht zu vollständigem Schutz.
D) Dagegen schützt Copolymer P6YE5C schon in kleinen zugesetzten Mengen vollständig vor Komplementaktivierung .
Beispiel 5
Erythrozyten-Lyse-Test
Der durchgeführte Test dient zur Untersuchung der Fähigkeit von Peptiden, natürliche Membranen pH-abhängig zu lysieren.
Die in diesem Beispiel verwendeten Erythrozyten wurden wie folgt erhalten: 10 ml frisches Blut wurde von
Freiwilligen entnommen und sofort in 10 ml Alsevers Lösung (Whaley 1985; Plank et al., 1996) aufgenommen. Aliquots von je 3 ml wurden 3 mal mit dem entsprechenden Puffer (je 40 ml Citrat bzw. HBS) gewaschen (nach Pufferzugabe und Schütteln
Zentrifugation bei 2500 x g und Verwerfen des Überstandes) . Die Konzentration der Erythrozyten wurde mit einem "Extinktionskoeffizienten" von 2.394 x 108 ml/Zellen bei 541 nm bestimmt. Zur Herleitung des Extinktionskoeffizienten wurde die Zellzahl in einem Aliquot mit einer Neubauerkammer bestimmt und nachfolgend die Extinktion dieser Lösung nach Zugabe von 1 μl 1 % Triton X-100 bei 541 nm bestimmt.
In einer 96-Kalotten-Platte wurden in Spalte 1 Aliquots von INF7 bzw. copolymergekoppelten INF7 (P3INF7) in 150 μl 10 mM Natriumeitrat pH 5 / 150 mM NaCl bzw. in HBS-Puffer vorgelegt (üblicherweise 45 μmol Peptid) . In allen anderen Vertiefungen wurden je 50 μl Puffer
(Citrat bzw. HBS) vorgelegt. 100 μl wurden mit einer Mehrkanalpipette von Spalte 1 in Spalte 2 transferiert, durch Pipettieren gemixt, 100 μl wurden von Spalte 2 in Spalte 3 transferiert usw. Die übrigen 100 μl aus Spalte 11 wurden verworfen, in Spalte 12 befand sich nur Puffer. Die resultierende 1.5-fache Verdünnungsreihe wurde mit je 50 μl Puffer (Citrat bzw. HBS) auf 100 μl aufgefüllt. Daraufhin wurden je 3 x 106 humane Erythrozyten zugegeben, die Platten mit Parafilm abgedeckt und bei 400 rpm in einem Schüttelinkubator (Series 25 Incubator Shaker; New Brunswick Scientific Co.; NJ, USA) bei 37 °C für 1 h geschüttelt. Daraufhin wurden die Platten bei 2500 x g zentrifugiert, je 150 μl Überstand in eine Flachboden-96-Kalottenplatte transferiert und freigesetztes Hämoglobin bei 410 nm mit einem ELISA-Plate-Reader gemessen. 100 % Lyse wurde durch Zugabe von 1 μl 1 % Triton X-100 in einzelne Vertiefungen aus Spalte 12 (vor Transferieren in die Flachbodenplatte) bestimmt, 0 % Lyse wurde aus unbehandelten Proben aus Spalte 12 bestimmt. Das Ergebnis des Erythrozyten-Lyse-Tests ist in Fig. 5 dargestellt: Peptid INF7 zeigte hohe pH-spezifische Aktivität. Aus der Synthese des Copolymers P3INF7 wurden nach chromatographischer Auftrennung (Superdex 75, Pharmacia) vier Fraktionen (abnehmendes
Molekulargewicht von 1 bis 4) gewonnen. Von diesen zeigten Fraktionen 2 und 3 gegenüber freiem Peptid INF7 höhere Lyseaktivität . In allen Fällen war die Aktivität streng pH-abhängig, d.h. keine Lyse bei neutralem pH (nicht gezeigt) .
Beispiel 6
Größenbestimmung von DNA-Komplexen mittels dynamischer Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie
Herstellung von PEI-DNA Polyplexen und Aufbringen der Polymerhülle: Je 40 μg DNA (pCMVLuc) in 333 μl 20 mM HEPES pH 7.4 wurden zu 41.7 μg PEI (25 kD, Aldrich) in 333 μl HEPES pH 7.4 pipettiert und gemixt. Nach 10 - 15 min Inkubation wurden 0, 0.5, 1, 1.5, 2 oder 3 Ladungsäquivalente (bezüglich der Ladung der eingesetzten DNA) an Polymeren P3YE5C bzw. P6YE5C in je 333 μl HEPES zugesetzt (bzw. 0, 1, 2, 3 und 5 Äquivalente in einem zweiten Experiment) . Dies entspricht einer Menge bezogen auf das Peptid YE5C von 0, 152, 303, 455, 606 oder 909 pmol an Polymer pro μg DNA. DOTAP/Cholesterin-DNA-Komplexe wurden aus DOTAP/Cholesterin (1:1 mol/mol) -Liposo en in 330 μl 20 mM HEPES pH 7.4 und DNA im selben Volumen bei einem Ladungsverhältnis von 5 hergestellt. Die Lipoplexe wurden mit 0, 1, 2, 3 und 5 Äquivalenten des Copolymers P3YE5C in 330 μl Puffer inkubiert. Die endgültige DNA-Konzentration des Komplexes war 10 μg/ml.
Die Größe der DNA-Komplexe wurde einerseits durch dynamische Lichtstreuung (Zetamaster 3000, Malvern Instruments) sofort nach Polymerzugabe und dann zu verschiedenen Zeitpunkten über mehrere Stunden hinweg bestimmt, andererseits durch Elektronenmikroskopie wie in Erbacher et al., 1998, und Erbacher et al., 1999, beschrieben.
Fig. 6 zeigt die elektronenmikroskopischen Aufnahmen von PEI-DNA-Komplexen (N/P = 8) in Gegenwart des Copolymers P3YE5C.
A) In Gegenwart eines Ladungsäquivalents (bezüglich der Ladungen der eingesetzten DNA) des Copolymers. Die Partikelgröße beträgt 20 bis 30 nm.
B) In Gegenwart von zwei Ladungsäquivalenten des Copolymers. Die Mehrzahl der Partikel weist Größen um 20 nm auf. Dies sind monomolekulare DNA-Komplexe, d.h. ein Plasmidmolekül verpackt in ein Partikel.
C) In Gegenwart von 1,5 Ladungsäquivalenten des
Copolymers nach Zugabe von BSA zu einer
Endkonzentration von 1 mg/ml und Inkubation über Nacht.
Copolymergeschützte DNA-Komplexe bleiben stabil und aggregieren nicht, im Gegensatz zu ungeschützten PEI-DNA-Komplexen, die unter diesen Bedingungen sofort präzipitieren (nicht gezeigt) . SO
Beispiel 7
Bestimmung des Zetapotentials von DNA-Komplexen
An den gleichen Proben wie in Beispiel 6 wurden die Zetapotentiale mit dem Gerät von Malvern bestimmt, wobei die Parameter Brechungsindex, Viskosität und Dielektrizitätskonstante auf die Werte von deionisiertem Wasser eingestellt wurden, was nur näherungsweise gelten kann.
Fig. 7A zeigt das Zetapotential von PEI- und DOTAP/Cholesterin-DNA-Komplexen in Abhängigkeit von der Menge zugesetzten Copolymers P3YE5C. Das Zetapotential als Maß für die Oberflächenladung der Komplexe nimmt von stark positiv über neutral zu leicht negativ mit steigender Menge zugesetzten Copolymers ab. Dies zeigt, daß das Copolymer an die DNA-Komplexe bindet und deren elektrostatische Ladung ausgleicht bzw. abschirmt.
Fig. 7B zeigt das Zetapotential von gereinigten PEI-DNA-Komplexen. Die Abtrennung von überschüssigem PEI erfolgte wie in Beispiel 4B beschrieben. Aus der PEI-DNA-Stammlösung, die aus der Aufreinigung resultierte, wurden Aliquote entnommen, die einer DNA-Menge von je 40 μg entsprachen, und mit 20 mM HEPES pH 7.4 auf je 666 μl aufgefüllt. Die resultierenden PEI-DNA-Suspensionen wurden mit Lösungen von P3YE5C in je 333μl 20 mM HEPES pH 7.4 vereinigt und durch Pipettieren gemischt. Die Lösungen von P3YE5C enthielten Polymermengen entsprechend 1, 2, 3 und 5 Ladungsäquivalenten relativ zur eingesetzten DNA-Menge. Die Zetapotentiale wurden wie in Beispiel 7A beschrieben bestimmt. Beispiel 8
Herstellung von DNA-Komplexen und Transfektionen
Für die in den nachfolgenden Beispielen durchgeführten Zellkultur- und Transfektionsexperimente wurden, wenn nich anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet:
a) Gentransfer in Zellkultur in einer 96-Well Platte
Adhärente Zellen werden am Tag vor der Transfektion in Flachboden-Platten zu 20.000 - 30.000 Zellen pro
Vertiefung ausgesät (je nach Teilungsrate der Zellen. Während der Transfektion sollte die Konfluenz etwa 70 - 80 % sein) .
Vor der Transfektion wird Medium abgesaugt. Zur Transfektion gibt man 150 μl Medium auf die Zellen und gibt dann 50 μl DNA-Komplexe zu.
b) Zusammensetzung der DNA-Komplexe: Vorzugsweise 1 μg DNA/well Endkonzentration; Berechnung für 1.2-fache Menge; 20 μl Volumen pro Komponente (DNA, PEI, Polymer) . Schließlich werden 50 μl DNA-Komplex für die Transfektion verwendet. Puffer: 20 mM HEPES pH 7.4/ 150 mM NaCl = HBS. Die verwendeten Volumina an Puffer bleiben gleich.
Für den Fall, daß man DNA-Komplexe für 96 Einzelversuche benötigt, führt man die Berechung zweckmäßig so durch, als würde man 100 Einzelversuche durchführen: z.B. DNA: 1 μg x 100 x 1.2 = 120 μg in 20 x 100 μl HBS = 2 ml Gesamtvolumen.
Polyethylenimin (PEI) : Um ein N/P-Verhältnis von 8 zu erzielen berechnet man gemäß der Formel
w/, Bϊ£S-x 30
43 (μgDNÄ)
(μgPEΪ) 330 * " 43 (120) '
daß man 125.09 μg PEI benötigt und zwar in 20 x 100 μl = 2 ml HBS.
Hüllpolymer: Will man z.B. für die angegebene Menge DNA und PEI Hüllpolymer in einer Menge von
2 Ladungsäquivaltenten (bezüglich DNA) einsetzen so berechnet sich nach der Formel
μl (Hüllpol.) =1000 xÜ£-^Öx Ladungsäqu. μ ' 330 c (Hüllpol. [μmol/ml])
das benötigte Volumen an Hüllpolymer bei einer Konzentration c von 11.1 μmol / ml als
μl (Hüllpol.) =1000 x— x — = 65.5 μl , μ } 330 11.1
die ebenfalls auf 2 ml mit HBS aufgefüllt werden.
Dies ist ein Beispiel für 100 Versuche zu je 1 μg DNA. Üblicherweise werden etwa je 5 Versuche durchgeführt und z.B. N/P-Verhältnisse von 4, 5, 6, 7, 8 mit jeweils 0, 1, 2, 3 Ladungsäquivalenten Hüllpolymer untersucht. c) Mischen der DNA-Komplexe:
Nach Herstellung der benötigten Vorverdünnungen wird DNA unter Vortexen zu PEI gegeben. Nach 15 min wird wiederum unter Vortexen Hüllpolymer zum vorgefertigten PEI-DNA-Komplex gegeben. Nach weiteren 30 min werden je 50 μl DNA-Komplexe zu den Zellen gegeben, die sich in je 150 μl Medium befinden.
Die verwendeten Gefäße richten sich nach dem berechneten Gesamtvolumen. Im obigen Fall wird PEI zweckmäßig in einem 14 ml Polypropylen-Röhrchen (z.B. Falcon 2059) vorgelegt, die anderen beiden Komponenten in 6 ml-Röhrchen (z.B. Falcon 2063). Für Einzelversuche im 96-Well-Plate kann man die Komponenten auch in einer 96-Well-Platte anmischen. Wenn das endgültige Gesamtvolumen der DNA-Komplexe 1 - 1.5 ml beträgt, eignen sich Eppendorf-Tubes . Zum Mischen kann statt Vortexen mit der Mikropipette auf- und abpipettiert werden.
Umrechnung auf 3 cm-Schalen (6-well plate) :
Für 3 cm-Schalen (6-well plate) werden zweckmäßig
Mengen von 2 bis 5 μg DNA, Volumen je Komponente etwa je 100 μl eingesetzt, wobei die Berechnung analog zu oben erfolgt. Im 12-well plate werden zweckmäßig Mengen von ca. 1 μg DNA je Versuch eingesetzt.
Fig. 8 zeigt schematisch die Formulierung von
DNA-Komplexen: Bevorzugt wird zuerst Polykation mit Plasmid-DNA inkubiert, was zu einem positiv geladenen DNA-Komplex führt (z.B. PEI, N/P = 8) . Dann wird negativ geladenes Copolymer zugesetzt, das elektrostatisch an den vorgeformten Komplex bindet. Das Copolymer kann mit Rezeptorliganden modifiziert sein, symbolisiert durch Sterne (rechts) .
d) Luciferin-Substratpuffer
Als Luciferin-Substratpuffer wurde eine Mischung von
60 mM Dithiothreitol, 10 mM Magnesiumsulfat, 1 mM ATP, 30 μM D (-) -Luciferin, in 25 mM Glycyl-Glycin-Puffer pH 7.8, verwendet.
e) Proteinbestimmung in Zellysaten
Den Proteingehalt der Lysate bestimmte man mit dem Bio- Rad Protein Assay (Fa. Bio-Ra) : Zu 10 μl (bzw. 5 μl) des Lysats wurden 150 μl (bzw. 155 μl) dest. Wasser und 40 μl Bio-Rad Protein Assay Farbstoff-Konzentrat in eine Vertiefung einer durchsichtigen 96-Kalotten-Platte (Typ „flat botto " , Fa. Nunc, Dänemark) gegeben und bei 630 nm mit dem Absorbance-Reader „Biolumin 690" und dem Computer-Programm „Xperiment" (beide Fa. Molecular Dynamics, USA) die Absorption gemessen. Als Eichkurve wurden Konzentrationen von 50, 33.3, 22.3, 15, 9.9, 6.6, 4.4, 2.9, 2.0, 1.3, 0.9 und 0 ng BSA / μl vermessen. Bovines Serum Albumin (BSA) wurde als Bio-Rad Protein Assay Standard II gekauft. Somit konnte insgesamt eine Angabe in pg Luciferase pro mg Protein gemacht werden. Beispiel 9
Gentransfer in K562-Zellen mit PEI (25 kD) -DNA-Komplexen in Gegenwart und Abwesenheit des Copolymers P3YE5C
K562-Zellen (ATCC CCL 243) wurden in RPMI-1640-Medium unter Zusatz von 10 % FCS, 100 units/ l Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % C02 kultiviert. Die Zellen wurden am Abend vor der Transfektion mit Desferoxamin zu einer Endkonzentration von 10 μM versetzt. Unmittelbar vor der Transfektion wurde das Medium gewechselt. Je 50.000 Zellen in je 160 μl Medium wurden in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte ausgebracht.
Transferrin-PEI (hTf-PEI 25 kD) wurde im wesentlichen wie von Kircheis et al. beschrieben (Kircheis et al., 1997) durch reduktive Aminierung hergestellt. Es wurde ein Produkt erhalten, das durchschnittlich 1.7 Transferrinmoleküle pro PEI-Molekül gekoppelt hat.
In einem Vorversuch wurde eine Zusammensetzung von hTf-PEI-Polyplexen bestimmt, die hohe Transfektion ergibt und bei der ein deutlicher Einfluß des Rezeptorliganden feststellbar ist.
32.4 μg hTf-PEI (Mengenangabe bezieht sich auf hTf) in 600 μl HBS wurden mit 36 μg PEI (25kD) in 600 μl HBS vereinigt. Zu dieser Mischung wurden 40 μg DNA (pCMVLuc) in 600 μl HBS pipettiert und gemischt. Je 270 μl der resultierenden Lösung wurden nach 15 min zu je 90 μl von Lösungen des Polymers P3YE5C in HBS bzw. HBS alleine gegeben. Diese Lösungen enthielten Polymermengen, die 0/0.5/1/1.5/2/3 Ladungsäquivalenten bezüglich der Ladung der eingesetzten DNA enthielten. Gleichermaßen wurden DNA-Komplexe ohne hTf mit der äquivalenten Menge PEI hergestellt (40 μg DNA + 42 μg PEI + Hüllpolymer) . Je 60 μl der resultierenden Mischungen (entspricht einer Menge von je 1 μg DNA / well) wurden in je
5 Vertiefungen einer Rundboden-96-Well-Platte vorgelegt und 50.000 K562 in je 160 μl RPMI-Medium wurden zugegeben. Nach 24 h wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, der Überstand durch Aspiration entfernt und je 100 μl Lysepuffer (250 mM
Tris pH 7.8; 0.1 % Triton X-100) wurden zugegeben. Nach 15 min Inkubation wurde durch Pipettieren gemischt und je 10 μl Probe wurden zum Luciferasetest im 96-well- plate-Format in eine schwarze Platte (Costar) transferiert und mit je 100 μl Luciferin-Substrat-Puffer versetzt. Die Messung der resultierenden Lichtemission erfolgte mittels Microplate Scintillation & Luminescence counter „Top Count" (Fa. Canberra-Packard, Dreieich). Die Meßzeit betrug 12 Sekunden, die Meßverzögerung war 10 min. und Hintergrund-Werte wurden automatisch abgezogen. Als Standard wurden je 100, 50, 25, 12.6, 6.25, 3.13, 1.57, 0.78, 0.39, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.013, 0.007 und 0 ng Luciferase (Boehringer Mannheim) in je 10 μl Lysepuffer (= 2-fache Verdünnungsserie) unter gleichen Bedingungen gemessen und daraus eine Eichkurve erstellt.
Fig. 9 zeigt das Ergebnis der Gentransferexperimente mit PEI-DNA-Komplexen (N/P = 8) in K562-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von Transferrin als Rezeptorligand unter Zusatz des Copolymers P3YE5C. Das Copolymer interferiert nicht mit Gentransfer und steigert diesen sogar, wenn ein Rezeptorligand im DNA-Komplex vorhanden ist. Gezeigt ist die Expression des Reportergens Luciferase bezogen auf die Menge Gesamtprotein im Zellextrakt (Mittelwerte und Standardabweichungen aus Triplikaten) .
Beispiel 10
a) Transfektion der Brustkrebszellinie MDA-MB435S mit Polylysin-DNA-Komplexen in Gegenwart und Abwesenheit des Hüllpolymers P3INF7
MDA-MB435S Zellen (ATCC 45526; humane Brustkrebszellinie) wurden in DMEM-Medium unter Zusatz von 10 % FCS, 100 units/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamine bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % C02 kultiviert . Am Abend vor der Transfektion wurden die Zellen zu 20.000 Zellen pro
Vertiefung in 96-Well-Platten (Flachboden) ausgebracht.
Die DNA-Komplexe wurden wie folgt hergestellt:
Berechnung für 1 Well: Zu erzielende Menge ist 1 μg DNA pro Well, 4 μg pLl70 in einem Gesamtvolumen von 60 μl HBS. Diese Mengen wurden mit 1.2 multipliziert. Die
DNA-Komplexe wurden wie in folgender Tabelle angegeben gemixt, wobei zuerst DNA zu Polylysin gegeben wurde und dies wiederum nach 15 min zu Polymer P3INF7 bzw. zum Puffer. Die Versuche wurden in Triplikaten ausgeführt. Je 60 μl DNA-Komplexe wurden zu Zellen, bedeckt von 150 μl Medium gegeben. Nach 4 h wurde Medium gewechselt, nach 24 h wurde nach Waschen mit PBS und Zugabe von 100 μl Lysepuffer der Luciferasetest und der Proteintest wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt. ;Q
Fig. 10A zeigt das Ergebnis der Gentransferexperimente mit Polylysin-DNA-Komplexen in die humane Brustkrebszellinie MDA-MB435S in Gegenwart und Abwesenheit des Copolymers P3INF7. In Abwesenheit des Copolymers tritt keine meßbare Reportergenexpression auf. Die pH-abhängig membranzerstörende und somit endosomolytische Aktivität des Copolymers bewirkt effizienten Gentransfer. 5 nmol bzw. 10 nmol P3INF7 beziehen sich auf die Menge des eingesetzten, polymergebundenen Peptids INF7.
b) Transfektion der Brustkrebszellinie MDA-MB435S mit Polylysin-DNA-Komplexen in Gegenwart und Abwesenheit des Hüllpolymers P3INF7
In einer weiteren Versuchsserie mit MDA-MB435S Zellen wurde die Effizienz der Transfektion mittels DNA- Polylysin-Komplexen in Gegenwart und Abwesenheit des Hüllpolymers P3INF7 bei verschiedenen Ladungsverhältnissen pL/DNA untersucht. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 10B dargestellt. Beispiel 11
Lipofection in Gegenwart von Hüllpolymeren (Fig. 11)
NIH3T3-Zellen (ATCC CRL 1658) wurden in DMEM-Medium unter Zusatz von 10 % FCS, 100 units/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamine bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % C02 kultiviert.
Am Abend vor der Transfektion in 6-Well-Plates in einer Dichte von 500.000 Zellen pro Vertiefung ausgebracht.
Herstellung von DNA-Komplexen:
16 μg DNA in 240 μl 20 mM HEPES pH 7.4 wurden mit einer Lösung von 242 nmol DOTAP/Cholesterin-Liposomen in 240 μl des gleichen Puffers versetzt. Dies ergibt ein Ladungsverhältnis (V-) von 5. 210 μl der resultierenden Lösung wurden zu 105 μl einer Lösung pipettiert, die
6,36 nmol des Polymers P3YE5C enthielt (bezogen auf den Peptidanteil YE5C; dies entspricht 3 DNA- Ladungsäquivalenten) . Für den Kontrollversuch wurden 210 μl DOTAP/Cholesterin-DNA zu 105 μl 20 mM HEPES pH 7.4 pipettiert. Je 90 μl der resultierenden
DNA-Komplexe wurden den Zellen zugegeben, die sich in 800 μl frischem Medium befanden; dies entspricht 2 μg DNA pro Vertiefung. Die Versuche wurden in Triplikaten ausgeführt.
Gleichermaßen wurde der Versuch mit Lipofectamine™ anstatt DOTAP/Cholesterin durchgeführt. In diesem Falle wurde eine Menge von Lipofectamin (DOSPA) eingesetzt, die zu einem Ladungsverhältnis von 7 (V-) führt. La 30 min nach Zugabe der DNA-Komplexe wurden den Zellen je 1 ml frisches Medium zugefügt, nach 3 h weitere 2 ml. Das Medium wurde nicht gewechselt. 22 h nach Komplex-Zugabe wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 500 μl Lysepuffer lysiert. Aliquots des Zellysats wurden im Luciferasetest und zur Proteinbestimmung eingesetzt .
Fig. 11 zeigt das Ergebnis der Lipofection in NIH3T3- Zellen in Gegenwart und Abwesenheit des Copolymers P3YE5C. Weder die Transfektion mit DOTAP/Cholesterin- DNA noch jene mit Lipofectamin wird signifikant erniedrigt (3 Ladungsäquivalente des Copolymers; DOTAP/Cholesterin-DNA hat bei dieser Zusammensetzung ein neutrales Zetapotential, s. Fig. 7A) .
Beispiel 12
a) Transfektion von HepG2-Zellen mit DOTAP/Cholesterin- DNA und PEI-DNA in Gegenwart und Abwesenheit von P6YE5C
HepG2-Zellen (ATCC HB 8065) wurden in DMEM-Medium unter Zusatz von 10 % FCS, 100 units/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % C02 kultiviert.
Zwei Tage vor der Transfektion wurden die Zellen in 6-Well-Plates in einer Dichte von 500.000 Zellen pro Vertiefung ausgebracht. Die Transfektion mit
DOTAP/Cholesterin erfolgte exakt, wie oben für NIH3T3- Zellen beschrieben, wobei diesmal Polymer P6YE5C verwendet wurde. Weiters wurden 7 μg DNA in 105 μl HEPES-Puffer zu 7,3 μg PEI 25 kD gelöst im gleichen Lι
Volumen pipettiert. Nach 15 min Inkubation wurde diese Lösung zu 105 μl einer Lösung des Polymers P6YE5C pipettiert, die 3 DNA-Ladungsäquivalente PYE5C enthielt. Je 90 μl dieser Lösung wurden den Zellen zugegeben. Die Versuche wurden in Triplikaten ausgeführt .
Fig. 12 zeigt den Gentransfer in HepG2-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit des Copolymers P6YE5C (in der Fig. als P6 bezeichnet) . Transfektion durch DOTAP/Cholesterin-DNA wird nicht signifikant inhibiert. Die Transfektion durch PEI-DNA-Komplexe wird erniedrigt (3 Ladungsäquivalente des Copolymers) .
Beispiel 13
Transfektion von HepG2-Zellen mit PEI-DNA-Komplexen in Gegenwart von verschiedenen Mengen P3YE5C oder P6YE5C bei verschiedenen Ladungsverhältnissen
Die Komplexe wurden in 20mM HEPES pH 7.4 hergestellt, wie in Beispiel 14 angegeben, wobei ungerereinigte Komplexe verwendet und vor Zugabe auf die Zellen auf eine Konzentration von 5 % Glukose eingestellt wurde. Die Versuche, deren Ergebnis in Fig. 13 dargestellt ist, wurden dreifach durchgeführt, die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Es zeigte sich, dass die Hüllcopolymeren mit höherem Ladungsverhältnis die Transfektionseffizienz verstärken. Beispiel 14
Transfektionen von K-562-, HepG2- und NIH3T3-Zellen
Die DNA-PEI-Komplexe wurden wie folgt hergestellt: Die Polyplexe (N/P=8) wurden als Stammlösungen in 20 mM HEPES pH 7,4 hergestellt, wobei jede Komponente (DNA, Polykation, Copolymer) in einem gleichen Volumen dispergiert wurde, so dass eine Endkonzentration von 1 μg DNA pro 50 μl erzielt wurde, was der in jede Vertiefung auf die Zellen aufgebrachte Menge entsprach (im Fall der gereinigten Komplexe wurden ebenfalls gleiche Mengen von DNA-Komplex in dem selben Volumen sowie Puffer beigegeben) . Zuerst wurde die DNA unter mildem Vortexen oder Mischen mit einer Pipette dem Polykation beigegeben, nach 15 min wurden die Copolymeren P3YE5C oder P6YE5C hinzugefügt; nach weiteren 30 min oder mehr wurden die Komplexe auf die Zellen aufgegeben. Im Falle der Verwendung gereinigter Komplexe wurde die Reinigung wie folgt vorgenommen: Stammlösungen von PEI-DNA-Komplexen (N/P=8; 100 μg DNA pro ml in 20 mM HEPES pH 7,4) wurden durch Centricon- 100-Membranen (Millipore) 4 x 15 min bei 500 g auf einem Beckman JA-20 Rotor mit fixem Winkel zentrifugiert . Zwischen den Zentrifugationen wurden die Lösungen wieder auf die ursprünglichen Konzentrationen verdünnt. Es wurde darauf geachtet, dass eine DNA- Konzentration von 500 μg pro ml nicht überschritten wurde. Die letzte Zentrifugation lieferte Komplexe von 300 - 500 μg DNA pro ml. Die DNA-Konzentration wurde aufgrund ihrer Absorption bei 260 nm bestimmt (1 OD260 = 0.45 μg pro ml für dsDNA in einem PEI-DNA-Komplex, bestimmt von einer Standardverdünnung eines DNA- Komplexes mit bekanntem DNA-Gehalt) . Die Menge an freiem, nicht DNA-assoziiertem PEI wurde in den vereinigten Filtraten mittels Trinitrobenzosulfonsäure- Assay (Snyder und Sobocinski, 1975) bestimmt.
Fig. 14 zeigt die Abhängigkeit der
Transfektionseffizienz von der Menge an P3YE5C und P6YE5C, von der Komplexreinigung durch Ultrafiltration (ungereinigt: gefüllte Balken; gereinigt: schraffierte Balken) und von der Anwesenheit von Salz während oder nach (für die gereinigten Komplexe) der Komplexbildung (schwarze Balken: 150 mM NaCl; graue Balken: kein Salz) . (A) : K562-Zellen; (B) : HepG2-Zellen; (C) : NIH-3T3-Zellen.
Beispiel 15
Intravenöser Gentransfer in vivo
a) Kontrolle (PEI-DNA, N/P = 8):
150 μg DNA (pCLuc) in 337.5 μl 20 mM HEPES pH 7.4 wurden zu 156.4 μl PEI (25 kD, Aldrich) im gleichen Volumen HEPES-Puffer pipettiert. Nach 15 min wurden
75 μl 50 % Glucose zugegeben. Von dieser Lösung wurden je 100 μl in die Schwanzvene von Mäusen injiziert (entsprechend einer Dosis von 20 μg DNA pro Tier) .
b) Kontrolle (DOTAP/Cholesterin-DNA; Ladungsverhältnis +/_ = 5) :
DOTAP-Cholesterin-Liposo en wurden nach Standardvorschrift hergestellt (Barron et al., 1998). In diesem Fall wurden Liposomen mit einem molaren Verhältnis DOTAP zu Cholesterin von 1:1 hergestellt und einer Endkonzentration von DOTAP von 5 mM in 5 % Glucose. 130 μg DNA in 91.1 μl 20 mM HEPES pH 7.4 wurden zu 393.5 μl Liposomensuspension gegeben. Nach 15 min wurden 65 μl 50 % Glucose zugegeben. Von dieser Lösung wurden je 100 μl in die Schwanzvene von Mäusen injiziert (entsprechend einer Dosis von 20 μg DNA pro Tier) .
c) PEI-DNA (N/P = 8) mit Copolymerhülle :
150 μg DNA in 2475 μl wurden zu 156.4 μg PEI (25 kD) im gleichen Volumen unter Vortexen zugegeben. Nach 15 min wurden 3 Ladungsäquivalente (bezüglich der Ladungen der eingesetzten DNA-Menge) an Polymer P3YE5C in 2475 μl HEPES-Puffer unter Vortexen zugegeben. Nach weiteren 30 min wurden die DNA-Komplexe durch Zentrifugation in Centricon 30-Röhrchen auf eine DNA-Konzentration von 454 μg/ml aufkonzentriert . Diese Lösung wurde dann unter Zugabe von 50 % Glucose und 20 mM HEPES pH 7.4 auf eine Endkonzentration von 200 μg DNA pro ml und 5 % Glucose gebracht. Von dieser Lösung wurden je 100 μl in die Schwanzvene von Mäusen injiziert (entsprechend einer Dosis von 20 μg DNA pro Tier) .
d) DOTAP/Cholesterin-DNA (5:1) mit Copolymerhülle: 393.9 μl Liposomensuspension wurden direkt zu einer Lösung von 130 μg DNA in 65.3 μl Wasser pipettiert. Nach 15 min wurden 3 Ladungsäquivalente P3YE5C in 216.9 μl HEPES-Puffer zugegeben und nach weiteren 30 min 75 μl 5 % Glucose. Von dieser Lösung wurden je 115.5 μl in die Schwanzvene von Mäusen injiziert (entsprechend einer Dosis von 20 μg DNA pro Tier) . G
Fig. 15 zeigt das Ergebnis der in vivo Gentransferexperimente: PEI-DNA- bzw.
DOTAP/Cholesterin-DNA-Komplexe mit oder ohne gebundenes Copolymer P3YE5C (3 Ladungsäquivalente) wurden in die Schwanzvene von Mäusen injiziert (n = 6) . Die Tiere wurden 24 h nach Injektion geopfert, und die Reportergenexpression in Organen wurde bestimmt. Die höchste Aktivität wurde jeweils an der Injektionsstelle gemessen, mit PEI-DNA-Copolymer trat signifikante Reportergenexpression in Lunge und Herz auf, während Gentransfer in die Lunge durch DOTAP/Cholesterin-DNA bei Anwendung des Copolymers inhibiert wurde.
Beispiel 16
Sterische Stabilisierung von PEI-DNA-Komplexen
PEI-DNA-Komplexe wurden exakt wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt (PEI-DNA, N/P = 8, 0/1,5/3 Ladungsäquivalente Copolymer P3YE5C bzw. P6YE5C) . Die Größe der Komplexe wurde mittels dynamischer Lichtstreuung bestimmt und betrug 20 bis 30 nm.
Daraufhin wurde 5 M NaCl zu einer Endkonzentration von 150 mM zugegeben. PEI-DNA ohne Copolymer aggregierte sofort (nach 5 min war eine Population von Partikeln >500 nm zu messen; nach 15 min war die Mehrzahl der Partikel >1000 nm; über Nacht fielen die Komplexe aus der Lösung aus) . In Gegenwart von P3YE5C bzw. P6YE5C (1,5 oder 3 Ladungsäquivalente) blieb die Partikelgröße zumindest über 3 Tage stabil. Ebenso führte die Zugabe von BSA zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zu sofortiger Präzipitation von PEI-DNA. In Gegenwart von P3YE5C bzw. P6YE5C (1,5 Ladungsäquivalente und mehr) bleibt die Partikelgröße zumindest über 24 h konstant (siehe auch Fig. 6) .
Beispiel 17
Gentransferstudien mit copolymer-geschützten PEI-DNA- Vektoren in vivo
a) P3YE5C-PEI-DNA in einem T-Zell-Lymphommodell in DBA2-Mäusen
200.000 Tumorzellen wurden den Mäusen (Alter 5 Wochen) intradermal an Tag 0 injiziert, wie beschrieben (Kruger et al. 1994) . An Tag 21 wurde den Tieren über die Schwanzvene je 200 μl DNA-Komplex, je 50 μg DNA (p55pCMV-IVS-luc+, zur Verfügung gestellt von Dr. Andrew Baker, Bayer Corp., USA. ) enthaltend, injiziert.
DNA-Komplexe: DNA (250 μg in 700 μl 20 mM HEPES pH7.4) wurde mit PEI (260.6 μg in 700 μl des gleichen Puffers) durch Pipettieren gemischt. Nach 15 min Inkubation wurden die DNA-Komplexe zu 400 μl Hüllpolymerlösung pipettiert, die 5 Ladungsäquivalente P3YE5C enthielt. Nach weiteren 15 min Inkubation wurden 200 μl 50 % Glucose (in Wasser) zugesetzt. Die Komplexe wurden mittels Ultrafiltration wie in Beispiel 4b beschrieben von überschüssigem PEI gereinigt. Die Vektorsuspension wurde schließlich auf ein Volumen von 1 ml mit 20 mM L-n
I
HEPES aufgefüllt. Je 200 μl wurde den Versuchstieren über die Schwanzvene injiziert. Nach 24 Stunden wurden die Tiere geopfert und die Reportergenexpression in den Organen bestimmt: Die Tiere wurden mittels einer intraperitonealen Injektion von 100 mg Ketamin und 5 mg Xylazin pro kg Körpergewicht in Vollnarkose gelegt. Daraufhin wurde die Bauchhöhle geöffnet und über die Vena cava caudalis mit 20 ml isotonischer Natriumchloridlösung perfundiert. Die Organe wurden in 2 ml-Schraubverschlußröhrchen übertragen, die 500 μl Lysepuffer (0.1 % Triton X-100 in 250 mM Tris-HCl pH 7.8) und Zirkonium-Beads (2.5 mm Durchmesser; Biospec Products, Bartlesville, USA) enthielten. Die Gewebeproben wurden 2 x 20 sec mit einem Mini-Bead- Beater (Biospec Products) homogenisiert. Je 50 μl
Gewebehomogenisat wurden im Luciferasetest eingesetzt (Promega Luciferase Assay Kit) ; das Ergebnis ist in Fig. 16 dargestellt.
b) P6YE5C-PEI-DNA in DBA2-Mäusen:
DNA-Komplexe: Je 350 μg DNA in 420 μl 20 mM HEPES pH 7.4 wurden mit je 364 μg PEI im gleichen Volumen des gleichen Puffers vermischt. Nach 5 min. Inkubation wurden entweder 420 μl 20 mM HEPES oder 3 Ladungsäquivalente P6YE5C in 420 μl 20 mM HEPES pH 7.4 zugesetzt und gemischt. Schlussendlich wurden 140 μl
50 % Glucose in Wasser zugesetzt. Je 200 μl (entspricht 50 μg DNA) wurden den Tieren (Alter: 5 Wochen) über die Schwanzvene injiziert. Die Auswertung der Versuche erfolgte wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass diesmal 750 μl Lysepuffer aus dem Promega Luciferase Assay Kit zur Homogenisation der Organe verwendet wurden und dass für den Luciferasetest je 20 μl
Gewebehomogenisat verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Fig. 17 dargestellt.
Beispiel 18
P6YE5C verstärkt den Transport von DNA-PEI-Komplexen in den Tumor (Tumor-Targeting)
Zunächst wurden Tumore gesetzt, indem lxlO6 murine Melanom M3 Zellen (ATCC No . CCL 53.1) in 100 μl Ringer' s Lösung subkutan in DBA/2Mäuse gesetzt wurden.
Zur Herstellung der Polyplexe wurden 50μg pCMVLuc DNA mit PEI (25) (N/P =6) in 0.5 x HBS komplexiert. Die Komplexe wurden dann bei Raumtemperatur 20 min inkubiert. Im Falle der Verwendung von Hüll-Copolymer wurden 3 Äquivalente P6YE5C zugegeben, unter Anwendung der Formel:
Menge P6YE5C (μl)= [1000* (μg of DNA) *Ladungsäquivalent von P6YE5C] /330*19.3; wobei das Ladungsäquivalent das oben definierte (3) und 19.3 die Konzentration in mM der verwendeten Lösung von P6YE5C ist.
Vor der Verabreichung der Komplexe wurden 2.5% Glucose zugefügt, um für die Injektion in vivo eine isotonische Lösung bereitzustellen.
20 Tage nach Tumorsetzung - die Tumore hatten zu diesem Zeitpunkt eine durchschnittliche Größe von 15mm x 15mm - wurden die Mäuse behandelt. Jeweils 250μl Polyplexe pro Maus wurden streng i.v.(in die laterale Schwanzvene) injiziert. Es wurden zwei Gruppen, bestehend aus 3 Mäusen, behandelt, wobei die erste Gruppe ungeschützte DNA-PEI-Komplexe verabreicht erhielt und die zweite Gruppe Komplexe, umhüllt mit P6YE5C.
Nach 24 Stunden wurden die Tiere euthanasiert und die Organe (Leber, Milz, Nieren, Herz und Lunge) sowie der jeweilige Tumor entnommen. Die weitere Behandlung der Organe wurde sowie die Messung der Luciferaseaktivität wurde vorgenommen, , wie in den vorigen Beispielen beschrieben; das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 18 dargestellt.
Beispiel 19
Biosensorstudien der Interaktion von PEI-DNA-Komplexen und humanen Serumbestandteilen
Um die Interaktion von DNA-Komplexen und humanen Serumbestandteilen zu untersuchen, wurden Oberflächenplasmonen-Resonanz-Messungen durchgeführt (BIAcore, Uppsala, Schweden) . Humanes Komplementserum (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) wurde nach den
Vorschriften des Herstellers gelöst und kovalent an einen "Research Grade" Sensor-Chip (CM5) , dem Standardprotokoll folgend, gekoppelt { Johnsson et al . 1991 ) . Dabei wurde nach N- (3-Dimethylaminopropyl) -N' - ethyl-carbodiimid / N-Hydroxysuccinimid-Aktivierung der Carboxylatgruppen am Sensorchip eine Serumverdünnung (100 μg/ml in 10 mM Natriumacetat pH 4) automatisch auf den Chip aufgebracht. Unreagierte N- Hydroxysuccinimidester wurden mit 1 M Ethanolamin, pH 8.5 in Wasser inaktiviert. Die
Immobilisierungsprozedur und die Bindungsstudien wurden bei 25°C mit 10 mM HEPES pH 7.4 / 150 mM sodium Chloride / 3.4 mM EDTA / 0,05% Surfactant P20 als kontinuierlichem Laufpuffer bei einer Flussrate von 5 μl/min durchgeführt. DNA-Komplexe wurden in 20 mM HEPES pH 7.4 mit einer endgültigen DNA-Konzentration von 10 μg/ml wie beschrieben hergestellt. Unmittelbar vor der Injektion auf den Sensorchip wurde die DNA-Komplex-Suspension direkt am Gerät automatisch durch Beimischen einer 5 molaren Natriumchloridlösung auf 150 M Natriumchlorid gebracht.
Fig. 19 zeigt die biospezifische Interaktionsanalyse (BIAcore) von PEI-Polyplexen in der Gegenwart von Copolymeren mit Serumbestandteilen: PEI-DNA-Komplexe (N/P = 8), inkubiert mit den beschriebenen Mengen Copolymer, wurden zweimal über 4 Minuten auf den Sensorchip injiziert (Pfeile) , gefolgt von Waschschritten, bis sich das Meßsignal stabilisierte (Flussrate 5 μl/min) . Bindung an den serumbeladenen
Sensorchip zeigt sich durch ein zunehmendes Meßsignal (Resonance Units, RU, y-Achse) . Die Zeitachse über das gesamte Experiment (x-Achse) betrug 1200 Sekunden. Links P3YE5C-geschütze Komplexe, rechts P6YE5C- geschützte Komplexe (Überlagerung einzelner
Sensogramme) . Eine Reduktion der Interaktion mit dem serumbeladenen Chip bei zunehmender Menge Copolymer ist offensichtlich. Das Beladungssignal "nackter" PEI-DNA- Komplexe ("0 equiv.") erreicht kein Plateau auf Grund fortdauernder Aggregation am Sensorchip während der Injektion in salzhaltigem Puffer. Literatur
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Claims

Ή
Patentanspüche
Geladenes Copolymer der allgemeinen Formel I
wobei R amphiphiles Polymer oder ein homo- oder hetero-bifunktionelles Derivat davon ist,
und worin X i) eine Aminosäure oder ein Aminosäurederivat, ein Peptid oder ein Peptidderivat oder ein Spermin- oder Spermidinderivat ist; oder
ii) worin X
ist, wobei a H oder, gegebenenfalls halogen- oder dialkylamino-substituiertes, Ci-Cε-Alkyl bedeutet; und wobei b, c und d gleiches oder verschiedenes, gegebenfalls halogen- oder dialkylamino- substituiertes Cι-C6~Alkylen bedeutet;
oder iii) worin X
ist, wobei a H oder, gegebenenfalls halogen- oder dialkylamino-substituiertes, Ci-Cε-Alkyl bedeutet, und wobei b und c gleiches oder verschiedenes, gegebenenfalls halogen- oder dialkylamino- substituiertes Ci-Cε-Alkylen bedeuten; oder
iv) worin X
eine substituierte aromatische Verbindung mit drei funktionellen Gruppierungen W1Y1Z1 ist, wobei W, Y und Z die unten angegebenen Bedeutungen haben;
wobei
W, Y oder Z gleiche oder verschiedene Rest.e CO, NH, 0 oder S oder eine zur Reaktion mit SH, OH, NH oder NH2 befähigte Linkergruppierung sind; und wobei das Effektormolekül E ein kationisches oder anionisches Peptid oder Peptidderivat oder ein Spermin- oder Spermidinderivat oder ein Glykosaminoglycan oder ein nichtpeptidisches Oligo/Poly-kation oder -anion; worin
und n unabhängig voneinander 0, 1 oder 2 sind; worin
p vorzugsweise 3 bis 20; und worin
1 1 bis 5, vorzugsweise 1 ist.
2. Copolymer nach Anspruch 1, worin das amphiphile Polymer ein Polyalkylenoxid ist.
3. Copolymer nach Anspruch 2, worin das amphiphile Polymer ein Polyalkylenglykol ist.
4. Copolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin X oder E ein geladenes Peptid- oder Peptidderivat ist.
5. Copolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, an das ein Ligand für eine höhere eukaryotische Zelle gekoppelt ist.
6. Komplex, enthaltend ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle und ein oder mehrere
Copolymere nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
1 . Komplex, enthaltend ein Voder mehrere
Nuklemsäuremoleküle, kondensiert mit organischen Polykation- oder kationischen Lipidmolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß er an seiner Oberfläche ein geladenes Copolymer der allgemeinen Formel I über ionische Wechselwirkung gebunden hat.
8. Komplex nach Anspruch 6 oder 7, enthaltend ein therapeutisch wirksames Nukleinsäuremolekül.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Komplex nach Anspruch 8.
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