EP1207954A2 - Compositions utilisables pour l'hydratation d'un support d'electrophorese, pour l'electrophorese de zone - Google Patents

Compositions utilisables pour l'hydratation d'un support d'electrophorese, pour l'electrophorese de zone

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Publication number
EP1207954A2
EP1207954A2 EP01907836A EP01907836A EP1207954A2 EP 1207954 A2 EP1207954 A2 EP 1207954A2 EP 01907836 A EP01907836 A EP 01907836A EP 01907836 A EP01907836 A EP 01907836A EP 1207954 A2 EP1207954 A2 EP 1207954A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
electrophoresis
sample
composition according
acid
concentration
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01907836A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Georges Nouadje
Laurent Vincent
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sebia SA
Original Assignee
Sebia SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sebia SA filed Critical Sebia SA
Publication of EP1207954A2 publication Critical patent/EP1207954A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44743—Introducing samples

Definitions

  • Zone electrophoresis techniques in agarose gel allow the separation of the protein constituents contained in notably biological samples, such as serum, blood, urine, cerebrospinal fluid, etc.
  • biological samples such as serum, blood, urine, cerebrospinal fluid, etc.
  • the proteins deposited on the surface of the gel ionize and will migrate, under the effect of an electric field, at different speeds depending on their respective charge.
  • the fineness of the bands obtained after electrophoresis corresponding to the separate constituents of the sample and therefore the resolving power of the technique depends mainly on the fineness of the deposition of the sample.
  • sample applicators In order to improve the fineness of the deposit, different types of sample applicators can be used. These applicators, often called deposit combs, can come in different forms. They are illustrated in particular by the following devices:
  • “Throat” combs the teeth of which bear a groove, the edges of which are parallel to the application plane, which makes it possible to recover a drop of biological sample by capillary action.
  • the comb is then applied to the electrophoresis gel under the effect of its own weight.
  • the teeth are then in contact with the gel surface and the sample transfers from the tooth to the gel.
  • These combs can be made of a metallic or plastic material.
  • the sample is taken by capillary action in the space delimited by the two strips and deposited on the gel in the same way as in the case of the throat comb.
  • These combs can, like the previous ones, be made of a metallic or plastic material.
  • Membrane combs whose teeth are made of microporous membrane. These combs are described in patents EP 0 493 996, US 5,464,515, US 5,405,516.
  • the teeth are impregnated with the sample until the microporous membrane is saturated.
  • the teeth of the comb are then brought into contact with the surface of the gel in the same way as in the two cases. precedents. In this case, the sample is deposited by diffusion of the proteins from the microporous membrane to the gel.
  • the sample is usually diluted.
  • the most generally used dilutions are from 1/3 to 1/10.
  • the dilution is carried out in physiological water in order to maintain the solubilized proteins.
  • the object of the invention is to provide a means of eliminating this trademark, whatever the type of applicator used.
  • the deposit mark produced on the electrophoresis support can be eliminated or at least neutralized so that it does not affect the interpretation of the results obtained.
  • After the electrophoresis by hydrating the electrophoresis support at the level of the sample deposition area compressed by the application of the sample applicator. This hydration must be carried out under conditions allowing the constituents and in particular the proteins contained in the test sample, to penetrate into this region of the electrophoresis support in order to undergo electrophoretic migration there.
  • the area of the electrophoresis support compressed by the applicator used to deposit the sample must be rehydrated sufficiently quickly and efficiently, so that the constituents of the sample can penetrate into the electrophoresis support and undergo migration in the applied electric field.
  • the hydration must occur in a duration interval corresponding to 10 to 20% of the time of the electrophoresis (the latter corresponding to the duration of application of the voltage at the terminals of the electrophoresis support), from the energization of the electrophoresis support.
  • rehydration can occur more quickly, that is to say in a time less than 10% of the time of electrophoresis, from the power up.
  • the inventors have identified certain compounds which, when introduced into the diluent of the sample and are therefore deposited at the same time as the sample on the electrophoresis support, are capable of removing the clear mark left by compression of the electrophoresis support. These compounds have the effect of eliminating or at least attenuating this clear mark from the first moments of electrophoretic migration, while this mark persists throughout the migration in the absence of said compounds.
  • the subject of the invention is therefore a composition which can be used in a process for separating the constituents of a sample, by electrophoresis on a support electrophoresis, comprising one or more ionic compounds allowing, during the application of an electric field at the level of an electrophoresis support having negative surface charges, a hydration of the deposit zone of the sample to be separated , when this zone bears a compression mark resulting from the deposition of the sample. This compression results from the pressure exerted by the applicator on the support.
  • the presence of negative surface charges at the level of the electrophoresis support indicates a non-zero electroendosmosis (or electroosmotic flow capacity).
  • the compression of the electrophoresis support resulting from the deposition of the sample by means of the applicator can be observed with the naked eye and corresponds to a hollow mark in said support.
  • a mark can for example be described as having the shape of a V, generally of a depth less than 100 ⁇ and having a width of approximately 1 mm between the two upper parts of the V for an electrophoresis support constituted by 0.8% agarose gel, when the pressure of the applicator is greater than 0.1 g / mm 2 .
  • the ionic compounds used for the preparation of the composition of the invention can, depending on the case, move or on the contrary remain essentially immobile during the electrophoretic migration.
  • the absence of displacement in the electric field is attributable either to the nature of the compound or to its concentration in the composition, or even to a combination of these elements.
  • the concentration of ionic compounds present in the composition is determined according to the nature of these compounds , and in particular their capacity or not to migrate in the electrophoresis support after the application of the electric field. This concentration must be chosen so as to allow hydration, from the first moments of the electrophoretic migration, of the zone of deposit of the sample at the level of the electrophoresis support.
  • the hydration or rehydration effect of the electrophoresis support sought which depends, as indicated above, on the nature of the ionic compounds used, can also be influenced by the composition of the electrophoresis support and in particular its electroendosmosis index.
  • the electrophoresis support is an agarose gel
  • agarose gels will be used. having a non-zero electro-osmotic flow capacity, for example corresponding to a relative mobility index, -mr greater than or equal to 0.07.
  • the ionic compounds used in the context of the invention are dissolved to form the composition defined above. They are used at a determined concentration below their solubility limit.
  • the composition comprises one or more ionic compounds chosen from those which do not undergo significant displacement in an electric field.
  • these compounds allow the rehydration of the area of the compressed electrophoresis support, but do not migrate with the constituents of the sample during electrophoresis.
  • the invention advantageously relates to a composition comprising one or more ionic compounds chosen from zwitterionic compounds.
  • amino acids corresponding to the formula NH 2 -R-COOH in which R comprises an uncharged polar side chain will be used for the production of the composition according to the invention.
  • the amino acids chosen can be amino acids corresponding to the formula NH 2 -R-COOH, in which R comprises a basic side chain.
  • amino acids corresponding to one or other of the preceding definitions can be used alone or, where appropriate, as a mixture, optionally in mixture with other compounds, ionic or nonionic, which can be used to obtain rehydration of the electrophoresis support, when this support can undergo electroendosmosis.
  • amino acid suitable for the preparation of the composition of the invention By way of example of an amino acid suitable for the preparation of the composition of the invention, mention will be made of: glycine (preferably at a concentration compatible with its solubility in water at 25 ° C. and in this respect, a concentration between 1 M and 3.33 M is usable), phenylalanine at a concentration of 0.28 M.
  • Other examples are the amino acids chosen from L-lysine advantageously at a concentration greater than or equal to 1 M, L-arginine preferably at a concentration between 0.45 M and 0.86 M, L-histidine preferably at a concentration of 0.27 M.
  • TRICIN N-tris ( hydroxymethyl) methyl-glycine
  • MOPS 3- (N-Morpholino) propanesulfonic acid
  • TAPS N-tris (Hydroxymethyl) methyl-3aminopropanesulfonic acid
  • AMPSO (3 - ((1, 1-Dimethyl-2-hydroxyethyl) amino) -2-hydroxy-propanesulfonic acid)
  • EPPS N- (2-Hydroxyethyl) piperazine-N '- (3-propanesulfonic acid)
  • these salts can be chosen from NaCI, KCI or NaHCO 3 at a concentration greater than or equal to 1 M or a boric acid salt at a concentration greater than or equal to 0.15 M or a salt of phosphoric acid, or acetic acid at a concentration greater than or equal to 0.5 M.
  • the subject of the invention is therefore the use of a composition corresponding to one of the definitions given above, or to several of these definitions taken in combination, for the hydration of an electrophoresis support, at the level of the sample deposition zone to be separated by electrophoresis.
  • This use can be made in the form of a dilution of the sample to be separated by electrophoresis using the composition according to the invention.
  • the invention also relates to a kit intended for the implementation of a process of separation by electrophoresis, of the constituents of a sample, characterized in that it comprises: - a composition defined above, - a support electrophoresis consisting of a gel having a non-zero electro-osmotic flow.
  • a kit thus defined can also include any other reagent or device usually present in electrophoresis kits, such as migration buffers, and the developers used to identify the constituents separated by electrophoresis from the sample.
  • An electrophoresis support which can be used for carrying out the invention is generally a gel and in particular a gel having a non-zero electro-osmatic flow.
  • agarose gels and in particular agarose gels HGT® or HEEO®, from the company FMC-BIOWHITTAKER or agaroses LE® or SHE® from the company HISPANAGAR or their mixtures.
  • agarose gels have the property of exhibiting non-zero electroendosmosis.
  • the agarose gels used to prepare the electrophoresis supports according to the invention have a concentration of 0.8 to 1% in agarose, and can contain agaroses in a mixture.
  • the invention also relates to a method of separation by electrophoresis of the constituents of a sample comprising:
  • the revelation can be carried out by means of dyes and in the case of immunofixation, by means of antisera and dyes.
  • the previously defined process can be implemented according to the usual methods of electrophoresis and can in particular comprise, for the revelation of the constituents separated by electrophoresis, an immunofixation procedure.
  • the method according to the invention implementing the composition defined above can be effectively used to detect the presence of paraproteins in a biological sample.
  • This process can be implemented advantageously in the context of zone electrophoresis separation.
  • the simultaneous deposition of the sample and of the composition of the invention allows the rehydration of the gel in the very first moments of the electrophoretic migration.
  • the sample and the composition of the invention can be combined, if necessary, before their deposition on the electrophoresis support, in particular by diluting the sample in the composition.
  • Example 1 Typing of serum paraproteins diluted in a tricin solution (0.45 M), on an immunofixation gel.
  • tricin dissolved in 4 ml of water.
  • the diluent thus formed is ready for use.
  • the serum sample to be typed was diluted in the diluent by a third for the track corresponding to the electrophoretic profile, as well as for the tracks IgA, IgM, IgK and Ig ⁇ (for example, 30 ⁇ l of serum and 60 ⁇ l of diluent) and sixth for the IgG revelation track (for example, 20 ⁇ l of serum and 100 ⁇ l of diluent).
  • the typing of the paraproteins was carried out by incubating each migration track with a specific antiserum (anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti Ig ⁇ ) and the track corresponding to the electrophoretic profile with a protein binding solution. The excess reagent was removed, the gel was dried and stained with acid violet.
  • a specific antiserum anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti Ig ⁇
  • Example 2 Typing of serum paraproteins diluted in a solution of Arginine (0.86 M), on an immunofixation gel.
  • 0.6 g of L Arginine was dissolved in 4 ml of water in a test tube.
  • the diluent thus formed is ready for use.
  • the serum sample to be typed was diluted in the diluent by a third for the track corresponding to the electrophoretic profile, as well as for the tracks IgA, IgM, IgK and Ig ⁇ (for example, 30 ⁇ l of serum and 60 ⁇ l of diluent) and sixth for the IgG revelation track (for example, 20 ⁇ l of serum and 100 ⁇ l of diluent).
  • 4 ml of physiological water was introduced which made it possible to dilute the same sample in an identical manner to the previous case.
  • the applicator thus loaded was then applied to the surface of the IF gel for 1 minute.
  • Example 3 Typing of serum paraproteins diluted in a solution of sodium chloride (1.2 M), on an immunofixation gel.
  • the serum sample to be typed was diluted in the diluent by a third for the track corresponding to the electrophoretic profile, as well as for the tracks IgA, IgM, IgK and Ig ⁇ (for example, 30 ⁇ l of serum and 60 ⁇ l of diluent) and sixth for the IgG revelation track (for example, 20 ⁇ l of serum and 100 ⁇ l of diluent).
  • the applicator thus loaded was then applied to the surface of the IF gel for 1 minute.
  • the separation of these samples applied to the IF gel was obtained by electrophoresis for approximately 10 minutes and at a power of 20 W, on an instrument making it possible to regulate the temperature at 20 ° C.
  • the typing of the paraproteins was carried out by incubating each migration track with a specific antiserum (anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti Ig ⁇ ) and the track corresponding to the electrophoretic profile with a protein fixing solution. . The excess reagent was removed, the gel was dried and stained with acid violet.
  • a specific antiserum anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti Ig ⁇

Abstract

L'invention a pour objet une composition utilisable dans un procédé de séparation des constituants d'un échantillon, par électrophorèse sur un support d'électrophorèse, comprenant un ou plusieurs composés ioniques permettant, lors de l'application d'un champ électrique au niveau d'un support d'électrophorèse présentant des charges de surface négatives, une hydratation de la zone de dépôt de l'échantillon à séparer, lorsque cette zone porte une marque de compression résultant du dépôt de l'échantillon.

Description

COMPOSITIONS UTILISABLES POUR L'HYDRATATION D'UN SUPPORT D'ELECTROPHORESE, POUR L'AMELIORATION DE L'ELECTROPHORESE DE ZONE. Les techniques d'électrophorèse de zone en gel d'agarose permettent la séparation des constituants protéiques contenus dans des échantillons notamment biologiques, tels que sérum, sang, urine, liquide céphalo-rachidien etc .. Dans un milieu gélifié et contenant une solution tampon, les protéines déposées à la surface du gel s'ionisent et vont migrer, sous l'effet d'un champ électrique, à des vitesses différentes en fonction de leur charge respective. La finesse des bandes obtenues après électrophorèse correspondant aux constituants séparés de l'échantillon et donc le pouvoir de résolution de la technique dépend principalement de la finesse du dépôt de l'échantillon.
Afin d'améliorer la finesse du dépôt, différents types d'applicateurs d'échantillons peuvent être utilisés. Ces applicateurs, souvent appelés peignes de dépôt, peuvent se présenter sous différentes formes. Ils sont notamment illustrés par les dispositifs suivants :
Les peignes à « gorge » dont les dents portent une gorge, dont les bords sont parallèles au plan d'application, qui permet de récupérer par capillarité une goutte d'échantillon biologique. Le peigne est ensuite appliqué sur le gel d'électrophorèse sous l'effet de son propre poids. Les dents sont alors en contact avec la surface du gel et l'échantillon transfère de la dent vers le gel. Ces peignes peuvent être réalisés dans une matière métallique ou plastique.
Les peignes à « lamelles », dont le principe est identique aux peignes à gorge, mais dont les dents comportent à leur extrémité, deux lamelles parallèles et disposées dans un plan perpendiculaire au plan d'application. L'échantillon est prélevé par capillarité dans l'espace délimité par les deux lamelles et déposé sur le gel de la même façon que dans le cas du peigne à gorge. Ces peignes peuvent, comme les précédents, être réalisés dans un matière métallique ou plastique. Les peignes à membrane dont les dents sont constituées de membrane microporeuse. Ces peignes sont décrits dans les brevets EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516. Les dents sont imprégnées de l'échantillon jusqu'à saturation de la membrane microporeuse. Les dents du peigne sont ensuite mises en contact avec la surface du gel de la même manière que dans les deux cas précédents. Dans ce cas, l'échantillon est déposé par diffusion des protéines de la membrane microporeuse vers le gel.
Ces différents types d'applicateurs permettent tous d'obtenir, avec une plus ou moins grande efficacité, des dépôts fins. Pour réaliser une électrophorèse, et en particulier dans l'optique d'effectuer une immunofixation, l'échantillon est habituellement dilué. Les dilutions les plus généralement utilisées sont de 1/3 à 1/10. Généralement, la dilution est réalisée dans de l'eau physiologique afin de maintenir les protéines solubilisées. Après application de l'échantillon dilué sur le gel au moyen d'un applicateur tel que ceux décrits précédemment pendant une durée moyenne de 30 secondes à 120 secondes, de préférence de 60 secondes à 120 secondes en fonction de l'applicateur et de la dilution de l'échantillon, on constate que le gel présente, à l'endroit du contact avec la dent, une marque en creux qui ne disparaît pas au cours de la migration. Ce creux se traduit, après l'étape de coloration, par l'absence de coloration ou par la diminution de l'intensité de coloration décrite précédemment.
Compte tenu de leur poids (de quelques grammes à une dizaine de grammes en fonction du mode de réalisation), l'application de ces peignes à la surface du gel entraîne, à l'endroit où les dents sont en contact avec le gel, une compression du gel qui conduit à une déformation sous la forme d'une marque en creux à la surface. En absence de précaution, cette déformation subsiste pendant la migration et devient visible après la coloration du gel qui est effectuée pour la révélation du profil électrophorétique. C'est cette déformation qui se traduit par une zone moins ou non colorée qui peut gêner considérablement l'interprétation de l'électrophérogramme.
L'invention a pour but de fournir un moyen d'éliminer cette marque de dépôt, quel que soit le type d'applicateur utilisé.
Les inventeurs ont observé que la marque de dépôt produite sur le support d'électrophorèse, et en particulier sur le gel peut être éliminée ou à tout le moins neutralisée de façon qu'elle n'affecte pas l'interprétation des résultats obtenus à l'issue de l' électrophorese, en hydratant le support d'électrophorèse au niveau de la zone de dépôt de l'échantillon comprimée par l'application de l'applicateur d'échantillon. Cette hydratation doit être réalisée dans des conditions permettant aux constituants et en particulier aux protéines contenues dans l'échantillon testé, de pénétrer dans cette zone du support d'électrophorèse pour y subir la migration électrophorétique.
Ainsi, la zone du support d'électrophorèse comprimée par l'applicateur utilisé pour déposer l'échantillon, doit être réhydratée de façon suffisamment rapide et efficace, pour que les constituants de l'échantillon puissent pénétrer dans le support de l'électrophorèse et subir la migration dans le champ électrique appliqué.
Ainsi lorsque l'électrophorèse est réalisée sur une durée déterminée, l'hydratation doit se produire dans un intervalle de durée correspondant à 10 à 20% du temps de l'électrophorèse (ce dernier correspondant à la durée d'application de la tension aux bornes du support d'électrophorèse), à partir de la mise sous tension du support d'électrophorèse. Avantageusement, la réhydratation peut se produire plus rapidement, c'est à dire dans un temps inférieur à 10% du temps de l'électrophorèse, à partir de la mise sous tension.
Les inventeurs ont identifié certains composés qui, lorsqu'ils sont introduits dans le diluant de l'échantillon et sont donc déposés en même temps que l'échantillon sur le support d'électrophorèse, sont capables de faire disparaître la marque claire laissée par la compression du support d'électrophorèse. Ces composés ont pour effet de supprimer ou au moins d'atténuer cette marque claire dès les premiers instants de la migration électrophorétique, alors que cette marque persiste durant toute la migration en l'absence desdits composés.
Les inventeurs ont observé que ces composés provoquent un regonflement du support d'électrophorèse à l'endroit marqué par le dépôt de l'échantillon, résultant d'une réhydratation rapide de la zone comprimée.
L'invention a donc pour objet une composition utilisable dans un procédé de séparation des constituants d'un échantillon, par électrophorese sur un support d'électrophorèse, comprenant un ou plusieurs composés ioniques permettant lors de l'application d'un champ électrique au niveau d'un support d'électrophorèse présentant des charges de surface négatives, une hydratation de la zone de dépôt de l'échantillon à séparer, lorsque cette zone porte une marque de compression résultant du dépôt de l'échantillon. Cette compression résulte de la pression exercée par l'applicateur, sur le support.
La présence de charges de surface négatives au niveau du support d'électrophorèse, traduit une électro-endosmose (ou capacité d'écoulement électro-osmotique) non nulle. La compression du support d'électrophorèse résultant du dépôt de l'échantillon au moyen de l'applicateur peut être observée à l'œil nu et correspond à une marque en creux dans ledit support. Une telle marque peut par exemple être décrite comme ayant le forme d'un V, généralement d'une profondeur inférieure à 100 μ et ayant une largeur d'environ 1 mm entre les deux parties hautes du V pour un support d'électrophorèse constitué par un gel d'agarose à 0,8%, lorsque la pression de l'applicateur est supérieure à 0,1 g/mm2.
Les composés ioniques utilisés pour l'élaboration de la composition de l'invention peuvent selon le cas se déplacer ou au contraire rester essentiellement immobiles au cours de la migration électrophorétique. L'absence de déplacement dans le champ électrique est attribuable soit à la nature du composé soit à sa concentration dans la composition, voire à une combinaison de ces éléments.
Pour un support d'électrophorèse donné, notamment dont l'indice d'électro- endosmose (indice -mr, indice de mobilité relative) est déterminé, la concentration de composés ioniques présents dans la composition est déterminée en fonction de la nature de ces composés, et en particulier de leur capacité ou non à migrer dans le support d'électrophorèse après l'application du champ électrique. Cette concentration doit être choisie de façon à permettre l'hydratation, dès les premiers instants de la migration électrophorétique, de la zone de dépôt de l'échantillon au niveau du support d'électrophorèse. L'effet d'hydratation, ou de réhydratation, du support d'électrophorèse recherché qui dépend, comme indiqué plus haut, de la nature des composés ioniques utilisés, peut être également influencé par la composition du support d'électrophorèse et en particulier de son indice d'électro-endosmose. A cet égard, lorsque le support d'électrophorèse est un gel d'agarose, pour permettre un apport d'eau suffisant pendant la migration, en particulier au niveau de la zone de compression du gel, on aura recours à des gels d'agarose présentant une capacité d'écoulement électro-osmotique non nulle, par exemple correspondant à un indice de mobilité relative, -mr supérieur ou égal à 0,07. Les composés ioniques utilisés dans le cadre de l'invention sont mis en solution pour former la composition ci-dessus définie. Ils sont utilisés à une concentration déterminée inférieure à leur limite de solubilité.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la composition comprend un ou plusieurs composés ioniques choisis parmi ceux qui ne subissent pas de déplacement sensible dans un champ électrique.
Ainsi, ces composés permettent la réhydratation de la zone du support d'électrophorèse comprimé, mais ne migrent pas avec les constituants de l'échantillon lors de l'électrophorèse.
L'invention concerne de façon avantageuse une composition comprenant un ou plusieurs composés ioniques choisis parmi les composés zwitterioniques.
A titre d'exemple pour la réalisation de l'invention, on citera les composés zwitterioniques de type acides aminés ou encore les tampons zwitterioniques.
Par exemple, on aura recours pour la réalisation de la composition sur l'invention à des acides aminés répondant à la formule NH2-R-COOH dans laquelle R comporte une chaîne latérale polaire non chargée.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les acides aminés choisis peuvent être des acides aminés répondant à la formule NH2-R-COOH, dans laquelle R comporte une chaîne latérale basique.
Les acides aminés répondant à l'une ou l'autre des définitions précédentes peuvent être utilisés seuls ou le cas échéant, en mélange, éventuellement en mélange avec d'autres composés, ioniques ou non ioniques, utilisables pour obtenir la réhydratation du support d'électrophorèse, lorsque ce support peut subir une électro-endosmose.
A titre d'exemple d'acide aminé propre à la préparation de la composition de l'invention, on citera : la glycine (de préférence à une concentration compatible avec sa solubilité dans l'eau à 25°C et à cet égard, une concentration comprise entre 1 M et 3,33 M est utilisable), la phénylalanine à une concentration de 0,28 M. D'autres exemples sont les acides aminés choisis parmi la L-lysine avantageusement à une concentration supérieure ou égale à 1 M, la L-arginine de préférence à une concentration comprise entre 0,45 M et 0,86 M, la L-histidine de préférence à une concentration de 0,27 M.
Parmi les tampons zwitterioniques utilisables dans le cadre de l'invention, à concentration supérieure à 0,3 M et dans la limite de leur solubilité, on citera à titre d'exemple les tampons biologiques suivants ou leur sel : TRICINE (N-tris(Hydroxymethyl)methyl-glycine)
HEPES (N-(2Hydroxyethyl)piprazine-N'-(2-ethanesulfonic acide))
PIPES (Piperazine-N-N'-bis(2-ethanesulfonic acide)
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acide)
TAPS (N-tris(Hydroxymethyl)methyl-3aminopropanesulfonic acide) AMPSO (3-((1 ,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)amino)-2-hydroxy-propanesulfonic acide)
TES (N-tris(Hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acide)
BES (N,N'-bis(2-Hydroxyethyl)-2aminoethanesulfonic acide)
BICINE (5N,N-bis(2-Hydroxyethyl)Glycine) CHES (2-(N-Cyclohexylamino)ethanesulfonic acide)
DIPSO (3-(N,N-bis(2-Hydroxyethyl)amino)-2-hydroxy-propanesulfonic acide)
EPPS (N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(3-propanesulfonic acide))
MOPSO (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acide)
POPSO (Piperazine-N,N'-bis(2'hydroxypropanesulfonic acide)) MES (2-Morpholino-éthane sulfonique acide). Alternativement, les inventeurs ont observé que l'effet recherché de réhydratation du support d'électrophorèse dès les premiers instants de la migration de l'échantillon peut être obtenu avec des composés ioniques qui sont susceptibles de subir une migration électrophorétique, dès lors que ces composés sont présents en une concentration suffisante pour que malgré leur migration, l'hydratation du support d'électrophorèse soit permise au niveau de la zone de dépôt de l'échantillon. De tels composés sont par exemple des sels utilisés à forte concentration et en particulier à une concentration déterminée selon les techniques habituelles, prenant en compte la mobilité de Fanion. Plus l'anion a une mobilité lente, plus la concentration efficace de sel peut être faible.
A titre d'exemple, ces sels peuvent être choisis parmi NaCI, KCI ou NaHCO3 à une concentration supérieure ou égale à 1 M ou un sel d'acide borique à une concentration supérieure ou égale à 0,15 M ou un sel d'acide phosphorique, ou d'acide acétique à une concentration supérieure ou égale à 0,5 M. L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une composition répondant à l'une des définitions précédemment données, ou à plusieurs de ces définitions prises en combinaison, pour l'hydratation d'un support d'électrophorèse, au niveau de la zone de dépôt de l'échantillon à séparer par électrophorese.
Cette utilisation peut être faite sous la forme d'une dilution de l'échantillon à séparer par électrophorese au moyen de la composition selon l'invention.
L'invention a également pour objet un kit destiné à la mise en œuvre d'un procédé de séparation par électrophorese, des constituants d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : - une composition définie ci-dessus, - un support d'électrophorèse constitué par un gel présentant un écoulement électro-osmotique non nul.
Un kit ainsi défini peut également comprendre tout autre réactif ou dispositif habituellement présent dans les kits d'électrophorèse, tels que les tampons de migration, et les révélateurs utilisés pour identifier les constituants séparés par électrophorese à partir de l'échantillon. Un support d'électrophorèse utilisable pour la réalisation de l'invention est de façon générale, un gel et en particulier un gel présentant un écoulement électro-osmatique non nul.
A titre d'exemple, on citera les gels d'agarose et en particulier les gels d'agarose HGT® ou HEEO®, de la société FMC-BIOWHITTAKER ou les agaroses LE® ou SHE® de la société HISPANAGAR ou leurs mélanges.
Ces gels d'agarose ont la propriété de présenter une électro-endosmose non nulle. Les gels d'agarose utilisés pour préparer les supports d'électrophorèse selon l'invention ont une concentration de 0,8 à 1 % en agarose, et peuvent contenir des agaroses en mélange.
L'invention concerne également un procédé de séparation par électrophorese des constituants d'un échantillon comprenant :
- le dépôt sur le support d'électrophorèse, au moyen d'un applicateur, d'un échantillon dont on cherche à séparer les constituants, - le dépôt simultanément à celui de l'échantillon, d'une composition ci-dessus définie, sur un support d'électrophorèse,
- l'application d'un champ électrique pour permettre la migration des constituants de l'échantillon,
- la révélation des constituants séparés par électrophorese. La révélation peut être effectuée au moyen de colorants et lorsqu'il s'agit d'immunofixation, au moyen d'antisérums et de colorants.
Le procédé précédemment défini peut être mis en œuvre selon les méthodes habituelles de l'électrophorèse et peut notamment comporter, pour la révélation des constituants séparés par l'électrophorèse, une procédure d'immunofixation.
En particulier, le procédé selon l'invention mettant en œuvre la composition définie précédemment peut être efficacement utilisé pour détecter la présence de paraprotéines dans un échantillon biologique.
Ce procédé peut être mis en œuvre de façon avantageuse dans le cadre d'une séparation par électrophorese de zone. Dans le cadre de la réalisation du procédé de l'invention, le dépôt simultané de l'échantillon et de la composition de l'invention permet la réhydration du gel dans les tout premiers instants de la migration électrophorétique.
Pour réaliser un dépôt simultané, on peut le cas échéant associer, préalablement à leur dépôt sur le support d'électrophorèse, l'échantillon et la composition de l'invention, notamment en diluant l'échantillon dans la composition.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent.
Exemple de réalisation n° 1 : Typage des paraprotéines sériques diluées dans une solution de tricine (0,45 M), sur un gel d'immunofixation.
Dans un tube à essai, on a dissout 0,32 g de tricine dans 4 ml d'eau. Le diluant ainsi constitué est prêt à l'emploi. L'échantillon sérique à typer a été dilué dans le diluant au tiers pour la piste correspondant au profil électrophorétique, ainsi que pour les pistes IgA, IgM, IgK et Igλ (par exemple, 30 μl de sérum et 60 μl de diluant) et au sixième pour la piste de révélation des IgG (par exemple, 20 μl de sérum et 100 μl de diluant).
Dans un autre tube à essai, on a introduit 4 ml d'eau physiologique qui a permis de diluer le même échantillon de façon identique au cas précédent. 10 μl d'échantillon dilué ont été chargés dans chaque puits de l'applicateur à membrane décrit dans les brevets EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516. L'applicateur ainsi chargé a ensuite été appliqué à la surface du gel IF pendant 1 minute. La séparation de ces échantillons appliqués sur le gel IF a été obtenue par électrophorese pendant 10 minutes environ et à une puissance de 20 W, sur un instrument permettant de réguler la température à 20°C.
Après migration, le typage des paraprotéines a été réalisé en incubant chaque piste de migration avec un antisérum spécifique (anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti Igλ) et la piste correspondant au profil électrophorétique avec une solution de fixation des protéines. L'excès de réactif a été éliminé, le gel a été séché et coloré au Violet acide.
Sur le gel, on a observé que les échantillons dilués dans la tricine ne présentaient pas de marque à l'endroit du dépôt tandis que ceux dilués dans l'eau physiologique présentaient une forte empreinte de l'applicateur.
Exemple de réalisation n° 2 : Typage des paraprotéines sériques diluées dans une solution de l'Arginine (0,86 M), sur un gel d'immunofixation.
Dans un tube à essai, on a dissout 0,6 g de L Arginine dans 4 ml d'eau. Le diluant ainsi constitué est prêt à l'emploi. L'échantillon sérique à typer a été dilué dans le diluant au tiers pour la piste correspondant au profil électrophorétique, ainsi que pour les pistes IgA, IgM, IgK et Igλ (par exemple, 30 μl de sérum et 60 μl de diluant) et au sixième pour la piste de révélation des IgG (par exemple, 20 μl de sérum et 100 μl de diluant). Dans un autre tube à essai, on a introduit 4 ml d'eau physiologique qui a permis de diluer le même échantillon de façon identique au cas précédent.
10 μl d'échantillon dilué ont été chargés dans chaque puits de l'applicateur à membrane décrit dans les brevets EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516.
L'applicateur ainsi chargé a ensuite été appliqué à la surface du gel IF pendant 1 minute.
La séparation de ces échantillons appliqués sur le gel IF a été obtenue par électrophorese pendant 10 minutes environ et à une puissance de 20 W, sur un instrument permettant de réguler la température à 20°C.
Après migration, le typage des paraprotéines a été réalisé en incubant chaque piste de migration avec un antisérum spécifique (anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti
IgK, anti Igλ) et la piste correspondant au profil électrophorétique avec une solution de fixation des protéines. L'excès de réactif a été éliminé, le gel a été séché et coloré au Violet acide. Sur le gel, on a observé que les échantillons dilués dans la solution d'arginine ne présentaient pas de marque à l'endroit du dépôt tandis que ceux dilués dans l'eau physiologique présentaient une forte empreinte de l'applicateur.
Exemple de réalisation n° 3 : Typage des paraprotéines sériques diluées dans une solution de Chlorure de sodium (1,2 M), sur un gel d'immunofixation.
Dans un tube à essai, on a dissout 0,29 g de Nacl dans 4 ml d'eau. Le diluant ainsi constitué est prêt à l'emploi. L'échantillon sérique à typer a été dilué dans le diluant au tiers pour la piste correspondant au profil électrophorétique, ainsi que pour les pistes IgA, IgM, IgK et Igλ (par exemple, 30 μl de sérum et 60 μl de diluant) et au sixième pour la piste de révélation des IgG (par exemple, 20 μl de sérum et 100 μl de diluant).
Dans un autre tube à essai, on a introduit 4 ml d'eau physiologique qui a permis de diluer le même échantillon de façon identique au cas précédent.
10 μl d'échantillon dilué ont été chargés dans chaque puits de l'applicateur à membrane décrit dans les brevets EP 0 493 996, US 5.464.515, US 5.405.516.
L'applicateur ainsi chargé a ensuite été appliqué à la surface du gel IF pendant 1 minute. La séparation de ces échantillons appliqués sur le gel IF a été obtenue par électrophorese pendant 10 minutes environ et à une puissance de 20 W, sur un instrument permettant de réguler la température à 20 °C.
Après migration, le typage des paraprotéines a été réalisé en incubant chaque piste de migration avec un antisérum spécifique (anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti IgK, anti Igλ) et la piste correspondant au profil électrophorétique avec une solution de fixation des protéines. L'excès de réactif a été éliminé, le gel a été séché et coloré au Violet acide.
Sur le gel, on a observé que les échantillons dilués dans la solution de NaCI concentrée ne présentaient pas de marque à l'endroit du dépôt tandis que ceux dilués dans l'eau physiologique présentaient une forte empreinte de l'applicateur.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition utilisable dans un procédé de séparation des constituants d'un échantillon, par électrophorese sur un support d'électrophorèse, comprenant un ou plusieurs composés ioniques permettant, lors de l'application d'un champ électrique au niveau d'un support d'électrophorèse présentant des charges de surface négatives, une hydratation de la zone de dépôt de l'échantillon à séparer, lorsque cette zone porte une marque de compression résultant du dépôt de l'échantillon.
2. Composition selon la revendication 1 , comprenant un ou plusieurs composés ioniques ne subissant pas de déplacement sensible dans un champ électrique.
3. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la concentration en composés ioniques est telle que leur présence au niveau de la zone de dépôt de l'échantillon à séparer élimine la marque de compression résultant du dépôt de l'échantillon, par l'hydratation de la zone de dépôt.
4. Composition selon la revendication 1 ou 2, comprenant un ou plusieurs composés ioniques choisis parmi les composés zwitterioniques.
5. Composition selon la revendication 4 dans laquelle le composé zwittérionique est un acide aminé.
6. Composition selon la revendication 4 dans laquelle le composé zwittérionique est un tampon biologique zwittérionique.
7. Composition selon la revendication 5, dans laquelle l'acide aminé répond à la formule NH2-R-COOH, dans laquelle R comporte une chaîne latérale polaire non chargée.
8. Composition selon la revendication 5, dans laquelle l'acide aminé répond à la formule NH2-R-COOH, dans laquelle R comporte une chaîne latérale basique.
9. Composition selon la revendication 7, dans laquelle l'acide aminé est la glycine, présente à une concentration compatible avec sa solubilité dans l'eau à 25°C ou est la phénylalanine à une concentration de 0,28 M.
10. Composition selon la revendication 8 dans laquelle l'acide aminé est choisi parmi la L-lysine à une concentration supérieure ou égale à 1 M, la L-arginine à une concentration comprise entre 0,45 M et 0,86 M, la L-histidine à une concentration de 0,27 M.
11. Composition selon la revendication 4, comprenant un tampon zwittérionique choisi parmi les tampons biologiques suivants :
TRICINE (N-tris(Hydroxymethyl)methyl-glycine)
HEPES (N-(2Hydroxyethyl)piprazine-N'-(2-ethanesulfonic acide))
PIPES (Piperazine-N-N'-bis(2-ethanesulfonic acide) MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acide)
TAPS (N-tris(Hydroxymethyl)methyl-3aminopropanesulfonic acide)
AMPSO (3-((1 ,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)amino)-2-hydroxy-propanesulfonic acide)
TES (N-tris(Hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acide) BES (N,N'-bis(2-Hydroxyethyl)-2aminoethanesulfonic acide)
BICINE (5N,N-bis(2-Hydroxyethyl)Glycine)
CHES (2-(N-Cyclohexylamino)ethanesulfonic acide)
DIPSO (3-(N,N-bis(2-Hydroxyethyl)amino)-2-hydroxy-propanesulfonic acide)
EPPS (N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(3-propanesulfonic acide)) MOPSO (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acide)
POPSO (Piperazine-N,N'-bis(2'hydroxypropanesulfonic acide))
MES (2-Morpholino-éthane sulfonique acide) ou un sel de ces tampons.
12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, comprenant un sel en concentration suffisante pour permettre l'hydratation de la zone comprimée du support d'électrophorèse préalablement à son élimination sous l'effet du champ électrique.
13. Composition selon la revendication 11 , dans laquelle le tampon zwittérionique est à une concentration supérieure à 0,3 M.
14. Composition selon la revendication 12 ou 13, dans laquelle le sel est choisi parmi, NaCI, KCI ou NaHCÛ3 à une concentration supérieure ou égale à 1 M ou un sel de l'acide borique à une concentration supérieure ou égale à 0,15 M ou un sel de l'acide phosphorique ou de l'acide acétique à une concentration supérieure ou égale à 0,5 M.
15. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour l'hydratation d'un support d'électrophorèse, au niveau de la zone de dépôt de l'échantillon à séparer par électrophorese.
16. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour diluer l'échantillon à séparer par électrophorese.
17. Kit destiné à la mise en œuvre d'un procédé de séparation par électrophorese, des constituants d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, - un support d'électrophorèse constitué par un gel présentant un écoulement électro-osmotique non nul.
18. kit selon la revendication 17, caractérisé en ce que le support d'électrophorèse est un gel d'agarose.
19. Procédé de séparation par électrophorese, des constituants d'un échantillon comprenant :
- le dépôt sur le support d'électrophorèse, au moyen d'un applicateur, d'un échantillon dont on cherche à séparer les constituants,
- le dépôt simultanément à celui de l'échantillon, d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, sur un support d'électrophorèse, - l'application d'un champ électrique pour permettre la migration des constituants de l'échantillon,
- la révélation des constituants séparés par électrophorese.
20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel l'échantillon et la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 sont associées préalablement au dépôt sur le support d'électrophorèse.
21. Procédé selon la revendication 19 ou 20, dans lequel le support d'électrophorèse est un gel d'agarose comportant des charges de surface négatives.
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