TW572772B - Compositions for use in hydrating an electrophoresis support to improve zone electrophoresis - Google Patents

Description

572772 五、發明說明（1) 本發明之背景 在洋菜（agarose)膠上的區帶電泳技術可分離包含於樣 本中的蛋白質組份，特別是在生物樣本中，如··血漿、血 液、尿液、腦脊髓液等。在膠形式並且包含緩衝溶液的介 質中，沉積在膠表面的蛋白質離子化，並且取決電場效應 下的分別電荷而以不同的速率移動。在電泳之後所得區帶 的薄度、相對應於樣本所分離之組份及因此之步驟解析能 力，是主要取決於樣本之裝載的薄度。 可使用不同種類之樣本塗敷器（ap p 1 i c a t 〇 r )，以改進裝 載的薄度。此塗敷器通常術語稱樣品梳，可採用許多不同 的形式，如下列裝置所說明的： ”凹槽（Groove)”梳，其中梳齒採用凹槽，其邊緣是平行 於塗敷的平面，該裝置是將生物樣本滴以毛細作用進行。 然後該梳在其重量的效應下被加到電泳膠上。然後梳齒與 膠的表面接觸，並且樣本從齒梳被轉移到膠上。此梳齒可 由金屬或塑膠材質製成。 π條狀π梳，其原理與凹槽梳相同，但其梳齒包含兩個平 行條狀物，置於與塗敷器平面垂直之平面的其末端。該樣 本可以毛細作用進入以該兩區帶物界定之空間中，並且如 使用凹槽梳地、以相同的方式裝載於膠上。一如前述，此 梳可由金屬或塑膠材質製成。 薄膜梳的梳齒是由微孔性薄膜所組成。此梳以敘述於歐 洲專利Ε Ρ - Α - 0 4 9 3 9 9 6及美國專利U S - Α - 5 4 6 4 5 1 5及 US-A- 5 4 0 5 5 1 6中。該梳齒以樣本含浸，直到該微孔性薄 572772 五、發明說明（2) 膜飽和。然 膠表面接觸 膠的擴散來 此不同塗 載。 當進行電 (immunofix 通常，稀釋 在如上所述 秒至1 2 0秒 將該稀釋樣 察到顯示壓 後，此壓縮 減低。 考慮其重 梳對膠表面 表面上以壓 在移動期間 其進行而曝 較少染色或 本發明的 所使用之塗 本發明人 後該梳的梳齒以與上述兩情況的相同方式，與 。在此情況下，樣本以蛋白質從微孔性薄膜向 裝載。 敷器種類可以或多或少的效率都產生薄的裝 泳時，通常樣本被稀釋，特別是對免疫固定化 a t i ο η )。最例行使用的稀釋是從1 / 3至1 / 1 0。 的溶液為生理水，以將蛋白質保持於溶液中。 地、在3 0秒至1 2 0秒的平均時間内，較佳為6 0 ，取決於塗敷器及樣本的稀釋，而使用塗敷器 本塗敷到膠上之後，梳齒與膠接觸的位置被觀 縮標記，其在移動期間不消失。在染色步驟之 標記造成染色的缺乏或如上所述之染色強度的 量（從幾克至幾十克，取決於具體實施例），此 的塗敷在該梳齒與膠接觸處壓縮該膠，造成在 縮標記的形式變形。如果不進行照料，此變形 繼續存在，並且在染色該膠之後變成可見的， 露出電泳的外形。該變形造成一個區帶，其被 不染色，其會相當有害於電泳圖的解讀。 本發明之摘要 目的是提供一種排除此裝載標記的裝置，不論 敷器的種類。 已觀察到在電泳載體上所產生之裝載標記-特

)72772 五、發明說明 別是在膠上 續電泳所i 樣本裝栽區 且特別是包 *行，渗； #!此辦要 樣本的紱份 體帶，心: I - 須 田電泳進 之電泳時間 的時段内發 ，再水合可 段内’是從 本發明人 稀釋物並且 縮導致所遺 第一時間移 該化合物時 本發明人 載樣本所標 合。 因此本發 樣本之組份 在對具有負 的，可以排除或至少被中和，使得其不影響後 之結果的解讀’是在樣本塗敷器施用而壓縮之 帶將電泳載體水合。此水合必須在該組份-並 含於被測試之樣本中的蛋白質-容許的條件下 到此電泳載體的區帶，以進行電泳移動。 被滲透到電泳載體上並且在所加電場下移動之 而言，以用來裝載樣本之塗敷器壓縮的電泳載 被夠快且有效地再水合。 行某一段時間，水合必須在相對應於10%至20% 後/Λ對/於電壓加到電泳載體上的時間） ."U Γ'水載體加上電壓來計時。有利地 丄，办两七A 士 於10 /0電泳時間的時 加上電壓來計時。 τ 已確認某些化合物，其鱼接丄 ^ 、 因此裝載於電泳載體上:、是？:: 3導入樣本 留的清楚標記消失。這此f使電泳載體壓 除或至少減弱此分明的；1己匕合：：泳移動的 整個移動t繼續存在。、5己，而此私記在缺乏 已經觀察到·這些化合物會導 記的位置上再膨服，造成壓 明提供一種用於在電泳載體上、 方法的組合物，包含一或夕/ /7來为離 表面電荷之電泳載體加β S 3合物，其 %，當該區帶裝載

第6頁 572772 五、發明說明（4) 由裝載樣本所造成之壓縮標記時，導致要被分離之樣本的 裝載區帶的水合。此壓縮是載體上由運用塗敷器之壓力所 造成的。 在電泳載體上負表面電荷的存在是非零電内滲性（或電 滲透流）的訊息。 由使用塗敷器裝載樣本所造成之電泳載體壓縮可以肉眼 觀察到，並且相對應於在載體上的壓縮標記。例如：當塗 敷器的壓力是大於0. 1克/平方公釐時，被敘述為V字形的 此標記，在對由0. 8 %洋菜膠所組成之電泳載體而言，通常 是少於1 0 0微米的深度，並且V的兩個頂部之間是約1毫米 的寬度。 取決於情況，用於製備本發明之組合物的離子化合物在 電泳移動期間可被移動或或維持幾乎不動。 在電場中缺乏移動是歸因於化合物的天性其在組合物中 的濃度、或這些因素的組合。 對所給之電泳載體而言，當電内滲指數（-r m指數，相對 移動指數）為已知的特別情況下，離子化合物存在於組合 物中的濃度被測定為這些化合物之天性的函數，特別是其 在加上電場之後於電泳載體上的移動能力與否。此濃度必 須選擇，而使得於電泳移動的第一時間内在電泳載體上使 樣本裝載區帶水合。 如上所述，電泳載體之所要的水合或再水合效應取決於 所用離子化合物的天性，並且也可被電泳載體的組合物影 響，特別是其電内滲指數。

第7頁 572772 五、發明說明（5) 在這方面， 夠添加足夠的 滲透流之洋菜 0. 07或更大。 用於本發明 合物。其被使 在本發明之 或多個選自在 因此這些化 電泳期間不與 本發明有利 (zwitterioni 可在本發明 胺基酸類的兩 做為一個實 基酸來產生， 在本發明之 式 NH「R-C00H 滿足上述定 與其他化合物 性或非離子性 合該電泳載體 適用於製備 當電泳載體為洋菜膠時，為了在移動期間能 水，特別在膠壓縮帶上，例如使用有非零電 膠，例如：相對應於相對流動指數-r m為 之離子化合物被溶解而形成上述所定義之組 用於低於其溶解限度的一組濃度。 較佳具體實施例之詳細敘述 第一個較佳具體實施例中，該組合物包含一 電場中幾乎不進行移動的那些離子化合物。 合物可再水合經壓縮的電泳載體帶，但是在 樣本的組份一起移動。 地提供包含一或多個選自兩性離子 c )化合物的組合物。 之内容中引述之兩性離子化合物的實例為： 性離子化合物或兩性離子緩衝物。 例，本發明之組合物可以式N Η 2 - R _ C 0 0 Η的胺 其中R包含一個無電荷的極性支鏈。 另一個較佳具體實施例中，該胺基酸是選自 的胺基酸，其中R包含一個鹼性的支鏈。 義之一或其他的胺基酸可單獨、或可選擇地 混合而以混合物來使用，該化合物可為離子 ，當此載體可進行電内滲透時，其能夠再水 本發明之組合物的可引用胺基酸實例為：胺

第8頁 572772 五、發明說明（6) 基醋酸（較佳的濃度為與其在2 5 °C下的水中溶解度相容； 在這方面，可使用的濃度範圍為1莫耳濃度至3. 33莫耳濃 度）及濃度為0.28莫耳濃度的苯基丙胺酸。 其他的實例為選自優越濃度為1莫耳濃度或更大之L-離 胺酸、較佳濃度範圍為0 . 4 5莫耳濃度至0 . 8 6莫耳濃度之L -精胺酸及較佳濃度為0 . 2 7莫耳濃度之L -組胺酸的胺基酸。 可引用於本發明之用、濃度大於0.3莫耳濃度並且在其 溶解度限制内的兩性離子緩衝物實例為下列的生物缓衝物 或其鹽類： 淬辛（TRICINE)(N-參（羥甲基）甲基-甘胺酸）； 赫皮斯（1^?£8)以-(2-羥乙基）哌嗪-『-（2-乙烷磺酸）； 皮派斯（PIPES)(哌嗪-Ν-Ν’ -雙（2-乙烷磺酸）； 摩帕斯（MOPS)(3-(N-嗎啉基）丙烷磺酸）； 塔波斯（TAPS)(N-參（羥甲基）甲基-3 -胺基丙烷磺酸）； 阿帕所（AMPSO)(3 -（（1，：1 -二曱基-2 -羥乙基）胺基）-2-羥 基丙烷磺酸）； 泰斯（TES)(N-參（羥曱基）曱基-2-胺基乙烷磺酸）； 貝斯（BES)(N，N -雙（2 -羥乙基）-2-胺基乙烷磺酸）； 拜辛（BICINE)(5N，N-雙（2-羥乙基）甘胺酸）； 崔斯（CHES)(2-(N-環己基胺基）乙烷磺酸）； 迪普索（DIPSO)(3-(N，N_雙（2_羥乙基）胺基-2 -羥基-丙 烧續酸）； 伊普斯（EPPS) (N-( 2 -羥乙基）哌嗪-Ν’ -（3-丙烷磺酸）； 瑪普索（MOPSO)(3-(Ν-嗎啉基）丙烷磺酸）；

第9頁 572772 五、發明說明（7) 帕普索（POPSO)(哌嗪-N，Ν’ -雙（2’ -羥丙烷磺酸）； 曼斯（MES)(2 -嗎啉基乙烷磺酸）。 另外，本發明人觀察到：來自樣本移動第一時間之電泳 載體的理想再水合效果可以進行電泳移動的離子化合物得 到，其限制條件為：這些化合物存在的濃度是足以使得除 了其移動之外，使電泳載體在樣本裝載區帶水合。此類化 合物是例如：使用高濃度的鹽類，且特別使用例行的步驟 來測定濃度，計算陰離子的流動性。陰離子的流動性越低 ，鹽的有效濃度越低。 藉著實例，這些鹽類可選自濃度1莫耳濃度或更高的 NaCl、KC1或NaHC03，或濃度0.15莫耳濃度或更高的硼酸 鹽、或濃度0.5莫耳濃度或更高的磷酸鹽或醋酸鹽。 因此本發明係關於滿足上述定義之一、或幾個這些定義 組合的組合物用途，用來在區帶中水合電泳載體，其中以 電泳分離的樣本被裝載。 此用途可以使用本發明之組合物，來藉以稀釋要以電泳 分離的樣本。 本發明也提供一種套組（k i t )，用來進行以電泳分離樣 本組份的方法，其特徵在於包含： •上述所定義之組合物； •由有非零電滲透流之凝膠所構成的電泳載體。 此套組也可包含任何其他試劑或裝置，其為一般存在於 電泳套組中的，如··移動緩衝物，以及用來鑑別以電泳自 樣本中分離之組份的顯示劑。

第10頁 572772 五、發明說明（8) 可用於本發明之電泳載體，一般為凝膠，並且特別是有 非零之電滲透流的凝膠。 可引用的實例為洋菜膠，特別是來自FMC-拜歐惠特克 (BIOWHITTAKER)的HGT®或HEEO®洋菜膠、或來自伊斯斑那 格（HISPANAGAR)的LE®或SHE®、或其混合物。 這些洋菜膠具有非零之電内滲性。用來製備本發明之電 泳載體的洋菜膠濃度為〇·8%至1 %的洋菜，並且可包含洋菜 的混合物。 本發明也係關於以電泳將樣本之組份分離的方法，包 含： •使用塗敷器裝載樣本，其組 •如上述地同時裝载樣本、裝 •加上電場，使樣本組份移動 •顯示以電泳分離之組份。 物 顯示的進行可使用染色 使用抗毒血清並染色。 上述所定義之方法可使用 可特別包含免疫固定化步驟 特別地，本發明之方法使 效地被用於偵測在生物樣本 (para-protein)的存在。 此方法可有利地在區帶 當進行本發明之方法時 ’能在電泳移動的第一 份在電泳載體上被分離； 載組合物到電泳載體上； 並且在免疫固定化的情況下可 例行之電泳方法來進行，並且 ’來顯示以電泳方離之組份。 出上述所定義之組合物，右 中之對偶.蛋白質 了有 時再本::發明之

572772 五、發明說明（9) 為了進行同時裝載，可在裝載於電泳載體之前將樣本 本發明之組合物組合，特別是在組合物中稀釋該樣本。 本發明之另外特色及優點從下列實例中而變得更清楚 〆··在免疫固定膠上分析（Typing)稀釋於淬辛 溶液（0 · 4 5莫耳濃度）中之血清對偶蛋白質 · (para~protein $ 〇 \ Va^ ^ > 0 〇 · 3 2克之淬辛被溶解於試管中的4毫升水裡。因此所組 成之稀釋物準備被使用。要被typed之血清樣本於稀釋液 中被稀釋成三分之一，用於相對應於電泳型態之狹道 (lane)中，一如IgA、IgM、IgK 及Ig λ 狹道（例如·· 3〇 微 之血漿及60微升的稀釋液），並且對igG顯示狹道稀釋成為 六分之一（例如：2 0微升之血漿及1 〇 〇微升的稀釋液）。”、、 4亳升之生理水被導入另一個試管中，以如上相同之 式稀釋相同的樣本。 、，10微升的經稀釋樣本被進料到歐洲專利—A —〇 4 9 3 9 9 6、 ，國專利-5 464 515及美國專利-A -5 405 516中所述之 :ϊ ί敷器的個別井孔中。'然後此帶電荷的塗敷器以1分 名里塗敷至I F膠表面。 20 ί ί =膠之樣本使用在2〇。。溫度下調整之儀器，藉著 瓦的私力以電泳來分離約1 0分鐘。 、ίτ移，之J，以特定之抗毒血清（抗1 gG、抗1以、抗1 §Μ (几S 几來培養各移動狹道而將對偶蛋白質 tyPed，並且相對應於電泳型態之狹道有 吳固定溶液。過量的試劑被移除，並且該凝膠被乾燥

572772 五、發明說明α〇) ~ _ ，並以酸藍紫（acid vi〇iet)染色。 ，淬辛中稀釋之樣本被觀察到在膠上裝 那些以生理水稀釋的凝膠顯示強列 記。 .〜‘一一一.一——〜_一一，...”一..一 '、、、的塗敷器印 實例第2號：在免疫固定膠上分析（Typ 酸溶液（0.86莫耳濃度）中之血清對偶蛋白質）稀釋於精胺 (para-proteiη) 〇 、 0.6克之L -精胺酸被溶解於試管中的4毫升 組成之稀釋物準備被使用。要被typed之血清樣於因所 液中被稀釋成三分之一，用於相對應於電泳型’鮮之狹酋 ，一如IgA、IgM、IgK 及Ig λ 狹道（例如：3〇 微； 60微升的稀釋液），並且對][gG顯示狹道稀釋成為六分^一 (例如：2 0微升之血漿及1 〇 〇微升的稀釋液）。 刀 4毫升之生理水被導入另一個試管中，以如上相同之方 式稀釋相同的樣本。 1 0微升的經稀釋樣本被進料到歐洲專利-A — 〇 4 9 3 9 9 6、 美國專利-A -5 464 515及美國專利-A - 5 405 516中所述之 薄膜塗敷器的個別井孔中。然後此帶電荷的塗敷器以丨分 鐘塗敷至I F膠表面。 塗敷到I F膠之這些樣本使用在2 0 °C溫度下調整之儀器， 藉著20瓦的電力以電泳來分離約1〇分鐘。 在移動之後，以特定之抗毒血清（抗I g G、抗I g a、抗I g μ 、抗IgK、抗Ig又）來培養各移動狹道而將對偶蛋白質 (para-protein) typed，並且相對應於電泳型態之狹道有

第13頁 572772 五、發明說明（11) '^ -- 蛋白質固定溶液。過量的試劑被移除，並 ，並以酸藍紫染色。且^膝被乾無 在精胺酸中稀釋之樣本被觀察到在膠上裝 記顯示，而那些以生理水稀釋的凝膠顯示強烈的塗器^

記。 时I 納2號草耳在Λ疫=定膠上分析(typing)稀釋於氯化 納心液（1 · 2莫耳》辰度）中之血清對偶蛋白質 (para-prote in) ° 、 〇·29克之NaCl被溶解於試管中的4亳斗 忐夕絲®铷進供分说& T J零升水中。因此所組 成之稀釋物準備被使用。要被typed之血 φ姑接經士、-八— m 月樣本於稀釋液 中被稀釋成二刀之一，用於相對應於電泳 一如 IgA、IgM、IgK 及 IgA 狹道（例如：3〇t:m = Rn 做升的稀釋液）’亚且對IgG顯示狹道稀八 (例如：2 0微升之血漿及丨〇 〇微升的稀釋液）’、、、/、刀 4毫升之生理水被導入另一個試管中，以如 式稀釋相同的樣本。 上相U之万 、1 0微升的經稀釋樣本被進料到歐洲專利—A — 〇 4 9 3 9 6、 ΪΞΪΓ_Α_ 5 4 6 4 5 1 5及美國專利-A-5 4 0 5 5 1 6中所述之 Ϊ Ϊ Ϊ tV!的個別井孔中。然後此帶電荷的塗敷器以1分 知塗敷至I F膠表面。 $到IF膠之這些樣本使用在2〇。。溫度下調整之儀器， 稭耆2 0瓦的電力以電泳來分離約丨〇分鐘。 f移動之，以特定之抗毒血清（抗IgG、抗IgA、抗IgM 几I g K、抗I g λ)來培養各移動狹道而將對偶蛋白質

572772 五、發明說明（12) (para-protein) typed，並且相對應於電泳型態之狹道有 蛋白質固定溶液。過量的試劑被移除，並且該凝膠被乾燥 ，並以酸藍紫染色。 在濃NaCl溶液中稀釋之樣本被觀察到在膠上裝載的位置 無標記顯示，而那些以生理水稀釋的凝膠顯示強烈的塗敷 器印記。

第15頁 572772 圖式簡單說明

Claims (1)

1. 572772, 號 901(33911 申請專利範圍 修正

   1. 一種用於在電泳載體上以電泳分離樣本組份之方法之 組合物，其包含一個離子化合物，其對具有負表面電荷之 電泳載體加上電場，當該區帶帶有由裝載樣本所造成之壓 縮標記時，導致要被分離之樣本區帶產生水合。 2 .根據申請專利範圍第1項的組合物，其中該離子化合 物在電場中不進行實質上地移動。 3 .根據申請專利範圍第1或2項的組合物，其中離子化合 物的濃度是藉著裝載區帶的水合，使得其在樣本裝載區帶 的存在排除由裝載樣本所造成之壓縮標記。 4.根據申請專利範圍第1或2項的組合物，其中該離子化 合物是選自兩性離子（zwitterionic)化合物。 5 .根據申請專利範圍第4項的組合物，其中該兩性離子 化合物是胺基酸。 6 .根據申請專利範圍第4項的組合物，其中該兩性離子 化合物是兩性離子緩衝物。 7. 根據申請專利範圍第5項的組合物，其中該胺基酸式 為NH2-R_C00H，其中R包含一個無電荷的極性支鏈。 8. 根據申請專利範圍第5項的組合物，其中該胺基酸式 為NH2-R-C00H，其中R包含一個鹼性的支鏈。 9 .根據申請專利範圍第7項的組合物，其中該胺基酸為 胺基醋酸，存在的濃度為與其在25°C下的水中溶解度相容 ;或濃度為0.28莫耳濃度的苯基丙胺酸。 1 0 .根據申請專利範圍第8項的組合物，其中該胺基酸是 選自濃度為1莫耳濃度或更高的L-離胺酸、濃度範圍為0.45

   O:\69\69338-920325.ptc 第17頁 572772 _案號90103911 ^么年j月 日 修正_ 六、申請專利範圍 莫耳濃度至0.86莫耳濃度的L-精胺酸、及濃度為0.27莫耳 濃度之L -組胺酸。 1 1 .根據申請專利範圍第4項的組合物，其中該兩性離子 緩衝物是選自下列的生物緩衝物： 淬辛（TRICINE)(N-參（羥甲基）甲基-甘胺酸）； 赫皮斯（HEPES)(N-（2 -羥乙基）哌嗪-Ν’ -（2 -乙烷磺 酸）； 皮派斯（PIPES)(哌嗪-Ν-Ν’ -雙（2 -乙烷磺酸）； 摩帕斯（MOPS)(3-(N-嗎啉基）丙烷磺酸）； 塔波斯（TAPS)(N -參（經甲基）甲基-3 -胺基丙烧石黃 酸）； 阿帕所（AMPSO)(3 -（（1, 1-二甲基-2 -羥乙基）胺基）-2 -羥基丙烷磺酸）； 泰斯（TES)(N -參（羥甲基）甲基-2 -胺基乙烷磺酸）； 貝斯（BES)(N,N -雙（2 -羥乙基）-2 -胺基乙烷磺酸）； 拜辛（BICINE)(5N,N-雙（2-羥乙基）甘胺酸）； 崔斯（CHES)(2-(N-環己基胺基）乙烷磺酸）； 迪普索（DIPSO)(3-(Ν,Ν -雙（2 -羥乙基）胺基-2 -羥基-丙烧績酸）； 伊普斯（£??3)(1(2-羥乙基）哌嗪-『-(3-丙烷磺 酸）； 瑪普索（MOPSO)(3-(N-嗎啉基）丙烷磺酸）； 帕普索（POPSO)(哌嗪-N, Ν’ -雙（2’ -羥丙烷磺酸）； 曼斯（Μ E S ) ( 2 -嗎啉基乙烷磺酸）；

   O:\69\69338-920325.ptc 第18頁 572772 _案號 90103911 年 月 日_^_ 六、申請專利範圍 或該等緩衝物的鹽。 1 2.根據申請專利範圍第1項的組合物，進一步包含一個 鹽，其濃度足以在其移除之前，能夠於電場效應下將電泳 載體之壓縮區帶水合。 1 3.根據申請專利範圍第1 1項的組合物，其中該兩性離 子緩衝物的濃度是大於0 . 3莫耳濃度。 1 4.根據申請專利範圍第1 2項的組合物，其中該鹽是選 自濃度為1莫耳濃度或更高的NaCl、KC1或NaHC03，或濃度 0.15莫耳濃度或更高的硼酸鹽、或濃度0.5莫耳濃度或更 高的磷酸鹽或醋酸鹽。 1 5. —種在要以電泳分離之樣本的裝載區帶中水合電泳 載體的方法，該方法包含的步驟是在電泳期間使用根據申 請專利範圍第1項的組合物。 1 6. —種稀釋以電泳分離之樣本的方法，該方法包含的 步驟是添加申請專利範圍第1項的組合物至被分析的該樣 本中。 1 7、一種進行以電泳來分離樣本組份之方法的套組（k i t) ，其包含： •根據申請專利範圍第1項的組合物； •由有非零電滲透流之凝膠所構成的電泳載體。 1 8.根據申請專利範圍第1 7項的套組，其中該電泳載體 是洋菜（agarose)膠。 1 9. 一種以電泳分離樣本之組份的方法，包含： •使用裝載器（appl icator)裝載樣本，該樣本之組份

   O:\69\69338-920325.ptc 第19頁 572772 _案號90103911 年3月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 在電泳載體上可被分離； •同時裝載樣本、裝載根據申請專利範圍弟1項的組 合物到電泳載體上； •加上電場，使樣本組份移動； ‘顯示以電泳分離之組份。 2 0 .根據申請專利範圍第1 9項的方法，其中在裝載於電 泳載體之前，將該樣本及該組合物組合。 2 1 .根據申請專利範圍第1 9或2 0項的方法，其中該電泳 載體是含有負表面電荷之洋菜膠。

   O:\69\69338-920325.ptc 第20頁