EP1180242A1 - Polymer-enthaltendes vesikel und darauf basierte sensor-nachweisverfahren - Google Patents

Polymer-enthaltendes vesikel und darauf basierte sensor-nachweisverfahren

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Publication number
EP1180242A1
EP1180242A1 EP00938651A EP00938651A EP1180242A1 EP 1180242 A1 EP1180242 A1 EP 1180242A1 EP 00938651 A EP00938651 A EP 00938651A EP 00938651 A EP00938651 A EP 00938651A EP 1180242 A1 EP1180242 A1 EP 1180242A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
detection method
biological
vesicle
sensor platform
bioanalytical
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00938651A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dietmar KRÖGER
Horst Vogel
Michael Pawlak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Zeptosens AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeptosens AG filed Critical Zeptosens AG
Publication of EP1180242A1 publication Critical patent/EP1180242A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings

Definitions

  • the invention relates to a functionalized, polymer-reinforced (sterically stabilized) vesicle, which comprises a biological or biochemical recognition element for the recognition and binding of a ligand, a method for the production and its use.
  • a reagent for bioanalytical applications both in solution and on a solid surface, which ensures the functionality and native conformation of a biological molecule serving as a recognition element, for example membrane receptors, for the detection of a ligand specifically binding to it and at the same time minimized non-specific interactions with this recognition element.
  • the present invention relates to a biological or biochemical reagent comprising
  • Another object of the invention is a functionalized, polymer-reinforced (sterically stabilized) vesicle, which additionally contains labels as signal-generating components in a bioanalytical method, which can be selected from the group of ESR or NMR spin labels, mass labels, electrochemical labels , Luminescence labels or fluorescence labels.
  • the at least one label as a signal-generating component can be located inside the vesicle or can be bound to the outer shell of the vesicle directly or via a spacer or via the polymer.
  • a large number of similar labels, in particular of similar luminescent or fluorescent labels, can also be associated with the vesicle.
  • luminescent or fluorescent labels can be conventional luminescent or fluorescent labels or so-called luminescent or fluorescent nanoparticles based on semiconductors (WCW Chan and S. Nie, "Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection", Science 281 (1998) 2016 - 2018) act.
  • the invention further relates to methods for producing said functionalized vesicle and its use in bioanalytical detection methods. These can be selected from the group consisting of the detection of optical signal changes, electrochemical detection, impedance spectroscopy, electron spin resonance, nuclear magnetic resonance, quartz crystal measurements or a combination of these methods.
  • Another object of the invention is a method for producing a biological or biochemical reagent according to the invention, characterized in that
  • C) brings together at least one biological or biochemical or synthetic recognition element to be bound or adsorbed to the vesicle or to be bound or adsorbed to a polymer molecule in order to recognize and bind a ligand in sequential mixing and evaporation steps.
  • the invention further relates to a bioanalytical detection method using a biological or biochemical reagent according to the invention.
  • the analyte can be detected by means of an optical signal change.
  • the optical signal change is determined using an optical sensor serving as a sensor platform. This sensor platform is preferably selected from the group consisting of optical waveguide sensors and surface plasmon sensors.
  • the optical signal change to be determined is based on the change in the effective refractive index in the near field of the sensor surface. It is also preferred if the optical to be determined Signal change based on a luminescence or fluorescence generated in the near field of the sensor.
  • a planar or fibrous waveguide can be used as the sensor platform. It is preferred if a planar thin-film waveguide is used, which comprises a first optically transparent layer (a) on a second optically transparent layer (b).
  • the invention further relates to a bioanalytical detection method using a biological or biochemical reagent according to the invention, characterized in that the excitation light is coupled into the thin-film waveguide serving as a sensor platform via one or more gratings (c).
  • optically transparent layer (b ') with a lower refractive index than that of layer (a) and a thickness between the optically transparent layers (a) and (b) and in contact with layer (a) from 5 nm to 1000 ⁇ m, preferably from 10 nm to 1000 nm.
  • the function of the intermediate layer is to reduce the surface roughness under layer (a) or to reduce the penetration of the evanescent field of light guided in layer (a) into the one or more layers below or to improve the adhesion of layer (a) the one or more underlying layers or the reduction of thermally induced voltages within the optical sensor platform or the chemical isolation of the optically transparent layer (a) from underlying layers by sealing micropores in layer (a) against underlying layers.
  • the biological or biochemical recognition elements there are a number of methods for applying the biological or biochemical recognition elements to the optically transparent layer (a). For example, this can be done by physical adsorption or by electrostatic interaction. The orientation of the recognition elements is then generally statistical. In addition, there is a risk that if the composition of the sample containing the analyte or the reagents used in the detection method differ, some of the immobilized recognition elements will be washed away. It can therefore be advantageous if biological or biochemical detection elements (e) an adhesion-promoting layer (f) is applied to the optically transparent layer (a).
  • This adhesive layer should also be optically transparent. In particular, the adhesive layer should not protrude beyond the depth of penetration of the evanescent field from the wave-guiding layer (a) into the medium above. Therefore, the adhesion promoting layer (f) should have a thickness of less than 200 nm, preferably less than 20 nm.
  • Another object of the invention is a bioanalytical detection method with a sensor platform, which is characterized in that the thin-film waveguide serving as the sensor platform comprises several measuring ranges for the simultaneous or sequential determination of one or more analytes from one or more samples.
  • the lattice structure (c) is a diffractive lattice with a uniform period.
  • the resonance angle for coupling the excitation light via the grating structure (c) to the measuring areas is then uniform in the entire area of the grating structure.
  • the corresponding resonance angles for the coupling can differ significantly, which can make the use of additional adjustment elements in an optical system necessary to accommodate the sensor platform or can lead to spatially very unfavorable coupling angles .
  • the grating structure (c) is a multi-diffractive grating.
  • the material of the second optically transparent layer (b) can consist of glass, quartz or a transparent thermoplastic from the group formed by polycarbonate, polyimide or polymethyl methacrylate.
  • the refractive index of the waveguiding, optically transparent layer (a) is significantly larger than the refractive index of the adjacent layers. It is particularly advantageous if the refractive index of the first optically transparent layer (a) is greater than 2.
  • the first optically transparent layer (a) can consist of Ti0 2 , ZnO, Nb 2 ⁇ 5 , Ta 2 ⁇ 5 , Hf0 2 , or Zr0 2 . It is particularly preferred if the first transparent optical layer (a) consists of Ti0 2 or Ta 2 Os.
  • the thickness of the wave-guiding optically transparent layer (a) is the second relevant parameter for generating the strongest possible evanescent field at its interfaces with neighboring layers with a lower refractive index.
  • the strength of the evanescent field increases with decreasing thickness of the waveguiding layer (a) as long as the layer thickness is sufficient to guide at least one mode of the excitation wavelength.
  • the minimum “cut-off" layer thickness for guiding a mode depends on the wavelength of this mode. It is larger for longer-wave light than for short-wave light. However, as the "cut-off" layer thickness is approached, undesired propagation losses also increase sharply to what further limits the choice of preferred layer thickness.
  • layer thicknesses of the optically transparent layer (a) which only allow the guidance of 1 to 3 modes of a predetermined excitation wavelength
  • layer thicknesses which lead to monomodal waveguides for this excitation wavelength are very particularly preferred.
  • the discrete mode character of the guided light only refers to the transverse modes.
  • the resonance angle for the coupling of the excitation light in accordance with the above-mentioned resonance condition depends on the diffraction order to be coupled in, the excitation wavelength and the grating period.
  • the first diffraction order is advantageous.
  • the grating depth is decisive for the level of the coupling efficiency. In principle, the coupling efficiency increases with increasing grid depth.
  • the coupling efficiency also increases at the same time, so that it is used to excite luminescence in a measuring area (d) arranged on or adjacent to the lattice structure (c), depending on the geometry of the Measuring ranges and the irradiated excitation light bundle, gives an optimum. Because of these boundary conditions, it is advantageous if the grating (c) has a period of 200 nm - 1000 nm and the modulation depth of the grating (c) is 3 nm to 100 nm, preferably 10 nm to 30 nm.
  • the ratio of the modulation depth to the thickness of the first optically transparent layer (a) is equal to or less than 0.2.
  • a thin metal layer preferably made of gold or silver, optionally on an additional layer, is located between the optically transparent layer (a) and the immobilized biological or biochemical detection elements dielectric layer with a lower refractive index than the layer (a), for example made of silica or magnesium fluoride, is applied, the thickness of the metal layer and the possible further intermediate layer being selected such that a surface plasmon in the Excitation wavelength and / or the luminescence wavelength can be excited.
  • Another object of the present invention is an optical system for determining one or more luminescences, with at least one excitation light source of a sensor platform according to at least one of the named
  • the excitation light emitted by the at least one light source is coherent and is irradiated onto the one or more measurement areas at the resonance angle for coupling into the optically transparent layer (a).
  • At least one spatially resolving detector is used for the detection.
  • At least one detector from the group formed by CCD cameras, CCD chips, photodiode arrays, avalanche diode arrays, multichannel plates and multichannel photomultipliers can be used as the at least one spatially resolving detector.
  • optical components from the group that are used by lenses or lens systems can be used between the one or more excitation light sources and the sensor platform according to one of the aforementioned embodiments and / or between the said sensor platform and the one or more detectors for shaping the transmitted light bundles, planar or curved mirrors for deflection and, if necessary, additionally for shaping the shape of light bundles, prisms for deflection and, if necessary, for spectral division of light bundles, dichroic mirrors for spectrally selective deflection of parts of light bundles, neutral filters for regulating the transmitted light intensity, optical filters or monochromators for spectrally selective transmission of parts of light bundles or polarization-selective elements for the selection of discrete ones Polarization directions of the excitation or luminescent light are formed.
  • the excitation light is irradiated in pulses with a duration of between 1 fsec and 10 minutes.
  • the emission light from the measurement areas is measured in a temporally resolved manner.
  • the excitation light can be irradiated and the emission light to be detected sequentially from one or more measurement areas for individual or more measurement areas.
  • the sequential excitation and detection can be carried out using movable optical components which are formed from the group of mirrors, deflection prisms and dichroic mirrors.
  • the sensor platform is moved between steps of sequential excitation and detection.
  • the one or more excitation light sources and the components used for detection can be spatially fixed.
  • Another object of the invention is a complete analytical system for luminescence detection of one or more analytes in at least one sample on one or more measurement areas on a sensor platform, comprising an optical layer waveguide, with a sensor platform according to one of the aforementioned
  • Embodiments as well Feeding means to bring the one or more samples into contact with the measuring areas on the sensor platform.
  • samples and any additional reagents can be supplied in parallel or crossed microchannels, under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials.
  • the one or more luminescence or fluorescence labels used for the detection of the analyte on the analyte or in a competitive assay on an analogue of the analyte or in a multi-stage assay is bound to one of the binding partners of the analyte or the biological or biochemical or synthetic recognition elements used.
  • the bioanalytical detection method according to the invention is used for the simultaneous or sequential, quantitative or qualitative determination of one or more analytes from the group of antibodies or antigens, receptors or ligands, chelators or "histidine tag components", oligonucleotides, DNA or RNA strands, DNA - or RNA analogs, enzymes, enzyme factors or inhibitors, lectins and carbohydrates.
  • the samples to be examined can be naturally occurring body fluids such as blood, serum, plasma, lymph or urine or egg yolk.
  • a sample to be examined can also be an optically cloudy liquid, surface water, a soil or plant extract, a bio- or synthesis process broth.
  • the samples to be examined can also be taken from tissue parts of living or deceased organisms.
  • lipid vesicles with their double-layer membranes have mainly been used in two ways.
  • lipid vesicles are used in research as model systems for biological membranes.
  • the vesicles then serve as carrier systems for water-insoluble membrane proteins and receptors.
  • lipid vesicles are used commercially in the pharmaceutical business as transport systems of therapeutically active reagents for the targeted therapeutic treatment of diseases.
  • the term "vesicle” is used exclusively, regardless of the different use of both terms in the literature.
  • vesicle-forming lipids contain amphiphatic lipids with hydrophobic and polar groups.
  • the hydrophobic components are referred to as “lipid chains” and the hydrophilic or polar components as "polar head groups”.
  • lipid molecules can spontaneously form double-layer structures, such as lipid vesicles.
  • the above-mentioned lipid molecules can also be easily inserted into already formed double layers or vesicles in such a way that the lipid chains are integrated into the hydrophobic interior of the lipid double layer and the polar head groups into the region formed by the head groups of the existing vesicles.
  • the vesicle-forming lipids preferably have two hydrocarbon chains with a typical length of 14 to 22 carbon atoms with different unsaturated character, for example with alkyl chains.
  • Such lipid molecules can be isolated, for example, from biological membranes of different organisms and are referred to as "naturally occurring lipids".
  • Typical examples are glycero- phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic acid and sphinogomyelin.
  • lipids include the classes of glycolipids, sterols such as cholesterol, cardiolipin, plasmalogen and lipids which are found in archaebacteria, for example those with hydrocarbon chains coupled to ether groups, branched hydrocarbon chains or hydrocarbon chains with aliphatic ring structures or so-called bipolar lipids in which a lipid molecule is involved extends over a lipid double layer (for a detailed description see, for example, RB Gennis: "Biomembranes", Advanced Texts in Chemistry (publisher: CR Cantor), Springer, Heidelberg 1989).
  • Other examples include artificial lipids, such as those commercially available, for example, from Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA.
  • lipids that do not belong to naturally occurring lipid classes. They can contain activatable or polymerizable groups, both in the lipid chains and in the polar head groups. Further examples are positively charged lipids such as dodecylammonium bromide (DODAB) or boloamphiphiles as well as lipids which contain fluorinated or halogenated lipid-hydrocarbon chains.
  • DODAB dodecylammonium bromide
  • boloamphiphiles as well as lipids which contain fluorinated or halogenated lipid-hydrocarbon chains.
  • Synthetic lipids are ideally suited for the formation of vesicles, either as pure compounds , as mixtures of different synthetic lipids or in mixtures which comprise synthetic and naturally occurring lipids.
  • Vesicles are typically prepared according to one of the following protocols or in a combination thereof (as described, for example, by F. Szoka and D. Papahadjopoulos, Rev. Biophys. Bioeng. 9 (1980) 467-508).
  • n Multilamellar vesicles are typically made by rehydrating dried lipid films or powders under various conditions, for example adding water or an aqueous buffer solution to a lipid film that has been previously deposited in a suitable vessel from a lipid solution in an organic solvent by its evaporation .
  • MLVs of different sizes are formed.
  • Small unilamellar vesicles are produced by sonication of MLVs or by extrusion (extruding) of MLVs through filters. In the latter case, the diameter of the vesicles is typically of the same order of magnitude as the pore size of the filters used.
  • Another very useful manufacturing method is the detergent dilution method. Lipids or MLVs are dissolved in the presence of detergents, which are subsequently removed by means of dilution, dialysis, chromatography, adsorption, ultrafiltration or centrifugation, so that SUVs ultimately form.
  • LUV's Large unilamellar vesicles
  • LUV's are typically made by removing a detergent or by injection methods, whereby lipids dissolved in organic solvents are injected into water or an aqueous buffer solution, or by reverse phase evaporation methods. In the latter case, LUVs are formed by emptying droplets of organic solvents in which the lipids have been dissolved and which are dispersed in the aqueous phase.
  • Very large vesicles are produced, for example, by vibration-free swelling of uniformly dried lipid films in aqueous solution.
  • vesicles with a diameter of 20-1000 nm are preferred, particularly preferably 50-400 nm, very particularly preferably 50-200 nm.
  • the polymers mentioned under B) serve both to stabilize the vesicle and to reduce non-specific binding to the surface.
  • the biological or biochemical reagent according to the invention contains hydrophilic polymer molecules which are bound to the inner and / or outer surface of the vesicle.
  • the hydrophilic polymer is bound to the vesicle to create a hydrophilic shell. This shell can be viewed as a steric barrier to the diffusion of molecules into or out of the vesicle.
  • Such vesicles are therefore also referred to as sterically stabilized vesicles.
  • the vesicle-bound polymers have a high conformational flexibility and enable a high transition rate between different conformations, which corresponds to a high entropy.
  • a vesicle approaches or even binds to a particle or a macroscopic surface, such as the surface of a sensor
  • the reduction in the conformational freedom of the polymer corresponds to a loss of entropy.
  • vesicles can evade the mononuclear phagocyte system and are also called “stealth vesicles”. They are used to transport active pharmaceutical ingredients in an organism. In the understanding of this invention, such vesicles are referred to as “sterically stabilized vesicles” (SSV's).
  • the polymer molecule can be attached to the vesicle surface by one of the following methods or a combination of these methods:
  • Electrostatic interactions between positively (or negatively) charged portions of the polymer and negatively (or positively) charged groups on the vesicle surface can be, for example, from the polar lipid head groups or others suitable compounds, such as natural or artificial polypeptides, in or on the vesicle double layer.
  • Suitable functional groups on lipids are amino groups, e.g. Diacylglycerophosphatidylethanolamine, or SH groups or OH groups of natural or synthetic lipid molecules.
  • the polymers can be bound either directly to the lipid molecules or via spacer molecules between the lipid molecules or lipid-like molecules. Some of these compounds are commercially available with active head groups, which are, for example, reactive towards amines or thiols.
  • succinimide derivatives examples include succinimide derivatives, pyridinylthio derivatives or maleimide derivatives, and some are sold, for example, by Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA. Further examples not commercially available were described in G. Brink et al., Biochem. Biophys. Acta 1196 (2, 1994) 227-230.
  • anchoring molecules are naturally occurring transmembrane proteins or membrane-spanning polypeptides or membrane-associated proteins or polypeptides or their synthetically produced analogs. Said membrane proteins or polypeptides are also referred to as the hydrophobic core ("core") of the membrane, for example in the case of membrane-spanning or transmembrane proteins or polypeptides.
  • core hydrophobic core
  • Peripheral protein or polypeptide molecules are connected to the membrane primarily through ionic interactions, hydrogen bonds or hydrophobic interactions, and in some cases via lipid anchors which are covalently bound to a protein molecule (see L. Stryer: "Biochemistry", 4th edition, Freeman ( 1995) p. 275 ff.).
  • hydrophilic polymers are suitable for binding to vesicles, some examples of which are described below.
  • Stepth Vescicles is described in DD Lasic and F. Martin: “Stealth Liposomes ", CRC Press, Boca Raton, 1995.
  • US 5534241 US 5770222 and US 5891468 vesicle-bound polyglycols or similar hydrophilic polymers are described as part of diblock copolymers consisting of hydrophilic and hydrophobic polymers, to the hydrophobic polymers and in to enclose and shield active substances enclosed in the vesicles and to release them under suitable physiological conditions by opening the hydrophilic polymers.
  • Negatively or positively charged or zwitterionic polymers can be used. Typical examples are polypeptides and polysulfoxides, which, like further examples, are mentioned in US 5770222.
  • Examples are chitin / chitosan dextran, starch and similar polymers, as they are named in US 5891468.
  • lipid vesicles There are two main uses for lipid vesicles.
  • the first area of application is the use of lipid vesicles as model systems for biological membranes, especially in the field of basic research (see, for example, RB Gennis: "Biomembranes", Advanced Texts in Chemistry (publisher: CR Cantor), Springer, Heidelberg (1989).
  • vesicles as carriers or for the administration of therapeutic agents for the targeted treatment of diseases.
  • membrane enzymes e.g. tyrosine kinases, adenylate cyclases
  • membrane transporters e.g. ATPases
  • these conventional vesicles When used for drug delivery, these conventional vesicles have a very short circulation time in the blood. When administered in vivo, they show a strong tendency towards rapid accumulation in the phagocytic cells of the mononuclear phagocytic system. In order to overcome the disadvantageous short circulation time, hydrophilic polymers were bound to the vesicle, as already mentioned above.
  • antibodies or antibody fragments are bound to the vesicle as specific recognition elements.
  • these vesicles circulate in the bloodstream and bind to the corresponding antigen, which occurs specifically in the target tissue, by means of the antibodies bound to them, which leads to a concentration of the vesicles and thus also the active substances transported by them in this tissue.
  • These vesicles are called immuno-liposomes.
  • the antibodies can be bound to the lipids of the vesicle either directly or via so-called spacer molecules.
  • PEG polyethylene glycol
  • Other known examples include binding the antibody directly (or via a short spacer molecule) to a lipid of an SSV such that the antibody is within the hydrophilic polymer shell.
  • WO 94/21235 claims liposome compositions for patient treatment which have an outer, hydrophilic layer of PEG (molecular weight 1000-10000 Dalton) and which have covalently bound recognition elements, so-called effectors.
  • the PEG envelope is used to prevent the vesicles from breaking down in the bloodstream.
  • the effectors consist of small to medium-sized immunodetection elements, namely F AB fragments, Glycoproteins, cytokines, polysaccharides or various peptides or peptide hormones.
  • WO 97/35561 claims biologically activated liposomes stabilized with a water-soluble polymer shell for therapeutic use.
  • Biological, amphiphilic recognition elements in active form are non-covalently linked to the polymer-stabilized liposomes, i.e. via physisorption.
  • the recognition element is a peptide, a 'growth hormone releasing factor'.
  • Unilamellar liposomes with a diameter of less than 300 nm, produced by extrusion, are preferred.
  • PEG is preferably used as the polymer, which is present in the form of a covalently coupled PEG lipid in the liposome-forming membrane.
  • a liposome composition for diagnostic purposes is claimed, which additionally contains labels for detection purposes. Fluorescence markers, radioactive labels, dyes and components for signal amplification in nuclear magnetic resonance are given as detectable markers. The method and position of attaching the labels to the vesicle are not specified.
  • polymer-stabilized vesicles for therapeutic use are claimed in which ligands for the detection of cell receptors are bound at the end of the polymer chains. After target recognition via ligand-receptor interaction and subsequent fusion of the vesicle with the target membrane, the vesicle should also have the function of releasing the hydrophilic polymer chains.
  • WO 97/33618 i.a. Vesicles for intracellular drug delivery especially for therapeutic purposes of cancer therapy, which is mediated by T-lymphocytes, claimed, wherein the recognition elements are attached via a combination spacer-polymer-spacer. HPMA copolymer is used as the polymer.
  • vesicles described above and their areas of application have hitherto exclusively related to therapeutic use with the main function of a vesicle as a carrier or transport vehicle.
  • the use of vesicles in the bioanalytical field has only been described occasionally.
  • WO 97/39736 describes vesicles as reagents for immunoassays in order to analyze patient samples.
  • Vesicles with associated ligands for the detection of analyte molecules are generally claimed here, where the ligands can consist of proteins, peptides, antibodies or fragments thereof as well as nucleic acids.
  • the ligands are smaller hapten molecules for immuno-recognition, which are covalently linked to the vesicle in particular in the form of hapten lipids.
  • Signal detection in the assay is carried out by binding the vesicle reagent to a hard surface equipped with the appropriate biological receptors in the form of beads, particles or a microtiter plate wall.
  • the signal is generated by attaching a secondary label in solution to the liposome after analyte detection, for example in a sandwich assay, the label being a fluorescent or luminescent molecule, a dye, or a signal-generating enzyme, for example an alkaline phosphatase.
  • the specific bio-recognition can also be carried out by binding to a secondary vesicle that carries the corresponding receptors.
  • the specific ligand-receptor binding should be maintained during the analysis in the presence of the vesicle. It should be noted that in the case described, no additional polymers are used and described for stabilizing the liposome.
  • vesicles for signal amplification in bioanalytical detection methods has been described by some groups.
  • a competitive assay method is described in which vesicle-bound theophyillin molecules compete with free theophylline molecules in solution as analyte for binding to anti-theophylline antibodies immobilized on the waveguide surface.
  • the vesicles in the hydrophilic interior are loaded with a large number of carboxy-fluorescein molecules as fluorescent labels.
  • a partner of an affinity system is immobilized on a solid surface, for example a chemical or biochemical sensor, in order to specifically recognize and bind the analyte from a sample in the subsequent detection method.
  • the functionalization of the surface is of crucial importance.
  • environment-sensitive biological interactions such as, for example, with membrane receptors
  • a variety of techniques are known for the detection of analytes on a solid surface.
  • optical detection methods which are based on interactions in the surface-bound near field of the sensor, are particularly important because of minimal interference with the binding processes.
  • Such optical near-field methods are known, for example, as refractive or luminescence-based detection methods in the evanescent field of a waveguide or in the field of the depth of penetration of a surface plasmon produced in a thin metal film (surface plasmon resonance, SPR).
  • Fluorescence-based detection methods by fluorescence excitation in the evanescent field of planar waveguides are described, for example, in WO 95/33197 and WO 95/33198 for discrete analyte determinations and in WO 96/35940 for the simultaneous determination of several analytes.
  • lipids and amphiphilic or hydrophilic polymers are converted into sterically stabilized vesicles which comprise a biological or biochemical or synthetic recognition element for recognizing and binding a ligand.
  • a biological or biochemical or synthetic recognition element refers to any biological molecule or molecular complex or artificial, chemical or genetic modification, or synthetic molecule or molecular complex that is specific to any other Connection binds.
  • Biological or biochemical or synthetic recognition elements are preferably used from the group consisting of antibodies, antibody fragments, nucleic acids or nucleic acid analogs, DNA, RNA, enzymes, natural and synthetic polypeptides, histidine tag components and membrane receptors.
  • Said other compound can be ions, atoms, clusters of atoms, molecules, molecular clusters, any synthetic or biological compounds or parts thereof, which are specifically recognized and bound by said recognition element.
  • the biological or biochemical or synthetic recognition elements are associated with or integrated into the surface of the vesicle or are bound to the polymer or to the lipids of the vesicle.
  • the specific recognition and binding of said compound by the identified recognition element can be part of a bioanalytical detection method and thus be a further subject of the invention.
  • said compound can be an analyte to be detected in a sample.
  • the detection can be carried out by determining the change in a physically measurable quantity as a result of the binding of the analyte itself or an analogue of the analyte (for example in a competitive detection method) or in a multi-stage binding process in which the analyte or its analogue is bound in a partial step will be done.
  • a physically measurable quantity can be changed, for example, by luminescence after excitation of light or signals from an ESR or NMR label after excitation, or by changing the molecular mass adsorbed on a surface.
  • the detection can take place in free solution or on a solid surface, for example the surface of a sensor.
  • the bioanalytical detection method was carried out using a commercial SPR apparatus (Biacore 1000, Upsala, Sweden). Unless otherwise stated, the process was carried out under constant flow at a flow rate of 5 ⁇ L / min at 25 ° C.
  • Monomolecular layers were produced by self-assembly (self-assembled monolayers, SAM's) of 16-mercapto-hexadecanoic acid and 11-mercaptoundekanol on the pure gold surface of SPR sensor chips Jl (Biacore) outside the device in a chamber saturated with ethanol Avoid evaporation of the solvent.
  • SAM's self-assembled monolayers
  • a solution with 1 mM 16-mercaptohexadecanoic acid and 1.5 mM 11-mercaptoundekanol (from a mixture of 40 ⁇ L stock solution of 4 mM 16-mercapto-hexadecanoic acid in 1: 1 water / ethanol and 6 mM 11-mercaptoundekanol in ethanol with 80 ⁇ L Ethanol) in 1: 7 water / ethanol in aliquots of 30 ⁇ L added to the sensor surface. After 30 minutes, the solution was renewed, resulting in the formation of a mixed monomolecular self-assembled layer (SAM) after 80 to 100 minutes.
  • SAM monomolecular self-assembled layer
  • the SAM was functionalized using the following procedure: The sensor surface was firstly coated with HEPES-buffered saline (HBS: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween 20, pH 7.4) flushed at a flow rate of 10 ⁇ L / min.
  • HBS HEPES-buffered saline
  • Lipids dissolved in chloroform were mixed in the desired ratio (typically 80 mol% l, 2-dioleoyl-s “-glycero-3-phosphatidylchorine (DOPC), 10" cholesterol (chol), and 10% l, 2-dioleoyl-j "- Glycero-3-phosphatidylglycerol (DOPG))
  • DOPC 2-dioleoyl-s "-glycero-3-phosphatidylchorine
  • chol cholesterol
  • DOPG 2-dioleoyl-j "- Glycero-3-phosphatidylglycerol
  • solutions (1) to (3) were dialyzed against a 650-fold buffer volume (10 mM HEPES, 3 mM EDTA, 1 mM NaN 3 , pH 7.4) at room temperature.
  • the dialysis buffers for (1) and (2) additionally contained 500 mM NaCl, for (3) additionally 500 mM NaCl and CHAPS in a concentration corresponding to one tenth of the kitic micellar concentration (CMC), ie approx. 0.5 mM.
  • CMC kitic micellar concentration
  • the buffers were renewed and the ionic strength of the buffer (1) was reduced from 500 mM NaCl to 300 mM NaCl. After 5 hours of further dialysis at 4 ° C., the buffers were renewed again, the ionic strength of the buffer (1) being reduced further to 150 mM NaCl. Dialysis was completed after 10 hours at 4 ° C.
  • the optimal selection of the polymer chain length and the optimal proportion of polymer-coupled lipids depends on the size of the vesicle-associated biological or biochemical or synthetic recognition element and the accessibility for the analyte to be bound, with a tendency to prefer relatively long-chain polymers and / or a high proportion of the total number of lipid molecules in the case of large recognition elements or relatively short-chain polymers and / or a small proportion in the case of small recognition elements.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein funktionalisiertes, polymerverstärktes (sterisch stabilisiertes) Vesikel, welches ein biologisches oder biochemisches oder synthetisches Erkennungselement zur Erkennung und Bindung eines Liganden umfasst, und gegebenenfalls zusätzlich Label als signalerzeugende Komponenten in einem bioanalytischen Nachweisverfahren enthält, ein Verfahren zur jeweiligen Herstellung und dessen Verwendung in Nachweisverfahren.

Description

POLYMER-ENTHALTENDES VESIKEL UND DARAUF BASIERTE SENSOR-NACHWEISVERFAHREN
Gegenstand der Erfindung ist ein funktionalisiertes, polymerverstärktes (sterisch stabilisiertes) Vesikel, welches ein biologisches oder biochemisches Erkennungselement zur Erkennung und Bindung eines Liganden umfasst, ein Verfahren zur Herstellung und dessen Verwendung. Es besteht also ein Bedürfnis für die Entwicklung eines Reagens für bioanalytische Anwendungen sowohl in Lösung als auch an einer festen Oberfläche, welches die Funktionalität und native Konformation eines als Erkennungselement dienenden biologischen Moleküls, beispielsweise von Membranrezeptoren, für den Nachweis eines spezifisch daran bindenden Liganden, gewährleistet und zugleich unspezifische Wechselwirkungen mit diesem Erkennungselement minimiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein biologisches oder biochemisches Reagens, umfassend
A) ein Vesikel
B) ein oder mehrere an die innere und / oder äussere Oberfläche des Vesikels gebundene Polymermoleküle
C) mindestens ein an das Vesikel gebundenes oder adsorbiertes oder an das Polymermolekül gebundenes oder adsorbiertes biologisches oder biochemisches oder synthetisches Erkennungselement zur Erkennung und Bindung eines Liganden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein funktionalisiertes, polymerverstärktes (sterisch stabilisiertes)Vesikel, welches zusätzlich Label als signalerzeugende Komponenten in einem bioanalytischen Nach weis verfahren enthält, wobei diese ausgewählt sein können aus der Gruppe von ESR- oder NMR-Spinlabeln, Massenlabeln, elektrochemischen Labein, Lumineszenzlabeln oder Fluoreszenzlabeln. Das mindestens eine Label als signalerzeugende Komponente kann sich dabei im Innern des Vesikels befinden oder an die äussere Hülle des Vesikels direkt oder über einen Spacer oder über das Polymere gebunden sein. Es können auch eine Vielzahl von gleichartigen Labein, insbesondere von gleichartigen Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabeln, mit dem Vesikel assoziiert sein. Für bestimmte Anwendungen, in denen Energietransfer zu einer Verbesserung der Unterscheidung des spezifischen Signals von den Hintergrundsignalen eingesetzt werden soll, kann es von Vorteil sein, wenn als signalerzeugende Komponenten mehrere Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabel unterschiedlicher Emissionswellenlänge und gleicher oder unterschiedlicher Anregungs Wellenlänge verwendet werden. Bei den Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabeln kann es sich um herkömmliche Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabel oder auch um sogenannte lumineszente oder fluoreszente Nanopartikel, basierend auf Halbleitern (W. C. W. Chan und S. Nie, "Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection", Science 281 (1998) 2016 - 2018) handeln.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Methoden zur Herstellung des besagten funktionalisierten Vesikels und dessen Verwendung in bioanalytischen Nachweisverfahren. Diese können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus der Detektion optischer Signaländerungen, elektrochemischer Detektion, Impedanzspektroskopie, Elektronenspinresonanz, Kernspinresonanz, Schwingquarzmessungen oder einer Kombination dieser Verfahren.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemässsen biologischen oder biochemischen Reagens, dadurch gekennzeichnet, dass man
A) die für die Vesikelherstellung mittels Dialyse benötigten Lipidmoleküle,
B) eine oder mehrere an die innere und / oder äussere Hülle des Vesikels zu bindende Polymermoleküle und
C) mindestens ein an das Vesikel zu bindendes oder zu adsorbierendes oder an ein Polymermolekül zu bindendes oder zu adsorbierendes biologisches oder biochemisches oder synthetisches Erkennungselement zur Erkennung und Bindung eines Liganden in sequentiellen Mischungs- und Verdampfungsschritten zusammenbringt.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein bioanalytisches Nachweisverfahren unter Verwendung eines erfindungsgemässen biologischen oder biochemischen Reagens. Insbesondere kann dabei der Nachweis des Analyten mittels einer optischen Signaländerung erfolgen. Bevorzugt ist dabei, dass die Bestimmung der optischen Signaländerung mithilfe eines als Sensorplattform dienenden optischen Sensors erfolgt. Diese Sensorplattform ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus optischen Wellenleitersensoren und Oberflächenplasmonen- sensoren.
Bevorzugt ist, wenn die zu bestimmende optische Signaländerung auf der Änderung des effektiven Brechungsindex im Nahfeld der Sensoroberfläche beruht. Ebenfalls bevorzugt ist, wenn die zu bestimmende optische Signaländerung auf einer im Nahfeld des Sensors erzeugten Lumineszenz oder Fluoreszenz beruht.
Als Sensorplattform kann insbesondere ein planarer oder faserförmiger Wellenleiter verwendet werden. Bevorzugt wird, wenn ein planarer Dünnschichtwellenleiter verwendet wird, welcher eine erste optisch transparente Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein bioanalytisches Nachweisverfahren unter Verwendung eines erfindungsgemässen biologischen oder biochemischen Reagens, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in den als Sensorplattform dienenden Dünnschichtwellenleiter über ein oder mehrere Gitter (c) eingekoppelt wird.
Es kann von Vorteil sein, wenn sich zwischen den optisch transparenten Schichten (a) und (b) und in Kontakt mit Schicht (a) eine weitere optisch transparente Schicht (b') mit niedrigerem Brechungsindex als dem der Schicht (a) und einer Stärke von 5 nm - 1000 μm, vorzugsweise von 10 nm - 1000 nm, befindet. Die Zwischenschicht hat die Aufgabe einer Verringerung der Oberflächenrauhigkeit unter der Schicht (a) oder der Verminderung des Eindringens des evaneszenten Feldes von in Schicht (a) geführtem Licht in die eine oder mehrere darunter liegende Schichten oder einer Verbesserung der Haftung der Schicht (a) auf der einen oder mehreren darunter liegenden Schichten oder der Verminderung von thermisch hervorgerufenen Spannungen innerhalb der optischen Sensorplattform oder der chemischen Isolation der optisch transparenten Schicht (a) von darunter liegenden Schichten mittels Abdichten von Mikroporen in der Schicht (a) gegen darunter liegende Schichten.
Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Aufbringung der biologischen oder biochemischen Erkennungselemente auf die optisch transparente Schicht (a). Beispielsweise kann dieses durch physikalische Adsorption oder durch elektrostatische Wechselwirkung erfolgen. Die Orientierung der Erkennungselemente ist dann im allgemeinen statistisch. Ausserdem besteht die Gefahr, dass bei unterschiedlicher Zusammensetzung der den Analyten enthaltenden Probe oder der im Nachweisverfahren eingesetzten Reagentien ein Teil der immobilisierten Erkennungselemente fortgespült wird. Daher kann es von Vorteil sein, wenn zur Immobilisierung biologischer oder biochemischer Erkennungselemente (e) auf der optisch transparenten Schicht (a) eine Haftvermittlungsschicht (f) aufgebracht ist. Diese Haftvermittlungsschicht sollte ebenfalls optisch transparent sein. Insbesondere sollte die Haftvermittlungsschicht nicht über die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes aus der wellenleitenden Schicht (a) in das darüber liegende Medium hinausragen. Daher sollte die Haftvermittlungsschicht (f) eine Stärke von weniger als 200 nm, vorzugsweise von weniger als 20 nm, haben.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der als Sensorplattform dienende Dünnschichtwellenleiter mehrere Messbereiche zur gleichzeitigen oder sequentiellen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren Proben umfasst.
Durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf der Sensorplattform ist es möglich, räumlich getrennte Messbereiche (d) zu erzeugen. Im Kontakt mit einem lumineszenzfähigen Analyten oder eines mit dem Analyten um die Bindung an die immobilisierten Erkennungselemente konkurrierenden lumineszenzmarkierten Analogen des Analyten oder eines weiteren lumineszenzmarkierten Bindungspartners in einem mehrstufigen Assay werden diese lumineszenzfähigen Moleküle nur selektiv in den Messbereichen an die Oberfläche der Sensorplattform binden, welche durch die Flächen definiert werden, die von den immobilisierten Erkennungselementen eingenommen werden.
Für viele Anwendungen ist es von Vorteil, wenn die Gitterstruktur (c) ein diffraktives Gitter mit einer einheitlichen Periode ist. Der Resonanzwinkel zur Einkopplung des Anregungslichts über die Gitterstruktur (c) zu den Messbereichen ist dann im gesamten Bereich der Gitterstruktur einheitlich. Will man jedoch beispielsweise das Anregungslicht verschiedener Lichtquellen mit deutlich unterschiedlicher Wellenlänge einkoppeln, so können sich die entsprechenden Resonanzwinkel für die Einkopplung deutlich unterscheiden, was die Verwendung zusätzlicher Justierelemente in einem optischen System zur Aufnahme der Sensorplattform erforderlich machen kann oder zu räumlich sehr ungünstigen Koppelwinkeln fuhren kann. Beispielsweise zur Verringerung stark unterschiedlicher Koppelwinkel kann es daher von Vorteil sein, wenn die Gitterstruktur (c) ein multidiffraktives Gitter ist.
Das Material der zweiten optisch transparenten Schicht (b) kann aus Glas, Quarz oder einem transparenten thermoplastischen Kunststoff aus der Gruppe bestehen, die von Polycarbonat, Polyimid oder Polymethylmethacrylat gebildet wird.
Zur Erzeugung eines möglichst starken evaneszenten Feldes an der Oberfläche der optisch transparenten Schicht (a) ist es wünschenswert, dass der Brechungsindex der wellenleitenden, optisch transparenten Schicht (a) wesentlich grösser als der Brechungsindex der benachbarten Schichten ist. Insbesondere ist es von Vorteil, wenn der Brechungsindex der ersten optisch transparenten Schicht (a) grösser als 2 ist.
Beispielsweise kann die erste optisch transparente Schicht (a) aus Ti02, ZnO, Nb2θ5, Ta2θ5, Hf02, oder Zr02 bestehen. Besonders bevorzugt wird, wenn die erste transparente optische Schicht (a) aus Ti02, oder Ta2Os besteht.
Neben dem Brechungsindex der wellenleitenden optisch transparenten Schicht (a) ist deren Dicke der zweite massgebliche Parameter zur Erzeugung eines möglichst starken evaneszenten Feldes an deren Grenzflächen zu benachbarten Schichten mit niedrigerem Brechungsindex. Dabei nimmt die Stärke des evaneszenten Feldes mit abnehmender Dicke der wellenleitenden Schicht (a) zu, solange die Schichtdicke ausreicht, um mindestens einen Mode der Anregungs Wellenlänge zu führen. Dabei ist die minimale "Cut-off '-Schichtdicke zur Führung eines Modes abhängig von der Wellenlänge dieses Modes. Sie ist für längerwelliges Licht grösser als für kurzwelliges Licht. Mit Annäherung an die "Cut-off '-Schichtdicke nehmen allerdings auch ungewünschte Ausbreitungsverluste stark zu, was die Auswahl der bevorzugten Schichtdicke zusätzlich nach unten begrenzt. Bevorzugt sind solche Schichtdicken der optisch transparenten Schicht (a), welche nur die Führung von 1 bis 3 Moden einer vorgegebenen Anregungswellenlänge ermöglichen, ganz besonders bevorzugt sind Schichtdicken, welche zu monomodalen Wellenleitern für diese Anregungswellenlänge führen. Dabei ist klar, dass sich der diskrete Modencharakter des geführten Lichts nur auf die transversalen Moden bezieht. Diese Anforderungen führen dazu, dass vorteilhaft die Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) 40 nm bis 300 nm beträgt. Ganz besonders vorteilhaft beträgt die Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) 70 nmbis 160 nm.
Bei vorgegebenen Brechungsindices der wellenleitenden, optisch transparenten Schicht (a) und der benachbarten Schichten ist der Resonanzwinkel für die Einkopplung des Anregungslichts entsprechend der oben genannten Resonanzbedingung abhängig von der einzukoppelnden Beugungsordnung, der Anregungswellenlänge sowie der Gitterperiode. Zur Erhöhung der Einkoppeleffizienz ist die Einkopplung der ersten Beugungsordnung vorteilhaft. Neben der Höhe der Beugungsordnung ist für die Höhe der Einkoppeleffizienz die Gittertiefe massgeblich. Prinzipiell vergrössert sich die Koppeleffizienz mit steigender Gittertiefe. Da der Prozess der Auskopplung völlig reziprok zur Einkopplung erfolgt, erhöht sich jedoch zugleich auch die Auskoppeleffizienz, so dass es zur Anregung von Lumineszenz in einem auf der Gitterstruktur (c) angeordneten oder an diese angrenzenden Messbereich (d), in Abhängigkeit von der Geometrie der Messbereiche und der eingestrahlten Anregungslichtbündel, ein Optimum gibt. Aufgrund dieser Randbedingungen ist es von Vorteil, wenn das Gitter (c) eine Periode von 200 nm - 1000 nm aufweist und die Modulationstiefe des Gitters (c) 3 nmbis 100 nm, bevorzugt 10 nm bis 30 nm beträgt.
Weiterhin wird bevorzugt, dass das Verhältnis von Modulationstiefe zur Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) gleich oder kleiner als 0,2 ist.
Zur Verstärkung einer Lumineszenz oder zur Verbesserung des Signal-zuHintergrund-Verhältnisses kann es weiterhin von Vorteil sein, wenn zwischen der optisch transparenten Schicht (a) und den immobilisierten biologischen oder biochemischen Erkennungselementen eine dünne Metallschicht, vorzugsweise aus Gold oder Silber, gegebenenfalls auf einer zusätzlichen dielektrischen Schicht mit niedrigerem Brechungsindex als der Schicht (a), beispielsweise aus Silica oder Magnesiumfluorid, aufgebracht ist, wobei die Dicke der Metallschicht und der eventuellen weiteren Zwischenschicht so ausgewählt ist, dass ein Oberflächenplasmon bei der Anregungswellenlänge und / oder der Lumineszenzwellenlänge angeregt werden kann.
Ein weiterer Gegegnstand der vorliegenden Erfindung ist ein optisches System zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen, mit mindestens einer Anregungslichtquelle einer Sensorplattform nach mindestens einer der genannten
Ausführungen mindestens einem Detektor zur Erfassung des von dem mindestens einem oder mehreren Messbereichen (d) auf der Sensorplattform ausgehenden Lichts.
Dabei ist es von Vorteil, wenn das von der mindestens einen Lichtquelle ausgesandte Anregungslicht kohärent ist und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf die einen oder mehreren Messbereiche eingestrahlt wird.
Im Falle unzureichender Intensität einer einzigen Lichtquelle oder des Bedarfs nach Lichtquellen unterschiedlicher Emissionswellenlängen, beispielsweise für biologische Applikationen, ist es vorteilhaft, wenn als Anregungslichtquellen zwei oder mehrere kohärente Lichtquellen mit gleicher oder unterschiedlicher Emissions Wellenlänge verwendet werden.
Um die Signale von einer Vielzahl von Messbereichen getrennt aufzunehmen, wird bevorzugt, dass zur Detektion mindestens ein ortsauflösender Detektor verwendet wird.
Dabei kann als der mindestens eine ortsauflösende Detektor mindestens ein Detektor aus der Gruppe verwendet werden, die von CCD-Kameras, CCD- Chips, Photodioden-Arrays, Avalanche-Dioden-Arrays, Multichannelplates und Vielkanal-Photomulipliern gebildet wird.
In dem erfindungsgemässen optischen System nach einer der genannten Ausführungen können zwischen der einen oder mehreren Anregungslichtquellen und der Sensorplattform nach einer der vorgenannten Ausführungen und /oder zwischen besagter Sensorplattform und dem einen oder mehreren Detektoren optische Komponenten aus der Gruppe verwendet werden, die von Linsen oder Linsensystemen zur Formgestaltung der übertragenen Lichtbündel, planaren oder gekrümmten Spiegeln zur Umlenkung und gegebenenfalls zusätzlich zur Formgestaltung von Lichtbündeln, Prismen zur Umlenkung und gegebenenfalls zur spektralen Aufteilung von Lichtbündeln, dichroischen Spiegeln zur spektral selektiven Umlenkung von Teilen von Lichtbündeln, Neutralfiltern zur Regelung der übertragenen Lichtintensität, optischen Filtern oder Monochromatoren zur spektral selektiven Übertragung von Teilen von Lichtbündeln oder polarisationsselektiven Elementen zur Auswahl diskreter Polarisationsrichtungen des Anregungs- oder Lumineszenzlichts gebildet werden.
Für eine Reihe von Anwendungen ist es von Vorteil, wenn die Einstrahlung des Anregungslichts in Pulsen mit einer Dauer zwischen 1 fsec und 10 Minuten erfolgt.
Für kinetische Messungen oder für die Diskriminierung rasch abklingender Fluoreszenz von fluoreszenten Verunreinigungen in der Probe oder in Materialien von Komponenten des optischen Systems oder der Sensorplattform selbst kann es von Vorteil sein, wenn das Emissionslicht aus den Messbereichen zeitlich aufgelöst gemessen wird.
Es ist auch möglich, dass die Einstrahlung des Anregungslichts auf und Detektion des Emissionslichts von einem oder mehreren Messbereichen sequentiell für einzelne oder mehrere Messbereiche erfolgt. Dabei kann die sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung beweglicher optischer Komponenten erfolgen, die aus der Gruppe von Spiegeln, Umlenkprismen und dichroischen Spiegeln gebildet wird. Eine andere mögliche Ausführungsform ist, dass die Sensorplattform zwischen Schritten der sequentiellen Anregung und Detektion bewegt wird. In diesem Fall können die eine oder mehreren Anregungslichtquellen und die zur Detektion verwendeten Komponenten räumlich fixiert sein.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein vollständiges analytisches System zum Lumineszenznachweis eines oder mehrerer Analyten in mindestens einer Probe auf einem oder mehreren Messbereichen auf einer Sensorplattform , umfassend einen optischen Schichtwellenleiter, mit einer Sensorplattform nach einer der vorgenannten
Ausführungsformen, einem optischen System nach einer der vorgenannten
Ausführungsformen, sowie Zuführungsmitteln, um die eine oder mehrere Proben mit den Messbereichen auf der Sensorplattform in Kontakt zu bringen.
Dabei kann die Zufuhr der Proben und gegebenenfalls zusätzlichen Reagentien in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen erfolgen.
Für die quantitative und / oder qualitative Bestimmung des Analyten in dem erfindungsgemässen bioanalytischen Nachweisverfahren ist es auch möglich, dass das eine oder die mehreren zum Nachweis des Analyten verwendeten Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabel an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner des Analyten oder der eingesetzten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente gebunden sind.
Bei den vorgenannten Verfahren ist es möglich, dass (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über die Gitterstruktur (c) ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
Das erfindungsgemässe bioanalytische Nachweisverfahren dient der gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Antikörpern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren oder "Histidin-Tag- Komponenten", Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
Die zu untersuchenden Proben können natürlich vorkommende Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Eigelb sein.
Eine zu untersuchende Probe kann aber auch eine optisch trübe Flüssigkeit, Oberflächenwasser, ein Boden- oder Pflanzenextrakt, eine Bio- oder Syntheseprozessbrühe sein. Die zu untersuchenden Proben können auch aus Gewebeteilen lebender oder verstorbener Organismen entnommen sein.
Lipidvesikel mit ihren doppelschichtigen Membranen werden bis jetzt hauptsächlich in zweierlei Hinsicht angewendet.
Zum einen werden Lipidvesikel in der Forschung als Modellsysteme für biologische Membranen eingesetzt. Die Vesikel dienen dann als Trägersysteme für wasserunlösliche Membranproteine und -rezeptoren.
Zum anderen werden Lipidvesikel kommerziell im Pharmageschäft als Transportsysteme von therapeutisch wirksamen Reagenzien für die gezielte therapeutische Behandlung von Krankheiten benutzt. Nachfolgend wird ausschliesslich die Bezeichnung "Vesikel" benutzt, unabhängig von dem unterschiedlichen Gebrauch beider Bezeichnungen in der Literatur. Im allgemeinen enthalten vesikelbildende Lipide amphiphatische Lipide mit hydrophoben und polaren Gruppen. Nachfolgend werden die hydrophoben Anteile als "Lipidketten" und die hydrophilen oder polaren Anteile als "polare Kopfgruppen" bezeichnet. In wässriger Umgebung können solche Lipidmoleküle spontan Doppelschichtstrukturen ausbilden, wie beispielsweise Lipidvesikel.
Die Struktur und Charakterisierung solcher Vesikel wird in Standard- Lehrbüchern wie beispielsweise in R. B. Gennis: "Biomembranes", Advanced Texts in Chemistry (Herausgeber: C. R. Cantor), Springer, Heidelberg 1989, beschrieben.
Die oben genannten Lipidmoleküle können auch leicht in bereits ausgebildete Doppelschichten oder Vesikel derart eingefügt werden, dass die Lipidketten in das hydrophobe Innere der Lipid-Doppelschicht und die polaren Kopfgruppen in die von den Kopfgruppen der vorhandenen Vesikel gebildete Region integriert werden. Die vesikelbildenden Lipide besitzen vorzugsweise zwei Kohlenwasserstoffketten mit einer typischen Länge von 14 bis 22 Kohlenstoff atomen mit unterschiedlichem, ungesättigtem Charakter, beispielsweise mit Alkyl-Ketten.
Solche Lipidmoleküle können beispielsweise aus biologischen Membranen unterschiedlicher Organismen isoliert werden und werden als "natürlich vorkommende Lipide" bezeichnet. Typische Beispiele sind Glycero- phospholipide wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure und Sphinogomyelin. Andere natürlich vorkommende Lipide umfassen die Klassen von Glycolipiden, Sterolen wie Cholesterol, Cardiolipin, Plasmalogen und Lipide, welche in Archaebakterien vorkommen, beispielweise solche mit an Äthergruppen gekoppelten Kohlenwasserstoffketten, verzweigten Kohlenwasserstoffketten oder Kohlenwasserstoffketten mit aliphatischen Ringstrukturen oder sogenannten bipolaren Lipiden, bei denen ein Lipidmolekül sich über eine Lipid- doppelschicht erstreckt (für eine detaillierte Beschreibung siehe beispielsweise R. B. Gennis: "Biomembranes", Advanced Texts in Chemistry (Herausgeber: C. R. Cantor), Springer, Heidelberg 1989). Weitere Beispiele umfassen künstliche Lipide, wie sie beispielsweise in einer Vielzahl von Ausführungen von Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA, kommerziell erhältlich sind.
Viele der oben genannten natürlich vorkommenden Lipide können auch chemisch synthetisiert werden.
Zusätzlich gibt es auch synthetisch hergestellte Lipide, welche nicht zu natürlich vorkommenden Lipidklassen gehören. Sie können aktivierbare oder polymerisierbare Gruppen enthalten, sowohl in den Lipidketten als auch in den polaren Kopfgruppen. Weitere Beispiele sind postiv geladene Lipide wie Dodecylammoniumbromid (DODAB) oder Boloamphiphile sowie Lipide, welche fluorierte oder halogenierte Lipidkohlenwasserstoff- ketten enthalten.
Ein Überblick über ein breites Spektrum synthetischer Lipide wird gegeben in J.-H. Furhop und J. Köning: "Membranes and Molecular Assemblies: The Synkinetic Approach", Monographs in Supramolecular Chemistry (Herausgeber: J. F. Stoddart), The Royal Society of Chemistry, 1994. Synthetische Lipide sind ideal geeignet zur Bildung von Vesikeln, entweder als reine Verbindungen, als Mischungen unterschiedlicher synthetischer Lipide oder in Mischungen, welche synthetische und natürlich vorkommende Lipide umfassen.
Vesikel werden typischerweise nach einem der nachfolgenden Protokolle oder in deren Kombination hergestellt (wie beispielsweise beschrieben von F. Szoka und D. Papahadjopoulos, Rev. Biophys. Bioeng. 9 (1980) 467 - 508).
n Multilamellare Vesikel (MLV's) werden typischerweise durch Rehydrierung getrockneter Lipidfilme oder -pulver unter verschiedenen Bedingungen hergestellt, beispielsweise unter Zugabe von Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung zu einem Lipidfilm, der zuvor in einem geeigneten Gefäss aus einer Lipidlösung in einem organischen Lösungsmittel durch dessen Verdampfung abgeschieden wurde. Abhängig von der Herstellungsmethode, wie beispielsweise Rühren, Schütteln, Beschallen, und der Art des Lipids, der Ionenstärke oder der Konzentration, um beispielhaft nur einige Parameter zu nennen, werden MLV's unterschiedlicher Grosse gebildet.
Beispiele für weitere Herstellungsmethoden sind die "solvent spherule method", die Umkehrphasenmethode oder Vesikelfusion durch Gefrieren / Auftauen oder Dehydrierung / Rehydrierung (siehe z. B. D. D. Lasic, Biochem. J. 256 (1988) 1 - 11).
Kleine unilamellare Vesikel (small unilamellar vesicles SUV's) werden mittels Beschallung von MLV's oder durch Extrusion (extruding) von MLV's durch Filter hergestellt. Im letzteren Fall ist der Durchmesser der Vesikel typischerweise von gleicher Grössenordnung wie die Porengrösse der verwendeten Filter. Eine andere sehr nützliche Herstellungsmethode ist die Detergens-Verdünnungsmethode. Dabei werden Lipide oder MLV's in Gegenwart von Detergentien gelöst, welche nachfolgend mittels Verdünnung, Dialyse, Chromatographie, Adsorption, Ultrafiltration oder Zentrifugierens entfernt werden, so dass sich schliesslich SUV's bilden.
Grosse unilamellare Vesikel (large unilamellar vesicles LUV's) werden typischerweise hergestellt durch Entfernen eines Detergens oder durch Injektionsmethoden, wobei in organischen Lösungsmitteln gelöste Lipide in Wasser oder eine wässrige Pufferlösung injiziert werden, oder durch Umkehrphasen-Verdampfungsmethoden. Im letzteren Fall werden LUV's durch Entleerung von Tröpfchen organischer Lösungsmittel, in denen die Lipide gelöst waren und welche in der wässrigen Phase dispergiert sind, gebildet.
Sehr grosse Vesikel werden beispielsweise durch erschütterungsfreies Anschwellen von gleichförmig getrockneten Lipidfilmen in wässriger Lösung hergestellt. Für das erfindungsgemässe biologische oder biochemische Reagens werden Vesikel bevorzugt mit einen Durchmesser von 20 - 1000 nm, besonders bevorzugt von 50 - 400 nm, ganz besonders bevorzugt von 50 - 200 nm.
Die unter B) erwähnten Polymere dienen sowohl der Stabilisierung des Vesikels als auch der Verminderung unspezifischer Bindung an die Oberfläche. Es sei insbesondere zu erwähnen, dass das erfindungsgemässe biologische oder biochemische Reagens hydrophile Polymermoleküle enthält, welche an die innere und / oder äussere Oberfläche des Vesikels gebunden sind. Das hydrophile Polymere ist an das Vesikel zwecks Erzeugung einer hydrophilen Schale gebunden. Diese Schale kann als eine sterische Barriere gegen die Diffusion von Molekülen in das Vesikel hinein oder aus diesem heraus angesehen werden. Daher werden solche Vesikel auch als sterisch stabilisierte Vesikel bezeichnet. Idealerweise haben die vesikelgebundenen Polymeren eine hohe konformationale Flexibilität und ermöglichen eine hohe Übergangsrate zwischen verschiedenen Konformationen, was einer hohen Entropie entspricht. Bei der Annäherung oder gar Bindung eines solchen Vesikels an ein Partikel oder eine makroskopische Oberfläche, wie beispielsweise die Oberfläche eines Sensors, entspricht die Verminderung der konformationellen Freiheit des Polymeren einem Entropieverlust. Dieses führt zu einer verminderten (unspezifischen) Bindung an andere Partikel oder makroskopische Oberflächen. Man bezeichnet diesen Effekt als "entropische Abschirmung" (D. D. Lasic und F. Martin: "Stealth Liposomes", CRC Press, Boca Raton, 1995). Diese Vesikel können sich dem mononuklearen Phagocytensystem entziehen und werden auch als "Stealth Vesicles" bezeichnet. Sie finden Einsatz zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe in einem Organismus. Im Verständnis dieser Erfindung werden solche Vesikel als "sterisch stabilisierte Vesikel" (SSV's) bezeichnet.
Das Polymermolekül kann an die Vesikeloberfläche durch eines der folgenden Verfahren oder eine Kombination dieser Verfahren gebunden werden:
(1) Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen positiv (oder negativ) geladenen Anteilen des Polymeren und negativ (oder positiv) geladenen Gruppen der Vesikeloberfläche. Die elektrischen Ladungen des Vesikels können beispielsweise von den polaren Lipid-Kopfgruppen oder anderen geeigneten Verbindungen, wie beispielsweise natürlichen oder künstlichen Polypeptiden, in oder auf der Vesikel-Doppelschicht, stammen.
(2) Durch kovalente Bindung des Polymermoleküls an die polaren Kopfgruppen der Lipidmoleküle, welche als Anker zur Einfügung in die Lipid-Doppelschicht des Vesikels dienen. Geeignete funktionale Gruppen an Lipiden sind Aminogruppen, z.B. Diacylglycerophosphatidylethanolamin, oder SH-Gruppen oder OH- Gruppen natürlicher oder synthetischer Lipidmoleküle. Die Polymeren können sowohl direkt an die Lipidmoleküle oder über Spacer-Moleküle zwischen den Lipidmolekülen oder lipidähnlichen Molekülen gebunden sein. Einige dieser Verbindungen sind mit aktiven Kopfgruppen kommerziell erhältlich, welche beispielsweise reaktiv gegenüber Aminen oder Thiolen sind. Beispiele umfassen Succinimid-Derivate, Pyridinylthio-Derivate oder Maleimid-Derivate und werden zum Teil beispielsweise von Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA, vertrieben. Weitere, kommerziell nicht erhältliche Beispiele wurden beschrieben in G. Brink et al., Biochem. Biophys. Acta 1196 (2, 1994) 227 - 230.
(3) Andere geeignete Verankerungsmoleküle sind natürlich vorkommende Transmembranproteine oder membranüberspannende Polypeptide oder membran-assoziierte Proteine oder Polypeptide oder deren synthetisch hergestellte Analoga. Besagte Membranproteine oder -polypeptide werden auch als der hydrophobe Kern ("core") der Membran bezeichnet, beispielsweise im Fall von membranüberspannenden oder Transmembran-Proteinen oder Polypeptiden. Periphere Protein- oder Polypeptidmoleküle sind mit der Membran vorwiegend durch ionische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken oder hydrophobe Wechselwirkungen verbunden, sowie in einigen Fällen über Lipidanker, welche kovalent an ein Proteinmolekül gebunden sind (siehe L. Stryer: "Biochemistry", 4. Ausgabe, Freeman (1995) S. 275 ff.).
Verschiedene hydrophile Polymere eignen sich für eine Bindung an Vesikel, von denen nachfolgend einige Beispiele beschrieben werden.
(l)Ungeladene Polymere
Die Verwendung von Polyethylenglycolen und deren Derivaten mit
"Stealth Vescicles" wird beschrieben in D. D. Lasic und F. Martin: "Stealth Liposomes", CRC Press, Boca Raton, 1995. In den US 5534241, US 5770222 und US 5891468 werden vesikelgebundene Poylethylenglycole oder ähnliche hydrophile Polymere als Teil von Diblock-Copolymeren, bestehend aus hydrophilen und hydrophoben Polymeren, beschrieben, um die hydrophoben Polymere sowie in den Vesikeln eingeschlossene Wirkstoffe einzuschliessen und abzuschirmen und unter geeigneten physiologischen Konditionen durch Öffnung der hydrophilen Polymere zu entlassen.
(2) Elektrisch geladene Polymeren
Es können negativ oder postiv geladene oder auch zwitterionische Polymeren verwendet werden. Typische Beispiele sind Polypeptide und Polysulfoxide, welche ebenso wie weitere Beispiele in der US 5770222 genannt werden.
(3) Kohlenhydrate und deren Derivate
Beispiele sind Chitin / Chitosan-dextran, Stärke und ähnliche Polymere, wie sie in der US 5891468 benannt sind.
(4) Dendritische hydrophile Polymere
Typische Beispiele dieser Klasse werden in G. R. Newkome, C. N. Moorefield und F. Vögtle: "Dendritic Molecules", Verlag Chemie (1996) beschrieben.
Es gibt zwei verschiedene Hauptanwendungsgebiete füi Lipid- Vesikel. Das erste Anwendungsgebiet ist die Verwendung von Lipid- Vesikeln als Modellsysteme für biologische Membranen, vor allem im Bereich der Grundlagenforschung (siehe beispielsweise R. B. Gennis: "Biomembranes", Advanced Texts in Chemistry (Herausgeber: C. R. Cantor), Springer, Heidelberg (1989). Bei dieser Anwendung dienen die Vesikel vorwiegend als Träger wasserunlöslicher Membranproteine und -rezeptoren, wie zum Beispiel Ionenkanalrezeptoren (z.B. nAchR = Acetylcholinrezeptor, 5HT3- Rezeptor, Glutamat-Rezeptor, GABA Rezeptor), G-Protein gekoppelte Rezeptoren (z.B. Neurokinin-Rezeptoren, Chemokine-Rezeptoren, ß- adrenergische Rezeptoren), Membranenzyme (z.B. Tyrosinkinasen, Adenylatcyclasen) und Membrantransporter (z.B. ATPasen) Das weitere Hauptanwendungsgebiet betrifft die Verwendung von Vesikeln als Träger oder zur Darreichung therapeutischer Wirkstoffe zur gezielten Behandlung von Krankheiten. Für diesen Einsatz ist die Verwendung von Vesikeln seit mehr als 20 Jahren bekannt. Die meisten frühen Anwendungen beruhen auf sogenannten konventionellen Vesikeln, welche typischerweise zusammengesetzt sind aus wenigen neutralen oder negativ geladenen unterschiedlichen Lipiden (meistens Phospholipiden) und / oder Cholesterol. Im Einsatz für die Wirkstoffverabreichung haben diese konventionellen Vesikel eine sehr kurze Zirkulationszeit im Blut. Bei der in-vivo-Verabreichung zeigen sie eine starke Tendenz zur schnellen Akkumulation in den phagozytischen Zellen des mononuklearen Phagozytensy stems. Zur Überwindung der nachteiligen kurzen Zirkulationszeit wurden hydrophile Polymere an das Vesikel gebunden, wie bereits oben erwähnt.
Um die Vesikel gezielter zum Gewebe zu bringen, wo sie appliziert werden sollen, werden Antikörper oder Antikörperfragmente (FAB) als spezifische Erkennungselemente an das Vesikel gebunden. Nach in-vivo-Verabreichung zirkulieren diese Vesikel im Blutstrom und binden mittels der an sie gebundenen Antikörper an das entsprechende Antigen, welches spezifisch im Zielgewebe vorkommt, was zu einer Aufkonzentrierung der Vesikel und damit auch der von ihnen transportierten Wirkstoffe bei diesem Gewebe führt. Diese Vesikel werden entsprechend als Immuno-Liposome bezeichnet. Dabei können die Antikörper entweder direkt oder über sogenannte Spacer-Moleküle an die Lipide des Vesikels gebunden sein. Als dieser Spacer kann auch ein Polymeres wie Polyethylenglycol (PEG), verwendet zur Bildung von SSVs (sterically stabilized vesicles), eingesetzt werden, so dass der Antikörper am Ende der Polymerenkette gebunden ist. Andere bekannte Beispiel umfassen die direkte Bindung des Antikörpers (oder über ein kurzes Spacer-Molekül) an ein Lipid einer SSV derart, dass sich der Antikörper innerhalb der hydrophilen Polymerenhülle befindet.
So werden in der WO 94/21235 Liposomenzusammensetzungen für Patientenbehandlung beansprucht, die eine äusssere, hydrophile Schicht von PEG (Molekulargewicht 1000 - 10000 Dalton) tragen und Erkennungselemente, sogenannte Effektoren, daran kovalent gebunden haben. Die PEG-Hülle wird beansprucht, um den Abbau der Vesikel im Blutstrom zu unterbinden. Die Effektoren bestehen aus nieder- bis mittelgrossen Immunoerkennungselementen, nämlich FAB-Fragmenten, Glykoproteinen, Zytokinen, Polysacchariden oder verschiedenen Peptiden oder Peptidhormonen. In der WO 97/35561 werden mit einer wasserlöslichen Polymerhülle stabilisierte, biologisch aktivierte Liposomen für den therapeutischen Einsatz beansprucht. Dabei sind biologische, amphiphile Erkennungselemente in aktiver Form nicht-kovalent, also über Physisorption, mit den polymer-stabilisierten Liposomen verbunden. Im speziellen Fall ist das Erkennungselement ein Peptid, ein 'growth hormone releasing factor'. Bevorzugt werden unilamellare Liposomen mit einem Durchmesser von weniger als 300 nm, hergestellt über Extrusion. Bevorzugt wird als Polymer PEG benutzt, das in Form eines kovalent gekoppelten PEG-Lipids in der liposomenformenden Membran vorliegt. Im weiteren Sinn wird eine Liposomenzusammensetzung für diagnostische Zwecke beansprucht, die zusätzlich Label zu Detektionszwecken beinhaltet. Als detektierbare Marker werden Fluoreszenzmarker, radioaktive Label, Farbstoffe und Komponenten zur Signalverstärkung in der Kernspinresonanz, angegeben. Die Methode und Position der Anknüpfung der Label an das Vesikel sind nicht spezifiziert.
In einer weiteren Variante, US 589 1468, werden polymer-stabilisierte Vesikel für den therapeutischen Einsatz beansprucht, bei denen Liganden für die Erkennung von Zellrezeptoren am Ende der Polymerketten gebunden sind. Nach erfolgter Zielerkennung über Ligand-Rezeptor- Wechselwirkung und anschliessender Fusion des Vesikels mit der Zielmembran, soll das Vesikel zusätzlich die Funktion haben, die hydrophilen Polymerketten zu entlassen. In der WO 97/33618 werden u.a. Vesikel für intrazelluläre Arzneimittelzuführung speziell für therapeutische Zwecke der Krebstherapie, welche über T-Lymphozyten vermittelt wird, beansprucht, wobei die Erkennungselemente über eine Kombination Spacer-Polymer- Spacer angebracht sind. Als Polymer dient speziell HPMA-Copolymer. Als Erkennungselemente werden u.a. Peptide, Zellgifte, Nukleinsäuren, Antigene und Arzneimittel beschrieben. In Nachfolgepatenten wurden die Erweiterung auf PEG als Polymer eingeführt (WO 98/51336) und im weiteren das Spektrum der Anwendungen erweitert, z.B. ein Interleukin 2 Peptid (IL2) als Ligand für IL2 T-Zellen Membranrezeptorerkennung (WO 99/07324).
Die oben beschriebenen Vesikel und deren Einsatzgebiete beziehen sich bisher ausschliesslich auf den therapeutischen Einsatz mit der Hauptfunktion eines Vesikels als Träger bzw. Transportvehikel. Der Einsatz von Vesikeln im bioanalytischen Bereich ist nur vereinzelt beschrieben. So werden in der WO 97/39736 Vesikel als Reagenzien für Immunoassays beschrieben, um Patientenproben zu analysieren. Allgemein beansprucht werden hier Vesikel mit assoziierten Liganden zur Detektion von Analytmolekülen, wobei die Liganden aus Proteinen, Peptiden, Antikörpern oder Fragmenten davon sowie aus Nukleinsäuren bestehen können. Speziell sind die Liganden kleinere Haptenmoleküle für die Immunoerkennung, die im besonderen in Form von Haptenlipiden kovalent mit dem Vesikel verbunden sind. Die Signaldetektion im Assay erfolgt durch Anbinden des Vesikel-Reagens an eine mit entprechenden biologischen Rezeptoren bestückte, harte Oberfläche in Form von Beads, Partikeln oder einer Mikrotiterplattenwand. Die Signalerzeugung entsteht durch Anbinden eines in Lösung befindlichen, sekundären Labels an das Liposom, nach erfolgter Analyterkennung, z.B. in einem Sandwichassay, wobei das Label ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Molekül, ein Farbstoff, oder ein signalerzeugendes Enzym, z.B. eine alkalische Phosphatase ist. Anstelle durch Bindung an eine makroskopische, feste Oberfläche kann die spezifische Bioerkennung auch durch Bindung an ein sekundäres Vesikel erfolgen, das den entsprechenden Rezeptoren trägt. In jedem Fall soll die spezifische Liganden-Rezeptor-Bindung in Anwesenheit des Vesikels während der Analyse aufrechterhalten bleiben. Anzumerken ist, dass im beschriebenen Fall keine zusätzlichen Polymeren zur Stabilisierung des Liposoms verwendet und beschrieben werden.
Als weitere Anwendung ist die Verwendung von Vesikels zur Signalverstärkung in bioanalytischen Nachweismethoden von einigen Gruppen beschrieben worden. So werden in S. A. Choquette et al.: "Planar waveguide immunosensor with fluorescent liposome amplification", Analytical Chemistry 64 (1992) 55 - 60, Vesikel in fluoreszenzbasierenden Immunoassays auf planaren Wellenleitern beschrieben. Dabei wird ein kompetitives Assay- Verfahren beschrieben, bei dem vesikelgebundene Theophyillin-Moleküle mit in Lösung befindlichen freien Theophyllin- Molekülen als Analyt um die Bindung an auf der Wellenleiteroberfläche immobilisierte anti-Theophyllin-Antikörper konkurrieren. Zugleich sind die Vesikel im hydrophilen Innern mit einer Vielzahl von Carboxy-Fluorescein- Molekülen als Fluoreszenzlabel beladen. In Abwesenheit von Theophyllin in einer zu untersuchenden Probe wird daher ein maximales, sehr hohes Fluoreszenzsignal beobachtet. Jedoch ist die Stabilität dieser Vesikels nicht durch Polymeren verstärkt, so dass durchaus ein gewisses Austreten eingekapselter Fluoreszenzlabel, in Abhängigkeit von der spezifischen Zusammensetzung der Probe, zu erwarten ist.
In oberflächengebundenen Nachweisverfahren für einen Analyten wird ein Partner eines Affinitätssystems an einer festen Oberfläche, beispielsweise eines chemischen oder biochemischen Sensors, immobilisiert, um im nachfolgenden Nachweisverfahren den Analyten aus einer Probe spezifisch zu erkennen und zu binden. Dabei ist die Funktionalisierung der Oberfläche von entscheidender Bedeutung. Insbesondere im Falle umgebungsempfindlicher biologischer Wechselwirkungen, wie beispielsweise mit Membranrezeptoren, ist die Beibehaltung der nativen Konformation des Erkennungselements zur Aufrechterhaltung der spezifischen Bindungsfähigkeit wesentlich. Zugleich ist es wichtig, unspezifische Bindung an die Oberfläche zu minimieren. Für den Analytnachweis an einer festen Oberfläche sind eine Vielzahl von Techniken bekannt. Dabei kommt optischen Nachweismethoden, welche auf Wechselwirkungen im oberflächengebundenen Nahfeld des Sensors beruhen, eine besonders grosse Bedeutung wegen minimaler Störung der Bindungsvorgänge zu. Als derartige optische Nahfeldmethoden sind beispielsweise refraktive oder lumineszenzbasierende Nachweisverfahren im evaneszenten Feld eines Wellenleiters oder im Feld der Eindringtiefe eines in einem dünnen Metallfilms erzeugten Oberflächenplasmons bekannt (Surface Plasmon Resonance, SPR)
Fluoreszenzbasierende Nachweismethoden durch Fluoreszenzanregung im evaneszenten Feld planarer Wellenleiter sind beispielsweise in den WO 95/33197 und WO 95/33198 für diskrete Analytbestimmungen und in der WO 96/35940 für die gleichzeitige Bestimmung mehrerer Analyten beschrieben.
In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung werden Lipide und amphiphile oder hydrophile Polymere in sterisch stabiliserte Vesikel überführt, welche ein biologisches oder biochemisches oder synthetisches Erkennungselement zur Erkennung und Bindung eines Liganden umfassen. Als "biologisches oder biochemisches oder synthetisches Erkennungselement" wird hierbei ein beliebiges biologisches Molekül oder Molekülkomplex oder künstlich daraus, chemisch oder genetisch, hergestellte Modifikation, oder synthetisches Molekül oder Molekülkomplex bezeichnet, welches spezifisch an eine beliebige andere Verbindung bindet. Bevorzugt werden biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente verwendet aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antikörperfragmenten, Nukleinsäuren oder Nukleinsäure- Analoga, DNA, RNA, Enzymen, natürlichen und synthetischen Polypeptiden, Histidin-Tag-Komponenten und Membranrezeptoren. Bei der besagten anderen Verbindung kann es sich um Ionen, Atome, Cluster von Atomen, Moleküle, Molekülcluster, beliebige synthetische oder biologische Verbindungen oder Teile von ihnen handeln, welche durch das besagte Erkennungselement spezifisch erkannt und gebunden werden. Zur Gewährleistung einer ausreichenden Zugänglichkeit für den Liganden oder Analyten wird bevorzugt, dass die biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente an die Oberfläche des Vesikels assoziiert oder in diese integriert oder an das Polymere oder an die Lipide des Vesikels gebunden sind.
Die spezifische Erkennung und Bindung besagter Verbindung durch das bezeichnete Erkennungselement kann Teil eines bioanalytischen Nachweisverfahrens und damit ein weiterer Gegenstand der Erfindung sein.
Beispielsweise kann es sich bei besagter Verbindung um einen nachzuweisenden Analyten in einer Probe handeln. Dabei kann der Nachweis durch die Bestimmung der Änderung einer physikalisch messbaren Grosse als Folge der Bindung des Analyten selbst oder eines Analogen des Analyten (zum Beispiel in einem kompetitiven Nachweisverfahren) oder in einem mehrstufigen Bindungsvorgang, in dem der Analyt oder sein Analogon in einem Teilschritt gebunden wird, erfolgen. Die Änderung einer physikalisch messbaren Grosse kann beispielsweise durch eine nach Lichtanregung erfolgte Lumineszenz oder nach Anregung erfolgte Signale eines ESR- oder NMR-Labels oder durch Änderung der an einer Oberfläche adsorbierten molekularen Masse erfolgen. Der Nachweis kann in freier Lösung oder an einer festen Oberfläche, beispielsweise der Oberfläche eines Sensors, erfolgen.
Zur Minimierung unspezifischer Bindung der wie oben beschrieben rekonstituierten Vesikel wurden verschiedene Parameter wie die Zusammensetzung der Lipidmischung, die Ladung des Vesikels oder der modifizierten Sensoroberfläche, Zugabe von Detergentien und Ionenstärke des Puffers variiert. Auch wenn alle diese Parameter einen gewissen Beitrag zur Herabsetzung der unspezifischen Bindung liefern können, war die verbleibende unspezifische Bindung im Endergebnis immer noch zu hoch.
Demgegenüber führte die Inkorporation von PEG-Lipiden in die Vesikel zu einer überraschenden, starken Verminderung der unspezifischen Bindung. Zwar verringert sich aufgrund sterischer Hinderung auch das spezifische Bindungssignal. Im Endergebnis wird jedoch eine deutliche Verbesserung des Verhältnisses von spezifischem zu unspezifischem Signal erzielt, was für die Messtechnik die entscheidende Grosse ist. Der Einfluss der Inkorporation des Polymeren in die Vesikel auf die beobachteten Bindungssignale kann folgendermassen erklärt werden: Das Polymere bildet eine sterische Barriere um die Membranen und führt damit zu der beobachteten Verminderung der unspezifischen Bindung. Es wurden PEG- Lipide unterschiedlicher Kettenlänge von PEG (mit Molekulargewichten von 750, 2000 und 5000 Dalton) eingesetzt.
Das nachfolgende Beispiel erläutert die Erfindung näher.
Beispiel Instrumentierung
Das bioanalytische Nachweisverfahren wurde mit einer kommerziellen SPR- Apparatur (Biacore 1000, Upsala, Schweden) durchgeführt. Wenn nicht anders bezeichnet, fand das Verfahren unter konstantem Durchfluss bei einer Flussrate von 5 μL/min bei 25°C statt.
a)
Funktionalisierung von Sensoroberflächen
Monomolekulare Schichten wurden durch Selbstorganisation (self- assembled monolayers, SAM's) von 16-Mercapto-Hexadekansäure und 11- Mercaptoundekanol auf der reinen Goldoberfläche von SPR-Sensor-Chips Jl (Biacore) ausserhalb des Geräts in einer mit Ethanol gesättigten Kammer hergestellt, um ein Verdampfen des Lösungsmittels zu vermeiden. Dazu wurde eine Lösung mit 1 mM 16-Mercaptohexadekansäure und 1.5 mM 11- Mercaptoundekanol (aus Mischung von je 40 μL Vorratslösung von 4 mM 16-Mercapto-Hexadekansäure in 1:1 Wasser / Ethanol und 6 mM 11- Mercaptoundekanol in Ethanol mit 80 μL Ethanol) in 1:7 Wasser/Ethanol in Teilmengen (aliquots) von 30 μL auf die Sensoroberfläche gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Lösung erneuert, was zur Ausbildung einer gemischten monomolekularen selbstorganisierten Schicht (SAM) nach 80 bis 100 Minuten führte.
Nach Einsetzen des SPR-Chips in die SPR- Apparatur wurde die SAM mittels des folgenden Vefahrens funktionalisiert: Die Sensoroberfläche wurde zunächst mit HEPES -gepufferter Salzlösung (HBS: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % Tween 20, pH 7.4) bei einer Flussrate von 10 μL/min gespült.
Dann wurden 20 μL von 0.2 M /V-Ethyl-iV-Dimethylaminopropyl- Carbodiimid (EDC) / 0.05 M V-Hydroxysuccinimid (NHS) bei einer reduzierten Flussrate von 5 μL/min, gefolgt von einer Injektion von 50 μL einer Streptavidin-Lösung in 1:3 Wasser/HBS (250 μg(mL) und einer weiteren Injektion von 35 μL Ethanolamin-Lösung (1 M, pH 8.5), jeweils bei einer Russrate von 5 μL/min. Abschliessend wurde α-Bungarotoxin (BgTx) an die Oberfläche gebunden mittels zweiminütiger Zufuhr einer Lösung von biotinyliertem α-Bungarotoxin (biot-BgTx) in HBS (50 μg/mL). b)
Rekonstitution von Nikotin-Acetylcholinrezeptoren (nAchR) in Lipid-
Vesikeln
In Chloroform gelöste Lipide wurden im gewünschten Verhältnis (typischerweise 80 mol % l,2-Dioleoyl-s«-Glycero-3-Phosphatidylchorin (DOPC), 10 " Cholesterol (Chol), und 10 % l,2-Dioleoyl-j«-Glycero-3- Phosphatidylglycerol (DOPG)) gemischt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde der abgeschiedene Lipidfilm wiederum gelöst unter Zugabe von 480 μL Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, pH 7.4) und von 270 μL zehnprozentigem (w/w) CHAPS, um nach anschliessender Ultrabeschallung eine endgültige Lipidkonzentration von 2 mg/mL zu erhalten. 250 μL angereicherter Rezeptormembranen (1.9 mg/mL) wurden hinzugefügt und die erhaltene Suspension nach Schütteln zentrifugiert, um ungelöstes Material zu entfernen. Lipdvesikel wurden hergestellt durch Dialyse des Überstands gegen ein 650-faches Puffervolumen (500 mM NaCl, 10 mM HEPES, 3 mM EDTA, 1 mM NaN3, pH 7.4) in einem "Slide-a-Lyser", zunächst 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, dann 8 bis 15 Stunden lang und abschliessend nochmals 2 bis 4 Stunden lang, wobei der Dialyse-Puffer bei jedem Schritt ausgetauscht wurde. Die dialysierten Vesikel wurden bis zu zwei Tage lang aufbewahrt und vor der Durchführung von SPR-Messungen nochmals zentrifugiert, um aus nicht rekonstituierten Rezeptoren entstandene Aggregate zu entfernen. Sofern nicht anders festgestellt, wurden alle Schritte bei 4°C durchgeführt.
Die Konzentrationen der in die Vesikel inkorporierten Rezeptoren wurden bestimmt durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm (ε = 450 000 M" ^m"1) in Gegenwart eines hohen Überschusses von CHAPS, um die Vesikel zu lösen und Lichtstreu-Effekte zu vermindern. Unter der Annahme, dass die beobachtete Absorption ausschliesslich durch nAchR verursacht wurde, wurden typische Rezeptorkonzentrationen von 350 nM bestimmt. Mittels quasi-elastischer Lichtstreuung nach Standard- Verfahren wurde eine enge Grössenverteilung der Vesikel, mit einem Durchmesser von 18 - 20 nm, bestimmt. Mit einer typischen Oberfläche von 60 Ä2 pro Lipidmolekül wurde abgeschätzt, dass im Durchschnitt ein Vesikel jeweils 4000 Lipidmoleküle und 0.5 Rezeptoren enthielt. Unspezifische Bindung von nAchR- Vesikeln
(1) Vier Lösungen von nAchR- Vesikeln (Lösungen (1) - (3) ohne, (4) mit 2 % PEG-Lipiden) wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Lösungen (1) bis (3) wurden gegen ein 650-faches Puffervolumen (10 mM HEPES, 3 mM EDTA, 1 mM NaN3, pH 7.4) bei Raumtemperatur dialysiert. Die Dialysepuffer für (1) und (2) enthielten zusätzlich 500 mM NaCl, für (3) zusätzlich 500 mM NaCl und CHAPS in einer Konzentration entsprechend einem Zehntel der kitischen micellaren Konzentration (CMC), d. h. ca. 0.5 mM. Nach 30 Minuten wurden die Puffer erneuert, und die Ionenstärke des Puffers (1) wurde von 500 mM NaCl auf 300 mM NaCl verringert. Nach 5 Stunden weiterer Dialyse bei 4°C wurden die Puffer nochmals erneuert, wobei die Ionenstärke des Puffers (1) weiter auf 150 mM NaCl verringert wurde. Nach 10 Stunden bei 4°C wurde die Dialyse abgeschlossen.
Zur Verringerung der unspezifischen Bindung von Lipiden wurde die Sensoroberfläche vorbehandelt mit einer Mischung mit einer molaren Zusammensetzung aus 70 % DOPC (l,2-Dioleoyl-sn-glycero-3- phosphatidylcholin), 10 % DOPG (l,2-Dioleoyl-sn-glycero-3- phosphatidylglycerol), 10 % Chol, 3 % l,2-Dimyristoyl-5«-glycero-3- Phosphatidsäure [Poly(ethylenglycol)]ester (Mr PEG = 750, DMPA- PEG750), 3 % l-Palmitoyl-2-oleoyl-5«-glycero-phosphatoethanolamin- Vr- [poly(ethylenglycol)] (Mr PEG = 2000, POPE-PEG20oo) und ), 3 % 1- Palπütoyl-2-oleoyl-5/ι-glycero-phosphatoethanolamin-N- [poly(ethylenglycol)] (Mr PEG = 5000, POPE-PEG5000) in einem Puffer aus 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 3 mM EDTA, 1 mM NaN3 bei pH 7.4.
(2) Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung der Vesikel an die mit BgTx als immobilisertem Erkennungselement modifizierte Sensoroberfäche wurden alle Bindungsstellen von nAchR für BgTx an den Vesikeln mit einem hohen Überschuss von BgTx abgesättigt und anschliessend in Lösung des entsprechenden Dialysepuffers die Bindung der abgesättigten Vesikel an die BgTx-modifizierte Sensoroberfläche als Signal für die unspezifische Bindung gemessen. Anschliessend wurde das spezifische Bindungssignal als Differenz zwischen dem totalen Bindungssignal mit nicht BgTx-abgesättigten Vesikeln und dem unspezifischen Signal bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1:
In dem vorliegenden Beispiel wurde ein maximales Verhältnis von spezifischem zu unspezifischem Signal bei PEG-Lipiden mit einem PEG- Molekulargewicht von 750 bis 2000 Dalton beobachtet. Der Anteil von PEG-Lipiden an der Gesamtzahl das vesikelbildender Lipide wurde ebenfalls variiert in einem Bereich von 0 % bis 10 %. Dabei zeigte sich die Tendenz, dass insbesondere bei längerkettigen Polymeren ein hoher Anteil zu einer nachteiligen Herabsetzung des spezifischen Bindungssignals infolge sterischer Hinderung führt. Die optimale Auswahl der Polymerkettenlänge und der optimale Anteil polymergekoppelter Lipide ist gemäss dieser Erfindung abhängig von der Grosse des vesikelassoziierten biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselements und der Zugänglichkeit für den zu bindenden Analyten, mit der Tendenz zur Bevorzugung relativ langkettiger Polymeren und / oder eines hohen Anteils an der Gesamtzahl von Lipidmolekülen im Falle grösser Erkennungselemente bzw. relativ kurzkettiger Polymeren und / oder eines kleinen Anteils im Falle kleiner Erkennungselemente.

Claims

Patentansprüche
1. Ein biologisches oder biochemisches Reagens, dadurch gekennzeichnet, dass es
A) ein Vesikel,
B) ein oder mehrere an die innere und / oder äussere Oberfläche des Vesikels gebundene Polymermoleküle und
C) mindestens ein an das Vesikel gebundenes oder adsorbiertes oder an das Polymermolekül gebundenes oder adsorbiertes biologisches oder biochemisches oder synthetisches Erkennungselement zur Erkennung und Bindung eines Liganden umfasst.
2. Biologisches oder biochemisches Reagens nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein biologisches oder biochemisches oder synthetisches Erkennungselement ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antikörperfragmenten, Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga, DNA, RNA, Enzymen, natürlichen und synthetischen Polypeptiden, Histidin-Tag-Komponenten und insbesondere Membranrezeptoren.
3. Biologisches oder biochemisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 -
2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein biologisches oder biochemisches oder synthetisches Erkennungselement an die Oberfläche des Vesikels assoziiert oder in diese integriert oder an das Polymere oder an die Lipide des Vesikels gebunden ist.
4. Biologisches oder biochemisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 -
3, dadurch gekennzeichnet, dass als stabilisierendes Polymer ein wasserlösliches Polymer verwendet wird.
5. Biologisches oder biochemisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 -
4, dadurch gekennzeichnet, dass als stabilisierendes Polymer ein hydrophiles Polymeres aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglycolen, bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 750 bis 2000 Dalton, Polypeptiden, Polysulfoxiden, Kohlenhydraten wie beispielsweise Dextranen und dendritischen hydrophilen Polymeren, verwendet wird.
6. Biologisches oder biochemisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 -
5, dadurch gekennzeichnet, dass das Vesikel unilamellar ist.
7. Biologisches oder biochemisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 -
6, dadurch gekennzeichnet, dass das Vesikel Lipide umfasst aus der Gruppe bestehend aus natürlich vorkommenden Lipiden wie Glycerophospholipiden, wie beispielsweise Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Sphinogomyelin, Glycolipiden, Sterolen wie beispielsweise Cholesterol, Cardiolipin, Plasmalogen, in Archaebakterien vorkommenden Lipiden, beispielweise solche mit an Äthergruppen gekoppelten Kohlenwasserstoffketten, verzweigten Kohlenwasserstoffketten oder Kohlenwasserstoffketten mit aliphatischen Ringstrukturen oder bipolaren Lipiden, künstliche Lipide, wie positiv geladene Lipide, wie beispielsweise Dodecylammoniumbromid (DODAB) oder Boloamphiphile, sowie künstliche Lipide, welche fluorierte oder halogenierte Lipidkohlenwasserstoffketten oder aktivierbare oder polymerisierbare Gruppen enthalten.
8. Biologisches oder biochemisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 -
7, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich ein Label als signalerzeugende Komponente zur Detektion in einem bioanalytischen Nachweisverfahren umfasst, wobei vorzugsweise das Label als signalerzeugende Komponente mit dem Vesikel assoziert ist.
9. Biologisches oder biochemisches Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zusätzliche mindestens eine Label als signalerzeugende Komponente sich im Innern des Vesikels befindet oder an die äussere Hülle des Vesikels direkt oder über einen Spacer oder über das Polymere gebunden ist.
lO.Biologisches oder biochemisches Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zusätzliche eine Label als signalerzeugende Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ESR- oder NMR-Spin-Labeln, Massenlabeln, elektrochemischen Labein oder insbesondere Lumineszenzlabeln oder Fluoreszenzlabeln.
11. Biologisches oder biochemisches Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als signalerzeugende Komponenten eine Vielzahl von gleichartigen Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabeln mit dem Vesikel assoziiert sind oder mehrere Lumineszenz- oder FTuoreszenzlabel unterschiedlicher Emissionswellenlänge und gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge mit dem Vesikel assoziiert sind.
12. Biologisches oder biochemisches Reagens nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabel lumineszente oder fluoreszente Nanopartikel verwendet werden.
13. Verfahren zur Herstellung eines biologischen oder biochemischen Reagens gemäss einem der Ansprüche 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass man
A) die für die Vesikelherstellung mittels Dialyse benötigten Lipidmoleküle,
B) eine oder mehrere an die innere und / oder äussere Hülle des Vesikels zu bindende Polymermoleküle und
C) mindestens ein an das Vesikel zu bindendes oder zu adsorbierendes oder an ein Polymermolekül zu bindendes oder zu adsorbierendes biologisches oder biochemisches Erkennungselement zur Erkennung und Bindung eines Liganden in sequentiellen Mischungs- und Verdampfungsschritten zusammenbringt.
14.Bioanalytisches Nachweisverfahren unter Verwendung eines biologischen oder biochemischen Reagens nach einem der Ansprüche 1 - 12.
15. Bioanalytisches Nachweisverfahren nach Anspruch 14 unter
Verwendung eines biologischen oder biochemischen Reagens nach einem der Ansprüche 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Analyten mittels einer Methode ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus elektrochemischer Detektion, Impedanzspektroskopie, Elektronenspinresonanz, Kernspinresonanz, Schwingquarzmessungen und insbesondere der Detektion optischer Signaländerungen oder einer Kombination dieser Verfahren erfolgt.
lό.Bioanalytisches Nachweis verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der optischen Signaländerung mithilfe eines als Sensorplattform dienenden optischen Sensors erfolgt, wobei vorzugsweise der optische Sensor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus optischen Wellenleitersensoren oder Oberflächenplasmonensensoren.
17.Bioanalytisches Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 15 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmende optische Signaländerung auf der Änderung des effektiven Brechungsindex im Nahfeld der Sensoroberfläche oder insbesondere einer im Nahfeld des Sensors erzeugten Lumineszenz oder Fluoreszenz beruht.
18. Bioanalytisches Nachweis verfahren nach einem der Ansprüche 16 - 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Sensorplattform ein planarer oder faserförmiger Wellenleiter verwendet wird.
19.Bioanalytisches Nachweisverfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Sensorplattform ein planarer Dünnschichtwellenleiter verwendet wird, welcher eine erste optisch transparente Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) umfasst.
20.Bioanalytisches Nachweisverfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in den als Sensorplattform dienenden planaren Dünnschichtwellenleiter über ein oder mehrere Gitter (c) eingekoppelt wird.
21. Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 16 - 20, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen den optisch transparenten Schichten (a) und (b) und in Kontakt mit Schicht (a) eine weitere optisch transparente Schicht (b') mit niedrigerem Brechungsindex als dem der Schicht (a) und einer Stärke von 5 nm - 1000 μm, vorzugsweise von 10 nm - 1000 nm, befindet.
22. Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 16 - 21, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immobilisierung biologischer oder biochemischer Erkennungselemente (e) auf der optisch transparenten Schicht (a) eine Haftvermittlungsschicht (f) aufgebracht ist.
23. Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 19 - 22, dadurch gekennzeichnet, dass der als Sensorplattform dienende Dünnschichtwellenleiter mehrere Messbereiche (d) zur gleichzeitigen oder sequentiellen Bestimmung einer oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren Proben umfasst.
24.Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass räumlich getrennte Messbereiche (d) durch räumlich selektive Aufbringung von biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen auf besagter Sensorplattform erzeugt werden.
25. Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 20 - 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Gitterstruktur (c) eine senkrecht oder parallel zur Ausbreitungsrichtung des in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelten Anregungslichts räumlich variierende Periodiziät aufweist.
26.Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 19 - 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Material der zweiten optisch transparenten Schicht (b) aus Glas, Quarz oder einem transparenten thermoplastischen Kunststoff aus der Gruppe besteht, die von Polycarbonat, Polyimid oder Polymethylmethacrylat gebildet wird.
27. Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 19 - 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Brechungsindex der ersten optisch transparenten Schicht (a) grösser als 2 ist.
28.Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Anspruch 19 - 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) 40 nm bis 300 nm beträgt.
29. Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 20 - 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Gitter (c) eine Periode von 200 nm - 1000 nm aufweist und die Modulationstiefe des Gitters (c) 3 nm bis 100 nm, bevorzugt 10 nm bis 30 nm beträgt.
30.Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Modulationstiefe zur Dicke der ersten optisch transparenten Schicht (a) gleich oder kleiner als 0,2 ist.
31.Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einem optischen System zur Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen, mit mindestens einer Anregungslichtquelle einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 19 - 30 mindestens einem Detektor zur Erfassung des von dem mindestens einem oder mehreren Messbereichen (d) auf der Sensorplattform ausgehenden Lichts.
32.Bioanalytisches Nachweisverfahren mit einer Sensorplattform nach einem der Ansprüche 20 - 31 , dadurch gekennzeichnet, dass das von der mindestens einen Lichtquelle ausgesandte Anregungslicht kohärent ist und unter dem Resonanzwinkel zur Einkopplung in die optisch transparente Schicht (a) auf die einen oder mehreren Messbereiche eingestrahlt wird.
33. Bioanalytisches Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 17 - 32, dadurch gekennzeichnet, dass zur Detektion mindestens ein ortsauflösender Detektor verwendet wird.
34.Bioanalytisches Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 17 - 33, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der einen oder mehreren Anregungslichtquellen und der Sensorplattform und /oder zwischen besagter Sensorplattform und dem einen oder mehreren Detektoren optische Komponenten aus der Gruppe verwendet werden, die von Linsen oder Linsensystemen zur Formgestaltung der übertragenen Lichtbündel, planaren oder gekrümmten Spiegeln zur Umlenkung und gegebenenfalls zusätzlich zur Formgestaltung von Lichtbündeln, Prismen zur Umlenkung und gegebenenfalls zur spektralen Aufteilung von Lichtbündeln, dichroischen Spiegeln zur spektral selektiven Umlenkung von Teilen von Lichtbündeln, Neutralfiltern zur Regelung der übertragenen Lichtintensität, optischen Filtern oder Monochromatoren zur spektral selektiven Übertragung von Teilen von Lichtbündeln oder polarisationsselektiven Elementen zur Auswahl diskreter Polarisationsrichtungen des Anregungs- oder Lumineszenzlichts gebildet werden.
35. Bioanalytisches Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 17 - 34, dadurch gekenzeichnet, dass die Einstrahlung des Anregungslichts auf und Detektion des Emissionslichts von einem oder mehreren Messbereichen sequentiell für einzelne oder mehrere Messbereiche erfolgt.
36.Bioanalytisches Nachweisverfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass sequentielle Anregung und Detektion unter Verwendung beweglicher optischer Komponenten erfolgt, die aus der Gruppe von Spiegeln, Umlenkprismen und dichroischen Spiegeln gebildet wird.
37. Bioanalytisches Nachweisverfahren nach Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorplattform zwischen Schritten der sequentiellen Anregung und Detektion bewegt wird.
38. Bioanalytisches Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 17 - 37, dadurch gekennzeichnet, dass das eine oder die mehreren zum Nachweis des Analyten verwendeten Lumineszenz- oder Fluoreszenzlabel an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner des Analyten oder der eingesetzten biologogischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselemente gebunden sind.
39.Bioanalytisches Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 17 - 38, dadurch gekennzeichnet, dass (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über die Gitterstruktur (c) ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.
40.Bioanalytisches Nachweisverfahren nach mindestens einem der
Ansprüche 14 - 39 zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Antikörpern oder Antigenen, Rezeptoren oder Liganden, Chelatoren oder "Histidin-tag-Komponenten", Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Strängen, DNA- oder RNA- Analoga, Enzymen, Enymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen und Kohlehydraten.
41. Bioanalytisches Nachweis verfahren nach mindestens einem der
Ansprüche 14 - 40, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben natürlich vorkommende Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Eigelb oder optisch trübe Flüssigkeiten oder Oberflächenwasser oder Boden- oder Pflanzenextrakte oder Biooder Syntheseprozessbrühen oder aus Gewebeteilen lebender oder verstorbener Organismen entnommen sind.
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