EP1161550A1 - Zielzellspezifische, multivalente proteine (mvp) - Google Patents

Zielzellspezifische, multivalente proteine (mvp)

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Publication number
EP1161550A1
EP1161550A1 EP00910717A EP00910717A EP1161550A1 EP 1161550 A1 EP1161550 A1 EP 1161550A1 EP 00910717 A EP00910717 A EP 00910717A EP 00910717 A EP00910717 A EP 00910717A EP 1161550 A1 EP1161550 A1 EP 1161550A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
binding
virus
mvp
cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00910717A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Roland Kontermann
Dirk Nettelbeck
Hans-Harald Sedlacek
Rolf Müller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Aventis Pharma Deutschland GmbH
Publication of EP1161550A1 publication Critical patent/EP1161550A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • MVP Target-cell-specific, multivalent proteins
  • monovalent proteins are found in nature. These monovalent proteins bind with their binding partner, e.g. B. a cell membrane receptor, in a stoichiometric ratio of 1: 1. Examples of such monovalent proteins are growth factors, cytokines, chemokines, peptide hormones and complement receptors. Furthermore, bonds also occur in nature in a stoichiometric ratio of> 2: 1. For example, two molecules of the growth factor VEGF bind in the form of a dimer to a cell membrane receptor, the VEGF receptor, in order to activate it, while the binding of monomers cannot bring about activation of this receptor.
  • B a cell membrane receptor
  • the amount of binding products between such monovalent proteins and, for example, their receptors is determined here by the strength of the binding forces between the two binding partners and their respective concentrations.
  • bivalent and multivalent proteins are already produced by nature.
  • Such bivalent and multivalent proteins are, for example, dimers or multimers of monovalent proteins.
  • antibodies dimers linked to one another via SH groups, of two identical heterodimers linked via SH groups, each consisting of an L chain and an H chain
  • T cell receptor consisting of an ⁇ chain and a ß chain.
  • the invention now relates to new target-cell-specific, multivalent proteins (MVP) which have at least two binding structures which bind to a molecule of a binding partner or at least to two different binding partners.
  • MVP multivalent proteins
  • the invention further relates to target-cell-specific, multivalent proteins (MVP) which contain a fusogenic peptide and can penetrate through cell membranes with the aid of this fusogenic peptide.
  • MVP target-cell-specific, multivalent proteins
  • the invention further relates to target cell-specific multivalent proteins (MVP) which contain a cleavage sequence for a protease.
  • MVP target cell-specific multivalent proteins
  • the invention also relates to the use of such a target-cell-specific, multivalent protein for the prophylaxis, therapy or diagnosis of a disease.
  • Target-cell-specific, multivalent proteins have already been described as ligands for viral or non-viral vectors.
  • viruses in particular adenoviruses
  • additional peptide sequences for conjugation of the desired ligands are expressed on their surface (WO 95/26412)
  • a virus in particular adenovirus
  • a fusion protein consisting of the cell-external part of the cellular receptor for the virus, a linker and a ligand for a receptor on the desired target cell
  • a virus in particular adenovirus
  • a fusion protein consisting of an antibody or antibody fragment specific for a protein on the virus capsid and a ligand specific for the desired target cell (WO 94/10323, WO 98/40508)
  • a virus especially adenovirus
  • Fusion piotein consisting of an antibody or antibody fragment specific for an epitope in the hexon region of the virus and a cationic peptide
  • a plasmid EP A 0 535 576 A1
  • cell-specific binding structures such as heregulin (Han et al., PNAS 92, 9747 (1995)), erythropoietin (Kasahara et al., Science 266, 1373 (1994)), antibody fragments such as "single chain Fv” ( Marin et al., J. Virol. 70, 2957 (1996)) or receptors such as the extracellular part of the Fc receptor (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)) incorporated into the envelope glycoproteins of retroviral vectors and thereby causes a target cell specificity.
  • heregulin Hasahara et al., Science 266, 1373 (1994)
  • antibody fragments such as "single chain Fv” ( Marin et al., J. Virol. 70, 2957 (1996)) or receptors such as the extracellular part of the Fc receptor (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)) incorporated into the envelope glycoprotein
  • non-viral vectors consist of plasmids complexed with cationic molecules, such as, for example, cationic polymers or cationic lipids.
  • cationic molecules such as, for example, cationic polymers or cationic lipids.
  • cell-specific binding structures such as asialoglycoprotein (Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 1152 (1994)) or synthetic derivatives thereof (Merwin et al., Bioconjugate Chem. 5, 612 (1994)) linked with polylysine and this either complexed with the gene construct or chemically bound to coat proteins of adenoviral vectors.
  • Another method was to bind cell-specific binding structures to streptavidin, which in turn binds to biotin conjugated to the phospholipid head groups of liposomes, the liposomes being complexed with gene constructs (Redelmeir et al., Drug Deliv. J. Deliv. Targeting Therap. Agents 2 , 98 (1995)).
  • a further development consisted in the production of artificial ligand systems consisting of a target cell-specific binding structure, a vector-specific binding structure and possibly a fusogenic peptide. a first such ligand system was presented by Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271, 10560 (1996).
  • This ligand system consists of an antibody fragment specific for the Erb B2 receptor on tumor cells, the fusogenic peptide of Pseudomonas exotoxin A and the DNA-binding domain of the Gal4 protein of yeast, which is inserted into a transgene containing the corresponding Gal4 binding sequence Plasmid, binds.
  • this ligand system leads to target cell-specific transfection, it has the disadvantage of the immunogenicity of the yeast Gal4 protein.
  • the invention relates to target cell-specific, multivalent proteins (MVP) for the prophylaxis, therapy or diagnosis of a disease, characterized in that the MVP has at least two identical binding structures which bind to a molecule of a binding partner on the target cell.
  • the invention further relates to MVPs which have at least two different binding structures specific to the same or different binding partners on the target cell.
  • the molecules according to the invention enable improved binding to, inclusion in or networking with the target cell.
  • the present invention is a further development of the invention, disclosed in patent application EP-A 0 846 772, in which multifunctional ligands are described, and a further development of the technology for producing single-chain, double-antigen-binding molecules (DE 198161417, not published).
  • Patent applications are expressly referred to with this invention.
  • the cell-specific binding structures according to the present invention can be cell membrane-binding active substances, such as, for example, homodimers or homomultimers of an adhesion molecule, a growth factor, a cytokine, a chemokine, a hormone, an antibody or an antibody fragment, or the cell membrane-binding parts of these molecules, which are only one of these substances of a cell membrane receptor.
  • cell membrane-binding active substances such as, for example, homodimers or homomultimers of an adhesion molecule, a growth factor, a cytokine, a chemokine, a hormone, an antibody or an antibody fragment, or the cell membrane-binding parts of these molecules, which are only one of these substances of a cell membrane receptor.
  • binding structures can furthermore be heterodimers or heteromultimers composed of cell-membrane-binding active substances, such as, for example, from adhesion molecules, growth factors, cytokines, chemokines, hormones, antibodies or antibody fragments, or else the cell-membrane-binding parts of these active substances, which bind to at least two different cell and membrane receptors.
  • active substances such as, for example, from adhesion molecules, growth factors, cytokines, chemokines, hormones, antibodies or antibody fragments, or else the cell-membrane-binding parts of these active substances, which bind to at least two different cell and membrane receptors.
  • the increased binding to or cross-linking of the same or different cell membrane receptors has the consequence, for example, that the MVP according to the invention bind more strongly to the target cell and / or are taken up in the target cell (for example by pinocytosis, endocytosis or phagocytosis).
  • the increased binding to target structures other than cell membrane receptors can, for example, result in increased complex formation with the target structure.
  • the MVP can be constructed from the following components: a) from at least one active ingredient [component (a) n ] b) from one or more linkers which may contain a fusogenic peptide and / or a cleavage sequence for a protease [component b ) m ] c) from at least two binding structures, [component c) 0 ],
  • components a) n , b) m and c) 0 are to be joined together here by any peptide sequence with a length of preferably 0-30 amino acids in such a way that the resulting MVP represents a single protein strand and the function or Effect of each individual component a) n , b) m and c) 0 is completely retained. 7
  • the invention further relates to target-cell-specific, multivalent proteins in which at least two MVPs are linked to one another.
  • This connection can take place between components a) n , b) m and / or c) 0 and can be non-covalent or covalent, for example in the sense of a peptide bond or an -SS bond.
  • FIGS. 1 and 2 Examples of the possibilities resulting from this invention are shown schematically in FIGS. 1 and 2 (a-c).
  • component a) n may be the same or different from component c) 0 .
  • Component a or component c can be selected from a group comprising, for example:
  • a binding structure for a virus such as for AdV, AAV, a lentivirus, an RTV, vaccinia virus, HSV, influenza virus, HIV - a recombinant antibody specific for a virus protein, for a non-viral vector or for a nucleic acid, such as an IgG, F (from ') 2 , Fab, rec. Fv, diabody or single chain, double antigen binding protein
  • a peptide with binding affinity to a defined nucleic acid sequence such as LexA, Gal4 or the DNA binding domain of a transcription factor or an antibody
  • An active ingredient such as the part of a receptor that binds the ligand, the ligand for a receptor or the part that binds the receptor
  • a recombinant antibody specific for a membrane structure on the target cell for example IgG, F (ab ') 2 , Fab, rec. Fc, diabody or single chain, double antigen binding proteins
  • component b) m can contain one or more linkers selected from a group, for example comprising
  • Another object of the present invention is a nucleic acid coding for a molecule according to the invention.
  • the nucleic acid is generally a DNA or RNA, preferably a double-stranded DNA.
  • Expression product contains the nucleic acid of the invention at the 5 'end
  • Nucleotide sequence coding for a signal or transmembrane sequence (see e.g. EP-A 0 848 063 or EP-A 0848 061).
  • An example of suitable signal or transmembrane sequences is the signal sequence for the immunoglobulin (DNA position ⁇ 63 to> 107, the signal sequence for the CEA (DNA position ⁇ 33 to> 134) or the signal sequence of the Human Respiratory Syncytial Virus Glycoproteins (cDNA the amino acid sequences ⁇ 38 to> 50 or 48 to 65).
  • the nucleic acid according to the invention contains a promoter and / or activator at the 5 'end.
  • the activator is preferably cell-specific, cell cycle-specific, metabolically specific and / or can be activated or suppressed by an active ingredient.
  • activator sequences including their combinations, are described in EP-A 0 790 313, EP-A 0 805 209, EP-A 0 848 063, EP-A 0 848 061, EP-A 0 857 781, EP-A 0 860 445 and EP-A 0 864 651.
  • the nucleic acid according to the invention contains the sequence GCCACC or GCCGCC at the 5 'end of the start codon, which sequence can increase the translation.
  • the vector can be a viral or non-viral vector.
  • a non-viral vector is preferably selected from a group comprising a cationic lipid, a cationic polymer, a cationic peptide or a cationic porphyrin.
  • a viral vector is preferably selected from a group comprising RTV, AV, AAV, HSV, vaccinia virus, lenti virus, infiuenza virus.
  • the nucleic acid described is cloned into an expression vector, for example a suitable plasmid, into a suitable cell, for example into a bacterial, yeast, insect or mammalian cell, the cultivated or transfected cell is cultivated and the expression product is isolated if necessary.
  • these cells express a molecule according to the invention with a binding structure [component a) n or c) 0 ], this binding structure preferably being a transmembrane domain.
  • the DNA sequence coding for the transmembrane sequence of the human macrophage colony-stimulating factor (DNA position ⁇ 1485 to> 1554) or the DNA sequence coding for the signal and transmembrane region of the human respiratory syncytical virus (RSV) - glycoprotein G (Amino acids 1 to 63 or their partial sequence amino acids 38 to 63) or the DNA sequence coding for the signal and transmembrane region of the influenza virus neuraminidase (amino acids 7 to 35 or the partial sequence
  • Amino acids 7 to 27 are inserted between the promoter sequence and the DNA sequence of the molecule according to the invention or at the 3 'end of the gene.
  • nucleic acid construct a nucleotide sequence coding for a glycophospholipid anchor can also be inserted into the nucleic acid construct.
  • a glycophospholipid anchor is generally inserted at the 3 'end of the nucleotide sequence coding for the molecule according to the invention and can also be used to insert a signal sequence.
  • Glycophospholipid anchors have been described, for example, for the CEA, for the N-CAM and for other membrane proteins, such as Thy-1.
  • the respective cell expresses the molecule according to the invention on the cell membrane and thus receives a "receptor" which is specific for those target or effector structures which are recognized by the antigen-binding parts of the molecule according to the invention.
  • Another preferred binding structure is the transmembrane or signal transducing domain of a receptor, for example the T cell receptor or the M-CSF receptor.
  • the cell expressing the molecule according to the invention on the cell membrane can be activated by binding the target structures to specific functions.
  • Such specific functions can be, for example, a cytotoxic reaction of T lymphocytes, phagocytosis reactions of macrophages and granulocytes or exocytosis reactions of granulocytes, monocytes and macrophages.
  • Another object of the present invention is therefore a cell containing a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention, in particular a bacterial, insect, yeast or mammalian cell.
  • a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention in particular a bacterial, insect, yeast or mammalian cell.
  • nucleic acids such as e.g. CHO or BHK cells
  • a lymphocyte, a macrophage, a glial cell, an epithelial cell, a liver cell, a kidney cell, a bone marrow cell, an endothelial cell, a smooth or striated muscle cell or a fibroblast are suitable.
  • the last-mentioned cells are particularly suitable for gene therapy use, since these cells, which contain the nucleic acid construct according to the invention, are administered to a patient locally or parenterally, e.g. can be injected intravenously, intraarterially, into a body cavity, into an organ or subcutaneously, in order to serve as prophylaxis or therapy for a disease.
  • nucleic acid constructs according to the invention can also be administered directly to the patient in a Body cavity, into an organ, into the blood vessel system, subcutaneously or intramuscularly.
  • Another object of the present invention is therefore also a medicament containing an MVP according to the invention, a nucleic acid according to the invention coding for an MVP or a cell according to the invention, which expresses an MVP.
  • Another object of the present invention is a diagnostic agent containing a molecule according to the invention, which is directed against an analyte with its binding structure [component a) n or c) 0 ].
  • the MVP according to the invention, the nucleic acid according to the invention, the vector according to the invention or the cell according to the invention are therefore suitable for therapy, prophylaxis or diagnosis of, for example, tumor diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, diseases of the blood, in particular of the blood coagulation and / or blood circulation system, diseases of the nervous system and / or infectious diseases.
  • component a and / or component c) 0 preferably contains at least one whole antibody molecule or at least one epitope-binding fragment of an antibody.
  • These antibodies are preferably of completely human origin.
  • the murine monoclonal antibodies are preferably used in humanized form. Humanization takes place in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) and Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)).
  • Antibody fragments and recombinant Fv fragments are made according to the prior art and as described below.
  • the specificity of the antibody can be directed against one or more identical or different epitopes on the coat proteins of the virus.
  • Antibodies against the envelope proteins of viruses that can be used as vectors are, for example, antibodies against the
  • component a) n and / or c) 0 contains at least one cell-specific part of an Fc receptor.
  • Fc receptor One of the antibodies already mentioned binds to this Fc receptor via its Fc part, which binds directly or indirectly to the gene construct with its antigen-binding part.
  • component a) n and / or c) 0 contains the receptor for the coat protein of a virus.
  • the choice of this active ingredient depends on the disease which is to be prevented (prophylactic use) or treated (therapeutic use) by administering the MVP or the gene coding for the MVP.
  • the promoter sequences for the nucleotide sequence which codes the active substance are to be selected with regard to the type of therapy for the disease and taking into account the target cell to be transduced.
  • the retinoblastoma protein (pRb / p110) and the related p107 and p130 proteins are inactivated by phosphorylation.
  • Those genes of these cell cycle inhibitors which are preferred are to be used Have mutations for the inactivation sites of the expressed proteins without their function being impaired thereby. Examples of these mutations have been described for p110.
  • the DNA sequence for the p107 protein or the p130 protein is mutated in an analogous manner.
  • the protein p53 is inactivated in the cell either by binding to special proteins, such as MDM2, or by oligomerizing the p53 via the dephosphorylated C-terminal serine.
  • a DNA sequence is therefore preferably used for a p53 protein which is shortened at the C-terminal by the serine 392.
  • coagulation inducing factors and angiogenesis inhibitors for example:
  • PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1
  • IFN ⁇ endostatin - interferons
  • LIF Leukemia inhibitory factor
  • TF Tissue Factor
  • coagulation-active fragments cytostatic and cytotoxic proteins
  • Interferons such as IFN- ⁇ , IFNß or IFN ⁇
  • TNF such as TNF ⁇ or TNFß
  • cytostatic or cytotoxic antibodies and fusion proteins between antigen-binding antibody fragments with cytostatic, cytotoxic or inflammation-causing proteins or enzymes d) cytostatic or cytotoxic antibodies and fusion proteins between antigen-binding antibody fragments with cytostatic, cytotoxic or inflammation-causing proteins or enzymes.
  • the cytostatic or cytotoxic antibodies include those directed against membrane structures of endothelial cells, as described, for example, by Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) and Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)).
  • these include antibodies against the VEGF receptors.
  • This also includes cytostatic or cytotoxic antibodies directed against membrane structures on tumor cells.
  • cytostatic or cytotoxic antibodies directed against membrane structures on tumor cells.
  • Such antibodies have been described, for example, by Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Kunststoff (1988) and Contrib. to Oncol. 43, Karger
  • Suitable ligands are, for example, monoclonal antibodies or their antigen-binding antibody fragments directed against the following membrane antigens:
  • MCP-2 - IL-2 - RANTES
  • MCAF monocyte chemotactic and activating factor
  • MIP-1 ⁇ , -ß macrophage inflammatory protein-1
  • NAP-2 neutrophil activating protein-2
  • LIF human leukemia inhibitory factor
  • Cobra venom factor or partial sequences from the CVF which functionally correspond to the human complement factor C3b, i.e. which can bind to the complement factor B and, after cleavage by the factor D, represent a C3 convertase
  • bacterial proteins which activate complement or trigger inflammation such as, for example, porins from salmonella typhimurium, "clumping" factors from staphylococcus aureus, modulins especially from gram-negative bacteria, "major outer membrane protein” from Legionella or from haemophilus influenzae type B or from stickies or M-molecules from streptococcal group G.
  • Enzymes for the activation of precursors of cytostatics for example for enzymes which cleave inactive pre-substances (prodrugs) into active cytostatics (drugs).
  • CB human carboxypeptidase
  • - Phosphatase in particular human alkaline phosphatase, human acidic prostate phosphatase or type 5 acidic phosphatase - oxidase, in particular human lysyl oxidase or human D-amino acid oxidase - Peroxidase, in particular human glutathione peroxidase, human eosinophil peroxidase or human thyroid peroxidase
  • Target cells - proliferating endothelial cells or
  • Immunosuppressive antibodies are, for example, antibodies specific for the T cell receptor or its CD3 complex, against CD4 or CD8 furthermore against the IL-2 receptor, IL-1 receptor or IL-4 receptor or against the adhesion molecules CD2, LFA-1, CD28 or CD40
  • active substances can be used for the purposes of the invention, which fusion proteins from antibodies or Fab or rec. Fv fragments of these antibodies or other ligands specific for the target cell and the above.
  • Cytokines
  • active substances or their nucleic acid sequences are selected which directly or indirectly inhibit inflammation in the joint, for example, and / or promote the reconstitution of extracellular matrix (cartilage, connective tissue) in the joint.
  • IL-1-RA - IL-1 receptor antagonist
  • soluble IL-1 receptor binds and inactivates IL-1
  • IL-6 increases the secretion of TIMP and superoxides and decreases the secretion of IL-1 and TNF ⁇ by synovial cells and chondrocytes - soluble TNF receptor soluble TNF receptor binds and inactivates TNF.
  • IL-4 inhibits the formation and secretion of IL-1, TNF ⁇ and MMP - IL-10
  • IL-10 inhibits the formation and secretion of IL-1, TNF ⁇ and MMP and increases the secretion of TIMP
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • IGF-1 stimulates the synthesis of extracellular matrix.
  • TGFß especially TGFßl and TGFß2
  • TGFß stimulates the synthesis of extracellular matrix.
  • TIMP-1 TIMP-1
  • TIMP-2 TIMP-3
  • Target cells - proliferating, immature cells of the hematopoietic system or
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • Target cells Target cells
  • NGF Nerve growth factor
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor
  • CNTF - Ciliary neurotrophic factor
  • Enzymes for example - tyrosine hydroxylase - dopadecarboxylase 3c) cytokines and their inhibitors, which inhibit or neutralize the neurotoxic effect of TNF ⁇ , for example
  • IL-10 inhibits the formation of IFN ⁇ , TNF ⁇ , IL-2 and IL-4
  • Active substances for inhibiting coagulation or for promoting fibrinolysis for example - Tissue plasminogen activator (tPA)
  • Urokinase-type plasminogen activator uPA
  • Serine proteinase inhibitors such as C-1S inhibitor, ⁇ 1-antitrypsin or antithrombin III
  • TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
  • Angiogenesis factors for example - VEGF (1-4)
  • Active substances for inhibiting the proliferation of smooth muscle cells after injuries to the endothelial layer for example - an antiproliferative, cytostatic or cytotoxic protein or
  • cytostatics an enzyme for splitting precursors of cytostatics into cytostatics as already listed above (under tumor) or a fusion protein of one of these active ingredients with a ligand, for example an antibody or antibody fragments specific for muscle cells
  • the MVP according to the invention containing a protein for the prophylaxis of
  • a protein formed by the infectious agent (or the nucleic acid sequence encoding this protein) is to be selected as the active substance, which can be produced by triggering an immune reaction, i.e. leads to neutralization and / or killing of the pathogen by antibody binding and / or by cytotoxic T lymphocytes.
  • Such neutralization antigens are already used as vaccine antigens (see
  • the neutralization antigens (or their nucleic acid sequences) of the following pathogens are preferably selected as active ingredients:
  • HSV Herpes Simplex Virus
  • RSV Respiratory Syncytial Virus
  • VZV Varizella Zoster Virus
  • Such active substances within the meaning of the invention also include an anti-idiotype antibody or its antigen-binding Fragments whose antigen binding structures (the "complementarity determining regions") represent copies of the protein or carbohydrate structure of the neutralizing antigen of the infectious agent.
  • anti-idiotype antibodies can replace carbohydrate antigens in particular in bacterial infectious agents.
  • antigens on tumor cells have been described, for example, by Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag,
  • genes for the following antigens and for the following anti-idiotype antibodies are further examples:
  • - a protein that has cytostatic, apoptotic or cytotoxic effects.
  • an enzyme which is a precursor of an antiviral or cytotoxic
  • IFN ⁇ , IFNß, IFN- ⁇ , TNFß, TNF ⁇ , IL-1 or TGFß include, for example, IFN ⁇ , IFNß, IFN- ⁇ , TNFß, TNF ⁇ , IL-1 or TGFß
  • Antibodies against virus antigens include:
  • Rev binding proteins bind to the Rev-RNA and inhibit Rev-dependent post-transcriptional stages of retrovirus gene expression.
  • Rev binding proteins are:
  • Ribozymes that digest the mRNA of genes for cell cycle control proteins or the mRNA of viruses have been clearly described, for example, by Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995).
  • Antibacterial Active Ingredients include, for example, antibodies that neutralize bacterial toxins or opsonize bacteria. For example, antibodies against
  • component a) n and / or c) 0 can contain an active ingredient, part of the active ingredient or an analog of the active ingredient which binds to a receptor of the target cell.
  • Such active ingredients are, for example:
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF EGF
  • TGF ⁇ TGFß
  • KGF EGF
  • SDGF EGF
  • FGF IGF
  • HGF HGF
  • NGF NGF
  • BDNF Neurotrophine
  • BMF Bombesin
  • M-CSF Thrombopoietin
  • Erythropoietin SCF
  • SDGF Oncostatin
  • PDEGF Endothelin -1 - cytokines such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL -12, IL- 13, IL-14, IL-15
  • - Chemokines such as RANTES, MCAF, MIP-1 ⁇ or -ß, NAP, ß-thromboglobulin - Peptide hormones such as SRH, SIH or STH, MRH or MSH, PRH, PIH or prolactin, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH / ICSH or FSH, TRH or TSH, CRH or ACTH
  • angiotensin kinins, histamine, homologues or analogues thereof
  • steroid hormones such as estrogens, gestagens, androgens, glucocorticoids, Mineralokortiko.de, homologues or analogues thereof
  • component a) n and / or c) 0 can also be an adhesion molecule, part of the adhesion molecule or an analogue of an adhesion molecule which is attached to a corresponding adhesion molecule on the cell membrane or to another specific binding structure for an adhesion molecule on the target cell binds.
  • adhesion molecules that function as component a) n and / or c) 0 are, for example
  • Vitronectin for the Vitronectin receptor
  • GMP-140 for lewis X
  • ICAM-1 for LFA-1, MAC-1
  • component a) n and / or c) 0 can also be the extracellular part of an Fc receptor (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)), on which an antibody is specific for the target cell is bound via its Fc part.
  • component c) 0 can also be an antibody molecule or the epitope-binding part of an antibody molecule.
  • the murine monoclonal antibodies are preferably used in humanized form. Humanization takes place in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991) and Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 1993)). Antibody fragments are prepared according to the prior art, for example in the by Winter et al., Nature 349, 293 (1991), Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991) or Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993).
  • Recombinant antibody fragments are produced directly from existing hybridomas or are isolated from libraries of murine or human antibody fragments using "phage display” technology. These antibody fragments are then used directly on the genetic level for further manipulations (e.g. fusion with other proteins).
  • the genetic information which codes for the antigen-binding domains (VH, VL) of the antibodies is obtained by isolating the mRNA and reverse transcribing the RNA in cDNA and the subsequent amplification by means of polymerase chain reaction and oligonucleotides complementary to the 5 'and 3' ends of the variable fragments.
  • the VH and VL fragments are then cloned into bacterial expression vectors, for example in the form of Fv fragments, single-chain Fv fragments (scFv) or as Fab fragments.
  • New antibody fragments can also be isolated directly from antibody libraries (immune libraries, naive libraries) of murine or human origin using the "phage dispiay” technology.
  • the antigen-binding domains are cloned as fusion proteins with the coat protein g3P of filamentous bacteriophages either in the phage genome or in phagemid vectors in the form of scFv fragments or as Fab fragments.
  • Antigen-binding phages are selected on antigen-loaded plastic vessels (panning), on antigen-conjugated, paramagnetic "beads" or by binding to cell surfaces.
  • Immune libraries are prepared by PCR amplification of the variable antibody fragments from B lymphocytes of immunized animals or patients. Combinations of oligonucleotides that are specific for murine or human immunoglobulin genes or for the human immunoglobulin gene families are used for this purpose.
  • Naive libraries can be made using non-immunized donors as the source of the immunoglobulin genes.
  • immunoglobulin germline genes can be used for the production of semisynthetic antibody repertoire, the complementarity-determining region 3 of the variable fragments being supplemented by PCR using degenerate primers.
  • single pot libraries have the advantage over immune libraries that antibody fragments against a large number of antigens can be isolated from a single library.
  • antibody fragments can be further increased by means of the "phage display” technology, whereby new libraries from existing ones Antibody fragments can be produced by random, codon-based or targeted mutagenesis, by "chain shuffling" individual domains with fragments from naive repertoires or with the help of bacterial mutator strains and antibody fragments with improved properties can be isolated by reselection under stringent conditions.
  • murine murine
  • Antibody fragments are humanized by gradually replacing one of the variable domains with a human repertoire and subsequent selection with the original antigen ("guided selection").
  • the humanization of murine antibodies takes place by targeted exchange of the hypervariable regions of human antibodies by the corresponding regions of the original murine antibody.
  • At least two identical or different binding structures for the target cell [component c) 0 ] should be contained in the ligand according to the invention.
  • a special form of bispecific or multispecific, recombinant antibodies are single-chain, double or multiple antigen-binding molecules. The preparation of these molecules was described in patent application DE 198161417 (not published). This patent application is expressly referred to, for example, for the production of component c) 0 .
  • component c) o can also represent the coat protein or a part of the coat protein of viruses which specifically bind to selected cells via their coat protein.
  • the choice of the binding structure for a target cell depends on the target cell to which the MVP is to bind.
  • Examples include:
  • this includes antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of endothelial cells, as described, for example, by Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989) and Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)).
  • these include antibodies against the VEGF receptors.
  • the binding structures also include all active substances which bind to membrane structures or membrane receptors on endothelial cells.
  • active substances include substances that contain mannose in addition, 1L-1 or growth factors or their fragments or
  • Partial sequences of them that bind to receptors expressed by endothelial cells such as for example PDGF, bFGF, VEGF, TGFß (Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)).
  • adhesion molecules that bind to activated and / or proliferating endothelial cells.
  • adhesion molecules such as Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4, vitronectin or RGD peptides have already been described (reviews by Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 ( 1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. H, 353 (1992)).
  • the binding structures in the sense of this invention include, in particular, glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for endothelial cells.
  • viruses include, for example:
  • Alpha viruses such as Semliki Forest virus - the virus of epidemic, hemorrhagic fever
  • binding structures in the sense of the invention also include
  • Substances that bind specifically to the surface of immune cells include antibodies or antibody fragments directed against membrane structures of immune cells, as described, for example, by Powelson et al., Biotech. Adv. U, 725 (1993).
  • binding structures also include monoclonal or polyclonal antibodies or antibody fragments which, with their antigen-binding variable part, bind to Fc- ⁇ - or Fc- ⁇ - or Fc- ⁇ receptors of immune cells (Rojanasakul et al., Pharm. Res. H, 1731 (1994)).
  • Fc fragment of human monoclonal or polyclonal immunoglobulin This also includes the Fc fragment of human monoclonal or polyclonal immunoglobulin.
  • Fc fragments are, for example, genetically engineered using recombinant DNA or according to the methods of Haupt et al., Klin. Wschr. 47: 270 (1969), Kranz et al., Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979); Fehr et al., Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974),
  • the binding structures also include all substances that bind to membrane receptors on the surface of immune cells. These include cytokines such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNF ⁇ ,
  • GM-CSF, M-CSF of further growth factors such as EGF, TGF, FGF, IGF or PDGF or their fragments or partial sequences of them that bind to receptors expressed by immune cells.
  • adhesion molecules and other ligands that bind to cell membrane structures such as the mannose 6-phosphate receptor on macrophages in the spleen, liver, lungs and other tissues.
  • binding structures within the meaning of this invention also include glycoproteins of the envelope of those viruses which have a tropism for lymphocytes and / or macrophages.
  • Viruses that infect macrophages include, for example:
  • HIV-1 particularly those strains with mutations in the V3 region of gp120 which lead to an increased binding to macrophages - HIV-2
  • Viruses that infect lymphocytes include, for example:
  • VZV varicella zoster virus
  • HHV-6 Herpes virus 6
  • HHV-6 particularly infects T cells - Rabies virus; the Rabies virus coat protein binds particularly to TH2 cells
  • glycoprotein gp120 preferentially binds to the CD4 molecule of T cells - HTLV-II;
  • HTLV-II particularly infects B cells
  • HTLV-I particularly infects T cells
  • Influenza C viruses bind via the haemagglutinin esterase fusion (HEF) -
  • Influenza C viruses with a mutation in nucleotide position 872 (which encodes position 284 of the HEF of the amino acid sequence), for example a
  • the surface protein HEF with this mutation has a significantly stronger affinity for the N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid receptor than the wild virus
  • binding structure for N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid.
  • This binding structure is defined by the catalytic triad serine-71, histidine 368 or - 369 and aspartic acid 261
  • EBV particularly infects B cells - herpes simplex virus 2;
  • HSV-2 particularly infects T cells
  • Binding structures for muscle cells include, for example, antibodies or antibody fragments directed against membrane structures of muscle cells, in particular of smooth muscle cells.
  • Such antibodies are, for example - the antibody 10F3
  • the binding structures also include all active substances which bind to membrane structures or membrane receptors on muscle cells (review by Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2, 260 (1991) ).
  • this includes growth factors or their fragments or partial sequences of them, which bind to receptors expressed by smooth muscle cells, for example
  • the binding structures in the sense of this invention also include glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for muscle cells.
  • viruses include, for example, the cytomegalovirus.
  • the binding structures include antibodies or antibody fragments directed against receptors expressed on poorly differentiated blood cells.
  • binding structures also include monoclonal ⁇ or polyclonal antibodies or antibody fragments which bind with their constant domains to Fc- ⁇ receptors of immune cells.
  • the binding structures also include all substances which
  • Bind membrane structures or membrane receptors on the surface of poorly differentiated blood cells includes growth factors, such as SCF, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF or their fragments or partial sequences thereof, which bind to receptors expressed by blood cells.
  • growth factors such as SCF, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF or their fragments or partial sequences thereof, which bind to receptors expressed by blood cells.
  • Binding structures for svnovial cells and inflammatory cells include monoclonal or polyclonal antibodies or antibody fragments that bind with their variable domains to membrane structures of synovial cells or inflammatory cells.
  • membrane structures are, for example
  • This also includes monoclonal or polyclonal antibodies or antibody fragments that bind to the Fc receptor with their constant domains.
  • Cytokines or growth factors or their fragments or partial sequences of them that bind to receptors expressed by synovial cells such as IL-1-RA, TNF ⁇ , IL-4, IL-6, IL-10, IGF, TGFß.
  • the binding structures include antibodies or antibody fragments directed against the virus antigens expressed on the cell membrane of virus-infected cells.
  • the binding structures include all substances that bind to membrane structures or membrane receptors on the surface of liver cells.
  • this includes growth factors, such as cytokines, EGF, TGF, FGF or PDGF, or their fragments or partial sequences thereof, which bind to receptors expressed by such cells.
  • growth factors such as cytokines, EGF, TGF, FGF or PDGF, or their fragments or partial sequences thereof, which bind to receptors expressed by such cells.
  • binding structures that bind to cell membrane structures that are selective for certain tissues. These include, for example:
  • Transferrin receptor transferrin liver, other tissue cells
  • Insulin receptor insulin liver other tissue cells
  • Fc- ⁇ receptors immunoglobulin G reticuloendothelial system, other tissues
  • binding structures in the sense of the invention particularly include glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for selected cells, such as for example
  • liver cells e.g. the Marburg virus via the asialoglycoprotein
  • HBV is bound via fibronectin.
  • glial cells include antibodies or antibody fragments directed against membrane structures of glial cells, as described, for example, by Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 29, 57 (1985)) and McKeever et al. (Neurobiol. 6, 119 (1991)).
  • membrane structures also include neural adhesion molecules such as
  • N-CAM especially its polypeptide chain C.
  • This also includes all active substances that bind to membrane structures or membrane receptors on glial cells.
  • active substances that bind to membrane structures or membrane receptors on glial cells.
  • these include substances that carry mannose at the end and are attached to the mannose-6
  • binding structures in the sense of the invention include in particular
  • Glycoproteins of the envelope of those viruses which have tropism for glial cells are Glycoproteins of the envelope of those viruses which have tropism for glial cells.
  • viruses include, for example:
  • Suitable ligands are, for example, monoclonal antibodies or their antigen-binding antibody fragments with specificity for the following antigens:
  • the binding structures also include all of the active ingredients
  • Bind membrane structures or membrane receptors of leukemia cells Bind membrane structures or membrane receptors of leukemia cells. For example, this includes growth factors or their fragments or partial sequences of them that bind to receptors expressed by leukemia cells.
  • Retinoids e.g. "Retinoic acid” in acute promyelocytic leukemia.
  • linker depends on the chemical nature of components a) n and c) 0 and on the method by which these components are connected to one another via the linker. If the binding structures are peptides or proteins, a peptide or protein is preferably used as the linker and the linker is preferably connected to components a) n and c) 0 via a peptide bond.
  • Such molecules are preferably produced as fusion proteins with the aid of recombined DNA technology.
  • linker represents a structure which connects component a) n to component c) 0 .
  • Such structures result from the various chemical conjugation methods with the help of which molecules
  • linker [component a) n and component b) m ] can also each be a peptide or protein.
  • the connection between the two is preferably via a peptide bond and to component c) o via one of the chemical conjugation methods.
  • the linker contains a fusogenic peptide or a translocalization peptide depends on the use of the molecule according to the invention. If the molecule according to the invention is to have its effect extravascularly in the connective tissue or in the cell, the linker is preferably a molecule with a fusogenic property. This fusoge ⁇ e property facilitates the passage of the molecule according to the invention through the cell membrane.
  • viral or bacterial peptides or proteins as well as synthetic peptides are used as linkers with a fusogenic property.
  • Molecules with a fusogenic property are, for example (for details see patent application EP-A 0 846 772): * Peptides containing the translocation domain (domain II) of exotoxin A from Pseudomonas
  • LAEA LAAAAGC (SEQ. ID NO .: 2)
  • FAG V-VLAG AALG VAAAAQ I (SEQ ID NO .: 3) of the fusion protein of the measles virus
  • proteins of viruses which have fusogenic properties are also used.
  • viruses have fusogenic and / or translocating coat proteins, for example paramyxoviruses, Retroviruses and herpesviruses. These include, for example, the TAT protein from HIV or its translocalizing amino acid sequence or the VP22 protein from HSV.
  • viruses also have glycoproteins which are responsible both for virus attachment and subsequently for cell membrane fusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).
  • Such proteins are formed, for example, by alpha, rhabdo and orthomyxoviruses.
  • Fusogenic proteins in the sense of this invention are, for example:
  • the hemagglutinin from influenza A or B viruses in particular the HA2 component - the M2 protein from influenza A viruses used alone or in combination with the hemagglutinin from influenza or with mutants of neuraminidase from influenza A which the Enzyme activity is absent, but this causes hemagglutination.
  • the fusion activity of the HEF protein is activated by cleaving the HEFo into the subunits HEF1 and HEF2.
  • transmembrane glycoprotein of filoviruses such as * the Marburg virus * the Ebola virus
  • the fusion protein of the Sendai virus especially the amino-terminal 33 amino acids of the F1 component - the transmembrane glycoprotein of the semliki forest virus, especially the egg component
  • Viral fusogenic proteins are either obtained by dissolving the coat proteins from a virus enrichment with the aid of detergents (such as, for example, ⁇ -D-octylglucopyranoside) and separation by centrifugation (review by Mannio et al., BioTechniques 6, 682 (1988)) or else with the aid from molecular biological methods known to the person skilled in the art.
  • detergents such as, for example, ⁇ -D-octylglucopyranoside
  • Components a) n , b) m and c) 0 are preferably linked to form an MVP via peptide bonds.
  • an arbitrarily long peptide sequence is inserted between these components, preferably a peptide sequence of 0-30 amino acids.
  • Such compounds are produced in such a way that the naturally occurring dimerization (or multimerization) of proteins is used or that connecting parts are inserted into components a, b and / or c and these connecting parts enable the linkages.
  • connecting parts can be, for example:
  • Multimerization has occurred through a non-covalent or covending connection (e.g. through S-S bridges, peptide compounds)
  • MVP multivalent protein
  • binding sites The functionality of the binding sites is verified immunologically (ELISA, immunocytology, flow cytometry) or in proliferation assays with primary human endothelial cells. Targeted transduction is performed using adenoviruses that express the lacZ gene under the control of the CMV promoter.
  • PSecTagA (Invitrogen, expression vector with Igk leader sequence) was used as the vector for the cloning of all expression constructs.
  • the PCR products were purified with QIAquick TM spin columns (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, digested with the restriction enzymes BamHI and EcoRI and, after separation by agarose gel electrophoresis, purified again with QIAquick TM spin columns.
  • the digested PCR products were then ligated into the correspondingly cut and purified vector pSeqTagA (T4 ligase, promega).
  • a plasmid preparation was carried out using qiagen tip 500 columns according to the manufacturer's instructions. The correctness of the construct was confirmed by sequencing.
  • the sc Fv (anti AV) -VEGF construct was cloned by 2-fragment ligation.
  • the sc Fv (anti AV) fragment was produced by means of PCR (see above) using the following oligonucleotides: PelB Metminus
  • a A Q P A T A Q V (SEQ ID NO .: 23) 5 'TAA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAG GT 3' (SEQ ID NO .: 24)
  • the plasmid anti AV-pUC119mycHis (R. Hawkins in: Watkins et al., Gene Therapy 4, 1104 (1997)) served as a template.
  • the PCR product was purified with QIAquick TM spin columns (Qiagen) according to the manufacturer's instructions and digested with the restriction enzymes Sfil and Notl.
  • the 2nd fragment, VEGF was obtained by restriction digestion of the VEGF plasmid with the restriction enzymes Not1 and EcoRI.
  • the vector, pSecTagA was digested with Sfil and EcoRI. After the restriction digestion products had been separated by agarose gel electrophoresis, they were purified again with QIAquick TM spin columns. Fragments 1 and 2 were then ligated into the cut and purified vector (T4 ligase, promega).
  • a plasmid preparation was carried out using qiagen tip 500 columns according to the manufacturer's instructions. The correctness of the construct was confirmed by sequencing.
  • the nucleotide and protein sequence of the s.c. construct Fv anti AV-VEGF is shown in Figure 3.
  • s.c. anti AV-VEGF The expression of s.c. anti AV-VEGF is also carried out by stably transfected HEK293 cells. Like VEGF, this fragment can also be purified using IMAC.
  • This molecule is thus present as a monomer and has one binding site for the adenoviral "fiber” protein and two binding sites for the VEGF receptors. The functionality of these binding sites is verified immunologically (ELISA, immunocytology, flow cytometry) or in proliferation assays with primary human endothelial cells. Targeted transduction is performed using adenoviruses that express the lacZ gene under the control of the CMV promoter.
  • an scVEGF2 construct (amino acids 1-109, GGGSGGGRASG-GGS linker (SEQ ID NO .: 26) and amino acids 6-114) was cloned and expressed.
  • 2 PCR reactions (see under 1) were carried out with the following oligonucleotides: - with VEGF back 1 (see under 1) and VEGF for 2 (see below)
  • CAC GAA GTG GTG AAG (SEQ ID NO .: 28)
  • the PCR products were purified with QIAquick TM spin columns (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, digested with the restriction enzymes BamHI and Ascl (1) or Ascl and EcoRI (2) and, after separation by agarose gel electrophoresis, again with QIAquick TM spin columns cleaned up.
  • the digested PCR products (1) and (2) were then ligated into the correspondingly cut and purified vector pSeqTagA (T4 ligase, Promega).
  • a plasmid preparation was carried out with Qiagen tip 500 columns according to the manufacturer's instructions. The correctness of the construct was confirmed by sequencing.
  • the scVEGF2 plasmid was digested with the restriction enzyme EcoRI and the single-stranded overhang was filled in using klenow fragment (Boehringer Mannheim). Then it was digested with Notl.
  • the S11-VEGF plasmid was digested with the restriction enzyme Xhol as a vector, the single-stranded overhang was filled in and then digested with NotI.
  • the products were purified and ligated with QIAquick TM spin columns.
  • a plasmid preparation was carried out using Qiagen tip 500 columns according to the manufacturer's instructions.
  • the nucleotide and protein sequence of the construct S11-scVEGF2 is shown in FIG. 4.
  • scVEGF2 construct In vitro transcription and translation (promega, according to the manufacturer) of the scVEGF2 construct resulted in a protein that ran in the SDS polyacrylamide gel with the expected size of about 34 kd.
  • the plasmid was transfected into HEK293 cells as described in Example 1. Transiently transfected cells showed a clear signal in immunofluorescence (see Example 1). Here were mainly the compartments of the cellular secretion path are shown. Stable clones were obtained by selection in 200 ⁇ g / ⁇ l zeocin. The cell culture supernatant was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) using six C-terminal histidine residues.
  • IMAC immobilized metal affinity chromatography
  • Sc Fv anti AV (S11) - scVEGF2 is also expressed by stably transfected HEK293 cells. Like scVEGF2, this fragment is also purified using IMAC.
  • target cell-specific multivalent proteins for systemic therapy of cancer were developed.
  • the aim is to selectively bind the MVP to tumor or tumor endothelial cells. This is a prerequisite for the use of toxic proteins or prodrug-activating systems for the targeted destruction of tumors without toxic effects on healthy tissue.
  • the active ingredient contained in the MVP acts on the tumor endothelial cells. Their destruction leads to an obstruction of the blood supply to the tumor and to its death.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • KDR kinase insert domain-containing receptor
  • flt-1 fms-like tyrosine kinase
  • VEGF binds to its receptors as a disulfide-linked dimer.
  • the recombinant scFv fragment of a selected antibody was used as the active ingredient. This antibody binds to the CD3 molecule of the human T cell receptor.
  • scFv-VEGF polypeptide chain leads to the formation of a homodimer which has two binding sites for CD3 and two binding sites for VEGF receptors.
  • VEGF Cell binding structure
  • disulfide bridges formation of disulfide bridges.
  • the receptor-binding domain of VEGF amino acids 1-114 was first cloned into a eukaryotic expression vector and expressed in mammalian cells.
  • a VEGF fragment from amino acid 11 to 109 is sufficient for binding to Flk-1 (Sieffle et al., J. Biol. Chem. 273, 11115 (1998)).
  • This VEGF fragment was fused N-terminally to the single chain Fv fragment (scFv) anti CD3 by a short linker.
  • Anti CD3 binds to the CD3 subunit of the T cell receptor. Expression was also in mammalian cells. The functionality of the binding sites is verified immunologically (ELISA, immunocytology, flow cytometry) or in proliferation assays with primary human endothelial cells. Furthermore, by binding T cells to endothelial cells via the MVP according to the invention.
  • PSecTagA (Invitrogen, expression vector with Igk leader sequence) was used as the vector for the cloning of all expression constructs.
  • the VEGF cDNA cloned into this vector was amplified by PCR from genomic DNA of the human tumor cell line LNCaP with Taq polymerase (Pharmacia) (30 cycles, annealing temperature: 58 ° C.). For this, oligonucleotides published by Leung et al., Science 246, 1306 (1989) were used.
  • the PCR products were purified with QIAquick TM spin columns (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, digested with the restriction enzymes BamHI and EcoRI and, after separation by agarose gel electrophoresis, purified again with QIAquick TM spin columns.
  • the digested PCR products were then ligated into the correspondingly cut and purified vector pSeqTagA (T4 ligase, Promega).
  • a plasmid preparation was carried out using Qiagen tip 500 columns according to the manufacturer's instructions. The correctness of the construct was confirmed by sequencing.
  • the sc Fv anti CD3-VEGF construct was cloned by 2-fragment ligation.
  • the 2nd fragment, VEGF was obtained by restriction digestion of the VEGF plasmid with the restriction enzymes Not1 and EcoRI.
  • the vector, pSecTagA was digested with Sfil and EcoRI. After the restriction digestion products had been separated by agarose gel electrophoresis, they were purified again with QIAquick TM spin columns. Fragments 1 and 2 were then ligated into the cut and purified vector (T4 ligase, Promega).
  • a plasmid preparation was carried out using Qiagen tip 500 columns according to the manufacturer's instructions. The correctness of the construct was confirmed by sequencing.
  • VEGF construct In vitro transcription and translation (Promega, according to the manufacturer) of the VEGF construct resulted in a protein that ran in the SDS polyacrylamide gel with the expected size of about 20 kd.
  • Transiently transfected cells showed a clear signal in immunofluorescence (1st antibody: monoclonal anti-His-Tag, Dianova; 2nd antibody: goat anti-mouse Cy3, Dianova). Here were mainly the compartments of the cellular secretion path are shown. Stable clones were obtained by selection in 200 ug / ul Zeozin. The cell culture supernatant was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) using six C-terminal histidine residues.
  • IMAC immobilized metal affinity chromatography
  • Sc Fv anti CD3-VEGF is also expressed by stably transfected HEK293 cells. Like VEGF, this fragment can also be purified using IMAC. Production of a monomeric scFv-scVEGF2 molecule according to the invention
  • an scFv fragment is fused with two VEGF units which are connected via an additional peptide linker.
  • This molecule is thus present as a monomer and has one binding site for the CD3 molecule of the T cell receptor and two binding sites for a VEGF receptor. The functionality of these binding sites is verified immunologically (ELISA, immunocytology, flow cytometry) or in proliferation assays with primary human endothelial cells. Targeted binding of T cells is measured based on their cytotoxicity for the endothelial cell.
  • scVEGF2 construct (amino acids 1-109, GGGSGGGRASG-GGS linker and amino acids 6-114) was cloned and expressed.
  • 2 PCR reactions (see under 1) were carried out with the following oligonucleotides:
  • CAC GAA GTG GTG AAG (SEQ ID NO .: 33)
  • the PCR products were purified with QIAquick TM spin columns (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, digested with the restriction enzymes BamHI and Ascl (1) or Ascl and EcoRI (2) and, after separation by agarose gel electrophoresis, again with QIAquick TM spin columns cleaned up.
  • the digested PCR products (1) and (2) were then ligated into the correspondingly cut and purified vector pSeqTagA (T4 ligase, Promega).
  • a plasmid preparation was carried out using Qiagen tip 500 columns according to the manufacturer's instructions. The correctness of the construct was confirmed by sequencing.
  • the scVEGF2 plasmid was digested with the restriction enzyme EcoRI and the single-stranded overhang was filled in using Klenow fragment (Boehringer Mannheim). Then it was digested with Notl.
  • the products were purified and ligated with QIAquick TM spin columns.
  • a plasmid preparation was carried out using Qiagen tip 500 columns according to the manufacturer's instructions.
  • the nucleotide and protein sequence of the construct BMA031-scVEGF2 is shown in FIG. 4.
  • s.c. Fv anti CD3-scVEGF2 also occurs through stably transfected HEK293 cells. Like scVEGF2, this fragment is also purified using IMAC.
  • MVL-Illb1 MVL which is formed by dimerization or multimerization of the cell binding structure, this assembly being stabilized by the formation of disulfide bridges.
  • MVPs according to the invention containing at least one binding structure for the vector, at least two binding structures for the target cell and at least one linker.
  • MVPs according to the invention containing several ligands; A. at least simply connected via the same or different binding structures for the vector; B. at least simply connected via the same or different linkers; C. at least simply connected via the same or different binding structures for the target cell.
  • Table 1
  • GCT GTA CTG GTG AGG CCT GGG TCC TCA GTG AAG ATT TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAT GTA A V L V R P G S S V K I S C K A S G Y V
  • GCT GTA CTG GTG AGG CCT GGG TCC TCA GTG AAG ATT TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAT GTA A V L V R P G S S V K I S C K A S G Y V

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Abstract

The invention relates to a target cell-specific, multivalent protein (MVP) characterized in being comprised of the following components which are covalently bound to one another: a) a binding structure (a)n specific for the vector; b) a linker (b)m and; d) at least two binding structures (c)o for the target cell, whereby, independent of one another, n=1, m=1-10 and o=2-10. The invention also relates to the production and use of said multivalent protein.

Description

Beschreibung
Zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP)
1. Einleitung
In der Natur kommen zahlreiche monovalente Proteine vor. Diese monovalenten Proteine binden mit ihrem Bindungspartner, z. B. einem Zellmembranrezeptor, in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1 :1. Beispiele für derartige monovalente Proteine sind Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Peptidhormone und Komplementrezeptoren. Des weiteren kommen in der Natur auch Bindungen in einem stöchiometrischen Verhältnis von > 2:1 vor. So binden beispielsweise zwei Moleküle des Wachstumsfaktors VEGF in Form eines Dimers an einen Zellmembranrezeptor, den VEGF-Rezeptor, um diesen zu aktivieren, während die Bindung von Monomeren keine Aktivierung dieses Rezeptors bewirken kann.
Die Menge an Bindungsprodukten zwischen derartigen monovalenten Proteinen und beispielsweise ihren Rezeptoren wird hierbei bestimmt von der Stärke der Bindungskräfte zwischen beiden Bindungspartnern und ihren jeweiligen Konzentrationen.
Zur Erhöhung der Menge an Bindungsprodukten werden von der Natur bereits bivalente und multivalente Proteine hergestellt. Derartige bivalente und multivalente Proteine sind beispielsweise Dimere oder Multimere von monovalenten Proteinen. Beispiele hierfür sind Antikörper (über SH-Gruppen miteinander verbundene Dimere zweier gleicher, über SH-Gruppen miteinander verbundener Heterodimere, jeweils bestehend aus einer L-Kette und einer H-Kette) oder der T-Zell-Rezeptor, bestehend aus einer α-Kette und einer ß-Kette.
Die in natürlicher weise vorkommenden bivalenten und multivalenten Proteine haben jedoch folgende Nachteile:
- sie binden nur an einen Bindepartner - ihre Molekülgröße ist beträchtlich
- ihre Penetrationsfähigkeit durch Zellmembranen und durch die extrazelluläre Matrix ist äußerst gering
- sie binden nur homogene, nicht heterogene Bindepartner
- ihre biotechnologische Herstellung ist äußerst aufwendig.
Gegenstand der Erfindung sind nunmehr neue zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP), welche mindestens zwei Bindestrukturen haben, die an ein Molekül eines Bindepartners oder mindestens an zwei unterschiedliche Bindepartner binden.
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP), welche ein fusogenes Peptid enthalten und mit Hilfe dieses fusogenen Peptids durch Zellmembranen penetrieren können.
Gegenstand der Erfindung sind desweiteren zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP), welche eine Spaltsequenz für eine Protease enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist darüber hinaus die Verwendung eines derartigen zielzellspezifischen, multivalenten Proteins für die Prophylaxe, Therapie oder Diagnose einer Erkrankung.
Zielzellspezifische, multivalente Proteine sind bereits als Liganden für virale oder nicht virale Vektoren beschrieben worden.
Zur Zielsteuerung von Adenoviren wurden bisher zwei verschiedene Strategien beschrieben (Curiel, D.T. et al., 1998, Tumor Targeting 3:59). Eine Möglichkeit ist die Modifikation des adenoviralen "fiber"-Proteins an der für die Bindung an Zellen verantwortlichen "knob"-Domäne. Dazu muß das adenovirale Genom modifiziert werden. Bei der zweiten Strategie werden Fusionsproteine aus einer neutralisierenden Domäne und einem Liganden an die Viren gebunden. Als neutralisierende Domäne werden bisher Antikörper verwendet, die an die "knob"- Domäne des Adenovirus binden und so die Bindung des Virus an Zellen verhindern, d.h. die Adenoviren "neutralisieren". Der fusionierte Ligand bedingt durch Bindung an den entsprechenden, spezifischen zellulären Rezeptor eine Zielsteuerung des Virus an jene Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren. Eine Modifikation des fiber- Gens ist bei diesem Ansatz nicht notwendig und es können mit vergleichsweise geringem Aufwand viele verschiedene Liganden getestet werden.
Im Sinne der oben beschriebenen Strategien sind folgende Techniken beschrieben worden:
- die genetische Modifikation von Viren (im besonderen Adenoviren), so daß auf ihrer Oberfläche zusätzliche Peptidsequenzen zur Konjugation von den gewünschten Liganden exprimiert werden (WO 95/26412)
- die Komplexierung eines Virus (im besonderen Adenovirus)mit einem Fusionsprotein bestehend aus dem zellexternen Teil des zellulären Rezeptors für das Virus, einem Linker und einem Liganden für einen Rezeptor auf der gewünschten Zielzelle (WO 98/33929)
- die Komplexierung eines Virus (im besonderen Adenovirus) mit einem Fusionsprotein bestehend aus einem Antikörper bzw. Antikörperfragment spezifisch für ein Protein auf dem Viruskapsid und einem Liganden spezifisch für die gewünschte Zielzelle (WO 94/10323, WO 98/40508) - die Komplexierung eines Virus (im besonderen Adenovirus) mit einem
Fusionspiotein (bestehend aus einem Antikörper bzw. Antikörperfragment spezifisch für ein Epitop in der Hexonregion des Virus und einem kationischen Peptid) und einem Plasmid (EP A 0 535 576 A1 ).
Des weiteren wurden beispielsweise mit gentechnologischen Methoden zellspezifische Bindestrukturen wie Heregulin (Han et al., PNAS 92, 9747 (1995)), Erythropoietin (Kasahara et al., Science 266, 1373 (1994)), Antikörperfragmente wie "Single chain Fv" (Marin et al., J. Virol. 70, 2957 (1996)) oder Rezeptoren wie der extrazelluläre Teil des Fc-Rezeptors (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)) in die Hüllglykoproteine von retroviralen Vektoren eingebaut und hierdurch eine Zielzellspezifität bewirkt. Nichtvirale Vektoren bestehen im einfachsten Falle aus Plasmiden komplexiert mit kationischen Molekülen, wie beispielsweise kationische Polymeren oder kationische Lipiden. Um derartige Vektoren selektiv in Zellen eines bestimmten Typs einbringen zu können, wurden beispielsweise mit chemischen Methoden zellspezifische Bindestrukturen, wie das Asialoglykoprotein (Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 1152 (1994)) oder synthetische Derivate hiervon (Merwin et al., Bioconjugate Chem. 5, 612 (1994)) mit Polylysin verknüpft und dieses entweder mit dem Genkonstrukt komplexiert oder an Hüllproteine von adenoviralen Vektoren chemisch gebunden.
Eine weitere Methode war zellspezifische Bindestrukturen an Streptavidin zu binden, welches sich wiederum an Biotin, konjugiert an die Phospholipidkopfgruppen von Liposomen bindet, wobei die Liposomen mit Genkonstrukten komplexiert sind (Redelmeir et al., Drug Deliv. J. Deliv. Targeting Therap. Agents 2, 98 (1995)). Eine Weiterentwicklung bestand in der Herstellung künstlicher Ligandensysteme bestehend aus einer zielzellspezifischen Bindestruktur, einer vektorspezifischen Bindestruktur und ggf. einem fusogenen Peptid. ein erstes derartiges Ligandensystem wurde von Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271 , 10560 (1996) vorgestellt.
Dieses Ligandensystem besteht aus einem Antikörperfragment spezifisch für den Erb B2-Rezeptor auf Tumorzellen, dem fusogenen Peptid des Pseudomonas Exotoxin A und der DNA-bindenden Domäne des Gal4-Proteins der Hefe, die an die korrespondierende Gal4-Bindesequenz, eingefügt in ein das Transgen enthaltende Plasmid, bindet. Dieses Ligandensystem führt zwar zu einer zielzellspezifischen Transfektion, besitzt jedoch den Nachteil der Immunogenität des Gal4-Proteins der Hefe.
Eine deutliche Verbesserung fusogener Ligandensysteme für virale und nicht virale Vektoren erfolgte mit dem Aufbau von mehrfach funktionellen Ligandensystemen unter Bevorzugung nicht oder nur gering immunogener Komponenten (EP-A 0 846 772). Des weiteren ermöglicht die Technologie für einzelkettige, zweifachantigenbindende Moleküle (DE 198161417, nicht veröffentlicht), relativ einfach zielzellspezifische, künstliche Ligandensysteme mit oder ohne fusogene Peptide für virale oder nichtvirale Vektoren herzustellen.
Die Funktionsfähigkeit dieser verschiedenen Techniken für zielzellspezifische Liganden von Vektoren wurde in den aufgeführten unterschiedlichen
Veröffentlichungen und Patentanmeldungen beschrieben. Gemeinsam ist diesen Ligandensystemen jedoch der Nachteil, daß die Aufnahme der Vektoren in die Zelle durch Pinozytose oder Endozytose nur unzureichend ist. Es besteht somit ein beträchtlicher Bedarf an einer Verbesserung von künstlichen zielzellspezifischen Ligandensystemen auch in der Gentherapie.
2. Kurzbeschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP) für die Prophylaxe, Therapie oder Diagnose einer Erkrankung, dadurch charakterisiert, daß das MVP mindestens zwei gleiche Bindestrukturen aufweist, die an ein Molekül eines Bindepartners auf der Zielzelle binden. Gegenstand der Erfindung sind des weiteren MVP, welche mindestens zwei unterschiedliche Bindestrukturen spezifisch für gleiche oder unterschiedliche Bindepartner auf der Zielzelle aufweisen. Durch die erfindungsgemäßen Moleküle wird eine verbesserte Bindung an, Aufnahme in die oder Vernetzung mit der Zielzelie ermöglicht. Die vorliegende Erfindung ist eine Weiterentwicklung der Erfindung, offenbart in der Patentanmeldung EP-A 0 846 772, in welcher multifunktionelle Liganden beschrieben werden, sowie eine Weiterentwicklung der Technologie zur Herstellung einzelkettiger, zweifach- antigenbindender Moleküle (DE 198161417, nicht veröffentlicht). Auf beide
Patentanmeldungen wird mit dieser Erfindung ausdrücklich Bezug genommen.
Die zellspezifischen Bindestrukturen gemäß der vorliegenden Erfindung können sein zellmembranbindende Wirkstoffe, wie beispielsweise Homodimere oder Homomultimere eines Adhäsionsmoleküles, eines Wachstumsfaktors, eines Cytokins, eines Chemokins, eines Hormons, eines Antikörpers oder eines Antikörperfragmentes oder aber die zellmembranbindenden Teile dieser Wirkstoffe, welche nur an ein Molekül eines Zellmembranrezeptors binden. Diese Bindestrukturen können des weiteren sein Heterodimere oder Heteromultimere aus zellmembranbindenden Wirkstoffen, wie beispielsweise aus Adhesionsmolekülen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Chemokinen, Hormonen, Antikörpern oder Antikörperfragmenten oder aber die zellmembranbindenden Teile dieser Wirkstoffe, welche an mindestens zwei unterschiedliche Zellmembranrezeptoren binden und diese vernetzen.
Die erhöhte Bindung an oder die Kreuzvernetzung von gleichen oder unterschiedlichen Zellmembranrezeptoren hat beispielsweise zur Folge, daß die erfindungsgemäße MVP verstärkt an die Zielzelle binden und/oder in die Zielzelle aufgenommen werden (beispielsweise durch Pinozytose, Endozytose oder Phagozytose).
Die erhöhte Bindung an andere Zielstrukturen als Zellmembranrezeptoren kann beispielsweise eine verstärkte Komplexbildung mit der Zielstruktur zu Folge haben.
Entsprechend dieser Erfindung kann das MVP aus folgenden Komponenten aufgebaut sein: a) aus mindestens einem Wirkstoff [Komponente (a)n] b) aus einem oder mehreren Linkern, die ein fusogenes Peptid und/oder eine Spaltsequenz für eine Protease enthalten können [Komponente b)m] c) aus mindestens zwei Bindestrukturen, [Komponente c)0],
wobei unabhängig voneinander n=1-10, m=1-10 und o=2-10 sind und n, m und o ganze Zahlen sind.
Im Sinne der Erfindung sind hierbei die Komponenten a)n, b)m und c)0 durch eine beliebige Peptidsequenz mit einer Länge von vorzugsweise 0-30 Aminosäuren derartig miteinander zu verbinden, daß das hieraus resultierende MVP einen Proteineinzelstrang darstellt und die Funktion bzw. Wirkung jeder einzelnen Komponente a)n, b)m und c)0 vollständig erhalten bleibt. 7
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren zielzellspezifische, multivalente Proteine, bei welchen mindestens zwei MVP miteinander verbunden sind. Diese Verbindung kann zwischen den Komponenten a)n, b)m und/oder c)0 erfolgen und nicht kovalent oder kovalent sein, beispielsweise im Sinne einer Peptidbindung oder einer -S-S-Bindung.
Beispiele für die sich aus dieser Erfindung ergebenden Möglichkeiten sind schematisch in den Figuren 1 und 2 (a-c) dargestellt.
Entsprechend dieser Erfindung kann die Komponente a)n gleich oder unterschiedlich zur Komponente c)0 sein. Die Komponente a bzw. die Komponente c kann ausgewählt sein aus einer Gruppe beispielsweise umfassend:
- eine Bindestruktur für ein Virus, wie beispielsweise für AdV, AAV, ein Lentivirus, ein RTV, Vacciniavirus, HSV, Influenzavirus, HIV - einen rekombinanten Antikörper spezifisch für ein Virusprotein, für einen nichtviralen Vektor oder für eine Nukleinsäure, wie beispielsweise ein IgG, F(ab')2, Fab, rec. Fv, Diabody oder einzelkettiges, doppelantigenbindendes Protein
- ein Peptid mit Bindeaffinität zu einer definierten Nukleinsäuresequenz, wie beispielsweise LexA, Gal4 oder die DNA-Bindedomäne eines Transkriptionsfaktors oder ein Antikörper
- eine Transmembrandomäne oder ein Glykophospholipidanker,
- einen Wirkstoff wie beispielsweise der den Liganden bindenden Teil eines Rezeptors, der Ligand für einen Rezeptor oder die den Rezeptor bindende
Teilsequenz des Liganden; ein Peptidhormon; ein Cytokin; ein Wachstumsfaktor; ein Wachstumsfaktorinhibitor; ein Chemokin; ein Interferon; ein Mediator; ein kreislaufwirksames Peptid; ein Enzym, welches eine inaktive Vorstufe eines Wirkstoffes in einen aktiven Wirkstoff überführt; ein Protein, welches die Gerinnung aktiviert oder inhibiert; ein Protein, welches die Fibrinolyse aktiviert oder inhibiert; ein Protein, welches das Komplementsystem aktiviert oder inhibiert; eine oder mehrere konstante Domänen eines Immunglobulins; ein zytotoxisches Peptid; ein die Apoptose induzierendes Peptid; ein die Apoptose hemmendes Peptid; ein Tumorantigen oder das Antigen eines Infektionserregers, wie beispielsweise ein bakterielles Antigen oder ein virales Antigen; ein Peptid enthaltend Cystein zur Herstellung von Dimeren des erfindungsgemäße Moleküls: und/oder ein di- bzw. multimerisierendes Peptid (Plückthun und Pack, Immunotechnol. 3, 83-105 (1997)) oder eine Bindestruktur für eine Zielzelle ausgewählt aus einer Gruppe beispielsweise umfassend:
- einen rekombinanten Antikörper spezifisch für eine Membranstruktur auf der Zielzelle, beispielsweise IgG, F(ab')2, Fab, rec. Fc, Diabody oder einzelkettige, doppelantigenbindende Proteine
- das Fc-Teil eines Immunglobulins
- einen Wachstumsfaktor
- ein Cytokin - ein Chemokin
- ein Peptidhormon
- ein Adhäsionsmolekül
- einen Mediator
- die Zellmembran-bindende Domäne eines Virushüllproteins.
Des weiteren kann entsprechend dieser Erfindung die Komponente b)m einen oder mehrere Linker enthalten, ausgewählt aus einer Gruppe beispielsweise umfassend
- ein Peptid beliebiger Länge - ein Peptid mit mindestens zwei Cysteinen
- die Hingeregion eines Immunglobulins
- ein homo- oder heterodimerisierendes Peptid
- eines der bereits aufgeführten Peptide verbunden mit einem fusogenen oder Translokationspeptid - eines der bereits aufgeführten Peptide mit einer Spaltstelle für Proteinase. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure kodierend für ein erfindungsgemäßes Molekül. Die Nukleinsäure ist im allgemeinen eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA.
Für die gegebenenfalls gewünschte Sekretion des erfindungsgemäßen
Expressionsproduktes enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende eine
Nukleotidsequenz kodierend für eine Signal- oder Transmembransequenz (siehe z.B. EP-A 0 848 063 oder EP-A 0848 061 ). Ein Beispiel für geeignete Signal- oder Transmembransequenzen ist die Signalsequenz für das Immunglobulin (DNA- Position < 63 bis > 107, die Signalsequenz für das CEA (DNA-Position < 33 bis > 134) oder die Signalsequenz des Human Respiratory Syncytial Virus Glycoproteins (cDNA der Aminosäuresequenzen < 38 bis > 50 oder 48 bis 65).
In einer weiteren Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende einen Promotor und/oder Aktivator. Der Aktivator ist vorzugsweise zellspezifisch, zellzyklusspezifisch, metabolisch-spezifisch und/oder durch einen Wirkstoff aktivierbar oder suprimierbar. Derartige Aktivatorsequenzen einschließlich ihrer Kombinationen sind in EP-A 0 790 313, EP-A 0 805 209, EP-A 0 848 063, EP-A 0 848 061 , EP-A 0 857 781 , EP-A 0 860 445 bzw. EP-A 0 864 651 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende des Startkodons die Sequenz GCCACC oder GCCGCC, welche eine Verstärkung der Translation bewirken kann.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure. Der Vektor kann hierbei ein viraler oder nicht viraler Vektor sein. Ein nicht viraler Vektor ist bevorzugterweise ausgewählt aus einer Gruppe umfassend ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, ein kationisches Peptid oder ein kationisches Porphyrin.
Ein viraler Vektor ist bevorzugterweise ausgewählt aus einer Gruppe umfassend RTV, AV, AAV, HSV, Vaccinia Virus, Lenti Virus, Infiuenzavirus. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Moleküle wird die beschriebene Nukleinsäure in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein geeignetes Plasmid kloniert, in eine geeignete Zelle, beispielsweise in eine Bakterien-, Hefe-, Insektenoder Säugerzelle eingebracht, die so transformierte oder transfizierte Zelle kultiviert und das Expressionsprodukt gegebenenfalls isoliert. Die Methoden sind dem
Fachmann allgemein bekannt und beispielsweise bei Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook 2πd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, näher beschrieben.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung exprimieren diese Zellen ein erfindungsgemäßes Molekül mit einer Bindestruktur [Komponente a)n oder c)0], wobei diese Bindestruktur vorzugsweise eine Transmembrandomäne ist.
So kann beispielsweise die DNA-Sequenz kodierend für die Transmembransequenz des menschlichen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (DNA-Position < 1485 bis > 1554) oder die DNA-Sequenz kodierend für die Signal- und Transmembranregion des menschlichen Respiratory Syncytical Virus (RSV)- Glykoproteins G (Aminosäuren 1 bis 63 oder deren Teilsequenz Aminosäuren 38 bis 63) oder die DNA-Sequenz kodierend für die Signal- und Transmembranregion der Influenzavirus-Neuraminidase (Aminosäuren 7 bis 35 oder die Teilsequenz
Aminosäuren 7 bis 27) zwischen der Promotorsequenz und der DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Moleküls oder auch am 3'-Ende des Gens eingefügt werden.
Zur Verankerung des erfindungsgemäßen Moleküls in die Zellmembran der das erfϊndungsgemäße Molekül exprimierenden Zellen kann jedoch auch eine Nukleotidsequenz kodierend für einen Glykophospholipid-Anker in das Nukleinsäurekonstrukt eingefügt werden.
Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt im allgemeinen am 3'-Ende der Nukleotidsequenz kodierend für das erfindungsgemäße Molekül und kann zusätzlich zur Einfügung einer Signalsequenz erfolgen. Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA, für das N-CAM und für weitere Membranproteine, wie beispielsweise Thy-1 , beschrieben worden.
Durch diese Transmembranregion exprimiert die jeweilige Zelle das erfindungsgemäße Molekül auf der Zellmembran und erhält somit einen "Rezeptor", der für diejenigen Ziel- oder Effektorstrukturen spezifisch ist, welche durch die antigenbindenden Teile des erfindungsgemäßen Moleküls erkannt werden. Eine andere bevorzugte Bindestruktur ist die transmembran- bzw. signaltransduzierende Domäne eines Rezeptors, beispielsweise der T-Zell-Rezeptor oder der M-CSF-Rezeptor. Hierdurch kann die das erfindungsgemäße Molekül auf der Zellmembran exprimierende Zelle durch Bindung der Zielstrukturen zu spezifischen Funktionen aktiviert werden. Derartige spezifische Funktionen können beispielsweise eine zytotoxische Reaktion von T-Lymphozyten, Phagozytosereaktionen von Makrophagen und Granulozyten oder Exozytosereaktionen von Granulozyten, Monozyten und Makrophagen sein.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Zelle enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder eine erfindungsgemäßen Vektor, insbesondere eine Bakterien-, Insekten-, Hefe- oder Säugerzelle. Als Säugerzellen sind neben den allgemein bekannten Zellen zur Expression von Nukleinsäuren, wie z.B. CHO- oder BHK-Zellen, auch ein Lymphozyt, ein Makrophage, eine Gliazelle, eine Epithelzelle, eine Leberzelle, eine Nierenzelle, eine Knochenmarkszelle, eine Endothelzelle, eine glatte oder quergestreifte Muskelzelle oder ein Fibroblast geeignet.
Die zuletzt genannten Zellen sind insbesondere für eine gentherapeutische Anwendung geeignet, da diese Zellen, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt enthalten, einem Patienten lokal oder parenteral, z.B. intravenös, intraarteriell, in eine Körperhöhle, in ein Organ oder subkutan injiziert werden können, um so zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung zu dienen.
Für die gentherapeutische Behandlung von Erkrankungen können jedoch auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte direkt dem Patienten lokal, in eine Körperhöhle, in ein Organ, in das Blutgefäßsystem, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Arzneimittel enthaltend ein erfindungsgemäßes MVP, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierend für ein MVP oder eine erfindungsgemäße Zelle, welche ein MVP exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnostikum enthaltend ein erfindungsgemäßes Molekül, welches mit seiner Bindestruktur [Komponente a)n oder c)0] gegen einen Analyten gerichtet ist.
Das erfindungsgemäße MVP, die erfindungsgemäße Nukleinsäure, der erfindungsgemäße Vektor oder die erfindungsgemäße Zelle eignen sich somit zur Therapie, Prophylaxe oder Diagnose von beispielsweise Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Entzündungserkrankungen, Erkrankungen des Blutes, insbesondere des Blutgerinnungs- und/oder Blutkreislaufsystems, Erkrankungen des Nervensystems und/oder Infektionserkrankungen.
Die Wahl der einzelnen Komponenten a)n, b)m und c)0 richtet sich hierbei im allgemeinen nach der Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände. Im folgenden werden die einzelnen Komponenten und deren Verwendungen allgemein und beispielhaft näher beschrieben:
3. Beschreibung der Komponente a)n und/oder Komponente c)0
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthält die Komponente a und/oder Komponente c)0 bevorzugterweise mindestens ein ganzes Antikörpermolekül oder mindestens ein Epitop-bindendes Fragment eines Antikörpers. Diese Antikörper sind bevorzugt komplett humanen Ursprungs. Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991 )) und Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente und rekombinante Fv-Fragmente werden entsprechend dem Stand der Technik, und wie nachfolgend beschrieben, hergestellt.
Die Spezifität des Antikörpers kann gerichtet sein gegen ein oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Epitope auf den Hüllproteinen des Virus.
- Antikörper gegen Hüllproteine von Viren, die als Vektoren Verwendung finden können, sind beispielsweise Antikörper gegen das
* murine Leukämie Virus
* HIV-Virus
* Adenovirus
* Herpes Simplex Virus * Cytomegalovirus
* Minute Virus of mice
* adenoassoziiertes Virus
* Sindbis-Virus
* Vaccinia Virus
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Komponente a)n und/oder c)0 mindestens einen zellextemen Teil eines Fc- Rezeptors. An diesen Fc-Rezeptor bindet über sein Fc-Teil einer der bereits erwähnten Antikörper, welcher mit seinem antigenbindenden Teil direkt oder indirekt an das Genkonstrukt bindet.
In einer weiteren bevorzugen Ausführungsform enthält die Komponente a)n und/oder c)0 den Rezeptor für das Hüllprotein eines Virus.
Derartige Rezeptoren sind beispielsweise für folgende Viren beschrieben worden:
- HIV * das CD4-Molekül (löslich oder nativ)
* Galactosylceramid
* Rezeptoren für Chemokine
- HBV * der IL-6 Rezeptor
* Annexin oder Apolipoprotein
- HTLV
* der IL-2 Rezeptor (die ß- wie auch die γ-Kette)
- Masern Virus * das CD46 Molekül
Friend Leukemia Virus
* der Erythropoietin Rezeptor
- Varizella Zoster
* das Fc-Fragment von humanem Immunglobulin G - Sendai Virus
* das Glycophohn
- Influenza C-Virus
* die N-acetyl-9-acetamido-9-deoxy-neuraminsäure
* die 9-0-acetyl-N-acetyl-neuraminsäure - Foot and Mouth Disease Virus
* das integrin αVß3
- EBV
* der Complement Rezeptor 2 (CD21 )
- Herpes simplex Virus * der 275-kDa Mannose-6-Phosphat-Rezeptor oder der 46-kDa Mannose-6-
Phosphat-Rezeptor
- adenovirales Virus
* der CAR (Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor)
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält die
Komponente a)n und/oder c)0 mindestens einen Wirkstoff, der zugleich auch eine
Bindestruktur für eine Zelle sein kann. Die Wahl dieses Wirkstoffes richtet sich nach der Erkrankung, welche durch Gabe des MVP oder des das MVP kodierenden Genes verhütet (prophylaktische Anwendung) oder behandelt (therapeutische Anwendung) werden soll. Bei Verabreichung einer Nukleotidsequenz für ein MVP sind die Promotorsequenzen für die Nukleotidsequenz, welche den Wirkstoff kodiert im Hinblick auf die Art der Therapie der Erkrankung und unter Berücksichtigung der zu transduzierenden Zielzelle auszuwählen.
Beispielsweise sind bei folgenden Erkrankungen folgende Wirkstoffe bzw. folgende Kombinationen von Promotorsequenzen (Beispiele siehe Abschnitt Cl) und Nukleotidsequenzen kodierend für die Wirkstoffe zu wählen (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 804 601 , EP-A 0 790 313, EP-A 0 805 209, EP-A 0 848 063 und EP-A 0 848 061 , auf die Bezug genommen wird).
Therapie von Tumoren
1 ) Zielzellen:
- proliferierende Endothelzellen oder
- der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen oder - Tumorzellen oder Leukämiezellen
2) Promotoren:
- endothelzellspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- zellunspezifisch oder muskelzellspezifisch und zellzyklusspezifisch oder - tumorzellspezifisch (solide Tumoren, Leukämien) und zellzyklusspezifisch
3) Wirkstoffe oder deren Nukleotidsequenzen:
3a) Inhibitoren der Zeilproliferation, zum Beispiel
- das Retinoblastomprotein (pRb=p110) oder die verwandten p107 und p130 Proteine
Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene dieser Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110. In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert.
- das p53 Protein
Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin.
Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal verkürzt ist um das Serin 392.
- das p21 (WAF-1 )
- das p16 Protein - andere cdk-lnhibitoren
- das GADD45 Protein
- das bak Protein
b) Gerinnung induzierende Faktoren und Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:
- Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1 )
- PAI-2
- PAI-3
- Angiostatin, Endostatin - Interferone (IFNα, IFNß oder IFNγ)
- Platelet factor 4
- IL-12
- TIMP-1
- TlMP-2 - TlMP-3
- Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente c) zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiel
- Perforin
- Granzym
- IL-2 - IL-4
- IL-12
- Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFNß oder IFNγ
- TNF, wie TNFα oder TNFß
- Oncostatin M - Sphingomyelinase
- Magainin und Magainin-Derivate
d) zytostatische oder zytotoxische Antikörper und Fusionsproteine zwischen antigenbindenden Antikörperfragmenten mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen.
- Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
- Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger
Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen Sialyl Lewis; gegen Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden; gegen von Onkogenen exprimierte Proteine; gegen Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1 ; gegen Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; gegen
Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; gegen Antigene auf Heat Shock Proteinen - Des weiteren gehören hierzu Antikörper gerichtet gegen
Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991 )). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente gerichtet gegen folgende Membranantigene geeignet:
Zellen Membranantigen
AML CD 13
CD15
CD33
CAMAL
Sialosyl-Le
B-CLL CD5
CD1c
CD23
Idiotypen und Isotypen der Membranimmunglobuline
T-CLL CD33
M38
IL-2-Rezeptoren
T-Zell-Rezeptoren
ALL CALLA
CD19
Non-Hodgkin Lymphoma
Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt entsprechend der dem Fachmann bekannten Technik (Winter et al., Nature 349, 293 (1991 ); Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991 ) oder Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit Genen für zytostatische, zytotoxische oder entzündungserregende Proteinen oder Enzymen erfolgt gleichermaßen entsprechend dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik.
) Induktoren von Entzündungen, zum Beispiel
- IL-1
- IL-2 - RANTES (MCP-2)
- monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
- IL-8
- macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -ß)
- neutrophil activating protein-2 (NAP-2) - IL-3
- IL-5
- human leukemia inhibitory factor (LIF)
- IL-7
- IL-11 - IL-13
- GM-CSF
- G-CSF
- M-CSF
- Cobra venom factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welche dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d.h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen
- der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b
- Spaltprodukte des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktioneil und strukturell dem CVF ähneln
- bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von salmonella typhimurium, "clumping" Faktoren von staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von haemophilus influenzaeTyp B oder von Klebsiellen oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G.
Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika, zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten.
Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Müllen,
(Pharmac. Ther. 63, 199 (1994)) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise ist die DNA- Sequenz eines der folgenden Enzyme zu verwenden:
- Herpes Simplex Virus thymidinkinase
- Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
- bakterielle Nitroreduktase - bakterielle ß-Glucuronidase . ;.
- pflanzliche ß-Glucuronidase aus Seeale cereale
- humane ß-Glucuronidase
- humane Carboxypeptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB-B des Pankreas oder bakterielle Carboxypeptidase - bakterielle ß-Laktamase
- bakterielle Cytosine deaminase
- humane Catalase bzw. Peroxidase
- Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase - Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane D- aminosäure oxidase - Peroxidase, im besonderen humane Glutathion Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase oder humane Schilddrüsen Peroxidase
- Galaktosidase
Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen
(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP-A 0 807 183 und EP-A 0 848 061 , auf die Bezug genommen wird)
1 ) Zielzellen: - proliferierende Endothelzellen oder
- Makrophagen und/oder Lymphozyten oder
- Synovialzellen
2) Promotoren:
- endothelzellspezifisch und Zellzyklusspezifisch oder
- makrophagen- und/oder lymphozytenspezifisch und/oder zellzyklusspezifisch oder
- synovialzellspezifisch und/oder Zellzyklusspezifisch
3) Wirkstoffe oder deren Nukleotidsequenzen
3a)Wirkstoffe zur Therapie von Allergien, zum Beispiel
- IFNß
- IFNγ - IL-10
- Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4
- lösliche IL-4-Rezeptoren
- IL-12
- TGFß
3b) Wirkstoffe zur Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, zum Beispiel - IL-10
- TGFß
- lösliche IL-1 -Rezeptoren
- lösliche IL-2-Rezeptoren - IL-1-Rezeptorantagonisten
- lösliche IL-6-Rezeptoren
- immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene V - und V - Fragmente. Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex, gegen CD4 oder CD8 des weiteren gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1 -Rezeptor oder IL- 4-Rezeptor oder gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1 , CD28 oder CD40
c) Wirkstoffe zur Therapie von Antikörper-mediierten
Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel
- TGFß
- IFNα
- IFNß - IFNγ
- IL-12
- lösliche IL-4-Rezeptoren
- lösliche IL-6-Rezeptoren
- immunsuppressive Antikörper oder deren VH und V -enthaltende Fragmente
d) Wirkstoffe zur Therapie von Zell-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel
- IL-6 - IL-9
- IL-10
- IL-13 - TNFα oder TNFß
- einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen VH- und V - enthaltende Fragmente
e) Inhibitoren der Zeilproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika
Beispiele für Wirkstoffe oder für Gene kodierend für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt "Strukturgene für die Therapie von Tumoren" aufgeführt.
In gleicher Form wie dort bereits beschrieben, können im Sinne der Erfindung Wirkstoffe verwendet werden, welche Fusionsproteine aus Antikörpern bzw. Fab oder rek. Fv-Fragmenten dieser Antikörper oder anderen Liganden spezifisch für die Zielzelle und den o.a. Cytokinen,
Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, zytostatischen oder zytotoxischen Proteinen und Enzymen darstellen.
f) Wirkstoffe zur Therapie der Arthritis
Im Sinne der Erfindung werden Wirkstoffe bzw. deren Nukleinsäuresequenzen ausgewählt, die die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmen und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördern.
Hierzu gehören zum Beispiel
- IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1-RA); IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α, ß
- löslicher IL-1 -Rezeptor; löslicher IL-1 -Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1
- IL-6
IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten - löslicher TNF-Rezeptor löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF.
- IL-4
IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1 , TNFα und MMP - IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1 , TNFα und MMP und erhöht die Sekretion von TIMP
- Insulin-like growth factor (IGF-1 )
IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix. - TGFß, im speziellen TGFßl und TGFß2
TGFß stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
- Superoxiddismutase
- TIMP, im speziellen TIMP-1 , TIMP-2 oder TIMP-3
Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes
(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP A 0 807 183, auf die Bezug genommen wird)
1 ) Zielzelien: - proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder
- Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen
2) Promotoren:
- spezifisch für blutbildende Zellen und/oder Zellzyklusspezifisch - zellunspezifisch und zellzyklusspezifisch
3) Wirkstoffe oder deren Nukleinsäuresequenzen:
3a) Wirkstoffe zur Therapie der Anämie, zum Beispiel
- Erythropoietin 3b) Wirkstoffe zur Therapie der Leukopenie, zum Beispiel
- G-CSF
- GM-CSF - M-CSF
3c) Wirkstoffe zur Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispiel
- IL-3 - Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- IL-11
- Thrombopoietin
Therapie von Schäden des Nervensystems 1 ) Zielzellen:
- Gliazellen oder
- proliferierende Endothelzellen
2) Promotoren: - Gliazell-spezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- Endothelzell-spezifisch und Zellzyklusspezifisch oder
- unspezifisch und Zellzyklusspezifisch
3) Wirkstoffe oder deren Nukeinsäuresequenzen: 3a) neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispiel
- FGF
- Nerve growth factor (NGF) Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
- Neurotrophin-3 (NT-3) - Neurotrophin-4 (NT-4)
- Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
3b) Enzyme, zum Beispiel - Tyrosinhydroxylase - Dopadecarboxylase 3c) Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispiel
- TGFß
- lösliche TNF-Rezeptoren - TNF-Rezeptoren neutralisieren TNFα
- IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4
- lösliche IL-1 -Rezeptoren
- I L-1 -Rezeptor I - IL-1 -Rezeptor II
- lösliche IL-1 -Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1
- IL-1-Rezeptor-Antagonist
- lösliche IL-6-Rezeptoren
Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 777 739, EP-A 0 805 209 und EP-A 0 848 063, auf weiche Bezug genommen wird) 1 ) Zielzellen:
- Endothelzellen oder - proliferierende Endothelzellen oder
- somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskelzellen oder
- Makrophagen
2) Promotoren:
- zellunspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- spezifisch für Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Makrophagen und zellzyklusspezifisch
3) Wirkstoffe oder deren Nukleinsäuresequenzen
3a) Wirkstoffe zur Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse, zum Beispiel - Tissue Plasminogen Activator (tPA)
- Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)
- Hybride von tPA und u PA
- Protein C - Hirudin und Analoga von Hirudin
- Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1S- Inhibitor, α1-Antitrypsin oder Antithrombin III
- Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
b) Wirkstoffe zur Förderung der Gerinnung, zum Beispiel
- F VIII
- F IX
- von Willebrand factor
- F XIII - PAI-1
-- PAI-2
- Tissue Factor and Fragmente hiervon
c)Angiogenesefaktoren, zum Beispiel - VEGF (1-4)
- FGF
- TΪE-2
d) Wirkstoffe zur Blutdrucksenkung, zum Beispiel - Kallikrein
- Endothelzell "nitric oxide synthase"
e) Wirkstoffe zur Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiel - ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder
- ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (unter Tumor) aufgeführt oder - ein Fusionsprotein eines dieser Wirkstoffe mit einem Liganden, beispielsweise einem Antikörper oder Antikörperfragmenten spezifisch für Muskelzellen
3f) Blutplasmaproteine, zum Beispiel
- Albumin
- C1-lnaktivator
- Serum Cholinesterase
- Transferrin - 1 -Antitrypsin
Impfungen
(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 807 183, EP-A 0 805 209, EP-A 0 848 063 und EP-A 0 848 061 , auf weiche Bezug genommen wird)
1 ) Zielzellen:
- Muskelzellen oder
- Makrophagen, dendritische Zellen und/oder Lymphozyten 2) Promotoren:
- unspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- zielzellspezifisch und zellzyklusspezifisch
3) Wirkstoffe oder deren Nukleinsäuresequenzen: 3a) Wirkstoffe zur Prophylaxe von Infektionserkrankungen
Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind beschränkt.
Die erfindungsgemäßen MVP, enthaltend ein Protein zur Prophylaxe von
Infektionserkrankungen, versprechen eine größere Wirksamkeit aufzuweisen als konventionelle Impfstoffantigene. Des weiteren verspricht eine Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein MVP, enthaltend ein Impfstoffantigen, eine größere Wirksamkeit zu besitzen, als eine konventionelle DNA Vakzine. Deren Wirksamkeit ist eingeschränkt (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995); Donnelly et al., Immunol. 2, 20 (1994)).
Als Wirksubstanz ist ein vom Infektionserreger gebildetes Protein (oder die dieses Protein kodierende Nukleinsäuresequenz) auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d.h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T-Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits angewandt (siehe
Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
Bevorzugt im Sinne der Erfindung werden als Wirkstoffe die Neutralisationsantigene (oder deren Nukleinsäuresequenzen) folgender Erreger ausgewählt:
- Influenza A-Virus
- HIV
- Tollwut-Virus
- HSV (Herpes Simplex Virus) - RSV (Respiratory Syncytial Virus)
- Parainfluenza-Virus
- Rotavirus
- VZV (Varizella Zoster Virus)
- CMV (Cytomegalo-Virus) - Masern-Virus
- HPV (Humanes Papillomvirus)
- HBV (Hepatitis B-Virus)
- HCV (Hepatitis C-Virus)
- HDV (Hepatitis D-Virus) - HEV (Hepatitis E-Virus)
- HAV (Hepatitis A-Virus)
- vibrio Cholerae-Antigen
- borrelia Burgdorferi
- helicobacter pylori - Malaria-Antigen
- Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch ein Antiidiotyp-Antikörper oder dessen Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementarity determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.
Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.
Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in immunopathol. 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.
3b) Wirkstoffe für "Tumorvakzinen"
- Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag,
München (1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt.
Weitere Beispiele stellen die Gene für folgende Antigene bzw. für folgende Antiidiotypantikörper dar:
- Sialyl Lewis ?
- Peptide auf 1 umoren, welche von T-Zellen erkannt werden
- von Onkogenen exprimierte Proteine - Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
- Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen
die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A
0 807 183, EP-A 0 805 209, EP-A 0 848 063 und EP-A 0 848 061 , auf weiche Bezug genommen wird) 1 ) Zielzelle:
- Leberzelle - Lymphozyt und/oder Makrophage
- Epithelzelle - Endothelzelle
2) Promotoren:
- virusspezifisch oder zellspezifisch und zellzyklusspezifisch
3) Wirkstoffe oder deren Nukleinsäuresequenzen: 3a)Wirkstoffe, beispielsweise
- ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkungen aufweist. - ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen
Substanz in die aktive Substanz spaltet.
3b) antivirale Wirkstoffe
- antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise IFNα, IFNß, IFN-γ, TNFß, TNFα, IL-1 oder TGFß
- Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen VH und VL enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene VH und VL Fragmente herstellt wie bereits beschrieben.
Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:
anti HBV anti HCV anti HSV anti HPV anti HIV anti EBV anti HTLV
Anti Coxsackie Virus anti Hantaan Virus
- ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus- Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
RBP9-27 RBP1-8U RBP1-8D
Pseudogene von RBP1-8
- Ribozyme, welche die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine oder die mRNA von Viren verdauen. Ribozyme katalytisch für HIV wurden beispielsweise von Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995) übersichtlich beschrieben.
3c) antibakterielle Wirkstoffe Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegen
Meningokokken C oder B E. coli
Borrelia
Pseudomonas helicobacter pylori staphylococcus aureus
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a)n und/oder c)0 einen Wirkstoff, einen Teil des Wirkstoffes oder ein Analogon des Wirkstoffes enthalten, welcher an einen Rezeptor der Zielzelle bindet.
Derartige Wirkstoffe sind beispielsweise:
- Wachstumsfaktoren wie VEGF, PDGF, EGF, TGFα, TGFß, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, Neurotrophine, BMF, Bombesin, M-CSF, Thrombopoietin, Erythropoietin, SCF, SDGF, Oncostatin, PDEGF, Endothelin-1 - Cytokine wie IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL- 13, IL-14, IL-15
- Interferon α, ß und γ
- Tumomekrosisfaktoren TNFα, -ß
- Chemokine wie RANTES, MCAF, MIP-1α oder -ß, NAP, ß-Thromboglobulin - Peptidhormone wie SRH, SIH oder STH, MRH oder MSH, PRH, PIH oder Prolaktin, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH oder FSH, TRH oder TSH, CRH oder ACTH
- Angiotensin, Kinine, Histamin, Homologe oder Analoge hiervon - Steroidhormone wie Östrogene, Gestagene, Androgene, Glukokortikoide, Mineralokortiko.de, Homologe oder Analoge hiervon
- Vitamine wie z.B. Folsäure
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a)n und/oder c)0 auch ein Adhäsionsmolekül, ein Teil des Adhäsionsmoleküls oder ein Analogon eines Adhäsionsmoleküls sein, welches an ein korrespondierendes zellmembranständiges Adhäsionsmolekül oder an eine andere spezifische Bindestruktur für ein Adhäsionsmolekül auf der Zielzelle bindet.
Derartige als Komponente a)n und/oder c)0 funktionsfähige Adhäsionsmoleküle sind beispielsweise
- lewis X (für GMP-140)
- S-lewis X (für ELAM-l ). - LFA-1 (für ICAM-1 und ICAM-2)
- MAC-1 (für lCAM-1 )
- VLA-4 (für VCAM-1 )
- PECAM (für PECAM)
- Vitronectin (für den Vitronectinrezeptor) - GMP-140 (für lewis X)
- S-lewis X (für ELAM-l )
- ICAM-1 , ICAM-2 (für LFA-1 , MAC-1 )
- VCAM-1 (für VLA-4)
- Fibronectin (für VLA-4) - Laminin (für VLA-6)
- Fibronectin, Laminin (für VLA-1 , VLA-2, VLA-3)
- Fibronectin (für VLA-4) - Fibrinogen (für GPIIb-llla)
- B7 (für CD28)
- CD28 (für B7)
- CD40 (für CD40L) - CD40L (für CD40)
Im Rahmen der vorliegenden Verbindung kann die Komponente a)n und/oder c)0 auch der extrazelluläre Teil eines Fc-Rezeptors sein (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)), an welchem ein Antikörper spezifisch für die Zielzelle über seinen Fc-Teii gebunden wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente c)0 auch ein Antikörpermolekül oder der epitopbindende Teil eines Antikörpermoleküls sein.
Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991 ) und Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al., Nature 349, 293 (1991 ), Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991 ) oder Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993) beschriebenen Weise.
Rekombinante Antikörperfragmente werden direkt aus existierenden Hybridomen hergestellt oder werden mit Hilfe der "phage display"-Technologie aus Bibliotheken muriner bzw. Humaner Antikörperfragmente isoliert. Diese Antikörperfragmente werden dann auf genetischer Ebene direkt für weiter Manipulationen (z.B. der Fusion mit anderen Proteinen) eingesetzt.
Zur Herstellung von rekombinanten Antikörperfragmenten aus Hybridomen wird die genetische Information, die für die antigenbindenden Domänen (VH, VL) der Antikörper kodiert, durch Isolierung der mRNA, die reverse Transkription der RNA in cDNA und die anschließende Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion und Oligonukleotiden komplementär zu den 5'- bzw. 3'-Enden der variablen Fragmente gewonnen. Die VH- und VL-Fragmente werden dann in bakterielle Expressionsvektoren z.B. in Form von Fv-Fragmenten, einzelkettigen Fv- Fragmenten (scFv) oder als Fab-Fragmente kloniert.
Neue Antikörperfragmente können mittels der "phage-dispiay"-Technologie auch direkt aus Antikörperbibliotheken (Immunbibliotheken, naive Bibliotheken) murinen oder humanen Ursprungs isoliert werden. Beim "phage display" von Antikörperfragmenten werden die antigenbindenden Domänen als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein g3P filamentöser Bakteriophagen entweder in das Phagengenom oder in Phagemid-Vektoren in Form von scFv-Fragmenten oder als Fab-Fragmente kloniert. Antigen-bindende Phagen werden an antigenbeladenen Plastikgefäßen (panning), an antigenkonjugierten, paramagnetischen "beads" oder durch Bindung an Zelloberflächen selektioniert.
Immunbibliotheken werden hergestellt durch PCR-Amplifikation der variablen Antikörperfragmente aus B-Lymphozyten immunisierter Tiere oder Patienten. Dazu werden Kombinationen von Oligonukleotiden die spezifisch sind für murine oder humane Immunglobulingene bzw. für die humanen Immunglobulin-Genfamilien verwendet.
Unter Verwendung nichtimmunisierter Spender als Quelle der Immunglobulingene lassen sich naive Bibliotheken herstellen. Alternativ können Immunglobulin- Keimbahngene zur Herstellung semisynthetischer Antikörperrepertoires eingesetzt werden, wobei die Komplementarität-bestimmende Region 3 der variablen Fragmente durch PCR mit Hilfe degenerierter Primer ergänzt wird. Diese sogenannten "Single pot"-Bibliotheken haben gegenüber Immunbibliotheken den Vorteil, daß Antikörperfragmente gegen eine Vielzahl von Antigenen aus einer einzigen Bibliothek isoliert werden können.
Die Affinität von Antikörperfragmenten kann mittels der "phage display"-Technologie weiter erhöht werden, wobei neue Bibliotheken von bereits existierenden Antikörperfragmenten durch zufällige, kodonbasierende oder gezielte Mutagenese, durch "chain shuffling" einzelner Domänen mit Fragmenten aus naiven Repertoires oder unter Zuhilfenahme von bakteriellen Mutatorstämmen hergestellt werden und durch Reselektion unter stringenten Bedingungen Antikörperfragmente mit verbesserten Eigenschaften isoliert werden. Zusätzlich können murine
Antikörperfragmente durch stufenweisen Austausch einer der variablen Domänen gegen ein humanes Repertoire und anschließende Selektion mit dem ursprünglichen Antigen ("guided selection") humanisiert werden. Alternativ erfolgt die Humanisierung muriner Antikörper durch zielgerichteten Austausch der hypervariablen Regionen humaner Antikörper durch die korrespondierenden Regionen des originalen murinen Antikörpers.
Entsprechend der Erfindung sollen mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche Bindestrukturen für die Zielzelle [Komponente c)0] im erfindungsgemäßen Liganden enthalten sein. Eine besondere Form von bispezifischen oder multispezifischen, rekombinanten Antikörpern stellen einzelkettige, zweifach- oder mehrfach- antigenbindende Moleküle dar. Die Herstellung dieser Moleküle wurde in der Patentanmeldung DE 198161417 (nicht veröffentlicht) beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird zur beispielsweisen Herstellung der Komponente c)0 ausdrücklich Bezug genommen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente c)o auch das Hüllprotein oder ein Teil des Hüllproteins von Viren darstellen, welche über ihr Hüllprotein an ausgewählte Zellen spezifisch binden.
Die Wahl der Bindestruktur für eine Zielzelle richtet sich nach der Zielzelle, an welche das MVP binden soll.
Als Beispiele hierfür gelten:
- Bindestrukturen für aktivierte Endothelzellen Hierzu gehören im Sinne der Erfindung Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989) und Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose enthalten des weiteren 1L-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw.
Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGFß (Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)).
Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise Slex, LFA-1 , MAC-1 , LECAM-1 , VLA-4, Vitronectin oder RGD- Peptide wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. H, 353 (1992)).
Zu den Bindestrukturen im Sinne dieser Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Endothelzellen haben. Zu diesen Viren gehören beispielsweise:
- Filoviren, beispielsweise
* das Marburg-Virus mit seinem Hüllprotein GP (glycoprotein) und sGP (second glycoprotein)
* oder das Ebola-Virus jeweils mit seinem Hüllprotein GP und sG
- das Cytomegalovirus besonders mit seinem gB-Protein
- das Herpes Simplex-Virus Type l - das HIV-1 Virus
- das Masern-Virus
- das Hantaan-Virus
- Alphaviren, wie Semliki Forest-Virus - das Virus des epidemischen, haemorrhagischen Fiebers
- das Poliovirus
- Enteroviren (wie z.B. Echo 9, Echo 12, Coxsackie B3)
- Bindestrukturen für aktivierte Makrophagen und/oder aktivierte Lymphozyten
Zu den Bindestrukturen im Sinne der Erfindung gehören des weiteren
Substanzen, welche an die Oberfläche von Immunzellen spezifisch binden. Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Immunzellen, wie sie beispielsweise von Powelson et al., Biotech. Adv. U, 725 (1993) beschrieben wurden.
Des weiteren gehören zu den Bindestrukturen auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihrem antigenbindenden variablen Teil an Fc-γ - oder Fc-ε - oder Fc-μ Rezeptoren von Immunzellen binden (Rojanasakul et al., Pharm. Res. H, 1731 (1994)).
Des weiteren gehört hierzu das Fc-Fragment von humanem monoklonalem oder polyklonalem Immunglobulin. Derartige Fc-Fragmente werden beispielsweise gentechnisch mit Hilfe rekombinierter DNA oder entsprechend der Methoden von Haupt et al., Klin. Wschr. 47, 270 (1969), Kranz et al., Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979); Fehr et al., Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974),
Menninger et al., Immunochem. 13, 633 (1976) hergestellt.
Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Immunzellen binden. Hierzu gehören Zytokine wie beispielsweise IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα,
GM-CSF, M-CSF des weiteren Wachstumsfaktoren wie beispielsweise EGF, TGF, FGF, IGF oder PDGF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Immunzellen binden.
Hierzu gehören des weiteren Adhäsionsmoleküle und andere Liganden, welche an Zellmembranstrukturen, wie beispielsweise an den Mannose 6-Phosphat- Rezeptor auf Makrophagen in Milz, Leber, Lunge und andere Gewebe binden.
Eine Auswahl dieser Liganden und Membranstrukturen ist übersichtlich bei Perales et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994) beschrieben.
Zu den Bindestrukturen im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Lymphozyten und/oder Makrophagen haben.
Zu diesen Makrophagen infizierenden Viren gehören beispielsweise:
- HIV-1 besonders solche Stämme mit Mutationen in der V3-Region von gp120, die zu einer erhöhten Bindung an Makrophagen führen - HIV-2
- Hantaviren, beispielsweise des Punmalavirus
- Cytomegalovirus
- Respiratory Syncytial Virus
- Herpes simplex-Virus - Filoviren.
Zu den Lymphozyten infizierenden Viren gehören beispielsweise:
- Varizella-Zoster-Virus (VZV); VZV infiziert besonders T-Zellen
- Herpes Virus 6 (HHV-6);
HHV-6 infiziert besonders T-Zellen - Rabies-Virus; das Rabies-Virus Hüllprotein bindet besonders an TH2-Zellen
- HIV-1 ; das Glykoprotein gp120 bindet bevorzugt an das CD4 Molekül von T-Zellen - HTLV-II;
HTLV-II infiziert besonders B-Zellen
- HTLV-I;
HTLV-I infiziert besonders T-Zellen
- Influenza C-Viren; Influenza-C-Viren binden über das Haemagglutinin-Esterase-Fusions-(HEF)-
Protein an N-acetyl-9-O-acetyineuraminsäure (Neu 5,9 Ac2), welche bevorzugt auf B-Lymphozyten, weniger oder nicht auf T-Lymphozyten vorkommt
- Influenza C-Viren mit Mutation in der Nukleotidposition 872 (die die Position 284 des HEF der Aminosäuresequenz kodiert), beispielsweise ein
Austausch des Threonins durch Isoleucin. Das Oberflächenprotein HEF mit dieser Mutation hat eine deutlich stärkere Affinität zum N-acetyl-9-O- acetylneuraminsäure-Rezeptor als das Wildvirus
- HEF Spaltprodukte des Influenza C-Virus, welche die Bindestruktur für N- acetyl-9-O-acetylneuraminsäure enthalten. Diese Bindestruktur ist definiert durch die katalytische Triade Serin-71 , Histidin 368 oder - 369 und Asparaginsäure 261
- epstein-barr Virus;
EBV infiziert besonders B-Zellen - Herpes simplex-Virus-2;
HSV-2 infiziert besonders T-Zellen
- Masernvirus
Bindestrukturen für Muskelzellen Hierzu gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Muskelzellen, insbesondere von glatten Muskelzellen. Derartige Antikörper sind beispielsweise - der Antikörper 10F3
- Antikörper gegen Actin
- Antikörper gegen Angiotensin Il-Rezeptoren - Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren
oder Antikörper gerichtet beispielsweise gegen
- EGF-Rezeptoren - oder gegen PDGF-Rezeptoren
- oder gegen FGF-Rezeptoren
- oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren.
Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Wirksubstanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Muskelzellen binden (Übersicht bei Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2, 260 (1991 )). Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch glatte Muskelzellen binden wie beispielsweise
- PDGF
- EGF
- TGFß
- TGFα - FGF
- Endothelin A Zu den Bindestrukturen im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Muskelzellen haben. Zu diesen Viren gehört beispielsweise das Cytomegalovirus.
- Bindestrukturen für blutbildende Zellen
Zu den Bindestrukturen gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Rezeptoren exprimiert auf gering differenzierten Blutzellen.
Derartige Antikörper sind beispielsweise für folgende Rezeptoren beschrieben worden:
- Stern Cell Factor Receptor
- IL-1 -Rezeptor (Type I) - IL-l-Rezeptor (Type ll)
- IL-3-Rezeptor α
- IL-3-Rezeptor ß
- IL-6-Rezeptor
- G M-CSF-Rezeptor.
Des weiteren gehören zu den Bindestrukturen auch monoklonalβ oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-γ Rezeptoren von Immunzellen binden.
Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Substanzen, welche an
Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von gering differenzierten Blutzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie SCF, IL-1 , IL-3, IL-6, GM-CSF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Blutzellen binden.
- Bindestrukturen für Svnovialzellen und Entzündunqszellen Hierzu gehören monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren variablen Domänen an Membranstrukturen von Synovialzellen oder Entzündungszellen binden. Solche Membranstrukturen sind beispielsweise
- Vimentin
- Fibronectin oder
- Fc-Rezeptoren.
Hierzu gehören auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-Rezeptor binden.
Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe,' welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Synovialzellen binden. Beispielsweise gehören hier
Cytokine oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Synovialzellen binden wie beispielsweise IL-1-RA, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10, IGF, TGFß.
Des weiteren gehören hierzu 'Bindestrukturen, deren wesentlicher Bestandteil endständige Mannose ist, welche an Mannose-6-Phosphatrezeptoren auf Makrophagen bindet.
Bindestrukturen für mit Viren infizierte Zellen
Zu den Bindestrukturen gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen die Virusantigene exprimiert auf der Zellmembran von virusinfizierten Zellen.
Derartige Antikörper sind beispielsweise für mit folgenden Viren infizierten Zellen beschrieben worden:
- HBV - HCV
- HSV
- HPV
- HIV - EBV
- HTLV.
Bindestrukturen für Leberzellen und weitere Gewebezellen
Zu den Bindestrukturen gehören alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Leberzellen binden.
Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie Zytokine, EGF, TGF, FGF oder PDGF, oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch derartige Zellen binden.
Hierzu gehören des weiteren Bindestrukturen, welche an Zellmembranstrukturen binden, welche selektiv sind für bestimmte Gewebe. Hierzu zählen beispielsweise:
Membranstruktur Bindestruktur Gewebezellen
Asialoglycoprotein- Asialoorosomucoid Leberzellen Rezeptor Neoglycoprotein
Galactose
Transferrin-Rezeptor Transferrin Leber, andere Gewebezellen
Insulin-Rezeptor Insulin Leber, andere Gewebezellen
Mannose-6-Phosphat- Mannose Makrophagen in Milz, Rezeptor Leber, Lunge, andere Gewebe
Fc-γ-Rezeptoren Immunglobulin G retikuloendotheliales System, andere Gewebe
Diese Binde- und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Peraies et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994) beschrieben.
Zu den Bindestrukturen im Sinne der Erfindung gehören jedoch besonders Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für ausgewählte Zellen haben, wie beispielsweise für
- Bronchialepithelzellen
* Respiratory syncytial virus
- Leberzellen
* Hepatitis C-Virus, Hepatitis B-Virus, Hepatitis A-Virus
* Filoviren Leberzellen binden z.B. das Marburg-Virus über den Asialoglykoprotein-
Rezeptor
* Hepatitis B-Virus
Leberzellen binden bevorzugt über den Asialoglykoprotein-Rezeptor an der preS2 und preS1 Domäne von HBV * Hepatitis D-Virus
- lebersinusoidale Zellen * Hepatitis V-Virus
HBV wird gebunden über Fibronectin.
- Bindestrukturen für Gliazellen
Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Gliazellen, wie sie beispielsweise von Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 29, 57 (1985)) und McKeever et al. (Neurobiol. 6, 119 (1991 )) berichtet wurden. Zu diesen Membranstrukturen gehören des weiteren Neuraladhäsionsmoleküle wie
N-CAM, insbesondere dessen Polypeptid kette C.
Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Gliazellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose tragen und an den Mannose-6-
Phosphatrezeptor binden, Insulin und Insulin-like growth factor, PDGF und diejenigen Fragmente dieser Wachstumsfaktoren, welche an die zugehörigen Membranrezeptoren binden.
Zu den Bindestrukturen im Sinne der Erfindung gehören insbesondere
Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Gliazellen haben.
Zu diesen Viren gehören beispielsweise:
- HIV-1 Subtyp JRF1
- Herpes simplex-Virus I
- Bindestrukturen für Leukämiezellen
Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991 )). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente mit Spezifität für folgende Antigene geeignet:
Zellen Membranantigen
AML CD13
CD14
CD15
CD33
CAMAL sialosyl-le
B-CLL CD5
CD1c CD23
Idiotypen und Isotypen der Membranimmun- globuline
T-CLL CD33
M38
IL-2-Rezeptoren T-Zell-Rezeptoren
ALL CALLA
CD19 non-hodgkin lymphoma
Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an
Membranstrukturen oder Membranrezeptoren von Leukämiezellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Leukämiezellen binden.
Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Cross et al., Cell 64. 271 (1991); Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995); Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)). Beispielsweise gehören zu ihnen:
- IFNα bei non-hodgkin Lymphomen
- IL-2, besonders bei T-Zell-Leukämien
- FGF bei T-Zell-, monozytären, myeloiden, erythroiden und megakaryoblastischen Leukämien
- TGFß bei Leukämien
- Retinoide, z.B. "Retinoic acid" bei akuter promyelozytärer Leukämie.
- Bindestrukturen für Tumorzellen
Hierzu gehören Antikörper und Fragmente dieser Antikörper, gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und
Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt.
Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen:
- Sialyl Lewis
- Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
- von Onkogenen exprimierte Proteine
- Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1
- Blutgruppenantigene und deren Vorläufer - Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen
4a) Beschreibung des Linkers [Komponente b)m1
Die Wahl des Linkers richtet sich nach der chemischen Natur der Komponenten a)n und c)0 und nach der Methode, mit welcher diese Komponenten über den Linker miteinander verbunden werden. - Sind die Bindestrukturen Peptide oder Proteine, so wird vorzugsweise ein Peptid oder Protein als Linker verwendet und die Verbindung des Linkers mit den Komponenten a)n und c)0 erfolgt vorzugsweise über eine Peptidbindung.
Derartige Moleküle werden vorzugsweise als Fusionsproteine mit Hilfe der rekombinierten DNA-Technologie hergestellt.
- Ist die Komponente c)0 kein Peptid oder Protein, so stellt der Linker in seiner einfachsten Form eine Struktur dar, welche die Komponente a)n mit der Komponente c)0 verbindet. Derartige Strukturen resultieren aus den verschiedenen chemischen Konjugationsmethoden, mit Hilfe derer Moleküle an
Aminogruppen, Hydroxygruppen, SH-Gruppen, Carboxylgruppen oder an Aldehydgruppen in Proteinen gebunden werden (Übersicht der Methoden siehe Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, 42-49 und 81-85, Karger Verlag, München (1988)).
Der Linker [die Komponente a)n und die Komponente b)m] können jedoch auch selbst jeweils ein Peptid oder Protein sein. In diese Falle erfolgt die Verbindung zwischen beiden vorzugsweise über eine Peptidbindung und zur Komponente c)o über eine der chemischen Konjugationsmethoden.
Ob der Linker ein fusogenes Peptid oder ein Translokalisationspeptid enthält, richtet sich nach der Verwendung des erfindungsgemäßen Moleküls. Soll das erfindungsgemäße Molekül extravaskulär im Bindegewebe oder in der Zelle seine Wirkung entfalten, ist der Linker vorzugsweise ein Molekül mit fusogener Eigenschaft. Diese fusogeηe Eigenschaft erleichtert die Passage des erfindungsgemäßen Moleküls durch die Zellmembran.
Im Sinne dieser Erfindung werden als Linker mit fusogener Eigenschaft virale oder bakterielle Peptide oder Proteine wie auch synthetische Peptide verwendet.
Moleküle mit fusogener Eigenschaft sind beispielsweise (Details siehe Patentanmeldung EP-A 0 846 772): * Peptide enthaltend die Translokationsdomäne (Domäne II) des Exotoxins A von Pseudomonas
* Peptide enthaltend das Peptid
GLFEALLELLESLWELLLEA (SEQ ID NO.: 1 )
* Peptide enthaltend das Peptid
AALAEA[LAEA]4LAAAAGC (SEQ. ID NO.: 2)
* Peptide enthaltend das Peptid
FAG V-VLAG AALG VAAAAQ I (SEQ ID NO.: 3) des Fusionsproteins des Masern-Virus
* Peptide enthaltend das Peptid
GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG (SEQ ID NO.: 4) des HA2 Proteins von Influenza A
* Peptide enthaltend das Peptid GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG (SEQ ID NO." 5) oder das Peptid
GLFGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 6)
ALFGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 7)
LFLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 8)
LLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 9)
JJLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 10)
G1FGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 11 )
GLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 12)
GLFAAIAGFIE; (SEQ ID NO. 13)
GLFEAIAGFIE; (SEQ ID NO. 14)
GLFGAMAGFIE; (SEQ ID NO. 15)
GLFGAIAGLIE; (SEQ ID NO. 16)
GLFGAIAGFIV: (SEQ ID NO. 17)
GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG (SEQ ID NO.: 18) oder
GLLEALAELLEGGWEGLLEG (SEQ I D NO.: 19)
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden desweiteren Proteine von Viren verwendet, welche fusogene Eigenschaften haben. Eine Reihe von Viren besitzt fusogene und/oder translozierende Hüllproteine, so beispielsweise Paramyxoviren, Retroviren und Herpesviren. Hierzu gehören beispielsweise das TAT-Protein von HIV oder dessen translokalisierende Aminosäuresequenz oder das VP22-Protein von HSV.
Eine Reihe von Viren besitzen des weiteren Glykoproteine, die verantwortlich sind sowohl für die Virusanheftung als auch nachfolgend für die Zellmembranfusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).
Derartige Proteine werden beispielsweise von Alpha-, Rhabdo- und Orthomyxoviren gebildet.
Virale fusogene Proteine im Sinne der Erfindung wurden übersichtlich beschrieben von Hughson, Curr. Biol. 5, 265 (1995); Hoekstra, J. Bioenergetics Biomembranes 22, 121 (1990); White, Ann. Rev. Physiol. 52, 675 (1990).
Fusogene Proteine im Sinne dieser Erfindung sind beispielsweise:
- das Haemagglutinin von Influenza A- oder B-Viren, insbesondere die HA2-Kom- ponente - das M2-Protein von Influenza A-Viren alleine oder in Kombination mit dem Haemagglutinin von Influenza eingesetzt oder mit Mutanten von Neuraminidase von Influenza A, denen die Enzymaktivität fehlt, die jedoch Haemagglutination bewirken.
- Peptidanaloga des Influenza-Virus Haemagglutinins - das HEF-Protein des Influenza C-Virus
Die Fusionsaktivität des HEF-Proteins wird aktiviert durch Spaltung des HEFo in die Untereinheiten HEF1 und HEF2.
- das Transmembranglykoprotein von Filoviren, wie beispielsweise * des Marburg-Virus * des Ebola-Virus
- das Transmembranglykoprotein des Tollwutvirus
- das Transmembranglykoprotein (G) des Vesicular Stomatitis-Virus - das Fusionsprotein des HIV-Virus, insbesondere die gp41 -Komponente und fusogene Komponenten hiervon
- das Fusionsprotein des Sendai-Virus, insbesondere die aminoterminalen 33 Aminosäuren der F1 -Komponente - das Transmembranglykoprotein des semliki Forest-Virus, insbesondere die Ei- Komponente
- das Transmembranglykoprotein des Tick-bome Enzephalitis-Virus
- das Fusionsprotein des menschlichen respiratorischen syncytialen Virus (RSV) (im besonderen die gp37-Komponente) - das Fusionsprotein (S-Protein) des Hepatitis B-Virus
- das Fusionsprotein des Masern-Virus
- das Fusionsprotein des newcastle Disease Virus
- das Fusionsprotein des Visna-Virus
- das Fusionsprotein vom murinen Leukämie-Virus (im besonderen p15E) - das Fusionsprotein vom HTL-Virus (im besonderen das gp21 )
- das Fusionsprotein des Simian Immunodeficiency Virus (SIV)
Virale fusogene Proteine werden entweder durch Lösung der Hüllproteine aus einer Virusanreicherung mit Hilfe von Detergentien (wie beispielsweise ß-D- octylglucopyranosid) und Abtrennung durch Zentrifugation (Übersicht bei Mannio et al., BioTechniques 6, 682 (1988)) gewonnen oder aber mit Hilfe von dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Methoden.
5) Die Verknüpfung der Komponenten zu einem MVP
Die Verknüpfung der Komponenten a)n, b)m und c)0 zu einem MVP erfolgt vorzugsweise über Peptidbindungen. Um die Wirksamkeit bzw. die
Funktionsfähigkeit der einzelnen Komponenten a)n, b)m oder c)0 nicht zu beeinträchtigen, wird zwischen diesen Komponenten eine beliebig lange Peptidsequenz eingefügt, vorzugsweise eine Peptidsequenz von 0-30 Aminosäuren.
6) Herstellung eines Moleküls aus mindestens zwei zielzellspezifischen, multivalenten Proteinen (MVP) Ein derartiges Molekül wird hergestellt aus der Verbindung mindestens zweier MVPs durch Verbindung der jeweiligen Komponenten a)n, b)m und/oder c)0.
Derartige Verbindungen werden hergestellt in der Form, daß die natürlicherweise vorkommende Dimerisierung (oder Multimerisierung) von Proteinen ausgenutzt wird oder daß Verbindungsteile in die Komponenten a, b und/oder c eingefügt werden und diese Verbindungsteile die Verknüpfungen ermöglichen. Derartige Verbindungsteile können entsprechend der Erfindung beispielsweise sein:
- mehr als 3 Cysteine
- die Hinge Region der schweren Kette eines Antikörpers
- der zellinterne Teil von CD4 einerseits und die CD4 Bindedomäne von p56 LcK andererseits
- das GalδO Protein einerseits und die GalδO Bindedomäne von Gal4 andererseits. Hierdurch resultieren zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP), deren Di- oder
Multimerisierung erfolgt ist durch eine nicht kovalente oder kovaiente Verbindung (z.B. durch S-S-Brücken, Peptidverbindungen)
- der Komponente a)n
- der Linker [Komponente b)m] oder - der Komponente c)0.
Das zielzellspezifische, multivalente Protein (MVP) wird anhand folgender Beispiele näher verdeutlicht:
Beispiele zur Verdeutlichung des Erfindunqsqedankens
Beispiel 1
Vorarbeiten: Herstellung eines homodimeren s.c. Fv anti AV-VEGF2 Moleküls entsprechend dem Stand der Technik zur zielgesteuerten Transduktion von Adenoviren Die Expression einer scFv-VEGF-Polypeptid kette führt zur Ausbildung eines Homodimers, das zwei Bindungsstellen für Adenoviren und zwei Bindungsstellen für VEGF-Rezeptoren besitzt. Die Verbindung zum Dimer erfolgt hierbei über VEGF (= Zellbindestruktur) unter Ausbildung von Disulfidbrücken. Zur Herstellung dieses Konstruktes wurde zunächst die Rezeptor-bindende Domäne des VEGF
(Aminosäuren 1-114) in einen eukaryotischen Expressionsvektor kloniert und in Säugerzellen exprimiert. Für eine Bindung an Flk-1 ist ein VEGF-Fragment von Aminosäure 11 bis 109 ausreichend (Siemeister et al., J. Biol. Chem. 273,11115 (1998)). Dieses VEGF-Fragment wurde N-terminal durch einen kurzen Linker mit dem einzelkettigen Fv-Fragment (scFv) anti AV (S11 ) fusioniert. S11 bindet an die "knob"-Domäne des adenoviralen "fiber"-Proteins und neutralisiert die Bindung an den zellulären Adenovirus-Rezeptor. Die Expression erfolgte ebenfalls in Säugerzellen. Die Funktionalität der Bindungsstellen wird immunologisch (ELISA, Immunzytologie, Durchflußzytometrie) bzw. in Proliferationsassays mit primären humanen Endothelzellen verifiziert. Die zielgesteuerte Transduktion wird mit Hilfe von Adenoviren, die das lacZ-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren, durchgeführt.
Klonierung des Expressionsplasmids pSecTag-VEGF
Für die Klonierung sämtlicher Expressionskonstrukte wurde pSecTagA (Invitrogen, Expressionsvektor mit Igk-Ieader-Sequenz) als Vektor verwendet. Die in diesen Vektor klonierte VEGF-cDNA wurde mittels PCR aus genomischer DNA der humanen Tumorzellinie LNCaP mit Taq-Polymerase (Pharmacia) amplifiziert (30 Zyklen, Annealingtemperatur: 58°C). Dazu wurden folgende Oligonukleotide verwendet (Restriktionsstellen unterstrichen, Nummern = Aminosäureposition VEGF- cDNA nach Leader s. Leung et al., Science 246, 1306 (1989)):
VEGF backl 1
D P A A A P M A E G G G Q N 5" GC TGG GAT CCG GCG GCC GCA CCC ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT BamHI Notl VEGF forl (bottom Strand)
114 E C R P K K D R A R Q E H H H H 5' GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA CAT CAT CAC CAT CTT ACG TCT GGT TTC TTT CTA TCT CGT TCT GTT CTT GTA GTA GTG GTA
H H * (SEQ ID NO.: 20)
CAC CAT TGA GAA TTC GTC ACG (SEQ ID NO.: 21)
GTG GTA ACT CTT AAG CAG TGC 5' (SEQ ID NO.: 22)
EcoRI
Die PCR-Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquick™ Spin- Säulen aufgereinigt. Die verdauten PCR-Produkte wurden anschließend in den entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektor pSeqTagA ligiert (T4-Ligase, promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Die Klonierung des s.c. Fv (anti AV)-VEGF-Konstruktes erfolgte durch 2-Fragment- Ligation. Das s.c. Fv (anti AV)-Fragment wurde mittels PCR (s.o) unter Verwendung folgender Oligonukleotide hergestellt: PelB Metminus
A A Q P A T A Q V (SEQ ID NO.: 23) 5' TAA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAG GT 3' (SEQ ID NO.: 24)
Sfil
LMB2
5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3' (SEQ ID NO.: 25)
Dabei diente das Plasmid anti AV-pUC119mycHis (R. Hawkins in: Watkins et al., Gene Therapy 4, 1104 (1997)) als Template. Das PCR-Produkt wurde mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sfil und Notl verdaut.
Das 2. Fragment, VEGF, wurde durch Restriktionsverdau des VEGF-Plasmids mit den Restriktionsenzymen Notl und EcoRI erhalten. Der Vektor, pSecTagA, wurde mit Sfil und EcoRI verdaut. Nach Auftrennung der Restriktionsverdau-Produkte durch Agarosegelelektrophorese wurde erneut mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt. Die Fragmente 1 und 2 wurden anschließend in den geschnittenen und aufgereinigten Vektor ligiert (T4-Ligase, promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt. Die Nukleotid- und Proteinsequenz des Konstrukts s.c. Fv anti AV-VEGF ist in Figur 3 dargestellt.
Expression von VEGF
Eine in vitro-Transkription und -Translation (promega, nach Angaben des Herstellers) des VEGF-Konstruktes ergab ein Protein, das im SDS-Polyacrylamidgel mit der erwarteten Größe von etwa 20 kd lief. Die Transfektion des Plasmids in HEK293-Zellen wurde mit lipofektamin (gibco) nach Angaben des Herstellers unter Verwendung von 5 μg Plasmid und 30 μl lipofectamin pro 6 cm Schale durchgeführt. Transient transfizierte Zellen zeigten in der Immunfluoreszenz (1. Antikörper: monoklonaler anti-His-Tag, dianova; 2. Antikörper: Ziege-anti-Maus-Cy3, dianova) ein deutliches Signal. Hier waren v.a. die Kompartimente des zellulären Sekretionsweges dargestellt. Stabile Klone wurden durch Selektion in 200 μg/μl Zeocin erhalten. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellkulturüberstand durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mittels sechs C-terminaler Histidinreste.
Expression von s.c. anti AV (S1 D-VEGF
Die Expression von s.c. anti AV-VEGF erfolgt ebenfalls durch stabil transfizierte HEK293-Zellen. Wie VEGF kann auch dieses Fragment mittels IMAC aufgereinigt werden.
Herstellung des erfindungsgemäßen monomeren scFv-anti AV-scVEGF2-Moleküls zur zielzellspezifischen Transduktion von Adenoviren
In einem scFv-scVEGF2-Molekül (sc für "Single chain" = einzelkettig) wird ein scFv- Fragment mit zwei VEGF-Einheiten, die über einen zusätzlichen Peptid-Linker verbunden sind, fusioniert. Dieses Molekül liegt somit als Monomer vor und besitzt eine Bindungsstelle für das adenovirale "fiber"-Protein und zwei Bindungsstellen für die VEGF-Rezeptoren. Die Funktionalität dieser Bindungsstellen wird immunologisch (ELISA, Immunzytologie, Durchflußzytometrie) bzw. in Proliferationsassays mit primären humanen Endothelzellen verifiziert. Die zielgesteuerte Transduktion wird mit Hilfe von Adenoviren, die das lacZ-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren, durchgeführt.
Klonierung der Expressionsplasmide
Zunächst wurde ein scVEGF2-Konstrukt (Aminosäuren 1 - 109, GGGSGGGRASG- GGS-Linker (SEQ ID NO.: 26) und Aminosäuren 6 - 114) kloniert und exprimiert. Zur Klonierung dieses Konstruktes wurden 2 PCR-Reaktionen (siehe unter 1 ) mit folgenden Oligonukleotiden durchgeführt: - mit VEGF back 1 (s. unter 1 ) und VEGF for 2 (s.u.)
- mit VEGF back 2 (s.u.) und VEGF for 1 (s. unter 1 )
VEGF back2
6 G R A S G G G S G G G Q N H 5' GAC TCG GGG CGC GCC TCG GGA GGC GGT AGT GGA GGA GGG CAG AAT CAT
Ascl H E V V K (SEQ ID NO.: 27)
CAC GAA GTG GTG AAG (SEQ ID NO.: 28)
VEGF for2 (bottom Strand)
109 (SEQ ID NO.: 29)
Q H N K C K K D G G G S
5" CAG CAC AAC AAA TGT GAATGC AGA CCA AAG AAA GAT GGT GGA GGC AGC GTC GTG TTG TTT ACA CTTACG TCT GGTTTC TTT CTA CCA CCT CCG TCG
R
GGA GGC GGG CGC GCC ACT GTG (SEQ ID NO.: 30)
CCT CCG CCC GCG CGG TGA CAC 5* (SEQ ID NO.: 31 ) Ascl
(Restriktionsstellen und Linker unterstrichen, Nummern = Aminosäureposition VEGF cDNA nach Leader s. Leung et al., Science 246, 1306 (1989)).
Die PCR-Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und Ascl (1 ) bzw. Ascl und EcoRI (2) verdaut und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt. Die verdauten PCR-Produkte (1 ) und (2) wurden anschließend in den entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektor pSeqTagA ligiert (T4-Ligase, Promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Zur Klonierung von S11-scVEGF2 wurde das scVEGF2-Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und unter Verwendung von klenow-Fragment (Boehringer Mannheim) wurde der einzelsträngige Überhang aufgefüllt. Anschließend wurde mit Notl verdaut. Als Vektor wurde das S11-VEGF-Plasmid mit dem Restriktionsenzym Xhol verdaut, der einzelsträngige Überhang aufgefüllt und anschließend mit Notl verdaut. Die Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt und ligiert. Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Nukleotid- und Proteinsequenz des Konstrukts S11-scVEGF2 ist in Figur 4 dargestellt.
Expression von scVEGF2
Eine in vitro-Transkription und -Translation (promega, nach Angaben des Herstellers) des scVEGF2-Konstruktes ergab ein Protein, das im SDS- Polyacrylamidgel mit der erwarteten Größe von etwa 34 kd lief. Die Transfektion des Plasmids in HEK293-Zellen erfolgte wie unter Beispiel 1 aufgeführt. Transient transfizierte Zellen zeigten in der Immunfluoreszenz (s. Beispiel 1) ein deutliches Signal. Hier waren v.a. die Kompartimente des zellulären Sekretionsweges dargestellt. Stabile Klone wurden durch Selektion in 200 μg/μl Zeocin erhalten. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellkulturüberstand durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mittels sechs C-terminalen Histidinresten.
Expression von s.c. Fv-anti AV (S11 )-scVEGF2
Die Expression von s.c. Fv anti AV (S11 )- scVEGF2 erfolgt ebenfalls durch stabil transfizierte HEK293-Zellen. Wie scVEGF2 wird auch dieses Fragment mittels IMAC aufgereinigt. Beispiel 2
Vorarbeiten: Herstellung eines homodimeren s.c. Fv anti CD3-VEGF2 Moleküls entsprechend dem Stand der Technik
In den hier beschriebenen Beispielen wurden zielzellspezifische multivalente Proteine für eine systemische Therapie von Krebs entwickelt. Ziel ist eine selektive Bindung des MVP an Tumor- oder Tumorendothelzellen. Dies ist eine Voraussetzung für die Verwendung toxischer Proteine oder Prodrug-aktivierender Systeme zur zielgesteuerten Zerstörung von Tumoren ohne toxische Effekte auf gesundes Gewebe.
Durch die Bindung des MVP an Tumorendothelzellen wirkt der im MVP enthaltene Wirkstoff auf die Tumorendothelzellen ein. Deren Zerstörung führt zu einer Behinderung der Blutzufuhr des Tumors und zu dessen Absterben.
Bei den hier dargestellten Beispielen wird als Ligand VEGF ("vascular endothelial growth factor") - in unterschiedlichen Konfigurationen - für eine zielgerichtete Bindung anTumorendothelzellen eingesetzt. VEGF ist ein Wachstumsfaktor, der an die endothelspezifischen Rezeptoren KDR ("kinase insert domain-containing receptor") und flt-1 ("fms-like tyrosine kinase") bindet (Thomas, K.A., 1996, J. Biol. Chem. 271 : 603). Diese sind in Tumorendothelzellen verstärkt exprimiert (Gerber, H.-P., 1997, J. Biol. Chem 272: 23659; Waltenberger J., 1996, Circulation 94: 1647; Takahashi, Y., 1995, Cancer Res. 55: 3964). VEGF bindet als disulfidverbundenes Dimer an seine Rezeptoren.
Als Wirkstoff wurde das rekombinante scFv-Fragment eines ausgewählten Antikörpers verwendet. Dieser Antikörper bindet an das CD3 Molekül des humanen T-Zell-Rezeptors.
Die Expression einer scFv-VEGF-Polypeptidkette führt zur Ausbildung eines Homodimers, das zwei Bindungsstellen für CD3 und zwei Bindungsstellen für VEGF- Rezeptoren besitzt. Die Verbindung zum Dimer erfolgt hierbei über VEGF (= Zellbindestruktur) unter Ausbildung von Disulfidbrücken. Zur Herstellung dieses Konstruktes wurde zunächst die Rezeptor-bindende Domäne des VEGF (Aminosäuren 1-114) in einen eukaryotischen Expressionsvektor kloniert und in Säugerzellen exprimiert. Für eine Bindung an Flk-1 ist ein VEGF-Fragment von Aminosäure 11 bis 109 ausreichend (Siemeister et al., J. Biol. Chem. 273,11115 (1998)). Dieses VEGF-Fragment wurde N-terminal durch einen kurzen Linker mit dem einzelkettigen Fv-Fragment (scFv) anti CD3 fusioniert. Anti CD3 bindet an die CD3 Untereinheit des T-Zell-Rezeptors. Die Expression erfolgte ebenfalls in Säugerzellen. Die Funktionalität der Bindungsstellen wird immunologisch (ELISA, Immunzytologie, Durchflußzytometrie) bzw. in Proliferationsassays mit primären humanen Endothelzellen verifiziert. Des weiteren durch Bindung von T-Zellen an Endothelzellen über das erfindungsgemäße MVP.
Klonierung des Expressionsplasmids pSecTag-VEGF
Für die Klonierung sämtlicher Expressionskonstrukte wurde pSecTagA (Invitrogen, Expressionsvektor mit Igk-Ieader-Sequenz) als Vektor verwendet. Die in diesen Vektor klonierte VEGF-cDNA wurde mittels PCR aus genomischer DNA der humanen Tumorzellinie LNCaP mit Taq-Polymerase (Pharmacia) amplifiziert (30 Zyklen, Annealingtemperatur: 58°C). Dazu wurden Oligonukleotide publiziert von Leung et al., Science 246, 1306 (1989) verwendet.
Die PCR-Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquick™ Spin- Säulen aufgereinigt. Die verdauten PCR-Produkte wurden anschließend in den entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektor pSeqTagA ligiert (T4-Ligase, Promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Die Klonierung des s.c. Fv anti CD3-VEGF-Konstruktes erfolgte durch 2-Fragment- Ligation. Das 2. Fragment, VEGF, wurde durch Restriktionsverdau des VEGF-Plasmids mit den Restriktionsenzymen Notl und EcoRI erhalten. Der Vektor, pSecTagA, wurde mit Sfil und EcoRI verdaut. Nach Auftrennung der Restriktionsverdau-Produkte durch Agarosegelelektrophorese wurde erneut mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt. Die Fragmente 1 und 2 wurden anschließend in den geschnittenen und aufgereinigten Vektor ligiert (T4-Ligase, Promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Expression von VEGF
Eine in vitro-Transkription und -Translation (Promega, nach Angaben des Herstellers) des VEGF-Konstruktes ergab ein Protein, das im SDS-Polyacrylamidgel mit der erwarteten Größe von etwa 20 kd lief. Die Transfektion des Plasmids in HEK293-Zellen wurde mit Lipofektamin (Gibco) nach Angaben des Herstellers unter Verwendung von 5 μg Plasmid und 30 μl Lipofectamin pro 6 cm Schale durchgeführt.
Transient transfizierte Zellen zeigten in der Immunfluoreszenz (1. Antikörper: monoklonaler anti-His-Tag, Dianova; 2. Antikörper: Ziege-anti-Maus-Cy3, Dianova) ein deutliches Signal. Hier waren v.a. die Kompartimente des zellulären Sekretionsweges dargestellt. Stabile Klone wurden durch Selektion in 200 μg/μl Zeozin erhalten. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellkulturüberstand durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mittels sechs C-terminaler Histidinreste.
Expression von s.c. Fv anti CD3-VEGF
Die Expression von s.c. Fv anti CD3-VEGF erfolgt ebenfalls durch stabil transfizierte HEK293-Zellen. Wie VEGF kann auch dieses Fragment mittels IMAC aufgereinigt werden. Herstellung eines erfindunqsαemäßen monomeren scFv-scVEGF2-Moleküls
In einem scFv-scVEGF2-Molekül (sc für "single chain" = einzelkettig) wird ein scFv- Fragment mit zwei VEGF-Einheiten, die über einen zusätzlichen Peptid-Linker verbunden sind, fusioniert. Dieses Molekül liegt somit als Monomer vor und besitzt eine Bindungsstelle für das CD3 Molekül des T-Zell-Rezeptors und zwei Bindungsstellen für einen VEGF-Rezeptor. Die Funktionalität dieser Bindungsstellen wird immunologisch (ELISA, Immunzytologie, Durchflußzytometrie) bzw. in Proliferationsassays mit primären humanen Endothelzellen verifiziert. Die zielgesteuerte Bindung von T-Zellen wird an Hand deren Zytotoxizität für die Endothelzelle gemessen.
Klonierung der Expressionsplasmide
Zunächst wurde ein scVEGF2-Konstrukt (Aminosäuren 1 - 109, GGGSGGGRASG- GGS-Linker und Aminosäuren 6 - 114) kloniert und exprimiert. Zur Klonierung dieses Konstruktes wurden 2 PCR-Reaktionen (siehe unter 1 ) mit folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
- mit VEGF back 1 (s. unter 1 ) und VEGF for 2 (s.u.) - mit VEGF back 2 (s.u.) und VEGF for 1 (s. unter 1 )
VEGF back2
R Q N H
5' GAC TCG GGG CGC GCC TCG GGA GGC GGT AGT GGA GGA GGG CAG AAT CAT
Ascl
H E V V K (SEQ ID NO.: 32)
CAC GAA GTG GTG AAG (SEQ ID NO.: 33)
VEGF for2 (bottom Strand)
109 Q H N K C E C R P K K D G G G S 5' CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT GGT GGA GGC AGC
GTC GTG TTG TTT ACA CTT ACG TCT GGT TTC TTT CTA CCA CCT CCG TCG
G G G R A (SEQ ID NO.: 34)
GGA GGC GGG CGC GCC ACT GTG (SEQ ID NO.: 35)
CCT CCG CCC GCG CGG TGA CAC 5' (SEQ ID NO.: 36) Ascl
(Restriktionsstellen und Linker unterstrichen, Nummern = Aminosäureposition VEGF cDNA nach Leader s. Leung et al., Science 246, 1306 (1989)).
Die PCR-Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und Ascl (1 ) bzw. Ascl und EcoRI (2) verdaut und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt. Die verdauten PCR-Produkte (1 ) und (2) wurden anschließend in den entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektor pSeqTagA ligiert (T4-Ligase, Promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Zur Klonierung von s.c. anti CD3-scVEGF2 wurde das scVEGF2-Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und unter Verwendung von Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim) wurde der einzelsträngige Überhang aufgefüllt. Anschließend wurde mit Notl verdaut. Als Vektor wurde das s.c. Fv anti CD3- scVEGF2-Plasmid mit dem Restriktionsenzym Xhol verdaut, der einzelsträngige Überhang aufgefüllt und anschließend mit Notl verdaut. Die Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt und ligiert. Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Nukleotid- und Proteinsequenz des Konstrukts BMA031-scVEGF2 ist in Figur 4 dargestellt.
Expression von scVEGF2
Eine in vitro-Transkription und -Translation (Promega, nach Angaben des Herstellers) des scVEGF2-Konstrukt.es ergab ein Protein, das im SDS- Polyacrylamidgel mit der erwarteten Größe von etwa 34 kd lief. Die Transfektion des Plasmids in HEK293-Zellen erfolgte wie unter Beispiel 1 aufgeführt. Transient transfizierte Zellen zeigten in der Immunfluoreszenz (s. Beispiel 1 ) ein deutliches Signal. Hier waren v.a. die Kompartimente des zellulären Sekretionsweges dargestellt. Stabile Klone wurden durch Selektion in 200 μg/μl Zeocin erhalten. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zeil kulturüberstand durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mittels sechs C-terminalen Histidinresten.
Expression von s.c. Fv anti CD3-scVEGF2
Die Expression von s.c. Fv anti CD3-scVEGF2 erfolgt ebenfalls durch stabil transfizierte HEK293-Zellen. Wie scVEGF2 wird auch dieses Fragment mittels IMAC aufgereinigt.
MVL-Illb1 = MVL der durch Di- bzw. Multimerisierung der Zellbindestruktur entsteht, wobei diese Zusammenlagerung durch Ausbildung von Disulfidbrücken stabilisiert wird.
Figurenlegende:
Figur 1 :
Erfindungsgemäße MVP's enthaltend mindestens eine Bindestruktur für den Vektor, mindestens zwei Bindestrukturen für die Zielzelle und mindestens einen Linker.
Figur 2:
Erfindungsgemäße MVP's enthaltend mehrere Liganden; A. mindestens einfach verbunden über gleiche oder verschiedene Bindestrukturen für den Vektor; B. mindestens einfach verbunden über gleiche oder verschiedene Linker; C. mindestens einfach verbunden über gleiche oder verschiedene Bindestrukturen für die Zielzelle. Tabelle 1
S11-VEGFinpSecTagA 1/1 31/11 aga acc cac tgc tta ctg gct tat cga aat taa tac gac tca cta tag gga gac cca agc
61/21 91/31 tgg cta gcc acc atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca M E T D T L L L W V L L L W V P
- Ig kappa leader-Sequenz
121/41 Sfil 151/51 ggt tcc act ggt gac qcq qcc caq ccq qcc acg gcc CAG GTG CAA CTG CAG CAG TCA GGG G S T G D A A Q P A T A Q V Q L Q Q S G
→S11-VH
181/61 211/71
GCT GTA CTG GTG AGG CCT GGG TCC TCA GTG AAG ATT TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAT GTA A V L V R P G S S V K I S C K A S G Y V
241/81 271/91
TTC AGT AGT TAC TGG ATG AAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTT GAG TGG ATT F S S Y W M N W V K Q R P G Q G L E W I
301/101 331/111
GGA CAG ATT CAT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AAT TAC AAT GGA AAC CTC AAG GGT CAA GCC G Q I H P G D G D T N Y N G N L K G Q A
361/121 391/131
ACA GTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAC ATG CAG TTC AGC AGC CTA AAA TCT T V T A D K S S N T A Y M Q F S S L K S 421/141 451/151
GAG GAC TCT GCG GTC TAT TTC TGT GTC AGA GGA AGG GGA TGG CCT TAT GCT ATG GAC TAC E D S A V Y F C V R G R G W P Y A M D Y
481/161 511/171 TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC W G Q G T T V T V S S G G G G S G G G G scFv-Linker 541/181 571/191
TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA TCT TAT CTT GCT GCA TCT S G G G G S D I Q M T Q S P S Y L A A S
→S11-VL 601/201 631/211
CCT GGA GAA ACC ATT ACT ATT AAT TGC AGG GCA AGT AAG AGC ATT AGC AAA TAT TTA GCC P G E T I T I N C R A S K S I S K Y L A
661/221 691/231
TGG TAT CAA GAG AAA CCT GGG AAA ACT AAT AAG CTT CTT ATC TAC TCT GGA TCC ACT TTG W Y Q E K P G K T N K L L I Y S G S T L 721/241 751/251
CAA TCT GGA ATT CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT CGA TCT GGT ACA GAT TTC ACT CTC ACC Q S G I P S R F S G S R S G T D F T L T
781/261 811/271 ATC AGT AGC CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA ATG TAT TAC TGT CAA CAG TAT AAT GAA TAT I S S L E P E D F A M Y Y C Q Q Y N E Y 841/281 871/291 Notl
CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG GCG GCC GCA ccc atg gca P F T F G S G T K L E I K R A A A P M A
Linker → VEGF
901/301 931/311 gaa gga gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg aag ttc atg gat gtc tat cag cgc agc E G G G Q N H H E V V K F M D V Y Q R S
961/321 991/331 tac tgc cat cca atc gag acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag Y C H P I E T L V D I F Q E Y P D E I E 1021/341 1051/351 tac atc ttc aag cca tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg ggc tgc tgc aat gac gag Y I F K P S C V P L M R C G G C C N D E
1081/361 1111/371 ggc ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac atc acc atg cag att atg egg atc aaa G L E C V P T E E S N I T M Q I M R I K
1141/381 1171/391 cct cac caa ggc cag cac ata gga gag atg agc ttc cta cag cac aac aaa tgt gaa tgc P H Q G Q H I G E M S F L Q H N K C E C
1201/401 1231/411 EcoRI aga cca aag aaa gat aga gca aga caa gaa CAT CAT CAC CAT CAC CAT TGA GAA TTC tgc (SEQ ID NO.: 37)
R P K K D R A R Q E H H H H H H * (SEQ ID NO.: 38)
His-Tag
Tabelle 2
S11-scVEGF2 in pSecTagA
1/1 31/11 aga acc cac tgc tta ctg get tat cga aat taa tac gac tea cta tag gga gac cca agc
61/21 91/31 tgg cta gcc acc atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca M E T D T L L L W V L L L W V P
Ig kappa leader sequence
121/41 Sfil 151/51 ggt tcc act ggt gac qcq qcc caq ccq qcc acg gcc CAG GTG CAA CTG CAG CAG TCA GGG G S T G D A A Q P A T A Q V Q L Q Q S G
→S11-VH 181/61 211/71
GCT GTA CTG GTG AGG CCT GGG TCC TCA GTG AAG ATT TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAT GTA A V L V R P G S S V K I S C K A S G Y V
241/81 271/91
TTC AGT AGT TAC TGG ATG AAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTT GAG TGG ATT F S S Y W M N W V K Q R P G Q G L E W I
301/101 331/111
GGA CAG ATT CAT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AAT TAC AAT GGA AAC CTC AAG GGT CAA GCC G Q I H P G D G D T N Y N G N L K G Q A 361/121 391/131
ACA GTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAC ATG CAG TTC AGC AGC CTA AAA TCT T V T A D K S S N T A Y Q F S S L K S
421/141 451/151 GAG GAC TCT GCG GTC TAT TTC TGT GTC AGA GGA AGG GGA TGG CCT TAT GCT ATG GAC TAC E D S A V Y F C V R G R G W P Y A M D Y
481/161 511/171
TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC W G Q G T T V T V S S G G G G S G G G G scFv-Linker
541/181 571/191
TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA TCT TAT CTT GCT GCA TCT S G G G G S D I Q M T Q S P S Y L A A S
→S11-VL
601/201 631/211
CCT GGA GAA ACC ATT ACT ATT AAT TGC AGG GCA AGT AAG AGC ATT AGC AAA TAT TTA GCC P G E T I T I N C R A S K S I S K Y L A
661/221 691/231
TGG TAT CAA GAG AAA CCT GGG AAA ACT AAT AAG CTT CTT ATC TAC TCT GGA TCC ACT TTG W Y Q E K P G K T N K L L I Y S G S T L
721/241 751/251
CAA TCT GGA ATT CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT CGA TCT GGT ACA GAT TTC ACT CTC ACC Q S G I P S R F S G S R S G T D F T L T 781/261 811/271
ATC AGT AGC CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA ATG TAT TAC TGT CAA CAG TAT AAT GAA TAT I S S L E P E D F A M Y Y C Q Q Y N E Y
841/281 871/291 Notl
CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG GCG GCC GCA ccc atg gca P F T F G S G T K L E l K R A A A P M A
Linker →VEGF(1) 901/301 931/311 gaa gga gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg aag ttc atg gat gtc tat cag cgc agc E G G G Q N H H E V V K F M D V Y Q R S
961/321 991/331 tac tgc cat cca atc gag acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag Y C H P I E T L V D I F Q E Y P D E I E 1021/341 1051/351 tac atc ttc aag cca tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg ggc tgc tgc aat gac gag Y I F K P S C V P L M R C G G C C N D E
1081/361 1111/371 ggc ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac atc acc atg cag att atg egg atc aaa G L E C V P T E E S N l T M Q I M R I K
1141/381 1171/391 cct cac caa ggc cag cac ata gga gag atg agc ttc cta cag cac aac aaa tgt gaa tgc P H Q G Q H I G E M S F L Q H N K C E C
1201/401 1231/411 Ascl aga cca aag aaa gat GGT GGA GGC AGC GGA GGC GGG CGC GCC TCG GGA GGC GGT AGT gga R p K K D G G G S G G G R A S G G G S G scVEGF-ünker →
1261/421 1291/431 gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg aag ttc atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc G G Q N H H E V V K F M D V Y Q R S Y C VEGF(2)
1321/441 1351/451 cat cca atc gag acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag tac atc
H P I E T L V D I F Q E Y P D E I E Y I
1381/461 1411/471 ttc aag cca tcc tgt gtg ccc ctg atg cqa tgc ggg ggc tgc tgc aat gac gag ggc ctg
F K P S C V P L M R C G G C C N D E G L 1441/481 1471/491 gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac atc acc atg cag att atg egg atc aaa cct cac E C V P T E E S N I T M Q I M R I K P H
1501/501 1531/511 caa ggc cag cac ata gga gag atg agc ttc cta cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca Q G Q H I G E M S F L Q H N K C E C R P
1561/521 1591/531 EcoRI aag aaa gat aga gca aga caa gaa CAT CAT CAC CAT CAC CAT TGA GAA TTC tgc aga tat (SEQ ID NO.: 39) K K D R A R Q E H H H H H H * (SEQ ID NO.: 40)
His-Tag

Claims

Patentansprüche
1. Zielzellspezifisches, multivalentes Protein (MVP), dadurch charakterisiert, daß das MVP aus folgenden kovalent miteinander verbundenen Komponenten besteht: a) einer Bindestruktur (a)n spezifisch für den Vektor, b) einem Linker (b)m, und c) mindestens zwei Bindestrukturen (c)0 für die Zielzelle; wobei unabhängig voneinander n=1-10, m=1-10 und o=2-10 sind.
2. MVP nach Anspruch 1 , in welchen die Komponente b mindestens ein fusogenes Peptid oder ein Translokalisationspeptid enthält.
3. MVP nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch charakterisiert, daß die Bindestruktur für den Vektor ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend
- einen zellulären Rezeptor für ein Virus, wie beispielsweise für AdV, AAV, ein Lentivirus, ein RTV, Vacciniavirus, HSV, Influenzavirus, HIV
- einen rekombinanten Antikörper spezifisch für ein Virusprotein, für einen nichtviralen Vektor oder für eine Nukleinsäure, wie beispielsweise ein IgG, F(ab')2, Fab, rec. Fv, Diabody oder einzelkettiges, doppelantigenbindendes
Protein
- ein Peptid mit einer reaktiven Gruppe zur Konjugation an ein Virusprotein
- ein Peptid mit Bindeaffinität zu einer definierten Nukleinsäuresequenz, wie beispielsweise LexA, Gal4 oder die DNA-Bindedomäne eines Transkriptionsfaktors.
4. MVP nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch charakterisiert, daß die Bindestruktur für die Zielzelle ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend
- einen rekombinanten Antikörper spezifisch für eine Membranstruktur auf der Zielzelle, beispielsweise IgG, F(ab)2, Fab, rec. Fc, Diabody oder einzelkettige, doppelantigenbindende Proteine
- das Fc-Teil eines Immunglobulins - einen Wachstumsfaktor
- ein Cytokin
- ein Chemokin
- ein Peptidhormon - ein Adhäsionsmolekül
- einen Mediator
- die Zellmembran-bindende Domäne eines Virushüllproteins
5. MVP nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Komponenten a und c humanen Ursprungs sind.
6. Nukleinsäurekonstrukt, kodierend für ein MVP nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Ein Bakterium, eine Hefe oder eine Säugerzelle, in welche ein Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6 eingeführt worden ist.
8. MVP gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, an dessen Komponente a ein Vektor gebunden ist.
9. MVP gemäß Anspruch 8, wobei der Vektor ausgewählt wird aus einer Gruppe umfassend RTV, AdV, AAV, Influenzavirus, HSV, Vacciniavirus und Lentivirus.
10. MVP gemäß Anspruch 8, wobei der Vektor ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend einen nichtviralen Vektor, DNA, RNA und Plasmide.
11. MVP gemäß Anspruch 10, wobei der nichtvirale Vektor ausgewählt wird aus einer Gruppe umfassend kationische Lipide, kationische Polymere und Porphyrine.
12. Verwendung eines MVP gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 11 zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung von Zellen außerhalb des Gewebeverbandes bei Erkrankungen der Haut, der Schleimhaut, des Nervensystems, der inneren Organe, der Gerinnung, des blutbildenden Systems, des Immunsystems, der Muskulatur, des Stützgewebes oder der Gelenke und zur Impfung zur Vorbeuge oder Therapie dieser Erkrankungen.
13. Verwendung eines MVP's gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 11 zur Herstellung eines Heilmittels
a) zur lokalen Verabreichung bei Erkrankungen der Haut, der Schleimhaut, des Nervensystems, der inneren Organe, der Gerinnung, des blutbildenden Systems, des Immunsystems, der Muskulatur, des Stützgewebes oder der Gelenke und zur Impfung zur Vorbeuge oder Therapie dieser Erkrankungen;
b) zur Injektion bei Erkrankungen der Haut, der Schleimhaut, des Nervensystems, der inneren Organe, der Gerinnung, des blutbildenden Systems, des Immunsystems, der Muskulatur, des Stützgewebes oder der Gelenke und zur Impfung zur Vorbeuge oder Therapie dieser Erkrankungen.
14. Herstellung eines MVP's gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 11 durch Expression eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 8, Reinigung der exprimierten Proteine und gegebenenfalls Assoziierung verschiedener Expressionsprodukte.
15. MVP, bestehend aus einem scFv-Fragment mit einer Bindungsstelle für das adenovirale „fiber"-Protein und zwei VEBF-Einheiten, die über einen Peptidlinker verbunden sind.
16. MVP, bestehend aus einem scFv-Fragment mit einer Bindungsstelle für das CD3-Molekül und zwei VEGF-Einheiten, die über einen Peptidlinker verbunden sind.
17. Komplex, bestehend aus mindestens zwei LVP's gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei bei jedem der einzelnen Liganden o=1 sein kann.
8. Komplex gemäß Anspruch 17, wobei die Verbindung zwischen den Komponenten a), b) oder c) erfolgt.
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