EP1157099A2 - Substanzen für die fertilitätskontrolle - Google Patents

Substanzen für die fertilitätskontrolle

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Publication number
EP1157099A2
EP1157099A2 EP00910742A EP00910742A EP1157099A2 EP 1157099 A2 EP1157099 A2 EP 1157099A2 EP 00910742 A EP00910742 A EP 00910742A EP 00910742 A EP00910742 A EP 00910742A EP 1157099 A2 EP1157099 A2 EP 1157099A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lhop
fertility
substances
administered
substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00910742A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Monika Lessl
Ekkehard Brockstedt
Michaele Peters-Kottig
Christa Hegele-Hartung
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Schering AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering AG filed Critical Schering AG
Publication of EP1157099A2 publication Critical patent/EP1157099A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a substance and to methods for obtaining fertility control agents.
  • the female contraceptive that is used most often is the classic pill. It consists of an estrogen and a progestogen component. Regular intake leads to inhibition of ovulation in women.
  • the principle of this method is that by taking the pill it suppresses the endogenous
  • Steroid hormone production in the ovary leads to an inhibition of ovulation.
  • One disadvantage is that the woman no longer has a natural cycle.
  • side effects such as breast tensions, weight gain, etc. can occur in connection with taking the pill in patients with risk potential.
  • the present invention relates to methods of providing fertility control agents.
  • the methods are characterized in that a potentially active substance is tested for its ability to induce, stimulate or inhibit the LH-dependent ovary protein (LHOP). This is preferably done in test methods suitable for this purpose, in which the LHOP activity is induced, stimulated or inhibited. As well as the use of these substances for the production of fertility control agents.
  • LHOP LH-dependent ovary protein
  • the invention relates to fertility promotion agents which contain at least a portion of the amino acid primary structure of the LHOP.
  • Fertility-controlling agents are understood to mean all agents which are suitable both for promoting fertility and for inhibiting fertility, both for women and for men.
  • Stimulating substances according to the present invention are understood to mean those which increase the LHOP enzyme activity.
  • Inducing substances according to the present invention are understood to mean those which increase the LHOP mRNA or amount of protein.
  • Inhibitory substances according to the present invention are understood to mean those which reduce and / or inhibit the LHOP enzyme activity and / or reduce the LHOP mRNA or amount of protein.
  • the combination of 2-dimensional gel electrophoresis and subsequent mass spectrometry was used to identify a protein in mouse ovaries that was induced by the luteinizing hormone (LH).
  • LH luteinizing hormone
  • a database search showed that this is a protein which has a high protein sequence homology to mouse vas deferens protein (MVDP) and to human ARL-1 (Cao et al. 1998, J. Biol. Chem. 273: 11429 - 11435) shows.
  • the MVDP was first described by Taragnat et al, 1988 (J. Reprod. Fert. 83: 835-842) in the vas deferens of male mice.
  • LHOP LH-dependent ovary protein
  • LHOP protein belongs to the family of Aldo keto reductases. This group of enzymes reduces aldehydes or ketones from various substrates. Steroids with an aldehyde or keto group also belong to the substrates of the family of aldo keto reductases. Inhibition of LHOP (at the mRNA, protein and / or enzyme level) therefore leads to an inhibition of egg maturation, follicle maturation, steroidogenesis and / or ovulation. Stimulation of the protein (at the mRNA, protein and / or enzyme level) or administration of the recombinant protein has the opposite effect and promotes fertility (for example in the case of ovarian failure or if polycystic ovaries occur).
  • the MVD protein which is very similar to the LHO protein, occurs in large quantities in the vas deferens. Inhibition of the LHOP and / or the MVDP will thus have a negative influence on the maturation and / or the transport of the sperm by the vas deferens and lead to an inhibition of fertility. In contrast, stimulation of the LHOP and / or the MVDP or administration of recombinant protein has the opposite effect and contributes to the promotion of male fertility.
  • a first aspect of the invention relates to fertility enhancers, e.g. in in vitro or in vivo fertilization, which comprise at least a portion of the amino acid primary structure or the entire protein of the MVDP or ARL-1.
  • Another aspect of the invention relates to fertility enhancers, e.g. in in vitro or in vivo fertilization, which comprise at least a section of the amino acid primary structure or the entire protein of the LHOP.
  • Another aspect of the invention relates to methods for providing fertility control agents.
  • the methods are characterized in that a potentially active substance is tested for its ability to specifically induce or inhibit the LHO protein. This is preferably done in test methods suitable for this purpose, in which the LHOP activity is stimulated or inhibited.
  • the test procedure can be automated, for example, as a high-pressure throughput screening procedure. Substances that at this high pressure throughput
  • the substances found in this way can be small molecules, antisense RNA, ribozymes, GeneBloc or other substances which influence the induction of the mRNA, the protein or the enzymatic activity of the LHOP.
  • An enzyme assay is particularly suitable for finding substances which stimulate or inhibit LHOP enzyme activity (reduction of aldehydes and ketones).
  • the LHO protein is purified.
  • the coding region of the Ihop gene can be inserted into an expression vector and the enzyme overexpressed in pro- or eukaryotic cells (Ausubel er al, Current protocols in molecular biology, 1997, Vol. 2; p. 16.0.1).
  • the recombinant protein obtained in this way can then be purified using known chromatographic methods, for example by size exclusion and / or cation and / or anion exchange chromatography, and after incubation in phosphate buffer with NADPH can be used in the enzyme test.
  • substances can be tested that stimulate or inhibit the reduction of substrates of LHOP Aldo ketoreductase.
  • the stimulating substances thus found are then used to produce fertility enhancers in women and men.
  • the inhibiting substances are used to produce agents that inhibit fertility in women and / or in men.
  • AS antisense
  • RB ribozymes
  • GB Genebioc reagents
  • the model of the perfused ovary is suitable, for example, as a test method for finding molecules which inhibit or induce the LHOP at the mRNA, protein and / or enzyme level.
  • the ovary is prepared in rats or mice, with infusion catheters placed in the aorta and vena cava.
  • the model is exactly from Brännström et al. 1987 (Acta Physiol. Scand. 130: 107-14). With the help of this model, substances can be tested that inhibit or induce LHOP expression at the mRNA protein and / or enzyme level.
  • the inhibitory substances tested in this way are then used for the production of fertility inhibitors, the inducing substances are used for the production of fertility promoters, both in men and women.
  • pharmacologically acceptable substances are tested. As already stated, these include low molecular weight pharmacological active ingredients, but in particular small molecules as well as AS / RB or GB molecules.
  • Suitable pharmaceutical dosage forms contain the active ingredient in an amount that either prevents fertility or promotes it.
  • the active substance can be administered alone or in combination with other substances either simultaneously or sequentially.
  • the pharmaceutical composition can contain other pharmaceutically customary substances.
  • the substance can be administered either orally, nasally, transdermally, pulmonally or parenterally, for example by injection. Implants and vaginal rings or intrauterine systems are also conceivable.
  • Orally administrable compositions may be in the form of tablets, capsules, powders or liquids. Compositions which can be administered by injection are usually in the form of a parenterally acceptable aqueous solution or suspension.
  • the invention also relates to a method for promoting fertility, wherein an effective amount of a substance which stimulates or induces the LHO protein is administered to a patient, in particular a human patient.
  • the invention further relates to a method for inhibiting fertility, wherein an effective amount of a substance which inhibits the LHO protein is administered to a patient, in particular a human patient.
  • the invention further relates to a method for inhibiting fertility, wherein an effective amount of at least a portion of the amino acid primary structure of the LHOP, the MVDP or the ARL-1 is administered to a patient, in particular a human patient.
  • the invention relates to antibodies which are directed against or recognize at least a section of the amino acid primary structure or the entire protein of the LHOP of the MVDP or the ARL-1 (Sambrook et al., 1989, Production of Antibodies 18.3; Plückthun, Bio / Technology 9 (1991), 545-551 and references cited therein). As well as the use of these antibodies or agents and kits containing them for the diagnosis of fertility in men or women.
  • the invention further relates to antisense molecules which are directed against or recognize at least a portion of the nucleic acid sequence or the entire sequence of the Ihop, mvdp or arl-1 (Schaeren-Wiemers and Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100, 431-440 )). As well as the use of these antisense molecules or agents and kits containing them for the diagnosis of fertility in men or women.
  • Figure 1 Identification of the LHO protein in the ovary.
  • mice Ovaries from immature, FSH-primed mice (age: 19-23 days) were removed before or 14 h after LH application and prepared for further analysis. With the help of the high-resolution two-dimensional gel electrophoresis, a protein spot was detected that is expressed significantly variant under the influence of LH.
  • Figure 2 In situ hybridization to detect the Ihop mRNA in the mouse ovary.
  • FSH-primed mice Ovaries from immature, FSH-primed mice (ages 19-25 days) were removed before (A) or after LH application (B; 6h after LH treatment) and carried out in tissue teck to perform an in situ
  • the Ihop mRNA could be detected specifically in ovaries (in theca and stromal cells) after LH treatment (B).
  • Figure 3 Northem blot of mouse ovary mRNA. After LH application, a 300-fold increase in the Ihop mRNA was measured.
  • Figure 4 Comparison between the MVDP and ARL-1 protein.
  • FIG. 5 SDS-PAGE shows protein fractions before / after overexpression of LHOP in E. coli and before / after purification of the overexpressed LHOP using a NiNTA affinity column. Purified LHOP protein fraction (lane 5) is used in the enzyme assay.
  • the coding region of the LHOP cDNA was cloned into the expression vector pQE30 (Qiagen company), taking into account the reading frame, between an IPTG-inducible promoter and an N-terminal 6xHistidine signal.
  • the vector was transformed into the E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the native protein purification was carried out on a nickel affinity column (NiNTA agarose, Qiagen company) according to the manufacturer (The QIAexpressionist, Qiagen).
  • the eluted LHOP protein fraction was dialyzed against 10 mM phosphate buffer and used in the enzyme assay.
  • Standard enzyme reaction approach contained 135 mM sodium phosphate buffer (pH 6.3), 0.2 mM NADPH and adequate substrate and enzyme concentrations. The enzyme reaction took place at 28 ° C and the substrate conversion was determined spectrometrically via the acceptance of the A 340 from NADPH. The reaction was started by adding enzyme. It was by default
  • Controls measured without substrate and without enzyme One of the standard substrates for Aldo ketoreductases is DL-glyceraldehyde. With the help of the enzyme assay described, substances can be tested that stimulate the reduction of substrates of LHOP Aldo ketoreductase. 2) Enzyme assay for testing substances that inhibit LHOP enzyme activity (reduction of aldehydes and ketones). The enzyme assay described above should be used in a manner analogous to that described under 1) to find substances which inhibit LHOP activity.
  • the ovary is prepared by rats or mice, with infusion catheters placed in the aorta and vena cava.
  • the model is exactly from Brännström et al. 1987 (Acta Physiol. Scand. 130: 107-14).
  • substances can be found which inhibit or induce LHOP expression at the mRNA, protein and / or enzyme level.
  • the inhibiting substances found in this way are suitable for inhibiting fertility, the inducing substances are suitable for promoting fertility, both in men and women.
  • hypophysectomized rat model has been described in detail by JS Richard, 1980 (Physiol. Rev. 60: 51-89). In this model, follicular maturation and ovulation are induced by a precisely defined hormone regime (see literature reference above). The injection of 17 ⁇ -estradiol followed by
  • FoHicle stimulating hormone stimulates follicular maturation, the subsequent injection of LH triggers egg maturation, steroidogenesis and ovulation.
  • FSH FoHicle stimulating hormone
  • substances can be found which inhibit or induce LHOP expression at the mRNA, protein and / or enzyme level. The inhibitory substances found in this way are for
  • Fertility inhibition the inducible for fertility promotion, suitable for both men and women.
  • Follicular maturation induced synchronously in many ovary follicles. After 48 h with 10 IU LH the egg maturation, steroidogenesis and ovulation triggered. With the help of this model, substances can also be found that inhibit or induce LHOP expression at the mRNA, protein and / or enzyme level. The substances found in this way can be used for fertility control in men and women.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Substanz sowie Verfahren zur Gewinnung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle.

Description

Substanzen für die Fertilitätskontrolle
Beschreibung Die Erfindung betrifft eine Substanz sowie Verfahren zur Gewinnung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle.
Das weibliche Kontrazeptivum, das am häufigsten eingesetzt wird, ist die klassische Pille. Sie besteht aus einem Östrogen- und einem Gestagenanteil. Eine regelmäßige Einnahme führt zur Ovulationshemmung bei der Frau. Das Prinzip dieser Methode ist, daß es durch die Einnahme der Pille zu einer Unterdrückung der endogenen
Steroidhormonproduktion im Ovar und somit zu einer Ovulationshemmung kommt. Ein Nachteil ist, daß ein natürlicher Zyklus somit bei der Frau nicht mehr vorhanden ist. Zudem können in Zusammenhang mit der Einnahme der Pille bei Patientinnen mit Risikopotential Nebenwirkungen wie beispielsweise Brustspannungen, Gewichtszunahmen etc. auftreten.
Prinzipien für die männliche Fertilitätskontrolle sind bisher nur wenige bekannt. Eines der wenigen Prinzipien, das bisher beim Mann erprobt wurde, ist die Verabreichung von Testosteronderivaten. Dadurch kommt es zu einer Unterdrückung der Spermatogenese und somit zur männlichen Infertilität. Diese Methode der Empfängnisverhütung hat jedoch noch viele Nachteile. So dauert es bis zum Eintreten des Empfängnisschutzes ca 70 Tage. Darüber hinaus müssen die Testosteronderivate aufgrund mangelnder oraler Verfügbarkeit injiziert werden.
Durch zahlreiche Untersuchungen ist belegt, daß bei der Frau mit zunehmendem Alter die Fertilität abnimmt. Dies ist unter anderem auf eine schlechtere Qualität der Eizelle, eine erhöhte Abortrate, verstärkte Exposition mit Infektionskeimen (z.B. Chlamydien oder Gonococcen) zurückzuführen. Da sich in den Industrieländern jedoch das Alter der Erstgebährenden immer weiter nach hinten verschiebt, ist es notwendig, Möglichkeiten zur Verbesserung der Fertilität zu finden. Dieses trifft für die Frau und auch für den Mann zu. Für Paare mit Fertilitätsstörungen stehen heute die Techniken der assistierten Reproduktion zur Verfügung (In vitro Fertilisation (IVF); Gamete intrafallopian transfer (GIFT), Intrauterine Insemination). Diese Methoden sind jedoch invasiv und in den meisten Fällen mit einer vorherigen Stimulation der Follikelreifung bei der Frau durch Proteohormone (Follikel-stimulierendes Hormon/FSH) verbunden. Diese kann zu unangenehmen Nebenwirkungen wie Kopfschmerzen oder Schmerzen im Abdomen, im schlimmsten Fall jedoch auch zum sogenannten ovariellen Hyperstimulationssyndrom führen.
Liegt das Problem der Infertilität auf der Seite des Mannes, so steht heute die Technik der Intracytoplasmatischen Injektion des Spermiums (ICSI) in die Eizelle zur Verfügung. Da bei dieser Methode jedoch auch „defekte" Spermien in die Eizelle injiziert werden können, birgt sie bisher noch nicht genau bekannte Gefahren von Mißbildungen oder sonstigen Entwicklungsstörungen des Embryos. Daher besteht die dringende Notwendigkeit neue Substanzen und Mittel zur Fertilitätskontrolle, das heißt sowohl zur Fertilitätsförderung als auch zur Fertilitätshemmung, sowohl für die Frau, als auch für den Mann, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle. Die Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur Induktion, Stimulation oder Hemmung des LH-abhängigen-Ovar-Proteins (LHOP) getestet wird. Dies geschieht vorzugsweise in hierzu geeigneten Testverfahren, bei denen die LHOP Aktivität induziert, stimuliert oder gehemmt wird. Sowie die Verwendung dieser Substanzen zur Herstellung von die Fertilität kontrollierenden Mitteln.
Des weiteren betrifft die Erfindung Mittel zur Fertilitätsförderung, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur des LHOP enthalten.
Unter die Fertilität kontrollierende Mittel gemäß vorliegender Erfindung werden alle Mittel verstanden, die sich sowohl zur Fertilitätsförderung als auch zur Fertilitätshemmung, sowohl für die Frau, als auch für den Mann, eignen.
Unter stimulierenden Substanzen gemäß vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP Enzymaktivität steigern.
Unter induzierenden Substanzen gemäß vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP mRNA oder Proteinmenge erhöhen.
Unter hemmenden Substanzen gemäß vorliegender Erfindung werden solche verstanden, die die LHOP Enzymaktivität herabsetzen und/oder hemmen und/oder die LHOP mRNA oder Proteinmenge vermindern.
Mit Hilfe der Kombination von 2-dimensionaler Gelelektrophorese und nachfolgender Massenspektrometrie wurde ein Protein in Maus Ovarien identifiziert, das durch das luteinisierende Hormon (LH) induziert wird. Eine Datenbanksuche zeigte, daß es sich dabei um ein Protein handelt, welches eine hohe Proteinsequenzhomologie zum Maus- Vas-Deferens-Protein (MVDP) und zum humanem ARL-1 (Cao et al. 1998, J. Biol. Chem. 273: 11429 - 11435) zeigt. Das MVDP wurde zum ersten Mal von Taragnat et al, 1988 (J. Reprod. Fert. 83: 835-842) in Samenleitern von männlichen Mäusen beschrieben. Mit den oben beschriebenen Methoden konnte ein neues Protein im Ovar (LH-abhängiges-Ovar-Protein; LHOP) nachgewiesen werden. Zudem konnte gezeigt werden, daß LHOP im Ovar unter der Kontrolle von LH spezifisch exprimiert wird. LH wird in der Mitte des Zyklus von der Hypophyse ausgeschüttet und bewirkt die meiotische Reifung der Eizelle sowie die Ovulation der Eizelle. Dies läßt darauf schließen, daß Substanzen, welche LHOP beeinflussen (stimulieren, induzieren oder hemmen) regulativ auf die Eizellreifung, die Follikelreifung, die Steroidogenese und/oder die Ovulation wirken. Die Induktion von LHOP durch LH erfolgt sowohl auf der mRNA, als auch auf der Proteinebene. In einem Zeitverlauf konnte gezeigt werden, daß eine Induktion der mRNA bereits 2h nach Applikation des LH beginnt. Sequenzvergleiche zeigten, daß das LHOP Protein zur Familie der Aldo-Keto- Reduktasen gehört. Diese Gruppe von Enzymen reduziert Aldehyde oder Ketone von verschiedenen Substraten. Auch Steroide mit Aldehyd- oder Ketogruppe zählen zu den Substraten der Familie der Aldo-Keto-Reduktasen. Eine Hemmung des LHOP (auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene) führt daher zu einer Hemmung der Eizellreifung, der Follikelreifung, der Steroidogenese und/oder der Ovulation. Eine Stimulierung des Proteins (auf mRNA, Protein- und/oder Enzymebene) oder eine Verabreichung des rekombinanten Proteins hat den gegenteiligen Effekt und fördert die Fertilität (z.B. bei Ovarialinsuffizienz oder beim Auftreten von polycystischen Ovarien).
Es ist beim männlichen Tier (Maus ) beschrieben, daß das dem LHO Protein sehr ähnliche MVD Protein in großen Mengen im Vas deferens vorkommt. Eine Hemmung des LHOP und/oder des MVDP wird somit die Reifung und/oder den Transport der Spermien durch den Vas Deferens negativ beeinflussen und zu einer Fertilitätshemmung führen. Eine Stimulierung des LHOP und/oder des MVDP oder Verabreichung von rekombinantem Protein hingegen hat den gegenteiligen Effekt und trägt zur Förderung der männlichen Fertilität bei.
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft Mittel zur Förderung der Fertilität, z.B. bei der in vitro oder in vivo Fertilisation, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des MVDP oder ARL-1 umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Mittel zur Förderung der Fertilität, z.B. bei der in vitro oder in vivo Fertilisation, welche mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des LHOP umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Bereitstellung von Mitteln zur Fertilitätskontrolle. Die Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Induktion oder Hemmung des LHO-Proteins getestet wird. Dies geschieht vorzugsweise in hierzu geeigneten Testverfahren, bei denen die LHOP Aktivität stimuliert oder gehemmt wird. Das Testverfahren kann beispielsweise als Hochdruckdurchsatz-Screeningverfahren automatisiert werden. Substanzen, die bei diesem Hochdruckdurchsatz-
Screeningverfahren als LHOP hemmende oder stimulierende Substanzen identifiziert werden, können nachfolgend durch chemische Modifikation in ihrer Wirkung optimiert werden. Diese so gewonnenen Derivate lassen sich erfindungsgemäß einsetzen.
Bei den so aufgefundenen Substanzen kann es sich um kleine Moleküle, Antisense- RNA, Ribozyme, GeneBloc oder weitere Substanzen handeln, welche Einfluß auf die Induktion der mRNA, des Proteins oder auch auf die enzymatische Aktivität des LHOP nehmen.
So eignet sich insbesondere ein Enzymassay zum Auffinden von Substanzen, die die LHOP Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) stimulieren oder hemmen.
Zum Auffinden derartiger Substanzen wird das LHO-Protein gereinigt. Dazu kann beispielsweise der kodierende Bereich des Ihop Gens in einen Expressionsvektor insertiert werden und das Enzym in pro- oder eukaryontischen Zellen überexprimiert werden (Ausubel er al, Current protocols in molecular biology, 1997, Vol. 2; p. 16.0.1). Das so gewonnene rekombinante Protein kann anschließend mit bekannten chromatographischen Methoden, zum Beispiel durch Größenausschluß- und/oder Kationen- und/oder Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt werden und nach Inkubation in Phosphatpuffer mit NADPH im Enzymtest eingesetzt werden.
Mit Hilfe des beschriebenen Enzymassays können Substanzen ausgetestet werden, die die Reduktion von Substraten der LHOP Aldo-Ketoreduktase stimulieren oder hemmen. Die so aufgefundenen stimulierenden Substanzen werden dann zur Herstellung von Mitteln zur Förderung der Fertilität bei der Frau und beim Mann verwendet. Die hemmenden Substanzen werden zur Herstellung von Mitteln, die die Fertilität bei der Frau und/oder beim Mann hemmen, verwendet.
Des weiteren sind beispielsweise Antisense (AS) Moleküle, Ribozyme (RB) oder „Genebioc Reagenzien" (GB) zur Hemmung von LHOP auf Ebene der Transkription geeignet. Die AS, RB oder GB Moleküle, können beispielsweise mit dem Fachmann bekannten Methoden von der Sequenz des Ihop Gens abgeleitet werden und beispielsweise in geeigneten Zeil- und/oder Tiermodellen auf ihre die Fertilität hemmende Wirksamkeit in vitro und/oder in vivo getestet werden.
Als Testverfahren zum Auffinden von Molekülen, die das LHOP auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, eignet sich beispielsweise das Modell des perfundierten Ovars.
Beim Modell des perfundierten Ovars wird bei Ratten oder Mäusen das Ovar präpariert, wobei Infusionskatheter in die Aorta und Vena cava gelegt werden. Das Modell ist genau bei Brännström et al. 1987 (Acta Physiol. Scand. 130: 107-14) beschrieben. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen ausgetestet werden, die die LHOP Expression auf mRNA Protein- und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren.
Die so ausgetesteten hemmenden Substanzen werden dann, zur Herstellung von Mitteln zur Fertilitätshemmung, die induzierenden werden zur Herstellung von Mitteln für die Fertilitätsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, verwendet.
Zweckmäßigerweise werden pharmakologisch verträgliche Substanzen getestet. Hierzu zählen, wie bereits ausgeführt, niedermolekulare pharmakologische Wirkstoffe, insbesondere jedoch kleine Moleküle sowie AS/RB oder GB Moleküle.
Geeignete pharmazeutische Darreichungsformen enthalten den Wirkstoff in einer Menge, die entweder die Fertilität verhindert oder aber fördert.
Der Wirkstoff kann alleine oder in Kombination mit anderen Wikstoffen entweder gleichzeitig oder sequentiell verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann neben dem Wirkstoff weitere pharmazeutisch übliche Substanzen enthalten. Die Substanz kann entweder oral, nasal, transdermal, pulmonal oder parenteral, beispielsweise durch Injektion verabreicht werden. Weiterhin denkbar sind Implantate, sowie Vaginalringe oder intrauterine Systeme. Oral verabreichbare Zusammensetzungen können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern oder Flüssigkeiten vorliegen. Durch Injektion verabreichbare Zusammensetzungen sind üblicherweise in Form einer parenteral verträglichen wässrigen Lösung oder Suspension. Schließlich betrifft die Erfindung noch ein Verfahren zur Förderung der Fertilität, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge einer das LHO-Protein stimulierenden oder induzierenden Substanz verabreicht.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fertilitätshemmung, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge einer das LHO-Protein hemmenden Substanz verabreicht.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fertilitätshemmung, wobei man einem Patienten, insbesondere einem humanen Patienten, eine wirksame Menge mindestens eines Abschnittes der Aminosäureprimärstruktur des LHOP, des MVDP oder des ARL-1 verabreicht. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Antikörper, welche gegen mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur oder das gesamte Protein des LHOP des MVDP oder des ARL-1 gerichtet sind bzw. diese erkennen (Sambrook et al., 1989, Production of Antibodies 18.3; Plückthun, Bio/Technology 9 (1991 ), 545 - 551 und darin zitierte Literaturstellen). Sowie die Verwendung dieser Antikörper bzw. Mittel sowie Kits diese enthaltend zur Diagnose der Fertilität beim Mann oder der Frau.
Des weiteren betrifft die Erfindung Antisensemoleküle, welche gegen mindestens einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz oder die gesamte Sequenz des Ihop, mvdp oder arl-1 gerichtet sind bzw. diese erkennen (Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100, 431-440)). Sowie die Verwendung dieser Antisensemoleküle bzw. Mittel sowie Kits diese enthaltend zur Diagnose der Fertilität beim Mann oder der Frau.
Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Figuren erläutert. Es zeigen:
Figur 1 : Identifizierung des LHO-Proteins im Ovar.
Ovarien von immaturen, FSH-geprimten Mäusen (Alter: 19-23 Tage) wurden vor bzw. 14 h nach LH-Applikation entnommen und für die weitere Analytik präpariert. Mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophorese wurde ein Proteinspot detektiert, der unter LH-Einfluß signifikant variant exprimiert ist.
Figur 2: In situ Hybridisierung zum Nachweis der Ihop mRNA im Ovar der Maus.
Ovarien von immaturen, FSH-geprimten Mäusen (Alter 19-25 Tage) wurden vor (A) bzw. nach LH-Applikation (B; 6h nach LH-Behandlung) entnommen und in Tissue Teck zur Durchführung eine in situ
Hybridisierung eingebettet. Mit Hilfe einer für die Ihop mRNA spezifischen Sonde konnte die Ihop mRNA spezifisch in Ovarien (in Theca- und Stromazellen) nach LH-Behandlung nachgewiesen werden (B).
Figur 3: Northem-Blot von Maus-Ovarien mRNA. Nach LH-Applikation konnte eine 300-fache Steigerung der Ihop mRNA gemessen werden. Figur 4: Vergleich zwischen dem MVDP und ARL-1 -Protein.
Figur 5: SDS-PAGE zeigt Proteinfraktionen vor/nach Überexpression von LHOP in E. coli und vor/nach Aufreinigung des überexprimierten LHOP mit Hilfe einer NiNTA Affinitätssäule. Aufgereinigte LHOP-Proteinfraktion (Spur 5) wird im Enzymassay eingesetzt.
Beispiele
1) Enzymassay zum Austesten von Substanzen, die die LHOP Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) stimulieren.
Zur Herstellung von rekombinantem LHOP Protein wurde der kodierende Bereich der LHOP cDNA unter Beachtung des Leserasters in den Expressionsvektor pQE30 (Firma Qiagen) zwischen einen IPTG induzierbaren Promotor und einem N-terminalen 6xHistidin- Signal kloniert. Der Vektor wurde in den E. coli Stamm DH5α transformiert. Nach Überexpression und Zellaufschluß erfolgte die native Proteinaufreinigung über eine Nickel- Affinitätssäule (NiNTA-Agarose, Firma Qiagen) nach Angaben des Herstellers (The QIAexpressionist, Qiagen). Die eluierte LHOP Protein Fraktion wurde gegen 10 mM Phosphatpuffer dialysiert und im Enzymassay eingesetzt. Der
Standard Enzymreaktionsansatz enthielt 135 mM Natrium - Phosphatpuffer (pH 6,3), 0,2 mM NADPH und angemessene Substrat- und Enzymkonzentrationen. Die Enzymreaktion erfolgte bei 28°C und der Substratumsatz wurde spektrometrisch über die Abnhame der A340 von NADPH bestimmt. Die Reaktion wurde duch die Zugabe von Enzym gestartet. Es wurden standardmäßig
Kontrollen ohne Substrat und ohne Enzym gemessen. Eines der Standardsubstrate für Aldo-Ketoreduktasen ist DL-glyceraldehyde. Mit Hilfe des beschriebenen Enzymassays können Substanzen ausgetestet werden, die die Reduktion von Substraten der LHOP Aldo-Ketoreduktase stimulieren. 2) Enzymassay zum Austesten von Substanzen, die die LHOP Enzymaktivität (Reduktion von Aldehyden und Ketonen) hemmen. Der oben beschriebene Enzymassay sollte analog wie unter 1 ) beschrieben eingesetzt werden um Substanzen aufzufinden, die die LHOP-Aktivität hemmen.
3) Einsatz von „GeneblocReagenzien" (GB) zur Hemmung der LHOP Transkription. 4 unterschiedliche Ihop spezifische GB Moleküle und ein Kontroll GB Molekül wurden mit Hilfe geeigneter Computerprogramme von der c-DNA Sequenz des Ihop Gens abgeleitet und von der Firma Atugen synthetisiert. Die GB Moleküle sollen mit Hilfe von Alzet-pumps bei der Maus in vivo appliziert (Dosierung 3- 30mg/kg) werden. Zur Identifizierung derjenigen GB-Moleküle, die eine Transkription der Ihop mRNA inhibieren, wird die Methode der in situ Hybrisierung eingesetzt. Dazu werden die Ovarien der behandelten Tiere entnommen und in Tissue Teck eingebettet. Nachfolgend wird eine in situ- Hybridisierung mit /bop-spezifischen Sonden nach Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser (Histochemistry 1993 Vol. 100, 431-440) durchgeführt. Die GB Moleküle können alternativ in vitro appliziert werden. Dazu wird eine Follikelkultur von reifen Follikeln (genaue Beschreibung siehe Fehrenbach et al.,
J Reprod Fertil. 1998 Jul;113(2):287-97) angelegt und die o.g. Moleküle werden der Kultur zugesetzt. Durch beide Methoden der Applikation von Ihop- spezifischen GB Molekülen in vitro oder in vivo können GB Moleküle identifiziert werden, die die Bildung der /Λop-mRNA hemmen. Diese Moleküle können dann beim Menschen eingesetzt werden, wo es zu einer Hemmung der Follikelreifung,
Eizellreifung und/oder der Ovulation bei der Frau kommt. Werden diese Moleküle beim Mann in vivo appliziert, wird die Reifung der Spermien und/oder der Transport durch den Vas Deferens gehemmt. Spezifische GB Moleküle, die die Transkription der /bop-mRNA hemmen, können als Kontrazeptiva beim Mann und bei der Frau eingesetzt werden.
4) Beim Modell der perfundierten Ovars wird das Ovar von Ratten oder Mäusen präpariert, wobei Infusionskatheter in die Aorta und Vena cava gelegt werden. Das Modell ist genau bei Brännström et al. 1987 (Acta Physiol. Scand. 130: 107- 14) beschrieben. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen aufgefunden werden, die die LHOP Expression auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen hemmenden Substanzen sind zur Fertilitätshemmung, die induzierenden sind zur Fertilitätsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, geeignet.
5) Auffinden von Substanzen, die das LHOP auf mRNA- .Protein- und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, mittels des Modells der hypophysektomierten Ratte
Das Modell der hypophysektomierten Ratte ist von JS Richard, 1980 (Physiol. Rev. 60:51-89) ausführlich beschrieben worden. Bei diesem Modell wird die Follikelreifung und die Ovulation durch ein genau definiertes Hormonregime (siehe Literaturstelle oben) induziert. Die Injektion von 17-ß-Estradiol gefolgt von
FoHikel-Stimulierendem Hormon (FSH) stimuliert die Follikelreifung, die nachfolgende Injektion von LH triggert die Eizellreifung, Steroidogenese und die Ovulation. Mit Hilfe dieses Modells können Substanzen aufgefunden werden, die die LHOP Expression auf mRNA-, Protein- und /oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen hemmenden Substanzen sind zur
Fertilitätshemmung, die induzierenden zur Fertilitätsförderung, sowohl beim Mann als auch bei der Frau, geeignet.
6) Auffinden von Substanzen, die das LHOP auf mRNA-, Protein- und/oder Enzymebene hemmen oder induzieren, mittels des Modells der immaturen Ratte Im Modell der immaturen Ratte wird duch Injektion von 5-10 IU (FSH) die
Follikelreifung synchron in vielen Follikeln des Ovars induziert. Nach 48 h wird mit 10 I.U. LH die Eizellreifung, Steroidogenese und Ovulation ausgelöst. Mit Hilfe dieses Modells können ebenfalls Substanzen gefunden werden, die die LHOP Expression auf mRNA-, Protein und/oder Enzymebene inhibieren oder induzieren. Die so aufgefundenen Substanzen können zur Fertilitätskontrolle beim Mann und bei der Frau eingesetzt werden.

Claims

Patentansprüche
1. LHOP umfassend mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur zur Herstellung von die Fertilität fördernden oder hemmenden Mitteln.
2. Verwendung von LHOP spezifischen Antikörpern zur Diagnose der Fertilität.
3. Verwendung von Substanzen, die spezifisch das LHOP hemmen, zur Herstellung von die Fertilität hemmenden Mitteln.
4. Verwendung von Substanzen, die spezifisch das LHOP induzieren oder stimulieren, zur Herstellung von die Fertilität fördernden Mitteln.
5. Verfahren zur Bereitstellung von die Fertilität fördernden Mitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Induktion oder Stimulation des LHOP testet und bei einem positiven Testergebnis die Substanz in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt.
6. Verfahren zur Bereitstellung von die Fertilität hemmenden Mitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Hemmung des LHOP testet und bei einem positiven Testergebnis die Substanz in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt.
7. Verfahren zur Förderung der Fertilität, dadurch gekennzeichnet, daß man eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Induktion des LHOP testet und bei einem positiven Testergebnis die Substanz in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt und einem Patienten verabreicht.
8. Verfahren zur Fertilitätshemmung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine potentiell wirksame Substanz auf ihre Fähigkeit zur spezifischen Hemmung des LHOP testet und bei einem positiven Testergebnis die Substanz in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffen, überführt und einem Patienten verabreicht.
9. Verfahren zur Förderung der Fertilität, dadurch gekennzeichnet, daß das LHOP umfassend mindestens einen Abschnitt der Aminosäureprimärstruktur in eine für pharmazeutische Anwendungen geeignete Darreichungsform, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs-, Zusatz- und
Trägerstoffen, überführt und einem Patienten verabreicht wird.
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