EP1087950A1 - Neue 2-aminocarbonyl-5(2h)-isoxazolone als liganden einer dfp-bindungsstelle zur behandlung von zns-krankheiten - Google Patents

Neue 2-aminocarbonyl-5(2h)-isoxazolone als liganden einer dfp-bindungsstelle zur behandlung von zns-krankheiten

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EP1087950A1
EP1087950A1 EP99929179A EP99929179A EP1087950A1 EP 1087950 A1 EP1087950 A1 EP 1087950A1 EP 99929179 A EP99929179 A EP 99929179A EP 99929179 A EP99929179 A EP 99929179A EP 1087950 A1 EP1087950 A1 EP 1087950A1
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EP
European Patent Office
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optionally
oxygen
group
alkyl
represent
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99929179A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stephan Lensky
Bernd Riedl
Chantal FÜRSTNER
Jens ERGÜDEN
Frank BÖSS
Bernard Schmidt
Franz-Josef Van Der Staay
Werner Schröder
Joachim Schuhmacher
Delf Schmidt
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Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
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    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D261/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings
    • C07D261/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings not condensed with other rings
    • C07D261/06—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings not condensed with other rings having two or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D261/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings not condensed with other rings having two or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D261/12—Oxygen atoms

Definitions

  • the present invention relates to new 2-aminocarbonyl-5 (2H) isoxazolones as selective ligands of a high affinity binding site of diisopropyl fluorophosphate (DFP) on brain membranes for the prophylaxis and treatment of diseases of the central nervous system, in particular cognitive disorders, depression, schizophrenia and Anxiety.
  • DFP diisopropyl fluorophosphate
  • DFP diisopropyl fluorophosphate
  • Cholinesterase inhibitors that differ structurally from phosphoric acid esters, e.g. Tacrine, or physostigmine, show no improvement in cognitive performance in this animal model.
  • the discrepancy between cognitively stimulating dosages on the one hand and acetylcholinesterase-inhibiting dosages on the other hand indicates the involvement of a second mechanism of action, which is more sensitive to DFP than cholinesterase.
  • a high affinity binding site in the chicken spinal cord was identified for DFP (Biochem. Pharmacol. 1994, 48, 2073-2079), which differs from the catalytically active centers of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase.
  • the function of the new, high-affinity binding site for DFP is not yet known.
  • the high affinity binding site for DFP is not a previously known molecular target of DFP.
  • the competition profile of the binding site does not match that of acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, neuropathy target esterase, prolylendopeptidase and dipeptidyl peptidase II.
  • selective ligands for 84 known neurotransmitter receptors, enzymes and ion channels of the mammalian brain were tested for competition of [ 3 H] DFP in vitro. None of the compounds showed affinity, even at very high, already physiologically irrelevant concentrations.
  • Cerebral tissue preparations from mammals preferably from rats, calves or humans, are therefore suitable for locating ligands of the high-affinity DFP binding site.
  • the high-affinity DFP binding site is obtained from conventional mammalian cerebral tissue, preferably by homogenizing and centrifuging the tissue and resuspending the precipitate.
  • the ligand usually becomes this in different concentrations
  • DFP is added and the mixture is incubated.
  • the DFP is usually labeled, preferably radioactively labeled.
  • DFP is added in concentrations of less than 50 nM, preferably in a concentration of 0.1-20 nM, very particularly preferably 5-15 nM.
  • Ligands are usually understood to mean modulators, i.e. Substances that affect the activity of the binding site.
  • the modulators can act agonistically or antagonistically on the binding site.
  • the properties of the new, high-affinity binding site for DFP explain the above-mentioned learning and memory-enhancing effects of DFP. Therefore, substances that influence this binding site, such as DFP, should also have the cognitive-enhancing effect of DFP. Such substances are therefore suitable both for the therapeutic and for the preventive treatment of cognitive disorders in general, in particular dementias of the Alzheimer type.
  • the present invention relates to compounds of the general formula (I) in which
  • R 1 and R 2 are the same or different and
  • (C 3 -C 8 ) cycloalkyl which is optionally interrupted by an oxygen or sulfur atom or by a radical NR 8 and which is optionally selected one or more times by radicals from the group (C, -C 4 ) alkoxy , (C r C 3 ) -perfluoroalkoxy, halogen or NR 9 R '° is substituted,
  • R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are the same or different and are independently hydrogen, (C, -C) alkyl, (C, -C) acyl, (C, -C 4 ) - Alkoxy-carbonyl, carbamoyl, mono- or di- (C, -C 4 ) -alkylamino-carbonyl, and
  • n 0, 1, 2 or 3
  • R 1 represents hydrogen, aryl-S (O) n , (C, -C 4 ) alkoxy, aryl-O or halogen and R 2 has the meaning given above, and
  • n 0, 1 or 2
  • R 'and R 2 together with the adjacent carbon atoms form a 5-10-membered, monounsaturated carbocycle which is optionally interrupted by an oxygen or sulfur atom or by a radical NR "and which is optionally selected one or more times by radicals from the Group (C, -C 4 ) alkoxy, (C, -C 3 ) perfluoroalkoxy, halogen or NR 12 R 13 is substituted,
  • R ", R 12 and R 13 are identical or different and independently of one another have the meaning given for R 5 ,
  • R 3 and R 4 are the same or different and independent of each other
  • Sulfur atom or is interrupted by a residue NR 17 and that optionally substituted one or more times by radicals selected from the group (C, -C 4 ) alkoxy, halogen or NR 18 R 19 ,
  • R ' 4 , R' ⁇ R ' 6 , R 17 , R' S and R ' 9 are identical or different and independently of one another have the meaning given for R 3 , and
  • p 0 or 1
  • R 3 and R 4 together with the nitrogen atom form a saturated or partially unsaturated 3-10-membered, mono- or bicyclic heterocycle, which optionally contains up to two further heteroatoms selected from the group consisting of nitrogen, oxygen or sulfur, and optionally by residues selected from the group (C, -C 4 ) -alkyl, (C, -C) -alkoxy, hydroxy, halogen, COOR 20 , aryl-Y, or NR I R 22 is substituted,
  • R 20 denotes hydrogen or (C, -C 4 ) alkyl
  • Y represents a bond, CH 2 , CO or CHOH
  • R 21 and R 22 are the same or different and independently of one another have the meaning given for R 3 ,
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention can be salts of the substances according to the invention with mineral acids, carboxylic acids or sulfonic acids.
  • Salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid, tartaric acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid or benzoic acid.
  • the compounds according to the invention can exist in stereoisomeric forms which either behave like image and mirror image (enantiomers) or do not behave like image and mirror image (diastereomers).
  • the invention relates to both the enantiomers or diastereomers or their respective mixtures.
  • the racemic shapes can be just like that
  • -C 6 ) -alkyl or (C r C 4 ) -alkyl stand for a straight-chain or branched alkyl radical with 1 to 8 or 1 to 6 or 1 to 4
  • Carbon atoms examples include: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, tert-butyl, n-pentyl and n-hexyl.
  • a straight-chain or branched alkyl radical having 1 to 4 carbon atoms (C, -C) is preferred.
  • a straight-chain or branched alkyl radical having 1 to 3 carbon atoms (C ] -C 3 ) is particularly preferred.
  • (C, -C ft ) alkoxy stands for a straight-chain or branched alkoxy radical having 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples include: methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, tert-butoxy, n-pentoxy and n-hexoxy.
  • a straight-chain or branched alkoxy radical having 1 to 4 carbon atoms (C, -C 4 ) is preferred.
  • a straight-chain or branched alkoxy radical having 1 to 3 carbon atoms (C r C 3 ) is particularly preferred.
  • aryl stands for an aromatic or heteroaromatic radical having 5 to 6 ring atoms. Examples include phenyl, fur-2-yl, fur-3-yl, thien-2-yl, thien-3-yl, pyrid-2-yl, pyrid-3-yl, pyrid-4-yl, pyrimidin-2 -yl, pyrimidine-4-yl. Phenyl is preferred.
  • the radicals can in turn be substituted one or more times with halogen atoms, preferably chlorine or fluorine.
  • (C, -C 8 ) cycloalkyl, (C 3 -C 6 ) cycloalkyl etc. stand for cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl or cyclooctyl.
  • cyclopropyl cyclopentyl and cyclohexyl.
  • Halogen in the context of the invention generally represents fluorine, chlorine, bromine and iodine. Fluorine, chlorine and bromine are preferred. Fluorine and chlorine are particularly preferred.
  • (C, -C 4 ) -acyl represents a straight-chain or branched acyl radical having 1 to 4 carbon atoms. Examples include: formyl, acetyl, propionyl, n-butyryl, iso-butyryl.
  • (C ! -C 6 ) alkoxycarbonyl represents a straight-chain or branched alkoxycarbonyl radical having 1 to 6 carbon atoms. Examples include: methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, n-propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl and tert-butoxycarbonyl.
  • a straight-chain or branched alkoxycarbonyl radical having 1 to 4 carbon atoms (C, -C 4 ) is preferred.
  • a straight-chain or branched alkoxycarbonyl radical having 1 to 3 carbon atoms (C, -C 3 ) is particularly preferred.
  • the 5-10-membered, monounsaturated carbocycle stands for cyclopentene-1,2-diyl, cyclohexene-1,2-diyl, cycloheptene-1,2-diyl, cyclooctene-1,2-diyl, cyclonone 1,2-diyl or cyclodecene-1,2-diyl. Cyclohexene-1,2-diyl, cycloheptene-1,2-diyl and cyclooctene-1,2-diyl are preferred. Individual ring atoms can be replaced by an oxygen, sulfur or nitrogen atom. Examples include: 3-pyrroline-3,4-diyl, 1,2,5,6-tetrahydropyridine-3,4-diyl, 5,6-dihydro- (2H) -pyran-3,4-diyl.
  • heterocycle stands for a monocyclic or bicyclic ring with 3 to 10 ring atoms, which is bonded to the adjacent carbonyl / thiocarbonyl group via a nitrogen atom and contains up to two further heteroatoms and optionally one or more double or triple bonds.
  • the two rings can be linked spirocyclically, or the bridgehead atoms of the two rings are directly adjacent or separated by one or more ring atoms.
  • Examples include aziridin-1-yl, azetidin-1-yl, pyrrolidin-1-yl, pyrrolin-1-yl, piperidin-1-yl, 1,2,5,6-tetrahydropyridin-1-yl, morpholin-4 -yl, thiomorpholin-4-yl, hexahydroazepin-1-yl, 2,3-dihydro- (lH) -indol-l-yl, octahydroindol-1-yl, 8-azabicyclo [3.2.1] octan-8-yl ,
  • R 1 and R 2 are the same or different and
  • Sulfur atom is interrupted and if necessary one or more times is substituted by radicals selected from the group consisting of methoxy, ethoxy or fluorine,
  • n 0, 1 or 2
  • R 1 represents hydrogen, aryl-S, aryl-O, fluorine or chlorine and R 2 has the meaning given above,
  • R 1 and R 2 together with the adjacent carbon atoms form a 5-8-membered, monounsaturated carbocycle which is optionally interrupted by an oxygen or sulfur atom and which is optionally selected one or more times by radicals selected from the group consisting of methoxy, ethoxy or fluorine is substituted,
  • R 3 and R 4 are the same or different and independent of each other
  • R 14 , R ' 5 , R' 6 , R 17 , R 1S and R 19 are identical or different and are hydrogen, (C, -C 3 ) -alkyl, acetyl, propionyl, methoxycarbonyl or ethoxycarbonyl, and
  • p 0 or 1
  • R 3 and R 4 together with the nitrogen atom form a saturated or partially unsaturated 4-9-membered, mono- or bicyclic heterocycle which optionally contains up to two further heteroatoms selected from the group consisting of nitrogen, oxygen or sulfur, and if appropriate by radicals selected from the group methyl, ethyl, methoxy, ethoxy, hydroxy, fluorine, COOR 20 , aryl-Y, or NR 21 R 22 ,
  • R 20 represents hydrogen, methyl or ethyl
  • Y represents a bond, CH 2 or CHOH
  • R 2 'and R 22 are identical or different and independently of one another are hydrogen, (C, -C 3 ) -alkyl, acetyl, propionyl, methoxycarbonyl or ethoxycarbonyl,
  • X represents oxygen or sulfur
  • R 1 and R 2 are the same or different and
  • R 1 represents hydrogen, phenyl-S or phenyl-O and R 2 has the meaning given above, or
  • R 1 and R 2 together with the adjacent carbon atoms form a 5-9-membered, monounsaturated carbocycle which is optionally substituted one or more times by fluorine,
  • R 3 and R 4 are the same or different and independent of each other
  • p 0 or 1
  • R 3 and R 4 together with the nitrogen atom form a saturated or partially unsaturated 4-9-membered, mono- or bicyclic heterocycle which optionally contains up to two further heteroatoms selected from the group consisting of nitrogen, oxygen or sulfur, and if appropriate by radicals selected from the group methyl, hydroxy, fluorine, COOR 20 , phenyl-Y, or NR 21 R 22 is substituted,
  • R 2U means methyl
  • Y represents a bond or CHOH
  • R 21 and R 22 are the same or different and are hydrogen or methyl
  • R 1 and R 2 are the same or different and
  • R 3 and R 4 are the same or different and independently of one another represent methyl or ethyl
  • R 3 and R 4 together with the nitrogen atom form an azetidin-1-yl, pyrrolidin-1-yl or pyrrolin-1 -yl radical, and
  • R 1 and R 2 have the meaning given in claim 1, and R 23 represents (C, -C 4 ) -alkyl which is optionally substituted by fluorine,
  • R 1 , R 2 and R 23 have the meaning given above,
  • R 1 and R 2 have the meaning given above
  • X represents oxygen or sulfur
  • q means 1, 2 or 3
  • Customary organic solvents which do not change under the reaction conditions are suitable as solvents for the processes.
  • ethers such as diethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, glycol dimethyl ether, or hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, hexane, cyclohexane or petroleum fractions, or halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, trichloromethane, tetrachloromethane, dichlorethylene, tricholethylene or tricholethylene, or ethyl acetate, pyridine, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, hexamethylphosphoric triamide, acetonitrile, acetone or nitromethane.
  • ethers such as diethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, glycol dimethyl ether
  • hydrocarbons such as benzene, tol
  • (VI) -> (I) are preferably dichloromethane and trichloromethane. Dichloromethane is particularly preferred.
  • inorganic or organic bases can be used as bases for the processes according to the invention.
  • This preferably includes
  • Alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide or potassium hydroxide, alkaline earth metal hydroxides such as barium hydroxide, alkali metal carbonates such as sodium carbonate, potassium carbonate or cesium carbonate, alkaline earth metal carbonates such as calcium carbonate, or alkali metal or alkaline earth metal alcoholates such as sodium or potassium methanolate, sodium - or potassium ethanolate or potassium tert-butoxide, or organic
  • Amines such as triethylamine, or heterocycles such as 1,4-di-azabicyclo [2.2.2] octane (DABCO), 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU), pyridine, N, N-dimethylaminopyridine, methylpiperidine or morpholine.
  • DABCO 1,4-di-azabicyclo [2.2.2] octane
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene
  • pyridine N, N-dimethylaminopyridine, methylpiperidine or morpholine.
  • Sodium hydroxide is preferred for process (II) -> (III) -> (IV) and triethylamine for process (VI) -> (I).
  • the base is used in an amount of 0.05 mol to 10 mol, preferably 1 mol to 3 mol, based on 1 mol of the compound of the formula (III) or (VI).
  • the processes according to the invention are generally carried out in a temperature range from -20 ° C. to + 100 ° C., preferably from 0 ° C. to + 60 ° C.
  • Vacuum e.g. in a range of 0.5 to 5 bar.
  • DFP also has potent effects in an in vivo animal model for the discovery of new antidepressants. This is the "Rat Forced swimming Test” according to Porsolt (Nature 1977, 266, 730-732). DFP induces in this
  • a dose-dependent test has a behavior-activating effect, as is known from clinically effective antidepressants.
  • the optimal dose is 0.03 mg / kg orally, ie far below the concentrations that would be required for choline esterase inhibition (as described above).
  • ligands from the high-affinity DFP binding site are also suitable for use in psychiatric indications such as depression, schizophrenia or anxiety.
  • the compounds according to the invention also inhibit ACPH (N-acyl peptide hydrolase).
  • the new active compounds can be converted in a known manner into the customary formulations, such as tablets, dragées, pills, granules, aerosols, syrups, emulsions, suspensions and solutions, using inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients or solvents.
  • the therapeutically active compound should in each case be present in a concentration of about 0.0001 to 90% by weight, preferably 0.0001 to 1.0% by weight, of the total mixture, i.e. in amounts sufficient to achieve the dosage range indicated.
  • the formulations are prepared, for example, by stretching the active ingredients with solvents and / or carriers, optionally using emulsifiers and / or dispersants, e.g. in the case of the use of water as a diluent, organic solvents can optionally be used as auxiliary solvents.
  • the application is carried out in the usual way, preferably orally, transdermally or parenterally, in particular perlingually or intravenously.
  • the ligands of the high affinity DFP binding site are generally suitable for use in the prophylaxis and treatment of diseases of the central nervous system.
  • R 24 and R 25 are the same or different and are independently halogen, (C, -C 8 ) alkoxy. (C, -C 8 ) alkenoxy, aryl-S or aryl-O, where (C, -C 8 ) -
  • Alkoxy or (C, -C 8 ) alkenoxy are optionally substituted one or more times by halogen, and
  • R 26 has the meaning of R 24 and is the same or different from it, or represents optionally substituted (C, -C 8 ) -alkyl or substituted aryl, and
  • (C, -C 8 ) -alkenoxy stands for a straight-chain or branched alkenyloxy residue consisting of 1 to 8 carbon atoms. Examples include: ethenyl, prop-2-en-1-yl, prop-2-en-2-yl, prop-3-enyl or but-1-en-1-yl.
  • Such new drugs are first identified by an in vitro competition test at the high affinity DFP binding site. In principle, Zeil membranes from mammalian species other than rats, including humans, can also be used.
  • Ligands of the high-affinity DFP binding site in the sense of the invention are those substances which, when applied with [ 3 H] DFP, displace at a concentration of less than 10 nM with a dissociation constant K d of less than 100,000 nM.
  • Ligands are preferred whose K d at this binding site is less than 1000 nM.
  • Cholinesterase inhibition can be demonstrated with suitable in vitro tests.
  • One such test is the photometric determination of the cholinesterase activity according to Ellman (Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88-95).
  • the ligands of the high-affinity DFP binding site are particularly suitable for the
  • Rat brains were homogenized, cooled in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 and centrifuged twice for 30 min at 48,000 ⁇ g, the supernatants being discarded and the precipitate being resuspended in 50 mM Tris buffer.
  • the test batch in the binding test initially contained about 0.4 mg of membrane protein, DFP in various concentrations, and 50 mM Tris buffer. This mixture was preincubated for 30 min at 25 ° C. in a water bath before commercially available [ 3 H] DFP (0.1 to 20 nM, 5 nM in standard tests) was added. The samples were then mixed well again and incubated for 120 min at 25 ° C.
  • the binding measured in this way was 90% specific and saturable.
  • the apparent binding constant K d was in the whole brain as well as in some
  • Brain regions such as the cerebral cortex 1.8 + 0.2 nM (mean ⁇ standard error from a total of 21 experiments up to 10 nM).
  • the binding site density B max was in the range of 347 ⁇ 14.9 pmol / mg membrane protein in these experiments.
  • the Scatchard transformation of the binding data was linear. This implies interaction with a single, non-interacting, high affinity class of Close binding sites for the radioligand in this concentration range.
  • radioligand concentrations> 10 nM the total binding increased again disproportionately, which indicates an interaction with other, less affine binding sites at higher concentrations.
  • DFP binding site is not cholinesterases.
  • a comparison of the interaction of unlabelled DFP and physostigmine with both biological targets under largely the same conditions showed that DFP inhibits the binding of [3H] DFP to the high-affinity binding site in rat brain membranes about 200 times more potent than the acetylcholinesterase activity . (IC50 11 nM vs 2.6 ⁇ M).
  • physostigmine which like DFP binds to the acetylcholine binding region of acetylcholinesterase, was only able to inhibit acetylcholinesterase (IC50 33 nM), not to displace DFP from the high-affinity DFP binding site (IC50> 1 mM).
  • the selectivity of the substances as DFP ligands with regard to cholinesterase inhibition can be demonstrated with suitable in vitro tests.
  • One such test is the photometric determination of the cholinesterase activity according to Ellman (Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88-95).
  • Ellman Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88-95.
  • the experiment is carried out with raw whole brain rat homogenates.
  • brain homogenates from other warm-blooded animals, including humans, are suitable as enzyme preparations, as are commercially available, purified enzyme preparations.
  • rat brains are homogenized in 20-fold volume (w / v) 100 mM K 2 HPO 4 buffer, pH 8.0. The protein concentration of the homogenate is adjusted to approximately 3 mg / ml by dilution in the buffer.
  • the incubation batch (1500 ⁇ l) contains 100 mM phosphate buffer pH 8.0, 330 ⁇ M dithiobisnitrobenzoate, 50 ⁇ l brain homogenate corresponding to 150 ⁇ g protein, various test concentrations of the test substances to be tested and 40 ⁇ M acetylthiocholine as the enzyme substrate.
  • the reaction mixture is preincubated for 30 min at room temperature before adding the substrate.
  • the enzyme reaction is started by adding substrate.
  • the reaction time is 6 min.
  • the samples are then mixed with 25 ml of 1 mM tacrine solution (final concentration) in order to terminate the reaction, and the yellow color complex in the spectrophotometer at 412 nm is quantified against the corresponding blank value (tacrine addition before substrate addition).
  • the IC 50 is calculated from the enzyme activity in the presence of increasing concentrations of test substance in the test and with that for the [ 3 H] DFP-
  • Example 1 inhibited acetylcholinesterase with a K j of> 10 ⁇ M. This results in a selectivity of> 2,000 for this substance.
  • the Morris Test measures spatial orientation learning in rodents.
  • the test is ideal for evaluating the learning and memory-enhancing effects of substances.
  • rats or mice are trained to locate an invisible platform as the only way out of a water-filled swimming pool.
  • a proven method is to train the animals four times a day over a period of 5 days.
  • the test substances are tested on a daily basis at a defined time, e.g. 30 min before the first swimming attempt per day. Controls receive the corresponding
  • the learning performance of the animals is expressed in a training-related Shortening the swim distance between the starting position and the platform, as well as reducing the swimming time until reaching the platform, i.e. the better the animal remembers the location of the platform, the shorter the distance covered and the faster the platform is reached.
  • the test is performed on cognitively impaired animals, such as old animals or animals with experimentally induced brain damage.
  • Rats with an entorhinal cortex lesion are an animal model for Alzheimer's disease.
  • the bilateral lesion of the entorhinal cortex is created by intracerebral injection of the excitotoxin ibotenic acid. It leads to a severe impairment of learning performance in the Morris test.
  • Example 1 The learning and memory-improving effect of Example 1 was tested using this animal model. In rats with a bilateral entorhinal cortex lesion, learning of the platform position in the Morris test was greatly slowed, and that
  • Performance after five days of training was significantly worse than that of control animals that underwent surgery like the lesioned animals but did not receive intracerebral injections of the excitotoxin ibotenic acid.
  • Example 1 The intraperitoneal injection of Example 1 in a dose of 0.1 mg per kg
  • Example 1 Body weight, 30 minutes before each of the five daily training days, significantly accelerated learning the platform position.
  • the lesionized animals treated with Example 1 already achieved the same level of performance on the second training day as the vehicle-treated animals after 5 training days.
  • Example 1 could not completely antagonize the learning disability induced by the entorhinal cortex lesion; considering the extent of the experimentally induced brain damage, this was also not to be expected. 4. Rat Forced swimming Test:
  • the behavioral effect is indicated as mean change in immobility compared to vehicle-treated control animals ⁇ standard error.
  • Physiological saline was used as vehicle.
  • Example I 2- (l-methylpropyl) hexan-3-one carboxylic acid ethyl ester

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue 2-Aminocarbonyl-5(2H)-isoxazolone als selektive Liganden einer hochaffinen Bindungsstelle von Diisopropyl-Fluorophosphat (DFP) an Gehirnmembranen zur Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems, insbesondere kognitiven Störungen, Depression, Schizophrenie und Angst.

Description

Neue 2-Aminocarbonyl-5(2H)-isoxazoIone als Liganden einer DFP- Bindungsstelle zur Behandlung von ZNS-Krankheiten
Die vorliegende Erfindung betrifft neue 2-Aminocarbonyl-5(2H)-isoxazolone als selektive Liganden einer hochaffinen Bindungsstelle von Diisopropyl-Fluoro- phosphat (DFP) an Gehirnmembranen zur Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems, insbesondere kognitiven Störungen, Depression, Schizophrenie und Angst.
Untersuchungen im sogenannten Morris-Test, einem Tiermodell für Lernen und Gedächtnis ergaben, daß Diisopropyl-Fluorophosphat (DFP) eine fördernde Wirkung auf Lern- und Gedächtnisprozesse hat (J Pharmacol. Exp. Ther. 1996, 278, 697- 708). Die optimale Dosierung von DFP für die prokognitive Wirkung in jungen adulten Ratten liegt bei 0,03 mg/kg, oral gegeben. Eine Erhöhung der Dosis über diesen Wert hinaus führt nicht zu einer weiteren Steigerung der Lernleistung, sondern zu einer Rückkehr auf Kontrollniveau bzw. im weiteren zu einer Verschlechterung der kognitiven Leistung gegenüber Kontrolltieren. Zwar hemmt DFP die Cholinesterase, jedoch wird eine signifikante Hemmung der Cholinesterase im Gehirn von Ratten ex vivo erst bei Dosierungen von >3 mg/kg oral erreicht, also bei
Dosierungen, die um einen Faktor von etwa 100 höher sind als die aktive Dosis im Lerntest. Cholinesterasehemmer, die sich von Phosphorsäureestern strukturell unterscheiden, wie z.B. Tacrin oder Physostigmin, zeigen keine Verbesserung der kognitiven Leistungsfähigkeit in diesem Tiermodell.
Die Diskrepanz zwischen kognitiv stimulierenden Dosierungen einerseits und Acetylcholinesterase-hemmenden Dosierungen andererseits weist auf die Beteiligung eines zweiten Wirkmechanismus hin, welcher sensitiver für DFP ist als Cholinesterase. Für DFP wurde eine hochaffme Bindungsstelle im Hühnchenrückenmark identifiziert (Biochem. Pharmacol. 1994, 48, 2073-2079), die sich von den katalytisch aktiven Zentren der Acetylcholinesterase und der Butyrylcholinesterase unterscheidet. Die Funktion der neuen, hochaffinen Bindestelle für DFP ist bislang nicht bekannt.
Es wurde nun erstmals gefunden, daß hochaffine, spezifische Bindungsstellen für DFP in Membranen des Säugerhirns vorkommen. Sie wurde in Membranen des cerebralen Cortex von Ratte, Kalb und Mensch nachgewiesen.
Überraschenderweise handelt es sich bei der hochaffinen Bindestelle für DFP nicht um ein bisher bekanntes molekulares Target von DFP. Insbesondere stimmt das Kompetitionsprofil der Bindestelle nicht mit dem von Acetylcholinesterase, Butyrylcholinesterase, Neuropathie-Target Esterase, Prolylendopeptidase und Dipeptidyl Peptidase II überein. Außerdem wurden selektive Liganden für 84 bekannte Neuro- transmitter-Rezeptoren, Enzyme und Ionenkanäle des Säugerhirns auf Kompetition von [3H]DFP in vitro getestet. Keine der Verbindungen zeigte Affinität, auch nicht bei sehr hohen, bereits physiologisch irrelevanten Konzentrationen.
Neben DFP selbst bindet nur der bekannte Acetylcholinesteraseinhibitor Dichlorvos an die hochaffine DFP-Bindungsstelle.
Daher eignen sich cerebrale Gewebepräparate von Säugern, bevorzugt von Ratte, Kalb oder Mensch, zum Auffinden von Liganden der hochaffinen DFP-Bindungsstelle.
Die hochaffine DFP-Bindungsstelle wird nach üblichen Methoden aus cerebralem Gewebe von Säugern gewonnen, bevorzugt dadurch, daß das Gewebe homogenisiert und zentrifugiert und der Niederschlag resuspendiert wird.
Danach wird üblicherweise der Ligand in verschiedenen Konzentrationen zu dieser
Mischung gegeben und vorinkubiert. Zur Messung der Bindung wird DFP zugegeben, und die Mischung wird inkubiert. Das DFP ist üblicherweise markiert, bevorzugt radioaktiv markiert. DFP wird in Konzentrationen von weniger als 50 nM zugegeben, bevorzugt in einer Konzen- tration von 0,1 - 20 nM, ganz besonders bevorzugt 5 - 15 nM.
Unter Liganden werden üblicherweise Modulatoren verstanden, d.h. Substanzen, die die Aktivität der Bindungsstelle beeinflussen. Die Modulatoren können agonistisch oder antagonistisch auf die Bindungsstelle wirken.
Bindungsstellen in Sinne der Erfindung sind endogene Proteine, bevorzugt Enzyme oder Rezeptoren.
Die Eigenschaften der neuen, hochaffinen Bindestelle für DFP erklären die vorbe- schriebene lern- und gedächtnisfördernde Wirkung von DFP. Daher sollten Substanzen, die diese Bindestelle wie DFP beeinflussen, auch die kognitionsverbessernde Wirkung von DFP haben. Solche Substanzen eignen sich daher sowohl zur therapeutischen als auch zur präventiven Behandlung von kognitiven Störungen allgemein, insbesondere von Demenzen des Alzheimer-Typs.
Außerdem ist die antimikrobielle und antileukämische Wirkung von l-(l-Amino- carbonyl)-2,l-benzisoxazol-3(lH)-onen bekannt (J Med. Chem. 1984, 27, 1212- 1215).
Die Synthese von 2-Aminocarbonyl-3-methyl-5(2H)-isoxazolon ist ebenfalls be- schrieben (Can. J. Chem. 1981, 59, 175-179).
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in welcher
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und
für (C,-C8)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder durch einen Rest NR5 unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkoxy, (C,-C3)-Perfluoralkoxy, Halogen oder NR R7 substituiert ist.
für (C3-C8)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder durch einen Rest NR8 unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkoxy, (CrC3)-Perfluoralkoxy, Halogen oderNR9R'° substituiert ist,
für Aryl-(CH2)m stehen,
worin
R5, R6, R7, R8, R9 und R10 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für Wasserstoff, (C,-C )-Alkyl, (C,-C )-Acyl, (C,-C4)- Alkoxy-carbonyl, Carbamoyl, Mono- oder Di-(C,-C4)-Alkyl-amino- carbonyl stehen, und
m für 0, 1, 2 oder 3 steht,
oder R1 für Wasserstoff, Aryl-S(O)n , (C,-C4)-Alkoxy, Aryl-O oder Halogen steht und R2 die oben genannte Bedeutung hat, und
worin
n für 0, 1 oder 2 steht,
oder
R' und R2 zusammen mit den angrenzenden Kohlenstoffatomen einen 5 - 10- gliedrigen, einfach ungesättigen Carbocyclus bilden, der gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder durch einen Rest NR" unterbrochen ist und der gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkoxy, (C,-C3)-Perfluoralkoxy, Halogen oder NR12R13 substituiert ist,
worin
R", R12 und R13 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander die für R5 genannte Bedeutung haben,
R3 und R4 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander
für (C,-C8)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder
Schwefelatom oder durch einen Rest NR14 unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C3-C6)-Cycloalkyl, (C,-C4)-Alkoxy, Halogen oder NR15R16 substituiert ist,
für (C3-C8)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder
Schwefelatom oder durch einen Rest NR17 unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkoxy, Halogen oder NR18R19 substituiert ist,
für Aryl-(CH2) stehen,
worin
R'4, R'\ R'6, R17, R'S und R'9 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander die für R3 genannte Bedeutung haben, und
p für 0 oder 1 steht,
oder
R3 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen gesättigten oder teilweise ungesättigten 3-10-gliedrigen, mono- oder bicyclischen Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls bis zu zwei weitere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthält, und der gegebenfalls durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkyl, (C,-C )-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, COOR20, Aryl-Y, oder NR IR22 substituiert ist,
worin
R20 Wasserstoff oder (C,-C4)-Alkyl bedeutet,
Y für eine Bindung, CH2, CO oder CHOH steht, und
R21 und R22 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander die für R3 genannte Bedeutung haben,
und X für Sauerstoff oder Schwefel steht,
und deren Salze,
ausgenommen 2-Aminocarbonyl-3-methyl-5(2H)-isoxazolon.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen können Salze der erfindungsgemäßen Stoffe mit Mineralsäuren, Carbonsäuren oder Sulfon- säuren sein. Besonders bevorzugt sind z.B. Salze mit Chlorwasserstoffsäure, Brom- wasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfon- säure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure oder Benzoesäure.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von dem Substitutionsmuster in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Erfindung betrifft sowohl die Enantiomeren oder Diastereomeren oder deren jeweilige Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die
Diastereomeren in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.
(C,-C8)-Alkyl, (C|-C6)-Aikyl oder (CrC4)-Alkyl stehen im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 8 bzw. 1 bis 6 bzw. 1 bis 4
Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert.Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (C,-C ). Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (C]-C3). (C,-Cft)-Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, tert.Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff- atomen (C,-C4). Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (CrC3).
Aryl steht im Rahmen der Erfindung für einen aromatischen oder heteroaromatischen Rest mit 5 bis 6 Ringatomen. Beispielsweise seien genannt Phenyl, Fur-2-yl, Fur-3- yl, Thien-2-yl, Thien-3-yl, Pyrid-2-yl, Pyrid-3-yl, Pyrid-4-yl, Pyrimidin-2-yl, Pyrimi- din-4-yl. Bevorzugt ist Phenyl. Die Reste können ihrerseits ein- oder mehrfach mit Halogenatomen, bevorzugt Chlor oder Fluor substituiert sein.
(C,-C8)-Cycloalkyl, (C3-C6)-Cycloalkyl etc. stehen im Rahmen der Erfindung für Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl.
Bevorzugt seien genannt: Cyclopropyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Halogen steht im Rahmen der Erfindung im allgemeinen für Fluor, Chlor, Brom und Jod. Bevorzugt sind Fluor, Chlor und Brom. Besonders bevorzugt sind Fluor und Chlor.
(C,-C4)-Acyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Acylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Formyl, Acetyl, Propionyl, n-Butyryl, iso-Butyryl.
(C ! -C6)-Alkoxycarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl und tert.Butoxycarbonyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxy- carbonylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (C,-C4). Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (C,-C3). Der 5-10-gliedrige, einfach ungesättige Carbocyclus steht im Rahmen der Erfindung für Cyclopenten-l,2-diyl, Cyclohexen-l,2-diyl, Cyclohepten-l,2-diyl, Cycloocten- 1,2-diyl, Cyclononen-l,2-diyl oder Cyclodecen-l,2-diyl. Bevorzugt sind Cyclo- hexen- 1 ,2-diyl, Cyclohepten-l,2-diyl und Cycloocten-l,2-diyl. Einzelne Ringatome können durch ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatome ersetzt sein. Beispielsweise seien genannt: 3-Pyrrolin-3,4-diyl, l ,2,5,6-Tetrahydropyridin-3,4-diyl, 5,6- Dihydro-(2H)-pyran-3,4-diyl.
Der gesättigte oder teilweise ungesättigte 3-12-gliedrige, mono- oder bicyclische
Heterocyclus steht im Rahmen der Erfindung für einen monocyclischen oder bicyclischen Ring mit 3 bis 10 Ringatomen, der über ein Stickstoffatom an die benachbarte CarbonyL/Thiocarbonylgruppe angebunden ist und bis zu zwei weitere Heteroatome sowie gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifach- bindungen enthält. Im Falle des Bicyclus können die beiden Ringe spirocyclisch verknüpft sein, oder die Brückenkopfatome der beiden Ringe sind direkt benachbart oder über ein bis mehrere Ringatome getrennt. Beispielsweise seien genannt Aziridin-1-yl, Azetidin-1-yl, Pyrrolidin-1-yl, Pyrrolin-1-yl, Piperidin-1-yl, 1,2,5,6- Tetrahydropyridin-1-yl, Morpholin-4-yl, Thiomorpholin-4-yl, Hexahydroazepin-1-yl, 2.3-Dihydro-(lH)-indol-l-yl, Octahydroindol-1-yl, 8-Aza-bicyclo[3.2.1]octan-8-yl,
3-Aza-bicyclo[3.2.1]octan-3-yl, 3,8-Diaza-l-oxa-bicyclo[4.3.0]nonan-8-yl, Azacy- clodecen-1-yl. Bevorzugt sind Azetidin-1-yl, Pyrrolidin-1-yl und Pyrrolin-1-yl.
Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
in welcher
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und
für (C C8)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder
Schwefelatom unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methoxy, Ethoxy oder Fluor substituiert ist,
für (C3-C6)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methoxy, Ethoxy oder Fluor substituiert ist,
für Aryl-(CH2)m steht,
worin
m für 0, 1 oder 2 steht,
oder
R1 für Wasserstoff, Aryl-S , Aryl-O, Fluor oder Chlor steht und R2 die oben genannte Bedeutung hat,
oder
R1 und R2 zusammen mit den angrenzenden Kohlenstoffatomen einen 5 - 8- gliedrigen, einfach ungesättigen Carbocyclus bilden, der gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom unterbrochen ist und der gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methoxy, Ethoxy oder Fluor substituiert ist,
R3 und R4 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander
für (C,-C6)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder
Schwefelatom oder durch einen Rest NR14 unterbrochen ist und das ge- gebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Cyclopropyl, Cyclobutyl, Methoxy, Ethoxy, Fluor oder NR,3R16 substituiert ist,
für (C3-C6)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methoxy, Ethoxy, Fluor oder NRI8R19 substituiert ist,
für Aryl-(CH2) stehen, und
worin
R14, R'5, R'6, R17, R1S und R19 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, (C,-C3)-Alkyl, Acetyl, Propionyl, Methoxycarbonyl oder Ethoxycar- bonyl bedeuten, und
p für 0 oder 1 steht,
oder
R3 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen gesättigten oder teilweise ungesättigten 4-9-gliedrigen, mono- oder bicyclischen Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls bis zu zwei weitere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthält, und der gegebenfalls durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Hydroxy, Fluor, COOR20, Aryl-Y, oder NR21R22 substituiert ist,
worin
R20 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet,
Y für eine Bindung, CH2 oder CHOH steht, und R2' und R22 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, (C,-C3)-Alkyl, Acetyl, Propionyl, Methoxycarbonyl oder Ethoxycarbonyl bedeuten,
und
X für Sauerstoff oder Schwefel steht,
und deren Salze,
ausgenommen 2-Aminocarbonyl-3-methyl-5(2H)-isoxazolon.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
in welchen
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und
für (C,-C6)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Fluor substituiert ist,
für (C3-C6)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls durch Fluor substituiert ist,
für Benzyl steht,
oder
R1 für Wasserstoff, Phenyl-S oder Phenyl-O steht und R2 die oben genannte Bedeutung hat, oder
R1 und R2 zusammen mit den angrenzenden Kohlenstoffatomen einen 5 - 9- gliedrigen, einfach ungesättigen Carbocyclus bilden, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Fluor substituiert ist,
R3 und R4 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander
für (C,- )-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C3-C6)-Cycloalkyl oder Fluor substituiert ist,
für Phenyl-(CH2)P stehen,
worin
p für 0 oder 1 steht,
oder
R3 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen gesättigten oder teilweise ungesättigten 4-9-gliedrigen, mono- oder bicyclischen Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls bis zu zwei weitere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthält, und der gegebenfalls durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methyl, Hydroxy, Fluor, COOR20, Phenyl-Y, oder NR21R22 substituiert ist,
worin
R2U Methyl bedeutet, Y für eine Bindung oder CHOH steht, und
R21 und R22 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder Methyl bedeuten, und
X für Sauerstoff steht,
und deren Salze,
ausgenommen 2-Aminocarbonyl-3-methyl-5(2H)-isoxazolon.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen gemäß Anspruch 1 ,
wobei
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und
für (C2-C6)-Alkyl stehen, oder
für Cyclopentyl oder Cyclohexyl stehen,
R3 und R4 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für Methyl oder Ethyl stehen,
oder
R3 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrolidin-1-yl- oder Pyrrolin- 1 -yl-Rest bilden, und
X für Sauerstoff steht,
und deren Salze.
Außerdem wurden Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgmeinen Formel (I) gefunden dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der allgemeinen Formel (II),
in welcher
R1 und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und R23 für (C,-C4)-Alkyl steht, das gegebenenfalls durch Fluor substituiert ist,
mit Hydroxylamin als freie Base oder Salz gegebenenfalls in einem Lösungsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (III),
in welcher
R1, R2 und R23 die oben angegebene Bedeutung haben,
umsetzt, und anschließend in Gegenwart einer Base zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (IV),
in welcher
R1 und R2 die oben angegebene Bedeutung haben,
zyklisiert,
danach mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (V),
(Cl2C=X)q (V)
in welcher
X für Sauerstoff oder Schwefel steht, und
q 1, 2 oder 3 bedeutet,
gegebenenfalls in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels und einer Base zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (VI),
in welcher, R , R" und X die oben angegebene Bedeutung haben,
umsetzt,
die abschließend mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (VII),
HNR3R4 (VII)
in welcher
R"1 und R4 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben,
gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase zur Verbindung der allgemeinen Formel (I) kondensiert werden.
Zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (IV) ist auch, ausgehend von Verbindungen der Formel (II), ein einstufiges Verfahren ohne zwischenzeitliche Isolierung der Verbindungen der Formel (III) möglich.
Als Lösemittel für die Verfahren eignen sich übliche organische Lösemittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen nicht verändern. Hierzu gehören Ether wie Diethyl- ether, Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykoldimethylether, oder Kohlenwasser-stoffe wie Benzol, Toluol, Xylol, Hexan, Cyclohexan oder Erdölfraktionen, oder Halogen- kohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Trichlormethan, Tetrachlormethan, Dichlor- ethylen, Trichlorethylen oder Chlorbenzol, oder Essigester, Pyridin, Dimethyl- sulfoxid, N,N-Dimethylformamid, Hexamethylphosphorsäuretriamid, Acetonitril, Aceton oder Nitromethan. Ebenso ist es möglich, Gemische der genannten Lösemittel zu verwenden. Für die Verfahren (II) -> (III) und (III) -> (IV) eignet sich auch Wasser oder ein Gemisch von Wasser mit einem der genannten organischen Lösemittel. Bevorzugt für diese Verfahren ist Wasser. Für die Verfahren (IV) -> (VI) und - l o -
(VI) -> (I) sind bevorzugt Dichlormethan und Trichlormethan. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan.
Als Basen für die erfindungsgemäßen Verfahren können im allgemeinen an- organische oder organische Basen eingesetzt werden. Hierzu gehören vorzugs-weise
Alkalihydroxide wie zum Beispiel Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, Erd- alkalihydroxide wie zum Beispiel Bariumhydroxid, Alkalicarbonate wie Natrium- carbonat, Kaliumcarbonat oder Cäsiumcarbonat, Erdalkalicarbonate wie Calcium- carbonat, oder Alkali- oder Erdalkali-Alkoholate wie Natrium- oder Kalium-Metha- nolat, Natrium- oder Kalium-Ethanolat oder Kalium-tert.-Butylat, oder organische
Amine (Trialkyl (CrC6)-Amine) wie Triethylamin, oder Heterocyclen wie 1 ,4-Di- azabicyclo[2.2.2]octan (DABCO), l,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU), Pyridin, N,N-Dimethylaminopyridin, Methylpiperidin oder Morpholin. Bevorzugt sind für das Verfahren (II) -> (III) -> (IV) Natriumhydroxid und für das Verfahren (VI) -> (I) Triethylamin.
Im allgemeinen setzt man die Base in einer Menge von 0,05 Mol bis 10 Mol, bevorzugt von 1 Mol bis 3 Mol bezogen auf 1 Mol der Verbindung der Formel (III) bzw. (VI) ein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden im allgemeinen in einem Temperatur-be- reich von -20°C bis +100°C, bevorzugt von 0°C bis +60°C, durchgeführt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden im allgemeinen bei Normaldruck durch- geführt. Es ist aber auch möglich, die Verfahren bei Überdruck oder bei leichtem
Unterdruck durchzuführen (z.B. in einem Bereich von 0,5 bis 5 bar).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch das folgende Formelschema beispielhaft erläutert werden:
Die Verbindungen der allgemeinen Formeln (II), (V) und (VII) sind bekannt oder nach üblichen Methoden herstellbar.
Kognitive Störungen sind jedoch nicht das einzige medizinische Indikationsgebiet solcher Liganden für die neu aufgefundene Bindestelle. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß DFP auch potente Wirkung in einem in-vivo Tiermodell für die Auffindung neuer Antidepressiva hat. Dabei handelt es sich um den "Rat Forced Swimming Test" nach Porsolt (Nature 1977, 266, 730-732). DFP induziert in diesem
Test dosisabhängig eine verhaltensaktivierende Wirkung, wie sie von klinisch wirksamen Antidepressiva bekannt ist. Die optimale Dosierung liegt wie im Kognitions- test bei 0,03 mg/kg oral, d.h. weit unterhalb der Konzentrationen, die für eine Cholin- esterasehemmung erforderlich wären (wie oben beschrieben). Aufgrund dieser Ver- Suchsergebnisse sind Liganden der hochaffinen DFP-Bindestelle auch zum Einsatz in psychiatrischen Indikationen, wie z.B. Depression, Schizophrenie oder Angst, geeignet. Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren ebenfalls ACPH (N-Acyl-Peptid- Hydrolase).
Die neuen Wirkstoffe können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Tabletten, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen, unter Verwendung inerter, nicht toxischer, pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe oder Lösungsmittel. Hierbei soll die therapeutisch wirksame Verbindung jeweils in einer Konzentration von etwa 0,0001 bis 90 Gew.-%, bevorzugt 0,0001 bis 1,0 Gew.-%, der Gesamtmischung vorhanden sein, d.h. in Mengen, die ausreichend sind, um den angegebenen Dosierungsspielraum zu erreichen.
Die Formulierungen werden beispielsweise hergestellt durch Verstrecken der Wirk- Stoffe mit Lösungsmitteln und/oder Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, wobei z.B. im Fall der Benutzung von Wasser als Verdünnungsmittel gegebenenfalls organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden können.
Die Applikation erfolgt in üblicher Weise, vorzugsweise oral, transdermal oder parenteral, insbesondere perlingual oder intravenös.
Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei intravenöser Applikation Mengen von etwa 0,00001 bis 10 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,0001 bis 1 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit vom Körpergewicht bzw. der Art des Applikationsweges, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament, der Art von dessen Formulierung und dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchen die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muß. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Die Liganden der hochaffinen DFP-Bindungsstelle eignen sich allgemein zur Verwendung für die Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
Ausgenommen sind jedoch Verbindungen der allgemeinen Formel (IX),
in welchen
R24 und R25 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für Halogen, (C,-C8)-Alkoxy. (C,-C8)-Alkenoxy, Aryl-S oder Aryl-O steht, wobei (C,-C8)-
Alkoxy oder (C,-C8)-Alkenoxy gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen substituiert sind, und
R26 die Bedeutung von R24 hat und von dieser gleich oder verschieden ist, oder für gegebenenfalls substituiertes (C,-C8)-Alkyl oder substituiertes Aryl steht, und
X die oben angegebene Bedeutung hat.
(C,-C8)-Alkenoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder ver- zweigten Alkenyl-oxy-Rest bestehend aus 1 bis 8 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Ethenyl, Prop-2-en-l-yl, Prop-2-en-2-yl, Prop-3-enyl oder But- 1-en-l-yl. Solche neuen Wirkstoffe identifiziert man zunächst durch einen in vitro- Kompetitionstest an der hochaffinen DFP-Bindestelle. Dabei können grundsätzlich auch Zeil-Membranen von anderen Säugerspezies als der Ratte, inklusive dem Menschen, eingesetzt werden.
Liganden der hochaffinen DFP-Bindungsstelle im Sinne der Erfindung sind solche Substanzen, die [3H]DFP appliziert in einer Konzentration von weniger als 10 nM mit einer Dissoziationskonstante Kd von weniger als 100.000 nM verdrängen.
Bevorzugt sind Liganden, deren Kd an dieser Bindungsstelle kleiner als 1000 nM ist.
Auch eignen sich besonders solche Liganden, die um einen Faktor von mindestens 500 schwächer an die Acetylcholinesterase binden, ganz besonders bevorzugt um einen Faktor von mindestens 1000 schwächer.
Die Selektivität von Liganden der hochaffinen DFP-Bindestelle in Bezug auf
Cholinesterasehemmung kann mit geeigneten in vitro-Tests nachgewiesen werden. Ein solcher Test ist die photometrische Bestimmung der Cholinesteraseaktivität nach Ellman (Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88-95).
Besonders geeignet sind die Liganden der hochaffinen DFP-Bindungsstelle für die
Verwendung zur Prophylaxe und Behandlung von kognitiven Störungen, Angst, Schizophrenie oder Depression, ganz besonders von Demenzen des Alzheimer-Typs.
Die Wirksamkeit der so identifizierten Substanzen bei der Behandlung und Prävention kognitiver Störungen wird mit Hilfe von bekannten Standard-Tiermodellen für Lernen und Gedächtnis belegt (vgl. z.B. 'Alzheimer 's Disease: Biology, Diagnosis and Therapeutics Iqbal et al., ed.; 1997, John Wiley, S. 781-786). Geeignete Tiermodelle hierfür sind z.B. das passive oder aktive Vermeidungsverhalten, die klassische oder operante Konditionierung, räumliche Orientierungstests, oder Objekt- bzw. Subjekt- Wiedererkennungstests. Als besonders geeignetes Modell wird der sogenannte Morris-Test empfohlen, welcher auf dem räumlichen Gedächtnis beruht (J. Neurosci. Methods 1984, 11, 47-60).
1. Hochaffine DFP-Bindungsstelle
a) Charakterisierung
Rattenhirne wurden in 50 mM Tris-HCl Puffer, pH 7.4 gekühlt homogenisiert und zweimal für 30 min bei 48.000xg zentrifugiert, wobei die Überstände verworfen wurden und der Niederschlag in 50 mM Tris-Puffer resuspendiert wurde. Der Testansatz im Bindungstest enthielt zunächst etwa 0,4 mg Membranprotein, DFP in verschiedenen Konzentrationen, sowie 50 mM Tris- Puffer. Diese Mischung wurde 30 min bei 25°C im Wasserbad vorinkubiert, bevor kommerziell erhältliches [3H]DFP (0, 1 bis 20 nM, 5 nM in Standardtests) zugegeben wurde. Die Proben wurden daraufhin nochmals gut gemischt und für 120 min bei 25°C inkubiert. Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde in jede Probe 3 ml eiskalter Tris-Puffer gegeben und die Membran-gebundene Fraktion des Liganden von der ungebundenen, freien Fraktion durch schnelle Filtration durch Whatman GF/C-Filter getrennt. Die Filter wurden nochmals dreimal mit kaltem Puffer gewaschen und die gebundene Menge des Radio- liganden durch ß-Szintillationsmessung bestimmt. Zur Bestimmung der spezifischen Bindung wurde die in Gegenwart von 100 μM nichtradioaktivem DFP bestimmte unspezifische Bindung von der Gesamtbindung subtrahiert.
Die so gemessene Bindung war zu 90 % spezifisch und sättigbar. Die apparente Bindungskonstante Kd betrug im Gesamthirn wie auch in einzelnen
Hirnregionen wie zum Beispiel dem cerebralen Cortex 1.8 + 0.2 nM (Mittelwert ± Standardfehler aus ingesamt 21 Experimenten bis 10 nM). Die Bindestellendichte Bmax lag in diesen Experimenten bei im Bereich von 347 ± 14,9 pmol/mg Membranprotein. Im Bereich bis 10 nM [3H]DFP war die Scatchard-Transformation der Bindungsdaten linear. Das läßt auf die Interaktion mit einer einzigen, nicht mteragierenden, hochaffinen Klasse von Bindestellen für den Radioliganden in diesem Konzentrationsbereich schließen. Bei Radioligandenkonzentrationen >10 nM stieg die Gesamtbindung jedoch wieder überproportional an, was auf eine Interaktion mit weiteren, weniger affinen Bindestellen bei höheren Konzentrationen hinweist.
b) Unterscheidung der hochaffinen DFP-Bindestelle von Cholinesterasen: Bei der DFP-Bindestelle handelt es sich nicht um Cholinesterasen. Ein Vergleich der Interaktion von unmarkiertem DFP und Physostigmin mit beiden biologischen Targets unter weitestgehend gleichen Bedingungen ergab, daß DFP die Bindung von [3H]DFP an die hochaffine Bindestelle in Rattenhirn- membranen etwa 200mal potenter hemmt als die Acetylcholinesterase- aktivität .(IC50 11 nM vs 2.6 μM). Physostigmin, welches wie DFP an die Acetylcholinbinderegion der Acetylcholinesterase bindet, konnte jedoch lediglich Acetylcholinesterase hemmen (IC50 33 nM), nicht DFP von der hochaffinen DFP-Bindungsstelle verdrängen ( IC50>1 mM).
c) Identifizierung von Liganden der hochaffinen DFP-Bindungsstelle
Die Verdrängung von [3H]DFP von der hochaffinen DFP-Bindungsstelle wird analog zum Verfahren bestimmt, das unter 1.a) für DFP beschrieben ist. Beispiel 1 zeigte einen IC50 von 4,8 nM.
2. Bestimmung der Selektivität gegenüber Acetylcholinesterase
Die Selektivität der Substanzen als DFP-Liganden in Bezug auf Cholinesterase- hemmung kann mit geeigneten in vitro-Tests nachgewiesen werden. Ein solcher Test ist die photometrische Bestimmung der Cholinesteraseaktivität nach Ellman (Biochem. Pharmacol. 1961 , 7, 88-95). In der Regel wird der Versuch mit Rohhomo- genaten von Rattenganzhirn durchgeführt. Als Enzympräparation sind jedoch Ge- hirnhomogenate von anderen Warmblütern einschließlich des Menschen ebenso ge- eignet wie käuflich erhältliche, gereinigte Enzympräparationen. Im Standardversuch werden Rattenhirne im 20-fachen Volumen (w/v) 100 mM K2HPO4-Puffer, pH 8,0, homogenisiert. Die Proteinkonzentration des Homgenats wird durch Verdünnung im Puffer auf etwa 3 mg/ml eingestellt. Der Inkubationsansatz (1500 μl) enthält 100 mM Phosphatpuffer pH 8,0, 330 μM Dithiobisnitro- benzoat, 50 μl Hirnhomogenat entsprechend 150 μg Protein, verschiedene Testkonzentrationen der zu testenden Prüfsubstanzen und 40 μM Acetylthiocholin als Enzymsubstrat. Um eine bessere Vergleichbarkeit der Inkubationsbedingungen mit denen des [3H]DFP-Bindungstests zu ermöglichen, wird vor Zugabe des Substrats das Reaktionsgemisch für 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die Enzym- reaktion wird durch Substratzugabe gestartet. Die Reaktionszeit beträgt 6 min. Danach werden die Proben mit 25 ml 1 mM Tacrin-Lösung (Endkonzentration) versetzt, um die Reaktion zu beenden, und der gelbe Farbkomplex im Spektralphotometer bei 412 nm gegen den entsprechenden Leerwert (Tacrin-Zugabe vor der Substratzugabe) quantitativ bestimmt. Aus der Enzymaktivität in Gegenwart steigender Konzentra- tionen an Prüfsubstanz im Test wird die IC50 errechnet und mit der für die [3H]DFP-
Kompetition verglichen.
Beispiel 1 inhibierte Acetylcholinesterase mit einem Kj von >10 μM. Somit ergiebt sich für diese Substanz eine Selektivität von > 2.000.
Morris Test:
Mit dem Morris Test wird räumliches Orientierungslernen bei Nagern erfasst. Der Test eignet sich hervorragend zur Bewertung der lern- und gedächtnisfördernden Wirkung von Substanzen. In diesem Test werden Ratten bzw. Mäuse trainiert, eine für sie unsichtbare Plattform als einzige Auswegmöglichkeit aus einem wassergefüllten Schwimmbecken zu lokalisieren. Eine bewährte Methode ist es, die Tiere viermal pro Tag über den Zeitraum von 5 Tagen zu trainieren. Die Prüfsubstanzen werden dabei versuchstäglich zu einem definierten Zeitpunkt, z.B. 30 min vor dem ersten Schwimm versuch pro Tag, verabreicht. Kontrollen erhalten das entsprechende
Vehikel. Die Lernleistung der Tiere drückt sich in einer trainingsbedingten Ver- kürzung der geschwommenen Strecke zwischen Startposition und Plattform aus, sowie in einer Reduktion der Schwimmzeit bis zum Erreichen der Plattform, d.h. je besser sich das Tier an die Lokalisation der Plattform erinnert, desto kürzer wird die zurückgelegte Strecke und desto schneller wird die Plattform erreicht. Der Test wird mit kognitiv beeinträchtigten Tieren, wie alten Tieren oder Tieren mit einem experimentell induzierten Hirnschaden durchgeführt.
Ratten mit einer Läsion des Entorhinalcortex sind ein Tiermodell für die Alz- heimersche Erkrankung. Die bilaterale Läsion des Entorhinalcortex wird durch die intrazerebrale Injektion des Exzitotoxins Ibotensäure erzeugt. Sie führt zu einer starken Beeinträchtigung der Lernleistung im Morris Test.
Die lern- und gedächtnisverbessernde Wirkung von Beispiel 1 wurde mittels dieses Tiermodells geprüft. Bei Ratten mit einer bilateralen Läsion des Entorhinalcortex war das Erlernen der Plattformposition im Morris Test stark verlangsamt, und die
Leistung nach fünf Trainingstagen war wesentlich schlechter als die von Kontrolltieren, die zwar operiert wurden wie die läsionierten Tiere, die jedoch keine intrazerebralen Injektionen des Exzitotoxins Ibotensäure erhielten.
Die intraperitoneale Injektion von Beispiel 1 in einer Dosis von 0.1 mg pro kg
Körpergewicht, 30 Minuten vor jedem der fünf täglichen Trainingtage, beschleunigte das Erlernen der Plattformposition erheblich. Die mit Beispiel 1 behandelten läsionierten Tiere erreichten schon am zweiten Trainingstag dasselbe Leistungsniveau wie die Vehikel-behandelten Tiere nach 5 Trainingstagen. Beispiel 1 konnte die durch die Entorhinalcortexläsion induzierte Lernschwäche jedoch nicht völlig antagonisieren; dies war im Anbetracht des Ausmaßes des experimentell-induzierten Hirnschadens aber auch nicht zu erwarten. 4. Rat Forced Swimming Test:
Die Wirksamkeit der Substanzen bei der Behandlung und Prävention affektiver Störungen wird mit Hilfe des "Rat Forced Swimming Tests" nach Porsolt belegt (Nature 1977, 266, 730-732). Der Test beruht auf der Beobachtung, daß Ratten in einer ausweglosen Situation in einer unbeweglichen Stellung verharren ("behavioral despair"). 24 Stunden vor dem Test werden junge, adulte Ratten (3-4 Monate alt) für 20 min einzeln in Glaszylinder (Höhe 40 cm, Durchmesser 20 cm) gesetzt, welche bis zu einer Höhe von 15 cm mit Wasser gefüllt sind. Im Test werden die Tiere wiederum in die Zylinder überführt, und die Dauer der Immobilität über einen Zeitraum von
5 min gemessen. Die Prüfsubstanzen werden im Zeitraum zwischen den beiden Schwimmversuchen appliziert. Kontrollen erhalten das entsprechende Vehikel.
Tabelle 1:
Verhaltensaktivierende Wirkung von DFP im „Rat Forced Swimming Test". Der Verhaltenseffekt ist angegeben als mittlere Veränderung in der Immobilität im Vergleich zu Vehikel-behandelten Kontrolltieren ± Standardfehler. Als Vehikel wurde physiologische Kochsalzlösung eingesetzt. Die Signifikanz der Wirkung wurde mit ANOVA und nachfolgendem Fischer post-hoc Analyse überprüft, n.s. = nicht signifikant.
Ausgangsverbindungen:
Beispiel I: 2-(l-Methylpropyl)hexan-3-oncarbonsäurethylester
Zu einer Lösung von 8.84 g (68.8 mmol) Kalium tert.-Butanolat in 25 ml DMF wurde bei 0°C eine Lösung von 10.1 g (62.5 mmol) Hexan-3-on-carbonsäureethyl- ester in 60 ml DMF zugetropft und anschließend 30 min bei dieser Temperatur ge- rührt. Eine Lösung von 7.59 ml (9.53 g, 68.1 mmol) 2-Brombutan in 25 ml DMF wurde innerhalb von 30 min zugetropft und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde der Ansatz auf 250 ml Wasser gegeben und mit Essigester (3 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten org. Phasen wurden getrocknet (Natriumsulfat), eingeengt, und das Rohprodukt über Kieselgel (0.04 bis 0.63 mm) mit PetroletheπEssigester 40:1 chromatographisch gereinigt. 'H-NMR (DMSO, TMS, 400 MHz, δ): 4.1 1 (m, 2H), 3.48 (dd, 1H), 2.49 (m, 2H), 2.08 (m, 1H), 1.48 (m, 2H), 1.30 (m, 1H), 1.15 (dt, 3H), 1.10 (m, 1H), 0.84 (m, 9H); MS (DCI, NH3): 215 [M+Hf.
Beispiel II: 2-Cyclopentylhexan-3-oncarbonsäureethylester
Die Darstellung erfolgte analog zu Beispiel I aus 4.04 g (25.0 mmol) Hexan-3-on- carbonsäureethylester und 2.95 ml (4.10 g, 27.3 mmol) Bromcyclopentan. Die
Reinigung erfolgte chromatographisch (Kieselgel, PetroletheπEssigester 20: 1). MS (EI): 226 [M]+.
Beispiel III:
2-Hexylhexan-3-oncarbonsäureethylester
Unter Argonatmosphäre wurden zu 50 ml Ethanol portionsweise 1.59 g (69.3 mmol) Natrium gegeben. Anschließend wurde unter Rückfluß gerührt, bis eine homogene
Lösung entstanden war. Zu der heißen Alkoholat-Lösung wurden 1 1.0 g (69.3 mmol) Hexan-3-oncarbonsäureethylester zugegeben und der Ansatz für 45 min gerührt. Anschließend wurden in der Siedehitze 6.51 ml (7.93 g, 52.5 mmol) 1-Iodhexan langsam zugetropft. Nach 16 h Rühren unter Rückfluß wurde der Ansatz auf Raumtempe- ratur gekühlt, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen, erneut filtriert, und eingeengt. Die Reinigung des Rohproduktes erfolgte chromatographisch (Kieselgel, PetroletheπEssigester 30: 1). MS (DCI, NH3): 309 [M+H]+.
Herstellungsbeispiele:
Beispiel 1: 4-Ethyl-3-propyl-2-(l-pyrrolidinylcarbonyl)-5(2H)-isoxazolon
a) 4-Ethy 1-3 -propyl-5 (2H)-isoxazolon
11,53 g (165,9 mmol) Hydroxylaminhydrochlorid werden in 25 ml Wasser gelöst und bei einer Temperatur von max. 0°C mit einer Lösung von 13,27 g (331,8 mmol) Natriumhydroxid in 60 ml Wasser versetzt. Anschließend gibt man ohne weitere
Kühlung 30,9 g (165,9 mmol) 2-Ethylhexan-3-oncarbonsäureethylester auf einmal hinzu und rührt 3 h bei 50°C. Zur Aufarbeitung werden 15,5 ml konz. Salzsäure bei 0°C hinzugegeben, mit Wasser verdünnt und dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und im Hoch- vakuum fraktioniert. Kp2mbar. 105-1 15°C.
b) 4-Ethyl-3-propyl-2-(chloro-carbonyl)-5(2H)-isoxazolon
15 g (96,65 mmol) 4-Ethyl-3-propyl-5(2H)-isoxazolon in 150 ml Dichlormethan werden bei 0°C mit 27,81 g (144,98 mmol) Diphosgen versetzt und das Gemisch anschließend 6 h bei 0 °C gerührt. Zum Entfernen von überschüssigem Phosgen wurde 1 h bei RT Argon durch das Reaktionsgemisch geleitet, wobei die Abluft durch Natriumhydroxid neutralisiert wurde. Die Lösung wurde eingeengt und das Produkt im Vakuum destilliert. Kp3mbar 125-30°C. c) 4-Ethyl-3-propyl-2-(l-pyrrolidinylcarbonyl)-5(2H)-isoxazolon
Zu einer Lösung von 0.44 g (2 mmol) 4-Ethyl-3-propyl-2-(chloro-carbonyl)-5(2H)- isoxazolon in 10 ml Dichlormethan werden bei 0°C eine Lösung von 0,43 g (6 mmol) Pyrrolidin in 35 ml Dichlormethan zugetropft und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurden der Rückstand über Kieselgel mit Petrolether:Essigester (4:1) Chromatographien. MS (DCI): 253 (M+H).
Analog Beispiel 1 wurden die Verbindungen der folgenden Tabelle 2 aus den ent- sprechenden Edukten hergestellt:

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
in welcher
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und
für (C1-C8)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder durch einen Rest NR5 unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkoxy, (CrC3)-Perfiuoralkoxy, Halogen oder NR6R7 substituiert ist,
für (C3-C8)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder durch einen Rest NR8 unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C|-C4)-Alkoxy, (CrC3)-Perfluoralkoxy, Halogen oder NR9R10 substituiert ist,
für Aryl-(CH2)m stehen,
worin
R5, R6, R7, R8, R9 und R10 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für Wasserstoff, (C,-C4)-Alkyl, (C,-C4)- Acyl, (CrC4)-Alkoxy-carbonyl, Carbamoyl, Mono- oder Di- (C,-C4)-Alkyl-amino-carbonyl stehen, und
m für 0, 1, 2 oder 3 steht,
oder
R1 für Wasserstoff, Aryl-S(O)n , (C,-C4)-Alkoxy, Aryl-O oder Halogen steht und R2 die oben genannte Bedeutung hat, und
worin
n für 0, 1 oder 2 steht,
oder
R1 und R2 zusammen mit den angrenzenden Kohlenstoffatomen einen 5 - 10- gliedrigen, einfach ungesättigen Carbocyclus bilden, der gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder durch einen Rest NR" unterbrochen ist und der gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkoxy, (CrC3)-Perfluoralkoxy, Halogen oder NR'2R13 substituiert ist,
worin
R", R12 und R13 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander die für R5 genannte Bedeutung haben,
R3 und R4 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für (C,-C8)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoffoder Schwefelatom oder durch einen Rest NR14 unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C3-C6)-Cycloalkyl, (C,-C )-Alkoxy, Halogen oder NR15R16 substituiert ist,
für (C3-C8)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder durch einen Rest NR1 ' unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkoxy, Halogen oder NRI 8R19 substituiert ist,
für Aryl-(CH2) stehen,
worin
R14, R15, R,δ, R'7, R18 und R19 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander die für R5 genannte Bedeutung haben, und
p für 0 oder 1 steht,
oder
R3 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen gesättigten oder teilweise ungesättigten 3-10-gliedrigen, mono- oder bicyclischen Hetero- cyclus bilden, der gegebenenfalls bis zu zwei weitere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthält, und der gegebenfalls durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C,-C4)-Alkyl, (C,-C4)-Alkoxy, Hydroxy, Halogen, COOR20, Aryl-Y, oder NR21R22 substituiert ist,
worin R20 Wasserstoff oder (C,-C4)-Alkyl bedeutet,
Y für eine Bindung, CH2, CO oder CHOH steht, und
R21 und R22 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander die für R5 genannte Bedeutung haben,
und
X für Sauerstoff oder Schwefel steht,
und deren Salze,
ausgenommen 2-Aminocarbonyl-3-methyl-5(2H)-isoxazolon.
2. Verbindungen gemäß Anspruch 1,
wobei
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und
für (C,-C8)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoffoder Schwefelatom unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methoxy, Ethoxy oder Fluor substituiert ist,
für (C3-C6)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methoxy, Ethoxy oder Fluor substituiert ist, für Aryl-(CH2)m steht,
worin
m für 0, 1 oder 2 steht,
oder
R1 für Wasserstoff, Aryl-S , Aryl-O, Fluor oder Chlor steht und R2 die oben genannte Bedeutung hat,
oder
R1 und R2 zusammen mit den angrenzenden Kohlenstoffatomen einen 5 - 8- gliedrigen, einfach ungesättigen Carbocyclus bilden, der gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom unterbrochen ist und der gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methoxy, Ethoxy oder Fluor substituiert ist,
R3 und R4 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander
für (C,-C6)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder durch einen Rest NR14 unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Cyclopropyl, Cyclobutyl, Methoxy, Ethoxy, Fluor oder
NR15R16 substituiert ist,
für (C3-C6)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methoxy, Ethoxy, Fluor oder NR18R19 substituiert ist, für Aryl-(CH2) stehen, und
worin
R'4, R15, R'6, R17, R'8 und R19 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, (C,-C3)-Alkyl, Acetyl, Propionyl, Methoxy- carbonyl oder Ethoxycarbonyl bedeuten, und
p für 0 oder 1 steht,
oder
R"1 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen gesättigten oder teilweise ungesättigten 4-9-gliedrigen, mono- oder bicyclischen Hetero- cyclus bilden, der gegebenenfalls bis zu zwei weitere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthält, und der gegebenfalls durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Hydroxy, Fluor, COOR20, Aryl-Y, oder NR21R22 substituiert ist,
worin
R20 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet,
Y für eine Bindung, CH2 oder CHOH steht, und
R21 und R22 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, (C,-C3)-Alkyl, Acetyl, Propionyl, Methoxy- carbonyl oder Ethoxycarbonyl bedeuten,
und X für Sauerstoff oder Schwefel steht,
und deren Salze,
ausgenommen 2-Aminocarbonyl-3-methyl-5(2H)-isoxazolon.
Verbindungen gemäß Anspruch 1 ,
wobei
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und
für (C,-C6)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Fluor substituiert ist,
für (C3-C6)-Cycloalkyl stehen, das gegebenenfalls durch Fluor substituiert ist,
für Benzyl steht,
oder
R1 für Wasserstoff, Phenyl-S oder Phenyl-O steht und R2 die oben ge- nannte Bedeutung hat,
oder
R1 und R2 zusammen mit den angrenzenden Kohlenstoffatomen einen 5 - 9- gliedrigen, einfach ungesättigen Carbocyclus bilden, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Fluor substituiert ist, R3 und R4 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander
für (C,-C6)-Alkyl stehen, das gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom unterbrochen ist und das gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Reste ausgewählt aus der Gruppe (C3-C6)-Cycloalkyl oder Fluor substituiert ist,
für Phenyl-(CH2)_ stehen,
worin
p für 0 oder 1 steht,
oder
R3 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen gesättigten oder teilweise ungesättigten 4-9-gliedrigen, mono- oder bicyclischen Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls bis zu zwei weitere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthält, und der gegebenfalls durch Reste ausgewählt aus der Gruppe Methyl, Hydroxy, Fluor, COOR20, Phenyl-Y, oder NR2IR22 substituiert ist,
worin
R20 Methyl bedeutet,
Y für eine Bindung oder CHOH steht, und R21 und R22 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder Methyl bedeuten,
und
X für Sauerstoff steht,
und deren Salze,
ausgenommen 2-Aminocarbonyl-3-methyl-5(2H)-isoxazolon.
4. Verbindungen gemäß Anspruch 1 ,
wobei
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und
für (C2-C6)-Alkyl stehen, oder
für Cyclopentyl oder Cyclohexyl stehen,
R3 und R4 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander
für Methyl oder Ethyl stehen,
oder
R3 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrolidin- 1-yl- oder Pyrrolin-1-yl-Rest bilden, und X für Sauerstoff steht,
und deren Salze.
5. 4-Ethyl-3-propyl-2-(l-pyrrolidinylcarbonyl)dihydro-5(2H)-isoxazolon
6. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der allgemeinen Formel (II),
in welcher
R1 und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und
R23 für (C,-C4)-Alkyl steht, dasgegebenenfalls durch Fluor substituiert ist,
mit Hydroxylamin als freie Base oder Salz gegebenenfalls in einem Lösungsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (III),
in welcher R , R und R die oben angegebene Bedeutung haben,
umsetzt,
und anschließend in Gegenwart einer Base zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (IV),
in welcher
R' und R2 die oben angegebene Bedeutung haben,
zyklisiert,
danach mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (V),
(Cl2C=X)q (V)
in welcher
X für Sauerstoff oder Schwefel steht, und
q 1, 2 oder 3 bedeutet,
gegebenenfalls in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels und einer Base zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (VI), in welcher,
R1, R2 und X die oben angegebene Bedeutung haben,
umsetzt,
die abschließend mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (VII),
HNR3R4 (VII) in welcher
R3 und R4 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben,
gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase zur Verbindung der allgemeinen
Formel (I) kondensiert werden.
7. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in Zusammenmischung mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen, im wesentlichen ungiftigen Träger oder
Exzipienten.
8. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung als Arzneimittel in der Behandlung von Menschen und Tieren.
. Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems.
10. Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von kognitiven Störungen, Depression, Schizophrenie und Angst.
1 1. Verwendung von Liganden der hochaffinen Bindungsstelle von Diisopropyl- Fluorophosphat, ausgenommen Verbindungen der allgemeinen Formel (IX),
in welchen
R24 und R23 gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für Halogen, (C,-C8)-Alkoxy, (C,-C3)-Alkenoxy, Aryl-S oder Aryl-O steht, wobei (C,-C8)-Alkoxy oder (CrC8)-Alkenoxy gegebenenfalls ein- oder mehrfach durch Halogen substituiert sind, und
R26 die Bedeutung von R24 hat und von dieser gleich oder verschieden ist, oder für gegebenenfalls substituiertes (C,-C8)-Alkyl oder substituiertes
Aryl steht, und
X für Sauerstoff oder Schwefel steht,
an Gehirnmembranen von Säugern zur Herstellung von Arzneimitteln zur
Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
12. Verwendung nach Anspruch 1 1 , wobei die Dissoziationskonstante Kd der Liganden an dieser Bindungsstelle kleiner als 1000 nM ist.
13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Dissoziationskonstante Kd der Liganden zu dieser Bindungsstelle um mindestens den Faktor 500 größer ist als ihre Affinität zu Acetylcholinesterase.
14. Verwendung von Liganden nach Anspruch 12, wobei die Dissoziationskonstante Kd der Liganden zu dieser Bindungsstelle um mindestens den Faktor 1000 größer ist als ihre Affinität zu Acetylcholinesterase.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, wobei die Erkrankung des zentralen Nervensystems eine kognitive Störung ist.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die kognitive Störung eine Demenz des Alzheimer-Typs ist.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Erkrankung des zentralen Nervensystems Angst, Schizophrenie oder Depression ist.
18. Verwendung von cerebralem Gewebepräparaten von Säugern zum Auffinden von Liganden der hochaffinen DFP-Bindungsstelle.
19. Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die Säuger Ratte, Kalb oder Mensch sind.
20. Verfahren zum Auffinden von Liganden der hochaffinen DFP-Bindungsstelle an cerebralem Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß man
(A) die Bindungsstellen aus dem Gehirn von Säugern gewinnt,
(B) diese mit dem Liganden vorinkubiert,
(C) dann mit DFP inkubiert, und (D) die Bindung mißt.
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