EP1078039A2 - Verfahren zur durchführung einer messung der interaktion von chemikalien mit zellen - Google Patents

Verfahren zur durchführung einer messung der interaktion von chemikalien mit zellen

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EP1078039A2
EP1078039A2 EP99934492A EP99934492A EP1078039A2 EP 1078039 A2 EP1078039 A2 EP 1078039A2 EP 99934492 A EP99934492 A EP 99934492A EP 99934492 A EP99934492 A EP 99934492A EP 1078039 A2 EP1078039 A2 EP 1078039A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reactor
cells
chemical
interaction
detection system
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99934492A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Noll
Heinz MÜHLENSIEPEN
Markus Cremer
Manfred Papaspyrou
Karl-Josef Langen
Ralf Engels
Richard Reinartz
Kurt Hamacher
Manfred Biselli
Markus Holschbach
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP1078039A2 publication Critical patent/EP1078039A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C12M25/18—Fixed or packed bed
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/24—Stationary reactors without moving elements inside
    • B01J19/2455—Stationary reactors without moving elements inside provoking a loop type movement of the reactants
    • B01J19/2465—Stationary reactors without moving elements inside provoking a loop type movement of the reactants externally, i.e. the mixture leaving the vessel and subsequently re-entering it
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00049—Controlling or regulating processes
    • B01J2219/00051—Controlling the temperature
    • B01J2219/00074—Controlling the temperature by indirect heating or cooling employing heat exchange fluids
    • B01J2219/00087—Controlling the temperature by indirect heating or cooling employing heat exchange fluids with heat exchange elements outside the reactor
    • B01J2219/00094—Jackets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00049—Controlling or regulating processes
    • B01J2219/00177—Controlling or regulating processes controlling the pH
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00049—Controlling or regulating processes
    • B01J2219/00186—Controlling or regulating processes controlling the composition of the reactive mixture

Definitions

  • the invention relates to a method for carrying out a measurement of the interaction of chemicals with cells, the cells being contained in a reactor.
  • the invention also relates to an apparatus for performing the method and its use.
  • Another application is the detection of the pharmacokinetic properties of a chemical.
  • the pharmacokinetic properties of chemicals must also be investigated in the course of product development if the product is intended to be used on humans or animals.
  • the absorption of the chemical, its distribution in the body, its metabolism and its excretion are recorded. What can be excellently examined in the cell system is the absorption of the chemical into certain cells, its metabolism in these cells and their excretion by these cells.
  • P 195 37 033.3 describes how measurements are carried out on cells in a reactor to determine pharmacokinetic and toxicokinetic properties.
  • a fluidized bed reactor is used as the reactor and is bubbled without bubbles.
  • the cells are attached to carrier bodies. With this procedure it is fundamentally possible to solve a number of questions.
  • the method is characterized by good applicability.
  • a disadvantage of the known method was the fact that it was intended according to this method to carry out an off-line acquisition of the data, i.e. it was necessary to regularly take samples from the reactor so that the effects of the chemical on the cells were recorded.
  • Constant sampling of data to collect data is problematic in some respects. Withdrawal of material from the reactor leads to a change in the system; if frequent removal is required, this change can even be significant. In addition, this type of detection leads to a certain delay in the procedure. If it is necessary to make changes in the system based on the recorded measured values, for example by adding the chemical, this change can only be made after the respective measured value has been determined. This sluggishness is fundamentally disadvantageous. The fact that measurements have to be carried out at all is also undesirable. Measurements tie up material and personnel and are undesirable for the establishment of procedures in routine screening.
  • the first-mentioned object is achieved by a method with the characterizing features of the main claim.
  • the process relates generally to the interaction of a chemical with cells.
  • the method is therefore expressly not restricted to a specific interaction.
  • the system offers the possibility of examining the effect of the chemical on the cells of the test system. Such interaction is often observed as a deterioration in the condition of the cells.
  • a direct lethal effect of the chemical on the cells will usually be regarded as a toxic effect, unless the cells in the test system are downright target cells for a desired attack by the chemical, such as for tumor cells, in which case the lethal or toxic effect is desired is.
  • this type of interaction also includes influencing biochemical processes within the cell, the biochemical processes being able to represent effects at the level of protein synthesis, DNA synthesis or RNA synthesis.
  • a reactor is the general name for a vessel that contains cells. Depending on the arrangement of the cells in the reactor, this is called differently.
  • the process can be carried out with a fluidized bed reactor (also known as a fluidized bed reactor) or with a fixed bed reactor. These options will be specified later in the description. Other arrangements can also be considered.
  • the reactor is not limited to a particular format. A reactor with a total volume of about 50 ml is preferred, but other dimensions are also possible.
  • the process according to the invention can be carried out very well with the reactor described in P 195 37 033.3.
  • a preferred reactor has a total volume of about 50 ml.
  • the reactor is tapered at the lower end and the diameter of this end corresponds to the diameter of a line which is assigned to this end.
  • the reactor tube has a diameter of approx. 10-20 mm with an opening angle of approx. 25 °.
  • the cells can be used as cell culture, being freely available in a suitable liquid medium.
  • the biological specialist literature provides the specialist with sufficient information on how to proceed with regard to the establishment of a cell culture.
  • Lead cell density cell densities between 5 * 10 7 and 10 8 cells are achieved per ml carrier. The density achieved with this method is much closer to the natural situation than the previous in vitro methods.
  • the method is not limited to specific cells. The selection will primarily depend on the suitability for use in the method, because not all cell types are necessarily suitable for use in a free cell culture, and likewise not, according to the preferred embodiment, are suitable for settling on support material.
  • the method can be carried out very well with animal or human liver or kidney cells, a selection which is particularly useful in the context of pharmacokinetic Investigations is extremely useful. Use with tumor cells is also preferred, especially in the context of investigations that focus on screening for anti-carcinogenic
  • the solid particles are not bound to any particular embodiment. With regard to these solid particles, too, there is any variation of possibilities.
  • the only condition for carrying out the method according to the invention is the requirement that the solid particles are not soluble in the selected liquid medium. Otherwise, the material of the particles and their exact geometry should only be used for their purpose in the process. Within the scope of the invention it will certainly be a preferred variant to start from more or less spherical particles. These offer a relatively large surface area, can be stacked perfectly into a pack and still allow an undisturbed flow of liquid medium.
  • Siran® balls from Schott, Mainz.
  • Such Siran® balls are porous glass substrates with about 50% porosity and a grain size of 200 - 1500 ⁇ m, preferably 400 - 700 ⁇ m.
  • the glass slides can be pretreated with a diluted gelatin solution before use in the process.
  • the Siran® balls have repeatedly shown excellent properties in terms of adhesion and stability. Another variant which is also preferred in the context of investigations with
  • collagen microcarriers are used as collagen microcarriers. These carriers are also available in different sizes and designs. Collagen microcarriers show similarly good results
  • the process according to the invention is carried out in a liquid medium.
  • the conditions in the reactor such as the composition of the culture medium, the temperature, the type of fumigation, etc., must be determined and optimized individually for each cell type.
  • the optimized reaction conditions are preferably to be regulated automatically in the process according to the invention.
  • one of the components involved in the interaction between the chemical and the cells is a component producing a signal.
  • a component is directly or indirectly affected in the interaction between the chemical and the cells.
  • the component can thus be the chemical itself, for example if the focus of the investigation is to determine whether the chemical is influenced by the cells at all. Information will often be requested as to whether the chemical is absorbed by the cell. The knowledge that a certain chemical is not absorbed by certain cells can be of considerable importance. Recording a time course of the intracellular concentration of a chemical can also provide important information regarding the effectiveness or side effects of chemicals.
  • the component can just as well not be the chemical itself, but another component if, for example, the focus of the investigation is to determine whether certain intracellular processes are changed in the presence of the chemical. For example, it can be investigated whether the chemical causes a change in the protein synthesis in general, or the synthesis of a specific protein or the synthesis of the genetic material or the division of the cell.
  • the component involved may be a particular amino acid or two amino acids, but if it is an assay for a change in DNA or RNA synthesis, it may become one of the components of DNA or RNA can be used as the affected component. If another process is examined again, other components may also be examined. It therefore depends on the question during the investigation which component becomes the subject of the investigation.
  • the component concerned which is the subject of the investigation according to the method according to the invention, must be a component producing a signal. This produced signal enables the investigator to determine whether there is an interaction between the chemical and the cells and how this interaction works.
  • the signal produced by the affected component can be any signal. The only requirement is that such a signal is produced and that it can be detected by a detection system outside the reactor. Such a signal can be, for example, radioactive radiation if a radiotracer is used to carry out the method. Another possibility relates to fluorescent radiation if a fluorescent component is used when carrying out the method.
  • the chemical can be offered as an affected component labeled with a radioactive isotope.
  • the radiation produced by the radioactive isotope can be detected by an appropriate radioactivity detector outside the reactor.
  • a different radioactive label can be used. For the selection of the relevant marking in the examination, one can choose from the available offer. The Selection will of course be affected by which labels are available or usable for the intended study. However, there are other practical considerations. Short-lived radioactive compounds have been found in the
  • the signal is detected with a detection system outside the reactor.
  • the detection system will include a system that is suitable for the detection of the radioactive radiation, while a device for the detection of fluorescence beams is selected for the detection of fluorescence.
  • the signal produced in the reactor by one of the affected components, which is outside the Reactor is detected by a detection system, immediately fed to a computer and processed further.
  • the method according to the invention readily offers the possibility of using the method in a routine screening.
  • the need to carry out such a measurement by adding an indicator is eliminated.
  • This addition of an indicator was described in the prior art method and was undesirable if only because it could never be completely ruled out that there was an interaction between the chemical and the indicator.
  • the procedure is usually carried out with cells. However, it should be expressly pointed out that an application without cells is also possible.
  • a simple example is an examination which can be carried out to check the specificity of monoclonal antibodies.
  • the monoclonal antibodies can be bound to solid particles, the above-described ones in turn being preferably usable, in order to subsequently carry out L-examinations with marked substrates in order to test the binding of these substrates. The depletion of the marked The substrate or its enrichment in the area of the fluidized bed or fixed bed allows the
  • the invention also relates to a device with the features of claim 6.
  • the device was invented with the focus on being used in the method according to the invention.
  • a device is thus provided which is to be used for measuring the interaction of chemicals with cells.
  • the device has a reactor for taking up the cells, or according to the preferred embodiment of the method, for taking up the cells immobilized on solid particles.
  • the reactor can be designed differently and is adapted to the process.
  • a fluidized bed is often provided in the process according to the invention and the reactor accordingly represents a fluidized bed reactor.
  • liquid medium is usually fed to a reactor part containing the cells at such a flow rate that the cells cannot settle on the one hand, but continuously from the liquid flow be whirled up without being carried along.
  • Such fluidized bed reactors are described, for example, in P 195 28 871.8.
  • a fluidized bed reactor can have, for example, a cylindrical reactor tube and a conically tapered end.
  • the reactor tube can have a diameter of 10-20 mm, while the tapered end has a diameter which corresponds to that of an intended circulation system.
  • the fluidized bed reactor can have a membrane or filter in the tapered lower end in order to prevent cells from getting into the circulation system counter to the flow of the liquid medium, but this is not absolutely necessary since the experience with such fluidized bed reactors has shown that the cells with the correct setting of the
  • the reactor can also be designed as a fixed bed reactor.
  • the reactor can then basically also have a format as described above in relation to an embodiment as a fluidized bed reactor.
  • the fixed bed reactor can thus also have a cylindrical reactor tube and a tapered end.
  • the liquid medium will preferably flow from above through the fixed bed, which of course requires the arrangement of a filter, a membrane or a sieve in the reactor tube or in the section of the tapered end.
  • reactors can also be considered. Any spatial arrangement which is suitable for accommodating cells can be considered as a reactor in the device according to the invention.
  • the reactor will normally be made of glass. Other materials can also be considered, but it is not easy to imagine what advantages a certain other embodiment would have for the device according to the invention if it were made in a different material. Glass is cheap, stable, easy to clean, transparent and permeable to the signals which have to be detected according to the method according to the invention.
  • the device according to the invention must also have a circulation system. It must be provided to stir or swirl the liquid medium in the device so that an effective homogenization of the liquid medium can be carried out in the system.
  • the circulation system can be of any design as long as it ensures an intensive and thorough stirring process. It is a preferred embodiment of the device according to the invention that the device has a circulation system which comprises a first opening at the lower end of the reactor and a further opening at the upper end of the reactor, a line being arranged between the two openings. With this arrangement, the liquid medium is constantly in a kind of circular movement pumped round, a circulating pump preferably being arranged in the line for this round pumping.
  • the dimension of the openings in the reactor and the format of the line is not an essential feature of the device according to the invention.
  • the reactor according to the preferred embodiment described above is a fluidized bed reactor which consists of a cylindrical reactor tube with a tapered lower end
  • the line is connected to the tapered lower end.
  • the diameter of the tapered end is usually less than 7.5 mm and with such a diameter, a circulation hose can be used in a relatively simple setup.
  • the second opening which preferably has the same diameter, is arranged in the upper region of the cylindrical reactor tube, so that an identical hose can be used for the line between the two openings.
  • the device must have control elements for monitoring the composition of the medium. Reproducible and comparable studies require constant conditions. Consistency in the composition of the liquid medium is important for working with cell systems because this is the only way to ensure that the system is sufficiently vital. Parameters such as concentration of the medium's ingredients, concentration of nutrients, pH, osmolarity and oxygen concentration can be monitored with appropriate sensors.
  • the control bodies such as a pH probe, a pO2 electrode or flow injection analysis for substrate and metabolite analysis can be arranged in the reactor and in the circulation system. Ideally, the control elements are built into an automated control system, which also provides that any adjustment of the composition of the liquid medium that may be required is also controlled automatically. Such an adjustment can be carried out as the supply of any ingredients or nutrients (dissolved or undissolved), as the supply of fresh medium or an intensification of the fumigation.
  • the device according to the invention has an arrangement for gassing the medium.
  • this kind of fumigation means an arrangement that specifically supplies oxygen.
  • a certain minimum oxygen pressure is a decent one Course of the intracellular processes is an absolute requirement. That is why a well-functioning arrangement for fumigation is particularly important.
  • an arrangement for gassing which comprises a silicone membrane, via which oxygen reaches the liquid medium.
  • the device according to the prior art preferably provided a coaxial arrangement in the reactor tube for this silicone membrane.
  • a coaxial arrangement has disadvantages in the device according to the invention because, as will be described in more detail below, the device comprises a detection system and the arrangement of the silicone membrane in the reactor tube interferes with a particularly preferred embodiment of the detection system. It is therefore more favorable not to arrange the gas supply device in the reactor tube, but rather at some point in the circulation system.
  • the device according to the invention must have a point for metering the chemical. It can be provided that only one point is provided for metering, but it is also possible to provide two different positions for metering, one of the two points can be used for an acute injection, the other for metering which is carried out as an infusion becomes.
  • the device according to the invention has a detection system for detecting the signal produced by the interaction of the chemical with the cell.
  • the detection system has to be adapted to the respective signal.
  • the device according to the invention detects the interaction of a chemical with
  • the detection system When carrying out an experiment with a chemical that itself produces the signal, positioning the detection system in the area of the cells will make it possible to determine whether the chemical is accumulating in the area of the cells and a time course of the signal intensity will become clear. If the signal is not from the chemical itself, but e.g. is produced by a component of the cell, the influence of which is to be studied, the detection of the signal in the area of the cells provides information on the extent to which the chemical effects an increased uptake or discharge of this component over time.
  • the first detection system will be located in the area of the cells, as has already been described above for a device with only one detection system.
  • the second detection system should be positioned at a location in the device where there are no cells.
  • Such a preferred embodiment allows a much more meaningful statement about whether a certain signal level in the area of the cells really comes about through an interaction with the cells or rather represents a general change in the entire system, which ultimately only results from a signal at the level containing the cells liquid medium comes about.
  • the second detection system will make it possible to detect interactions between chemicals and cells with much greater accuracy and sensitivity. The detection of the signal intensity in the circulating medium and in the fluidized bed allows the continuous determination of the amount of chemicals absorbed by the cells.
  • the arrangement displaces the medium and accordingly causes the signal to weaken.
  • the detection system comprises a detector.
  • the detection system should comprise two separate detectors, which are arranged, for example, on opposite sides of the reactor (coincidence measurement). This more preferred embodiment is equally preferred in a single detection system and in a double detection system.
  • further detection systems are provided in the device according to the invention.
  • a first further arrangement is provided in the area of the access of the chemical, provided that the detected signal is produced by the chemical itself.
  • the advantage of this arrangement relates to the possibility of carrying out a targeted and precise metering of the chemical into the liquid medium, because the increase in the signal in the system as a whole is detected by means of the direct detection of the signal in the inlet area.
  • a further detector is provided in the area of the circulation system. With a detection system arranged at this position, a further refinement of the monitoring of the activity in the system is possible.
  • the detectors are each connected via a main amplifier and a window discriminator (for setting to the radionuclide used) to a counter card in a computer which displays and / or stores the data with a corresponding program.
  • the detection system consists of two or more measuring heads (these can be gamma radiation detectors, for example, depending on the radiation detected), an associated standard readout electronics and a data acquisition system (computer). Due to the different radiation energy which is to be detected in the fluidized bed reactor, a high dynamic range must be ensured.
  • the ionizing radiation can be detected directly (semiconductors) or indirectly (scintillation).
  • the scintillator can be coupled to the photomultiplier either directly or via optical fibers.
  • the detectors can be arranged around the reactor.
  • the detectors are collimated to the respective field of view by lead shielding with a suitable geometry or, in the case of positron emitters, optionally by coincidence measurements.
  • the aim of the invention is basically based on the fact that the investigation can be carried out completely on the closed system and that it is not necessary to take samples from the device. This goal can also be achieved if the method according to the invention is carried out as described above. However, examinations may be intended where removal is required. Such removal is e.g. required if the examination provides information about the identity of the metabolites produced by the cells, about a binding to certain cell organelles, about damage to the cells, and similar information that can only be carried out by a subsequent examination outside the device. In such cases, the method according to the invention provides that, in addition to the automatically recorded and on-line evaluations, samples are taken at certain times, which are processed for evaluation outside the device.
  • the method according to the invention is fundamentally suitable for use in tests which aim to investigate the pharmacokinetic properties of chemicals.
  • the method is also suitable for carrying out studies on
  • Another use of the method according to the invention relates to the measurement of the porosity in the reactor.
  • Porosity of a fluidized or fixed bed means the proportion of the liquid medium in the area of the bed, which is composed of the intermediate grain volume and the accessible cavities inside the carrier.
  • the porosity is thus the quotient of the signal intensity measured in the area of the bed and the intensity measured in the carrier-free circulation. It is a prerequisite for such a measurement that the labeled substance does not adhere to the carriers, because this would lead to an accumulation in the area of the bed and thus lead to an incorrect result.
  • the porosity of a fluidized or fixed bed can be determined by means of continuous data acquisition.
  • the porosity is of particular interest for procedural questions.
  • a very specific question can arise if, in the course of an investigation with a catalyst immobilized on solid supports, it is desired to measure whether the immobilized catalyst is bleeding (being flushed down by the supports).
  • This question is an examination which is carried out in the absence of cells.
  • the carrier which contains the carrier as a fixed bed or as a fluidized bed is flowed through by a liquid phase comprising the substrate.
  • the porosity of the bed can be measured by regularly injecting a signal producing compound, eg a radiotracer. If the catalyst is lost, a change in the porosity is determined.
  • Figure 1 shows schematically an experimental device with a fluidized bed reactor.
  • Figure 2 schematically represents an experimental device with a fluidized bed reactor.
  • Figure 3 shows the result of an investigation with 18 FDG in the device according to the invention.
  • Figure 4 shows the result of an examination with * 8 FDG on human glioma cells.
  • Figure 5 shows the result of a porosity measurement.
  • a device according to the invention is shown schematically in FIG.
  • the device has a reactor 1, which consists of a cylindrical part 2 and a tapering end 3.
  • the reactor 1 is surrounded by a heating jacket 4.
  • a circulation system 6 is assigned to the reactor.
  • the liquid medium present in the reactor is withdrawn from the reactor by means of a peristaltic Umlau 5 and fed to it again via the circulation system 6.
  • the circulation system 6 consists of a hose which is connected to the reactor 1 at positions 8 and 9.
  • liquid medium can be removed from the reactor.
  • Control elements 10 are assigned to the circulation system and enable the composition of the medium to be continuously monitored.
  • the control members 10 always include an oxygen probe, but can otherwise comprise any measuring devices. Fresh liquid medium can be supplied, specifically via the line 11.
  • the silicone membrane for gassing the liquid medium is integrated in an arrangement 12 in the circulation system 6 in order to avoid a possible disturbance of the measuring processes in the area of the reactor 1. Addition of chemicals or substances producing a signal takes place via a line 15.
  • the arrangement shown in FIG. 1 comprises a common supply line 15 which can be used as an infusion for an acute injection such as for adding the chemical or the signal-producing substance. If an acute injection is carried out, with which process an acute injection is practically to be imitated on humans or animals, the injection is carried out by means of a syringe 16 through a membrane 17 into the part 18 of the line. If an infusion is provided, this is carried out, for example, by means of an infusion pump 27 in part 19 of the line.
  • the device according to the invention has detectors for detecting the signal produced when the cells interact with the chemical.
  • FIG. 1 shows a device which comprises two detectors 20 and 21, the detector 20 being associated with the upper region of the reactor 1 and the detector 21 with the lower region of the reactor 1.
  • Another detector 22 is assigned to the part of the circulation system which connects directly to the tapered end of the reactor.
  • a further detector 23 is located on the feed line 15.
  • the detectors can be optimized for certain types of beams or fluorescence signals, they can consist of an excitation light source and an optical separation unit in addition to the detector, or they can be designed as a combination of different detection systems.
  • the reactor 1 is closed with a lid 24 which is connected to the reactor with a screw cap.
  • the lid 24 has devices for taking samples, which are not shown here. This removal can be done sterile with a sterile bench.
  • the reactor 1 When carrying out the method according to the invention, the reactor 1 is filled with a liquid medium which is pumped by the peristaltic circulation pump 5 through the circulation system 6. If the examination which is to be carried out relates to a reaction in a fluidized bed, the liquid medium is conveyed by the peristaltic pump 5 in the direction of the arrow 25. It speaks for itself that in the case of an orientation as a fixed bed, funding is provided in the opposite direction.
  • the reactor has in the liquid medium the solid particles 26 which are constantly stirred up by the constant inflow of the liquid medium, but without leaving the lower region of the reactor 1.
  • the on-line detection is carried out by the detector 22 as a control for compliance with the test conditions, by the detector 21 as an indicator for the activity absorbed by the cells and by the detector 20 as a detector for the activity remaining in the medium.
  • a labeled test liquid is used for the calibration of the system, ie for the quantitative detection of the activity absorbed in the cells.
  • FIG. 2 shows another possible embodiment of a device according to the invention.
  • the feed line 15 is provided at a different position in the circulation system.
  • the execution of the detection system is even more important.
  • all of the detectors 20, 21, 22 and 23 are not provided as individual detectors but as a duplicate. Such an embodiment allows a significantly more precise detection of the signal intensity.
  • Human brain tumor cells (86HG39) were immobilized on open - pore borosilicate glass substrates (Siran®, Schott, Mainz) in a spinal fluid reactor and up to a cell density of approx
  • Scintillation detectors equipped, one at the level of the fluidized bed (corresponding to detector 21 in Figure 1) and one above in the area of the cell-free circulation (corresponding to detector 20 in Figure 1).
  • 1 8 FDG is used in the clinic to investigate glucose metabolism and to diagnose tumors.
  • the compound is absorbed into the cells but, unlike natural glucose, is not metabolized.
  • the signals in the fluidized bed and in cell-free circulation are shown in FIG. 3.
  • the intracellular accumulation of the radiotracer in the immobilized cells results directly from the difference between the signal in the fluidized bed and in the cell-free circulation (shown in FIG. 4).
  • the radioactive decay and the glass content in the fluidized bed have already been taken into account by the measurement data acquisition.
  • carrier samples with immobilized cells were taken from the fluidized bed reactor (using a carrier sampling system integrated in the cover 24 shown in FIG. 1) in order to determine the intracellular accumulation of the radiotracer off-line and to compare it with the signal obtained on-line.
  • FIG. 4 shows the result of the comparison of the off-line and on-line determinations. It is obvious that the course of the curve, which documents the on-line binding of the radiotracer to the particles, corresponds perfectly with the result of the off-line determination.
  • a fluidized bed reactor there was a fluidized bed consisting of open-pore borosilicate glass substrates (Siran®, Schott, Mainz) with a diameter of 500-560 ⁇ m. Deionized water was used as the circulating medium in the test.
  • the reactor was equipped with two scintillation detectors, one at the level of the fluidized bed (corresponding to detector 21 in FIG. 1) and one above in the area of the cell-free circulation (corresponding to detector 20 in FIG. 1).
  • an aqueous [18F] -labeled fluoride solution was injected into the system (by injection at position 18 in Figure 1). After about 5 minutes, the activity in the reactor had mixed uniformly.
  • the quotient formed from activity in the fluidized bed and the activity in circulation corresponds to the current porosity of the fluidized bed, this value is usually represented as a percentage.
  • FIG. 5 shows the porosity determined in this way as a function of the circulating volume flow.

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung der Interaktion von Chemikalien mit Zellen in einem Reaktor, z.B. einem Festbettreaktor oder einem Wirbelschichtreaktor. Dabei wird ein Signal gemessen, welches von einer der bei der Interaktion betroffenen Komponenten produziert wird. Das Signal ist dazu geeignet von einem Detektionssystem ausserhalb des Reaktors erfasst zu werden. Die Komponente, welche das Signal produziert, kann die Chemikalie selbst sein, in welchem Fall es sich um die Untersuchung der pharmakokinetischen Eigenschaften der Chemikalie handeln kann. Eine weitere Möglichkeit betrifft die Untersuchung eines Einflusses der Chemikalie auf Vorgänge innerhalb der Zelle. Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens umfasst einen Reaktor zur Aufnahme von Zellen, ein Umlaufsystem, Kontrollorgane zur Überwachung der Zusammensetzung des Mediums, eine Anordnung zur Begasung des Mediums, einen Eingang für die Chemikalie und mindestens ein Detektionssystem zur Erfassung der Interaktion.

Description

Verfahren zur Durchführung einer Messung der Interaktion von
Chemikalien mit Zellen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer Messung der Interaktion von Chemikalien mit Zellen wobei die Zellen in einem Reaktor enthalten sind. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens sowie dessen Verwendung.
Interaktionen von Chemikalien mit Zellen werden in der biologischen Forschung häufig gemessen. Das Augenmerk solcher Untersuchungen kann unterschiedlich sein. Einerseits werden solche Untersuchungen vorgenommen, um festzustellen, ob Chemikalien eine bestimmte Wirkung auf die Zellen ausüben. Es kann sich dabei um eine pharmakologische Wirksamkeit handeln, wenn das Ziel der Untersuchungen das Auffinden neuer Wirkstoffe ist, es kann sich aber auch um die Feststellung einer toxischen Eigenschaft handeln. Beide Typen von Messungen werden im Rahmen eines Substanzscreenings anfallen, wo es immer auf einem bestimmten Verhältnis der biologischen Wirksamkeit im Vergleich zur Toxizität ankommt.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist die Erfassung der pharmakokinetischen Eigenschaften einer Chemikalie. Auch die pharmakokinetischen Eigenschaften von Chemikalien müssen im Rahmen einer Produktentwicklung untersucht werden, wenn beabsichtigt ist, das Produkt am Menschen oder bei Tieren anzuwenden. Im Rahmen der Untersuchung pharmakokinetischer Eigenschaften werden die Absorption der Chemikalie, seine Verteilung im Körper, sein Metabolismus und seine Ausscheidung erfaßt. Was sich im Zellsystem hervorragend untersuchen läßt, ist die Aufnahme der Chemikalie in bestimmte Zellen, ihre Verstoffwechselung in diese Zellen und ihre Ausscheidung durch diese Zellen.
Die biologische Aktivität von Chemikalien wird letzlich am Tier erfaßt. Ein großer Vorteil von Versuchen in Zellsystemen stellen jedoch ihre bessere Standardisierung, ihre Einfachheit und ihre geringeren Kosten dar. Versuche am Tier werden nicht nur erschwert durch gesetzliche Regelungen, sie sind immer teuer und aufwendig und die Widerstand in der Bevölkerung gegen solche Versuche nimmt ständig mehr zu.
Aus diesem Grund ist es begrüßenswert und notwendig, die Möglichkeit zu haben, die Eigenschaften von Chemikalien in einem Prüfverfahren ohne Verbrauch von Tieren zu screenen. Wenn auch solche Prüfverfahren die Tierversuche nie gänzlich ersetzen werden, ist ihr großer Vorteil bereits dadurch begründet, daß sie als Vorscreening in der ersten Phase der
Entwicklung von Chemikalien die Durchführung vieler Tierversuche überflüssig machen werden.
Versuche zur Durchfuhrung von Messungen bezüglich der Interaktion von Chemikalien mit
Zellen sind im Stand der Technik bekannt.
So beschreibt die P 195 37 033.3 die Durchfuhrung von Messungen an Zellen in einem Reaktor zu Erfassung von pharmakokinetischen und toxikokinetischen Eigenschaften. Als Reaktor wird ein Wirbelschichtreaktor verwendet welche blasenfrei begast wird. Die Zellen sind an Trägerkörpern angelagert. Mit diesem Verfahren ist es grundsätzlich möglich, eine Reihe von Fragestellungen aufzuklären. Das Verfahren zeigt sich durch gute Anwendbarkeit aus. Nachteilig bei dem bekannten Verfahren war jedoch die Tatsache, daß es gemäß diesem Verfahren vorgesehen war, eine off-line Erfassung der Daten vorzunehmen, d.h. es war erforderlich dem Reaktor regelmäßig Proben zu entnehmen, damit die Effekte der Chemikalie auf die Zellen erfaßt wurden.
Eine ständige Entnahme von Proben zur Erfassung von Daten ist in mancher Hinsicht problematisch. Eine Entnahme von Material aus dem Reaktor führt zu einer Veränderung im System, wenn eine häufige Entnahme erforderlich ist, kann diese Veränderung sogar erheblich sein. Außerdem führt diese Art von Erfassung zu einer gewissen Verzögerung im Verfahren. Wenn es erforderlich ist, anhand der erfaßten Meßwerte Veränderungen im System vorzunehmen, etwa durch eine Zugabe der Chemikalie, kann diese Veränderung frühestens nach Bestimmung des jeweiligen Meßwertes gemacht werden. Diese Trägheit ist grundsätzlich von Nachteil. Auch die Tatsache, daß überhaupt Messungen durchgeführt werden müssen, ist unerwünscht. Messungen binden Material und Personal und sind für die Etablierung von Verfahren im Routinescreening unerwünscht.
Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, daß die Nachteile des Standes der Technik nicht besaß und durch eine einfachere Erfassung von Meßdaten besser in einem Screeningsystem einpaßbar ist. Es war eine weitere Aufgabe der vorüegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit welcher sich das erfindungsgemäße Verfahren durchführen läßt.
Die erstgenannte Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Hauptanspruchs gelöst.
Das Verfahren bezieht sich ganz allgemein auf die Interaktion von einer Chemikalie mit Zellen. Das Verfahren ist damit ausdrücklich nicht auf eine bestimmte Interaktion beschränkt.
Es ist somit im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, eine Wirkung der Zellen auf die Chemikalie zu erfassen. Das beinhaltet somit eine Aufnahme der Chemikalie in die Zellen, eine Umwandlung der Chemikalie in der Zelle und eine Ausscheidung der veränderten oder unveränderten Chemikalie durch die Zellen. Diese Wirkung der Zelle auf die Chemikalie betrifft Vorgänge, welche sich allgemein unter pharmakokinetischen Untersuchungen subsumieren lassen.
Andererseits bietet das System die Möglichkeit, die Auswirkung der Chemikalie auf die Zellen des Prüfsystems zu untersuchen. Eine solche Interaktion wird häufig als Verschlechterung der Zustand der Zellen beobachtet. Eine direkte lethale Wirkung der Chemikalie auf die Zellen wird üblicherweise als toxische Wirkung zu werten sein, es sei denn, die Zellen im Prüfsystem sind geradezu Targetzellen für einen gewünschten Angriff durch die Chemikalie wie etwa bei Tumorzellen, in welchem Fall die lethale oder toxische Wirkung erwünscht ist. Es sei jedoch daraufhin zu weisen, daß diese Art der Interaktion ebenfalls eine Beeinflussung biochemischer Vorgänge innerhalb der Zelle umfaßt, wobei die biochemischen Vorgänge Effekte auf dem Niveau der Proteinsynthese , der DNA-Synthese oder der RNA-Synthese darstellen können.
Das Verfahren wird in einem Reaktor durchgeführt. Ein Reaktor ist die allgemeine Bezeichnung eines die Zellen umfassenden Gefäßes. Je nach Anordnung der Zellen im Reaktor wird dieser unterschiedlich bezeichnet. So kann das Verfahren sowohl mit einem Wirbelschichtreaktor (auch Fließbettreaktor genannt) wie mit einem Festbettreaktor durchgeführt werden. Diese Möglichkeiten werden nachher im Rahmen der Beschreibung näher spezifiziert. Auch andere Anordnungen können durchaus in Betracht kommen. Der Reaktor ist nicht auf ein bestimmtes Format beschränkt. Bevorzugt wird ein Reaktor mit einem Gesamtvolumen von etwa 50 ml, aber auch andere Abmessungen kommen in Betracht.
Ist der Reaktor ein Wirbelschichtreaktor, so ist das erfindungsgemäße Verfahren sehr gut mit dem in der P 195 37 033.3 beschriebenen Reaktor durchführbar. Ein solcher bevorzugter Reaktor weist ein Gesamtvolumen von etwa 50 ml auf. Der Reaktor ist am unteren Ende konisch verjüngt und der Durchmesser dieses Ende entspricht dem Durchmesser einer Leitung welche diesem Ende zugeordnet ist. Das Reaktorrohr besitzt einen Durchmesser von ca 10 - 20 mm bei einem Öffhungswinkel von ca. 25°.
Auch für die genaue Anordnung der Zellen im Reaktor gibt es mehrere Möglichkeiten. Die Zellen können als Zellkultur eingesetzt werden, wobei sie frei in einem geeigneten flüssigen Medium vorliegen. Die biologische Fachliteratur verschafft dem Fachmann ausreichend Information, wie er in bezug auf die Einrichtung einer Zellkultur vorzugehen hat.
Besonders bewährt hat sich jedoch eine Ausführungsform, bei welcher die Zellen nicht frei vorliegen, sondern sich an Trägerpartikeln angesiedelt haben und sie somit an diesen Trägerpartikeln als festen Partikeln immobilisiert sind. Diese Ausführungsform, welche z.B. in der P 195 37 033.3 beschrieben wird, führt zu überraschend hohen Zelldichten. Wenn ein Reaktor mit einem Volumen von 50 ml verwendet wird, wird bevorzugt mit einer Trägermenge von 20 bis 25 ml Schüttvolumen gearbeitet. Auf dieser Menge Trägermaterial können 1 bis 5 g Zellen immobilisiert werden. Das Verfahren kann zu einer sehr hohen
Zelldichte führen: pro ml Träger werden Zelldichten zwischen 5*107 und 108 Zellen erreicht. Die Dichte welche bei diesem Verfahren erreicht werden ist der natürlichen Situation wesentlich näher wie die früheren in-vitro-Verfahren.
Das Verfahren ist nicht auf bestimmte Zellen beschränkt. Der Auswahl wird primär von der Einsetzbarheit im Verfahren bedingt sein, weil nicht unbedingt alle Zelltypen für eine Anwendung in einer freien Zellkultur und ebenso nicht gemäß der bevorzugten Ausführungsform für eine Ansiedlung an Trägermaterial geeignet sein.
Durchführbar ist das Verfahren sehr gut mit tierischen oder menschlichen Leber- oder Nierenzellen, eine Auswahl, welche speziell im Rahmen von pharmakokinetischen Untersuchungen äußerst sinnvoll ist. Auch eine Anwendung mit Tumorzellen wird bevorzugt, speziell im Rahmen von Untersuchungen, welche sich auf ein Screening nach antikanzerogenen
Verbindungen richten. Im allgemeinen kann behauptet werde, daß Zellen, mit welchen das erfindungsgemäße Verfahren nicht durchgeführt werden kann, z.Z. nicht bekannt sind.
Die festen Partikeln sind nicht an einer bestimmten Ausführungsform gebunden. Auch in bezug auf diese feste Partikeln gibt es eine beliebige Variation an Möglichkeiten. Einzige Bedingung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Voraussetzung, daß die festen Partikeln im ausgewählten flüssigen Medium nicht löslich sind. Ansonsten ist bei dem Material der Partikeln und bei deren genauen Geometrie lediglich auf deren Zweck im Verfahren zu achten. Im Rahmen der Erfindung wird es sicherlich eine bevorzugte Variante darstellen, von mehr oder weniger kugelförmige Partikeln auszugehen. Diese bieten eine relativ große Oberfläche, lassen sich hervorragend zu einer Packung stapeln und erlauben trotzdem einen ungestörten Durchfluß von flüssigem Medium.
Selbstverständlich betrifft die Möglichkeit, das Verfahren mittels eines Festbettes oder eines Wirbelschichts auszuführen, gleichermaßen die freischwebenden Zellen wie die an festen Partikeln anhaftenden Zellen.
Wie nachher im Rahmen der Ausführungsbeispiel näher erörtert wird, ist es eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, es im Rahmen der Kultivierung von menschlichen Körperzellen zu verwenden. Bei solchen Versuchen haben sich bestimmte Partikeln als äußerst gut verwendbar gezeigt. Besonders zweckmäßig sind poröse Wirbelkörper mit 200 - 1500 μm Durchmesser und einer Dichte von mindestens 1,1 kg/1, deren Poren mit Medium gefüllt sind.
Zunächst wurden günstige Erfahrungen mit Siran®-Kugeln (Firma Schott, Mainz) gemacht. Solche Siran®-Kugeln sind poröse Glasträger mit etwa 50 % Porosität und einer Korngröße von 200 - 1500 μm, vorzugsweise von 400 - 700 μm. Die Glasträger können vor dem Einsatz im Verfahren mit einer verdünnten Gelatinelösung vorbehandelt werden. Die Siran®-Kugeln haben sich in Versuchen mit menschlichen oder tierischen Zellen immer wieder durch ihre hervorragenden Eigenschaften in bezug auf Haftung und Stabilität ausgezeichnet. Eine weitere Variante welche ebenfalls bevorzugt im Rahmen von Untersuchungen mit
Zellmaterial zur Anwendung kommt sind Kollagenmikroträger. Auch diese Träger sind in verschiedenen Größen und Ausführungen verfügbar. Kollagenmikroträger zeigen ähnlich gute
Eigenschaften im Versuch, weisen im Vergleich zu den Glaskugeln eine besondere Eigenschaft auf, welche ihnen je nach Bedarf einen entscheidenden Vorteil verschaffen kann. Es kommt nämlich häufig bei der Anwendung von Partikeln mit angehafteten Komponenten vor, daß gewünscht wird, diese Komponenten am Ende der Reaktion zurückzugewinnen, mit dem Ziel eines erneuten Einsatzes oder einer anschließenden Weiterbearbeitung. Bei solchen Kultivierungen stellen die angewachsenen Zellen den Zweck des Versuches dar und ist es somit unumgänglich sie von den Partikeln, wie z.B. den Siran®-Kugeln oder den Kollagenmikroträgern zu lösen. Gerade dann zeigt sich der Vorteil der letztgenannten Partikeln, weil man die Kollagenmikroträger einfach in einem eine Kollagenase enthaltenden System überführen kann, mit der Folge, daß die Träger sich auflösen und die Zellen welche von dem Enzym nicht angegriffen werden aus der Lösung isoliert werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem flüssigen Medium durchgeführt. Die Bedingungen im Reaktor, wie etwa die Zusammensetzung des Kulturmediums, die Temperatur, die Art der Begasung, usw. sind zu jedem Zelltyp einzeln zu bestimmen und zu optimieren. Die optimierten Reaktionsbedingungen sind bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt automatisch zu regulieren.
Es stellt ein besonderes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, daß eine der bei der Interaktion zwischen der Chemikalie und den Zellen betroffenen Komponenten eine ein Signal produzierende Komponente darstellt. Eine solche Komponente wird bei der Interaktion zwischen der Chemikalie und den Zellen direkt oder indirekt beeinflußt.
Die Komponente kann somit die Chemikalie selber sein, so z.B. wenn es das Augenmerk der Untersuchung ist, festzustellen, ob die Chemikalie überhaupt von den Zellen beeinflußt wird. Es wird häufig die Information verlangt werden, ob die Chemikalie von der Zelle aufgenommen wird. Die Erkenntnis, daß eine bestimmte Chemikalie von bestimmten Zellen nicht aufgenommen wird, kann eine erhebliche Bedeutung haben. Auch die Erfassung eines zeitlichen Verlaufs der intrazellulären Konzentration einer Chemikalie kann bedeutende Aufschlüsse in bezug auf Wirksamkeit oder Nebenwirkungen von Chemikalien verschaffen. Die Komponente kann aber genausogut nicht die Chemikalie selbst sondern eine andere Komponente sein, wenn es z.B. das Augenmerk der Untersuchung ist, festzustellen, ob bestimmte intrazelluläre Abläufe in Anwesenheit der Chemikalie verändert werden. Es kann hierbei z.B. untersucht werden, ob die Chemikalie eine Veränderung der Proteinsynthese ganz allgemein, oder der Synthese eines bestimmten Proteins oder der Synthese des Erbmaterials oder der Teilung der Zelle bewirkt. Wenn es eine Untersuchung in bezug auf die Proteinsynthese betrifft, wird die betroffene Komponente möglicherweise eine bestimmte Aminosäure oder zwei Aminosäuren sein, wenn es jedoch eine Untersuchung in bezug auf eine Veränderung der DNA- oder RNA-Synthese betrifft, wird möglicherweise eine der Bestandteile der DNA oder RNA als betroffene Komponente verwendet werden. Wenn wiederum ein anderer Vorgang untersucht wird, können noch andere Komponenten Gegenstand der Untersuchung sein. Es hängt somit von der Fragestellung bei der Untersuchung ab, welche Komponente im einzelnen Gegenstand der Untersuchungen wird.
Die betroffene Komponente welche Gegenstand der Untersuchung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, muß eine ein Signal produzierende Komponente sein. Durch dieses produzierte Signal ist der Untersucher in der Lage, zu erfassen, ob eine Interaktion zwischen Chemikalie und Zellen erfolgt und wie sich diese Interaktion auswirkt.
Das von der betroffenen Komponente produzierte Signal kann ein beliebiges Signal sein. Bedingung ist lediglich, daß ein solches Signal produziert wird und seine Erfassung durch ein Detektionssystem außerhalb des Reaktors erfolgen kann. Ein solches Signal kann z.B. radioaktive Strahlung sein, wenn bei der Durchführung des Verfahrens einen Radiotracer verwendet wird. Eine weitere Möglichkeit betrifft Fluoreszenzstrahlung wenn bei der Durchführung des Verfahrens eine fluoreszierende Komponente eingesetzt wird. Im Rahmen von Untersuchungen welche sich mit dem Einfluß der Zelle auf die Chemikalie befassen, also Untersuchungen mit einem pharmakokinetischen Hintergrund, kann die Chemikalie als betroffene Komponente markiert mit einem radioaktiven Isotop angeboten werden. Die von dem radioaktiven Isotop produzierte Strahlung kann durch einen entsprechenden Radioaktivitätsdetektor außerhalb des Reaktors erfaßt werden. Eine unterschiedliche radioaktive Markierung kann verwendet werden. Für die Auswahl der betreffenden Markierung in der Untersuchung kann aus dem vorhandenen Angebot ausgewählt werden. Die Auswahl wird natürlich dadurch beeinflußt werden, welche Markierungen überhaupt für die beabsichtigte Untersuchung verfügbar oder verwendbar sind. Darüberhinaus gibt es jedoch weitere praktische Überlegungen. Kurzlebige radioaktive Verbindungen haben bei der
Durchführung der Versuche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eindeutige Vorteile, weil es mit solchen Verbindungen mit wesentlich weniger Aufwand möglich ist, in relativ kurzen Abständen in dem gleichen Reaktor separate Versuche durchzuführen. Es stellt sich in bezug auf Reinigung, Entsorgung und Reststrahlung somit sehr vorteilhaft dar, solche kurzlebige Strahler zu verwenden Als solche kurzlebige Strahler kommen z.B. 1 unc} 18Q in
Betracht. Demgegenüber stellen z.B. Untersuchungen mit ^C eindeutige Nachteile dar.
Es wird aber für den Fachmann kein grundsätzlich neues Problem darstellen, zu überlegen, welche Radiotracer sich für seine Fragestellung am besten eignen. Die Anwendung von Radioaktivität in der biologischen Forschung ist ein Routineverfahren, das in vielen Versuchen Anwendung findet.
Es kann auch durchaus in Betracht kommen, in einer Untersuchungen zwei unterschiedliche markierte Verbindungen zu verwenden. Diese Möglichkeit kann nützlich sein, wenn in einer Untersuchung eine direkte Wirkung einer Chemikalie auf einem intrazellulären Vorgang sowie seine Pharmakokinetik erfaßt werden sollen. Bei einer solchen Untersuchung liegt somit eine markierte Chemikalie sowie möglicherweise eine markierte Vorstufe für den intrazellulären Vorgang vor.
Es ist ein weiteres Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß das Signal mit einem Detektionssystem außerhalb des Reaktors erfaßt wird. Es wird im Rahmen der Beschreibung der erfindungsgemäßen Vorrichtung näher auf die Ausführungsform des Detektionssystem eingegangen werden. Die Ausführung wird natürlich primär durch das produzierte Signal bestimmt sein. Bei Messungen an Komponenten mit einem radioaktiven Isotop wird das Detektionssystem ein System umfassen, daß zur Erfassung der radioaktiven Strahlung geeignet ist, während bei der Erfassung von Fluoreszenz eine Ausstattung zur Erfassung von Fluoreszenzstrahlen gewählt wird.
Es stellt ein weiteres bevorzugtes Merkmal der vorliegenden Erfindung dar, daß das im Reaktor von einer der betroffenen Komponenten produzierte Signal, welches außerhalb des Reaktors von einem Detektionssystem erfaßt wird, sofort einem Rechner zugeleitet und weiter verarbeitet wird. Eine solche bevorzugte Ausführungsform hat viele Vorteile. Es ist zunächst erforderlich, eine entsprechende Software vorzubereiten, welche die Verarbeitung der Daten ermöglicht. Ist diese Voraussetzung einmal erfüllt, kann das erfindungsgemäße Verfahren vollautomatisch ablaufen, ohne daß manuelle Handlungen und entsprechende Bindung von bedienendem Personal erforderlich sind. Insbesondere bei einer solchen Ausführungsform wird der große Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich. Die regelmäßige Entnahme von Proben bei dem Verfahren nach dem Stand der Technik, die Notwendigkeit, die entnommenen Proben je nach Reaktionsablauf außerhalb des Reaktors weiter zu bearbeiten, und zum Schluß die erzielten Daten weiterzuverarbeiten, führen zu einem aufwendigen und kostspieligen Ablauf. Dieser Aufwand entfällt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Wo der große Aufwand bei dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik möglicherweise dazu führte, dieses bekannte Verfahren nur gelegentlich bei ganz bestimmten Untersuchungen anzuwenden, liegt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ohne weiteres die Möglichkeit vor, das Verfahren in einem Routinescreening einzusetzen. Es ist z.B. ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß bei Erfassung der Verweildauer der Chemikalie im Prüfsystem die Notwendigkeit entfällt, eine solche Messung durch Beimischung eines Indikators durchzuführen. Diese Beimischung eines Indikators wurde bei dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik beschrieben und war schon alleine deswegen unerwünscht, weil nie gänzlich ausgeschlossen werden konnte, daß eine Wechselwirkung zwischen Chemikalie und Indikator vorliegt. Außerdem konnte nur vermutet werden, daß das Verhalten beider Verbindungen im Verfahren gleichermaßen abläuft. Insbesondere, wenn die Chemikalie von den Zellen aufgenommen und metabolisiert wird, ist die Annahme, daß Indikator und Chemikalie sich gleich verhalten, zweifelhaft.
Das Verfahren wird üblicherweise mit Zellen durchgeführt. Es ist jedoch ausdrücklich daraufhinzuweisen, daß auch eine Anwendung ohne Zellen durchaus in Betracht kommt. Ein einfaches Beispiel ist z.B. eine Untersuchung, welche zur Überprüfung der Spezifizität monoklonaler Antikörper durchgeführt werden kann. Dazu kann man die monoklonalen Antikörper an festen Partikeln binden, wobei die vorstehend beschriebenen wiederum bevorzugt verwendbar sind, um anschließend mit markierten Substraten LTntersuchungen zur Prüfung der Bindung dieser Substrate durchzuführen. Die Abreicherung des markierten Substrats bzw. dessen Anreicherung im Bereich des Wirbel- oder Festbettes erlaubt die
Spezifizität der Bindung sowie die Bestimmung der Bindungskinetik.
Es lassen sich gleichermaßen Untersuchungen zur Beeinflußung des Antikörper-Substrat- Komplexes durch Testsubstanzen und Temperatur- oder pH- Veränderungen durchführen.
Auch weiter unten wird im Rahmen der Beschreibung einiger bevorzugten Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein weitere Möglichkeit einer Verwendung in einem zellfreien System beschrieben.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 6. Die Vorrichtung wurde mit dem Augenmerk erfunden, in dem erfindungsgemäßen Verfahren genutzt zu werden. Somit ist eine Vorrichtung vorgesehen, welche zur Messung der Interaktion von Chemikalien mit Zellen eingesetzt werden soll.
Die Vorrichtung weist einen Reaktor zur Aufnahme der Zellen auf, bzw. gemäß der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, zur Aufnahme der auf festen Partikeln immobilisierten Zellen.
Der Reaktor kann unterschiedlich ausgeführt sein und ist dem Verfahren angepaßt. Häufig wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein Wirbelbett vorgesehen sein und stellt der Reaktor dementsprechend einen Wirbelschichtreaktor dar. In einem Wirbelschichtreaktor wird üblicherweise flüssiges Medium einem die Zellen enthaltenden Reaktorteil mit einer solchen Flußgeschwindigkeit zugeführt, daß die Zellen sich nicht einerseits absetzen können, sondern ständig von dem Flüssigkeitsstrom aufgewirbelt werden, ohne jedoch mitgeführt zu werden.
Solche Wirbelschichtreaktoren werden beispielsweise in P 195 28 871.8 beschrieben. Ein solcher Wirbelschichtreaktor kann z.B. einen zylindrischen Reaktorrohr und ein konisch verjüngtes Ende aufweisen. Bei einem Reaktor mit einem Gesamtvolumen von beispielsweise 50 ml kann das Reaktorrohr einen Durchmesser von 10 - 20 mm aufweisen, das verjüngte Ende demgegenüber einen Durchmesser, welcher dem eines vorgesehenen Umlaufsystems entspricht. Der Wirbelschichtreaktor kann im verjüngten unteren Ende ein Membran oder Filter aufweisen, um zu verhindern, daß Zellen entgegen dem Strom des flüssigen Mediums in das Umlaufsystem gelangen, absolut erforderlich ist dies jedoch nicht, da die Erfahrung mit solchen Wirbelschichtreaktoren gezeigt hat, daß die Zellen bei richtiger Einstellung des
Verfahrens den Bereich des zylindrischen Reaktorrohrs nicht verlassen.
Der Reaktor kann ebenfalls als Festbettreaktor ausgeführt sein. Der Reaktor kann auch dann grundsätzlich ein Format aufweisen, wie es vorstehend in bezug auf einer Ausführung als Wirbelschichtreaktor beschrieben wurde. Auch der Festbettreaktor kann somit einen zylindrischen Reaktorrohr und ein verjüngtes Ende aufweisen. Bei einer Ausführung als Festbettreaktor wird vorzugsweise das flüssige Medium von oben ab durch das Festbett strömen, was selbstverständlich die Anordnung eines Filters, eines Membrans oder eines Siebes in dem Reaktorrohr oder im Abschnitt des verjüngten Endes erforderlich macht.
Auch andere Typen von Reaktoren können in Betracht kommen. Jeder räumliche Anordnung, welche zur Aufnahme von Zellen geeignet ist, kann als Reaktor in der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Betracht kommen.
Der Reaktor wird normalerweise aus Glas bestehen. Auch andere Materialien können in Betracht kommen, aber es läßt sich nicht einfach ausdenken, welche Vorteile eine bestimmte andere Ausführung für die erfindungsgemäße Vorrichtung haben würde, sollte sie in einem anderen Material ausgeführt sein. Glas ist billig, beständig, gut reinigbar, durchsichtig und durchlässig für die Signale welche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren detektiert werden müssen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung muß des weiteren ein Umlaufsystem aufweisen. Es muß vorgesehen sein, das flüssige Medium in der Vorrichtung zu rühren oder zu wirbeln ist, damit eine effektive Homogenisierung des flüssigen Mediums im System vorgenommen werden kann.
Das Umlaufsystem kann jede beliebige Ausführung aufweisen, solange sie einen intensiven und gründlichen Rührvorgang gewährleistet. Es ist eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, daß die Vorrichtung ein Umlaufsystem aufweist, welches am unteren Ende des Reaktors eine erste Öffnung und am oberen Ende des Reaktors eine weitere Öffnung umfaßt, wobei zwischen den beiden Öffnungen eine Leitung angeordnet ist. Durch diese Anordnung wird das flüssige Medium ständig in eine Art Kreislaufbewegung rundgepumpt, wobei für dieses Rundpumpen vorzugsweise eine Umwälzpumpe in der Leitung angeordnet wird.
Die Dimension der Öffnungen in dem Reaktor und das Format der Leitung ist kein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Wenn der Reaktor gemäß der vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform ein Wirbelschichtreaktor ist, welcher aus einem zylindrischen Reaktorrohr mit einem verjüngten unteren Ende besteht, wird die Leitung an dem verjüngten unteren Ende angeschlossen. Der Durchmesser des verjüngten Ende beträgt meistens unter 7,5 mm und bei einem solchen Durchmesser kann in einer relativ einfachen Aufstellung einen Umlaufschlauch verwendet werden. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform wird im oberen Bereich des zylinderförmigen Reaktorrohrs die zweite Öffnung angeordnet, welche bevorzugt den gleichen Durchmesser aufweist, damit für die Leitung zwischen den beiden Öffnungen ein identischer Schlauch verwendet werden kann.
Die Vorrichtung muß Kontrollorgane zur Überwachung der Zusammensetzung des Mediums aufweisen. Reproduzierbare und vergleichbare Untersuchungen setzen gleichbleibende Bedingungen voraus. Konstanz der Zusammensetzung des flüssigen Mediums ist für eine Arbeit mit Zellsystemen wichtig, weil nur so eine ausreichende Vitalität des Systems vorliegt. Es können Parameter wie Konzentration der Inhaltsstoffe des Mediums, Konzentration der Nährstoffe, pH, Osmolarität und Sauerstoffkonzentration mit entsprechenden Sensoren überwacht werden. Die Kontrollorgane wie z.B. eine pH-Sonde, eine pO2-Elektrode oder Fließinjektionsanalytik zur Substrat- und Metabolitanalytik können in dem Reaktor sowie in dem Umlaufsystem angeordnet sein. Idealerweise sind die Kontrollorgane in einem automatisierten Kontrollsystem eingebaut, daß ebenfalls vorsieht, daß eine eventuell erforderliche Anpassung der Zusammensetzung des flüssigen Mediums ebenfalls automatische gesteuert wird. Eine solche Anpassung kann als Zuführ irgendwelcher Inhaltsstoffen oder Nährstoffe (gelöst oder ungelöst), als Zufuhr frisches Mediums oder eine Intensivierung der Begasung vorgenommen werden.
Wie bereits im vorletzten Absatz angedeutet, weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Anordnung zur Begasung des Mediums auf. Mit einer solchen Begasung wird in den meisten Untersuchungen eine Anordnung gemeint, welche speziell Sauerstoff zuführt. Für die meisten biologischen System ist ein bestimmter minimaler Sauerstoffdruck für einen ordentlichen Ablauf der intrazellulären Prozesse eine absolute Voraussetzung. Deswegen kommt auf eine gut funktionierende Anordnung zur Begasung besonders an.
Es kommt nicht auf eine bestimmte Ausführung der Anordnung zur Begasung an. In dem bereits mehrfach zitierten Stand der Technik gemäß P 195 37 033.3 ist eine Anordnung zur Begasung vorgesehen, welche eine Silikonmembran umfaßt, über welche Sauerstoff in das flüssige Medium gelangt. Die Vorrichtung gemäß dem Stand der Technik sah für diese Silikonmembran bevorzugt eine koaxiale Anordnung in dem Reaktorrohr vor. Eine solche koaxiale Anordnung hat in der erfindungsgemäßen Vorrichtung jedoch Nachteile, weil, wie nachfolgend mehr detailliert beschrieben wird, die Vorrichtung ein Detektionssystem umfaßt, und die Anordnung des Silikonmembrans in dem Reaktorrohr mit einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Detektionssystems interferiert. Somit ist es günstiger, die Vorrichtung zur Begasung nicht in dem Reaktorrohr anzuordnen, sondern an irgendeiner Stelle in dem Umlaufsystem.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung muß eine Stelle für die Zudosierung der Chemikalie aufweisen. Dabei kann vorgesehen sein, daß lediglich eine Stelle für die Zudosierung vorgesehen ist, es ist jedoch auch möglich, zwei unterschiedliche Positionen zur Dosierung vorzusehen, wobei eine der beiden Stellen für eine akute Injektion benutzt werden kann, die andere für eine Zudosierung welche als Infusion ausgeführt wird.
Es ist ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung ein Detektionssystem zur Erfassung des bei der Interaktion von der Chemikalie mit der Zelle produzierten Signals aufweist. Bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde bereits dargestellt, daß das Verfahren mit unterschiedlichen Signalen gleichermaßen durchführbar ist oder sogar in einem einzelnen Versuchsdurchgang mit verschiedenen Signalen . Es ist offensichtlich, daß das Detektionssystem an dem jeweiligen Signal angepaßt werden muß. Es spielt jedoch bei der grundsätzlichen Beschreibung der erfindungsgemäßen Vorrichtung keine besondere Rolle, für die Erfassung welcher Signale das Detektionssystem vorgesehen ist. Da die erfindungsgemäße Vorrichtung die Erfassung einer Interaktion einer Chemikalie mit
Zellen bezweckt, wird die Anordnung des Detektionssystems im Bereich des Reaktors wo die
Zellen sich befinden selbstverständlich das meist sinnvolle sein.
Bei einer Versuchsdurchführung mit einer Chemikalie, welche selbst das Signal produziert, wird es mit einer Positionierung des Detektionssystems im Bereich der Zellen möglich sein, zu erfassen, ob die Chemikalie sich im Bereich der Zellen anhäuft und wird ein zeitlicher Verlauf der Signalintensität deutlich werden. Wenn das Signal nicht von der Chemikalie selbst, sondern z.B. von einem Bestandteil der Zelle produziert wird, dessen Beeinflußung es zu studieren gilt, gibt die Erfassung des Signals im Bereich der Zellen Aufschluß darüber, inwieweit die Chemikalie zeitlich eine vermehrte Aufnahme oder Ausschleusung diese Bestandteils bewerkstelligt.
Obwohl eine Vorrichtung mit lediglich einem Detektionssystem somit bei verschiedenen Fragestellungen einen Sinn macht, wird eine weitere mehr bevorzugte Ausführungsform mit zwei Detektionssystemen zu einem besseren Ergebnis führen. Bei dieser mehr bevorzugten Ausführungsform wird sich das erste Detektionssystem im Bereich der Zellen befinden, wie es bereits hiervor bei einer Vorrichtung mit nur einem Detektionssystem beschrieben wurde. Das zweite Detektionssystem jedoch soll an einer Stelle in der Vorrichtung positioniert werden, wo keine Zellen vorliegen. Eine solche bevorzugte Ausführungsform erlaubt eine wesentlich aussagekräftigere Aussage darüber, ob ein bestimmtes Signalniveau im Bereich der Zellen wirklich durch eine Interaktion mit den Zellen zustande kommt oder vielmehr eine generelle Veränderung im gesamten System darstellt, welche letztlich lediglich durch ein Signal auf dem Niveau die Zellen enthaltenden flüssigen Mediums zustandekommt. Durch das zweite Detektionssystem wird es mit einer wesentlicher größeren Genauigkeit und einer höheren Empfindlichkeit möglich sein, Interaktionen zwischen Chemikalien und Zellen zu erfassen. Die Detektion der Signalintensität im umlaufenden Medium und im Wirbelbett erlaubt die kontinuierliche Ermittlung der von den Zellen aufgenommene Chemikalienmenge.
Diese Beschreibung der erfindungsgemäßen Vorrichtung macht deutlich, weshalb eine Ausführungsform der Vorrichtung, welche eine koaxiale Position des Gasmembrans zur Oxygenierung des Mediums vorsieht, in Verbindung mit der Erfassung des Signals im Bereich des Reaktors einen Nachteil darstellt. Die Anordnung des Gasmembrans innerhalb des Reaktors muß unvermeidlich zu Störungen im Meß Vorgang führen. Nicht nur kann die
Anwesenheit des Membrans stören, außerdem wird durch die Anordnung Medium verdrängt und dementsprechend eine Abschwächung des Signals verursacht.
Gemäß einer ersten Ausführungsform ist es vorgesehen, daß das Detektionssystem einen Detektor umfaßt. Gemäß einer weiteren mehr bevorzugten Ausführungsform soll das Detektionssystem zwei getrennte Detektoren umfasse, welche beispielsweise auf gegenüberliegende Seiten des Reaktors angeordnet sind (Koinzidenzmessung). Diese mehr bevorzugte Ausführungsform ist bei einem einzelnen Detektionssystem sowie bei einem zweifachen Detektionssystem gleichermaßen zu bevorzugen.
Gemäß weitere, noch mehr bevorzugte Ausführungsformen, sind noch weitere Detektionssysteme in der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen. Eine erste weitere Anordnung ist im Bereich des Zugangs der Chemikalie vorgesehen, vorausgesetzt, das erfaßte Signal wird von der Chemikalie selber produziert. Der Vorteil dieser Anordnung betrifft die Möglichkeit, eine gezielte und präzise Zudosierung der Chemikalie in das flüssige Medium vorzunehmen, weil mittels der direkten Erfassung des Signals im Zulaufbereich insgesamt die Erhöhung des Signals im System erfaßt wird.
Gemäß noch einer weiteren, ebenfalls bevorzugten Ausführungsform ist ein weiterer Detektor im Bereich des Umlaufsystems vorgesehen. Mit einem an dieser Position angeordneten Detektionssystem ist eine weitere Verfeinerung der Überwachung der Aktivität im System möglich.
Die Detektoren werden je über einen Hauptverstärker und einen Fensterdiskriminator (zur Einstellung auf das verwendete Radionuklid) mit einer Zählerkarte in einem Rechner verbunden, welcher die Daten mit einem entsprechenden Programm anzeigt und/oder speichert.
Das Detektionssystem besteht gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform aus zwei oder mehr Meßköpfen (dies können je nach erfaßten Strahlung z.B. Gamma- Strahlungs- Detektoren sein), einer zugehörigen Standar Ausleseelektronik und einem Datenerfassungssystem (Rechner). Aufgrund der unterschiedlichen Strahlungsenergie welche im Wirbelschichtreaktor nachgewiesen werden sollen, muß ein hoher Dynamikbereich sichergestellt sein.
Für die Ausführung des Meßkopfes bieten sich verschiedene Möglichkeiten an, wie z.B. die
Verwendung von Halbleiter-Detektoren oder Szintillations-Detektoren. Beide Typen von Detektoren sind für Einzel- sowie Koinzidenzmessung geeignet und müssen sorgfältig mit einer Bleiummantelung abgeschirmt werden. Die ionisierende Strahlung kann direkt (Halbleiter) oder indirekt (Szintillation) nachgewiesen werden. Der Szintillator kann sowohl unmittelbar oder über Lichtwellenleiter an den Photomultiplier gekoppelt werden. Um die Empfindlichkeit der Meßanordnung zu erhöhen, können die Detektoren rund um den Reaktor angeordnet werden.
Bei einer Durchführung des Verfahrens mit Radiotracern ist es zum Schutz des bedienenden Personals erforderlich, den Reaktor mit einem Bleischirm abzuschirmen. Die Kollimation der Detektoren auf das jeweilige Gesichtsfeld erfolgt durch Bleiabschirmungen geeigneter Geometrie oder bei Positronenstrahlern optional durch Koinzidenzmessungen.
Das Ziel der Erfindung ist zwar grundsätzlich darauf abgestellt, daß die Untersuchung vollständig am geschlossenen System durchgeführt werden kann und eine Entnahme von Proben aus der Vorrichtung nicht erforderlich ist. Dieses Ziel läßt sich auch erreichen, wenn das erfindungsgemäße Verfahren gemäß der vorstehenden Beschreibung durchgeführt wird. Es können jedoch Untersuchungen beabsichtigt sein, wo eine Entnahme erforderlich ist. Eine solche Entnahme ist z.B. dann erforderlich, wenn die Untersuchung Auskunft über die Identität der von den Zellen hergestellten Metaboliten, über eine Bindung an bestimmten Zellorganellen, über Beschädigungen der Zellen, und ähnliche Auskünfte die nur durch eine anschließende Untersuchung außerhalb der Vorrichtung durchgeführt werden können. In solchen Fällen sieht das erfindungsgemäße Verfahren vor, daß zusätzlich zu den automatische erfaßten und on-line ausgewerteten Untersuchungen zu bestimmten Zeitpunkten Proben genommen werden, welche zur Auswertung außerhalb der Vorrichtung aufgearbeitet werden.
Sollte eine Abnahme von Proben aus der Vorrichtung erforderlich sein, ist in der Vorrichtung eine Entnahmestelle vorgesehen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich grundsätzlich zur Anwendung in Untersuchungen welche zum Ziel haben, die pharmakokinetischen Eigenschaften von Chemikalien zu untersuchen. Das Verfahren ist ebenfalls geeignet, zur Durchführung von Untersuchungen zur
Erfassung der toxischen Eigenschaften von Chemikalien.
Eine weitere Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Messung der Porosität in dem Reaktor.
Unter Porosität eines Wirbel- oder Festbettes versteht man den Anteil des flüssigen Mediums im Bereich des Bettes, welcher sich aus dem Zwischenkornvolumen und den zugänglichen Hohlräumen im Innern der Träger zusammensetzt.
Im zellfreien Reaktor ist die Porosität somit der Quotient aus der im Bereich des Bettes gemessenen Signalintensität und der im trägerfreien Umlauf gemessenen Intensität. Es ist eine Voraussetzung für eine solche Messung, daß die markierte Substanz nicht an den Trägern haftet, weil dies zu einer Anreicherung im Bereich des Bettes führen und somit zu einem falschen Ergebnis führen würde.
Bei einem Wirbelbett führt die Erhöhung des Volumenstroms im Umlauf des Wirbelschichtreaktors zu einer Expansion des Wirbelbettes und damit zu einer Erhöhung der Porosität.
Die Porosität eines Wirbel- oder Festbettes kann mittels kontinuierlicher Datenerfassung ermittelt werden. Die Porosität ist vor allem für verfahrenstechnische Fragestellungen von Interesse.
Eine sehr konkrete Fragestellung kann sich ergeben, wenn im Rahmen einer Untersuchung mit einem an festen Trägern immobilisierten Katalysator die Messung gewünscht wird, ob der immobilisierte Katalysator ausblutet (von den Trägern runtergespült wird). Bei dieser Fragestellung handelt es sich um eine Untersuchung welche in Abwesenheit von Zellen durchgeführt wird. Der Träger welche die Träger als Festbett oder als Wirbelbett enthält wird von einer flüssigen, das Substrat aufweisenden Phase durchströmt. Durch regelmäßige Injektion einer ein Signal produzierende Verbindung, z.B. einem Radiotracer, kann die Porosität des Bettes gemessen werden. Bei einem Verlust des Katalysators wird eine Veränderung der Porosität festgestellt. Beschreibung der Erfindung anhand von Abbildungen.
Figur 1 stellt schematisch eine Versuchsvorrichtung mit Wirbelschichtreaktor. Figur 2 stellt schematische eine Versuchsvorrichtung mit Wirbelschichtreaktor dar. Figur 3 stellt das Ergebnis einer Untersuchung mit 18FDG in der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar.
Figur 4 stellt das Ergebnis einer Untersuchung mit *8FDG an humanen Gliomzellen dar. Figur 5 stellt das Ergebnis einer Porositätsmessung dar.
In der Figur 1 ist schematisch eine erfindungsgemäße Vorrichtung dargestellt. Die Vorrichtung weist einen Reaktor 1 auf, welche aus einem zylindrischen Teil 2 und einem sich verjüngenden Ende 3 besteht. Der Reaktor 1 ist von einem Heizmantel 4 umgeben. Ein Umlaufsystem 6 ist dem Reaktor zugeordnet. Das in dem Reaktor vorhandene flüssige Medium wird mittels einer peristaltischen Umlau umpe 5 dem Reaktor entzogen und ihm über dem Umlaufsystem 6 wieder zugeführt. Das Umlaufsystem 6 besteht in seiner einfachsten Ausführung aus einem Schlauch, welcher an Positionen 8 und 9 an dem Reaktor 1 angeschlossen ist. Bei der Position 7 kann dem Reaktor flüssiges Medium entnommen werden. Dem Umlaufsystem sind Kontrollorgane 10 zugeordnet welche eine laufende Überwachung der Zusammensetzung des Mediums ermöglichen. Die Kontrollorgane 10 umfassen immer eine Sauerstoffsonde aber können ansonsten beliebige Meßgeräte umfassen. Es kann frisches flüssiges Medium zugeführt werden und zwar über die Leitung 11. Die Silikonmembran zur Begasung des flüssigen Mediums ist in einer Anordnung 12 im Umlaufsystem 6 integriert um eine eventuelle Störung der Meßvorgänge im Bereich des Reaktors 1 zu vermeiden. Zugabe von Chemikalien oder einen Signal produzierende Substanzen findet über einer Leitung 15 statt. Die in der Figur 1 gezeigte Anordnung umfaßt eine gemeinschaftliche Zufuhrleitung 15 welche für eine akute Injektion wie für eine Zugabe der Chemikalie oder der ein Signal produzierenden Substanz als Infusion verwendet werden kann. Wird eine akute Injektion vorgenommen, mit welchem Vorgang praktisch eine akute Injektion am Menschen oder am Tier imitiert werden soll, wird die Injektion mittels einer Spritze 16 durch eine Membran 17 in den Teil 18 der Leitung vorgenommen. Ist eine Infusion vorgesehen, wird diese z.B. mittels einer Infüsionspumpe 27 im Teil 19 der Leitung vorgenommen. Die Positionen der Zuführleitung 11, der Kontrollorgane 10, der Begasungsanordnung 12 und der Zuführleitung 15 sind alle dem Umlaufsystem zugeordnet, ihre genaue Position muß jedoch nicht unbedingt sein wie es in der schematischen Figur dargestellt ist, es kommen für die gleiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch andere Positionen in Betracht, wobei auch die
Reihenfolge der Anordnung in dem Umlaufsystem variiert werden kann. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist Detektoren zur Erfassung des bei der Interaktion der Zellen mit der Chemikalie produzierten Signals auf. Die Figur 1 stellt eine Vorrichtung dar, welche zwei Detektoren 20 und 21 umfaßt, wobei der Detektor 20 dem oberen Bereich des Reaktors 1, der Detektor 21 demgegenüber dem unteren Bereich des Reaktors 1 zugeordnet ist. Ein weiterer Detektor 22 ist dem Teil des Umlaufsystems zugeordnet, welcher sich direkt am verjüngten Ende des Reaktors anschließt. Noch ein weiterer Detektor 23 befindet sich an der Zuführleitung 15. Die Detektoren können für bestimmte Strahlenarten oder Fluoreszenzsignale optimiert sein, sie können aus einer Anregungslichtquelle und einer optischen Separierungseinheit zusätzlich zum Detektor bestehen oder auch als Kombination verschiedener Detektionssysteme ausgebildet sein. Der Reaktor 1 ist mit einem Deckel 24 abgeschlossen, welcher mit einem Schraubverschluß mit dem Reaktor verbunden wird. Der Deckel 24 weist Vorrichtungen zur Entnahme von Proben auf, welche hier nicht weiter dargestellt sind. Diese Entnahme kann steril mit einer Sterilbank vorgenommen werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Reaktor 1 mit einem flüssigen Medium gefüllt, welches von der peristaltischen Umlaufpumpe 5 durch das Umlaufsystem 6 gepumpt wird. Bezieht sich die Untersuchung welche durchgeführt werden soll auf einer Reaktion in einem Wirbelbett wird das flüssige Medium durch die peristaltische Pumpe 5 in die Richtung des Pfeiles 25 gefördert. Es spricht von selber, daß bei einer Ausrichtung als Festbett eine Förderung in die entgegengesetzte Richtung vorgesehen wird. Der Reaktor weist in dem flüssigen Medium die festen Partikeln 26 auf, welche durch den konstanten Zustrom des flüssigen Mediums ständig aufgewirbelt werden, ohne jedoch den unteren Bereich des Reaktors 1 zu verlassen. Die on-line-Erfassung erfolgt durch den Detektor 22 als Kontrolle für die Einhaltung der Versuchsbedingungen, durch den Detektor 21 als Indikator für die von den Zellen aufgenommene Aktivität und durch den Detektor 20 als Detektor für die im Medium verbliebene Aktivität. Für die Kalibrierung des Systems d.h. für die quantitative Erfassung der in den Zellen aufgenommenen Aktivität wird erfindungsgemäß eine markierte Testflüssigkeit verwendet. Sie erlaubt durch den Vergleich der Meßdaten der Detektoren 20 und 21 die Bestimmung der markierten Substanzmenge welche sich an den Zellen angelagert hat oder von den Zellen aufgenommen und metabolisiert wird. Die Figur 2 stellt eine weitere mögliche Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung dar. Im Unterschied zu der in der Figur 1 dargestellten Vorrichtung ist hier die Zuführleitung 15 an einer anderen Position im Umlaufsystem vorgesehen. Wesentlicher noch ist die Ausführung des Detektionssystems. Sämtliche Detektoren 20, 21, 22 und 23 sind bei dieser Ausführungsform nicht als einzelne Detektoren sondern als eine doppelte Ausfertigung vorgesehen. Eine solche Ausführung erlaubt eine wesentliche genauere Erfassung der Signalintensität.
Beschreibung der Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen.
Beispiel 1.
Untersuchungen zur Aufnahme von [18F]-markierter Fluordeoxyglukose (18FDG) an humanen Gliomzellen (86HG39) im Wirbelschichtreaktor.
In einem Wirbelscbichtreaktor wurden humane Hirntumorzellen (86HG39) auf offenporige Borosilikatglasträgern (Siran®, Schott, Mainz) immobilisiert und bis zu einer Zelldichte von ca
1*108 Zellen pro Gramm Träger kultiviert. Als Medium kam handelsübliches LMDM mit 10 %-igem Kälberserum zum Einsatz. Der Wirbelschichtreaktor war mit zwei
Szintillationsdetektoren ausgestattet, einer auf der Höhe des Wirbelbettes (entsprechend Detektor 21 in der Figur 1) und einer oberhalb im Bereich des zellfreien Umlaufs (entsprechend Detektor 20 in der Figur 1).
Zu dem in der Figur 3 gekennzeichneten Zeitpunkt wurde der Wirbelscbichtreaktor mit [^8F]- markierter Fluordeoxyglukose (^8FDG) in Form einer Sprungfunktion beaufschlagt.
18FDG wird in der Klinik zur Untersuchung des Glukosestoffwechsels und zur Diagnose von Tumoren genutzt. Die Verbindung wird in die Zellen aufgenommen, aber im Gegensatz zur natürlichen Glukose nicht ver stoffwechselt. Die Signale im Wirbelbett und im zellfreien Umlauf sind in der Figur 3 dargestellt. Aus der Differenz zwischen dem Signal im Wirbelbett und im zellfreien Umlauf (dargestellt in Figur 4) ergibt sich direkt die intrazelluläre Anreicherung des Radiotracers in den immobilisierte Zellen. Der radioaktive Zerfall und der Glasanteil im Wirbelbett wurden durch die Meßdatenerfassung bereits berücksichtigt.
Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden dem Wirbelschichtreaktor Trägerproben mit immobilisierten Zellen entnommen (mittels eines im in der Figur 1 dargestellten Deckel 24 integrierten Trägerprobenahmesystem), um die intrazelluläre Akkumulation des Radiotracers off-line zu bestimmen und mit dem on-line erhaltenen Signal zu vergleichen.
Die Figur 4 zeigt das Ergebnis des Vergleiches der off-line und on-line Bestimmungen. Es ist offensichtlich, daß der Verlauf der Kurve, welche die on-line erfaßte Bindung des Radiotracers an den Partikeln dokumentiert, perfekt mit dem Ergebnis der off-line Bestimmung übereinstimmt.
Beispiel 2.
In einem Wirbelscbichtreaktor befand sich ein Wirbelbett bestehend aus offenporigen Borosilikatglasträgern (Siran®, Schott, Mainz) mit einem Durchmesser von 500 - 560 μm. Als Umlaufmedium wurde bei der Untersuchung entionisiertes Wasser verwendet. Der Reaktor war mit zwei Szintillationsdetektoren ausgestattet, einer auf der Höhe des Wirbelbettes (entsprechend Detektor 21 in der Figur 1) und einer oberhalb im Bereich des zellfreien Umlaufs (entsprechend Detektor 20 in der Figur 1).
Zum Zeitpunkt t=0 wurde eine wäßrige [18F]-markierte Fluoridlösung in das System injiziert (mittels einer Injektion in der Position 18 der Figur 1). Nach ca 5 Minuten hatte sich die Aktivität im Reaktor gleichmäßig durchmischt.
Der Quotient gebildet aus Aktivität im Wirbelbett und der Aktivität im Umlauf entspricht der aktuellen Porosität des Wirbelbettes, dieser Wert wird üblicherweise als Prozentwert dargestellt.
Anschließend wurden mittels der Umlaufpumpe (Umlaufpumpe 5 in der Figur 1) unterschiedliche Volumenströme für den Umlauf eingestellt. In Abhängigkeit vom Volumenstrom änderte sich die Expansion des Wirbelbettes und damit auch die Porosität, welche jeweils wie oben dargestellt durch Quotientenbildung der gemessenen Aktivitäten im Bereich des Wirbelbettes und des Umlaufs on-line gemessen wurde. Die Figur 5 zeigt die so ermittelte Porosität als Funktion des Umlaufvolumenstroms.

Claims

Ansprüche.
1. Verfahren zur Durchführung der Messung einer Interaktion von einer Chemikalie mit in einem Reaktor enthaltenen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß eine der bei der Interaktion zwischen der Chemikalie und den Zellen betroffenen Komponenten eine ein Signal produzierende Komponente darstellt, welches Signal sich zur Erfassung durch ein Detektionssystem außerhalb des Reaktors eignet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Chemikalie in dem Reaktor mittels eines detektierbaren Signals erfaßt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Chemikalie mittels Erfassung der Radioaktivität detektierbar ist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen an festen Partikeln immobilisiert sind.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das detektierbare Signal einem Rechner zugeleitet und on-line verarbeitet wird.
6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur
Messung der Interaktion von Chemikalien mit Zellen in einem flüssigen Medium, umfassend einen Reaktor zur Aufnahme der Zellen, ein Umlaufsystem,
Kontrollorgane zur Überwachung der Zusammensetzung des Mediums, eine Anordnung zur Begasung des Mediums und mindestens einen Eingang für die Chemikalie, dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorrichtung mindestens ein Detektionssystem zur Erfassung der Interaktion angeordnet ist.
7. Vorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Umlaufsystem eine am unteren Ende des Reaktors angeordnete Öffnung umfaßt, welche mittels einer Leitung mit einer am oberen Ende des Reaktors angeordnete Öffnung verbunden ist.
8. Vorrichtung gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß in der Leitung eine Umwälzpumpe angeordnet ist.
9. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktor ein Wirbelschichtreaktor ist.
10.Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
Anordnung zur Begasung des Mediums eine Begasungsmembran zur blasenfreie Begasung umfaßt.
11.Vorrichtung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Anordnung in der Leitung gemäß Anspruch 7 angeordnet ist.
12.Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Anordnung zur Entnahme von Proben angeordnet ist.
13.Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die
Vorrichtung ein Detektionssystem im Bereich der Zellen und ein weiteres Detektionssystem im Bereich des zellfreien Überstands umfaßt.
14.Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Detektionssystem der Leitung gemäß Anspruch 7 zugeordnet ist.
15.Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Detektionssystem dem Eingang für die Chemikalie zugeordnet ist.
16. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Messung von pharmakinetischen Eigenschaften von Chemikalien.
7.Verwendung des Verfahrens gemäß einem der ansprüche 1 bis 4 zur Erfassung von pharmakologischen oder toxischen Eigenschaften von Chemikalien.
8Nerwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Messung der Porosität in einem Wirbelbett oder einem Festbett.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE40393E1 (en) * 2003-11-12 2008-06-24 Icefloe Technologies Inc. Method and apparatus for controlled ice crystal formation in a beverage

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7747390B2 (en) 2003-06-25 2010-06-29 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Digital cell

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4246352A (en) * 1978-12-18 1981-01-20 Buddemeyer Edward U Test sample container
SE448881B (sv) * 1981-03-12 1987-03-23 Erik Walum Apparat for genomforandet av perfusionsodling av en eller flera cellkulturer samt forfarande for perfusionsodling av en eller flera cellkulturer
ZA834672B (en) * 1982-08-31 1984-03-28 Becton Dickinson Co Detection of the presence of biological activity utilizing infrared analysis
US5094955A (en) * 1988-03-15 1992-03-10 Akzo N.V. Device and method for detecting microorganisms
DE4119079C2 (de) * 1991-06-10 1993-10-21 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Bestimmung der Abgabe von biologisch aktiven Stoffen aus Holzwerkstoffen
CA2092372C (en) * 1992-04-24 2000-03-14 Klaus W. Berndt Methods and apparatus for detecting microorganisms in blood culture vials
US5310658A (en) * 1992-10-09 1994-05-10 Becton, Dickinson And Company Method and apparatus for detecting biological activities in a specimen
EP0650396B1 (de) * 1993-05-17 1998-01-14 AMERSHAM INTERNATIONAL plc Vorrichtung und verfahren zum nachweis zellularer und biochemischer prozesse
DE4332163A1 (de) * 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Verfahren und Gerät zur Schadstoffanalyse von Gewässerproben
DE4332165A1 (de) * 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Verfahren und Gerät zur Schadstoffanalyse von Gewässerproben
EP0727480A3 (de) * 1995-02-16 2000-04-12 Forschungszentrum Jülich Gmbh Verfahren zur Bestimmung von Pharmakokinetik bzw. Toxikokinetik von Testsubstanzen mit Hilfe von in-vitro-Zellkultursystemen und dafür geeignete Vorrichtungen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9960094A3 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE40393E1 (en) * 2003-11-12 2008-06-24 Icefloe Technologies Inc. Method and apparatus for controlled ice crystal formation in a beverage

Also Published As

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WO1999060094A2 (de) 1999-11-25

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