EP1064536A2 - Verfahren zur kontrastverstärkung für ein transmissionselektronenmikroskop - Google Patents

Verfahren zur kontrastverstärkung für ein transmissionselektronenmikroskop

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Publication number
EP1064536A2
EP1064536A2 EP99920547A EP99920547A EP1064536A2 EP 1064536 A2 EP1064536 A2 EP 1064536A2 EP 99920547 A EP99920547 A EP 99920547A EP 99920547 A EP99920547 A EP 99920547A EP 1064536 A2 EP1064536 A2 EP 1064536A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
image
contrast
intensities
enhancement method
contrast enhancement
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99920547A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ansgar Haking
Helmut TRÖSTER
Karsten Richter
Michael Trendelenburg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1064536A2 publication Critical patent/EP1064536A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J37/00—Discharge tubes with provision for introducing objects or material to be exposed to the discharge, e.g. for the purpose of examination or processing thereof
    • H01J37/26—Electron or ion microscopes; Electron or ion diffraction tubes
    • H01J37/28—Electron or ion microscopes; Electron or ion diffraction tubes with scanning beams
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
    • G01N23/02—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by transmitting the radiation through the material
    • G01N23/06—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by transmitting the radiation through the material and measuring the absorption

Definitions

  • the invention relates to a method for contrast enhancement for a specific particle in an image of a sample taken by a transmission electron microscope.
  • One aspect of the present invention relates in particular to high-resolution structural analysis by transmission electron microscopy in biological and medical research using immunogold labeling.
  • gold grains with a size between 1 nm and 20 nm are coupled to a specific biomolecule in the electron microscopic sample, so that this molecule can be detected indirectly via the position of the gold grains in the sample. It is assumed that gold as a heavy metal creates a particularly strong contrast in the electron microscope and is therefore clearly visible.
  • the structure of the cell in which the gold-marked molecule is to be detected must also be contrasted, for example to make individual cell compartments visible. This is usually done with uranium and / or lead. Since these elements are also heavy metals, they create a similar contrast to gold, so that the gold grains cannot be clearly identified in many samples.
  • the contrast for a particular particle can be increased by image processing.
  • a calculated, high-contrast image is generated by subtracting background intensities calculated pixel by pixel from the intensities of a first image, the background intensities being calculated as a function of the intensities of a second image.
  • An energy-filtering transmission electron microscope (EFTEM) is used to record the first image in an energy window in which there is an element-specific energy edge of the particular particle.
  • the second picture is taken in an energy window, which is below the element-specific edge for energy values.
  • a background intensity is determined as a linear representation of the intensities of the second image. The determination is made in such a way that this function, which is dependent on the intensities of the second image, is fitted to the intensities of the first image for a sub-area of both images in which none of the specific particles are present.
  • this background intensity is calculated for each pixel of the first image from the intensities of the second image and subtracted from the intensity of the first image.
  • the particular particle has an element-specific energy loss edge, such as the energy loss edge of uranium at 1 20 eV or the energy loss edge of phosphorus at 1 60 eV.
  • not all particles have a specific energy loss edge, which provides a signal that can be selectively displayed in practice.
  • gold has two specific energy loss edges, a first at 60 eV and another at over 2000 eV.
  • the first edge, at 60 eV delivers a weak signal on a high element-unspecific background, so that this signal cannot be displayed selectively in practice.
  • the second edge, at over 2000 eV is not detectable, since the inelastic signals become so weak already at around 1,000 eV that detection is virtually impossible.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a generic contrast enhancement method which has a broader field of application and is not necessarily dependent on the presence of specific energy loss edges.
  • the method is intended to enable contrast enhancement for gold particles in the case of immunogold marking.
  • the invention proposes a generic contrast enhancement method in which the first image is recorded under conditions in which the particle has the highest possible contrast, and in which the second image is recorded in a selected energy window, which is chosen such that the difference in contrast between the two images for the particle differs from the corresponding difference in contrast for at least one second sample component.
  • This inventive method for contrast enhancement differs from the previously described contrast enhancement method by a fundamental difference in the property of that for image processing used images.
  • the images are selected based on the specific energy loss edge of the element whose contrast is to be enhanced.
  • the first image is recorded in an energy window that includes the specific energy loss edge of the element.
  • the second image is taken in an energy window that lies below the specific energy loss edge.
  • any specific energy loss edge of the particle, the contrast of which is to be enhanced is not used.
  • this method is suitable both for particles which have no specific energy loss edge and for particles whose specific energy loss edge does not provide selectively representable signals.
  • this method is particularly suitable for enhancing the contrast of gold.
  • the first image is recorded under conditions in which the particle has the highest possible contrast.
  • This can be, for example, an image of the sample with a transmission electron microscope without an energy filter. It is also possible, and in particular if the particle is a gold particle, it is advantageous to take the first image with an energy window of 0 eV. In the case of an energy-filtering transmission electron microscope, this means that the electrons are selected which have lost no energy.
  • the sample contains a further sample component in addition to the specific particle and the second sample component, it may be advantageous if at least one further image is recorded in a further, selected energy window, which is selected such that the contrast difference between the first and the another image and / or the second and the further image for the particle and / or for the second Sample component differs from the corresponding contrast difference for the other sample component.
  • This provides a set of images in which the second image and the further image each selectively contain information about two sample components.
  • the background intensities can be calculated as a linear representation of the intensities of the second and the further image.
  • the background intensities are represented as a polynomial of the first or higher (1st - 3rd) degree by the intensities of the second and the further image.
  • the background intensity function is advantageously obtained by fitting the intensities of the first image. If the background intensity function comprises a linear mapping, the corresponding coefficients can be determined by any known statistical fitting method.
  • the time required for this can also be reduced by fitting only for selected pixels arranged in a matrix.
  • a pixel matrix 1,024 x 1,024 pixels thus result in approximately 1,000 image pixels which are used to determine the background intensity function.
  • a pixel matrix to fit the background intensity function is also inventive independently of the other features of the contrast enhancement method according to the invention. It has been shown that individual pixels of the pixel matrix which happen to represent one of the specific particles, for example gold, are of no importance for the fitting carried out.
  • the selected pixels arranged in the matrix can be selected that are based on an image of the particular one Particles lie.
  • the background intensity function can then be fitted again to the intensities of the first image, the pixels selected in this way not being taken into account in the matrix or being replaced by other pixels.
  • This second step in which the matrix is adapted to any special circumstances that may exist, can also be carried out automatically, so that this method is still suitable for automated particle evaluation.
  • a particle of the sample has a specific energy loss edge which supplies a selectively representable signal
  • the present contrast enhancement method according to the invention in this case uses the specific energy loss edge of another particle in order to increase the contrast for the particular particle. No use is made of any energy loss edge of the particular particle.
  • the sample comprises uranium, for example, it is advantageous if an image is taken at an energy window of 1 20 eV, the specific energy loss edge of uranium.
  • relative contrast denotes the manner in which a particle stands out from the background or from the background intensity in a specific one. Depending on the selected energy window and the particles, these may appear lighter or darker than the environment. In this respect, the concept of the sign of the relative contrast refers to whether a particle is shown lighter or darker than the background.
  • gold grains appear darker than the surroundings, with these providing the strongest negative contrast at 0 eV. Above 70 eV, the gold grains are shown lighter.
  • the energy window of the second image and / or a further image such that the relative contrast of a second sample component in either this image or the first image has the same sign as another sample component, while the relative contrast of the second sample component in the other image has an opposite sign as the other sample component.
  • 1 a is an image of a sample with an energy window of 0 eV with a
  • Fig. 1 c is an image of the sample with an energy window between 1 1 5 eV and
  • 3a is a schematic sample sample in section
  • FIG. 3b shows a schematic representation of measured intensities in images of the sample according to FIG. 3a
  • 3c shows the gold signal calculated from the intensities according to FIG. 3b
  • FIG. 5 shows the calculated gold distribution in superimposition with the 0 eV image according to FIG. 1a.
  • the exemplary embodiment comprises a sample in which an ultrathin section of a cell with uranium and lead was made visible, in which the DNA was labeled with 6 nm gold grains.
  • the image was chosen at 0 eV because it provides the strongest contrast for the gold grains.
  • the window between 1 1 5 and 1 25 eV was chosen because the element-specific energy loss edge of uranium lies in this area and uranium can thus be displayed selectively in this window.
  • the intensity of the background ⁇ ⁇ was calculated as a linear function of the intensities at 45 eV (l 45 ) and at 1 20 eV (l 120 ).
  • the sample consists of a cut, which has a uniform thickness, but with which the density varies.
  • the dark gray stands for a high-density area.
  • a spot with uranium and a grain of gold is shown.
  • the contrast for uranium in the 45 eV image is similar to that for gold.
  • the difference between gold and uranium is clear in the 1 20 eV picture. While gold only creates a weak positive contrast, the intensity for uranium is much stronger.
  • FIG. 4 The gold distribution calculated for each pixel after the fitting is shown as a binarized result image in FIG. 4, while FIG. 5 shows a superposition of the intensities at 0 eV and the binarized result image.
  • a gold-labeled biomolecule used for a localization examination for example antibodies, DNA or RNA probe.
  • a simultaneous consideration of the uranium and / or lead contrast also present in the sample is possible, which is essential for the structural recognition of the entire cell topology.
  • the contrast of the gold particles appears to be strongly emphasized, while the contrast of the cell structure is lowered in a defined manner, so that the position and number of gold grains in relation to the underlying cell structure is clearly defined.

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Abstract

Es soll ein Verfahren zur Kontrastverstärkung für ein bestimmtes Teilchen in einem von einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommenen Bild einer Probe bereitgestellt werden, bei welchem ein errechnetes, kontrastreiches Bild dadurch erzeugt wird, daß von den Intensitäten eines ersten Bildes errechnete Untergrundintensitäten pixelweise abgezogen werden, wobei die Untergrundintensitäten als Funktion der Intensitäten eiens zweiten Bildes errechnet werden. Hierbei soll dieses Verfahren einen breiteren Anwendungsbereich als bisher bekannte Verfahren aufweisen und insbesondere zur Kontrastverstärkung für Goldpartikel bei der Immunogoldmarkierung geeignet sein. Hierfür wird vorgeschlagen, daß das erste Bild unter Bedingungen aufgenommen wird, bei welchen das Teilchen eine möglichst hohen Kontrast aufweist und daß das zweite Bild in einem ausgewählten Energiefenster aufgenommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwischen den beiden Bildern für das Teilchen von dem entsprechenden Kontrastunterschied für wenigstens einen zweiten Probenbestandteil unterscheidet.

Description

Verfahren zur Kontrastverstärkung für ein Transmissionselektronenmikroskop
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrastverstärkung für ein bestimmtes Teilchen in einem von einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommenen Bild einer Probe.
Ein Aspekt vorliegender Erfindung betrifft insbesondere die hochauflösende Strukturanalyse durch die Transmissionselektronenmikroskopie in der biologischen und medizinischen Forschung mittels Immunogoldmarkierung. Hierbei werden Goldkörner von einer Größe zwischen 1 nm und 20 nm an ein bestimmtes Biomolekül in der elektronenmikroskopischen Probe gekoppelt, so daß dieses Molekül indirekt über die Position der Goldkörner in der Probe nachgewiesen werden kann. Hierbei wird davon ausgegangen, daß Gold als ein Schwermetall einen besonders starken Kontrast im Elektronenmikroskop erzeugt und damit deutlich sichtbar ist.
Jedoch muß die Struktur der Zelle, in der das Gold markierte Molekül detektiert werden soll, ebenfalls kontrastiert werden, um beispielsweise einzelne Zellkom- partimente sichtbar zu machen. Dies geschieht in der Regel mit Uran und/oder Blei. Da diese Elemente ebenfalls Schwermetalle sind, erzeugen sie einen ähnlichen Kontrast wie Gold, so daß die Goldkörner in vielen Proben nicht eindeutig identifiziert werden können.
Um die Identifizierung zu erleichtern, könnten größere Goldkörner verwendet werden. Bei größeren Goldkörnern ist jedoch die Spezifität der Kopplung an das Molekül erheblich reduziert. Auch könnte man eine höhere Vergrößerung wählen. Diese würde jedoch nur noch einen kleineren Ausschnitt der Zelle abbilden, der allein nicht immer aussagekräftig ist. Des weiteren könnte nach der Goldmarkie- rung gezielt Silber an die Goldkörner angelagert werden, so daß um die Goldkörner ein Silbermantel entsteht und sich der Kontrast erheblich verstärkt. Jedoch geschieht eine derartige Silberanlagerung nicht bei allen Goldkörnern, so daß deren Kontrast nicht gleichmäßig verstärkt werden würde.
Nach einem anderen Ansatz kann durch Bildverarbeitung der Kontrast für ein bestimmtes Teilchen angehoben werden. Hierbei wird ein errechnetes, kontrastreiches Bild dadurch erzeugt, daß von den Intensitäten eines ersten Bildes errechnete Untergrundintensitäten pixelweise abgezogen werden, wobei die Untergrundintensitäten als Funktion der Intensitäten eines zweiten Bildes errechnet werden. Dabei wird mit einem energiefilternden Transmissionselektronenmikroskop (EFTEM) das erste Bild in einem Energiefenster aufgenommen, in welchem eine elementspezifische Energiekante des bestimmten Teilchens liegt. Das zweite Bild wird in einem Energiefenster aufgenommen, welches bei Energiewerten unter der elementspezifischen Kante liegt.
In einem hierauf folgenden, bildverarbeitenden Schritt wird eine Untergrundintensität als lineare Abbildung der Intensitäten des zweiten Bildes bestimmt. Die Bestimmung erfolgt derart, daß diese von den Intensitäten des zweiten Bildes abhängige Funktion für einen Teilbereich beider Bilder, in welchen keines der bestimmten Teilchen vorhanden ist, an die Intensitäten des ersten Bildes angefit- tet wird.
Nachdem auf diese Weise die funktionale Abhängigkeit der Untergrundintensitäten des ersten Bildes von den Intensitäten des zweiten Bildes bestimmt wurde, wird diese Untergrundintensität für jedes Pixel des ersten Bildes aus den Intensitäten des zweiten Bildes errechnet und von der Intensität des ersten Bildes subtrahiert.
Auf diese Weise wird ein errechnetes Bild gewonnen, in welchem der Kontrast für das bestimmte Teilchen verstärkt ist. Voraussetzung zur Durchführung dieses Verfahrens ist, daß das bestimmte Teilchen eine elementspezifische Energieverlustkante, wie zum Beispiel die Energieverlustkante von Uran bei 1 20 eV oder die Energieverlustkante von Phosphor bei 1 60 eV, aufweist.
Jedoch weisen nicht alle Partikel eine spezifische Energieverlustkante auf, die ein in der Praxis selektiv darstellbares Signal liefert. Zum Beispiel weist zwar Gold zwei spezifische Energieverlustkanten, eine erste bei 60 eV und eine andere bei über 2000 eV, auf. Die erste Kante, bei 60 eV, liefert jedoch ein schwaches Signal auf hohem elementunspezifischem Untergrund, so daß sich dieses Signal in der Praxis nicht selektiv darstellen läßt. Die zweite Kante, bei über 2000 eV, ist nicht detektierbar, da schon bei etwa 1 000 eV die inelastischen Signale so schwach werden, daß eine Detektion quasi nicht mehr möglich ist.
Vorliegender Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein gattungsgemäßes Kontrastverstärkungsverfahren bereitzustellen, welches einen breiteren Anwendungsbereich aufweist und nicht zwingend auf das Vorhandensein spezifischer Energieverlustkanten angewiesen ist. Insbesondere soll das Verfahren eine Kontrastverstärkung für Goldpartikel bei der Immunogoldmarkierung ermöglichen.
Als Lösung schlägt die Erfindung ein gattungsgemäßes Kontrastverstärkungsverfahren vor, bei welchem das erste Bild unter Bedingungen aufgenommen wird, bei welchen das Teilchen einen möglichst hohen Kontrast aufweist, und bei welchem das zweite Bild in einem ausgewählten Energiefenster aufgenommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwischen den beiden Bildern für das Teilchen von dem entsprechenden Kontrastunterschied für wenigstens einen zweiten Probenbestandteil unterscheidet.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren zur Kontrastverstärkung unterscheidet sich von dem vorgehend beschriebenen Kontrastverstärkungsverfahren durch einen grundlegenden Unterschied in der Eigenschaft der für die Bildverarbeitung verwendeten Bilder. Bei dem nach dem Stand der Technik arbeitenden Kontrastverstärkungsverfahren werden die Bilder nach der spezifischen Energieverlustkante des Elementes ausgewählt, dessen Kontrast verstärkt werden soll. Das erste Bild wird hierbei in einem Energiefenster aufgenommen, welches die spezifische Energieverlustkante des Elementes einschließt. Das zweite Bild wird in einem Energiefenster aufgenommen, welches unterhalb der spezifischen Energieverlustkante liegt.
Bei den Bildern nach dem erfindungsgemäßen Kontrastverstärkungsverfahren hingegen findet eine gegebenenfalls vorhandene spezifische Energieverlustkante des Teilchens, dessen Kontrast verstärkt werden soll, keine Anwendung. Insofern eignet sich dieses Verfahren sowohl für Teilchen, die keine spezifische Energieverlustkante aufweisen, als auch für Teilchen, deren spezifische Energieverlustkante keine selektiv darstellbaren Signale liefert. Insbesondere hat sich herausgestellt, daß dieses Verfahren zur Kontrastverstärkung von Gold besonders geeignet ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Kontrastverstärkungsverfahren wird das erste Bild unter Bedingungen aufgenommen, bei welchen das Teilchen einen möglichst hohen Kontrast aufweist. Dieses kann zum Beispiel ein Bild der Probe mit einem Transmissionselektonenmikroskop ohne Energiefilter sein. Ebenso ist es möglich und insbesondere, wenn das Teilchen ein Goldpartikel ist, vorteilhaft, das erste Bild bei einem Energiefenster von 0 eV aufzunehmen. Dieses bedeutet bei einem energiefilternden Transmissionselektonenmikroskop, daß die Elektronen selektiert werden, die keine Energie verloren haben.
Wenn die Probe neben dem bestimmten Teilchen und dem zweiten Probenbestandteil noch einen weiteren Probenbestandteil enthält, kann es vorteilhaft sein, wenn wenigstens ein weiteres Bild in einem weiteren, ausgewählten Energiefenster aufgenommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwischen dem ersten und dem weiteren Bild und/oder dem zweiten und dem weiteren Bild für das Teilchen und/oder für den zweiten Probenbestandteil von dem entsprechenden Kontrastunterschied für den weiteren Probenbestandteil unterscheidet.
Hierdurch wird ein Satz Bilder bereitgestellt, bei welchem das zweite Bild und das weitere Bild jeweils selektiv Informationen über zwei Probenbestandteile enthalten.
Auf diese Weise ist es möglich, die Untergrundintensitäten als Funktion der Intensitäten des zweiten und des weiteren Bildes zu errechnen. Insbesondere können die Untergrundintensitäten als lineare Abbildung der Intensitäten des zweiten und des weiteren Bildes errechnet werden.
Ausreichend gute Ergebnisse bei minimalem Rechenaufwand lassen sich bereits erzielen, wenn die Untergrundintensitäten als Polynom ersten oder höheren ( 1 .- 3.) Grades durch die Intensitäten des zweiten und des weiteren Bildes dargestellt werden. Bei einer derartigen Darstellung genügt es, einen additiven Koeffizienten sowie für jede der Intensitäten des zweiten und des weiteren Bildes jeweils einen multiplikativen Koeffizienten zu ermitteln.
Vorteilhafterweise wird die Untergrundintensitätenfunktion durch Fitten an die Intensitäten des ersten Bildes gewonnen. Umfaßt die Untergrundintensitätenfunktion eine lineare Abbildung, so können die entsprechenden Koeffizienten durch jedes bekannte statistische Fittverfahren ermittelt werden.
Es versteht sich, daß bei einem Polynom ersten Grades, bei welchem lediglich drei Koeffizienten zu ermitteln sind, die zur Bestimmung der Untergrundintensitätenfunktion notwendige Zeit minimiert wird.
Die hierfür benötigte Zeit läßt sich des weiteren dadurch reduzieren, daß das Fitten lediglich für selektierte, in einer Matrix angeordnete Pixel erfolgt. Insbesondere ist es möglich, jedes zehnte Pixel jeder zehnten Pixelreihe zur Bestimmung der Untergrundintensitätenfunktion zu verwenden. Bei einer Pixelmatrix von 1 024 x 1 024 Bildpunkten ergeben sich somit in etwa 1 0.000 Bildpixel, die zur Bestimmung der Untergrundintensitätenfunktion verwendet werden.
Insofern ist die Verwendung einer Pixelmatrix zum Fitten der Untergrundintensitätenfunktion auch unabhängig von den übrigen Merkmalen des erfindungsgemäßen Kontrastverstärkungsverfahrens erfinderisch. Es hat sich gezeigt, daß einzelne Pixel der Pixelmatrix, die zufällig eines der bestimmten Teilchen, zum Beispiel Gold, darstellen, bei dem vorgenommenen Fitten nicht ins Gewicht fallen.
Sollte sich nach Errechnung des kontrastreichen Bildes herausstellen, daß eine nur unzureichende Kontrastverstärkung vorliegt - dieses kann an einer zu hohen Dichte der bestimmten Teilchen (Gold) liegen -, können diejenigen selektierten, in der Matrix angeordneten Pixel ausgewählt werden, die auf einem Abbild des bestimmten Teilchen liegen. Anschließend kann die Untergrundintensitätenfunktion nochmals an die Intensitäten des ersten Bildes gefittet werden, wobei in der Matrix die derart ausgewählten Pixel nicht berücksichtigt oder durch andere Pixel ersetzt werden. Auch dieser zweite Schritt, bei welchem die Matrix gegebenenfalls vorhandenen, besonderen Gegebenheiten angepaßt wird, ist automatisch durchführbar, so daß nach wie vor dieses Verfahren für eine automatisierte Partikelauswertung geeignet ist.
Es versteht sich, daß bei weiteren Probenbestandteilen noch weitere Bilder bei entsprechenden Energiefenstern aufgenommen und entsprechend verarbeitet werden können.
Weist ein Partikel der Probe eine spezifische Energieverlustkante auf, die ein selektiv darstellbares Signal liefert, ist" es vorteilhaft, daß Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart zu wählen, daß in diesem die partikelspezifische Energiekante, vorzugsweise eine elementspezifische Energiekante, dieses Probenbestandteils liegt. Hierdurch ist es möglich, diesen Probenbestandteil besonders selektiv zu detektieren und entsprechend genau diesbezüglich die Untergrundintensitätenfunktion zu bestimmen.
In diesem Zusammenhang ist festzuhalten, daß das vorliegende, erfindungsgemäße Kontrastverstärkungsverfahren in diesem Falle gerade die spezifische Energieverlustkante eines anderen Partikel nutzt, um den Kontrast für das bestimmte Teilchen zu verstärken. Von einer eventuell vorhandenen Energieverlustkante des bestimmten Teilchens wird kein Gebrauch gemacht.
Umfaßt die Probe zum Beispiel Uran, so ist es vorteilhaft, wenn ein Bild bei einem Energiefenster von 1 20 eV, der spezifischen Energieverlustkante von Uran, aufgenommen wird .
Es ist des weiteren möglich, daß Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart zu wählen, daß der relative Kontrast des Teilchens in entweder diesem Bild oder dem ersten Bild dasselbe Vorzeichen aufweist wie ein weiterer Probenbestandteil, während der relative Kontrast des Teilchens in dem jeweils anderen Bild ein entgegengesetztes Vorzeichen, wie der weitere Probenbestandteil, aufweist.
Hierbei bezeichnet der Begriff "relativer Kontrast" die Art, wie sich ein Partikel in einem bestimmten vom Untergrund bzw. von der Hintergrundintensität abhebt. Je nach gewähltem Energiefenster und je nach Partikel können diese heller oder dunkler als die Umgebung erscheinen. Insofern bezieht sich der Begriff des Vorzeichens des relativen Kontrastes darauf, ob ein Partikel gegenüber dem Untergrund heller oder dunkler abgebildet wird.
Die . Tatsache, daß ein bestimmter Probenbestandteil in einem Bild mit einem anderen Vorzeichen abgebildet wird, als das Teilchen, dessen Kontrast verstärkt werden soll, und in einem anderen Bild mit demselben Vorzeichen abgebildet wird, wie das bestimmte Teilchen, ermöglicht eine verhältnismäßig gute Selektion dieses Probenbestandteils und somit eine entsprechend genaue Bestimmung der Untergrundintensitätenfunktion. Eine derartige Kontrasteigenschaft zeichnet insbesondere Schwermetalle, also auch Gold, von den übrigen, üblichen Probenmaterialien aus. So erscheinen Schwermetalle bei niedrigen Energien dunkler als ihre Umgebung . Ab einem bestimmten Energiewert hingegen werden diese heller abgebildet.
Im Einzelnen erscheinen etwa bis 60 eV Goldkörner dunkler als die Umgebung, wobei diese bei 0 eV den stärksten negativen Kontrast liefern. Über 70 eV werden die Goldkörner heller abgebildet.
Insofern hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn ein weiteres Bild bei einem Energiefenster von 40 eV aufgenommen wird.
Überraschenderweise hat sich darüber hinaus herausgestellt, daß bei einer uran- und bleikontrastierten Probe mit Immunogoldmarkierung, die mit Bildern bei 0 eV, 40 eV und 1 20 eV aufgenommen wurden, Signale von sowohl Uran als auch Blei, sowie Signale, die durch die Dicke der Probe bedingt sind, erfolgreich gefiltert werden können, und im wesentlichen das reine Goldsignal übrig bleibt.
Dementsprechend ist es auch möglich, das Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart zu wählen, daß der relative Kontrast eines zweiten Probenbestandteils in entweder diesem Bild oder dem ersten Bild dasselbe Vorzeichen aufweist, wie ein weiterer Probenbestandteil, während der relative Kontrast des zweiten Probenbestandteils in dem jeweils anderen Bild ein entgegengesetztes Vorzeichen, wie der weitere Probenbestandteil, aufweist.
Weitere Vorteile, Ziele und Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachfolgend in der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels und anliegender Zeichnung erläutert. In der Zeichnung zeigen:
Fig. 1 a ein Bild einer Probe bei einem Energiefenster von 0 eV mit einer
Vergrößerung von M = 40O0, Fig. 1 b ein Bild der Probe bei einem Energiefenster zwischen 40 eV und 50 eV,
Fig. 1 c ein Bild der Probe bei einem Energiefenster zwischen 1 1 5 eV und
1 25 eV,
Fig. 2 Bilder von Goldkörnern aus der Probe nach Figur 1 bei hoher Vergrößerung (M = 31 500) und verschiedenen Energieverlustwerten,
Fig. 3a eine schematische Beispielprobe im Schnitt,
Fig. 3b eine schematische Darstellung gemessener Intensitäten bei Bildern der Beispielprobe nach Figur 3a,
Fig. 3c das aus den Intensitäten nach Figur 3b errechnete Goldsignal,
Fig. 4 die aus Fign. 1 a bis 1 c errechnete Goldverteilung, und
Fig. 5 die errechnete Goldverteilung in Überlagerung mit dem 0 eV-Bild nach Figur 1 a.
Das Ausführungsbeispiel umfaßt eine Probe, bei welcher ein Ultradünnschnitt einer Zelle mit Uran und Blei sichtbar gemacht wurde, in welcher die DNA mit Goldkörnern von 6 nm markiert wurde.
Von der Probe wurden Aufnahmen mit einem energiefilternden Transmissions- elektonenmikroskop gemacht, wobei Elektronen selektiert wurden, die keine Energie verloren haben, (Figur 1 a), die zwischen 40 und 50 eV verloren haben (Figur 1 b) und die zwischen 1 1 5 und 1 25 eV verloren haben (Figur 1 c).
Hierbei wurde das Bild bei 0 eV gewählt, weil es den stärksten Kontrast für die Goldkörner liefert. Das Fenster zwischen 1 1 5 und 1 25 eV wurde gewählt, weil in diesem Bereich die elementspezifische Energieverlustkante des Uran liegt und sich Uran somit in diesem Fenster gut selektiv darstellen läßt.
Für die Wahl des Energiefensters zwischen 40 und 50 eV wurde eine andere Kontrasteigenschaft von Schwermetallen, speziell von Gold, ausgenutzt, die es ermöglicht, daß Goldsignal vom Untergrund zu trennen. Diese Eigenschaft ist in Figur 2 dargestellt. Hierbei wurden Goldkörner aus der in Figuren 1 a bis 1 c dargestellten Probe bei hoher Vergrößerung und bei verschiedenen Energieverlustwerten aufgenommen. Wie aus Figur 2 ersichtlich, erscheinen bis etwa 60 eV die Goldkörner dunkler als die Umgebung, wobei diese bei 0 eV den stärksten negativen Kontrast liefern. Zwischen 70 und 1 20 eV werden die Goldkörner heller abgebildet. Ab etwa 1 1 0 eV sind die Goldkörner nicht mehr zu erkennen, da das Signal vom Uran dominiert wird .
Um den Kontrast der Goldkörner vom Untergrund zu trennen, wurde die Intensität des Untergrundes \υ als lineare Funktion von den Intensitäten bei 45 eV (l45) und bei 1 20 eV (l120) berechnet.
= co+ C1/45 + C^Λ 20
Um die Intensität des Untergrundes zu berechnen, wurden von den 1 .024 x 1 .024 Pixeln der Bilder jedes zehnte Pixel jeder zehnten Pixelreihe ausgewählt und anschließend die Funktion der Untergrundintensitäten lυ für die etwa 10.000 Pixeln in ihren Koeffizienten Cg, C, und c2 an die Intensitäten bei 0 eV (^) angefittet.
Nachdem auf diese Weise die Funktion der Untergrundintensität bestimmt war, wurde für jedes Pixel die Untergrundintensität von der Intensität bei 0 eV abge¬ zogen,
so daß im wesentlichen nur noch der durch das Gold verursachte Kontrast übrig blieb. Schematisch ist dies in Figur 3 dargestellt. Die Probe besteht aus einem Schnitt, der zwar eine gleichmäßige Dicke hat, bei dem aber die Dichte variiert. Hierbei steht das dunkle Grau für eine Stelle hoher Dichte. Zusätzlich ist eine Stelle mit Uran und ein Goldkorn dargestellt. Zwischen dem Bild bei 0 eV und den Bilden bei 45 eV und 1 20 eV ergibt sich für die Probe ohne Schwermetalle eine Kon- trastumkehr. Der Kontrast für Uran ist in dem 45 eV-Bild ähnlich wie für Gold. Der Unterschied zwischen Gold und Uran wird im 1 20 eV-Bild deutlich. Während Gold nur einen schwachen positiven Kontrast erzeugt, ist die Intensität für Uran sehr viel stärker. In diesem Beispiel ergeben die Konstanten c0 = 0, c, = 1 und c2 = 1 das reine Goldsignal.
Die nach dem Fitten errechnete Goldverteilung für jedes Pixel ist als binarisiertes Ergebnisbild in Figur 4 dargestellt, während Figur 5 eine Überlagerung der Intensitäten bei 0 eV und des binarisierten Ergebnisbildes darstellt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, den Kontrast eines für eine Lokalisationsuntersuchung verwendeten, goldmarkierten Biomoleküls (zum Beispiel Antikörper, DNA- oder RNA- Sonde) differentiell und selektiv zu optimieren. Hierbei ist eine gleichzeitige Berücksichtigung des in der Probe ebenfalls vorhandenen Uran- und/oder Bleikontrasts möglich, welcher zur Strukturerkennung der gesamten Zelltopologie unerläßlich ist.
Als Endresultat der Kontrastoptimierung erscheint der Kontrast der Goldpartikel stark hervorgehoben, während der Kontrast der Zellstruktur definiert abgesenkt wird, so daß die Position und Zahl der Goldkörner in Bezug zur unterliegenden Zellstruktur eindeutig definiert ist.
Somit ist es mit diesem Verfahren möglrch, ein Experiment, bei dem ein Biomolekül mit Gold markiert wurde, objektiver und sicherer als bisher auszuwerten. So kann das Ergebnisbild binarisiert und auf das 0 eV-Bild gelegt werden, so daß genauere Aussagen über die Verteilung des betreffenden Moleküls in der Zelle möglich sind. Zudem sollte es möglich sein, diese Bilder automatisch, zum Beispiel computergestützt, auswerten zu lassen.

Claims

Patentansprüche:
1 . Verfahren zur Kontrastverstärkung für ein bestimmtes Teilchen in einem von einem Transmissionselektonenmikroskop aufgenommenen Bild einer Probe, bei welchem ein errechnetes, kontrastreiches Bild ( lE ) dadurch erzeugt wird, daß von den Intensitäten ( l0) eines ersten Bildes errechnete Untergrundintensitäten (\υ) pixelweise abgezogen werden, wobei die Untergrundintensitäten als Funktion der Intensitäten (l45, l120) eines zweiten Bildes errechnet werden, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Bild unter Bedingungen aufgenommen wird, bei welchen das Teilchen einen möglichst hohen Kontrast aufweist, und daß das zweite Bild in einem ausgewählten Energiefenster aufgenommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwischen den beiden Bildern für das Teilchen von dem entsprechenden Kontrastunterschied für wenigstens einen zweiten Probenbestandteil unterscheidet.
2. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein weiteres Bild in einem weiteren, ausgewählten Energiefenster aufgenommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwischen dem ersten und dem weiteren Bild und/oder dem zweiten und dem weiteren Bild für das Teilchen und/oder für den zweiten Probenbestandteil von dem entsprechenden Kontrastunterschied für wenigstens einem weiteren Probenbestandteil unterscheidet.
3. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Untergrundintensitäten (\υ) als Funktion der Intensitäten (l45, l120) des zweiten und weiteren Bildes errechnet werden.
4. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Untergrundintensitäten (ly) als lineare Abbildung der Intensitäten (l45, l120) des zweiten und des weiteren Bildes errechnet werden.
5. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Untergrundintensitäten (!,_>) als Polynom 1 . oder höheren Grades durch die Intensitäten (l45, l120) des zweiten und des weiteren Bildes dargestellt werden.
6. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Untergrundintensitätenfunktion (\v) durch Fitten an die Intensitäten (l0) des ersten Bildes gewonnen wird.
7. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Fitten für selektierte, in einer Matrix angeordnete Pixel erfolgt.
8. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß nach Errechnung des kontrastreichen Bildes diejenigen selektierten, in der Matrix angeordneten Pixel ausgewertet werden, die auf einem Abbild des bestimmten Teilchens liegen, und anschließend die Untergrundintensitätenfunktion nochmals an die Intensitäten des ersten Bildes gefittet wird, wobei in der Matrix die derart ausgewählten Pixel nicht berücksichtigt oder durch andere Pixel ersetzt werden.
9. Kontrastverstärkungsverfahren h-ach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Energiefenster des zweiten Bildes und/- oder eines weiteren Bildes derart gewählt ist, daß in diesem eine partikelspezifische, vorzugsweise elementspezifische, Energiekante eines Probenbestandteils liegt.
0. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Energiefenster des zweiten Bildes und/- oder eines weiteren Bildes derart gewählt ist, daß der relative Kontrast des Teilchens in entweder diesem Bild oder dem ersten Bild dasselbe Vorzeichen aufweist, wie ein weiterer Probenbestandteil, während der relative Kontrast des Teilchens in dem jeweils anderen Bild ein entgegengesetztes Vorzeichen, wie der weitere Probenbestandteil, aufweist.
1 . Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 0, dadurch gekennzeichnet, daß das Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart gewählt ist, daß der relative Kontrast eines zweiten Probenbestandteils in entweder diesem Bild oder dem ersten Bild dasselbe Vorzeichen aufweist wie ein weiterer Probenbestandteil, während der relative Kontrast des zweiten Probenbestandteils in dem jeweils anderen Bild ein entgegengesetztes Vorzeichen, wie der weitere Probenbestandteil, aufweist.
1 2. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das bestimmte Teilchen Gold ist.
1 3. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Bild bei einem Energiefenster von 0 eV aufgenommen wird.
14. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Bild bei einem Energiefenster von 40 eV aufgenommen wird.
1 5. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Bild bei einem Energiefenster von 120 eV aufgenommen wird.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004212355A (ja) * 2003-01-09 2004-07-29 Hitachi Ltd バイオ電子顕微鏡及び試料の観察方法
TWI753739B (zh) 2021-01-08 2022-01-21 閎康科技股份有限公司 物性分析方法、物性分析試片及其製備方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5578823A (en) 1994-12-16 1996-11-26 Hitachi, Ltd. Transmission electron microscope and method of observing element distribution by using the same
US5713364A (en) * 1995-08-01 1998-02-03 Medispectra, Inc. Spectral volume microprobe analysis of materials
US5798524A (en) * 1996-08-07 1998-08-25 Gatan, Inc. Automated adjustment of an energy filtering transmission electron microscope
JP3439614B2 (ja) 1997-03-03 2003-08-25 株式会社日立製作所 透過型電子顕微鏡及び元素分布観察方法
JP2002508065A (ja) 1997-07-04 2002-03-12 ドイチェス・クレプスフォルシュングスツェントルム・スチフトゥング・デス・エッフェントリヒェン・レヒツ 試料中の元素を検出する方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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