DE19811395A1 - Verfahren zur Kontrastverstärkung für ein Transmissionselektronenmikroskop - Google Patents

Abstract

Es soll ein Verfahren zur Kontrastverstärkung für ein bestimmtes Teilchen in einem von einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommenen Bild einer Probe bereitgestellt werden, bei welchem ein errechnetes, kontrastreiches Bild dadurch erzeugt wird, daß von den Intensitäten eines ersten Bildes errechnete Untergrundintensitäten pixelweise abgezogen werden, wobei die Untergrundintensitäten als Funktion der Intensitäten eines zweiten Bildes errechnet werden. Hierbei soll dieses Verfahren einen breiteren Anwendungsbereich als bisher bekannte Verfahren aufweisen und insbesondere zur Kontrastverstärkung für Goldpartikel bei der Immunogoldmarkierung geeignet sein. Hierfür wird vorgeschlagen, daß das erste Bild unter Bedingungen aufgenommen wird, bei welchen das Teilchen einen möglichst hohen Kontrast aufweist und daß das zweite Bild in einem ausgewählten Energiefenster aufgenommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwischen den beiden Bildern für das Teilchen von dem entsprechenden Kontrastunterschied für wenigstens einen zweiten Probenbestandteil unterscheidet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrastverstärkung für ein bestimmtes Teilchen in einem von einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenomme­ nen Bild einer Probe.

Ein Aspekt vorliegender Erfindung betrifft insbesondere die hochauflösende Strukturanalyse durch die Transmissionselektronenmikroskopie in der biologi­ schen und medizinischen Forschung mittels Immunogoldmarkierung. Hierbei werden Goldkörner von einer Größe zwischen 1 nm und 20 nm an ein bestimm­ tes Biomolekül in der elektronenmikroskopischen Probe gekoppelt, so daß dieses Molekül indirekt über die Position der Goldkörner in der Probe nachgewiesen werden kann. Hierbei wird davon ausgegangen, daß Gold als ein Schwermetall einen besonders starken Kontrast im Elektronenmikroskop erzeugt und damit deutlich sichtbar ist.

Jedoch muß die Struktur der Zelle, in der das Gold markierte Molekül detektiert werden soll, ebenfalls kontrastiert werden, um beispielsweise einzelne Zellkom­ partimente sichtbar zu machen. Dies geschieht in der Regel mit Uran und/oder Blei. Da diese Elemente ebenfalls Schwermetalle sind, erzeugen sie einen ähn­ lichen Kontrast wie Gold, so daß die Goldkörner in vielen Proben nicht eindeutig identifiziert werden können.

Um die Identifizierung zu erleichtern, könnten größere Goldkörner verwendet werden. Bei größeren Goldkörnern ist jedoch die Spezifität der Kopplung an das Molekül erheblich reduziert. Auch könnte man eine höhere Vergrößerung wählen. Diese würde jedoch nur noch einen kleineren Ausschnitt der Zelle abbilden, der allein nicht immer aussagekräftig ist. Des weiteren könnte nach der Goldmarkie­ rung gezielt Silber an die Goldkörner angelagert werden, so daß um die Goldkör­ ner ein Silbermantel entsteht und sich der Kontrast erheblich verstärkt. Jedoch geschieht eine derartige Silberanlagerung nicht bei allen Goldkörnern, so daß deren Kontrast nicht gleichmäßig verstärkt werden würde.

Nach einem anderen Ansatz kann durch Bildverarbeitung der Kontrast für ein bestimmtes Teilchen angehoben werden. Hierbei wird ein errechnetes, kontra­ streiches Bild dadurch erzeugt, daß von den Intensitäten eines ersten Bildes errechnete Untergrundintensitäten pixelweise abgezogen werden, wobei die Untergrundintensitäten als Funktion der Intensitäten eines zweiten Bildes errech­ net werden. Dabei wird mit einem energiefilternden Transmissionselektronen­ mikroskop (EFTEM) das erste Bild in einem Energiefenster aufgenommen, in welchem eine elementspezifische Energiekante des bestimmten Teilchens liegt. Das zweite Bild wird in einem Energiefenster aufgenommen, welches bei Ener­ giewerten unter der elementspezifischen Kante liegt.

In einem hierauf folgenden, bildverarbeitenden Schritt wird eine Untergrund­ intensität als lineare Abbildung der Intensitäten des zweiten Bildes bestimmt. Die Bestimmung erfolgt derart, daß diese von den Intensitäten des zweiten Bildes abhängige Funktion für einen Teilbereich beider Bilder, in welchen keines der bestimmten Teilchen vorhanden ist, an die Intensitäten des ersten Bildes angefit­ tet wird.

Nachdem auf diese Weise die funktionale Abhängigkeit der Untergrundinten­ sitäten des ersten Bildes von den Intensitäten des zweiten Bildes bestimmt wurde, wird diese Untergrundintensität für jedes Pixel des ersten Bildes aus den Intensitäten des zweiten Bildes errechnet und von der Intensität des ersten Bildes subtrahiert.

Auf diese Weise wird ein errechnetes Bild gewonnen, in welchem der Kontrast für das bestimmte Teilchen verstärkt ist.

Voraussetzung zur Durchführung dieses Verfahrens ist, daß das bestimmte Teilchen eine elementspezifische Energieverlustkante, wie zum Beispiel die Energieverlustkante von Uran bei 120 eV oder die Energieverlustkante von Phosphor bei 160 eV, aufweist.

Jedoch weisen nicht alle Partikel eine spezifische Energieverlustkante auf, die ein in der Praxis selektiv darstellbares Signal liefert. Zum Beispiel weist zwar Gold zwei spezifische Energieverlustkanten, eine erste bei 60 eV und eine andere bei über 2000 eV, auf. Die erste Kante, bei 60 eV, liefert jedoch ein schwaches Signal auf hohem elementunspezifischem Untergrund, so daß sich dieses Signal in der Praxis nicht selektiv darstellen läßt. Die zweite Kante, bei über 2000 eV, ist nicht detektierbar, da schon bei etwa 1000 eV die inelastischen Signale so schwach werden, daß eine Detektion quasi nicht mehr möglich ist.

Vorliegender Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein gattungsgemäßes Kontrastverstärkungsverfahren bereitzustellen, welches einen breiteren Anwen­ dungsbereich aufweist und nicht zwingend auf das Vorhandensein spezifischer Energieverlustkanten angewiesen ist. Insbesondere soll das Verfahren eine Kontrastverstärkung für Goldpartikel bei der Immunogoldmarkierung ermögli­ chen.

Als Lösung schlägt die Erfindung ein gattungsgemäßes Kontrastverstärkungs­ verfahren vor, bei welchem das erste Bild unter Bedingungen aufgenommen wird, bei welchen das Teilchen einen möglichst hohen Kontrast aufweist, und bei welchem das zweite Bild in einem ausgewählten Energiefenster aufgenom­ men wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwi­ schen den beiden Bildern für das Teilchen von dem entsprechenden Kontrast­ unterschied für wenigstens einen zweiten Probenbestandteil unterscheidet.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren zur Kontrastverstärkung unterscheidet sich von dem vorgehend beschriebenen Kontrastverstärkungsverfahren durch einen grundlegenden Unterschied in der Eigenschaft der für die Bildverarbeitung verwendeten Bilder. Bei dem nach dem Stand der Technik arbeitenden Kontrast­ verstärkungsverfahren werden die Bilder nach der spezifischen Energieverlust­ kante des Elementes ausgewählt, dessen Kontrast verstärkt werden soll. Das erste Bild wird hierbei in einem Energiefenster aufgenommen, welches die spezifische Energieverlustkante des Elementes einschließt. Das zweite Bild wird in einem Energiefenster aufgenommen, welches unterhalb der spezifischen Energieverlustkante liegt.

Bei den Bildern nach dem erfindungsgemäßen Kontrastverstärkungsverfahren hingegen findet eine gegebenenfalls vorhandene spezifische Energieverlustkante des Teilchens, dessen Kontrast verstärkt werden soll, keine Anwendung. Inso­ fern eignet sich dieses Verfahren sowohl für Teilchen, die keine spezifische Energieverlustkante aufweisen, als auch für Teilchen, deren spezifische Energie­ verlustkante keine selektiv darstellbaren Signale liefert. Insbesondere hat sich herausgestellt, daß dieses Verfahren zur Kontrastverstärkung von Gold beson­ ders geeignet ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Kontrastverstärkungsverfahren wird das erste Bild unter Bedingungen aufgenommen, bei welchen das Teilchen einen möglichst hohen Kontrast aufweist. Dieses kann zum Beispiel ein Bild der Probe mit einem Transmissionselektronenmikroskop ohne Energiefilter sein. Ebenso ist es möglich und insbesondere, wenn das Teilchen ein Goldpartikel ist, vorteilhaft, das erste Bild bei einem Energiefenster von 0 eV aufzunehmen. Dieses bedeutet bei einem energiefilternden Transmissionselektronenmikroskop, daß die Elektronen selektiert werden, die keine Energie verloren haben.

Wenn die Probe neben dem bestimmten Teilchen und dem zweiten Proben­ bestandteil noch einen weiteren Probenbestandteil enthält, kann es vorteilhaft sein, wenn wenigstens ein weiteres Bild in einem weiteren, ausgewählten Energiefenster aufgenommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwischen dem ersten und dem weiteren Bild und/oder dem zweiten und dem weiteren Bild für das Teilchen und/oder für den zweiten Probenbestandteil von dem entsprechenden Kontrastunterschied für den weite­ ren Probenbestandteil unterscheidet.

Hierdurch wird ein Satz Bilder bereitgestellt, bei welchem das zweite Bild und das weitere Bild jeweils selektiv Informationen über zwei Probenbestandteile enthalten.

Auf diese Weise ist es möglich, die Untergrundintensitäten als Funktion der Intensitäten des zweiten und des weiteren Bildes zu errechnen. Insbesondere können die Untergrundintensitäten als lineare Abbildung der Intensitäten des zweiten und des weiteren Bildes errechnet werden.

Ausreichend gute Ergebnisse bei minimalem Rechenaufwand lassen sich bereits erzielen, wenn die Untergrundintensitäten als Polynom ersten oder höheren (1.-3.) Grades durch die Intensitäten des zweiten und des weiteren Bildes dargestellt werden. Bei einer derartigen Darstellung genügt es, einen additiven Koeffizienten sowie für jede der Intensitäten des zweiten und des weiteren Bildes jeweils einen multiplikativen Koeffizienten zu ermitteln.

Vorteilhafterweise wird die Untergrundintensitätenfunktion durch Fitten an die Intensitäten des ersten Bildes gewonnen. Umfaßt die Untergrundintensitäten­ funktion eine lineare Abbildung, so können die entsprechenden Koeffizienten durch jedes bekannte statistische Fittverfahren ermittelt werden.

Es versteht sich, daß bei einem Polynom ersten Grades, bei welchem lediglich drei Koeffizienten zu ermitteln sind, die zur Bestimmung der Untergrundinten­ sitätenfunktion notwendige Zeit minimiert wird.

Die hierfür benötigte Zeit läßt sich des weiteren dadurch reduzieren, daß das Fitten lediglich für selektierte, in einer Matrix angeordnete Pixel erfolgt. Ins­ besondere ist es möglich, jedes zehnte Pixel jeder zehnten Pixelreihe zur Bestim­ mung der Untergrundintensitätenfunktion zu verwenden. Bei einer Pixelmatrix von 1024 × 1024 Bildpunkten ergeben sich somit in etwa 10 000 Bildpixel, die zur Bestimmung der Untergrundintensitätenfunktion verwendet werden.

Insofern ist die Verwendung einer Pixelmatrix zum Fitten der Untergrundinten­ sitätenfunktion auch unabhängig von den übrigen Merkmalen des erfindungs­ gemäßen Kontrastverstärkungsverfahrens erfinderisch. Es hat sich gezeigt, daß einzelne Pixel der Pixelmatrix, die zufällig eines der bestimmten Teilchen, zum Beispiel Gold, darstellen, bei dem vorgenommenen Fitten nicht ins Gewicht fallen.

Sollte sich nach Errechnung des kontrastreichen Bildes herausstellen, daß eine nur unzureichende Kontrastverstärkung vorliegt - dieses kann an einer zu hohen Dichte der bestimmten Teilchen (Gold) liegen -, können diejenigen selektierten, in der Matrix angeordneten Pixel ausgewählt werden, die auf einem Abbild des bestimmten Teilchen liegen. Anschließend kann die Untergrundintensitäten­ funktion nochmals an die Intensitäten des ersten Bildes gefittet werden, wobei in der Matrix die derart ausgewählten Pixel nicht berücksichtigt oder durch andere Pixel ersetzt werden. Auch dieser zweite Schritt, bei welchem die Matrix gegebenenfalls vorhandenen, besonderen Gegebenheiten angepaßt wird, ist automatisch durchführbar, so daß nach wie vor dieses Verfahren für eine auto­ matisierte Partikelauswertung geeignet ist.

Es versteht sich, daß bei weiteren Probenbestandteilen noch weitere Bilder bei entsprechenden Energiefenstern aufgenommen und entsprechend verarbeitet werden können.

Weist ein Partikel der Probe eine spezifische Energieverlustkante auf, die ein selektiv darstellbares Signal liefert, ist es vorteilhaft, daß Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart zu wählen, daß in diesem die partikelspezifische Energiekante, vorzugsweise eine elementspezifische Energiekante, dieses Probenbestandteils liegt. Hierdurch ist es möglich, diesen Probenbestandteil besonders selektiv zu detektieren und entsprechend genau diesbezüglich die Untergrundintensitätenfunktion zu bestimmen.

In diesem Zusammenhang ist festzuhalten, daß das vorliegende, erfindungs­ gemäße Kontrastverstärkungsverfahren in diesem Falle gerade die spezifische Energieverlustkante eines anderen Partikel nutzt, um den Kontrast für das bestimmte Teilchen zu verstärken. Von einer eventuell vorhandenen Energiever­ lustkante des bestimmten Teilchens wird kein Gebrauch gemacht.

Umfaßt die Probe zum Beispiel Uran, so ist es vorteilhaft, wenn ein Bild bei einem Energiefenster von 120 eV, der spezifischen Energieverlustkante von Uran, aufgenommen wird.

Es ist des weiteren möglich, daß Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart zu wählen, daß der relative Kontrast des Teilchens in entweder diesem Bild oder dem ersten Bild dasselbe Vorzeichen aufweist wie ein weiterer Probenbestandteil, während der relative Kontrast des Teilchens in dem jeweils anderen Bild ein entgegengesetztes Vorzeichen, wie der weitere Probenbestandteil, aufweist.

Hierbei bezeichnet der Begriff "relativer Kontrast" die Art, wie sich ein Partikel in einem bestimmten vom Untergrund bzw. von der Hintergrundintensität ab­ hebt. Je nach gewähltem Energiefenster und je nach Partikel können diese heller oder dunkler als die Umgebung erscheinen. Insofern bezieht sich der Begriff des Vorzeichens des relativen Kontrastes darauf, ob ein Partikel gegenüber dem Untergrund heller oder dunkler abgebildet wird.

Die Tatsache, daß ein bestimmter Probenbestandteil in einem Bild mit einem anderen Vorzeichen abgebildet wird, als das Teilchen, dessen Kontrast verstärkt werden soll, und in einem anderen Bild mit demselben Vorzeichen abgebildet wird, wie das bestimmte Teilchen, ermöglicht eine verhältnismäßig gute Selek­ tion dieses Probenbestandteils und somit eine entsprechend genaue Bestimmung der Untergrundintensitätenfunktion.

Eine derartige Kontrasteigenschaft zeichnet insbesondere Schwermetalle, also auch Gold, von den übrigen, üblichen Probenmaterialien aus. So erscheinen Schwermetalle bei niedrigen Energien dunkler als ihre Umgebung. Ab einem bestimmten Energiewert hingegen werden diese heller abgebildet.

Im Einzelnen erscheinen etwa bis 60 eV Goldkörner dunkler als die Umgebung, wobei diese bei 0 eV den stärksten negativen Kontrast liefern. Über 70 eV werden die Goldkörner heller abgebildet.

Insofern hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn ein weiteres Bild bei einem Energiefenster von 40 eV aufgenommen wird.

Überraschenderweise hat sich darüber hinaus herausgestellt, daß bei einer uran- und bleikontrastierten Probe mit Immunogoldmarkierung, die mit Bildern bei 0 eV, 40 eV und 120 eV aufgenommen wurden, Signale von sowohl Uran als auch Blei, sowie Signale, die durch die Dicke der Probe bedingt sind, erfolgreich gefiltert werden können, und im wesentlichen das reine Goldsignal übrig bleibt.

Dementsprechend ist es auch möglich, das Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart zu wählen, daß der relative Kontrast eines zweiten Probenbestandteils in entweder diesem Bild oder dem ersten Bild dassel­ be Vorzeichen aufweist, wie ein weiterer Probenbestandteil, während der relati­ ve Kontrast des zweiten Probenbestandteils in dem jeweils anderen Bild ein entgegengesetztes Vorzeichen, wie der weitere Probenbestandteil, aufweist.

Weitere Vorteile, Ziele und Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachfolgend in der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels und anlie­ gender Zeichnung erläutert. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1a ein Bild einer Probe bei einem Energiefenster von 0 eV mit einer Vergrößerung von M = 4000,

Fig. 1b ein Bild der Probe bei einem Energiefenster zwischen 40 eV und 50 eV,

Fig. 1c ein Bild der Probe bei einem Energiefenster zwischen 115 eV und 125 eV,

Fig. 2 Bilder von Goldkörnern aus der Probe nach Fig. 1 bei hoher Ver­ größerung (M = 31 500) und verschiedenen Energieverlustwerten,

Fig. 3a eine schematische Beispielprobe im Schnitt,

Fig. 3b eine schematische Darstellung gemessener Intensitäten bei Bildern der Beispielprobe nach Fig. 3a,

Fig. 3c das aus den Intensitäten nach Fig. 3b errechnete Goldsignal,

Fig. 4 die aus Fig. 1a bis 1c errechnete Goldverteilung, und

Fig. 5 die errechnete Goldverteilung in Überlagerung mit dem 0 eV-Bild nach Fig. 1a.

Das Ausführungsbeispiel umfaßt eine Probe, bei welcher ein Ultradünnschnitt einer Zelle mit Uran und Blei sichtbar gemacht wurde, in welcher die DNA mit Goldkörnern von 6 nm markiert wurde.

Von der Probe wurden Aufnahmen mit einem energiefilternden Transmissions­ elektronenmikroskop gemacht, wobei Elektronen selektiert wurden, die keine Energie verloren haben, (Fig. 1a), die zwischen 40 und 50 eV verloren haben (Fig. 1b) und die zwischen 115 und 125 eV verloren haben (Fig. 1c).

Hierbei wurde das Bild bei 0 eV gewählt, weil es den stärksten Kontrast für die Goldkörner liefert. Das Fenster zwischen 115 und 125 eV wurde gewählt, weil in diesem Bereich die elementspezifische Energieverlustkante des Uran liegt und sich Uran somit in diesem Fenster gut selektiv darstellen läßt.

Für die Wahl des Energiefensters zwischen 40 und 50 eV wurde eine andere Kontrasteigenschaft von Schwermetallen, speziell von Gold, ausgenutzt, die es ermöglicht, daß Goldsignal vom Untergrund zu trennen. Diese Eigenschaft ist in Fig. 2 dargestellt. Hierbei wurden Goldkörner aus der in Fig. 1a bis 1c dargestellten Probe bei hoher Vergrößerung und bei verschiedenen Energie­ verlustwerten aufgenommen. Wie aus Fig. 2 ersichtlich, erscheinen bis etwa 60 eV die Goldkörner dunkler als die Umgebung, wobei diese bei 0 eV den stärksten negativen Kontrast liefern. Zwischen 70 und 120 eV werden die Goldkörner heller abgebildet. Ab etwa 110 eV sind die Goldkörner nicht mehr zu erkennen, da das Signal vom Uran dominiert wird.

Um den Kontrast der Goldkörner vom Untergrund zu trennen, wurde die Intensi­ tät des Untergrundes I_U als lineare Funktion von den Intensitäten bei 45 eV (I₄₅) und bei 120 eV (I₁₂₀) berechnet.

I_U = c₀ + c₁I₄₅ + c₂I₁₂₀.

Um die Intensität des Untergrundes zu berechnen, wurden von den 1024 × 1024 Pixeln der Bilder jedes zehnte Pixel jeder zehnten Pixelreihe ausgewählt und anschließend die Funktion der Untergrundintensitäten I_U für die etwa 10 000 Pixeln in ihren Koeffizienten c₀, c₁ und c₂ an die Intensitäten bei 0 eV (I₀) angefittet.

Nachdem auf diese Weise die Funktion der Untergrundintensität bestimmt war, wurde für jedes Pixel die Untergrundintensität von der Intensität bei 0 eV abge­ zogen,

I_Erg = I₀ - I_U

so daß im wesentlichen nur noch der durch das Gold verursachte Kontrast übrig blieb.

Schematisch ist dies in Fig. 3 dargestellt. Die Probe besteht aus einem Schnitt, der zwar eine gleichmäßige Dicke hat, bei dem aber die Dichte variiert. Hierbei steht das dunkle Grau für eine Stelle hoher Dichte. Zusätzlich ist eine Stelle mit Uran und ein Goldkorn dargestellt. Zwischen dem Bild bei 0 eV und den Bilden bei 45 eV und 120 eV ergibt sich für die Probe ohne Schwermetalle eine Kon­ trastumkehr. Der Kontrast für Uran ist in dem 45 eV-Bild ähnlich wie für Gold. Der Unterschied zwischen Gold und Uran wird im 120 eV-Bild deutlich. Während Gold nur einen schwachen positiven Kontrast erzeugt, ist die Intensität für Uran sehr viel stärker. In diesem Beispiel ergeben die Konstanten c₀ = 0, c₁ = 1 und c₂ = 1 das reine Goldsignal.

Die nach dem Fitten errechnete Goldverteilung für jedes Pixel ist als binarisiertes Ergebnisbild in Fig. 4 dargestellt, während Fig. 5 eine Überlagerung der Intensitäten bei 0 eV und des binarisierten Ergebnisbildes darstellt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, den Kontrast eines für eine Lokalisationsuntersuchung verwendeten, goldmarkierten Biomoleküls (zum Beispiel Antikörper, DNA- oder RNA-Sonde) differentiell und selektiv zu optimie­ ren. Hierbei ist eine gleichzeitige Berücksichtigung des in der Probe ebenfalls vorhandenen Uran- und/oder Bleikontrasts möglich, welcher zur Strukturerken­ nung der gesamten Zelltopologie unerläßlich ist.

Als Endresultat der Kontrastoptimierung erscheint der Kontrast der Goldpartikel stark hervorgehoben, während der Kontrast der Zellstruktur definiert abgesenkt wird, so daß die Position und Zahl der Goldkörner in Bezug zur unterliegenden Zellstruktur eindeutig definiert ist.

Somit ist es mit diesem Verfahren möglich, ein Experiment, bei dem ein Biomole­ kül mit Gold markiert wurde, objektiver und sicherer als bisher auszuwerten. So kann das Ergebnisbild binarisiert und auf das 0 eV-Bild gelegt werden, so daß genauere Aussagen über die Verteilung des betreffenden Moleküls in der Zelle möglich sind. Zudem sollte es möglich sein, diese Bilder automatisch, zum Beispiel computergestützt, auswerten zu lassen.

Claims (15)

1. Verfahren zur Kontrastverstärkung für ein bestimmtes Teilchen in einem von einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommenen Bild einer Probe,

• - bei welchem ein errechnetes, kontrastreiches Bild (I_Erg) dadurch erzeugt wird, daß von den Intensitäten (I₀) eines ersten Bildes errechnete Untergrundintensitäten (I_U) pixelweise abgezogen wer­ den,
• - wobei die Untergrundintensitäten als Funktion der Intensitäten (I₄₅, I₁₂₀) eines zweiten Bildes errechnet werden, dadurch gekennzeichnet,
• - daß das erste Bild unter Bedingungen aufgenommen wird, bei welchen das Teilchen einen möglichst hohen Kontrast aufweist, und
• - daß das zweite Bild in einem ausgewählten Energiefenster aufge­ nommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrast­ unterschied zwischen den beiden Bildern für das Teilchen von dem entsprechenden Kontrastunterschied für wenigstens einen zweiten Probenbestandteil unterscheidet.

2. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß wenigstens ein weiteres Bild in einem weiteren, ausgewählten Energiefenster aufgenommen wird, welches derart gewählt ist, daß sich der Kontrastunterschied zwischen dem ersten und dem weiteren Bild und/oder dem zweiten und dem weiteren Bild für das Teilchen und/oder für den zweiten Probenbestandteil von dem entsprechenden Kontrast­ unterschied für wenigstens einen weiteren Probenbestandteil unterschei­ det.

3. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich­ net, daß die Untergrundintensitäten (I_U) als Funktion der Intensitäten (I₄₅, I₁₂₀ des zweiten und weiteren Bildes errechnet werden.

4. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich­ net, daß die Untergrundintensitäten (I_U) als lineare Abbildung der Intensitä­ ten (I₄₅, I₁₂₀) des zweiten und des weiteren Bildes errechnet werden.

5. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich­ net, daß die Untergrundintensitäten (I_U) als Polynom 1. oder höheren Grades durch die Intensitäten (I₄₅, I₁₂₀) des zweiten und des weiteren Bildes dargestellt werden.

6. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da­ durch gekennzeichnet, daß die Untergrundintensitätenfunktion (I_U) durch Fitten an die Intensitäten (I₀) des ersten Bildes gewonnen wird.

7. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich­ net, daß das Fitten für selektierte, in einer Matrix angeordnete Pixel erfolgt.

8. Kontrastverstärkungsverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich­ net, daß nach Errechnung des kontrastreichen Bildes diejenigen selektier­ ten, in der Matrix angeordneten Pixel ausgewertet werden, die auf einem Abbild des bestimmten Teilchens liegen, und anschließend die Unter­ grundintensitätenfunktion nochmals an die Intensitäten des ersten Bildes gefittet wird, wobei in der Matrix die derart ausgewählten Pixel nicht berücksichtigt oder durch andere Pixel ersetzt werden.

9. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, da­ durch gekennzeichnet, daß das Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart gewählt ist, daß in diesem eine partikel­ spezifische, vorzugsweise elementspezifische, Energiekante eines Proben­ bestandteils liegt.

10. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, da­ durch gekennzeichnet, daß das Energiefenster des zweiten Bildes und/- oder eines weiteren Bildes derart gewählt ist, daß der relative Kontrast des Teilchens in entweder diesem Bild oder dem ersten Bild dasselbe Vorzeichen aufweist, wie ein weiterer Probenbestandteil, während der relative Kontrast des Teilchens in dem jeweils anderen Bild ein entgegen­ gesetztes Vorzeichen, wie der weitere Probenbestandteil, aufweist.

11. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Energiefenster des zweiten Bildes und/oder eines weiteren Bildes derart gewählt ist, daß der relative Kon­ trast eines zweiten Probenbestandteils in entweder diesem Bild oder dem ersten Bild dasselbe Vorzeichen aufweist wie ein weiterer Probenbestand­ teil, während der relative Kontrast des zweiten Probenbestandteils in dem jeweils anderen Bild ein entgegengesetztes Vorzeichen, wie der weitere Probenbestandteil, aufweist.

12. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das bestimmte Teilchen Gold ist.

13. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Bild bei einem Energiefenster von 0 eV aufgenommen wird.

14. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Bild bei einem Energiefenster von 40 eV aufgenommen wird.

15. Kontrastverstärkungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Bild bei einem Energiefenster von 120 eV aufgenommen wird.