EP1024689A1 - Milieu de culture pour tissus meristematiques et procede de culture de ces tissus en conditions non steriles - Google Patents

Milieu de culture pour tissus meristematiques et procede de culture de ces tissus en conditions non steriles

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EP1024689A1
EP1024689A1 EP97911308A EP97911308A EP1024689A1 EP 1024689 A1 EP1024689 A1 EP 1024689A1 EP 97911308 A EP97911308 A EP 97911308A EP 97911308 A EP97911308 A EP 97911308A EP 1024689 A1 EP1024689 A1 EP 1024689A1
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EP
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medium according
active material
medium
fungicidal active
fungicidal
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Withdrawn
Application number
EP97911308A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Marc Dupuis
Jean-Louis Arnault
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Agro SA
Rhone Poulenc Agrochimie SA
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Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Agro SA, Rhone Poulenc Agrochimie SA filed Critical Rhone Poulenc Agro SA
Publication of EP1024689A1 publication Critical patent/EP1024689A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
    • A01C1/06—Coating or dressing seed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G24/00—Growth substrates; Culture media; Apparatus or methods therefor
    • A01G24/10—Growth substrates; Culture media; Apparatus or methods therefor based on or containing inorganic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G24/00—Growth substrates; Culture media; Apparatus or methods therefor
    • A01G24/30—Growth substrates; Culture media; Apparatus or methods therefor based on or containing synthetic organic compounds

Definitions

  • the present invention relates to a culture medium for meristematic tissues, a method for cultivating these tissues under non-sterile conditions and the plants obtained using this method.
  • fungicides such as carbendazim or benomyl have been used, but have been found to be non-phytotoxic only at low doses, for which their action was entirely insufficient. The same is true with certain combinations of fungicides and antibiotics in the literature.
  • the invention relates to culture medium for meristematic tissues, in non-sterile condition, comprising a sweet medium, characterized in that it also contains an effective and non- phytotoxic of at least one active ingredient protecting against microorganisms chosen from the group comprising a phytosanitary fungicidal active ingredient and a persistent bactericidal active ingredient.
  • tissue means any plant tissue, or set of plant cells, capable, when placed in suitable conditions, of growing until it forms a whole plant or part of a plant. whole.
  • tissue we include all kinds of plant tissue, in particular: somatic tissue, pro-embryogenic masses (known in English as pro-embryogenic masses, somatic embryo, zygotic tissue, seed , germ, weed bud, shoots, stem primordium (known in English as shoot primordium), analogs of protocorn (known in English as protocorn like body), tissue known in english as the name of green spot, germ cells and natural seeds (known in English as germ line), young plants.
  • the plants concerned by the invention are of the most diverse nature and include food crops such as rice, wheat, barley, corn, soybeans; vegetable crops such as celery, parsley, salad, cauliflower, carrot, eggplant, tomato, onion, garlic, ginger, strawberries, melons, asparagus; food and / or industrial crops such as rapeseed, sugar cane, sugar beet, tobacco, coffee; crops for medical purposes such as belladonna, ginseng; ornamental crops such as chrysanthemums, gladioli, lilies, orchids, amaryllis, geranium, begonia, Cape violets, poinsettia; trees or tree species or shrubs such as conifers, palm trees, fruit trees, vines, deciduous trees, and others.
  • food crops such as rice, wheat, barley, corn, soybeans
  • vegetable crops such as celery, parsley, salad, cauliflower, carrot, eggplant, tomato, onion, garlic, ginger, strawberries, melons, asparagus
  • food and / or industrial crops such as rapeseed,
  • the meristematic tissue can be dry, dehydrated or in hydrated form up to 100% moisture.
  • microorganisms means those belonging to the classes of fungi, bacteria, algae, viruses and protozoa.
  • culture medium means any medium, solid (for example agar medium) or liquid (nutritive solution), optionally adsorbed on culture substrates such as rock wool, cellulose acetate, polyethylene fibers, polyurethanes, coconut, allowing the cultivation of meristematic tissues, in vitro or in the greenhouse, possibly with controlled release active ingredients.
  • the medium can be static, brought once and for all or renewed regularly in the form of either a continuous flow or a discontinuous flow (batch).
  • the sugar is present in the medium according to the invention at a concentration generally between 0.1 mg and 200 g / l and preferably between 5 g / l and 200 g / l.
  • fungicidal active ingredient is essentially meant a fungicidal active ingredient.
  • This is preferably chosen from the group comprising copper derivatives, oxyquinoline derivatives, dithiocarbamates, dicarboximides, phenylpyrroles, triazoles.
  • fungicides chosen from the group comprising copper oxychloride, oxyquinoline, copper oxyquinoleate, mancozeb, maneb, thiram, fludioxonil, and iprodione.
  • the medium contains at least two fungicides.
  • the medium contains from 0.1 mg to 10 g / l, and preferably from 1 mg to 1 g / 1 of fungicidal active material.
  • the concentration is between:
  • bactericidal active ingredient is essentially meant a bactericidal or bacteriostatic active ingredient. This can belong to any family, preference being given to salicylic acid derivatives such as for example salicylic acid, acetylsalicylic acid, salicylates or to thiazolines, such as for example l, 2 -benzisothiazoline-3-one, or even antibiotics.
  • the medium may contain several bactericides.
  • the concentration of bactericidal active material is 0.1 to 100 mg / 1, and preferably 0.1 to 100 and preferably 0.1 to 10 mg / 1 of active material. More particularly and preferably, the concentration is between:
  • the medium according to the invention may also contain other active materials or adjuvants provided that the amounts are non-phytotoxic for meristematic tissues.
  • the ingredients described with the base of the medium it suffices to mix the ingredients described with the base of the medium. If the final medium is solid, the mixing is carried out hot in the liquid phase to then be poured into laboratory containers such as Petri dishes or Magenta.
  • Heller's nutrient solution (He 15), characterized by the presence of sucrose, which is used to ensure the germination of somatic embryos.
  • This solution is composed of the macronutrients of Heller (Ann. Sci Nat. Bot. Biol. Veg. 14: 1-223, 1953), micronutrients from Murashige and Skoog (Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962) and 15 g / l of sucrose. In the example, it is gelled with 6 g / l of gelrite, the pH being maintained at 5.6. After manufacture and autoclaving of approximately 3.5 liters of Heller's agar nutrient solution (He 15), approximately 250 ml of the following Heller media are produced.
  • the mother solution is produced by diluting the active ingredient, formulated or not, in a Heller medium devoid of sucrose.
  • the culture medium is produced by adding a fraction of the mother solution to the base medium, which contains 15 g / l of sucrose.
  • Each agar nutrient solution is distributed in Magenta boxes (Sigma, USA) at a rate of approximately 40 ml per box.
  • the Magenta boxes are brought into ⁇ iini-greenhouse which are opened without special precautions in non-sterile conditions, one box per medium and per mini-greenhouse.
  • the temperature is around 20 ° C, with a modular relative humidity of 30 to 70% by mist system. Greenhouses allow natural lighting to be used, but if it is too low, fixed auxiliary lighting is used using 400 watt high pressure sodium vapor lamps.
  • the activity criterion is that the protection is such that less than 10% of the total surface is contaminated.
  • Example 2 Protection test of a culture medium
  • Example 3 Protection test of a culture medium Proceeding according to the same protocol as that described in Example 1, but with the following Heller media: 10. Heller without active material 11. Heller + copper oxyquinoleate 1 mg / 1
  • Example 4 Somatic carrot embryo culture test A) Cell suspension: The somatic embryos are obtained according to the method described in Cryo-Lett. 12: 319-328, 1991, except that embryogenesis is obtained in the presence of 0.2% by weight of activated carbon, and dehydrated according to the method described in CR Acad. Sci. Paris, Ser. III, 314, 423, 1992. The embryos thus obtained have a water content of less than 0.35 grams of water per gram of dry matter.
  • the petri dishes containing the embryos placed on filter paper are placed for 3 days in the dark at 4 ° C. in desiccators where the relative humidity is maintained at 96% by a supersaturated solution of potassium nitrate. Then the filter papers are transferred in the dark at 4 ° C on Heller medium at 145 g / l of sucrose. After one day, they are again displaced on Heller medium at 80 g / l of sucrose, in the light and at 25 ° C. After one day, we can dispose of the embryos.
  • the somatic embryos are placed in germination in a culture chamber at 25 ° C under a photoperiod of 16 h day and 8 h night and a light intensity of 15 ⁇ E / m ⁇ / s.
  • the germination medium is a Heller agar medium containing 15 g / l of sucrose, with or without the addition of active ingredients.
  • the media are distributed in Magenta boxes at a rate of 30 ml of medium per box.
  • the somatic embryos are distributed over the various media at the rate of 60 embryos per medium and 10 embryos per dish, under aseptic conditions.
  • the various Heller media contain the following mixtures of active ingredients prepared as in the previous examples: 19. Heller without active ingredient
  • This table shows that all the conversion rates to plants are above the acceptable value of 80% and even for the most part at least equal to 95%. This shows the excellent property of the active ingredients according to the invention of not altering the development in plants of somatic embryos.

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Abstract

Milieu de culture gelosé contenant du sucre pour tissus méristématiques. Il contient en outre une quantité efficace et non phytotoxique d'au moins une matière active protectrice contre les micro-organismes choisis dans le groupe comprenant une matière active fongicide phytosanitaire et une matière active bactéricide rémanente. Application en agriculture.

Description

Milieu de culture pour tissus méristématiques et procédé de culture de ces tissus en condition non stériles
La présente invention concerne un milieu de culture pour tissus méristématiques, un procédé de culture de ces tissus en condition non stériles et les plantes obtenues à l'aide de ce procédé.
Il est bien connu que la culture d'embryons somatiques de plantes et de jeunes plantes qui en sont issues nécessite l'utilisation d'un milieu de culture sucré. Cependant la présence de sucre attire les microorganimes tels que champignons, bactéries, algues, protozoaires et virus. Or une protection maximale est nécessaire pour assurer la culture, la croissance et l'obtention de plantules puis de plantes saines. Cet inconvénient est évité en effectuant la culture en conditions stériles, ce qui alourdit et complique l'expérimentation. Une autre voie serait d'ajouter des antibiotiques. Cette solution a été tentée par exemple pour la culture d'embryons de carotte cf Synseedsl993 Ch; 15 F. Molle et coll.) mais s'est révélée inutilisable en raison d'une phytotoxicité inacceptable provoquant le blocage de la croissance des embryons. On a utilisé des fongicides à large spectre tels que le carbendazime ou le benomyl mais ils ne se sont révélés non phytotoxiques qu'à faibles doses, pour lesquelles leur action était tout à fait insuffisantes. Il en est de même avec certaines combinaisons de fongicides et d' antibiotiques de la littérature.
Il est donc connu que le problème d'une protection efficace des milieux de culture pour embryons somatiques dans des conditions non stériles reste entier et qu'il y a un besoin pour résoudre cette difficulté. Cette difficulté résulte d'une plus grande sensibilité, en conditions non stériles, des embryons par rapport aux graines, des embryons aux produits phytosanitaires et au fait qu'il faut également protéger ces embryons contre l'action de micro-organismes autres que les pathogènes. La demanderesse a maintenant découvert un nouveau milieu de culture permettant de résoudre ce problème avec obtention d'une protection efficace par l'utilisation de matières actives protectrices particulières. Par protection efficace on entend une protection d'au moins 10% de la surface du milieu.
Plus particulièrement l'invention concerne milieu de culture pour tissus méristématiques, en condition non stériles, comprenant un milieu sucré, caractérisé en ce qu'il contient en outre une quantité efficace et non phytotoxique d'au moins une matière active protectrice contre les microorganismes choisie dans le groupe comprenant une matière active fongicide phytosanitaire et une matière active bactéricide rémanente.
Au sens de la présente description, on entend par "tissu méristématique" tout tissu végétal, ou ensemble de cellules végétales, capable, lorsqu'il est mis dans des conditions convenables, de se développer jusqu'à former une plante entière ou partie de plante entière. Sous l'expression "tissu" on inclut toute sorte de tissus végétaux, notamment: le tissu somatique, les masses pro-embryogènes (connu en anglais sous le nom de pro-embryogenic masses, l'embryon somatique, le tissu zygotique, la graine, le germe, le bourgeon adventice, les pousses, le primordium de tige (connu en anglais sous le nom de shoot primordium), les analogues de protocorn (connus en anglais sous le nom de protocorn like body), le tissu connu en anglais sous le nom de green spot, les cellules germinales et semences naturelles (connues en anglais sous le nom de germ line), les jeunes plants.
Les végétaux concernés par l'invention sont de nature les plus diverses et incluent les cultures vivrières telles que le riz, le blé, l'orge, le maïs, le soja ; les cultures légumières telles que le céleri, le persil, la salade, le chou-fleur, la carotte, l'aubergine, la tomate, l'oignon, l'ail, le gingembre, les fraises, les melons, l'asperge ; les cultures vivrières et/ou industrielles telles que le colza, la canne à sucre, la betterave à sucre, le tabac, le café; les cultures à but médical telles que la belladone, le ginseng; les cultures ornementales telles que les chrysanthèmes, les glaïeuls, les lys, les orchidées, les amaryllis, les géranium, les bégonia, les violettes du Cap, la poinsettia; des arbres ou espèces arborescentes ou arbustes telles que les résineux, les palmiers, les arbres fruitiers, la vigne, les arbres à feuilles caduques, et autres.
Le tissu méristématique peut être sec, déshydraté ou sous forme hydratée jusqu'à 100% d'humidité.
Au sens de la présente invention, on entend par "micro-organismes" ceux appartenant aux classes des champignons, bactéries, algues, virus et protozoaires.
De même, on entend par "milieu de culture" tout milieu, solide ( par exemple milieu gélose) ou liquide (solution nutritive), éventuellement adsorbés sur des substrats de culture tels que laine de roche, acétate de cellulose, fibres polyethylène, polyuréthannes, noix de coco, permettant la culture de tissus méristématiques, in vitro ou en serre, éventuellement avec relargage contrôlé des matières actives. Le milieu peut être statique, apporté une fois pour toutes ou renouvelé régulièrement sous forme, soit d'un flux continu, soit d'un flux discontinu (batch).
Le sucre est présent dans milieu selon l'invention à une concentration comprise en général entre O.lmg et 200 g/1 et de préférence comprise entre 5 g/1 et 200 g/1 .
Par "matière active phytosanitaire", on entend essentiellement une matière active fongicide. Celle ci est de préférence choisie dans le groupe comprenant les dérivés du cuivre, les dérivés de l'oxyquinoléine, les dithiocarbamates, les dicarboximides, les phénylpyrroles, les triazoles. De manière particulièrement préférée, on utilise des fongicides choisis dans le groupe comprenant l'oxychlorure de cuivre, l'oxyquinoléine, l'oxyquinoléate de cuivre, le mancozèbe, le manèbe, le thirame, le fludioxonil, et l'iprodione.
Dans la présente demande les noms de matières fongicides sont les noms communs (cf Pesticide Manual 1995).
De manière particulièrement préférée, le milieu contient au moins deux fongicides.
Un autre aspect important de l'invention est que ces fongicides sont utilisés en quantité non phytotoxique pour le tissu méristématique, c'est à dire à des concentrations, qui peuvent être plus faibles que celles habituellement utilisées pour la protection des plantes entières. Plus précisément le milieu contient de 0,1 mg à 10g/l, et de préférence de 1 mg à 1 g/1 de matière active fongicide .
Plus particulièrement et de préférence, la concentration est comprise entre:
- 0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés du cuivre,
- 0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés de l'oxyquinoléine,
- 0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés dithiocarbamiques,
- 0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés phénylpyrroles, - 0,1 et 1000 mg/1 pour les dérivés dicarboximides.
Par "matière active bactéricide", on entend essentiellement une matière active bactéricide ou bactériostatique. Celle-ci peut appartenir à une famille quelconque, la préférence étant donnée au dérivés de l'acide salicylique tel que par exemple l'acide salicylique, l'acide acétylsalicylique, les salicylates ou encore aux thiazolines, telle que par exemple la l,2-benzisothiazoline-3-one, voire des antibiotiques. Le milieu peut contenir plusieurs bactéricides.
La concentration en matière active bactéricide est de 0,1 à 100 mg/1, et de préférence de 0,1 à 100 et de préférence de 0,1 à 10 mg/1 de matière active. Plus particulièrement et de préférence, la concentration est comprise entre:
- 0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés de l'acide salicylique,
- 0,1 et 5 mg/1 pour la l,2-benzisothiazoline-3-one. Le milieu selon l'invention peut encore contenir d'autres matières actives ou adjuvants à condition que les quantités soient non phytotoxiques pour les tissus méristématiques. Pour la fabrication du milieu ci-dessus, il suffit de mélanger les ingrédients décrits avec la base du milieu. Si le milieu final est solide, le mélange se fait à chaud en phase liquide pour être ensuite versé dans des récipients de laboratoire tels que des boites de Pétri ou Magenta.
Les conditions de culture et les résultats seront mieux compris à l'aide des exemples suivants, sans que ceux-ci limitent la portée de l'invention.
Exemple 1 : Test de protection d'un milieu de culture
Différents milieux de culture sont fabriqués à partir de la solution nutritive de Heller (He 15) , caractérisée par la présence de saccharose, qui est utilisée pour assurer la germination des embryons somatiques.. Cette solution est composée des macronutrients de Heller (Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 14: 1-223, 1953), des micronutrients de Murashige et Skoog (Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962) et de 15 g/1 de saccharose. Elle est gélifiée dans l'exemple par 6 g/1 de gelrite, le pH étant maintenu à 5,6. Après fabrication et stérilisation par autoclavage d'environ 3,5 litres de solution nutritive gélosée de Heller (He 15), environ 250 ml des milieux de Heller suivants sont fabriqués.
1. Heller sans matière active
2. Heller + oxyquinoléine 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 3. Heller + mancozèbe 10 mg/1
4. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + mancozèbe 10 mg/1
5. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + fludioxonil 10 mg/1
6. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + iprodione 100 mg/1
Les modalités de fabrication et de dilution des solutions mères de matières actives (m.a.)sont données dans le tableau 1 suivant :
La solution mère est fabriquée par dilution de la matière active, formulée ou non, dans un milieu de Heller dépourvu de saccharose . Le milieu de culture est fabriqué en ajoutant une fraction de la solution mère dans le milieu de base, qui contient 15 g/1 de saccharose.
Chaque solution nutritive gélosée est répartie dans des boîtes Magenta (Sigma, USA) à raison d'environ 40 ml par boîte. Les boîtes Magenta sont amenées en πiini-serre qui sont ouvertes sans précautions particulières en conditions non stériles, à raison d'une boîte par milieu et par mini-serre.
La température est d'environ 20 °C, avec une humidité relative modulable de 30 à 70% par système brouillard. Les serres permettent d'utiliser l'éclairage naturel mais, si celui-ci est trop faible, on utilise un éclairage d'appoint fixe à l'aide de lampes à vapeur de sodium haute pression de 400 watts.
Quatorze jours après la mise en place, la surface du milieu de culture contaminée par les micro-organismes est mesurée dans chaque boîte ainsi que le nombre de colonies qui se sont développées.
Les résultats sont donnés dans le tableau 2 suivant:
Le critère d'activité est que la protection soit telle que moins de 10% de la surface totale soit contaminée.
Dans ces conditions on observe que tous les produits testés apportent une excellente protection.
Exemple 2: Test de protection d'un milieu de culture En procédant selon le même protocole que celui décrit à l'exemple 1 , mais avec les milieux de Heller suivants:
7. Heller sans matière active
8. Heller + oxyquinoléate de cuivre 10 mg/1
9. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 on obtient les résultats donnés dans le tableau 3 suivant:
Exemple 3: Test de protection d'un milieu de culture En procédant selon le même protocole que celui décrit à l'exemple 1, mais avec les milieux de Heller suivants: 10. Heller sans matière active 11. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1
12. Heller + thirame 10 mg/1
13. Heller + acide salicylique 10 mg/1
14. Heller + l,2-benzisothiazoline-3-one 10 mg/1
15. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 16. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 + acide salicylique lmg/1
17. Heller + thirame 5 mg/1 + acide salicylique 1 mg/1
18. Heller + thirame 5 mg/1 + l,2-benzisothiazoline-3-one 10 mg/1 Ces milieux de culture géloses sont fabriqués à partir de lasolution nutritive de Heller (He 15), dont la composition est décrite dans le tableau n° de l'exemple 1. Les modalités de fabrication et de dilution des solutions mères sont données das les exemples précédents. Dans le cas de l'acide salicylique et de la l,2-benzisothiazoline-3-one, ces modalités sont données dans le tableau 4 suivant:
On obtient les résultats donnés dans le tableau 5 suivant
Dans ces conditions on observe que le thirame, la benzisothiazoline-3- one ainsi que des mélanges à base d' oxyquinoléate de cuivre et d'acétylsalicylique et/ ou de thirame, à des doses où ces produits seuls sont inefficaces apportent une excellente protection, de sorte que moins de 10% de la surface totale est contaminée.
Exemple 4: test de culture d'embryons somatiques de carottes A) Suspension cellulaire: Les embryons somatiques sont obtenus selon la méthode décrite dans Cryo-Lett. 12: 319-328, 1991, si ce n'est que l'embryogenèse est obtenue en présence de 0,2 %° en poids de charbon actif, et déshydratés selon la méthode décrite dans C.R. Acad. Sci. Paris, Sér. III, 314, 423, 1992. Les embryons ainsi obtenus ont une teneur en eau inférieure à 0,35 grammes d'eau par gramme de matière sèche.
B) Germination des embryons:
Les boîtes de Pétri contenant les embryons posés sur papier filtre sont placées pendant 3 jours dans l'obscurité à 4°C dans des dessiccateurs où l'humidité relative est maintenue à 96% par une solution sursaturée de nitrate de potassium. Ensuite les papiers filtres sont transférés dans l'obscurité à 4°C sur milieu de Heller à 145 g /l de saccharose. Au bout d'un jour, ils sont de nouveau déplacés sur milieu de Heller à 80 g /l de saccharose, à la lumière et à 25°C. Au bout d'un jour, on peut disposer des embryons. Les embryons somatiques sont placés en germination en chambre de culture à 25 °C sous une photopériode de 16 h de jour et 8 h de nuit et une intensité lumineuse de 15 μE/m^/s. Le milieu de germination est un milieu gélose de Heller contenant 15 g/1 de saccharose, additionné ou non de matières actives. Les milieux sont répartis dans des boîtes Magenta à raison de 30 ml de milieu par boîte. Les embryons somatiques sont répartis sur les différents milieux à raison de 60 embryons par milieu et de 10 embryons par boîte, en conditions aseptiques.
Les différents milieux de Heller contiennent les mélanges de matières actives suivantes préparés comme aux exemples précédents: 19. Heller sans matière active
11. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + mancozèbe 10 mg/1
5. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + fludioxonil 10 mg/1
6. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + iprodione 100 mg/1
20. Heller + oxyquinoléine de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 16. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 + acide salicylique 1 g/1
18. Heller + thirame 5 mg/1 + l,2-benzisothiazoline-3-one 1 mg/1
21. Heller -(-oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + fenpiclonil 1 m/gl Les taux de conversion des embryons sont mesurés environ 5 semaines après les semis et définis comme étant le nombre d'embryons présentant la première paire de feuilles vraies rapporté au nombre total d'embryons. Le poids frais de la partie aérienne de la jeune plante (au dessus du collet ) est mesuré à la balance de précision. Le poids frais est le marqueur de développement des plantes.
Le taux de conversion et le poids frais sont indiqués dans le tableau 6 suivant.
Ce tableau montre que tous les taux de conversion en plantes sont supérieurs à la valeur acceptable de 80% et même pour la plupart au moins égaux à 95% . Ceci montre l'excellente propriété des matières actives selon l'invention de ne pas altérer le développement en plantes des embryons somatiques.

Claims

Revendications
1. Milieu de culture pour tissus méristématiques, en condition non stériles, comprenant un milieu sucré, caractérisé en ce qu'il contient en outre une quantité efficace et non phytotoxique d'au moins une matière active protectrice contre les micro-organismes choisie dans le groupe comprenant une matière active fongicide phytosanitaire et une matière active bactéricide rémanente.
2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière active protectrice est une matière active fongicide.
3. Milieu selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matière active fongicide est un dérivé du cuivre.
4. Milieu selon la revendication 3, caractérisé en ce que la matière active fongicide est l'oxy chlorure de cuivre.
5. Milieu selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matière active fongicide est un dérivé de l'oxyquinoléine.
6. Milieu selon la revendication 5, caractérisé en ce que la matière active fongicide est l' oxyquinoléate de cuivre.
7. Milieu selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matière active fongicide est un dithiocarbamate.
8. Milieu selon la revendication 7, caractérisé en ce que la matière active fongicide est le mancozèbe.
9. Milieu selon la revendication 7, caractérisé en ce que la matière active fongicide est le thirame.
10. Milieu selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matière active fongicide est un dérivé des phénylpyrroles.
11. Milieu selon la revendication 10, caractérisé en ce que la matière active fongicide est le fluodioxonil.
12. Milieu selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matière active fongicide est un dicarboximide.
13. Milieu selon la revendication 12, caractérisé en ce que la matière active fongicide est l' iprodione
14. Milieu selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que le milieu contient au moins deux fongicides.
15. Milieu selon la revendication 14 , caractérisé en ce que l'un des deux fongicides est un dérivé de l'oxyquinoléine ou un dithiocarbamate.
16. Milieu selon l'une des revendications 2 à 15, caractérisé en ce que le milieu contient de 0,1 à 1000 mg/1, de préférence de 0,1 à 10 mg/1 de matière active fongicide.
17. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière active protectrice est une matière active bactéricide rémanente.
18. Milieu selon la revendication 17, caractérisé en ce que la matière active bactéricide est un salicylate.
19. Milieu selon la revendication 17, caractérisé en ce que la matière active bactéricide est la 1,2 benzisothiazoline.
20. Milieu selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que le milieu contient de 0,1 à 100 mg/1, de préférence de 0,1 à 10 mg/1 de matière active bactéricide.
21. Milieu selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que le milieu contient au moins une matière active fongicide et au moins une matière active bactéricide.
22 . Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en sucre est au moins égale à lg/1 .
23. Milieu selon l'une des revdications 1 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend une phase fibreuse pour le relargage contrôlé des matières actives.
24. Procédé de culture d'un tissu méristématique en condition non stériles, caractérisé en ce qu'on utilise un milieu selon l'une des revendications l à 23.
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