EP0983391A1 - Procede de diagnostic de la maladie d'alzheimer - Google Patents

Procede de diagnostic de la maladie d'alzheimer

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EP0983391A1
EP0983391A1 EP98933758A EP98933758A EP0983391A1 EP 0983391 A1 EP0983391 A1 EP 0983391A1 EP 98933758 A EP98933758 A EP 98933758A EP 98933758 A EP98933758 A EP 98933758A EP 0983391 A1 EP0983391 A1 EP 0983391A1
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EP
European Patent Office
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allele
gene
disease
expression
apoe
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EP98933758A
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EP0983391B1 (fr
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Marie-Christine Chartier-Harlin
Jean-Charles Lambert
Philippe Amouyel
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Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
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Publication date
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing Alzheimer's disease Alzheimer's disease is a neurodegenerative dementia characterized by a loss of cortical neurons associated with ⁇ -amyioid plaques, tangles of neurofib ⁇ lles and, in most cases, amyloid angiopathy There are strong presumptions for a genetic influence in the etiology of Alzheimer's disease (WO 94/01772)
  • chromosomal regions Four chromosomal locations have been described as being involved three on chromosomes 1, 14 and 21 in familial forms with early onset (age of onset less than 60 years), and one on chromosome 19 in familial and sporadic forms with late onset Two linkage studies have suggested that the 19q13 2 chromosomal region is associated with late-onset familial forms of Alzheimer's disease (Pencak-Vance et al, Am J Hum Genêt (1991), 48, 1034-1050) Within this chromosomal region, the group of apolipoproteins (APO) genes E-CI-CI'-CII is a candidate area Among the products of these genes, rapolipoprotein E (APOE) is particularly involved in the nervous system APOE is present in senile plaques and has a binding affinity with the A ⁇ peptide APOE is characterized by three major alleles ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4 St ⁇ ttmatter et al (Proc Nat
  • FR-2 716 894 describes a process making it possible to predict for a given patient the risks of developing Alzheimer's disease compared to the general population This process is based on the demonstration of the ⁇ 4 alleles of the APOE gene, short alleles of the marker D19S178 and long alleles of the APO Cil gene all located on chromosome 19
  • the inventors' studies show differences in significant expression levels in sick subjects compared to healthy controls, which indicates that one or more mutations in the regulatory regions of the APOE gene are involved in the onset of Alzheimer's disease In addition, relative differences in expression are found in the controls
  • the inventors have more particularly demonstrated a new polymorphism in the region of the promoter of the gene coding for the protein apo poproteme E found in a potential binding site of the Th1 / E47cs transcription factors.
  • Th1 / E47cs for Th1 / E47cs consensus, insofar as it is in a consensus sequence of binding of the transcription factor Th1 / E47cs
  • the mutation revealed is characterized by the substitution of a Thymine for Guanine (G ⁇ T) in the sequence GGGTGTCTGT (or G) ATTACTGGG, G being the most frequent allele in the normal population.
  • the alleles corresponding to this polymorphism are hereinafter called T (when the base is Thymine) or G (when the base is Guanine)
  • T when the base is Thymine
  • G when the base is Guanine
  • the determination of the allele can be carried out after PCR amplification of the DNA region comprising this polymorphism
  • the inventors studied the influence of the Th1 / E47cs polymorphism on the expression of alleles of the APOE gene and highlighted an increased risk of developing Alzheimer's disease associated with the T allele of Th1 / E47cs, specific to this allele and not due to the ⁇ 4 allele
  • the Th1 / E47cs polymorphism modulates the risk associated with the ⁇ 4 allele in individuals with the ⁇ 3 / ⁇ 4 genotype, GT genotype individuals with an increased risk of developing Alzheimer's disease compared to individuals homozygous for the Th1 / polymorphism.
  • the subject of the invention is therefore a method for diagnosing Alzheimer's disease, comprising the demonstration of one or more mutations in the genomic DNA region regulating the expression of the rapolipoprotein E gene, inducing a modification of the expression of rapolipoprotein E gene compared to a control population or a change in the relative expression of alleles of the apolipoprotein E gene
  • diagnostic within the meaning of the present invention, is meant the confirmation of a mutation in the regulatory region of the APOE gene in a patient whose clinical picture indicates symptoms which can be attributed to Alzheimer's disease, or still an increased probability in subjects of developing Alzheimer's disease compared to the whole population, the increase in the probability being statistically significant
  • the chromosomal DNA region regulating the APOE gene is broadly defined as being the chromosomal region 19q13 2 other than the region coding for rapolipoprotein E (Human Molecular Genetics, 1994, vol 3, no 4, 569-574) , the region of chromosomal DNA in which one or more mutations is highlighted is located between the marker D19S178 and the APOCII gene, and more particularly comprises the introns and the flanking regions of the APOE gene, extending over a distance of 5 kb upstream and downstream of the APOE gene
  • the subject of the invention is more particularly a method for diagnosing Alzheimer's disease comprising the detection of at least one mutation in the promoter of the APOE gene, located at 186 bases of the TATA box of this gene, the mutation consisting more particularly in replacing T ⁇ G in the sequence defined above More particularly, the method consists in searching for one or more s mutations in the promoter region of the gene coding for apolipoprotein E, in particular located in
  • a subject of the invention is also a method for diagnosing Alzheimer's disease comprising determining the genotype of apol i poprotein E and searching for a mutation of the type described above in the regulatory region of the APOE gene.
  • the presence of at least one ⁇ 4 allele of rapolipoprotein E together with the existence of a mutation in the regulatory region of the APOE gene, in particular the mutation defined above inducing a modification of the expression of the APOE gene or a difference in relative expression of the apolipoprotein E alleles if appropriate will lead to the diagnosis of Alzheimer's disease in patients whose clinical picture presents symptoms which can be attributed to a disease of Alzheimer or will classify his subjects in good health in a category at increased risk of developing Alzheimer's disease
  • relative difference of expression of the alleles is meant a difference of expression of one allele compared to the other, independently of the absolute level of expression of the gene.
  • the search for the ⁇ 4 allele is made by any suitable method based on the presence of an ARG residue in position 1 12 of apolipoprotein E for the ⁇ 4 allele, of a CYS residue in position 158 for the ⁇ 2 allele, by compared to CYS and ARG residues in these positions for the ⁇ 3 isoform, the most widespread
  • the demonstration of an additional mutation in the regulatory regions of the APOE gene as defined above is carried out by any suitable method, in particular a method for diagnosing Alzheimer's disease comprising the detection of at least a mutation in the promoter of the gene encoding APOE, located 186 bases from the TATA box of this gene
  • a method for diagnosing Alzheimer's disease comprising the detection of at least a mutation in the promoter of the gene encoding APOE, located 186 bases from the TATA box of this gene
  • the presence of at least one ⁇ 4 allele of the APOE gene, at least one short allele of the marker D19S178 and at least one long allele of the APO C1 gene as described in FR-2 716 894 and the existence of at least one mutation in the regulatory region of the APOE gene will greatly contribute to orienting the diagnosis of Alzheimer's disease in symptomatic subjects or will constitute an important risk factor in asymptomatic subjects Since the mutation (s) involved in Alzheimer's disease are responsible for a variation in the relative expression of all
  • the diagnostic method based on the determination of the level of expression of apolipoprotein E is particularly interesting in heterozygous subjects, in particular carriers of the ⁇ 4 allele.
  • the diagnostic method within the meaning of the invention advantageously comprises the determination of the level of expression of the ⁇ 4 allele relative to the ⁇ 2 or ⁇ 3 allele.
  • the method of diagnosis in individuals genotypes ⁇ 2 / ⁇ 3 advantageously comprises the determination of the level of expression of the ⁇ 2 allele relative to the ⁇ 3 allele.
  • a significant increase or decrease, respectively, in the expression / transcription rate of the ⁇ 4 allele in a heterozygous ⁇ 4 ⁇ 2 or ⁇ 4 ⁇ 3 subject and of the ⁇ 2 allele in a heterozygous subject ⁇ 2 ⁇ 3, will guide the diagnosis towards Alzheimer's type dementia , if, moreover, the subject presents a clinical picture evoking the symptomatology of Alzheimer's disease.
  • the increase or decrease in expression of the ⁇ 4 and ⁇ 2 alleles, respectively will be an indication of an increased probability in this subject of developing Alzheimer's disease later.
  • the determination of the level of expression of the APOE gene and more particularly of the ⁇ 4 and ⁇ 2 alleles of the APOE gene is advantageously carried out by measuring the relative level of the mRNAs of the APOE gene either by establishing the transcription ratio of the ⁇ 4 allele part relation to the ⁇ 2 or ⁇ 3 allele in the case of individuals genotypes ⁇ 4 ⁇ 2 and ⁇ 4 ⁇ 3, either in establishing the transcription ratio of the ⁇ 2 allele relative to the ⁇ 3 allele in the case of individuals with the ⁇ 2 ⁇ 3 genotypes
  • the measurement of the transcription rate is carried out following the extraction of mRNA from biopsy tissues or cells in cultures and amplification by RT-PCR (polymerase chain reaction by reverse transcription), using specific suitable primers. of the allele whose expression level we are trying to measure
  • the tissue used is for example from a biopsy of brain tissue, in particular of the frontal lobes, thus allowing the measurement of the level of expression of the APOE alleles in the brain. It is also possible to determine the transcription rate of the mRNAs. of APOE in lymphocytes or fibroblasts placed in cell culture In general, it will be possible to determine the rate of transcription of the APOE alleles in any tissue capable of exhibiting a variation in the percentage of expression of one allele compared to another between patients and patients Similarly, this method can also be applied for the development and use of cellular or animal models using APOE alleles
  • the ratio of expression of the alleles of the APOE gene is determined as follows a) the cDNA is subjected to a PCR amplification in the presence of primers allowing the specific amplification of at least one polymorphic sequence of the alleles, b ) the amplified DNA is subjected to the action of at least one restriction enzyme, allowing the differentiation of the alleles, c) the DNA fragments are separated, d) the quantity of fragments obtained is evaluated by means of a marker emitting a detectable signal, e) the initial ratio is determined in the various alleles, by the following formula No. allele 1 A ⁇ 'allele 1
  • N 0 is the initial number of DNA molecules
  • A is the proportionality coefficient making it possible to correct the difference in size between the different restriction fragments and is equal to the ratio of the lengths of restriction fragments characteristic of each allele , and ⁇ 'is determined
  • V is the volume of the sample obtained by PCR 25 subjected to step c) and DO is the optical density measured
  • DO a DO in which DO is the optical density measured, V is the volume of the sample obtained by PCR subjected to step c) and DO max is the maximum optical density which can be measured, the amplification coefficient Ei of the DNA containing allele 1 being identical to the amplification coefficient E 2 of the DNA containing allele 2, for the various alleles of APOE.
  • the DNA amplified in step a) is according to the invention a cDNA comprising the allelic sequences of interest, obtained from mRNA by the usual RT-PCR technique
  • the alleles are differentiated according to steps b) and c ) described above, which highlight the restriction polymorphisms (RFLP)
  • the separation of the DNA fragments according to step c) can be carried out in particular by gel electrophoresis, preferably by polyacrylamide gel electrophoresis
  • the alleles ⁇ 3, ⁇ 2 and ⁇ 4 can be characterized by restriction fragments of 91 bp, 83 bp and 72 bp respectively
  • ADO a ⁇ è ⁇ e ⁇ + DO a ⁇ i è i e 2 DO 91 bp
  • This method is also particularly simple. It suffices, in fact either to transfer the value of the optical density (OD) as a function of the volume V of the sample, the curve representative of the function f such that
  • DO f (V) can be plotted using the least squares method, and to determine DO max and K 'from this curve, that is to report the value 1 / Do as a function of the inverse of the sample volume, namely 1 / V,
  • the subject of the invention is also a method for diagnosing Alzheimer's disease comprising the determinations of the phase of the various polymorphisms ⁇ , etTh1 / E47cs and possibly of -491 AT and 1 E1 likely to entail an increased risk of developing the Alzheimer's disease.
  • the risk associated with the GT genotype is greater than that associated with the GG genotype.
  • This observation could be explained by taking into account the phase of the Th1 / E47cs and ⁇ 2, ⁇ or ⁇ 4 polymorphisms of APOE.
  • the risk of developing the disease depends on the association of the G allele and the ⁇ 4 allele on the same chromosome, thus determining the phase of the ⁇ and Th1 / E47cs polymorphisms of APOE. According to this phase, two possibilities exist: (i) a higher level of expression of ⁇ 4, (ii) a higher level of expression of the ⁇ 3 allele.
  • the first possibility would lead to a physiological response in favor of the properties of the isomorph APO ⁇ 4 and would explain a more marked effect in individuals carrying the ⁇ 3 ⁇ 4 and GT genotypes. This difference in the rate of expression linked to the phase will be true for all heterozygous genotypes. However, the risk associated with the G allele is probably attenuated due to the different possible combinations between the ⁇ and Th1 / E47cs polymorphisms of APOE.
  • phase of the polymorphisms of APOE and of Th1 / E47cs is studied as follows:
  • a fragment of 4600 bp containing the ⁇ polymorphisms of APOE and Th1 / E47cs is amplified by PCR. This amplification is carried out using the extend long template PCR System kit (Boehnnger) with for meaning o gonucleotide
  • the amplification product is then digested with the restriction enzyme Afl III, the only cleavage site of which on the amplified fragment makes it possible to differentiate the allele ⁇ 4 from the allele ⁇ 3
  • the DNA is transferred onto a nitrocellulose membrane and fixed under UV
  • the discrimination between the T allele and the G allele is carried out by a protocol similar to that used for genotyping by ASO of this polymorphism
  • subjects suffering from Alzheimer's disease have a predisposition to respond to certain therapies, in particular to cholinomimetic type therapies depending on the type and number of copies of the alleles of the APOE gene.
  • a method of identifying subjects suffering from Alzheimer's disease capable of responding to a given therapy for example of the choii ⁇ omimetic type comprising a) determining the genotype of rapolipoprotein E, b) determining the genotype of the Th1 polymorphism / E47cs, and c) optionally, the determination of the phase of the apolipoprotein E and Th1 / E47cs polymorphisms
  • the different polymorphisms of APOE and Th1 / E47cs can be used to create animal or cellular models expressing APOE better or worse, used alone or in combination with genetic factors capable of influencing the development of pathology such as APP, PS1, PS2, etc. or other markers of Alzheimer's disease such as abnormal phosphorylation of the Tau protein
  • the invention therefore also relates to a vector for transfection of eukaryotic cells comprising at least one allele of the APOE gene and an allele of the Th1 / E47cs polymorphism and possibly one or more other alleles of other genes or markers close to this gene, capable of modifying the risk of developing Alzheimer's disease compared to a normal population
  • vectors can be used for the production of transfected eukaryotic cells or transgenic animals
  • Another object of the invention therefore consists of eukaryotic cells transfected using a vector as defined above or transgenic animals produced using such a vector
  • the PCR reaction volume of 25 ⁇ l contained the primer F6 (5'-TAA GCT TGC CAC GGC TGT CCA AGG A-3 ') at 50 pmolar, the dNTPs at 0.5 mM, MgCI 2 at 0.1 mM, 0.1% triton X-100, 15% glycerol and 0.05-unit Taq-Polymerase (Eurogentec)
  • the method for calculating the differential expression of mRNAs is that described above.
  • the OD was estimated by the software ⁇ Imagemaster (Pharmacia)
  • the length of the restriction fragments was determined to be 91 bp for the ⁇ 3 allele, 83 bp for the ⁇ 2 allele and 72 bp for the ⁇ 4 allele
  • FIG. 1 showing the amplification products by RT-PCR after staining
  • FIG. 2 representing the expression of the mRNAs of heterozygous individuals ⁇ 2 ⁇ 3, ⁇ 3 ⁇ 4 and ⁇ 2 ⁇ 4 suffering from Alzheimer's disease and of controls.
  • the black lines represent the means.
  • the arrows represent the expected values of the expression rate of the ⁇ 4 allele in individuals genotypes ⁇ 2 / ⁇ 4. These values were estimated from the percentages observed for the ⁇ 2 and ⁇ 4 alleles in individuals with the ⁇ 2 / ⁇ 4 and ⁇ 3 / ⁇ 4 genotypes, respectively.
  • FIG. 3 shows the measurement of the expression rate of the ⁇ 4 allele in healthy young subjects with no cognitive impairment at the time of sampling and in demented subjects with a probable diagnosis of Alzheimer's disease.
  • FIG. 4 shows the percentage of expression of the ⁇ 4 allele in patients and controls according to the Th1 / E47cs and -491 AT genotypes. Control individuals are represented by circles and patients by triangles. The black patterns correspond to individuals heterozygous genotypes for the -491 AT polymorphism. Expression means are represented by black bars.
  • the number of subjects was 49 for patients with Alzheimer's disease and 45 for controls.
  • the results show that the expression of the mRNA of the ⁇ 3 allele was in all cases greater than that of the mRNA of the ⁇ 4 allele, this in all cases. This result is consistent with known measurements of the levels of APOE proteins found in the brains of individuals whose genotype has been determined. In this study, it was shown that the level of APOE in ⁇ 3 homozygotes was higher than that of ⁇ 3 ⁇ 4 heterozygotes, which itself was higher than that of ⁇ 4 homozygotes.
  • lymphocytes In order to find out whether the difference in expression of the APOE alleles is specific to the brain or perhaps found in other tissues that are easier to obtain during the patient's lifetime (lymphocytes, fibroblasts), the authors studied the differential expression of APOE alleles in lymphocytes. The results of this study are given below.
  • a blood sample is taken from individuals with probable Alzheimer's disease and from young individuals with no cognitive impairment at the time of the study. All these individuals have the distinction of being genotype ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the separation of the lymphocytes is carried out on a Leucosep tube containing a Ficoll gradient (). After several washes of the lymphocytes with RPMI, these are resuspended in a culture medium composed of RPMI, 10% FCS, 2 mM of glutamate, 100 ⁇ M of streptopenicillin and 1% of phytohemagagutinin (Gibco / Brl) . The cell concentration is then 1 million cells per ml. The cells in suspension are cultured for 48 hours for example.
  • lymphocytes patients express the ⁇ 4 allele at a level close to that observed in the brains of patients ⁇ 3 ⁇ 4 genotypes.
  • a fragment of 375 base pairs was amplified by PCR with the primers for the sense strand 5'TAC ll IC ll I CTGGGATCCAGG 3 'and for the antisense strand 5'ACTCAAGGATCCCAGACTTG 3'.
  • the amplification is carried out over 35 cycles (ohgonucleotide hybridization temperature 53 ° C) in a buffer containing 1 mM of final MgCl 2
  • the fragment obtained was sequenced according to the conditions described in the pretreatment kits (US 70993-Amersham ) and sequencing (USB-Amersham-T7 PCR product sequencing kit)
  • the amplification of a fragment of 228 base pairs containing the poly LBP1 polymorphism is carried out during 40 cycles in the presence of
  • the temperature of hybridization of the ohgonucleotides is 53 ° C.
  • the antisense o gonucleotide is identical to that used for sequencing The sense ohgonucleotide is as follows
  • 5'AGAATGGAGGAGGGTGCCTG 3 'In bold represents the modified nucleotide allowing the creation of a cleavage site with the allele
  • LBP1 is based on the protocol described by Tiret et al, (1994, Lancet, vol 344, 910-913)
  • the specific modifications to the detection of poly LBP1 polymorphism concerning the ohgonucleotides and the washing temperatures are as follows: the allele G specific oligonucleotide has the sequence 5'GCCCAGTAATCCAGACACCC 3 'with a washing temperature of 61 ° C, the T allele specific oligonucleotide for sequence 5 'GCCCAGTAATACAGACACCC 3' with for washing temperature 62 ° C
  • Three polymorphisms of the APOE locus were tested on the Th1 / E47cs polymorphism using the methods described previously, the 1 E1 polymorphism according to the technique used by Mui et al.
  • CI represents the 95% confidence interval
  • the level of expression of the APOE alleles is increased by the existence of cis mutations in the promoter region of the APOE gene, three implications must be verified (1) the mutation located in the promoter must modulate the expression of the APOE alleles, thus highlighting the deleterious effect of the ⁇ 4 allele or accentuating the protective effect of the ⁇ 2 allele, (2) since what determines the risk would be the relative level expression of the two APOE alleles in heterozygous individuals, this mutation must not have the same impact in the population of heterozygous genotype for APOE compared to the population of homozygous genotype (3) the effect of a cis mutation in heterozygous individuals must depend on the phase of this polymorphism with APOE alleles (ie the haplotype) In individuals carrying a copy of the heterozygous ⁇ 4 allele for the Th1 / E47cs genotype , the ⁇ 4 allele can be associated either with the T allele or with the G allele of Th1 /
  • the results of the authors show that the promoter region of the APOE gene have mutations capable of promoting the development of Alzheimer's disease, in particular the Th1 / E47cs polymorphism, independently to the ⁇ polymorphisms of the APOE gene
  • This polymorphism modifies the impact of the ⁇ 4 allele in the population studied, defining within the population ⁇ 3 / ⁇ 4, subpopulations presenting different risks, the individuals being heterozygous for the polymorphism
  • Th1 / E47cs presenting the greatest risk
  • the estimation of the phase allows a better understanding of the sub-population most at risk, that is to say that presenting the association of the ⁇ 4 allele and the T allele same chromosome
  • Th1 / E47cs polymorphism is localized in a consensus site for binding of the transcription factor Th1 / E47 and more particularly in the site for binding of the helix-loop-héhce transcription factor E47
  • This factor belongs to the proteins of class A, which are ubiquitously expressed and form multiple combinations with class B proteins to control tissue-specific expression of genes (Murre et al., Cell, Vol 15, 451-459)
  • E47 is expressed in the brain, associated with multiple class B proteins and involved in the development and maintenance of the mammalian nervous system.
  • NS.longeddrwdu is a genotype ⁇ 2 / ⁇ 2 in the population t e moin Table 2. Linkage imbalance in the chromosomal region 19q 13.2. region.
  • the APOE polymorphism was analyzed as a biallelic marker (allele 4 versus allele 2 or 3) Above the diagonal of the table is represented the coefficient of standardized linkage disequilibrium Below this diagonal is represented the percentage of maximum link imbalance for the given allelic frequencies.
  • Chromosome number 522 506 b Population of genotype ⁇ 3 / ⁇ 3 Haplotype Polvmorphisms Estimated frequencies of haplotypes number D19S178 Thl / E47cs 1E1 control cases Witnesses expected
  • Haplotype Polymo ⁇ hismes Estimated frequencies of haplotypes
  • Chromosome Number 204 78 Table 4 OR estimated by multiple logistic regression
  • the genotypic distributions are in Hardy-Wcinbcrg equilibrium in the control populations.

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Abstract

Cette invention concerne un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN génomique de régulation de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E, induisant une modification de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E, par rapport à une population témoin ou une modification de l'expression relative des allèles du gène de l'apolipoprotéine E.

Description

"Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer"
La présente invention concerne un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer La maladie d'Alzheimer est une démence neurodégénérative caractérisée par une perte de neurones corticaux associée à des plaques β- amyioides, des enchevêtrements de neurofibπlles et, dans la plupart des cas, une angiopathie amyloide II existe de fortes présomptions pour une influence génétique dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer (WO 94/01772)
Cette composante génétique a été mise en évidence depuis de nombreuses années par des observations indirectes qui suggèrent une hérédité sur le mode autosomique dominant et une pénétraπce dépendante de l'âge pour expliquer certaines formes familiales de la maladie d'Alzheimer Des études de génétique moléculaire récentes ont permis d'isoler des gènes putatifs de la maladie d'Alzheimer par la recherche de marqueurs génétiques polymorphes spécifiques de chromosomes (Bird et al , 1989 Neurobiology of Aging 10, 432-434)
Quatre localisations chromosomiques ont été décrites comme étant impliquées trois sur les chromosomes 1 , 14 et 21 dans les formes familiales à survenue précoce (âge de survenue inférieur à 60 ans), et une sur le chromosome 19 dans les formes familiales et sporadiques à survenue tardive Deux études de liaison ont suggéré que la région chromosomique 19q13 2 était associée à des formes de maladie d'Alzheimer familiales à survenue tardive (Pencak-Vance et al, Am J Hum Genêt (1991 ), 48, 1034-1050) Au sein de cette région chromosomique, le groupe de gènes d'apolipoprotéines (APO) E-CI-CI'-CII est une zone candidate Parmi les produits de ces gènes, rapolipoprotéine E (APOE) est particulièrement impliquée dans le système nerveux APOE est présente dans les plaques séniles et possède une affinité de liaison avec le peptide Aβ L'APOE se caractérise par trois allèles majeurs ε2, ε3, ε4 Stπttmatter et al (Proc Natl Acad Sci (1993) 90, 177-181 ) ont décrit une fréquence augmentée de l'allèle ε4 du gène APOE dans les formes familiales de la maladie d'Alzheimer à survenue tardive Cette observation a été confirmée pour les formes familiales (Corder et al , Science (1993), 261 , 921-923) et les formes sporadiques de la maladie d'Alzheimer (Corder et al , Science (1993), 261 , 921-923, Saunders et al , Neurology (1993), 13, 1467-1472)
FR-2 716 894 décrit un procédé permettant de pronostiquer pour un malade donné les risques de développer la maladie d'Alzheimer par rapport à la population générale Ce procédé repose sur la mise en évidence des allèles ε4 du gène APOE, des allèles courts du marqueur D19S178 et des allèles longs du gène APO Cil tous localisés sur le chromosome 19
Plusieurs hypothèses permettent d'expliquer ce phénomène
Des travaux récents des inventeurs auteurs de la présente invention viennent à présent confirmer l'hypothèse de l'existence d'au moins une autre mutation fonctionnelle dans la région 19q13 2
En effet, en plus d'un effet fonctionnel propre du polymorphisme de rapolipoprotéine E, les études des inventeurs montrent des différences de niveaux d'expression significatifs chez les sujets malades par rapport aux témoins sains, ce qui indique qu'une ou plusieurs mutations dans les régions de régulation du gène APOE sont impliquées dans la survenue de la maladie d'Alzheimer De plus, des différences d'expression relatives sont retrouvées chez les témoins
Les inventeurs ont plus particulièrement mis en évidence un nouveau polymorphisme dans la région du promoteur du gène codant pour la protéine apo poprotéme E se trouvant dans un site de fixation potentiel des facteurs de transcription Th1/E47cs
Pour la détermination de ce polymorphisme, on prendra comme référence la séquence décrite par Paik et al (1985, Proc Natl Aca
Ce polymorphisme a été dénommé par les inventeurs Th1/E47cs pour Th1/E47cs consensus, dans la mesure où il se situe dans une séquence consensus de fixation du facteur de transcription Th1/E47cs La mutation mise en évidence se caractérise par la substitution d'une Thymine en Guanine (G → T) dans la séquence GGGTGTCTGT(ou G)ATTACTGGG, G étant l'allèle le plus fréquent dans la population normale
Les allèles correspondant à ce polymorphisme sont dénommés ci-après T (lorsque la base est la Thymine) ou G (lorsque la base est la Guanine) La détermination de l'allèle peut être réalisée après amplification par PCR de la région d'ADN comprenant ce polymorphisme
- soit en créant dans une des amorces de la PCR un site de clivage pour une enzyme de restriction, n'existant pas chez les individus porteurs d'un des allèles, - soit par une technique d'hybridation utilisant des sondes oligonucléotidiques spécifiques des allèles
Les inventeurs ont étudié l'influence du polymorphisme Th1/E47cs sur l'expression des allèles du gène de l'APOE et mis en évidence une augmentation du risque de développer la maladie d'Alzheimer associé à l'allèle T de Th1/E47cs, propre à cet allèle et non dû à l'allèle ε4
De plus, le polymorphisme Th1/E47cs module le risque associé à l'allèle ε4 chez les individus génotypes ε3/ε4, les individus génotypes GT présentant un risque accru de développer la maladie d'Alzheimer par rapport aux individus homozygotes pour le polymorphisme Th1/E47cs Confortant cette observation, les auteurs ont estimé que l'association de l'allèle T de Th1/E47cs avec l'allèle ε4 sur le même chromosome correspond à la combinaison la plus défavorable
L'invention a ainsi pour objet un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN génomique de régulation de l'expression du gène de rapolipoprotéine E, induisant une modification de l'expression du gène de rapolipoprotéine E par rapport à une population témoin ou une modification de l'expression relative des allèles du gène de apolipoprotéine E
Par diagnostic, au sens de la présente invention, on entend la confirmation d'une mutation dans la région de régulation du gène APOE chez un patient dont le tableau clinique fait état d'une symptomatologie pouvant être attribuée à la maladie d'Alzheimer, ou encore une probabilité accrue chez des sujets de développer la maladie d'Alzheimer par rapport à l'ensemble d'une population, l'accroissement de la probabilité étant statistiquement significative
La région d'ADN chromosomique de régulation du gène APOE est définie de manière large comme étant la région chromosomique 19q13 2 autre que la région codant pour rapolipoprotéine E (Human Molecular Genetics, 1994, vol 3, n° 4, 569-574) Avantageusement, la région d'ADN chromosomique dans laquelle on met en évidence une ou plusieurs mutations est située entre le marqueur D19S178 et le gène APOCII, et comprend plus particulièrement les introns et les régions flanquantes du gène APOE, s'étendant sur une distance de 5kb en amont et en aval du gène APOE L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant la mise en évidence d'au moins une mutation dans le promoteur du gène APOE, située à 186 bases de la boîte TATA de ce gène, la mutation consistant plus particulièrement en le remplacement T → G dans la séquence définie ci-dessus Plus particulièrement, le procédé consiste à rechercher une ou plusieurs mutations dans la région du promoteur du gène codant pour apolipoprotéine E notamment se trouvant dans un site de fixation potentiel des facteurs de transcription TM/E47
L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant la détermination du génotype de apolipoprotéine E et la recherche d'une mutation du type décrit ci-dessus dans la région de régulation du gène APOE Conformément à cette méthode de diagnostic, la présence d'au moins un allèle ε4 de rapolipoprotéine E conjointement à l'existence d'une mutation dans la région de régulation du gène APOE, en particulier la mutation définie ci-dessus induisant une modification de l'expression du gène APOE ou une différence d'expression relative des allèles de apolipoprotéine E le cas échéant, orientera vers le diagnostic d'une maladie d'Alzheimer chez des patients dont le tableau clinique présente une symptomatoiogie pouvant être attribuée à une maladie d'Alzheimer ou permettra de classer ses sujets en bonne santé dans une catégorie à risque accru de développer une maladie d'Alzheimer
Par différence d'expression relative des allèles, on entend une différence d'expression d'une allèle par rapport à l'autre, indépendamment du niveau absolu d'expression du gène
La recherche de l'allèle ε4 est faite par toute méthode appropriée basée sur la présence d'un résidu ARG en position 1 12 de apolipoprotéine E pour l'allèle ε4, d'un résidu CYS en position 158 pour l'allèle ε2, par rapport aux résidus CYS et ARG dans ces positions pour l'isoforme ε3, la plus répandue
La mise en évidence d'une mutation supplémentaire dans les régions de régulation du gène APOE telles que définies ci-dessus est réalisée par toute méthode appropriée, notamment un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant la mise en évidence d'au moins une mutation dans le promoteur du gène codant APOE, située à 186 bases de la boîte TATA de ce gène La présence d'au moins un allèle ε4 du gène APOE, d'au moins un allèle court du marqueur D19S178 et d'au moins un allèle long du gène APO Cil comme décrit dans FR-2 716 894 et l'existence d'au moins une mutation dans la région de régulation du gène APOE contribueront fortement à orienter le diagnostic de la maladie d'Alzheimer chez des sujets symptomatiques ou constitueront un facteur de risque important chez des sujets asymptomatiques Dans la mesure où la (les) mutation(s) impliquée(s) dans la maladie d'Alzheimer sont à l'origine d'une variation de l'expression relative des allèles du gène APOE dans le cerveau, il est également possible de déterminer, au lieu de ou en complément d'une mutation dans les régions de régulation du gène APOE définies ci-dessus, le taux d'expression du gène APOE et de comparer ce taux d'expression à celui de la population générale.
La méthode de diagnostic basée sur la détermination du taux d'expression de apolipoprotéine E est particulièrement intéressante chez les sujets hétérozygotes, notamment porteurs de l'allèle ε4. Chez ces sujets, la méthode de diagnostic au sens de l'invention comprend avantageusement la détermination du taux d'expression de l'allèle ε4 par rapport à l'allèle ε2 ou ε3.
De la même manière, la méthode de diagnostic chez les individus génotypes ε2/ε3 comprend avantageusement la détermination du taux d'expression de l'allèle ε2 par rapport à l'allèle ε3.
Une augmentation ou une diminution significative, respectivement, du taux d'expression/de transcription de l'allèle ε4 chez un sujet hétérozygote ε4ε2 ou ε4ε3 et de l'allèle ε2 chez un sujet hétérozygote ε2ε3, orientera le diagnostic vers une démence de type Alzheimer, si par ailleurs le sujet présente un tableau clinique évoquant la symptomatoiogie de la maladie d'Alzheimer. Chez un sujet ne présentant pas de signes cliniques apparents, l'augmentation ou la diminution d'expression des allèles ε4 et ε2 respectivement, sera une indication d'une probabilité accrue chez ce sujet de développer ultérieurement la maladie d'Alzheimer.
La détermination du taux d'expression du gène APOE et plus particulièrement des allèles ε4 et ε2 du gène de l'APOE est réalisé avantageusement par mesure du taux relatif des ARNm du gène APOE soit en établissant le rapport de transcription de l'allèle ε4 part rapport à l'allèle ε2 ou ε3 dans le cas des individus génotypes ε4ε2 et ε4ε3, soit en établissant le rapport de transcription de l'allèle ε2 par rapport à l'allèle ε3 dans le cas des individus génotypes ε2ε3
La mesure du taux de transcription est réalisée suite à l'extraction d'ARNm de tissus biopsiques ou de cellules en cultures et amplification par RT-PCR (Réaction de Polymérisation en chaîne par transcription inverse), à l'aide d'amorces appropriées spécifiques de l'allèle dont on cherche à mesurer le taux d'expression
Le tissu utilisé est par exemple issu d'une biopsie de tissu cérébral, notamment de lobes frontaux, permettant ainsi la mesure du taux d'expression des allèles de l'APOE dans le cerveau II est également possible de déterminer le taux de transcription des ARNm de l'APOE dans des lymphocytes ou des fibroblastes mis en culture cellulaire De façon générale il sera possible de déterminer le taux de transcription des allèles de l'APOE dans n'importe quels tissus susceptible de présenter une variation du pourcentage d'expression d'un allèle par rapport à un autre entre les patients et les malades De même cette méthode peut s'appliquer également pour la mise au point et l'usage de modèles cellulaires ou animaux utilisant les allèles de l'APOE
Le rapport de l'expression des allèles du gène APOE est déterminé de la manière suivante a) on soumet l'ADNc à une amplification par PCR en présence d'amorces permettant l'amplification spécifique d'au moins une séquence polymorphe des allèles , b) on soumet l'ADN amplifié à l'action d'au moins une enzyme de restriction, permettant la différenciation des allèles , c) on sépare les fragments d'ADN , d) on évalue la quantité de fragments obtenus au moyen d'un marqueur émettant un signal détectable , e) on détermine le rapport initial en les différents allèles, par la formule suivante N o allèle 1 Aα' allèle 1
N0 allèle 1 + N0 allèle 2 Aα' allèle 1 + «.'allèle 2
5 dans laquelle N0 est le nombre initial de molécules d'ADN, A est le coefficient de proportionnalité permettant de corriger la différence de taille entre les différents fragments de restriction et est égal au rapport des longueurs de fragments de restriction caractéristiques de 10 chaque allèle, et α' est déterminé
• soit par la formule suivante
, - ι DO, max
15 α =
K' dans laquelle DOmax est la densité optique maximale qui peut être mesurée,
K' est une constante,
DOmax et K' étant déterminés par la fonction f suivante
20
DO
DO = f(V) = y-^ v
(K'+V)
dans laquelle V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR 25 soumis à l'étape c) et DO est la densité optique mesurée ,
• soit par la fonction g suivante
1 f 1 λ 1 1 1 x— +
DO a ; α' V DO dans laquelle DO est la densité optique mesurée, V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et DOmax est la densité optique maximale qui peut être mesurée , le coefficient d'amplification Ei de l'ADN contenant l'allèle 1 étant identique au coefficient d'amplification E2 de l'ADN contenant l'allèle 2, pour les différents allèles de l'APOE.
L'ADN amplifié dans l'étape a) est selon l'invention un ADNc comprenant les séquences alléliques d'intérêt, obtenu à partir d'ARNm par la technique usuelle de RT-PCR Les allèles sont différenciés selon les étapes b) et c) décrites ci-dessus, qui mettent en évidence les polymorphismes de restriction (RFLP)
La séparation des fragments d'ADN selon l'étape c) peut être réalisée notamment par électrophorèse sur gel, préférentiellement par électrophorèse sur gel de polyacrylamide
Dans le cas du gène APOE, les allèles ε3, ε2 et ε4 peuvent être caractérisés par des fragments de restriction respectivement de 91 pb, 83 pb et 72 pb
Le coefficient de proportionnalité A peut donc être calculé comme étant A= 91/72 pour les allèles ε3/ε4, A étant 83/72 pour les individus ε2/ε4 et A étant 91/83 pour les individus ε2/ε3 Pour ce dernier génotype, puisque les deux allèles ε2 et ε3 donnent une longueur de fragment de restriction de 91 pb, on a la relation ADOaιιèιe ι + DOaιièie 2 = DO91 pb
Cette méthode est en outre particulièrement simple II suffit, en effet soit de reporter la valeur de la densité optique (DO) en fonction du volume V de l'échantillon, la courbe représentative de la fonction f telle que
DO = f(V) pouvant être tracée en utilisant la méthode des moindres carrés, et de déterminer DOmax et K' à partir de cette courbe , soit de reporter la valeur 1/Do en fonction de l'inverse du volume de l'échantillon, à savoir 1/V,
1 ( la courbe représentative de la fonction g telle que — = JJ Pouvant être
tracée par régression linéaire, la pente de la droite obtenue étant égaie à l'inverse de α'.
L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant les déterminations de la phase des différents polymorphismes ε, etTh1/E47cs et éventuellement de -491 AT et 1 E1 susceptibles d'entraîner un risque accru de développer la maladie d'Alzheimer.
Au niveau de la population génotypée ε3ε4, le risque associé au génotype GT est supérieur à celui associé au génotype GG. Cette observation pourrait être expliquée en tenant compte de la phase des polymorphismes Th1/E47cs et ε2, ε ou ε4 de l'APOE. En effet, au niveau des hétérozygotes GT et ε3ε4, le risque de développer la maladie dépend de l'association de l'allèle G et de l'allèle ε4 sur le même chromosome, déterminant ainsi la phase des polymorphismes ε et Th1/E47cs de l'APOE. Suivant cette phase, deux possibilités existent : (i) un taux d'expression plus important de ε4, (ii) un taux d'expression plus important de l'allèle ε3. La première possibilité entraînerait une réponse physiologique en faveur des propriétés de l'isomorphe APOε4 et expliquerait un effet plus marqué au niveau des individus porteurs de génotypes ε3ε4 et GT. Cette différence du taux d'expression liée à la phase sera vraie pour tous génotypes hétérozygotes. Cependant, le risque associé à l'allèle G est probablement atténué en raison des différentes combinaisons possibles entre les polymorphismes ε et Th1/E47cs de l'APOE.
Conformément à l'invention la phase des polymorphismes de l'APOE et de Th1/E47cs est étudiée de la manière suivante :
Un fragment de 4600 pb contenant les polymorphismes ε de l'APOE et Th1/E47cs est amplifié par PCR. Cette amplification est réalisée en utilisant le kit extend long template PCR System (Boehnnger) avec pour o gonucléotide sens
5'-GGGGGAGGTGCTGGAATCT-3' et pour ohgonucléotide antisens 5'-CAGATGCGTGAAACTTGGTGA-3'
Le produit d'amplification est ensuite digéré par l'enzyme de restriction Afl III, dont le seul site de coupure sur le fragment amplifié permet de différencier l'allèle ε4 de l'allèle ε3 Après migration du produit de digestion sur gel d'agarose à 0,8 %, l'ADN est transféré sur membrane de nitrocellulose et fixé sous UV La discrimination entre l'allèle T et l'allèle G est réalisée par un protocole similaire à celui utilisé pour le genotypage par ASO de ce polymorphisme
En fonction des phases des polymorphismes APOE et Th1/E47cs, il sera possible de définir des sous-groupes de sujets malades et de déterminer pour chaque sous-groupe la thérapie optimale De même, la détermination de la phase avec d'autres polymorphismes des régions régulatrices du gène de l'APOE susceptibles d'influencer (ou non) son expression, tels que -491 AT décrit par Bul do et al , 1 E1 , APO Cl, APO Cil et D19S178 pourrait également s'avérer utile pour la détermination de sous groupes de sujets à risque élevé de développer la maladie
Ainsi on sait que les sujets atteints de la maladie d'Alzheimer ont une prédisposition à répondre à certaines thérapies, notamment aux thérapies de type cholinomimétique en fonction du type et du nombre de copies des allèles du gène de l'APOE L'invention a donc également pour objet une méthode d'identification de sujets atteints de la maladie d'Alzheimer susceptibles de répondre à une thérapie donnée, par exemple de type choiiπomimétique comprenant a) la détermination du génotype de rapolipoprotéine E , b) la détermination du génotype du polymorphisme Th1/E47cs, et c) éventuellement, la détermination de la phase des polymorphismes de apolipoprotéine E et de Th1/E47cs
Les différents polymorphismes de l'APOE et de Th1/E47cs peuvent être mis à profit pour créer des modèles animaux ou cellulaires exprimant mieux ou moins bien l'APOE, utilisés seuls ou en combinaison avec les facteurs génétiques susceptibles d'influencer le développement de la pathologie tels que l'APP, PS1 , PS2, etc ou les autres marqueurs de la maladie d'Alzheimer comme la phosphorylation anormale de la protéine Tau L'invention a donc également pour objet un vecteur de transfection de cellules eucaryotes comprenant au moins un allèle du gène APOE et un allèle du polymorphisme Th1/E47cs et éventuellement un ou plusieurs autres allèles d'autres gènes ou marqueurs proches de ce gène, susceptibles de modifier le risque de développer une maladie d'Alzheimer par rapport à une population normale
Ces vecteurs peuvent être utilisés pour la production de cellules eucaryotes transfectées ou d'animaux transgéniques
Un autre objet de l'invention est donc constitué par les cellules eucaryotes transfectées au moyen d'un vecteur tel que défini ci-dessus ou des animaux transgéniques produits au moyen d'un tel vecteur
On donnera ci-après les résultats d'une étude des taux d'expression des ARNm du gène APOE dans le cerveau
EXEMPLE 1 :
Expression dans le cerveau du gène APOE chez des malades atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport à des témoins sains
1 ) Extraction de l'ARN et amplification des transcripts Les tissus ont été choisis chez des témoins âgés de 65 ans ou plus et chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer à survenue tardive, dont le diagnostic a été confirmé par examen neuropathologique, avec des génotypes APOE hétérozygotes L'extraction de l'ARN a été réalisée sur des échantillons de lobes frontaux telle que décrit dans J Biol Chem 247, 4621-4627 (1972), ou en utilisant un kit d'extraction (QIAGEN) puis l'ARN a été digéré par DNase (Eurogentec) La RT-PCR a été effectuée à l'aide des amorces décrites dans J Lipid res 31 , 545-548 (1990) La réaction de transcription inverse a été conduite pendant 1 h 30 à 37° C, à l'aide de l'amorce F4 (5'- ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTA-3') à 50 pmolaire avec 1 μg d'ARN total comme matrice pour la transcriptase inverse M-MLV, conformément aux instructions du fabricant (Gibco/BRL) La PCR a été effectuée à 94° C pendant 10 minutes, suivie de 30 cycles à 58° C pendant 1 minute, 72° C pendant 1 minutes et 94° C pendant 1 minute
Le volume réactionnel de la PCR de 25 μl contenait l'amorce F6 (5'-TAA GCT TGC CAC GGC TGT CCA AGG A-3') à 50 pmolaire, les dNTP à 0,5 mM, du MgCI2 à 0,1 mM, du triton X-100 à 0, 1 %, du glycérol à 15 % et de la Taq-Polymérase à 0,05 unités (Eurogentec) La méthode de calcul de l'expression différentielle des ARNm est celle décrite ci-dessus
La DO a été estimée par le logiciel ©Imagemaster (Pharmacia)
La longueur des fragments de restriction a été déterminée à 91 pb pour l'allèle ε3, 83 pb pour l'allèle ε2 et 72 pb pour l'allèle ε4
La valeur du coefficient A correspond pour les génotypes ε3ε4 et ε2ε4 à A = 91/72 et A = 83/72 respectivement La valeur du coefficient A correspond pour les génotypes ε2ε3 à A=91/83 Le génotype ε2ε3 est caractérisé par les bandes à 94 et 83 pb Dans ce cas, étant donné que les deux allèles ε2 et ε3 donnent des fragments de restriction de 91 pb, AODε2 = ODε3 = OD 91 pb 2) Résultats
Les résultats sont rapportés aux figures 1 à 4 :
- la figure 1 représentant les produits d'amplification par RT- PCR après coloration; - la figure 2 représentant l'expression des ARNm d'individus hétérozygotes ε2ε3, ε3ε4 et ε2ε4 atteints de la maladie d'Alzheimer et de témoins. Les traits noirs représentent les moyennes. Les flèches représentent les valeurs attendues du taux d'expression de l'allèle ε4 chez les individus génotypes ε2/ε4. Ces valeurs ont été estimées à partir des pourcentages observés pour les allèles ε2 et ε4 chez les individus génotypes ε2/ε4 et ε3/ε4, respectivement.
- la figure 3 représente la mesure du taux d'expression de l'allèle ε4 chez des sujets sains jeunes ne présentant pas de troubles cognitifs au moment du prélèvement et chez des sujets déments présentant un diagnostic probable de maladie d'Alzheimer.
- la figure 4 représente le pourcentage d'expression de l'allèle ε4 chez les patients et témoins en fonction des génotypes Th1/E47cs et -491 AT. Les individus témoins sont représentés par les cercles et les malades par les triangles. Les motifs noirs correspondent aux individus génotypes hétérozygotes pour le polymorphisme -491 AT. Les moyennes d'expression sont représentées par les barres noires.
Le nombre de sujets était de 49 pour les patients atteints de la maladie d'Alzheimer et 45 pour les témoins. Les résultats montrent que l'expression de l'ARNm de l'allèle ε3 était dans tous les cas supérieure à celle de l'ARNm de l'allèle ε4, ceci dans tous les cas de figure. Ce résultat est concordant avec les mesures connues des niveaux des protéines APOE trouvés dans les cerveaux des individus dont le génotype a été déterminé. Dans cette étude, il a été montré que le niveau de l'APOE chez les homozygotes ε3 était supérieur à celui des hétérozygotes ε3ε4 qui lui-même était supérieur à celui des homozygotes ε4. Ajoutés les uns aux autres, ces résultats peuvent suggérer soit qu'il existe une différence de stabilité des différentes espèces d'ARNm ou qu'il existe une variabilité génétique de l'expression des deux allèles en déséquilibre avec le polymorphisme génétique. Toutefois, étant donné qu'il existe de plus une différence claire et consistante dans le rapport d'expression allélique entre les patients et les témoins, la seconde hypothèse est probablement la bonne. Les patients atteints de la maladie d'Alzheimer présentant une expression relative plus élevée de l'ARNm ε4 que les témoins ((34,9±2,7 % contre 22,9±2,4 respectivement ; p<0,0001 par un test non paramétrique de Mann et Wihtney) (figure 1 ). Une augmentation de l'expression de l'allèle ε4 est aussi détectée chez les patients génotypes ε2ε4 comparés aux témoins de même génotype (46,0±5,4% versus 28,0±2,8%, p<0,01 ) Par contre, une diminution significative de l'expression relative de l'allèle ε2 est mise en évidence dans le cerveau des patients génotypes ε2ε3 par rapport aux témoins de même génotype (32,8±4,5% versus 47,8±3,9%, p<0,002) (figure 1 ) Confirmant les données obtenues, les valeurs mesurées chez les individus malades ou témoins génotypes ε2ε4 correspondent aux valeurs estimées à partir des autres génotypes (figure 1 )
Dans le but de savoir si la différence d'expression des allèles de l'APOE est spécifique du cerveau ou peut-être retrouvée dans d'autres tissus plus faciles d'obtention du vivant du patient (lymphocytes, fibroblastes ), les auteurs ont étudié l'expression différentielle des allèles de l'APOE dans les lymphocytes. On donnera ci-après les résultats concernant cette étude.
EXEMPLE 2 : Expression dans les lymphocytes du gène
APOE chez des individus atteints de la maladie d'Alzheimer et des individus jeunes ne présentant pas, au moment de l'étude, de troubles cognitifs.
1 ) Séparation des lymphocytes et mise en culture Un prélèvement sanguin est réalisé sur des individus présentant une maladie d'Alzheimer probable et sur des individus jeunes ne présentant pas de troubles cognitif au moment de l'étude. Tous ces individus ont la particularité d'être génotype ε3ε4. La séparation des lymphocytes est réalisée sur tube Leucosep contenant un gradient de Ficoll (). Après plusieurs lavages des lymphocytes avec du RPMI, ceux-ci sont remis en suspension dans un milieu de culture composé de RPMI, 10% SVF, 2 mM de glutamate, 100 μM de strepto- penicilline et 1 % de phytohémaaglutinine (Gibco/Brl). La concentration cellulaire est alors de 1 million de cellules par ml. Les cellules en suspension sont mises en culture durant 48 heures par exemple.
2) Extraction de l'ARN et amplification des transcripts Les méthodes utilisées sont celles décrites précédemment dans l'exemple 1.
3) Résultats
Les auteurs observent un niveau d'expression supérieur de l'allèle ε3 par rapport à l'allèle ε4 chez tous les individus étudiés (qu'ils soient malades ou témoins), recoupant ainsi les observations faîtes dans le tissu cérébral. Dans les lymphocytes, les malades expriment l'allèle ε4 à un niveau proche de celui observé au niveau des cerveaux des malades génotypes ε3ε4. Sur les 7 individus potentiellement malades, tous présentent un taux d'expression de l'allèle ε4 similaire à celui obtenu à partir d'échantillons cérébraux d'individus pour lesquels le diagnostic de la maladie d'Alzheimer est certain.
Les auteurs ont étudiés l'expression relative de l'allèle ε4 chez 5 individus génotypes ε3ε4 et âgés de 23 à 55 ans ne présentant pas au moment du prélèvement de troubles cognitifs. Ceci a pour but de déterminer si une modification du taux d'expression de l'allèle ε4 peut être visible chez des individus ne présentant aucun signe clinique de la maladie d'Alzheimer. Il pourrait donc exister une possibilité de déterminer de façon précoce les individus à risque plus élevé de développer la maladie d'Alzheimer Sur les 5 individus étudiés, tous présentent un taux d'expression proche de celui observé dans le cerveau des témoins Ces résultats suggèrent que la sensibilité et la spécificité de ce test est donc excellente
En conclusion, il est intéressant de noter que le taux d'expression relatif de l'allèle ε4 serait similaire dans le tissu cérébral de malades de type Alzheimer certains et les lymphocytes de malades Alzheimer de type Alzheimer probables De même ce taux d'expression serait semblable dans ces deux types cellulaires pour les personnes ne présentant pas de troubles cognitifs Jusqu'à présent toutes les hypothèses cherchant à impliquer le rôle de l'APOE dans la maladie d'Alzheimer étaient basées sur le fait que les différents allèles de l'APOE étaient exprimés de façon équivalente et à des concentrations identiques dans le cerveau Les résultats de la présente invention montrent pour la première fois que ce n'est pas le cas et que les allèles sont exprimés de manière différente et que cette différence est significativement plus marquée chez les malades atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport à la population témoins Le même type d'étude pour les autres génotypes hétérozygotes du gène de l'APOE ainsi qu'une quantification absolue du gène de l'APOE quelque soit le génotype est en cours
En conclusion, les résultats jusqu'à présent obtenus, sont en accord avec l'existence d'une mutation dans les régions régulatrices du gène de l'APOE On donnera ci-après les résultats ayant conduit à la mise en évidence du polymorphisme Th ι/E47cs
EXEMPLE 3
Caractérisation du polymorphisme Th1/E47cs et impact de celui-ci dans la maladie d'Alzheimer. 1 Séαuencaαe de l'APOE
Un fragment de 375 paires de bases a été amplifié par PCR avec les amorces pour le brin sens 5'TAC l l I C l l I CTGGGATCCAGG 3' et pour le brin antisens 5'ACTCAAGGATCCCAGACTTG 3'. L'amplification est réalisée sur 35 cycles (température d'hybridation des ohgonucléotides 53°C) dans un tampon contenant 1 mM de MgCI2 final Le fragment obtenu a été séquence en suivant les conditions décrites dans les kits de prétraitement (US 70993-Amersham) et séquençage (USB-Amersham-T7 PCR product sequencing kit)
2 Détection du polymorphisme polv LBP1 par enzyme de restriction
L'amplification d'un fragment de 228 paires de base contenant le polymorphisme poly LBP1 est réalisée durant 40 cycles en présence de
0,5 mM de MgCI2, 0,5 % en DMSO La température d'hybridation des ohgonucléotides est de 53°C L'o gonucléotide antisens est identique à celui utilisé pour le séquençage L'ohgonucléotide sens est le suivant
5'AGAATGGAGGAGGGTGCCTG 3' En caractère gras, est représenté le nucléotide modifié permettant la création d'un site de coupure avec l'allèle
G pour l'enzyme de restriction Bstn / La digestion est effectuée à 60°C toute la nuit Les produits de digestion sont séparés sur un gel de polyacrylamide à 12% (acrylamide bisacrylamide 19 1 ) et colorés dans un bain de bromure d'éthidium L'allèle T est caractérisé par un fragment de restriction à 49 pb et l'allèle G par un fragment de restriction à 31 pb
3 Détection du polymorphisme par hybridation d'ohαonucléotides spécifiques de chaque allèle (Annea nq Spécifie O qonucleotide ou ASO) La technique ASO utilisée pour détecter le polymorphisme poly
LBP1 est basée sur le protocole décrit par Tiret et al , (1994, Lancet, vol 344, 910-913) Les modifications spécifiques à la détection du polymorphisme poly LBP1 concernant les ohgonucléotides et les températures de lavage sont les suivantes l'ohgonucléotide spécifique de l'allèle G a pour séquence 5'GCCCAGTAATCCAGACACCC 3' avec une température de lavage 61 °C, l'ohgonucléotide spécifique de l'allèle T a pour séquence 5' GCCCAGTAATACAGACACCC 3' avec pour température de lavage 62°C
4 Résultats
La première population européenne utilisée dans cette étude comporte 310 témoins (âge=73 5±10,9 , 37,3% d'hommes) et 293 sujets atteints de formes sporadiques précoces et tardives de la maladie d'Alzheimer (âge=74,6±9,3 , âge de début de maladιe=71 ,0+8,9 , 32,2% d'hommes) Sur cette population ont été teste trois polymorphismes du locus de l'APOE le polymorphisme Th1/E47cs utilisant les méthodes décrites précédemment, le polymorphisme 1 E1 selon la technique utilisée par Mui et collaborateurs (Neurology, 1996, vol 47, 196-201 ), le polymorphisme de l'APOE selon la technique de Hixon et Vernier (J Lipid Res , vol 31 , 545-548) Le nombre de sujet varie en fonction du polymorphisme étudié étude de Th1/E47cs, 279 malades et 310 témoins , étude de 1 E1 , 293 malades et 307 témoins Afin d'améliorer la puissance statistique de l'étude pour les analyses au niveau des individus hétérozygotes pour le génotype de l 'APOE, les auteurs ont augmenté le nombre d'individus de génotype ε3/ε4 en ajoutant des sujets de ce génotype à partir de populations indépendantes pour finalement atteindre un total de 152 malades et 91 témoins (respectivement 73,3±8,5 et 70,3±8,5 ans)
La distribution des trois polymorphismes étudiés est présentée dans le tableau 1 Aucune déviation par rapport à l'équilibre de Hardy- Weinberg n'a été observé pour chacun de ces polymorphismes
La tendance à développer la maladie est exprimée par un facteur d'approximation du risque relatif OR (pour « Odd Ratio »)
IC représente l'intervalle de confiance à 95% Les résultats sont rapportés aux tableaux 1 à 5 Comme attendu, l'allèle ε4 est fortement associé avec la maladie d'Alzheimer (OR=4,67 IC 95% [3,28-6,67]), tandis que l'allèle ε2 montre un effet protecteur (OR=0,27 IC 95% [0,14-0,52]) Dans la population témoin, l'allèle G de Th1/E47cs est le plus représenté (0,531 ) contrairement à ce qui est observé dans la population malade (0,468) Les distributions allèhque et génotypique sont significativement différentes chez les malades par rapport aux témoins (respectivement ρ=0,03 et p=0,007) L'allèle T de Th1/E47cs est associé à un risque accru de développer la maladie d'Alzheimer (OR=1 ,29 IC 95% [1 ,02-1 ,63]) et l'OR est de 1 ,79 (IC 95% [1 ,21 -12,65], p=0,002) pour les individus porteurs d'au moins un allèle T Pour le polymorphisme 1 E1 , les distributions allèhque et génotypique sont significativement différentes entre les deux populations (respectivement p=0,002 et p=0,0005) L'allèle C de 1 E1 est associé à une diminution du risque de développer la pathologie (OR=0,56 IC 95% [0,40- 0,78], p=0 0003)
Les auteurs ont calculé le déséquilibre de liaison, deux à deux, des différents polymorphismes étudiés (Tableau 2) Un déséquilibre de liaison significatif existe entre les polymorphismes Th1/E47cs, 1 E1 et de l'APOE Puis les auteurs ont estimé les haplotypes générés par ces trois polymorphismes en utilisant l'algorithme Myπad Haplotype (tableau 3) La distribution estimée des haplotypes est significativement différente entre la population des malades et celle des témoins Par ailleurs, afin de tenir compte de la forte association de l'allèle ε4 avec la maladie d'Alzheimer, les auteurs ont comparé la distribution estimée des haplotypes dans les sous groupes de génotype ε3/ε3 et ε3/ε4, cette distribution étant significativement différente entre les patients et les témoins (tableau 3) Ces résultats suggèrent que les polymorphismes Th1/E47cs et 1 E1 ont un effet propre par rapport aux polymorphismes ε de l'APOE
Dans la population générale (malades=261 et témoιns=253), les auteurs ont estimé le risque de développer la maladie d'Alzheimer pour les individus possédant au moins un allèle de chacun des polymorphismes, cette estimation étant réalisée dans un premier temps de façon indépendante entre ces polymorphismes Un effet significatif est alors observé pour les polymorphismes (Tableau 4) Lorsque tous ces polymorphismes sont pris en compte simultanément dans une régression logistique, les effets de Th1/E47 et 1 E1 persistent et augmentent même, appuyant l'hypothèse que plusieurs polymorphismes existeraient à l'intérieur du locus de l'APOE
Si le niveau d'expression des allèles de l'APOE est augmenté par l'existence de mutations en cis dans la région promotrice du gène de l'APOE, trois implications doivent être vérifiées (1 ) la mutation située dans le promoteur doit moduler l'expression des allèles de l'APOE, mettant alors en exergue l'effet délétère de l'allèle ε4 ou bien accentuant l'effet protecteur de l'allèle ε2, (2) étant donné que ce qui détermine le risque serait le niveau relatif d'expression des deux allèles de l'APOE chez les individus hétérozygotes, cette mutation ne doit pas avoir le même impact dans la population de génotype hétérozygote pour l'APOE par rapport à la population de génotype homozygote (3) l'effet d'une mutation en cis chez les individus hétérozygotes doit dépendre de la phase de ce polymorphisme avec les allèles de l'APOE (i e l'haplotype) Chez les individus porteurs d'une copie de l'allèle ε4 hétérozygote pour le génotype de Th1/E47cs, l'allèle ε4 peut être associé soit avec l'allèle T, soit avec l'allèle G de Th1/E47cs Une de ces combinaisons devrait augmenter le niveau relatif d'expression de l'allèle ε4 et diminuer celui de l'allèle ε3 l'autre combinaison ayant alors l'effet inverse
Ainsi chez les individus de génotype ε3/ε4, le risque de développer la maladie d'Alzheimer sera différent entre les individus hétérozygotes et homozygotes pour Th1/E47cs Afin de tester ces hypothèses, les auteurs ont étudié le risque de développer la pathologie (ajusté sur le sexe et l'âge) des individus hétérozygotes pour Th1/E47cs comparés aux individus homozygotes pour ce même polymorphisme Seul les individus hétérozygotes pour le génotype Th1/E47cs et pour celui de l'APOE présentent une augmentation de risque de développer la pathologie (OR=2,40 IC 95% [1 ,40-4,12], p=0,001 ), cet effet ne se retrouvant pas pour les individus homozygotes pour le génotype de l'APOE (OR=1 ,02 IC 95% [0,67-1 ,57], p=0,91 ) Cet impact est mis en évidence en particulier dans la sous-population de génotype ε3/ε4 puisque le risque de développer la maladie d'Alzheimer pour les individus hétérozygotes pour le génotype Th1/E47cs est augmenté par rapport aux individus homozygotes pour ce génotype (OR=1 ,90 IC 95% [0,97-3,70], p=0,06, malades=107 et témoιns=54) Cette augmentation de risque devient significative en élargissant la population de génotype ε3/ε4 (OR=2,07 IC 95% [1 ,21-3,54], p=0,008, malades=152 et témoιπs=91 ) (tableau 5) Par l'utilisation d'une régression logistique pas à pas, les auteurs ont montré que le risque de développer la pathologie est modifié seulement chez les individus hétérozygotes pour le génotype de Th1/E47cs (OR=1 ,89 IC 95% [1 ,07- 3,35], p=0,027) et pas chez les individus hétérozygotes pour le génotype de 1 E1 Ces résultats suggèrent donc qu'entre les deux polymorphismes Th1/E47cs et 1 E1 , Th1/E47cs serait un meilleur candidat pour modifier le taux relatif d'expression des allèles de l'APOE
Afin d'appréhender l'influence de la phase des polymorphismes Th1/E47cs et APOE sur le risque de développer la maladie d'Alzheimer, les auteurs ont estimé les fréquences des haplotypes correspondant à l'association des allèles T ou G de Th1/E47cs avec l'allèle ε4 chez les individus de génotype ε3/ε4 que ce soit pour les malades ou les témoins Pour les individus porteurs des génotypes ε3/ε4 et GT, 57,6% des témoins présenteraient l'association des allèles T et ε4 sur le même chromosome, cette proportion passant à 69,7% chez les malades L'OR estimé est alors de 1 ,7 pour les individus présentant cet haplotype, résultat suggérant de nouveau que le polymorphisme Th1/E47cs est susceptible d'influer le taux d'expression de l'allèle ε4
Afin de confirmer ces résultats, les auteurs ont étudié l'impact du polymorphisme Th1/47cs dans une population plus importante de cas et de témoins De plus ils ont associé à cette étude un nouveau polymorphisme dans le promoteur du gène de l'APOE, -491 AT (Bulhdo et al., Nat. Genêt, 1998), susceptible lui aussi de modifier le taux d'expression de l'APOE. La population sélectionnée comprend 573 cas sporadiques présentant une maladie d'Alzheimer probable (âge=73,8±8,1 ans, âge de début de maladιe=70,4±7,9 ans, 35,9% d'hommes) et 509 témoins (âge=74,9±9,9 ans, 35,9% d'hommes)
Comme précédemment cette population est adaptée pour étudier l'impact du gène de l'APOE dans la maladie d'Alzheimer, puisque l'allèle ε4 est fortement associé avec la pathologie (OR=5,40 IC 95% [4,11 - 7,09], p<0,0001 ) tandis que l'allèle ε2 présente un effet protecteur (OR=0,47 IC 95% [0,31 -0,70], p=0,0003) La fréquence de l'allèle T du polymorphisme Th1/E47cs est augmentée chez les cas par rapport aux témoins (tableau 6) et le risque de développer la MA pour les individus porteurs d'au moins un allèle T est de 2, 13 (IC 95% [1 ,61 -2,83])
Au niveau de l'étude du polymorphisme -491 AT, tout d'abord les auteurs ont observés une distribution similaire des fréquences alléliques et génotypiques à celles précédemment décrites dans la population nord- améπcaine La fréquence de l'allèle T du polymorphisme -491 AT est diminuée chez les patients comparée à celle des témoins et l'OR associé au risque de développer la MA pour les individus porteurs d'au moins un allèle T du polymorphisme -491 AT est de 0,67 (IC 95% [0,52-0,88], p=0,004) (tableau 4)
Afin d'éliminer un biais possible dû à l'allèle ε4 sur l'association des deux polymorphismes Th1/E47cs et -491 AT avec la MA, les auteurs ont testé les effets de chaque allèle en utilisant une régression logistique ajustée sur la présence ou l'absence de l'allèle ε4 Après ajustement, le risque associé à la présence d'au moins d'un allèle T du polymorphisme Th1/E47cs persiste (OR=1 ,56 IC 95% [1 ,15-2,11 ], p=0,004), tandis que le risque associé à la présence d'au moins d'un allèle T du polymorphisme -491 AT disparaît (OR=0,82 IC 95% [0,62-1 ,10], p=0,19] Cette observation suggère que l'effet de l'allèle T de Th1/E47cs n'est pas expliqué par la présence de l'allèle ε4 Comme précédemment suggéré lors de la première étude, si on assume que le niveau d'expression des allèles de l'APOE est augmenté ou diminué en fonction de mutations cis dans la région du promoteur, ces mutations doivent avoir un effet différent et détectable principalement chez les individus hétérozygotes ε2/ε3/ε4 Afin de vérifier cette hypothèse, les ORs associés au risque de développer la MA ont été étudiés chez les individus hétérozygotes et homozygotes pour le génotype de l'APOE en utilisant une régression logistique ajustée sur l'âge, le sexe, et la présence d'au moins un allèle T des polymorphismes Th1/E47cs et -491 AT Chez les individus homozygotes ε2/ε3/ε4, aucun effet n'est mis en évidence (OR=1 13 IC 95% [0,77-1 ,65] et OR=0,99 IC 95% [0,68-1 ,44] pour les individus porteurs d'au moins un allèle T de Th1/E47cs et de -491 AT, respectivement) Par contre chez les individus hétérozygotes ε2/ε3/ε4, ceux qui possèdent au moins un allèle T de Th1/E47cs présentent une augmentation de risque de développer la pathologie (OR=3,57 IC 95% [2,22-5,75], p<0,0001 ), contrairement à ceux porteurs d'au moins d'un allèle T de -491 AT qui présentent un effet protecteur (OR=0,57 IC 95% [0,37-0,90], p=0,014]) Ces observations sont donc en accord avec les hypothèses de départ des auteurs
Ainsi, les résultats des auteurs, obtenus par deux études épidémiologiques, montrent que la région promotrice du gène de l'APOE possèdent des mutations susceptibles de favoriser le développement de la maladie d'Alzheimer, en particulier le polymorphisme Th1/E47cs, de façon indépendante aux polymorphismes ε du gène de l'APOE Ce polymorphisme modifie l'impact de l'allèle ε4 dans la population étudiée, définissant au sein de la population ε3/ε4, des sous populations présentant des risques différents, les individus étant hétérozygotes pour le polymorphisme
Th1/E47cs présentant le risque le plus important L'estimation de la phase permet de mieux cerner la sous population la plus à risque, c'est à dire celle présentant l'association de l'allèle ε4 et de l'allèle T sur le même chromosome
L'influence de ces polymorphismes peut être expliquée par une augmentation du niveau d'expression de l'allèle ε4 ou une diminution de l'expression de l'allèle ε2 par rapport aux autres allèles, cette hypothèse étant confortée par l'analyse de l'expression différentielle des ARNms issus des allèles de l'APOE dans le cerveau des patients et des témoins
Il sera intéressant d'étudier la phase entre ces deux polymorphismes en utilisant des allèles spécifiques de chacun des polymorphismes
Ainsi, dans un premier temps, par deux études épidémiologiques, les auteurs ont mis en évidence les effets propres de deux polymorphismes sur le risque de développer la MA, l'allèle T de Th1/E47cs et de -491 AT ayant respectivement un effet délétère et protecteur Dans un deuxième temps les auteurs ont observé une expression différentielle marquée des allèles de l'APOE, l'allèle ε4 étant surexpπmée chez les patients de génotype ε3ε4 et ε2ε4, et l'allèle ε2 étant sous exprimé chez les patients ε2ε3 comparé aux témoins de même génotype Finalement en accord avec les données déduites des études cas- témoins, le niveau d'expression de l'allèle ε4 dans le cerveau des patients ε3ε4 est corrélé aux mutations présentes dans la région régulatrice du gène de l'APOE L'allèle T de Th1/E47cs augmente le niveau relatif d'expression de l'allèle ε4 chez les patients, tandis que l'allèle T de -491 AT diminue celui-ci (figure 3 et tableau 5) Ces résultats sont en accord avec des données récentes suggérant une modification de l'expression du gène de l'APOE par ces deux mutations dans une lignée cellulaire d'hépatome
Il est intéressant de noter que le polymorphisme Th1/E47cs est localisé dans un site consensus de fixation du facteur de transcription Th1/E47 et plus particulièrement dans le site de fixation du facteur de transcription hélice-boucle-héhce E47 Ce facteur appartient aux protéines de classe A, qui sont exprimées de façon ubiquitaire et forment de multiples combinaisons avec les protéines de classe B pour contrôler l'expression tissu-spécifique des gènes (Murre et collaborateurs, Cell, Vol 15, 451 -459) En particulier, E47 est exprimé dans le cerveau, associé à de multiples protéines de classe B et impliqué dans le développement et la maintenance du système nerveux des mammifères Par contre peu de choses sont connus du facteur de transcription Th1 , identifié lors d'un criblage de banque d'ADNc d'embryon de souris Une protéine homologue avait été décrite chez la drosophile, associée au facteur de transcription de classe A, Daugtherless, dont l'expression est essentielle dans la neurogénèse En conclusion, toutes les données recueillies par les auteurs laissent supposer que l'étude de l'expression du gène de l'APOE permettrait de poser un diagnostic chez les individus hétérozygotes pour le génotype de l'APOE, mais aussi mieux définir des sous-populations à risque Ces informations seront donc importantes pour définir de nouvelles cibles thérapeutiques et prescrire les traitements optimaux
Tableau 1 Combinaison des différents allèles des polymoφhismes APOE Thl/E47cs
et 1E1 dans les populations contrôles et malades
Fréquence allèhque Fréquence génotypique
APOE N ε2 ε3 ε4 ε2/ε2 ε2/ε3 ε2/ε4 ε3/ε3 ε3/ε4 ε4/ε4
Témoins 308 0 081 0 805 0 114 0 003 0 133 0 230 0 649 0 179 0 130 Malades 292 0 034 0 639 0 327 0 034 0 034 0 425 0 393 0 113
Thl/E47cs N Ga T GGb GT TT
Témoins 310 0 531 0 469 0 320 0 422 0 258 Malades 279 0 468 0 532 0 208 0 520 0 272
1E1 n Gc C GGd GC ce
Témoins 307 0 615 0 385 0 388 0 456 0 156 Malades 293 0 711 0 289 0 533 0 382 0 085
Combinaison des polymorphismes APOE and 1E1
Malades
N ε2/ε3* ε3/ε3 ε3/ε ε4/ε4 ε2/ε4 ce 22 1 20 - 1
GC 100 4 50 46
GG 139 4 44 56 27 n 261 9 114 102 28
Témoins ce 41 0 41 0
GC 112 12 76 24
GG 100 25 50 15 n 253 37 167 39
Combinaison des polymorphismes APOE and Thl E47cs
Malades
N ε2/ε3* ε3/ε3 ε3/ε4 ε4/ε4 ε2/ε4
GG 55 4 36 13 1 1
GT 134 5 54 60 8 7
TT 78 24 29 19 - n 261 114 102 28 8
Témoins
GG 85 25 52 5 β 3
GT 108 11 76 16 1 4
TT 60 1 39 18 2 - n 253 36 167 39 3 7
a p<0 001. b p=0 03. 0R(T7T )=1 29 CI 95% [1 02-1 63]. c p=0 007 d p=0 002 0R(G7G )=1 44 CI 95% [1 14-1 84] e p=0 0005. NS. un îndrwdu est génotype ε2/ε2 dans la population témoin Tableau 2. Déséquilibre de liaison dans la région chromosomique 19q 13.2. région.
Thl/E47cs 1E1 APOE
Cas
Thl E47cs - -8.4 -5.8
1E1 79 - -6 1
APOE 49 54 -
Témoins
Thl/E47cs - 11.9 -1.9
1E1 86 - -3.7
APOE 32 42 -
Le polymorphisme APOE a été anahse comme un marqueur biallelique (î e allèle 4 versus allèle 2 or 3) Au dessus de la diagonale du tableau est représenté le coefficient Δ de déséquilibre de liaison standardisé En dessous de cette diagonale est représenté le pourcentage D' maximal du déséquilibre de liaison pour les fréquences alléliques données.
Tableau 3 Estimation des haplotypes possibles entre les différents polvmorphismes étudies dans la région chromosomique 19q 13 2 Le marqueur anonyme D19S178 a ete intègre a cette étude a. Population Générale
Haplotype Polvmorphismes Fréquences estimées des haplotypes
Nombre D19S178 Thl E47cs 1E1 APOE Cas Témoins Témoins attendus
1 S T G ε4~ 0 130 0 032 0 029
2 S T C ε4" 0 004 0 000 0 019*
3 S G G ε4" 0 031 0 006 0 035*
4 L T G ε4~ 0 100 0 043 0 027
5 L T C ε4* 0 005 0 000 0 018*
6 L G G ε4~ 0 044 0 022 0 033
7 L G C ε4~ 0 003 0 000 0 021*
8 S T G ε4 0 018 0 009 0 114*
9 S T C ε4 0 127 0 183 0 072*
10 s G G ε4 0 184 0 267 0 142*
11 s G C ε4 0 000 0 011 0 087*
12 L T G ε4 0 020 0 014 0 113*
13 L T C ε4 0 128 0 170 0 070*
14 L G G ε4 0 195 0 224 0 136*
15 L G C ε4 0 011 0 019 0 084*
Nombre de chromosome 522 506 b. Population de génotype ε3/ε3 Haplotype Polvmorphismes Fréquences estimées des haplotypes nombre D19S178 Thl/E47cs 1E1 cas témoins Témoins attendus
1 S T G 0 035 0 014 0 129*
2 S T C 0 192 0 239 0 116*
3 S G G 0 259 0 268 0 151*
4 s G C 0 009 0 013 0 136*
5 L T G 0 027 0 010 0 113*
6 L T C 0 193 0 198 0 103*
7 L G G 0 285 0 234 0 133*
8 L G C 0 000 0 024 0 119*
Nombre de chromosome 228 334 c. Population de génotype ε3/ε4
Haplotype Polymoφhismes Fréquences estimées des haplotypes
Nombre D19S178 Thl/E47cs 1E1 Cas Témoins Témoins attendus
S T G 0 184 0 154 0 207 S T C 0 102 0 148 0 092 S G G 0 169 0 145 0 103 s G C 0 000 0 000 0 046
L T G 0 179 0 204 0 254 L T C 0 113 0 158 0 127 L G G 0 237 0 188 0 113 L G C 0 015 0 000 0 056
Nombre de chromosome 204 78 Tableau 4 OR estimés par régression logistique multiple
OR 95% IC Thl/E47cs 1E1 APOE
TT+GT/GG CC+GC/GG avec ε4/sans ε4
Non ajuste 1 79 [1 21-2 65] 0 56 [0 40-0 78] 4 32 [2 98-6 28]
P=0 002 p=0 0003 p<0 0001
Ajuste sur 1 90 [1 28-2 83] 0 58 [0 41-0 82] 4 66 [3 14-6 93] le sexe et l'âge P=0 002 p=0 002 p<0 0001
Ajuste sur le sexe l'âge 2 51 [1 38-4 56] 0 43 [0 25-0 74] 3 22 [2 06-5 02] et autres polymoφhismes P=0 001 p=0 002 p<0 0001
Tableau 5 Distπbutions des génotypes 1E1 et Thl/E47cs dans la population ε3ε4 élargie
Pohmoφhi sme IEΓ Polymoφhi .sme Thl/E47cs D
N GG GC GG GT TT
Témoins 91 50 41 16 38 37
Cas 152 67 85 19 89 44
a P= =0 10, V =0 04
Tableau 6 Distribution allcliquc et génotypique des polymoφhismes APOE. Thl/E47cs and — 491 AT
Allèle Génotype
-n APOE c2 ε3 ε4 ε2ε2* ε2ε3 ε2ε4 ε3ε3 ε3ε4 c4ε4 m c
Témoins 75(0 832(0 1 1 1(0 4(0 0 57(0 10(0 344(0 88(0 6(0 0 m σ Cas 40(0 699(0 407(0 - 16(0 24(0 223(0 237(0 73(0 m
3J m
S
Thl/E47cs G T GG* GT TT
O m Témoins 562(0 456(0 162(0 238(0 109(0 m z Cas 515(0 631(0 103(0 308(0 162(0
H m O r- m -491 AT A T AA1 AT TT
N> σ> Témoins 833(0 185(0 343(0 147(0 19(0
Cas 993(0 153(0 432(0 129(0 12(0
Le nombre d'allèlcs (fréquence) est présenté
Les distributions génotypiques sont en équilibre de Hardy- Wcinbcrg dans les populations contrôles.
*P<UY \ ' P=0.()05.
Tableau 7 Expression relative de l'allèle ε4 chez les patients et les témoins en fonction des polymoφhismes Thl/E47cs et -491 AT n Cas n Témoins*
Thl/E47cs
GG 4 33 5±1 7% 4 22 5±2 5%
GT 19 36 3+2 1%* 11 22 6+1 9%
TT 10 32 4±1 4% 10 22 8±2 7%
-491 AT
AA 26 35 3±2 7% 15 22 8±2 2%
AT 7 33 5±1 3%' 10 22 5±2 3%
*NS * <104 * =0 11

Claims
REVENDICATIONS
1 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN génomique de régulation de l'expression du gène codant pour rapolipoprotéine E, induisant une modification de l'expression du gène de rapolipoprotéine E par rapport à une population témoin ou une modification de l'expression relative des allèles du gène de rapolipoprotéine E 2 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon la revendication 1 , comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région chromosomique 19q13 2, induisant une différence de l'expression du gène codant pour rapolipoprotéine E ou une différence de l'expression relative des allèles du gène de rapolipoprotéine E, à l'exception de la région d'ADN chromosomique codant pour rapolipoprotéine E
3 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon la revendication 1 ou la revendication 2, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN chromosomique située entre le marqueur D19S178 et le gène APO Cil, à l'exception de la région d'ADN chromosomique codant pour rapolipoprotéine E
4 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans les introns et les régions flanquantes du gène de rapolipoprotéine E, s'étendant sur une distance de 5kb en amont et en aval du gène APOE
5 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région du promoteur du gène codant pour l'apoliprotéine E, notamment se trouvant dans un site de fixation potentiel des facteurs de transcription Th1/E47cs
6 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant la mise en évidence d'au moins une mutation dans le promoteur du gène codant pour rapolipoprotéine E, située à 186 bases de la boîte TATA de ce gène 7 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon la revendication 5, caractérisé en ce que la mutation consiste en GGGTGTCTG(G→ T)ATTACTGGG, G étant l'allèle le plus fréquent dans la population normale
8 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est mise en évidence
- soit en créant dans l'une des amorces d'amplification par PCR de la région polymorphique un site de clivage pour une enzyme de restriction n'existant pas chez les individus porteurs d'un des allèles, - soit après amplification par PCR de la région comprenant ce polymorphisme par une technique d'hybridation utilisant des sondes oligonucléotidiques spécifiques des allèles
9 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par les étapes suivantes a) détermination du génotype de rapolipoprotéine E, notamment de l'allèle ε4, b) mise en évidence d'une mutation, notamment de type induisant une modification de l'expression du gène de apolipoprotéine E ou une modification de l'expression relative des allèles du gène de apolipoprotéine E dans la région d'ADN génomique de régulation de l'expression du gène de rapolipoprotéine E, en particulier une mutation telle que définie aux revendications 2 à 7
10 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine le taux d'expression des allèles ε2, ε3 et/ou ε4 chez les individus hétérozygotes pour le génotype de l'APOE
11 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une mutation telle que définie dans les revendications 1 à 7, et/ou la mesure du taux d'expression des allèles de l'APOE telle que définie dans la revendication 10 est réalisée à partir d'un échantillon biologique de tissu cérébral prélevé par biopsie, de lymphocytes ou fibroblastes mis en culture, ou d'autres tissus susceptibles de présenter une différence d'expression des allèles de l'APOE
12 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine la phase entre les différents polymorphismes ε, et Th1/E47cs et éventuellement de -491 AT et 1 E1 susceptibles d'entraîner un risque accru de développer la maladie d'Alzheimer
13 Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine les haplotypes des polymorphismes ε et Th1 E47cs et éventuellement de -491 AT et 1 E1 de l'APOE, en combinaison avec les haplotypes d'autres gènes ou marqueurs proches du gène APOE, notamment APO Cl, APO Cil et/ou D19S 178
14 Procédé de diagnostic selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce que l'on mesure en outre la variation d'expression des allèles du gène APOE
15 Méthode d'identification de sujets atteints de la maladie d'Alzheimer susceptibles de répondre à une thérapie donnée, par exemple de type cholinomimétique comprenant a) la détermination du génotype de rapolipoprotéine E , b) la détermination de l'allèle du polymorphisme Th1/E47cs et du nombre de copies de cet allèle , et c) éventuellement, la détermination de la phase des polymorphismes de rapolipoprotéine E et du Th1/E47cs
16 Vecteurs de transfection de cellules eucaryotes comprenant au moins un allèle du gène APOE et un allèle du polymorphisme Th1/E47cs et éventuellement un ou plusieurs autres allèles de polymorphismes de l'APOE et/ou d'autres gènes ou marqueurs proches de ce gène, susceptibles de modifier le risque de développer une maladie d'Alzheimer par rapport à une population normale.
17. Utilisation d'un vecteur selon la revendication 16, pour la production de cellules eucaryotes transfectées ou d'animaux transgéniques.
18. Cellules eucaryotes transfectées au moyen d'un vecteur tel que défini à la revendication 16.
19. Animaux transgéniques produits au moyen d'un vecteur tel que défini à la revendication 16.
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