EP0879415A1 - Vorrichtung und verfahren zur bestimmung und/oder entfernung einer substanz in einer probe - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur bestimmung und/oder entfernung einer substanz in einer probe

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EP0879415A1
EP0879415A1 EP97901029A EP97901029A EP0879415A1 EP 0879415 A1 EP0879415 A1 EP 0879415A1 EP 97901029 A EP97901029 A EP 97901029A EP 97901029 A EP97901029 A EP 97901029A EP 0879415 A1 EP0879415 A1 EP 0879415A1
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EP
European Patent Office
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substance
sample
size
complexing agents
exclusion
Prior art date
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EP97901029A
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English (en)
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Inventor
Bernd Pevec
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Original Assignee
Individual
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Publication of EP0879415A1 publication Critical patent/EP0879415A1/de
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining and / or removing a substance in a sample by reacting the substance with complexing agents and an apparatus for carrying out the method.
  • Methods of the generic type are in particular those based on affinity reactions, the substances to be determined being labeled by reaction with affinity ligands, for example antibodies, and then being detected by means of a secondary reaction.
  • affinity ligands for example antibodies
  • Such reactions are sometimes quite complicated and prone to failure. They also require a lot of instrumentation.
  • the technical problem on which the invention is based is therefore, inter alia, to provide a method which allows a faster and simpler and at the same time equally reliable statement regarding the presence of a substance in a sample to be examined.
  • the method according to the invention for determining and / or removing a substance in a sample by reacting the substance with complexing agents is characterized in that the substance has at least two domains which interact with complexing agents. Those compounds which have at least two positions which correspond to the at least two domains of the ones to be removed and / or are used as complexing agents determining substance interact.
  • the structure of the at least two positions can in each case be the same or different, in particular taking into account the structure of the at least two domains of the substance to be determined or removed.
  • the complexing agents are added to the sample. After a complex formation time (incubation time), the sample is sorted according to the size of the complexes formed.
  • the separation devices according to the invention must therefore be able to retain the complexes formed, whereas the starting compounds, substance to be determined and / or removed and complexing agents can pass through the separation device.
  • the substance to be determined is preferably an at least divalent antigen.
  • the substance to be determined can also be an antibody that interacts with an antigen.
  • the following can be used according to the invention as systems which can be used alternately as analyte or detector: enzyme / substrate pairs and receptor / mediator pairs.
  • the relevant receptor ligand can be detected by using an appropriate receptor, which can be important for clinical diagnostics, for example.
  • the divalent antigen is preferably reacted with a complexing agent which consists of at least two different monoclonal antibodies or polyclonal antibody mixtures or fragments thereof. If an epitope is pronounced on the antigen at least twice, it is sufficient to carry out a corresponding reaction with at least one monoclonal antibody.
  • the principle of the present invention is explained in more detail on the basis of these relationships.
  • FIG. 1 shows an idealized relationship between the size of immune complexes as a function of the quotient Q from the concentration of the antigen and the concentration of an antibody which interacts with the antigen, on the assumption that the affinity is practically infinite. It follows from this that the largest complex is formed when the at least divalent antigen and the polyclonal antibody or at least two antibody cocktail consisting of at least two monoclonal antibodies is present in an approximately stoichiometric ratio. Then particularly long-chain immune complexes form. This situation is known per se and represents the basis of the phenomenon of immunoprecipitation.
  • the concentration of the antigen predominates or, alternatively, that of the antibody, correspondingly shorter-chain antigen / antibody complexes are formed, which accordingly have a smaller size.
  • FIG. 1 shows concentration values Q (Q x , Q 2 , Q 3 , Q 4 and Q 5 ) assumed at various points. At these points, the situation shown in FIG. 2 is approximately present. If, for example, Q is much greater than 1, this means that the concentration of the antigen is predominant, so that practically all antibody idiotopes can be saturated with one antigen each. This results in complexes consisting of two parts of antigen and one part of antibody. However, the equimolar ratios of the Antigen / antibody starting substances before, one obtains long chains, which are typical for immunoprecipitation. In the region Q less than 1, ie the antibody concentration is relatively high, practically all antigen molecules bind two antibodies each, so that complex formation with chain formation does not occur and complexes of smaller size are formed.
  • the separation device sorts according to the size of the complexes, so that on the one hand complexes are retained which consist approximately of an antigen with two antibodies or an antibody with two antigens. If one knows the size of the expected immune complexes of antigen and antibody or antibody fragment, the separating device can be designed accordingly in order to enable it to retard the expected complexes. If, for example, the concentration of the substance to be determined is in the order of magnitude of the complexing agents used, a separation by size will certainly be possible, since the complexes formed in any case remain in the separating device. This is also the case for unfavorable concentration ratios, on the one hand when the antibodies predominate or when the antigens predominate, since the smaller complexes of the type described above are also retained by previously selecting the separating capacity of the separating device.
  • the separating device has separating devices which have an exclusion size of 20 to 1,000 nm. This means that the separation devices in the separation device ensure that complexes with the appropriate sizes are retained.
  • Sub- ⁇ m filters are particularly suitable as separation devices. So z. B. cellulose acetate filter membranes that are commercially available (Milipore, Gelman and Whatman) are used. Corresponding membranes or thin ones Polycarbonate films are suitable. Materials made of hydrophilized PVDF can also be used.
  • this is carried out using two separating devices.
  • the two separators differ in their different exclusion sizes.
  • the complexes possibly retained in the respective separation devices are detected and evaluated depending on the accumulation of the immune complexes. If the complexes formed are found in the separating device with a high exclusion volume, the result is that the concentration of the antibodies roughly corresponds to the concentration of the antigens. In this case, semi-quantitative statements can already be made. However, if the antigen is either present in high excess or deficit, it will only be found in the separator with the lower exclusion size. A statement about the concentration ratio is then not readily possible since it cannot be seen whether Q is greater or less than 1.
  • control zone it can therefore be advantageous to add a control zone to the separating device or devices, by means of which a further differentiation is possible.
  • a control zone which is covered with anti-antigen immunoglobulins, determine whether Q is small or large against 1. If Q is very much smaller than 1, practically no antigen will be freely available in the sample, so that the control field, which contains anti-antigen IgG, cannot be occupied by free antigen from the sample.
  • this control field therefore remains negative.
  • a test field can also be provided in which there is an authentic antigen which is to be detected in the sample. In this case, at Q less than 1, the corresponding test field will show a reaction with excess antibodies.
  • This control field is then practically complementary to the control field which has an anti-antigen immunoglobulin antibody.
  • the complexes formed are detected in a manner known per se, preferably by secondary reactions such as detection by means of fluorescence-labeled antibody fragments, specific peptides which interact with antibody parts, etc.
  • fluorescence-labeled substances those which are enzyme-labeled and also come into consideration
  • Appropriate substrates enter into reactions that lead to detectable substances, for example dyes (horse raddish peroxidase labeled substrates). Radio-labeled substrates can also be used.
  • washing and dyeing steps are possible in a single step; special washing methods can be dispensed with;
  • IgG can be used as a gold (Ag, Se) complex, which gives exact specifications with regard to the size of the starting reactants;
  • the detection limit can be significantly reduced by enzyme conjugation compared to other rapid tests, detection limit of approx. 1 pg is possible;
  • the rapid test can be interpreted at least semi-quantitatively, which is essential for a rapid test to determine physiologically relevant compounds, for example troponin diagnostics for rapid heart attack tests;
  • the method according to the invention can be implemented in a particularly advantageous manner in the device according to the invention, which has the features of claim 9.
  • the subsequent sub-claims 10 to 14 relate to preferred embodiments of the device according to the invention.
  • the device according to the invention has a sample application device, an outlet and a separating device. At least one separating device is arranged in the separating device, which is capable of retaining a complex of the substance to be determined and / or removed.
  • the separating device preferably has an exclusion size of 20 to 1,000 nm. If the method according to the invention is only to be used to determine the presence of a substance to be determined and / or removed, it is sufficient if a separating device is present. In the case of more precise evaluations, in particular semi-quantitative evaluations, it can be advantageous if at least two separating devices with different exclusion sizes are present.
  • a first separation device with an exclusion size of 150 to 300 nm and a second separation device with an exclusion size of 80 to 160 nm are preferred. If a third separation device is to be provided, an exclusion size of 20 to 80 nm is recommended here as advantageous .
  • the separating device is preferably arranged in the outlet of the device according to the invention.
  • the sample to be examined is placed in the application device and the complexing agent or complexing agents is then added. If necessary, the complexing agent can also already be present in the application device. It is particularly preferred that the complexing agent is arranged in a separate space in the application device which is closed off by a membrane, for example. After the sample has been applied, the membrane can be destroyed, for example by a pressure surge, so that complexing agent and sample to be examined can be intimately mixed with one another.
  • the mixture is then transferred to the separating device.
  • the separating device is arranged in the outlet of the sample application device.
  • the outlet is initially optionally closed by a membrane.
  • a membrane closing the outlet of the separation device according to the invention can be destroyed, so that the mixture of complexing agents, complex and sample to be examined enters the outlet, passes through the separation devices which are arranged in the separation device and then exits the outlet .
  • a device can be arranged on the side of the outlet facing away from the sample application device, for example a suction felt, which exerts a force through the outlet through the action of capillary force, so that the sample to be examined in its entirety passed the outlet.
  • a flow of the sample to be examined can also be generated through the device according to the invention by exerting a pressure on the sample application side or a negative pressure on the side of the device according to the invention opposite the sample application side.
  • pumps and centrifuges can be used.
  • a first control field can be provided which contains the substance to be determined and / or removed and / or a second control field which contains a substance which interacts with the complexing agent (s).
  • the method according to the invention can be used in particular in indoor air analysis, food monitoring, drug screening, mold analysis, laboratory medicine, environmental analysis.
  • the sample to be examined with the substance to be removed and / or to be determined is filled through an inlet opening in the sample receiving device 1 and passes through a filter, in particular a paper filter, into the reaction space 2.
  • a filter in particular a paper filter
  • contact is made with lyophilized, gold-labeled enzyme IgG.
  • the device is open at the bottom so that a free distribution in the entire reaction space 2 can take place.
  • a mechanical device such as a slide, is actuated or a membrane is pierced, so that washing solution 4 and color solution 5 now penetrate into reaction chamber 2 one after the other.
  • the reaction mixture with the antibody-antigen complexes is brought into the separating device 6 in a close temporal connection and there separated according to size at the first separating device 7, second separating device 8 or third separating device 9 or subsequently according to their affinity.
  • the first separating device 7 has an exclusion size of e.g. 200 nm
  • the second separator -8 e.g. 120 nm
  • the third separating device 9 an exclusion size of e.g. 60 nm. If colored solutions are used, subsequent washing steps can be recommended.
  • the detection is carried out by means of a staining solution which is set such that after the solutions have passed through, a constant and small amount of dye remains in the analysis space, as a result of which no over-staining is possible and an exact time specification is eliminated.
  • the coloring solution is in particular precipitating dye and is generated by an enzyme reaction, e.g. for BCIP / NPT or DAß immune reactions.
  • control fields 10, 11, 12 are arranged downstream of the separation devices 7, 8, 9 and are also arranged in the outlet 13 of the device.
  • the control field 10 can contain, for example, the antigen to be tested, the control field 11 can contain an anti-antigen IgG, whereas the control field 12 contains an anti-IgG antibody.
  • the outlet 13 is connected to a suction felt 14, which takes up the sample by capillary forces and in addition to force ensures passage of the sample through the device according to the invention.

Abstract

Verfahren zur Bestimmung und/oder Entfernung einer Substanz in einer Probe durch Umsetzung der Substanz mit Komplexbildnern, dadurch gekenzeichnet, daß die Substanz mindestens zwei Domänen aufweist, die mit Komplexbildnern in Wechselwirkung treten, Komplexbildner eingesetzt werden, die wenigstens zwei Positionen aufweisen, die mit den mindestens zwei Domänen in Wechselwirkung treten, die Probe mit den Komplexbildnern versetzt wird und nach einer Komplexbildungszeit die Probe nach Größe der gebildeten Komplexe mittels einer nach Größe sortierenden Trennvorrichtung, in der die gebildeten Komplexe zurückgehalten werden, detektierbar ist.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung und/oder Entfernung einer Substanz in einer Probe
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung und/oder Entfernung einer Substanz in einer Probe durch Umsetzung der Substanz mit Komplexbildnern sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Verfahren der gattungsgemäßen Art sind insbesondere solche auf Basis von Affinitätsreaktionen, wobei die zu bestimmenden Substanzen durch Umsetzung mit Affinitätsliganden, beispielswei¬ se Antikörpern markiert werden und dann mittels Sekundärreaktion detektiert werden. Solche Reaktionen sind teilweise recht kompliziert und störanfällig. Sie erfordern außerdem einen hohen instrumenteilen Aufwand. Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht somit unter anderem darin, ein Verfahren bereitzustellen, das eine schnellere und einfachere und dabei gleichzeitig ebenso sichere Aussage hinsichtlich des Vorhandenseins einer Substanz in einer zu untersuchenden Probe erlaubt .
Gelöst wird das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung und/oder Entfer¬ nung einer Substanz in einer Probe durch Umsetzung der Substanz mit Komplexbildnern ist dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mindestens zwei Domänen aufweist, die mit Komplexbildnern in Wechselwirkung treten. Als Komplexbildner werden solche Verbin¬ dungen eingesetzt, die wenigstens zwei Positionen aufweisen, die mit den mindestens zwei Domänen der zu entfernenden und/oder bestimmenden Substanz in Wechselwirkung treten. Die wenigstens zwei Positionen können in ihrer Struktur jeweils gleich oder verschieden sein, insbesondere unter Berücksichtigung der Struktur der wenigstens zwei Domänen der zu bestimmenden oder zu entfernenden Substanz. Die Probe wird erfindungsgemäß mit den Komplexbildnern versetzt. Nach einer Komplexbildungszeit (Inkubationszeit) wird die Probe nach Größe der gebildeten Komplexe sortiert. Dies erfolgt mittels einer nach Größe sortie¬ renden Trennvorrichtung, in der die gebildeten Komplexe zurück¬ gehalten oder reversibel fixiert werden und detektierbar sind. Durch das Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Substanz mindestens.zwei Domänen aufweist und der Komplexbildner zwei entsprechende Positionen aufweist, welche miteinander in Wechselwirkung treten, kommt es bei Umsetzung des Komplexbild¬ ners mit der zu entfernenden und/oder zu bestimmenden Substanz zu Aggregaten, die erheblich größer sein können als die entspre¬ chenden Ausgangsverbindungen, der zu entfernenden und/oder zu bestimmenden Substanz und den Komplexbildnern.
Damit wird es möglich, die Komplexe von den Ausgangsverbindungen abzutrennen. Erfindungsgemäß erfolgt dies nach dem Auswahlkrite¬ rium der Größe.
Die erfindungsgemäßen Trennvorrichtungen müssen daher in der Lage sein, die gebildeten Komplexe zurückzuhalten, wohingegen die Ausgangsverbindungen, zu bestimmende und/oder zu entfernende Substanz und Komplexbildner, die Trennvorrichtung passieren können.
Vorzugsweise ist die zu bestimmende Substanz ein mindestens divalentes Antigen. Die zu bestimmende Substanz kann aber auch ein Antikörper sein, der mit einem Antigen in Wechselwirkung tritt. Darüber hinaus sind als Systeme, die wechselseitig als Analyt oder Detektor eingesetzt werden können, erfindungsgemäß einsetzbar: Enzym-/Substratpaare sowie Rezeptor-/Mediatorpaare. Beispielsweise kann durch Verwendung eines entsprechenden Rezeptors der diesbezügliche Rezeptorligand aufgespürt werden, was beispielsweise bei klinischer Diagnostik von Bedeutung sein kann. Vorzugsweise wird das divalente Antigen mit einem Kom¬ plexbildner umgesetzt, der aus mindestens zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern oder polyklonalen Antikörpermischungen oder jeweils deren Fragmente besteht, umgesetzt. Wenn ein Epitop mindestens zweimal auf dem Antigen ausgeprägt ist, ist es hinreichend eine entsprechende Umsetzung mit mindestens einem monoklonalen Antikörper durchzuführen. Anhand dieser Zusam¬ menhänge wird das Prinzip der vorliegenden Erfindung näher erläutert .
Die Figur 1 zeigt eine idealisierte Beziehung zwischen der Größe von Immunkomplexen in Abhängigkeit des Quotienten Q aus der Konzentration des Antigens und der Konzentration eines mit dem Antigen in Wechselwirkung tretenden Antikörpers, unter der Annahme, daß die Affinität praktisch unendlich groß ist. Daraus ergibt sich, daß der größte Komplex dann entsteht, wenn das mindestens divalente Antigen und der polyklonale Antikörper bzw. mindestens aus zwei monoklonalen Antikörpern bestehende An¬ tikörpercocktail in ungefähr stöchiometrischem Verhältnis vorliegt. Dann bilden sich besonders langkettige Immunkomplexe aus. Diese Situation ist an sich bekannt und stellt die Grundla¬ ge des Phänomens der Immunpräzipitation dar.
Überwiegt die Konzentration des Antigens oder alternativ dieje¬ nige des Antikörpers, so bilden sich entsprechend kürzerkettige Antigen-/Antikörperkomplexe aus, die dementsprechend eine gerin¬ gere Größe aufweisen.
Figur 1 zeigt an verschiedenen Stellen angenommene Konzentra¬ tionswerte Q (Qx, Q2, Q3, Q4 sowie Q5) . An diesen Stellen liegt in etwa die in Figur 2 gezeigte Situation vor. Ist beispielswei¬ se Q viel größer als 1, bedeutet dies, daß die Konzentration des Antigens stark überwiegt, so daß praktisch alle Antikör- peridiotope mit jeweils einem Antigen absättigbar sind. Mithin entstehen Komplexe aus zwei Teilen Antigen und einem Anteil Antikörper. Liegen jedoch in etwa äquimolare Verhältnisse der Antigen-/Antikörperausgangssubstanzen vor, erhält man lange Ketten, wie sie für die Immunpräzipitation typisch sind. Im Bereich Q kleiner als 1, d.h. die Antikörperkonzentration ist relativ hoch, binden praktisch alle Antigenmoleküle je zwei Antikörper, so daß eine Komplexbildung unter Kettenausbildung unterbleibt und Komplexe geringerer Größe entstehen.
Es besteht mithin die Möglichkeit, durch Trennung der Immunkom¬ plexe nach ihrer Größe und anschließender Detektion, festzustel¬ len, ob Immunkomplexe vorhanden sind. Es ist dann dafür Sorge zu tragen, daß die Trennvorrichtung nach Größe der Komplexe sortiert, so daß einerseits Komplexe zurückgehalten werden die in etwa aus einem Antigen mit zwei Antikörpern bzw. einem Anti¬ körper mit zwei Antigene bestehen. Kennt man also die Größe der zu erwartenden Immunkomplexe aus Antigen und Antikörper oder Antikörperfragment, so kann man die Trennvorrichtung entspre¬ chend ausgestalten, um diese in die Lage zu versetzen, die zu erwartenden Komplexe zu retardieren. Liegt beispielsweise die Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der Größenordnung der eingesetzten Komplexbildner, wird sicherlich eine Auftren¬ nung nach Größe möglich sein, da die gebildeten Komplexe auf jeden Fall in der Trennvorrichtung .verbleiben. Dies ist auch der Fall für ungünstigere Konzentrationsverhältnisse, zum einen beim Überwiegen der Antikörper oder auch beim Überwiegen der Antigene, da durch vorherige Auswahl des Trennvermögens de-r Trennvorrichtung auch die kleineren Komplexe der oben beschrier benen Art zurückgehalten werden.
Erfindungsgemäß weist die Trennvorrichtung Trenneinrichtungen auf, die eine Ausschlußgröße von 20 bis 1.000 nm aufweisen. D.h. die Trenneinrichtungen in der Trennvorrichtung sorgen dafür, daß Komplexe mit den entsprechenden Größen zurückgehalten werden. Als Trenneinrichtungen kommen insbesondere sub-μm-Filter in Frage. So können z. B. Celluloseacetatfiltermembranen, die kommerziell erhältlich sind (Fa Milipore, Gelman und Whatman) eingesetzt werden. Auch entsprechende Membranen oder dünne Folien aus Polycarbonat kommen in Betracht. Auch Materialien aus hydrophilisiertem PVDF können eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses unter Verwendung von zwei Trenneinrich¬ tungen durchgeführt . Die zwei Trenneinrichtungen unterscheiden sich jeweils durch ihre unterschiedlichen Ausschlußgrößen.
Wird der in der zu untersuchenden Probe gebildete Komplex zunächst über eine Trenneinrichtung mit höheren Ausschlußgrößen gegeben, werden dort die Komplexe retardiert, die entstehen, wenn die Konzentrationen der bei der Komplexbildungsreaktion beteiligten Komponenten ungefähr in der Größenordnung Q = 1 liegen. Ist das Konzentrationsverhältnis jedoch erheblich größer als 1 oder erheblich kleiner als 1, entstehen, wie oben ausge¬ führt, Komplexe geringerer Ausdehnung, so daß diese die Trenn¬ einrichtung mit relativ hohen Ausschlußgrößen ungehindert passieren. Diese werden dann aber in der nachgeschalteten Trenneinrichtung mit geringerer Ausschlußgröße zurückgehalten.
Die in den jeweiligen Trenneinrichtungen eventuell zurückgehal¬ tenen Komplexe werden detektiert und je nach Ansammlung der Immunkomplexe ausgewertet. Findet man die gebildeten Komplexe in der Trenneinrichtung mit hohem Ausschlußvolumen, ergibt sich, daß die Konzentration der Antikörper in etwa mit der Konzen¬ tration der Antigene übereinstimmt. In diesem Fall lassen sich bereits semiquantitative Aussagen treffen. Ist jedoch das Antigen entweder im hohen Überschuß oder Unterschuß vorhanden, wird es sich erst in der Trenneinrichtung mit der niedrigeren Ausschlußgröße finden. Eine Aussage über das Konzentrations¬ verhältnis ist dann nicht ohne weiteres möglich, da nicht erkennbar ist, ob Q größer oder kleiner 1 ist.
Es kann mithin vorteilhaft sein, an die Trenneinrichtung bzw. Trenneinrichtungen eine Kontrollzone anzufügen, durch die eine weitere Differenzierung möglich wird. So kann durch eine Kon¬ trollzone, die mit Anti-Antigenimmunglobulinen belegt ist, festgestellt werden, ob Q klein oder groß gegen 1 ist. Ist nämlich Q sehr viel kleiner als 1, wird praktisch kein Antigen mehr in der Probe frei vorhanden sein, so daß das Kontrollfeld, welches Anti-Antigen IgG enthält nicht von freiem, aus der Probe stammendem, Antigen belegt werden kann. Bei der Entwicklung der Kontrollzone mit entsprechenden Sekundärantikörpern oder mittels anderer Detektionsmethoden bleibt dieses Kontrollfeld mithin negativ. Ist Q jedoch groß gegen 1, was gleichbedeutend ist mit der Aussage, daß in der Probe eine hohe Konzentration des Antigens vorhanden ist, wird das Kontrollfeld in beträchtlichem Maße mit freiem noch vorhandenem Antigen reagieren (der Kom¬ plexbildner war nicht in der Lage, sämtliche Antigenmoleküle in der Probe zu komplexieren) , so daß bei Entwicklung des Kontrollfeldes eine entsprechend hohe Komplexbildung im Kon¬ trollfeld zu verzeichnen ist. Dies bedeutet dann, daß eine hohe Konzentration des Antigens in der Probe vorhanden war.
Es kann auch ein Testfeld vorgesehen werden, in dem sich ein authentisches Antigen befindet, welches in der Probe detektiert werden soll. In diesem Falle wird bei Q kleiner 1 das entspre¬ chende Testfeld eine Reaktion mit überschüssigen Antikörpern anzeigen.. Dieses Kontrollfeld ist dann praktisch komplementär zu dem Kontrollfeld, welches einen Anti-Antigenimmunglobulinan- tikörper aufweist.
Es kann desweiteren vorteilhaft sein, eine Kontrollzone vor¬ zusehen, in der sich Anti-IgG-Antikörper befinden, um bei negativem Ergebnis systematische Fehler sichtbar zu machen.
Die Detektion der gebildeten Komplexe erfolgt in an sich bekann¬ ter Weise, vorzugsweise durch Sekundärreaktionen wie Detektion mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper-Fragmente, spezifischer Peptide, die mit Antikörperteilen in Wechselwirkung treten etc. Neben fluoreszenzmarkierten Stoffen kommen auch solche in Betracht, die enzymmarkiert sind und mit entsprechenden Sub¬ straten Reaktionen eingehen, die zu detektierbaren Stoffen führen, beispielsweise Farbstoffen (horse raddish peroxidase markierte Substrate) . Aber auch radioaktiv markierte Substrate können eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt insbesondere die folgen¬ den Vorteile gegenüber den bisher erhältlichen Immun-Schnei1- tests :
Auftrage-, Wasch- und Färbeschritte sind in einem einzigen Schritt möglich, es kann auf spezielle Waschmethoden verzichtet werden;
IgG kann als Gold (Ag,Se) -Komplex verwendet werden, worauf sich exakte Vorgaben in bezug auf die Größe der Ausgangs- reaktanten ergeben;
durch Enzymkonjugation kann die Nachweisgrenze im Vergleich zu anderen Schnelltests deutlich gesenkt werden, Nachweis¬ grenze von ca. 1 pg sind möglich;
der Schnelltest ist zumindest semiguantitativ auslegbar, was essentiell bei Schnelltest zur Feststellung von physio¬ logisch relevanten Verbindungen, beispielsweise Troponin- Diagnostik bei Herzinfarkt-Schnelltests, ist;
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in besonders vorteilhafter Weise in der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die die Merkmale des Anspruchs 9 aufweist, realisiert werden. Die sich daran anschließenden Unteransprüche 10 bis 14 betreffen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Probenaufgabevor¬ richtung, einen Auslauf und eine Trennvorrichtung auf. In der Trennvorrichtung ist mindestens eine Trenneinrichtung angeord¬ net, die in der Lage ist, einen Komplex aus der zu bestimmenden und/oder zu entfernenden Substanz zurückzuhalten. Vorzugsweise weist die Trenneinrichtung eine Ausschlußgröße von 20 bis 1.000 nm auf. Soll das erfindungsgemäße Verfahren lediglich angewendet werden, um das Vorhandensein einer zu bestimmenden und/oder zu entfer¬ nenden Substanz festzustellen, genügt es, wenn eine Trennein¬ richtung vorhanden ist. Bei genaueren Auswertungen, insbesondere semiquantitativen Auswertungen kann es vorteilhaft sein, wenn mindestenε zwei Trenneinrichtungen mit unterschiedlichen Aus¬ schlußgrößen vorhanden sind. Bevorzugt sind eine erste Trenn¬ einrichtung mit einer Ausschlußgröße von 150 bis 300 nm und eine zweite Trenneinrichtung mit einer Ausschlußgröße von 80 bis 160 nm. Soll gegebenenfalls eine dritte Trenneinrichtung vor¬ gesehen sein, empfiehlt sich hier eine Ausschlußgröße von 20 bis 80 nm als vorteilhaft. Vorzugsweise ist die Trennvorrichtung im Auslauf der erfindungsgemäßen Vorrichtung angeordnet.
Die zu untersuchende Probe wird in die Auftragevorrichtung gegeben und danach mit dem Komplexbildner oder den Komplexbild¬ nern versetzt. Gegebenenfalls kann der Komplexbildner auch bereits in der Auftragevorrichtung vorhanden sein. Dabei ist besonders bevorzugt, daß der Komplexbildner in einem, durch beispielsweise eine Membran abgeschlossenen, separaten Raum in der Auftragevorrichtung angeordnet ist . Nach Aufgabe der Probe kann die Membran zerstört werden, beispielsweise durch einen Druckstoß, so daß Komplexbildner und zu untersuchende Probe miteinander innig gemischt werden können.
Nach der Inkubationszeit wird das Gemisch dann in die Trennvor¬ richtung überführt . In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Trennvorrichtung im Auslauf der Probenauf- gabenvorrichtung angeordnet. In diesem Falle ist der Auslauf zunächst gegebenenfalls durch eine Membran verschlossen. Nach Inkubation der Probe kann eine den Auslauf der erfindungsgemäßen Trennvorrichtung verschließende Membran zerstört werden, so daß das Gemisch aus Komplexbildnern, Komplex und zu untersuchender Probe in den Auslauf eintritt, die Trenneinrichtungen, die in der Trennvorrichtung angeordnet sind, passiert und danach aus dem Auslauf austritt. Zur Beschleunigung der Passage der Probe durch die erfindungsge¬ mäße Vorrichtung kann auf der der Probeauftragevorrichtung abgewandten Seite des Auslaufs eine Einrichtung angeordnet sein, beispielsweise ein Saugfilz, der durch Kapillarkrafteinwirkung eine Kraft durch den Auslauf hindurch ausübt, so daß die zu untersuchende Probe in ihrer Gesamtheit den Auslauf passiert.
Erfindungsgemäß kann ebenfalls durch Ausübung eines Drucks auf der Probenauftrageseite oder eines Unterdrucks auf der der Probenauftrageseite gegenüberliegenden Seite der erfindungs¬ gemäßen Vorrichtung, ein Fluß der zu untersuchenden Probe durch die erfindungsgemäße Vorrichtung hindurch erzeugt werden. Insbesondere können Pumpen und Zentrifugen eingesetzt werden.
Zur Prüfung, ob Störungen die Reaktion negativ beeinflußt haben, oder um andere Informationen zu erhalten, kann es vorteilhaft sein, entsprechende Testfelder vorzugsweise im Auslauf hinter der Trennvorrichtung (in Richtung des Flusses der Probe durch den Auslauf gesehen) anzuordnen. So kann ein erstes Kontrollfeld vorgesehen sein, das die zu bestimmende und/oder zu entfernende Substanz enthält und/oder ein zweites Kontrollfeld, das eine mit dem oder den Komplexbildner(n) in Wechselwirkung tretende Substanz enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich insbesondere bei der Raumluftanalyse, der Lebensmittelüberwachung, dem Drogenscree- ning, der Schimmelpilz-Analyse, Labormedizin, Umweltanalyse einsetzen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Immundia- gnostikum wird im folgenden näher erläutert (Figur 3) .
Die zu untersuchende Probe mit der zu entfernenden und/oder zu bestimmenden Substanz wird durch eine Eintrittsöffnung in die Probeaufnahmevorrichtung 1 gefüllt und gelangt durch einen Filter, insbesondere einen Papierfilter, in den Reaktionsraum 2. Im Reaktionsraum 2 erfolgt der Kontakt mit lyophilisiertem, gold-markierten Enzym-IgG. Die Vorrichtung ist nach unten offen, so daß eine freie Verteilung im gesamten Reaktionsraum 2 erfol¬ gen kann.
Durch Druck auf den Druckpunkt 3 wird eine mechanische Ein¬ richtung, wie ein Schieber, betätigt oder eine Membran durch¬ stoßen, so daß jetzt nacheinander Wasch- 4 und Farblösung 5 in den Reaktionεraum 2 eindringen.
In engem zeitlichen Zusammenhang wird die Reaktionsmischung mit den Antikörper-Antigenkomplexen in die Trennvorrichtung 6 gebracht und dort nach Größe an der ersten Trenneinrichtung 7, zweiten Trenneinrichtung 8 oder dritten Trenneinrichtung 9 bzw. anschließend nach ihrer Affinität getrennt. Die erste Trenn¬ einrichtung 7 weist eine Ausschlußgröße von z.B. 200 nm, die zweite Trenneinrichtung -8 z.B. 120 nm und die dritte Trenn¬ einrichtung 9 eine Ausschlußgröße von z.B. 60 nm auf. Werden gefärbte Lösungen eingesetzt, können sich anschließende Wasch¬ schritte empfehlen.
Die Detektion erfolgt durch eine Färbelösung, die so eingestellt ist, daß nach dem Durchlaufen der Lösungen eine konstante und geringe Menge an Farbstoff im Analysenraum stehenbleibt, wodurch kein Überfärben möglich ist und eine exakte Zeitvorgabe ent¬ fällt. Die Färbelösung ist insbesondere präzipitierender Farb¬ stoff und wird durch eine Enzymreaktion generiert, z.B. bei Immunreaktionen BCIP/NPT oder DAß.
Die Kontrollfelder 10, 11, 12 sind den Trenneinrichtungen 7, 8, 9 nachgeschaltet und ebenfalls im Auslauf 13 der Vorrichtung angeordnet. Das Kontrollfeld 10 kann beispielsweise das Antigen, das geprüft werden soll, enthalten, das Kontrollfeld 11 kann ein Anti-antigen-IgG enthalten, wohingegen das Kontrollfeld 12 ein Anti-IgG-Antikörper enthält.
Der Auslauf 13 steht mit einem Saugfilz 14 in Verbindung, der durch Kapillarkräfte die Probe aufnimmt und neben der Schwer- kraft für ein Durchtreten der Probe durch die erfindungsgemäße Vorrichtung sorgt .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung und/oder Entfernung einer Substanz in einer Probe durch Umsetzung der Substanz mit Komplex¬ bildnern, dadurch gekennzeichnet, daß
die Substanz mindestens zwei Domänen aufweist, die mit Komplexbildnern in Wechselwirkung treten,
Komplexbildner eingesetzt werden, die wenigstens zwei Positionen aufweisen, die mit den mindestens zwei Domänen in Wechselwirkung treten,
die Probe mit den Komplexbildnern versetzt wird und nach einer Komplexbildungszeit die Probe nach Größe der gebil¬ deten Komplexe mittels einer nach Größe sortierenden Trennvorrichtung, in der die gebildeten Komplexe zurück¬ gehalten werden detektierbar sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein mindestens divalentes Antigen, divalentes Enzym-/Substratsystem, divalentes Rezeptor-/Me- diatorsystem ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Komplexbildner mindestens zwei verschiedene monoklonale Antikörper oder -fragmente sind, die jeweils unterschiedliche Idiotype zu den mindestens zwei Domänen der zu bestimmenden Substanz aufweisen, oder polyklonale Antikörper oder -fragmente sind.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Größe der gebildeten Komplexe sortierenden Trennvorrichtung Trenneinrichtungen aufweist, die eine Ausschlußgröße von 20 bis 1.000 nm auf¬ weisen.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein Antigen mit mindestens zwei Epitopen ist.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Trenneinrich¬ tungen mit unterschiedlichen Ausschlußgrößen eingesetzt werden.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Trenneinrichtungen sub-μm- Filter sind.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion der gebildeten Komplexe durch Sekundärreaktionen erfolgt .
9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, mit einer Probenaufnahmevor¬ richtung (1) , einem Auslauf (14) und einer Trennvorrichtung (6) , dadurch gekennzeichnet, daß die Trennvorrichtung (6) mindestens eine Trenneinrichtung (7) aufweist, die in der Lage ist, einen Komplex aus der zu bestimmenden und/oder zu entfernenden Substanz zurückzuhalten.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Trenneinrichtung (7) eine Ausschlußgröße von 20 bis 1.000 nm aufweist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 und/oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Trenneinrich- tungen (7,8) mit unterschiedlichen Ausschlußgrößen vor¬ gesehen sind.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Trenneinrichtung (7) eine Ausschlußgröße von 150 biε 300 nm, eine zweite Trenneinrichtung (8) mit einer Ausschlußgröße von 80 bis 160 nm und gegebenenfalls eine dritte Trenneinrichtung (9) mit einer Ausschlußgröße von 20 bis 80 nm vorgesehen ist.
13. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes Kontrollfeld (10) vorgesehen ist, das die zu bestimmende und/oder zu entfer¬ nende Substanz enthält und/oder ein zweites Kontrollfeld
. (11) , das eine mit dem oder den Komplexbildner (n) in Wechselwirkung tretende Substanz enthält.
14. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, daß die Trennvorrichtung (6) , das erste und/oder das zweite Kontrollfeld (10,11) in dem Auslauf (14) angeordnet sind.
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