EP0788365A1 - Verwendung von 2',5'-oligoadenylaten zur behandlung von papillomatosen - Google Patents

Verwendung von 2',5'-oligoadenylaten zur behandlung von papillomatosen

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EP0788365A1
EP0788365A1 EP93920815A EP93920815A EP0788365A1 EP 0788365 A1 EP0788365 A1 EP 0788365A1 EP 93920815 A EP93920815 A EP 93920815A EP 93920815 A EP93920815 A EP 93920815A EP 0788365 A1 EP0788365 A1 EP 0788365A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
treatment
mixture
papillomas
day
oligoadenylates
Prior art date
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Pending
Application number
EP93920815A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Edward I. Budowsky
Arman D. Pivasyan
Alexander M. Zhelkovsky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ris Co Ltd
Original Assignee
Ris Co Ltd
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Publication date
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Publication of EP0788365A1 publication Critical patent/EP0788365A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to the field of medicine, namely a new use of natural adenosine residues containing oligoadenylates of different lengths with 2 ', 5'-phosphodiester internucleotide bonds with free 5'-terminal OH groups and free or phosphorylated 2'- and / or or 3'-terminal OH groups for the treatment of skin and mucosal papillomatoses.
  • Papillomaviruses (Papovaviridae family) cause papillomatosis, widespread infectious diseases in humans and animals (see WDLancaster, C.Olson / 1982 /, Microbiol.Rev. 46, 191-207; MA utzner / 1983 /, Arch. Dermat., 119, 631-635). More than 60 types of human papillomaviruses are currently known (see H.Pfister / 1987 /, VI International Papillomavirus Workshop, Georgetown, Washington DC; G.Nuovo, C.Crum, E.-M. de V Amsterdam, R. Levine , S. Silver- stain / 1988 /, J.Virol., 62, 1452-1455).
  • viruses are of similar construction, their genome is a double-stranded, covalently bound, closed, circular DNA which encodes virion proteins and the proteins required for intracellular virus development (H.Pfister / 1987 /, Rev. Physiol.Biochem.Pharmacol. 99, 111-181; DJ MeCance / 1986 /, Bioch.Biophys.Acta 823, 195-205; H. Pfister / 1987 /, The Papovaviridae / NPSalzman and PM Howley eds./ v. 2, pp. 1-38. Plenum Press , New York).
  • the genome of the papillomaviruses is reduplicated in the nucleus of the infected cells over the course of many generations (persistent infection) in the form of episomes (dozens of copies per cell).
  • the mature virions are then formed in the cells on the final stage of differentiation (see H. Pfister / 1987 /, The Papovaviridae / NPSalzman and PMHowley eds./ v. 2, pp. 1-38. Plenum Press, New York; LBTaichman, SS Reilly, RFLa Porta / 1983 /, J. Invest.Dermatol. 1, 137s-140s).
  • the papillomavirus DNA in the cells in the form of free episomes then causes benign papillomatoses of various types. There is a certain probability that these episomes can be incorporated into the host cell chromosome.
  • the incorporation of a certain part of the virus genome into the cell chromosome can lead to malignant changes (see H. zur Hausen / 1980 /, Adv. Cancer Res. 33, 77-107; M. Durst, L. Gissmann, H. Ikenberg, H Zur Hausen / 1983 /, Proc.Natl.Ac.Sci. USA 80, 3812-3815; TRBroker, M.
  • Botchan 1986 /, Cancer Cells, 4, 17-36, in: DNA Tumor Viruses, /M.Botchan , T.Grozdicker, P.Sharpdes, eds./ CSHL; H.zur Hausen, A.Schneider / 1987 /, The Papovaviridae / NPSalzman, PMHowley eds./ v. 2, pp. 245-263, Plenum Press, New York ; H. Zur Hausen / 1989 /, Cancer Res., 49, 4677-4681; M.Spitzer, BAKrumholz, VLSeltzer / 1989 /, Obstetrics. And Gynecol. 73, N3, 303-307).
  • the likelihood of such installation is usually very low and depends on the type of papillomavirus and the influence of other factors. factors. Approximately However, 30 - 40% of the population suffer from papillomatoses.
  • Papillomatoses are also widespread in other parts of the body, namely on the skin, in mucosal tissues of the upper respiratory tract, stomach, urinary bladder, intestine, etc.
  • papillomatoses are easily diagnosed precancerous diseases, the development of many tumors can be prevented by treating benign papillomatoses, ie before the malignant transformation occurs.
  • the generally customary method for the treatment of papillomatoses is the surgical removal of the papillomas or their necrotization by the action of chemical agents, ie mineral and / or organic acids (see W. Labhardt, / 1984 /, Dermatologica, 168, 31-32), silver salts etc., as well as in thermal, cryogenic and laser cauterization. These methods are painful, lead to keloids and do not guarantee protection against recurrences. To date, there are no effective means of treating papillomatosis.
  • podophylline showed colchicine-like effects on cell division (see LSKing, M.Sullivan / 1947 /, Arch.Pathol. 43, 374-386). Even the topical application of podophyllin leads to certain systemic effects such as dizziness, vomiting, peripheral neurophathy, tachynee, hematuria etc. (see KRBeutner / 1987 /, seminars in Dermatology 6, 10-18).
  • Animal cells contain an intracellular immune system, which is activated by interferons and ensures the antiviral and antitumor state of the cell (see P.Lengyel / 1982 /, Ann.Ev.Biochem., 51, 251-282; M.-F.Du - bois, M.Vignal, M.Cunff, C .Chang / 1983 /, Nature, 303, 433-434).
  • RNA-containing viruses The most important substances that mediate the antiviral effect of the interferon after infection with RNA-containing viruses are 2 ', 5'-01igoadenylates, formed from ATP with the help of 2', 5'-01igoadenylate synthetase: pppA -ppp (a2'p5 ') n A, where N> 2 (see P. Torrence / 1982 /, Mol.Aspects Med. 5, 129-171).
  • RNA double-stranded RNA
  • All currently known mechanisms mediated by 2'-5'-01igo-adenylate for producing an antiviral state induced by interferon in the cells are based on the activation of L-RNAse by these compounds containing pyrophosphate at the 5'-end (see MIJohnston, PFTorrence / 1984 /, Interferons, v. 3, pp. 189-298 / Friedman, RM ed./, Elsevier Sei. Publ., Amster ⁇ dam). These methods can therefore only be applied to viruses whose reproduction involves the formation of double-stranded RNA.
  • interferon In addition to its activity against RNA-containing viruses, interferon is also effective against certain DNA viruses and also has anti-tumor and anti-proliferative activity (see M.-F.Dubois, M.Vignal, M.Cunff, CL.Chang / 1983 /, Nature, 303, 433-434; A. Kimchi, H. Shure, M. Revel / 1981 /, Eur.J. Bioche. 114, 5-11). These activities can be determined on the basis of the inhibition of the DNA topoisomerases (see FJ Castora, CE Erikson, T. Kovacs, K. Lesiak, PFTorrence / 1991 /, J. Interferon Res. 11, 143-149) (see, however also APRice, WKRoberts, IMKerr / 1984 /, J.Virol. 50, 220-228).
  • the compounds according to the invention are prepared in a manner known per se by chemical-enzymatic synthesis. This begins with poly (A) with irregular 3 ', 5' and 2 ', 5' internucleotide linkages. This poly (A) is obtained using the Michelson method (see AMMichelson / 1963 /, The Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Acad. Press, pp. 418-419) by chemical polymerization of 2 '(3') AMP.
  • the desired oligomers of mixtures A and B are separated off by HPLC ion exchange chromatography.
  • Mixture C is separated by reverse phase HPLC.
  • the compounds obtained - as individual compounds or in a mixture - are highly effective against skin and mucous membrane diseases which are caused by papillomaviruses, the multiplication of which takes place in the form of episomes in the cell nucleus.
  • the results below show activity against papillomaviruses at least in the episomal state, i.e. in the state of benign lesions induced by papillomaviruses prior to the incorporation of the virus genome into the host cell chromosome and thus before the malignant change.
  • the preparation according to the invention can be administered in different formulations which are acceptable for topical use. These are prepared by carefully mixing or dissolving the individual compounds or their mixtures with a pharmaceutically acceptable carrier using the customary techniques, the carrier depending on the formulation of the preparation desired for the application, ie on the outer skin or on mucosal tissues, can have very different shapes.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example liquid carriers such as water, dimethyl sulfoxide in the presence or absence of alcohols, glycols etc. or in the form of a pomade, an ointment or a plaster. It is particularly advantageous to formulate the pharmaceutical preparations mentioned in one unit dose form to facilitate and standardize the dosage.
  • unit dose form refers to physically discrete units, each of which contains a certain amount of active ingredient, which is calculated in such a way that the desired therapeutic effect is achieved in conjunction with the required pharmaceutical carrier.
  • the total duration of treatment is usually up to 30 days with daily application.
  • a white powder of polyadenylate with irregular 2 ', 5' and 3 ', 5' internucleotide bonds is obtained in this way.
  • the general formula of the mixture is (A2 '(3') p5 '(A2' (3 ') p) n A> p, where 0 n ⁇ 10.
  • Nuclease cleavage The crude poly (A) is dissolved in 40 ml of H 2 O, the pH being adjusted to 8.0 with Tris-base. Then 2 ml (1 mg / ml) of a solution of RNAse from Bacillus intermedius (150 U / mg) are added, after which it is kept at 37 ° C. overnight. The completeness of the hydrolysis is checked by thin-layer chromatography using PEI cellulose sheets. The enzyme is removed by extraction with the same volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1). The analysis of the mixture obtained from 2 ', 3'-cyclophosphates of adenosine and 2'-5'-oligoadenylates is carried out by HPLC.
  • the general formula of the product (mixture A) is A2'p5'(A2'p5') n A> p , where 0 ⁇ n ⁇ 10. c) Opening of the 2 ', 3'-cyclophosphate group of the 2'-5'-oligo- adenylates
  • mixture A The pH of mixture A is adjusted with 1 M HCl. The mixture is then stirred at 20 ° C. for 3 hours and then neutralized with 1 M NaOH.
  • the analysis of the mixture obtained from adenosine and 2 '(3') phosphates of 2'-5'-oligoandenylates is carried out by HPLC.
  • Mixture B is incubated for 24 hours with BAP at pH 8.5 (2 U BAP per 1000 OD-E 260 ) at 37 ° C. After hydrolysis is complete, the enzyme is removed by extraction with the same volume of a mixture of chloroform and isoamyl alcohol (24: 1). The mixture of adenosine and 2'-5'-oligoadenylates obtained is analyzed by HPLC.
  • Ion exchange chromatography of mixtures A and B is carried out on a Diasorb NH 2 column (5 ⁇ , 4.6 x 125 mm for analysis and 10 ⁇ m, 9.2 x 250 mm for preparative purification; eluent NH 4 OAc, pH 6.5; in 20% CH 3 OH, linear gradient from 0 to IM NH, OAc, flow rate 0.75 ml / min for the analytical and 4 ml / min for the prepa- rative pillar). Detection is carried out using a UV test device at 260 nm.
  • the reverse phase chromatography of mixture C is carried out on a Zorbax ODS column (10 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm for the analysis and 10 ⁇ m, 9.2 ⁇ 250 mm for the preparative purification); Eluent - 7.5% MeOH in 0.1 M NH 4 OAc, pH 7.0; Elution profile - isocratic; Flow rate - 1 ml / min for the analytical and 4 ml / min for the preparative column. Detection is carried out using a UV test device at 254 nm.
  • the oligoadenylates are colorless compounds and easily soluble in water (up to 10 "2 M), dimethyl sulfoxide, aqueous ethanol or glycerin. They are in neutral aqueous solution at 4 ° C for several months and in frozen solution (below -20 ° C) or in lyophilized state borders soluble.
  • the pharmacological testing of the individual compounds or their mixtures was carried out by topical application of the aqueous solution containing the individual compounds or the oligomer mixture.
  • the papillomas were treated daily for 2 weeks or less (if the papilloma regressed earlier) by moistening the papilloma (diameter up to 5 mm) with 10-50 ⁇ l of the solution. Permanent positive results were obtained at concentrations of active (active) compound (s) (trimer and / or tetramer) of>. 10 "5 M.
  • the concentration of the active compound (s) was calculated on the basis of the optical density of the solution, taking into account the molar extinction coefficients at 260 nm for the individual compounds and their content in the mixture. Concentrations which are subsequently used for the clinical Examination of the mixtures of B and C are given, reflect the total content of all oligomers.
  • the concentration of the active oligoadenylates in the treatment solutions is at least two orders of magnitude higher than in the case of the interferon-induced cells, but the total amount of solution applied is usually less than 1.0 ml. Even if all oligoadenylates are absorbed, their average concentration in the cells and body fluids (blood, urine, etc.) is far below that in the non-induced cells. The concentration of the applied compounds can therefore only be temporarily (immediately after treatment) higher than that of their natural analogs in normal cells and only in the tissues in the immediate vicinity of the application site.
  • the 2'-5'-oligoadenylates can easily be broken down by nucleases and phosphatases which are present inside and outside the cells of the organism.
  • the end products obtained are adenylic acid and adenosine, which are customary cell metabolites whose average concentration in the cells is below 10 " M.
  • the condylomas were above the The penile gap and the prepuce were distributed, were nipple-shaped, had a cauliflower-like appearance in certain cases and were covered with a malodorous mucus.
  • the growth of the already formed papillomas stopped and new ones were not formed.
  • the younger papilomas had completely regressed.
  • three patients showed a complete regression of the papillomas with no scarring or other marks on the skin. In one case there was a significant improvement in the condition, while in two cases the condylomas did not regress.
  • the common warts were mainly small papillomas with a thin neck and weak pigmentation. During 1.5-2.0 weeks of treatment, one patient showed complete regression of the papillomas and in the remaining three patients only the larger papillomas remained after the end of the treatment period. The two flat warts patients who were treated for a month were then completely restored.
  • Findings papillo atous spreads on the penile cleft, which reached the size of a match head, with a cock's comb-like pore structure. The surface of the
  • Papilloma was covered with a whitish, foul-smelling layer. Treatment: moisten the papillomas once a day with an aqueous 10 " * M solution of the mixture B. On the fourth day the papillomas began to shrink and on the seventh day the penis mucosa was already completely free of pathological symptoms and pale pink in the place of the condylomas no scar-like changes were found.
  • Treatment moisten the papillomas once a day with an aqueous 10 " M solution of mixture B. After the first week of treatment, the papillomas flattened and on the 15th day a complete clinical recovery was ascertained. The skin on the affected areas their natural color has been regained and no scar-like changes have been observed.
  • Findings numerous cauliflower-like pink-yellow thin-necked papillomas on the mucous membrane of the small labia.
  • the papillomas were covered with a whitish-cloudy layer. Numerous paillomas of the same type were also found on the skin in the outer anal area.
  • Finding numerous papillomas on the inside of the wrists the size of a grain of grain, slightly raised above the surrounding skin, slightly pink.
  • Treatment Mix B (10 " * M) was applied daily. The flattening of the papillomas was observed on the fifth day of treatment, only the larger papillomas remained on the seventh to eighth days. Clinical recovery was established on day 14 Skin lines were restored, no side effects.
  • Diagnosis papilloma on the upper left eyelid. Findings: a single papilloma the size of a millet, skin-colored, without inflammation on the skin of the left upper lid above the eyelashes.
  • the mixture contains adenosine and 2'-5'-oligoadenylates of the general formula A2'p5 '(A2'p5') n A; component ratio and the concentration information see example 1).
  • the condylomas began to shrink on the second to fourth day and on the sixth to eighth day the mucous membrane was completely transparent.
  • Each papilloma was treated with an aqueous solution (10 "5 M) of each day for two weeks or less Trimer B treated.
  • the smaller papillomas disappeared completely on the eighth to ninth days, the larger two to three weeks after the end of treatment. No relapse was observed within the next six months.
  • Findings Six warts (diameter 2 - 4 mm, height 1 - 3 mm) on the left wrist, dark brown, hard, with a rough surface.
  • the warts were treated every day for two weeks with 50 ⁇ l of a solution (10 "5 M) of Tetramer B. Before each use, the warts were treated with a keratolytic preparation containing chymotrypsin to soften the surface On the sixth to ninth day of treatment, all the warts were flattened, three of them disappeared simultaneously on the eleventh day, two in the second and fourth weeks after treatment, the last one was still present at least 12 weeks after treatment.
  • Findings three yellow-brown soft warts (diameter 2 - 3 mm, height 1 - 1.5 mm) on the left cheek.
  • Treatment The warts were treated daily with 50 ⁇ l of a tetramer C solution (10 " * M). On the fourth to eighth day, the warts started to shrink and disappeared completely on the 10th to 12th day of treatment. Traces on the skin, negative No reactions or relapses during treatment and ten weeks afterwards were observed.

Abstract

Verfahren zur Behandlung von durch Papillomaviren verursachten Haut- und Schleimhauterkrankungen durch topische Applikation von 2',5'-Oligoadenylaten der Formel (I), worin R1 immer OH bedeutet, bei B R2 OH und R3 PO4<-2> oder R2 PO4<-2> und R3 OH bedeuten, bei C R2 = R3 = OH, und n 1 oder 2 bedeutet.

Description

VERWENDUNG VON 2' ,5'-OLIGOADENYLATEN ZUR BEHANDLUNG
VON PAPILLOMATOSEN
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, und zwar eine neue Verwendung natürliche Adenosinreste enthaltender Oligoadenylate von unterschiedlicher Länge mit 2',5'-Phos- phodiesterinternukleotidbindungen mit freien 5'-endständi¬ gen OH-Gruppen und freien oder phosphorylierten 2'- und/ oder 3'-endständigen OH-Gruppen zur Behandlung von Haut- und Schleimhautpapillomatosen.
Papillomaviren (Familie Papovaviridae) verursachen Papillo- matosen, weit verbreitete Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier (s. W.D.Lancaster, C.Olson /1982/, Microbiol.Rev. 46, 191-207; M.A. utzner /1983/, Arch. Dermat., 119, 631-635). Gegenwärtig sind mehr als 60 Typen menschlicher Papillomaviren bekannt (s. H.Pfister /1987/, VI Internatio¬ nal Papillomavirus Workshop, Georgetown, Washington D.C.; G.Nuovo, C.Crum, E.-M. de Villiers, R. Levine, S. Silver- stain /1988/, J.Virol., 62, 1452-1455). Alle diese Viren sind ähnlich gebaut, ihr Genom stellt eine doppelsträngige kovalent gebundene geschlossene ringförmige DNA dar, die Virionenproteine und die für die intrazelluläre Virusent¬ wicklung erforderlichen Proteine kodiert (H.Pfister /1987/, Rev. Physiol.Biochem.Pharmacol. 99, 111-181; D.J. MeCance /1986/, Bioch.Biophys.Acta 823, 195-205; H. Pfister /1987/, The Papovaviridae /N.P.Salzman and P.M. Howley eds./ v. 2, pp. 1-38. Plenum Press, New York). Das Genom der Papilloma¬ viren wird im Kern der infizierten Zellen im Verlaufe vieler Generationen (persistente Infektion) in Form von Episomen redupliziert (Dutzende Kopien pro Zelle). Die Bildung der reifen Virionen erfolgt dann in den Zellen auf der Endstufe der Differenzierung (s. H.Pfister /1987/, The Papovaviridae /N.P.Salzman and P.M.Howley eds./ v. 2, pp. 1-38. Plenum Press, New York; L.B.Taichman, S.S. Reilly, R.F.La Porta /1983/, J. Invest.Dermatol. 1, 137s-140s). Die Papillomaviren-DNA in den Zellen in Form freier Episomen verursacht dann gutartige Papillomatosen unterschiedlicher Art. Es besteht eine gewisse Wahrscheinlichkeit, daß diese Episomen in das Wirtszellenchromosom eingebaut werden können. Der Einbau eines bestimmten Teils des Virusgenoms in das Zellchromosom kann zu bösartigen Veränderungen führen (s. H. zur Hausen /1980/, Adv. Cancer Res. 33, 77-107; M. Durst, L.Gissmann, H.Ikenberg, H.zur Hausen /1983/, Proc.Natl.Ac.Sci. USA 80, 3812-3815; T.R.Broker, M. Botchan /1986/, Cancer Cells, 4, 17-36, in: DNA Tumor Viruses, /M.Botchan, T.Grozdicker, P.Sharpdes, eds./ CSHL; H.zur Hausen, A.Schneider /1987/, The Papovaviridae /N.P.Salzman, P.M.Howley eds./ v. 2, pp. 245-263, Plenum Press, New York; H.zur Hausen /1989/, Cancer Res., 49, 4677-4681; M.Spitzer, B.A.Krumholz, V.L.Seltzer /1989/, Obstetrics. and Gynecol. 73, N3, 303-307). Die Wahrschein¬ lichkeit eines solchen Einbaus ist gewöhnlich sehr gering und hängt vom Typ der Papillomaviren und vom Einfluß ande- rer Faktoren ab. Ca. 30 - 40 % der Bevölkerung leiden jedoch an Papillomatosen.
Das primäre Erscheinungsbild für die Mehrzahl menschlicher Tumore sind daher Papillomatosen. Die gefährlichsten Papil¬ lomatosen sind dabei die anogenitalen, die auf sexuellem Wege übertragen werden (s. H.zur Hausen, A.Schneider /1987/, The Papovaviridae /N.P.Salzman, P.M.Howley eds./ v. 2, pp. 245-263, Plenum Press, New York; H.zur Hausen /1989/, Cancer Res., 49, 4677-4681; L.T.Chow, M.Nasserl, S.Wolinsky, T.Broker /1987/, J.Virol., 61, 2581-2588; C.-C.Li, K.V.Shah, A Seth, R.Gilden /1987/, J.of Virol., 61, 2684-2690; Centers for Disease Control /1983/, Mor¬ bid.Mortal.Weekly Rep. 32, 306-308). Weit verbreitet sind Papillomatosen auch an anderen Stellen des Körpers, und zwar auf der Haut, in Schleimhautgeweben der oberen Atem¬ wege, des Magens, der Harnblase, des Darms usw.
Da Papillomatosen leicht zu diagnostizierende präkanzeröse Erkrankungen sind, kann die Entwicklung vieler Tumore durch Behandlung gutartiger Papillomatosen verhindert werden, d.h. bevor es zu einer malignen Umwandlung derselben kommt. Gegenwärtig besteht die allgemein übliche Methode bei der Behandlung von Papillomatosen in der chirurgischen Entfer¬ nung der Papillome bzw. in ihrer Nekrotisierung durch Einwirkung chemischer Mittel, d.h. Mineral- und/ oder organischer Säuren (s. W.Labhardt, /1984/, Dermatologica, 168, 31-32), Silbersalzen usw., sowie in der Thermo-, Kryo- und Laserkauterisation. Diese Methoden sind schmerzhaft, führen zu Keloiden und gewährleisten keinen Schutz vor Rezidiven. Bis heute gibt es keine wirksamen Mittel zur Behandlung von Papillomatosen. Bis heute wurden Podohpyllin (s. K.R. Beutner /1987/, Seminars in Dermatology 6, 10-18) und Interferone (s. J.C.Vance, R.CReich an, C.McEwen /1986/, Arch.Dermatol., 122, 272-277; G.Mahrle /1989/, J.Invest. Dermatol., 93,562; F.G.Bruins, A.J. van der Brule, R. Mulnik, J.M.Walboomers, CJ.Meijer, R.Willemze /1989/, J.Invest.Dermatol. , 93, 544) auf ihre Wirkung als Arzneimittel für die Behandlung von Papillomatosen gete¬ stet. Podophyllin zeigte colchicinähnliche Wirkung auf die Zellteilung (s. L.S.King, M.Sullivan /1947/, Arch.Pathol. 43, 374-386). Selbst die topische Applikation von Podo¬ phyllin führt zu bestimmten systemischen Wirkungen wie Schwindelgefühl, Erbrechen, periphere Neurophathie, Tachy- noe, Hämaturie usw. (s. K.R.Beutner /1987/, Seminars in Dermatology 6, 10-18).
Bei den für die Behandlung von Papillomatosen in Frage kommenden Dosen (10-30.10 E) pro Behandlungsdauer (s. J.C.Vance, R.C.Reichman, C.McEwen /1986/, Arch. Dermatol., 122, 272-277; G.Mahrle /1989/ J.Invest. Dermatol., 93,562; F.G.Bruins, A.J. van der Brule, R.Mulnik, J.M.Walboomers, CJ.Meijer, R.Willemze /1989/, J.Invest. Dermatol., 93, 544) verursachten Interferone ebenfalls viele Nebenwirkun¬ gen einschließlich einer Beeinträchtigung des humoralen und zellulären Immunsystems (s. R. Bauer, I.Böhm, H.W.Niedek- ken, J.A.Stefan /1989/, J. Investig.Dermatol. , 93, 540). Trotz der bekannten antiviralen Aktivität der Interferone ist ihre Wirksamkeit gegenüber durch Papillomaviren ver¬ ursachten Krankheiten gering (s. J.C.Vance, R.C.Reichman, CMcEwen /1986/, Arch.Dermatol. , 122, 272-277; G.Mahrle /1989/, J.Invest. Dermatol., 93, 562; F.G.Bruins, A.J. van der Brule, R.Mulnik, J.M.Walboomers, CJ.Meijer, R.Willemze /1989/, J.Invest.Dermatol., 93, 544).
Tierische Zellen enthalten ein intrazelluläres Immunsystem, das durch Interferone aktiviert wird und den antiviralen und antitumoralen Zustand der Zelle gewährleistet (s. P.Lengyel /1982/, Ann.Ev.Biochem. , 51, 251-282; M.-F.Du- bois, M.Vignal, M.Cunff, C .Chang /1983/, Nature, 303, 433-434). Die wichtigsten Stoffe, welche die antivirale Wirkung des Interferons nach der Infektion mit RNA-haltigen Viren vermitteln, sind 2' ,5'-01igoadenylate, gebildet aus ATP mit Hilfe von 2' ,5'-01igoadenylatsynthetase: pppA -ppp(a2'p5' )nA, worin N>2 (s. P.Torrence /1982/, Mol.Aspects Med. 5, 129-171).
Die Aktivität dieses Enzyms hängt insbesondere von der Anwesenheit doppelsträngiger RNA ab, die gewöhnlich viralen Usprungs ist. Sämtliche heute bekannten durch 2'-5'-01igo- adenylat vermittelten Mechanismen zur Herstellung eines durch Interferon induzierten antiviralen Zustandes in den Zellen beruhen auf der Aktivierung der L-RNAse durch diese am 5'-Ende Pyrophosphat enthaltenden Verbindungen (s. M.I.Johnston, P.F.Torrence /1984/, Interferons, v. 3, pp. 189-298 /Friedman, R.M. ed./, Elsevier Sei. Publ. , Amster¬ dam) . Diese Methoden können daher nur auf Viren angewandt werden, deren Reproduktion die Bildung doppelsträngiger RNA umfaßt. Neben ihrer Aktivität gegenüber RNA-haltigen Viren ist Interferon auch noch wirksam gegenüber bestimmten DNA-Viren und weist außerdem noch antitumorale und anti- proliferative Aktivität auf (s. M.-F.Dubois, M.Vignal, M.Cunff, CL.Chang /1983/, Nature, 303, 433-434; A.Kimchi, H. Shure, M.Revel /1981/, Eur.J.Bioche . 114, 5-11). Diese Aktivitäten lassen sich anhand der Inhibierung der DNA- Topoisomerasen bestimmen (s. F.J. Castora, C.E. Erikson, T.Kovacs, K.Lesiak, P.F.Torrence /1991/, J. Interferon Res. 11, 143-149) (s. jedoch auch A.P.Rice, W.K.Roberts, I.M.Kerr /1984/, J.Virol. 50, 220-228).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden in an sich be¬ kannter Weise durch chemisch-enzy atische Synthese herge¬ stellt. Diese beginnt mit poly(A) mit unregelmäßigen 3',5'- und 2' ,5'-Internukleotidbindungen. Dieses poly(A) wird erhalten nach dem Michelson-Verfahren (s. A.M.Michelson /1963/, The Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Acad. Press, pp. 418-419) durch chemische Polymerisation von 2'(3')AMP. Die nachfolgende Spaltung der 3'-5'-Bindungen in diesem Polymer durch RNAse von B.inter edius in einem Puffer (pH-Bereich 5,0-7,5) führt zu einem Gemisch A, das ein Monomer und 2'-5'-0ligoadenylate von unterschiedlicher Länge, worin Rj OH und R2 und R3 Cyclophosphat bedeuten, enthält. Durch Halten des Gemisches A bei einem pH von 1,0 wird das endständige zyklische Phosphat geöffnet, wodurch man zu einem Gemisch B mit Rt = OH, R2 = OH, R3 = P04 " oder R2 = P04 "2 , R3 = OH gelangt. Die endständige Phosphatgruppe wird enzymatisch mit bakterieller Alkaliphosphatase ent¬ fernt, wodurch man zum Gemisch C (R1=R2=R3=0H) gelangt.
Die Abtrennung der gewünschten Oligomere der Gemische A und B erfolgt durch HPLC-Ionenaustauschchromatographie. Das Gemisch C wird durch Reverse-phase-HPLC abgetrennt.
Die erhaltenen Verbindungen - als Einzelverbindungen oder im Gemisch - sind gegenüber Haut- und Schleimhauterkrankun¬ gen hochwirksam, die durch Papillomaviren verursacht wer¬ den, deren Vermehrung in Form von Episomen im Zellkern stattfindet. Die unten angeführten Ergebnisse zeigen die Aktivität gegenüber Papillomaviren zumindest im episomalen Zustand, d.h. im Zustand gutartiger durch Papillomaviren induzierter Läsionen vor dem Einbau des Virusgenoms in das Wirtszellenchromosom und damit vor der bösartigen Verände¬ rung.
Das erfindungsgemäße Präparat kann in unterschiedlichen, für die topische Anwendung annehmbaren Formulierungen verabreicht werden. Diese stellt man her durch sorgfältiges Mischen bzw. Lösen der Einzelverbindungen oder ihrer Gemi¬ sche mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger unter Verwendung der üblichen Techniken, wobei der Träger je nach der für die Applikation erwünschten Formulierung des Präpa¬ rats, d.h. auf der Außenhaut oder auf Schleimhautgeweben, sehr unterschiedliche Form haben kann. Für die Herstellung der Präparate können die verschiedensten pharmazeutischen Medien verwendet werden, wie z.B. flüssige Träger wie Wasser, Dimethylsulfoxid in An- oder Abwesenheit von Alko¬ holen, Glycolen usw. oder in Form einer Pomade, einer Salbe oder eines Pflasters. Besonders vorteilhaft ist es, die erwähnten pharmazeutischen Präparate zur Erleichterung und Vereinheitlichung der Dosierung in einer Dosiseinheitsform zu formulieren. Der Ausdruck "Dosiseinheitsform" bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, von denen jede eine bestimmte Menge Wirkstoff enthält, die so berechnet ist, daß in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeuti¬ schen Träger die gewünschte therapeutische Wirkung erzielt wird. Die entsprechende Dosis für e i n e Anwendung zur Behandlung von Papillomatosen sollte 10" bis 10" M Wirk¬ stoff (n = 1 und/oder 2) pro Papille (3 bis 5 mm Durchmes¬ ser) betragen. Die Gesamtdauer der Behandlung beträgt üblicherweise bis zu 30 Tagen bei täglicher Applikation.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration der Her¬ stellung, schränken den Anspruchsumfang jedoch nicht ein.
A. Herstellung und Reinigung der Einzelverbindungen bzw. ihres Gemisches
(Chemisch-enzymatische Synthese der 2'-5'-01igo- adenylate)
a) Synthese von Poly(A) :
0,9 g (2,5 mMol) Adenosin-2' (3' )- onophosphat (freie Säure) und 1,2 ml (2,6 mMol) tri-n-Octylamin werden in 30 ml Methanol/Ethanol (1:1) gelöst, wobei die Lösung mehrere Stunden gerührt wird. Danach werden die unlöslichen Anteile mit Hilfe eines Glasfilters abfiltriert, wonach das Filtrat mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bis zur Trockene eingedampft wird. Der erhaltene Feststoff wird dann in 10 ml abs. Dioxan gelöst und mit Hilfe eines Rotationsver¬ dampfers bis zur Trockene eingedampft. Beide Vorgänge werden zweimal wiederholt. Dann wird der erhaltene Fest¬ stoff in 5 ml abs. Dioxan gelöst, wonach 0,77 ml (3,75 mMol) Diphenylphosphorylchlorid unter Rühren mit Hilfe eines Magnetrührers zugetropft werden. Danach werden 3,2 ml (7,5 mMol) tri-n-Octylamin zugesetzt. Dann wird die erhal¬ tene Lösung 1 Stunde lang gerührt, wonach 0,77 ml Diphenyl¬ phosphorylchlorid und 3,2 ml tri-n-Octylamin zugesetzt werden und weitere 4 Stunden gerührt wird. Dann wird das Reaktionsgemisch in 5 Vol. Hexan/Ehter (4:6) unter Rühren gegossen. Der Niederschlag wird dann abfiltriert und mit dem erwähnten Gemisch und danach mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält auf diese Weise ein weißes Pulver von Polyadenylat mit unregelmäßigen 2' ,5'- und 3' ,5'-Internukleotidbindungen. Die allgemeine Formel des Gemisches ist (A2' (3' )p5' (A2' (3' )p)nA > p, worin 0 n < 10.
b) Spaltung der 3' ,5'-Internukleotidbindungen durch
Nukleasespaltung Das rohe Poly(A) wird in 40 ml H20 gelöst, wobei der pH mit Tris-base auf 8,0 eingestellt wird. Dann werden 2 ml (1 mg/ml) einer Lösung von RNAse aus Bacillus intermedius (150 E/mg) zugesetzt, wonach über Nacht bei 37°C gehalten wird. Die Vollständigkeit der Hydrolyse wird dünnschicht- chromatografisch mit Hilfe von PEI-Cellulose-Blättern überprüft. Das Enzym wird durch Extraktion mit demselben Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) entfernt. Die Analyse des erhaltenen Gemisches aus 2' ,3'-Cyclophosphaten von Adenosin und 2'-5'-Oligoadenylaten erfolgt durch HPLC Die allgemeine Formel des Produktes (Gemisch A) ist A2'p5' (A2'p5' )n A>p, worin 0 < n < 10. c) Öffnung der 2' ,3'-Cyclophosphatgruppe der 2'-5'-Oligo- adenylate
Der pH-Wert des Gemisches A wird mit 1 M HCl eingestellt. Danach wird das Gemisch 3 Stunden lang bei 20°C gerührt und dann mit 1 M NaOH neutralisiert. Die Analyse des erhaltenen Gemisches aus Adenosin und 2' (3' )-Phosphaten von 2'-5'- Oligoandenylaten erfolgt durch HPLC Die allgemeine Formel des Produkts (Gemisch B) ist A2'p5' (A2'p5')nAp, worin 0 <_ n < 10 (Fig. 1, worin R. = OH, R2 = 2' (3' )-Monophosphat und R3 = OH oder R3 = 2' (3' )-Monophosphat und R2 = OH).
d) Entfernung der 2' (3' )-Phosphatgruppe durch bakterielle Alkaliphosphatase (BAP)
Das Gemisch B wird 24 Stunden lang mit BAP bei einem pH- Wert von 8,5 (2 E BAP je 1000 OD-E260) bei 37°C inkubiert. Nach Abschluß der Hydrolyse wird das Enzym durch Extraktion mit demselben Volumen eines Gemisches von Chloroform und Isoamylalkohol (24:1) entfernt. Die Analyse des erhaltenen Gemisches aus Adenosin und 2'-5'-Oligoadenylaten erfolgt durch HPLC. Die allgemeine Formel des Produkts (Gemisch C) ist A2'p5' (A2'p5' ),.A, worin 0 <. n < 10 ist (Fig.l, worin Ri = R2 - R3 = OH) .
Analyse und Reinigung der 2'-5'-Oligoadenylate
Die Ionenaustauschchromatographie der Gemische A und B erfolgt an einer Diasorb-NH2-Säule (5 μ , 4,6 x 125 mm für die Analyse und 10 μm, 9,2 x 250 mm für die präparative Reinigung; Eluierungsmittel NH4OAc, pH 6,5; in 20 % CH3OH, linearer Gradient von 0 bis IM NH,OAc, Fließgeschwindigkeit 0,75 ml/min für die analytische und 4 ml/min für die präpa- rative Säule). Der Nachweis erfolgt mit Hilfe eines UV- Prüfgeräts bei 260 nm.
Die Reverse-phase-Chromatographie von Gemisch C erfolgt an einer Zorbax ODS-Säule (10 um, 4,6 x 250 mm für die Analyse und 10 μm, 9,2 x 250 mm für die präparative Reinigung); Eluierungsmittel - 7,5 % MeOH in 0,1 M NH4OAc, pH 7,0; Eluierungsprofil - isokratisch; Fließgeschwindigkeit - 1 ml/min für die analytische und 4 ml/min für die präpara¬ tive Säule. Der Nachweis erfolgt mit Hilfe eines UV-Prüfge¬ räts bei 254 nm.
Alle Gemische enthalten aufgrund der optischen Dichte bei 260 nm 50 bis 70 % Monomer, 20 bis 50 % Diadenylat, 8 bis 15 % Triadenylat, 2 bis 7 % Tetraadenylat und ca. 2 % höhere Oligoadenylate. Der durchschnittliche molare Extink¬ tionskoeffizient betrug 15.48.103 für das Monomer, 28.810 für das Dimer, 36.8.103 für das Trimer und 45.8.103 für das Tetramer.
Die einzelnen Komponenten ergaben nach Öffnung des Cyclo- phosphats (im Falle der Verbindungen der Serie A), De- phosphorylierung und alkalische Spaltung der Internukleo¬ tidbindungen ein Verhältnis Adenosin : Adenylsäure von 1:2 für das Trimer und 1:3 für das Tetramer. Dieselben Verhält¬ nisse von endständigem Phosphat (Cyclophosphat- bzw. Mono- phosphatgruppen in den Verbindungen der Serien A bzw. B) zu Internukleotidphosphat erhielt man für diese Verbindungen aufgrund ihrer 31P-NMR-Sρektra. )
Die Oligoadenylate sind farblose Verbindungen und in Wasser (bis zu 10"2 M), Dimethylsulfoxid, wässerigem Ethanol oder Glycerin leicht löslich. Sie sind in neutraler wässeriger Lösung bei 4°C mehrere Monate lang und in eingefrorener Lösung (unter -20 °C ) oder in lyophilisiertem Zustand unbe- grenzt löslich.
B. Pharmakologische Beispiele
Die starke antipapillomavirale Aktivität der beschriebenen Verbindungen und ihrer Gemische geht aus den Ergebnissen der nachfolgend beschriebenen Versuche deutlich hervor. Diese Daten dienen lediglich der Illustration der nützli¬ chen antipapillomatotischen Eigenschaften der Verbindungen und ihrer Gemische und stellen keine Einschränkung der Erfindung bezüglich des Umfangs der empfänglichen Viren und auch nicht bezüglich des Umfangs der erwähnten Verbindungen dar.
Die pharmakologische Prüfung der EinzelVerbindungen bzw. ihrer Gemische erfolgte durch topische Applikation der die Einzelverbindungen bzw. das Oligomerengemisch enthaltenden wäßrigen Lösung. Die Papillome wurden täglich während 2 Wochen oder weniger (wenn das Papillom sich früher zurück¬ bildete) durch Befeuchtung des Papilloms (Durchmesser bis zu 5 mm) mit 10 - 50 μl der Lösung behandelt. Dauerhafte positive Ergebnisse erzielte man bei Konzentrationen an aktiver (aktiven) Verbindung(en) (Trimer und/oder Tetramer) von >. 10"5 M. Die Konzentration der aktiven Verbindung(en) wurde ausgehend von der optischen Dichte der Lösung errech¬ net unter Berücksichtigung der molaren Extinktionskoeffi¬ zienten bei 260 nm für die Einzelverbindungen und ihren Gehalt im Gemisch. Konzentrationen, die nachfolgend für die klinische Prüfung der Gemische aus B und C angegeben sind, geben den Gesamtgehalt an sämtlichen Oligomeren wieder.
Die Konzentration der aktiven Oligoadenylate in den Behand¬ lungslösungen ist zwar wenigstens um zwei Größenordnungen höher als im Falle der interferoninduzierten Zellen, die Gesamtmenge an aufgebrachter Lösung liegt jedoch gewöhnlich unter 1,0 ml. Selbst wenn alle Oligoadenylate absorbiert werden, liegt ihre Durchschnittskonzentration in den Zellen und Körperflüssigkeiten (Blut, Urin usw. ) weit unter der in den nicht induzierten Zellen. Die Konzentration an den aufgebrachten Verbindungen kann daher nur vorübergehend (unmittelbar nach Behandlung) höher sein als die ihrer natürlichen Analoga in den normalen Zellen und das auch nur in den Geweben in der unmittelbaren Umgebung der Applika¬ tionsstelle.
Die 2'-5'-Oligoadenylate können durch Nucleasen und Phos- phatasen, die innerhalb und außerhalb der Zellen des Orga¬ nismus vorhanden sind, leicht abgebaut werden. Als End¬ produkte fallen dabei Adenylsäure und Adenosin an, die übliche Zellmetabolite darstellen, deren Durchschnittskon¬ zentration in den Zellen unter 10" M liegt.
Die Behandlung der Kondylome führte dazu, daß sich in der ersten Woche ihre Größe verringerte und sie innerhalb einiger Wochen völlig verschwanden. Bei gewöhnlichen und flachen Warzen sowie bei Sohlenwarzen erfolgte die völlige Genesung im allgemeinen innerhalb einiger Wochen, in eini¬ gen Fällen jedoch verschwanden die Warzen innerhalb 4 bis 8 Wochen nach Behandlungsende.
In keinem einzigen Fall wurden toxikoallergische oder andere Nebenwirkungen beobachtet. Die Behandlung ist schmerzlos und führt zu keinerlei Narbenbildung oder ande¬ ren sichtbaren Veränderungen in der Haut und in den Schleimhautgeweben. Wie der übliche Arnes-Test ergeben hat, zeigen die Gemische A, B und C bei Ausgangskonzentrationen im Züchtungsmedium von bis zu 10" M keine nachweisbare mutagene Aktivität. Gewöhnlich führte bei mehr als 80 % der Patienten die Behandlung zu einer vollständigen Genesung ohne Rückfälle wenigstens während 3 bis 4 Monaten. Beispiel 1: Klinische Prüfung des Gemisches B
(Gemisch B enthält 2' (3' )-Phosphate von Adenosin und 2'-5'- -Oligoadenylate der allgemeinen Formel A2'p5' (A2'p5' )nAp, worin n = 0, 1, 2 , und höhere Oligomere im Verhältnis 47:26:15:6:6 aufgrund der HPLC-Analyse. Die Konzentration ist dabei bezogen auf die Summe von Trimer und Tetramer, d.h. n = 1 und 2) .
Behandelt wurden 26 Patienten mit den nachfolgend genannten Papillomformen (ein Teil der Ergebnisse ist in Tabelle 1 zusammengefaßt): disseminierte Kondylome an den äußeren Genitalien (8 Patienten); gewöhnliche Warzen auf der Brust und am Hals (5 Patienten), flache Warzen (13 Patienten). Die Behandlung erfolgte durch Befeuchtung der Papillome mit 1 - 2 Tropfen (10 - 20 μl pro Papillom einer wäßrigen Lösung des Gemisches B (10" M) ein- oder zweimal täglich. Die Standardblut- und -urinanalyse vor, während und nach der Behandlung mit Gemisch B ergab keine pathologischen Veränderungen.
Tabelle 1
BEHANDLUNG HUMANER ÄUSSERER PAPILLOMATOSEN MIT OLIGOADENYLATGEMISCHEN
*) In den meisten Fällen wiesen die Patienten Mehrfach¬ läsionen desselben Typs auf.
**) Jede Läsion wurde mit 10 - 20 μl einer 10"*-10"5 M- Lösung des jeweiligen Gemisches ein- bis zweimal täglich befeuchtet.
Bei den männlichen Patienten waren die Kondylome über den Penisspalt und das Präputium verteilt, zeigten Nippelform, wiesen in bestimmten Fällen blumenkohlähnliches Aussehen auf und waren mit einem übelriechenden Schleim bedeckt. Am Ende der ersten Behandlungswoche kam das Wachstum der bereits gebildeten Papillome zum Stillstand und neue wurden nicht gebildet. Nach zwei Wochen waren die jüngeren Papil¬ lome vollständig zurückgebildet. Innerhalb von vier Wochen zeigten drei Patienten eine vollständige Rückbildung der Papillome ohne Narbenbildung oder andere Spuren auf der Haut. In einem Fall war eine erhebliche Besserung des Zustandes festzustellen, während in zwei Fällen sich die Kondylome nicht zurückbildeten.
Die gewöhnlichen Warzen waren in der Hauptsache kleine Papillome mit dünnem Hals und schwach ausgeprägter Pigmen¬ tierung. Während 1,5 - 2,0 Wochen der Behandlung zeigte ein Patient vollständige Rückbildung der Papillome und bei den übrigen drei Patienten waren am Ende der Behandlungsdauer nur noch die größeren Papillome zurückgeblieben. Die beiden flache Warzen aufweisenden Patienten, die ein Monat lang behandelt wurden, waren danach vollständig wiederherge¬ stellt.
In allen Fällen bewirkte die Behandlung keine toxiko-al- lergischen Reaktionen.
Klinische Fälle
1. Patient B.f Alter 30.
Diagnose: scharfkantige Kondylome.
Befund: papillo atöse Ausstreuungen an der Penisspalte, welche die Größe eines Streichholzkopfes erreichten, mit einer hahnenkammähnlichen Porenstruktur. Die Oberfläche der
Papillome war mit einer weißlichen, übelriechenden Schicht bedeckt. Behandlung: Befeuchtung der Papillome einmal pro Tag mit einer wäßrigen 10"* M Lösung des Gemisches B. Am vierten Tag begannen die Papillome zu schrumpfen und am siebten Tag war die Penismucosa bereits völlig frei von pathologischen Erscheinungen und blaßrosa gefärbt. An der Stelle der Kondylome waren keine narbenähnlichen Veränderungen festzu¬ stellen.
2. Patient M., Alter 42. Diagnose: gewöhnliche Warzen.
Befund: zwei runde, sich über die Hautoberfläche leicht erhebende Papillome (Durchmesser 0,6 - 0,8 cm) auf der Oberfläche des linken Handgelenks. Die Papillome zeigten eine ins Graue gehende gelbe Färbung und hatten eine etwas unebene Oberfläche. Die Papillome standen mit den darunter liegenden Geweben nicht in Verbindung.
Behandlung: Befeuchtung der Papillome einmal pro Tag mit einer wäßrigen 10" M Lösung von Gemisch B. Nach der ersten Behandlungswoche kam es zur Abflachung der Papillome und am 15. Tag wurde eine vollständige klinische Genesung festge¬ stellt. Die Haut hatte an den befallenen Stellen ihre natürliche Farbe wiedergewonnen; narbenähnliche Verände¬ rungen wurden nicht festgestellt.
3. Patientin M., Alter 33.
Diagnose: scharfkantige Kondylome im Bereich der kleinen
Schamlippen und im Afterbereich.
Anamnese: akute Gonorrhoe, Schädigungen im Colon- und
Rektalbereich. Wassermann-Reaktion negativ.
Befund: zahlreiche blumenkohlähnliche rosa-gelbe dünnhalsi- ge Papillome auf der Schleimhaut der kleinen Schamlippen.
Die Papillome waren mit einer weißlich-trüben Schicht überzogen. Zahlreiche Ppaillome desselben Typs waren auch auf der Haut im äußeren Analbereich festzustellen.
Behandlung: Täglich wurde das Gemisch B (10" M) appli- \ 7
ziert. Am dritten Tag begannen die Papillome zu schrumpfen, die kleineren verschwanden und am achten Tag waren die Kondylome vollständig zurückgebildet. An der Stelle der früheren Papillome waren keinerlei narbenähnliche Verände¬ rungen festzustellen. Schleimhaut und Haut zeigten die übliche Färbung. Nebenwirkungen wurden nicht beobachtet.
4. Patient U., Alter 38. Diagnose: gewöhnliche Warzen.
Befund: zahlreiche Papillome auf der Innenseite der Hand¬ gelenke von der Größe eines Getreidekorns, leicht über die umgebende Haut erhaben, schwach rosafarben. Behandlung: Täglich wurde das Gemisch B (10"* M) appli- ziert. Am fünften Behandlungstag wurde eine Abflachung der Papillome festgestellt, am siebten bis achten Tag waren lediglich die größeren Papillome zurückgeblieben. Die klinische Genesung wurde am 14. Tag festgestellt. Die Hautlinien waren wiederhergestellt. Keine Nebenwirkung.
5. Patient I., Alter 28.
Diagnose: Papillom auf dem linken oberen Augenlid. Befund: ein einziges Papillom von Hirsekorngröße, haut- farben, ohne Entzündung auf der Haut des linken oberen Lids oberhalb der Wimpern.
Da die übrige Lidhaut intakt war, wurde auf einen chirur¬ gischen Eingriff verzichtet.
Behandlung: Verwendung von Gemisch B (10" M) . Am sechsten Behandlungstag wurde eine Schrumpfung des Papilloms festge¬ stellt. Am 12. Tag war es vollkommen zurückgebildet, wobei keine narbenähnlichen Veränderungen festzustellen waren.
Beispiel 2: Klinische Prüfung des Gemisches C
(Das Gemisch enthält Adenosin und 2'-5'-Oligoadenylate der allgemeinen Formel A2'p5' (A2'p5' )nA; bezüglich des Kom- ponentenverhältnisses und der Konzentrationsangaben siehe Beispiel 1).
An 15 Patienten wurde das Gemisch C (wäßrige 10"* M Lösung) getestet. (Ein Teil der Ergebnisse ist in Tabelle 1 angege¬ ben). Vier Patienten litten an scharfkantigen Kondylomen im Bereich des Penisspalts und der Eichel. Sieben Patienten zeigten flache Warzen auf dem Körper sowie an Armen und Beinen. Medikation: Die Kondylome wurden einmal täglich mit der Lösung von Gemisch C behandelt. Die Warzen waren vor¬ gängig mit keratolytischen Präparaten (im Falle ausgepräg¬ ter Hyperkeratose) vorbehandelt worden, wonach täglich Gemisch C aufgebracht wurde.
Die Kondylome begannen am zweiten bis vierten Tag zu schrumpfen und am sechsten bis achten Tag war die Schleim¬ haut vollständig durchsichtig.
Die Verwendung von Gemisch C zur Behandlung flacher Warzen erwies sich als überaus effektiv. Bei täglicher Applikation flachten sich die meisten Papillome nach fünf bis sieben Tagen ab und waren nach 12 bis 15 Tagen vollständig zurück¬ gebildet.
Beispiel 3: Klinische Prüfung des Trimers und Tetramers B
(A2'p5' (A2'p5')nAp, n = 1 bzw. 2)
Patient B., Alter 22.
Diagnose: gewöhnliche Warzen.
Befund: mehrfache (elf) Papillome, leicht erhaben, größere
Papillome mit unebener Oberfläche, an der Außenseite des linken Handgelenks.
Behandlung: Jedes Papillom wurde zwei Wochen lang oder kürzer jeden Tag mit einer wäßrigen Lösung (10"5 M) von Trimer B behandelt. Die kleineren Papillome (acht von elf) verschwanden am achten bis neunten Tag vollständig, die größeren zwei bis drei Wochen nach Abschluß der Behandlung. Innerhalb der darauffolgenden sechs Monate wurde kein Rückfall beobachtet.
Patient Ju., Alter 41. Diagnose: gewöhnliche Warzen.
Befund: Sechs Warzen (Durchmesser 2 - 4 mm, Höhe 1 - 3 mm) auf dem linken Handgelenk, dunkelbraun, hart, mit rauher Oberfläche.
Behandlung: Die Warzen wurden zwei Wochen lang jeden Tag mit je 50 μl einer Lösung (10"5 M) von Tetramer B behan¬ delt. Vor jeder Anwendung wurden die Warzen mit einem keratolytischen, Chymotrypsin enthaltenden Präparat behan¬ delt, um die Oberfläche aufzuweichen. Am sechsten bis neunten Behandlungstag waren alle Warzen abgeflacht, drei von ihnen verschwanden gleichzeitig am elften Tag, zwei in der zweiten bzw. vierten Wochen nach der Behandlung, die letzte war zumindest 12 Wochen nach der Behandlung noch vorhanden.
Beispiel 4: Klinische Prüfung von Trimer und Tetramer C
(A2'p5' (A2'p5' )nAp, n = 1 bzw. 2)
Patientin P., Alter 12 Jahre. Diagnose: scharfkantige Kondylome
Befund: unterhalb des Kinns acht dünnhalsige Kondylome (2 - 3 mm, Gesamtfläche etwa 2 cm2), sowie ein flaches Kondylom (Durchmesser ca. 3 mm). Alle Kondylome sichtlich dunkler als die umgebende Haut. Behandlung: Die Kondylome wurden täglich mit einer wäßrigen Lösung (5.10*5 M) von Trimer C befeuchtet. Am sechsten bis siebten Tag begannen alle Kondylome zu schrumpfen und verschwanden am 12. bis 14. Tag vollständig ohne sichtbare Spuren zu hinterlassen. Die flache Warze war selbst acht Wochen nach der zweiwöchigen Behandlung noch vorhanden.
Patient 0., Alter 27: Diagnose: gewöhnliche Warzen.
Befund: drei gelb-braune weiche Warzen (Durchmesser 2 - 3 mm, Höhe 1 - 1,5 mm) auf der linken Wange. Behandlung: Die Warzen wurden täglich mit je 50 μl einer Tetramer C-Lösung (10"* M) behandelt. Am vierten bis achten Tag begannen die Warzen zu schrumpfen und verschwanden am 10. bis 12. Behandlungstag vollständig. Spuren auf der Haut, negative Reaktionen oder Rückfälle während der Be¬ handlung und zehn Wochen danach wurden nicht beobachtet.

Claims

Patentanspruch
Verwendung von 2' ,5'-01igoadenylaten der Formel
als Einzelverbindungen oder als ihre Gemische, worin Wx immer OH bedeutet, bei B R2 OH und R3 PO* -"2" oder R2 P04 "2 und R3 OH bedeuten, bei C R2 = R3 - OH; n größer oder gleich 1 ist und insbesondere 1 bis 5, vorzugsweise 1 oder 2 bedeutet, jede Verbindung vom Typ B ein Gemisch von zwei Isomeren darstellt, worin R2 = OH und R3 = H2P04 oder R2 = H2P04 und R3 = OH, wobei inbesondere das Gemisch B Adeno- sin-2' (3' )-monophosphat und Einzeloligomere vom Typ B mit n gleich 1, 2, 3 oder mehr in einem molaren Verhältnis von zum Beispiel 50-70:20-50:8-15:2-7:~2 enthält, bei Verbin¬ dungen vom Typ C R2 = R3 und OH bedeutet, und das Gemisch C Adenosin und Einzeloligomere mit n gleich 1, 2, 3 oder mehr in einem molaren Verhältnis von z.B.
50-70:20-50:8-15:2-7:~2 enthält, zur Behandlung von vira- len, durch Papillomaviren verursachten Erkrankungen der Haut und von Schleimhautgeweben durch örtliche Anwendung.
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