EP0666917A1 - Promoteur de m. paratuberculosis et son utilisation pour l'expression de sequences immunogenes - Google Patents

Promoteur de m. paratuberculosis et son utilisation pour l'expression de sequences immunogenes

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EP0666917A1
EP0666917A1 EP92922721A EP92922721A EP0666917A1 EP 0666917 A1 EP0666917 A1 EP 0666917A1 EP 92922721 A EP92922721 A EP 92922721A EP 92922721 A EP92922721 A EP 92922721A EP 0666917 A1 EP0666917 A1 EP 0666917A1
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EP
European Patent Office
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sequence
ggc
nucleotide sequence
recombinant
nucleic acid
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Ceased
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EP92922721A
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German (de)
English (en)
Inventor
Alan Murray
Marina Gheorghiu
Brigitte Gicquel
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Institut Pasteur de Lille
Massey University
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
Massey University
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Filing date
Publication date
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    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the subject of the invention is a nucleotide sequence making it possible to clone or express nucleotide sequences in a determined cell host.
  • a nucleotide sequence of the invention can be obtained from Mycobacterium paratuberculosis.
  • BCG Bacillus Calmette et Guerin
  • Mycobacterium bovis an avirulent strain of Mycobacterium bovis widely used in the context of vaccination against tuberculosis worldwide. Its biological characteristics make it an interesting candidate for the development of recombinant vaccines.
  • the cell wall functions as a very effective adjuvant and a single inoculation can trigger long-lasting immunity. Serious side effects from this bacillus are rare even with repeated immunizations.
  • T cells interact with macrophages with mycobacterial antigens in association with the products of the major histocompatibility complex (abbreviation MHC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • Clones of sensitized T cells proliferate and produce lympho ines which in turn activate macrophages to nonspecifically eliminate bacilli.
  • helper T cells induce the proliferation of B cell clones leading to the production of antibodies. Attempts have already been made to carry out the cloning and expression of heterologous genes in BCG, in particular by using the knowledge available on replicative or integrative vectors.
  • gag protein of HIV-1 has been cloned in the form of a fusion polypeptide with the ⁇ antigen, this antigen being one of the major proteins exported by mycobacteria, in particular BCG or Mycobacterium Kansasii and genes of Antibiotic resistance has been expressed under the control of their own regulatory region.
  • mycobacteria in particular BCG or Mycobacterium Kansasii
  • genes of Antibiotic resistance has been expressed under the control of their own regulatory region.
  • the inventors In order to optimize the expression of heterologous antigens in BCG recombinants, the inventors have directed their research towards the characterization of gene regulatory units, which are functional in mycobacteria.
  • the inventors have thus described the isolation and characterization from Mycobacterium paratuberculosis of nucleotide sequences allowing the expression of nucleic acids given in mycobacteria or in other cellular hosts.
  • nucleic acid is intended to mean any nucleotide sequence capable of being cloned and / or expressed, whatever its composition, its length, or its origin (obtained by extraction or synthetic).
  • M. paratuberculosis also referred to hereinafter by Mptb
  • Green et al Nucleic Acids Research Vol. 17 (22) 1989, pages 9063-9072
  • this insert contains an open reading phase, called ORF1197 coding for a protein of 399 amino acids.
  • the inventors sought sequences specific for the species Mycobacterium paratuberculosis, by screening a genomic library lambda gtll by performing hybridization tests with the DNA of strains of other mycobacteria in particular of M. phlei described in Murray A et al New Zeland, Veterinary Journal 37: 47-50. On this occasion, they were interested in a specific DNA sequence, which contained a fragment adjacent to the element IS900 described by Green et al.
  • a nucleotide sequence according to the invention which can be used for the cloning and / or the expression of a nucleic acid is characterized in that it comprises a sequence (I), chosen from: a) the sequence represented in FIG. 2 or any part of this sequence capable of intervening in the expression of a nucleic acid which would be placed under its control, b) a sequence hybridizing with the sequence complementary to the sequence a) under conditions given below.
  • a part of the sequence I of interest in the context of the invention can be defined by carrying out a test such as the following: a determined part of the sequence I is cloned upstream of a vector for recognition of promoter and of signal translation, containing for example the gene for ⁇ - galactosidase, devoid of its promoter and its first eight amino acids.
  • the conditions for carrying out the test can be established on the basis of the description corresponding to the constructions of FIGS. 7 to 9.
  • a part thus tested of the sequence I, of interest in the context of the invention leads to the synthesis of a protein having 9-galactosidase activity in different cellular hosts, for example actinomycetes.
  • a first particularly advantageous nucleotide sequence according to the invention which can be used for cloning and / or the expression of a nucleic acid is the sequence (II), characterized in that it comprises: a) the following nucleotide sequence or any part of this sequence containing in particular the site of initiation of transcription (position +1) and of the elements necessary for the recognition and the binding of the RNA polymerases of a determined cellular host which would be transformed by this sequence, these elements comprising in particular the sequences [TAC ACT] in position -10 relative to the transcription initiation site and [TC GAC A] in position -35 relative to this site: GAT CCC GTG ACA AGG CCG AAG AGC CCG CGA CCG TGC GGT CGT
  • a probe determined from the sequence with which one wishes to test the hybridization marked with 32 p (10 6 cpm / ml) which one puts in contact with the tested sequence for 16 hours at 65 "C in a hybridization solution (formamide 50%, 5 x SSPE, salmon sperm DNA 200 ⁇ g / ml and 10 x Denhart).
  • a hybridization solution formamide 50%, 5 x SSPE, salmon sperm DNA 200 ⁇ g / ml and 10 x Denhart.
  • the membranes on which the hybridization is carried out are then washed twice for 30 minutes with a solution ISSC, 0.1% SDS at room temperature (20 * C) then washed twice with 0.1SSC, 0.1% SDS for 30 minutes at 65 * C.
  • the nucleotide A marked +1 corresponds to a transcription initiation site determined within the framework of the invention and the nucleotide sequence upstream of this site comprises recognition and binding elements for RNA polymerases of cellular hosts (regions -35 and -10) in which the sequence is likely to be used as a promoter for the cloning or expression of specific nucleic acid sequences.
  • the -35 and -10 regions are located relative to the +1 site.
  • sequences I and II contain the minimum sequence necessary for the initiation of the transcription defined above as well as fragments upstream and downstream of this sequence, capable of playing a role in the regulation of the transcription and / or expression.
  • sequences comprise a sequence type sequence Shine Dalgarno [A AGG AG], involved in the binding of the ribosome.
  • nucleotide sequence capable of allowing the expression in a cellular host of a nucleotide sequence is according to the invention characterized in that it comprises a DNA sequence (III) chosen from: a) the following nucleotide sequence:
  • sequence designated under b) defined by its capacity for hybridization with I, II or III gives in each case the variants of the sequence of the invention which, while being modified at the level of one or more nucleotides, retain the properties of the sequences I, II or III of the invention in the transcription of a nucleic acid.
  • the modifications that may be introduced at the variant level are, for example, substitutions, insertions, deletions or inversions of nucleotides.
  • the nucleotide sequence comprising one of the sequences I, II or III or a variant of I, II or III, contains a nucleotide sequence which can function as a promoter for the expression of given nucleic acid sequences.
  • sequence containing the promoter when they contain sequence III.
  • sequence III can be implemented with a fragment of sequence I which is not necessarily adjacent to it in sequence I but which is capable of intervening with I for the expression of a given nucleic acid .
  • the above sequences can be obtained by extraction, purification from the DNA of M. paratuberculosis or by chemical synthesis.
  • any variant of a nucleotide sequence comprising the sequences I, II or III described above can be defined by the fact that it retains the functional properties of the sequences I, II or III and in particular their ability to fulfill the promoter functions during the transcription of nucleotide sequences within a given host.
  • nucleotide sequence I or of sequence II which surround sequence III can be deleted at least in part and optionally substituted.
  • sequence between the positions of nucleotides +2 and +41 with respect to the transcription initiation site can be replaced in whole or in part, by a sequence exogenous with respect to the sequence naturally present downstream of the sequence III in Mptb, this exogenous sequence comprising a Shine Dalgarno sequence capable of being recognized by the ribosome in a determined host.
  • this sequence between the positions +2 and +41 can be replaced by an exogenous sequence of bacterial origin, for example of E. coli comprising a sequence of Shine Dalgarno.
  • the invention also relates to the use of any part of the sequence I or II outside of the -35 and -10 regions or of the Shine Dalgarno (SD) sequence, capable of intervening in the transcription or the translation of a given nucleic acid.
  • SD Shine Dalgarno
  • the invention also relates to a recombinant nucleotide sequence, characterized in that it comprises a nucleotide sequence as defined above and at least one nucleic acid sequence, the cloning and / or expression of which is desired in a host determined cell, under the control of this promoter.
  • This sequence can be a sequence coding for a peptide of Mptb, or a heterologous sequence coding for a peptide or a polypeptide of different origin.
  • a nucleic acid sequence is considered to be a heterologous sequence, since it does not correspond to the sequence naturally adjacent to sequences I or II in Mptb, part of this naturally adjacent sequence corresponding to the sequence of 716 bp represented at Figure 2.
  • the means of the invention can therefore be used for the expression in a cellular host different from Mptb, of a nucleic acid sequence coding for a peptide or a polypeptide of Mptb, under the control of the nucleotide sequence of the invention.
  • the recombinant sequence can be used both to clone a coding sequence in a determined host for example in a bacterium such as E. coli and then to transfer this sequence to express it in a different host for example in an Actinomycete and in particular in a mycobacterial strain, in particular a BCG strain.
  • the invention can be implemented to clone or express any type of nucleic acid sequences and in particular sequences coding for peptides, polypeptides or proteins (this group can be designated by the expression polypeptide) having an antigenic character.
  • the subject of the invention is, for example, a particular recombinant sequence corresponding to the preceding definition, characterized in that at least one nucleic acid sequence placed under the control of a nucleotide sequence of the invention I, II or II defined above, code for a peptide or a polypeptide which is immunogenic or capable of being made immunogenic.
  • a nucleic acid sequence to be expressed, incorporated into the recombinant sequence of the invention can be a sequence characteristic of a pathogenic organism.
  • Pathogens are for example viruses, parasites, bacteria.
  • M. leprae M. tuberculosis
  • M. intracellulare M. africanum, M.
  • avium the sporozoites and the erozoites of plasmodium, the bacilli responsible for diphtheria, tetanus, Leishmania, Salmonella, certain treponemes, the toxin pertussis and other pathogenic and viral microorganisms including the mumps virus, rubella, herpes, influenza, Schistosoma, Shigella, Neisseria, Borrelia, rabies virus, the polio, hepatitis, AIDS HIV, HTLV-I, HTLV-II and
  • the nucleic acid sequence to be expressed can also code for an immunogenic sequence, for example of snake or insect venom.
  • the recombinant nucleotide sequence can thus contain, under the control of the same nucleotide sequence of the invention, several coding sequences of antigens, where appropriate characteristic of different organisms.
  • the invention relates to a recombinant sequence characterized in that the nucleic acid sequence to be expressed codes for a peptide or a polypeptide of an HIV retrovirus, for example a peptide or an envelope polypeptide, or a peptide or a Nef, HIV-1 or HIV-2 protein polypeptide.
  • nucleic acid sequences can be used in the context of carrying out the invention and examples of antigens or immunogenic sequences of mycobacteria, in particular the proteins or fragments of the proteins corresponding to genes involved in virulence and antigens with protective potential.
  • An antigen is said to have "protective potential” if it is capable of triggering or promoting a protective immune response in particular by the production of antibodies or by induction of an immune response of cell type, in particular of CTL type.
  • haptens or epitopes may be associated with a sequence coding for an antigen or in general a polypeptide which can be used as a carrier protein, in particular for expression on the surface of a cellular host, or even the secretion of the hapten or epitopes.
  • association is meant either the formation of a hybrid coding sequence between the different sequences present in the recombinant sequence or an association in the form of coding elements of an operon, the different coding sequences retaining in this case their individuality during the expression in a cell host is the formation of a fusion protein resulting from the expression of a fusion gene.
  • nucleotide sequence I, II or III of the invention can be placed either upstream of the nucleotide sequence to be expressed and in phase with this sequence, or downstream of the nucleic acid sequence to be expressed.
  • the choice of its relative position with respect to the coding sequence can be determined as a function of the level of expression sought in a determined host.
  • nucleotide sequence according to the invention and the nucleic acid sequence (s) to be expressed can therefore constitute a fusion operon.
  • nucleic acids are present, they are expressed under the control of the sequence but in the form of an individualized product.
  • the nucleotide sequence I, II or III and the nucleic acid sequence (s) to be expressed constitute a fusion gene.
  • the expression product of this gene consists of a hybrid protein or fusion protein when several nucleic acids are used.
  • the invention relates generally to the use of a nucleotide sequence according to the preceding description for the cloning and / or expression of nucleic acid sequences, in a cellular host different from Mptb, in particular in Actinomycetes and in particular Mycobacteria and in particular in M. bovis for example in the avirulent strain BCG, in Grain-negative bacteria such as E.coli or in Gram-positive bacteria such as B. subtilis.
  • a cloning and / or expression vector of integrative type or of replicative type, characterized in that it comprises, at a site which is not essential respectively for its integration or for its replication.
  • a nucleotide sequence comprising the sequences I, II or III or their variants, according to the preceding definitions.
  • vectors are therefore either capable of replicating extrachromosomally or on the contrary in the form of elements integrated within a chromosome or more generally within an element of the genome of a host to which they have incorporated, including in a plasmid or a bacteriophage present in this host.
  • a vector according to the invention can also be characterized in that it is modified at a site which is not essential respectively for its integration or for its replication, by a recombinant nucleotide sequence described above.
  • a particular vector comprises, in addition to the promoter and a heterologous sequence, at least a part of the sequence designated by ORF2 of Mptb (FIG. 10).
  • This sequence is advantageously placed downstream of the sequence containing the promoter, preferably between the promoter and the heterologous nucleic sequence.
  • this part of ORF2 corresponds to a sequence of 716 bp of Mptb as described in FIG. 2.
  • plasmids which are satisfactory for carrying out the invention
  • plasmids which are satisfactory for carrying out the invention
  • a plasmid of interest where appropriate as an intermediate plasmid for carrying out the invention is an E.coli strain (Myc758) containing the fragment of 716pb (Pstl / BamHI) cloned in the vector pUCl ⁇ , deposited in the Collection Nationale des Microorganismes in Paris, France, under the number 1-1157 on October 23, 1991.
  • This plasmid comprises in particular the promoter of the invention corresponding to sequence II, delimited by the EcoRI / B III restriction sites (pan promoter) as well as a binding sequence (linker).
  • vectors examples include the plasmids derived from pAL5000 (Ranzier et al, 1988, Gene 71: 315-321), RSF1010 (Hermans et al, 1991, Mol. Microbiol. 5_: 1561-1566), pNG2 (Radford et al, 1991, Plasmid 25: 149-153), transposons derived from Tn610 and IS6100 (Martin et al, 1990, Nature 345: 739-743), IS900 (Green et al, Mol. Microbiol.), IS901 (Kunze et al, 1991, Mol. Microbiol. 5: 2265-2272), IS6110 (Gold et al, Nucl.
  • nucleotide sequences can be incorporated or present on the vector of the invention; they may be, for example, expression markers and in this regard reference may be made to genes for resistance to antibiotics such as kanamycin or viomycin.
  • Other regulatory elements may be sequences involved in the expression of the coding sequence and in particular operator-type sequences or else elements capable of promoting export, exposure at the level of the host membrane. , excretion or secretion of the expression product of the heterologous sequence.
  • the invention also relates to a recombinant cellular host characterized in that it is transformed by a recombinant nucleotide sequence described above or by a vector described above, under conditions allowing the expression of the sequence (s) (s) of nucleic acid (s) to be expressed contained in the recombinant sequence or in the vector.
  • a particularly advantageous cellular host for carrying out the invention is a host which allows exposure to its surface, or even the excretion or secretion of the expression product of the nucleic acid sequence (s) ( s) to express that it contains or its synthesis under conditions of intracytoplasmic localization.
  • Particular hosts are, for example, the strains of Actinomycetes, preferably avirulent strains such as, for example, the avirulent strain BCG from INSTITUT PASTEUR n * 1173P2 used to constitute the vaccine marketed under the name "BCG Pasteur Mérieux Vaccine”.
  • avirulent strains such as, for example, the avirulent strain BCG from INSTITUT PASTEUR n * 1173P2 used to constitute the vaccine marketed under the name "BCG Pasteur Mérieux Vaccine”.
  • the sequence containing the specific promoter of Mptb is capable of functioning in strains other than Actinomycetes and for example can function in a gram-negative bacterium such as E. coli.
  • This sequence is also likely to be used in gram-positive bacteria such as B. subtilis or in Streptomyces.
  • a suitable method for the preparation of recombinant cellular hosts according to the invention is for example electroporation, in accordance with the description of Snapper S. et al (1988, PNAS USA 85: 6985-6991) or the conjugation according to for example the technique by Lazraq R. et al (1990, FEMS Microbiol. Lett. 69: 135-138).
  • the invention provides an immunogenic composition characterized in that it comprises a cellular host recombinant meeting the above criteria, in sufficient quantity to trigger the production of antibodies, or contribute to the production of preferably protective antibodies in an animal or human host to which it is administered.
  • This immunogenic composition can be used for the triggering of a protective response against a determined pathogenic agent, by the production of antibodies, and the induction of an immune response of cell type, as soon as the expression product of the nucleic acid sequence expressed under the control of sequences I, II or III is under conditions making it possible to trigger this production.
  • the immunogenic composition can also be used as a booster composition to stimulate the production of antibodies initiated by a protein or another constituent.
  • the response elicited following administration of the immunogenic composition may be cell type; it may in particular be a CTL type sequence.
  • the invention therefore also makes it possible to prepare vaccines of the mixed vaccine type, in which the production of antibodies will be directed both against the cell host and in particular against the bacillus BCG and against the expression product of the sequence of nucleic acid to be expressed.
  • composition comprising a recombinant cellular host according to the invention can be used to carry out immunotherapy.
  • Such a vaccine or composition for immunotherapy can be used in animals or in humans and administered by the intradermal, subcutaneous, oral, aerosol or percutaneous route. Several administrations may be necessary, for example in the form of a reminder, to obtain sufficient protection.
  • a recombinant cell host according to the invention can also be used to produce any protein or peptide in particular on an industrial scale.
  • the invention can thus be used for the production of antibiotics.
  • FIG. 1 Schematic description of the construction of pAM320
  • Mptb DNA is shown in gray with a double line and the lacZ gene with a double line.
  • pAM3 was digested with BamHI / PstI giving rise to a fragment of 716 bp which was recovered on a gel 1% agarose using the Geneclean system. The fragment was ligated to plasmid pNM482 digested with BamHI / PstI, to produce pAM310.
  • Competent E.coli MC1061 strains were transformed with the ligation product and the cells were spread on a Luria-Broth (LB) medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin.
  • the clones carrying the recombinant plasmid pAM310 were recovered by checking the restriction map of the plasmid.
  • the 3.8 kb fragment obtained from pAM310 by digestion with the Smal / Dral enzymes was eluted on 0.8% agarose gel and ligated with its blunt ends to the Seal site of pRR3 to produce pAM320.
  • the Ap R gene ampicillin resistance gene
  • the E.coli MC1061 cells were transformed and the colonies were selected by the Km R Ap s phenotype.
  • the DNA of these recombinants was prepared by alkaline lysis and used to transform M. smegmatis mc 2 155 (Snapper et al, 1990, Molec. Microbiol. 4_: 1911-1919) by electroporation.
  • Figure 2 Nucleotide sequence of the 716 bp BamHI / PstI fragment obtained from p ⁇ M3 and the 185 N-terminal amino acids of orf2
  • FIG. 3 ELZS ⁇ on mouse sera collected 40 days after iv (intravenous) inoculation
  • mice Balb / C mice were immunized iv with 10 7 CFU of r-BCG transformed with pAM320, or with BCG strain 1137P2. Several non-immunized mice were used as a control. The sera were collected 40 days after immunization and tested. Anti-£ -galactosidase antibodies were detected by the ELISA method (Engval E. and Perlman P, 1971, Immunochemistry 8_Î 871-874). The microtiter plates were covered with 1 ⁇ g of 9-galactosidase per well. Anti-3-galactosidase antibodies were detected with goat anti-mouse immunoglobulin antibodies labeled with alkaline phosphate (Biosis). Each value corresponds to a pool of sera from four or five mice.
  • Figure 4 Proliferative response of the lymph node cells of a Balb / C mouse immunized subcutaneously with 10 7 CFU or BC ⁇ + p ⁇ M3
  • mice A group of immunized mice was inoculated with 0.1 ml of IFA. Two weeks later, the proliferative responses of LN cells (lymph node cells) to 0-galactosidase, APH3 •, PPD and ConA were tested.
  • mice immunized with BCG 1173P2 b) mice immunized with r-BCG (+ pAM320) after stimulation with 1 ⁇ g / ml 8-gal (o), 10 ⁇ g / ml PPD (o), 2.5 ⁇ g / ml con A ( ⁇ )
  • Reaction volume 50 ⁇ l containing 10 ⁇ M of primers, 10 nmol of dNTP, the target DNA of pAM3.
  • Figure 8 Cloning of the PCR product in MC8 from pSL 1180
  • the product obtained by PCR was digested with Xbal / Ndel and ligated to pSL 1180 (Pharmacia) digested with Xpal / Ndel to give pWR30.
  • Figure 9a and 9b Schematic description of the construction of pWR31, pWR32 and p R33
  • PCR gene amplification
  • This fragment contained the pam promoter with the Xbal and EcoRI sites at the 5 'end and the BglII and NdeI sites at the 3' end.
  • the fragment was digested with Xbal and Ndel and cloned into the multiple site (MCS) of pSL11 ⁇ O to form the plasmid pWR30.
  • MCS multiple site
  • the resulting plasmid pIPJN thus possessed a functional gene for £ -galactosidase under the control of the pi lambda promoter.
  • pWR30 In order to clone pan into pIpJN digestion with EcoRI / BglII was made on pWR30. The 159 bp fragment was purified with Geneclean and cloned into pIpJN digested with EcoRI / BglII to give pWR31. When the E. coli strains were transformed with this plasmid and cultured in the presence of ampicillin and X-gal, blue colonies were formed. The fusion operon was then recovered from pWR31 by digestion with EcoRI / Dral.
  • the EcoRI site was completed with the Klenow enzyme and dNTPs and then ligated to the plasmid pRR3 digested with the enzyme Seal.
  • the two orientations of the operon in pRR3 have been obtained.
  • the transformation of E.coli and M. smegmatis with these two constructions allowed the formation of blue colonies when the bacteria were cultivated in the presence of chromogenic substrate of X-gal.
  • Figure 11 antibody response from serum of animals immunized with r-BCG expressing ⁇ -galactosidase.
  • FIG. 12 Construction of the plasmids containing the pAN-ORF2-Nef (SIV) fusions.
  • the plasmid pTG3148 is a vector derived from pTG959 (Guy et al, 1987, Nature 3_3j0: 266-269) where a BglII fragment containing the nef gene has been cloned. This fragment was isolated from monkey cells containing the SIV virus (mac251) integrated as a provirus.
  • the plasmid pBlue / pAM712 is derived from pBluescriptIISK + (Stratagene) where the BamHI / PstI fragment containing pAN-ORF2 and excised from pAM1 was cloned between the BamHI and PstI sites of the polylinker.
  • FIG. 13 Western type analysis of the expression of the ORF2-Nef (SIV) polypeptide. Molecular weight markers are indicated to the left of line 1; Line 1: Baculovirus extract containing the protein Nef (SIV); Line 2: BCG extract; Lanes 3 and 4: Two extracts of recombinant BCG carrying the plasmid pSN25; Lanes 5 and 6: Two extracts of recombinant BCG carrying the plasmid pSN26.
  • Line 1 Baculovirus extract containing the protein Nef (SIV)
  • Line 2 BCG extract
  • Lanes 3 and 4 Two extracts of recombinant BCG carrying the plasmid pSN25
  • Lanes 5 and 6 Two extracts of recombinant BCG carrying the plasmid pSN26.
  • Figure 14 Analysis of the proliferative responses of cells taken from the lymph nodes of BALB / c mice inoculated with recombinant BCG carrying the plasmid pSN25.
  • the immunization protocols are the same as those described at the Cold Spring Harbor conference (Vaccine, September 1991) and repeated in Winter et al, 1991 (Gene 109: 47-54).
  • the proliferation was measured after stimulation in vitro with the different peptides indicated on the ordinate in FIG. 3 according to their location on the protein (from N to C-terminal). Three concentrations of peptides were used (0.1 / 1 and 10 ⁇ g / ml). Maximum proliferation was observed for one or other of these concentrations depending on the peptides.
  • FIG. 15 Plasmid pTG5167. It is a derivative of pTG186 poly (Guy et al, 1987) where a BglII-EcoRI fragment carrying the gene coding for the GP160 protein of HIV1 / MN has been cloned in the polylinker.
  • Figure 16 Construction of plasmids pLA12 and pLA13 carrying the pAN-0RF2-Env fusion (HIV1 / MN).
  • Figure 17 Expression of the ORF2-Env polypeptide (HIV1 / MN) by BCG carrying the plasmids pLA12 and pLA13.
  • the gpl20 protein of HIV1-LAI is used to induce the proliferation of ganglion cells which have been in contact with the fusion protein ORF2-V3 region produced by the recombinant BCG.
  • FIG. 19 Levels of anti-V3 peptide antibodies measured by ELISA tests. 5 mice receive an intravenous injection of a vaccine preparation which contains 5 ⁇ 10 6 cfu of BCG transformed with pLA12; 5 others receive the same amount of recombinant pLA13 BCG; 5 mice receive a similar amount of recombinant BCG which expresses the lacZ gene but not the ORF2-env 'gene;"naive" mice do not receive an injection. Blood samples are taken after 14 days, then every 2 weeks in order to measure the development of the level of antibodies specific for the fusion protein ORF2-env *.
  • Figure 20 Plasmid pTG2103. It is a derivative of pTG959 (Guy et al, 1987) or a BglII / EcoRI fragment carrying the gene coding for the P24 protein of HIV1 / LAI has been cloned in the polylinker.
  • Figure 21 Construction of plasmids pLA22 and pLA23 carrying the pAN-ORF2-gag fusion (HIVl / LAI)
  • Figure 22 Expression of the ORF2-Gag polypeptide (HIV1 / LAI) by BCG. MATERIALS AND METHODS
  • Bacterial strains, phages, plasmids and culture media Bacterial strains, phages, plasmids and culture media
  • BCG bovis BCG
  • BCG Bacillary infection and tuberculosis in humans and animals. Infection and defense process. Biological and experimental study. Preventive vaccination. Ed Masson, Paris, 1928) was used as a host for the construction of various BCG recombinants (r-BCG). Other bacteria, phages and plasmids used in the experiments reported below are described in Table I.
  • the BCG was cultivated until the formation of veils on a Sauton medium (Sauton B., Reports of the Academy of Sciences 1912: 155-1860 in Calmette A. et al. Preventive vaccination with BCG p 811 - Ed.
  • Masson 1928 to carry out a classic vaccination preparation or in the form of a dispersed culture.
  • the bacterial r-BCG clones were first cultured on a Lowenstein-Jensen medium (Jensen K., Towards a standard of laboratory methods, 4 th Rep. Subcomm laboratory methods. Bull Union Internat, against Tuberc, 1957, 2_7: 146-166) containing 10 ⁇ g / ml of kanamycin, then transferred to Sauton medium. These cultures have been used for in vitro expression analyzes and for animal immunization.
  • the M. smegmatis and E. coli strains were cultivated according to the method described by Ranes et al (1990) J. Bact. 172 .: 2793-2797.
  • DNA preparation of M. paratuberculosis 50 mg of lyophilized M. paratuberculosis strains (Murray A. et al, NZ Vet Journal cited above) were resuspended in a homogenization buffer (0.1M NaCl, 0.03M Tris-HCCL, pH 7.5, 0.006M EDTA ), mixed with 2 ml of glass beads (diameter 0.45-0.5 mm) and stirred in a Braun rotary homogenizer at maximum speed for 2 minutes at 4 "C. After centrifugation and phenol extraction / chlorophorme, the DNA was precipitated with 95% ethanol and treated with 0.1 mg / ml of DNAse without RNAse. After another extraction with phenol / chlorophorme, and ethanol precipitation, the DNA was resuspended in water (A260 / 280 ratio 1.8).
  • the method used was based on the protocols described by Young et al (Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 8J2: 2583-2587) modified by Murray et al (NZ Vet. J. (1989) 37: 47-50 ).
  • the library contained 2.2 ⁇ 10 5 recombinant bacteriophages. After amplification in E.coli Y1090, the recombinants represented approximately 85% and corresponded to a titer of 3.10 11 PFU / ml.
  • the library was screened by differential hybridization of the DNA obtained by membrane transfer from the petri dishes containing the lysis phages (Young et al supra) using the full chromosic DNA of M. paratuberculosis (Mptb) and M. phlei as probes.
  • Mptb M. paratuberculosis
  • M. phlei M. paratuberculosis
  • the DNA fragments were separated on 0.8% or 1% agarose gels containing 0.5% ethidium bromide.
  • the DNA was eluted from the gels and purified using the Geneclean II kit (BiolOl Inc. La Jolla) according to the manufacturer's instructions.
  • RNA preparation was performed using the computer programs described by Staden et al (Nucleic Acids Res. (1986) 14: 217-231).
  • a culture of 100 ml of M. smegmatis MYC760 strains was cultivated until the mid-log phase in 7H9 medium, supplemented with ADC Middlebrook enrichment (Difco) plus 25 ⁇ g / ml of kanamycin at 37 ⁇ C. cells were collected after centrifugation, washed with the same fresh growth medium and resuspended in a medium containing 1% (w / v) of sodium triisopropylnaphthalene sulphonate, and 6% (w / v) of sodium 4-amino salycilate. 14 g of glass beads (4.5-5.5 mm) were added, the mixture was stirred vigorously in a vortex apparatus for two times 2 minutes.
  • the supernatant was extracted twice with phenol / chlorophorme and the nucleic acids inside the aqueous phase were precipitated with propan-2-ol, in the presence of 0.3 M sodium acetate at pH 6. After centrifugation for 10 minutes at 8000 rpm, the centrifugation pellet was washed with 100% ethanol, dried at room temperature for 10 minutes, and resuspended in 1 ml of distilled water treated with DEPC. The RNA was precipitated in the presence of three volumes of 4 M sodium acetate (pH 6) at -20 ° C for 18 hours, collected by centrifugation and resuspended in distilled water (optical density DO 260/280 2 , 0). The RNA was stored at -20 ⁇ C in the form of a propan-2-ol precipitate.
  • Plasmid pAM311 was linearized with BssHII to produce 5 'extensions, and dephosphorylated with alkaline phosphatase from calf intestine. After purification of the plasmid with the Geneclean kit, the DNA was cut with the restriction enzyme PstI and the 3.1 kb fragment was isolated from the 1% agarose gel. The 5 * hydroxyl end was radiolabelled with ATP (gama 32 P) (specific activity 3000 Ci / nmol) using the polynucleotide kinase (10 units). The unincorporated marker was removed by. passage through a Nick column (Pharmacia).
  • RNA (40 ⁇ g) and the radiolabelled DNA probe (0.1 ⁇ g) were mixed in a total volume of 30 ⁇ l of distilled water, 240 ⁇ l of deionized formamide were added and the mixture was heated to 100 * C for 3 minutes. After rapid cooling on ice, 30 ⁇ l of 10 ⁇ hybridization buffer (0.2 M PIPES-NaOH, pH 6.4, 4M NaCl, 20 mM EDTA) were added and the incubation was continued at 60 ° C. for 3 hours The DNA / RNA hybrids were precipitated with three volumes of ethanol at -20 ° C for 16 hours.
  • 10 ⁇ hybridization buffer 0.2 M PIPES-NaOH, pH 6.4, 4M NaCl, 20 mM EDTA
  • nucleic acid pellet was resuspended in 100 ⁇ l of buffer containing 50 mM sodium acetate at pH 4.6, 280 mM NaCl of 5 mM ZnCl 2 and 20 ⁇ g per ml of denatured salmon sperm DNA. 2 ⁇ l of nuclease SI (472 units) were then added and digestion was continued for 30 minutes at 20 "C. The reaction was stopped by adding 25 ⁇ l of a solution containing CH 3 COONH 4 2.5 M and 50 mM EDTA at pH 8. The DNA / RNA hybrids precipitated with propan-2-ol in the presence of 1 ⁇ g of carrier DNA (denatured salmon sperm DNA).
  • Murine sera were tested by ELISA to detect specific antibodies against 9-galactosidase according to the following technique: 96-well microtiter plates (Nunc) were covered with 10 ⁇ g / ml of purified 8-galactosidase in PBS buffer for 1 hour at 37 ° C and for 16 hours at 4 ° C. After washing three times with PBS containing 0.1% Tween 20, the sera pre-absorbed with BCG extracts for 16 hours at 4 ° C. were added to the wells in a dilution buffer (PBS + 0.1% Tween 20.1% BSA) for 2 hours at 37 "C.
  • a dilution buffer PBS + 0.1% Tween 20.1% BSA
  • the antibody titers were determined by photometry at 405 nm using an anti-mouse rabbit IgG conjugated with alkaline phosphatase (Biosys, Compiègne ) and 1 mg / ml of p-nitrophenyl phosphate as substrate.
  • the 8-galactosidase activity was measured in E.coli cells treated with toluene and in extracts of M. smegmatis subjected to an ultrasound treatment according to the description of Cossart et al (J. Bacteriol. (1985) 161 : 454-457).
  • mice 6 week old Balb / c female mice were obtained from Iffa Credo.
  • SC subcutaneously
  • CFU colony forming units
  • Lymph node cells were removed 14 days after immunization and proliferative responses were studied.
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • mice were inoculated intravenously (iv) with 5.10 6 CFU of BCG strains. Some mice were boosted intravenously, three times 21 days apart with 10 6 CFU; serum samples were taken 28 days after immunization and 14 days after each booster to titrate the antibodies.
  • the stability of the different strains of BCG was analyzed by determining the number of BCG CFUs recovered from the spleen two months after the inoculation (iv) of 10 7 CFUs of BCG.
  • LN inguinal lymph nodes
  • RPMI1690 Gibco
  • FCS fetal calf serum
  • the concentration of the antigens used was as follows: 0.01 ⁇ g / ml of APH3 'and 3-galactosidase and 10 ⁇ g / ml of a purified protein derivative (PPD).
  • PPD purified protein derivative
  • ConA concanavalin A
  • Some cell suspensions remained unstimulated; Each test was carried out in triplicate. The cultures were incubated for five days at 37 ° C, the last 22 hours in the presence of methyl tritiated thymidine (3H dThd lmCi 37KB2 Amersham) 0.4 uci / well in an atmosphere of humidified air containing 7% CO 2 .
  • the cells were then harvested on fiberglass filters (Automash 2000 Dynatch) and the incorporated radioactivity was measured. The results are expressed in terms of counts per minute (cpm) minus background noise. Standard errors of the mean for tripticate cultures were determined. The background noise values of the unstimulated control cultures were less than 10 4 cpm.
  • L3T4 (CD4 +) hybridoma GK 1-5 of anti-mouse CD4 + specific rat and LYT2 (CD8 +) (hybridoma H35 17-2 of anti-mouse CD8 + specific rat) were produced according to the method described by (Dialynas DP et al, 1984, J. of Immunology Tome 31, p 2445-2451). Briefly, to obtain ascites of monoclonal antibodies, nude mice were first inoculated with cells corresponding to 106 hybridomas. Antibodies were collected by precipitation in ammonium sulfate. The amount of protein was tested by optical density at 280 nm.
  • Interferon-gama synthesis was measured in the supernatant of LN cell cultures at the end of the proliferation test.
  • the level of interferon-gama was determined by an immunoenzymatic test in solid phase using the principle of the multiple sandwich (Genzyme).
  • the supernatant was diluted (1 / 2-1 / 10).
  • the standard interferon-gama was diluted to obtain values within the linear range of the test (128-8200 pg / ml).
  • a lambda gtll genomic library was constructed to isolate specific sequences for M. paratuberculosis (Mptb).
  • Mptb M. paratuberculosis
  • a recombinant phage which strongly hybridized with the chromosic DNA of Mptb but not with the DNA of M. phlei was taken up individually and used to prepare the stocks of phage lysates (Maniatis et al cited above).
  • One of these recombinants was randomly selected for further testing. Its genome contains an insertion of 3.8 kb.
  • Mycobacterial DNA was recovered from this fragment by digestion with the restriction enzymes EcoRI and BamHI. This led to the production of four fragments which were separated on an agarose gel.
  • pAM3 When pAM3 was labeled with the chemical probe kit (Promega) and used as a probe in a dot-blot test, hybridization occurred only with DNA extracted from M. paratuberculosis.
  • the plasmid pAM3 did not hybridize with M. avium serovar 2 and 3, M. intracellulare, M. tuberculosis strain H37Rv, M. bovis, M. phlei, M. smegmatis or N asteroids.
  • the nucleotide sequence of the 716 bp BamHI / PstI fragment is shown in FIG. 2.
  • Analysis of the sequence to search for consensus signals for the start of transcription and translation made it possible to show a potential region at -35 ( position 83-88) a region at -10 (position 106-111) and a Shine Dalgarno (SD) sequence at position 147-152.
  • a long open reading phase (ORF) designated by ORF2 follows the SD sequence with an ATG initiation codon at position 160.
  • Analysis of the nucleotide sequence of the fragment revealed homology with the insertion element IS900 M. paratuberculosis.
  • the segment 153-716 was identical to the sequence ntl451 to 888 of IS900 (Green et al (1989) Nucl. Acids. Res. 17: 9063-9073).
  • ORF2 is in the opposite direction to transcription of this element's potential transposase, orfll97.
  • the segment 1-152 is outside the sequence of IS900.
  • IS900 is used as a genomic probe for Southern blot tests of different Mptb isolates, almost identical multiple band patterns are obtained, regardless of the origin of the isolates (McFadden et al (1987) J. Clin. Microbiol. 25 : 796-801). This absence of polymorphism suggests that IS900 integrates predominantly at specific sites within the Mptb genome. A limited number of sequences adjacent to the IS900 termination have been reported, it appears to contain conserved nucleotide sequences (Green et al (1989) Nucl. Acids Res. 17: 9063-9073).
  • the Shine Dalgarno (SD) AAGGAG sequence shown in Figure 2 is adjacent to the IS element.
  • the reverse sequence complementary to this SD sequence (CTCCTT) is identical to the flanking sequence reported for IS900 contained in the clone pMB22 derived from the genomic library of the human isolate originating from a patient suffering from Crohn's disease of Mptb.
  • the starting site for the transcription of the orf2-lacZ fusion gene inside pAM320 was determined by high resolution mapping with nuclease SI. The experiments demonstrated that the starting site for the transcription of the sequence is located upstream of orf2 at position 119 (FIG. 4). A second start site is present outside the mycobacteria sequence. Two explanations can be found for this observation. First of all this may be due to hybridization of the probe with a small amount of shuttle plasmid which was co-precipitated during the preparation of the RNA, otherwise this may be due to the reading of the transcription results by the intermediate of the pRR3 picillin resistance gene.
  • pan promoter element which is adjacent to the IS900 element is capable of controlling the expression of orf2. This is the first demonstration of the induction of the expression of a gene located inside an insertion sequence, by means of an adjacent chromosomal promoter.
  • pan is functional in E.coli when it is present in a fusion operon with Lac-Z but it is not functional when it is present in a fusion gene with orf2.
  • pWR32 induced the same level of ⁇ -galactosidase activity in M. smegmatis as pAM320. However, the activity level with pWR33 was 10 times higher in E. coli. This must be due to the constitutive activity of a promoter upstream of the pAM-lacZ fusion gene.
  • mice were inoculated subcutaneously with BCG recombinants hosting the plasmid pAM320 expressing the APH3 'phosphotransferase under the control of its own regulatory region and lacZ under pan control.
  • the proliferative responses of the LN cells taken 14 days after the immunization were analyzed.
  • a specific response to in vitro stimulation with different antigens was observed ( Figure 4). Only the LN cells of mice immunized with r-BCG expressing lacZ and APH3 'proliferated in response to stimulation in vitro by j8-galactosidase and by aminoglycoside phosphotransferase (APH3 1 ).
  • CD4 + and CD8 + T cells have been shown to be involved in the proliferative responses described above by alternative inhibition of proliferation, with anti-CD4 + and anti-CD8 + monoclonal antibodies. The results appear in FIG. 5. A 70% inhibition of the specific response to ⁇ -galactosidase is observed after the addition of anti-CD4 antibodies to the cultures of LN cells. In similar experiments, a 30% inhibition was observed after addition of anti-CD8 antibodies to the cultures. These results show that the strongest response is obtained by the CD4 + T cell subgroup. Two different populations of CD4 + T cells participate in the regulation of the immune response in mice.
  • a subgroup of CD4 + T cells designated by THl produces interleukin-2 (IL2) and 1 * interferon-gama and preferentially activates macrophages to kill or to inhibit growth intracellular pathogen.
  • Another subset of CD4 + T cells designated by TH2 other product lymphokines including 1 "IL-4, IL-5, and is involved in the induction of humoral responses.
  • Significant production of interferon-gama was detected in the supernatant of LN cell cultures stimulated with specific antigens (Figure 6). These values were slightly lower than those obtained after stimulation with PPD or conA. However, they remain significant since the floor value of the standard curves was 100 pg / ml.
  • the production of interferon-gama by LN cells isolated from animals immunized with non-recombinant BCG was only observed after stimulation in vitro with PPD or ConA.
  • Blood was drawn four weeks after intravenous inoculation with the two strains of BCG and 14 days after each of the booster ivs.
  • the antibodies directed against jS-galactosidase were detected by an ELISA test from sera of animals immunized with r-BCG, expressing / 9-galactosidase (FIG. 3). An increase in the antibody response was observed after the various boosters. The results appear in FIG. 11. A significant increase in the level of antibodies is observed after the first and then the second booster. A third booster does not increase the level of antibodies.
  • the antibodies directed against ⁇ -galactosiase are detected in the sera of animals immunized with non-recombinant BCG.
  • the BCG bacilli were recovered from spleen homogenates two months after iv inoculation.
  • Table II shows that the different r-BCG clones used in this study have behavior similar to that of the non-recombinant BCG strain.
  • 7.410 5 CFU after culture in a medium in the absence of selection by kanamycin.
  • results presented here demonstrate that the r-BCG strains harboring plasmids coding for APH3 ′ under its own control region and the ⁇ -galactosidase under the control of pan can trigger cellular and humoral immune responses, specific for these antigens, in the mouse.
  • These polypeptide antigens are located in the cytoplasm of r-BCG.
  • r-BCG derivatives must multiply inside macrophages and present the peptides of 3-galactosidase in association with MHC molecules. This leads to recognition by T lymphocytes which respond by proliferating. LN cells showed strong proliferation in response to stimulation in vitro.
  • CD4 + and CD8 + T cells have been shown to be involved in the proliferative response with 70% CD4 + cells and 30% CD8 + cells.
  • infongama suggests an effective role for the TH1 cell subgroup. These cells are responsible for the activation of macrophages required for the elimination of intracellular pathogens.
  • the antibody titers found also suggest the cooperation of the T cell subgroup designated by TH2 which plays a role in the induction of humoral responses.
  • pGEM-2 Plasmid vector with a high number of Promega copies marketed pNM482 Vector for the detection of Minton and the promoter pRR3 Shuttle vector E. coli and mycobacterium pAM-3 Recombinant pGEM-2 containing a Described in the text fragment EcoRI / BamHI of 1.6 kb of Mptq pAM310 Recombinant pNM482 containing a Described in the text fragment BamHI / PstI of 716 bp of pAM-3 pAM320 Recombinant pRR3 containing a Described in the text fragment Dral / Smal of 3.8 kb of pAM310 pAM311 Recombinant pUC t ⁇ containing a Described in the text BamHI / PstI fragment of 716 bp of pAM-3 pAM312 Recombinant pUC 18 containing a Described in the text fragment EcoRI / Bam
  • pSL 1180 Derivative of pUC 1 ⁇ Pharmacia pWR30 Recombinant pSL 1180 containing Describes in the text the PCR digestion product of Xbal / Ndel (168 bp) pTGT 959 Plasmid containing the lambda Transgene PL promoter pIpJNI Recombinant pNM482 containing the Described in the text fragment Xhol / BamHI of pTG 959 pWR31 Recombinant pIpJN containing the Described in the text EcoRI / Blqll fragment of pWR30 (159 Bp) pWR32 + pWR33 Recombinant pRR3 containing the Described in the text fragment EcoRI / Dral (3.8 kb) of pWR31 in the 2 orientations
  • the PAN promoter associated with the open reading phase ORF2 was used to express several viral antigens in BCG. Immune responses directed against these viral antigens have been observed after inoculation in mice of the BCG strains expressing them.
  • the entire SIV nef gene was inserted at the PstI site of ORF2. To do this, a fragment containing the SIV nef gene was synthesized in vitro by PCR. Two oligonucleotides SN1 (5'CCCCTGCAGAGATCTATGGGTGGA-GCTATT3 ') and SN2 (5'AAAAAGCTrraAGC ⁇ iT rTCTAACTT3 •) were synthesized by the company APPLIGENE. They were used to amplify the SIV nef gene from the plasmid pTG3148 carrying it and originating from TRANSGENE (FIG. 12). The amplified fragment carries the PstI and HindIII restriction sites.
  • the recombinant plasmid carrying SIV nef was called pSN24.
  • the Xbal / HindIII fragment carrying the SIV nef gene was cut with the enzymes Xbal and HindIII, the ends were filled in with Klenow enzymes and the resulting fragment was cloned into the Scal site of pRR3, in the two directions.
  • the resulting plasmids were called pSN25 and pSN26.
  • Plasmids pSN25 and pSN26 were transferred to M.smegmatis and BCG by electroporation.
  • the ORF2-Nef fusion polypeptide is identified by western blot using sera from monkeys infected with SIV. (figure 13). After inoculation of mice with BCG expressing ORF2-Nef (SIV), a cell-type immune response directed against Nef (SIV) was observed using tests of proliferation of lymph node cells after stimulation with Nef peptides (SIV) .
  • the peptides come from the ANRS.
  • peptides 1-15; 16-30; 40-60 and 221-235 for which the numbers correspond to the location of the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid on the entire Nef protein.
  • the amplitude of the responses obtained with the different peptides is indicated in FIG. 14. It is likely that these are T (CD4) and T (CD8) lymphocytes as we had previously shown for Nef of HIV1.
  • cloning was carried out in a similar way to cloning the nave of SIV.
  • the gene fragment coding for the polypeptide of amino acid 242 to 335 of the protein GP120 was synthesized in vitro by PCR.
  • the amplified fragment carries the PstI and HindIII restriction sites.
  • the resulting plasmid was called pLAll. It contains an ORF2-env gene fusion containing the 554 bp corresponding to the N-terminal part of ORF2 and the 686 bp corresponding to the N-terminal part of the env gene.
  • the PAN-ORF2-env fusion was excised from pLAll by a double cleavage with the enzymes BamHI and HindIII. The ends of the fragment were filled with Klenow polymerase.
  • the resulting fragment was cloned into pRR3 at the Seal site, giving rise to the plasmids pLA12 and pLA13 according to the orientation of the insert.
  • the plasmids pLA12 and pLA13 were introduced by electroporation into M.smegmatis and into BCG.
  • the expression of the ORF2-Env fusion was detected using western blot using the monoclonal antibody SC-D (K24-1) of HYBRIDOLAB. As shown in FIG. 17, an expression of fusion polypeptide of the expected molecular weight (45.5 kDa) is observed.
  • mice were inoculated with BCG expressing the ORF2-Env fusion. Fifteen days after inoculation, an in vitro proliferative response of the lymph node cells was observed after stimulation with the GP120 protein ( Figure 18). It is likely that these are also T (CD4) and T (CD8) lymphocytes. Other mice were inoculated IV, and a booster was given after 28 days. Blood was drawn at different times after injection. Fifteen days after the booster, a high antibody level was detected by ELISA test, using the GP120 protein or peptides corresponding to the part of Env expressed by the BCG ( Figure 19).
  • the part of the gag gene coding for the protein P24 (the first 217 amino acids) of the HIV1 LAI virus was inserted at the Xhol site internal to ORF2.
  • a fragment containing the gag gene was synthesized in vitro by PCR using the EML3 oligonucleotides:
  • EML5 5 • GTTCGAATTCTCACAAAACTCTTGC3 * and the plasmid pTG2103 constructed by Transgene (Figure 20) as a matrix.
  • This fragment containing the gag gene was cut by the enzymes Xhol and EcoRI and cloned between the Xhol and EcoRI sites of the plasmid pAMI (Murray et al, 1992), thus achieving an ORF2-Gag fusion and giving rise to the plasmid pLA21 ( Figure 21 ).
  • the BamHI / EcoRI fragment carrying the ORF2-Gag fusion was excised from pLA21 by cutting with the enzymes EcoRI and BamHI. The ends of the fragment were filled in with Klenow polymerase and the resulting fragment was cloned in pRR3 at the Seal site to give rise to the plasmids pLA22 and pLA23. These plasmids were transferred by electroporation into M.smegmatis and BCG. The ORF2-Gag fusion is expressed in the form of a 46.5 kDa polypeptide by M.smegmatis and BCG ( Figure 22).

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Abstract

L'invention concerne une séquence nucléotidique de M. paratuberculosis (Mptb), caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'ADN comprenant: a) la séquence nucléotidique de 716 pb (P^_s^_t^_I/B^_a^_m^_HI), ou une partie de cette séquence, b) une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence a). Utilisation pour l'expression de séquences d'acide nucléique dans un hôte cellulaire.

Description

PROMOTEUR DE M. PARATUBERCULOSIS ET SON UTILISATION POUR L'EXPRESSION
DE SEQUENCES IMMUNOGENES
L'invention a pour objet une séquence nucléotidique permettant de cloner ou d'exprimer des enchaînements ήucléotidiques dans un hôte cellulaire déterminé.
Une séquence nucléotidique de l'invention peut être obtenue à partir de Mycobacterium paratuberculosis.
Parmi les mycobactéries , on connait particulièrement certaines souches et par exemple le bacille Calmette et Guerin (BCG) , qui est une souche avirulente de Mycobacterium bovis largement utilisée dans le cadre de la vaccination contre la tuberculose dans le monde. Ses caractéristiques biologiques en font un candidat intéressant pour le développement de vaccins recombinants. La paroi cellulaire fonctionne comme un adjuvant très efficace et une seule inoculation peut déclencher une immunité de longue durée. Les effets secondaires graves dûs à ce bacille sont rares même lors d'immunisations répétées.
L'induction d'une immunité spécifique , suivant la vaccination par le BCG est initiée lorsque des cellules T interagissent avec des macrophages présentant des antigènes de mycobactéries en association avec les produits du complexe majeur d'histocompatibilité (abréviation CMH) . Les clones de cellules T sensibilisées prolifèrent et produisent des lympho ines qui activent en retour les macrophages pour éliminer de façon non spécifique les bacilles. En outre des cellules T auxiliaires induisent la prolifération de clones de cellules B conduisant à la production d'anticorps. Des tentatives ont déjà été faites pour effectuer le clonage et l'expression de gènes hétérologues dans le BCG, notamment en utilisant les connaissances disponibles sur les vecteurs réplicatifs ou intégratifε. Ainsi un épitope de la protéine gag de HIV-1 a été clone sous forme d'un polypeptide de fusion avec l'antigène α, cet antigène étant une des protéines majeures exportées par des mycobactéries, notamment le BCG ou Mycobacterium Kansasii et des gènes de résistance à des antibiotiques ont été exprimés sous le contrôle de leur propre région de régulation. Afin d'optimiser l'expression d'antigènes hétérologues dans des recombinants BCG, les inventeurs ont orienté leurs recherches vers la caractérisation des unités de régulation de gènes, fonctionnelles dans les mycobactéries.
Les inventeurs ont ainsi décrit l'isolement et la caractérisation à partir de Mycobacterium paratuberculosis de séquences nucléotidiques permettant l'expression d'acides nucléiques donnés chez les mycobactéries ou chez d'autres hôtes cellulaires.
On entend par acide nucléique, toute séquence de nucléotides susceptible d'être clonée et/ou exprimée, quelle que soit sa composition, sa longueur, ou son origine (obtenue par extraction ou synthétique) .
Différents travaux ont été effectués à partir de M. paratuberculosis (désigné également dans la suite par Mptb) et Green et al (Nucleic Acids Research Vol. 17 (22) 1989, pages 9063-9072) ont en particulier caractérisé et séquence un élément d'insertion de cette mycobacterie, élément qui a été appelé IS900. Selon Green et al, cet élément d'insertion contient une phase ouverte de lecture, appelée ORF1197 codant pour une protéine de 399 acides aminés. Les inventeurs ont recherché des séquences spécifiques de l'espèce Mycobacterium paratuberculosis, par criblage d'une banque genomique lambda gtll en effectuant des tests d'hybridation avec l'ADN de souches d'autres mycobactéries en particulier de M. phlei décrit dans Murray A. et al New Zeland, Veterinary Journal 37: 47-50. A cette occasion, ils se sont intéressés à une séquence d'ADN spécifique, qui contenait un fragment adjacent à l'élément IS900 décrit par Green et al.
Ils ont déterminé la présence d'une séquence adjacente à la partie 5' de la séquence inverse complémentaire de la phase ouverte de lecture codant pour une transposase potentielle et contenue sur l'élément d'insertion IS900 ; cette nouvelle séquence est susceptible d'avoir des fonctions promoteur et de contenir des signaux importants pour la régulation de la transcription et de la traduction.
Une séquence nucléotidique selon l'invention utilisable pour le clonage et/ou l'expression d'un acide nucléique est caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence (I) , choisie parmi : a) la séquence représentée à la figure 2 ou toute partie de cette séquence susceptible d'intervenir dans l'expression d'un acide nucléique qui serait placé sous son contrôle, b) une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence a) dans des conditions données ci-dessous.
Une partie de la séquence I intéressante dans le cadre de l'invention, peut être définie en réalisant un test tel que le suivant: une partie déterminée de la séquence I est clonée en amont d'un vecteur de reconnaissance de promoteur et de signaux de traduction, contenant par exemple le gène de la β- galactosidase, dépourvu de son promoteur et de ses huit premiers acides aminés.
Les conditions de réalisation du test peuvent être établies sur la base de la description correspondant aux constructions des figures 7 à 9. Une partie ainsi testée de la séquence I, intéressante dans le cadre de l'invention conduit à la synthèse d'une protéine ayant une activité 9-galactosidase chez différents hôtes cellulaires, par exemple les actinomycètes .
Une première séquence nucléotidique particulièrement avantageuse selon l'invention, utilisable pour le clonage et/ou l'expression d'un acide nucléique est la séquence (II) , caractérisée en ce qu'elle comprend : a) la séquence nucléotidique suivante ou toute partie de cette séquence contenant notamment le site d'initiation de la transcription (position +1) et des éléments nécessaires à la reconnaissance et à la fixation des ARN polymérases d'un hôte cellulaire déterminé qui serait transformé par cette séquence, ces éléments comprenant en particulier les séquences [TAC ACT] en position -10 par rapport au site d'initiation de transcription et [TC GAC A] en position -35 par rapport à ce site : GAT CCC GTG ACA AGG CCG AAG AGC CCG CGA CCG TGC GGT CGT
CGA CGA CCG AGT GTG AGC AGA CCC CCT GGT GAA GGG TGA ATC
+1 GAC AGG TAC ACA CAG CCG CCA TAC ACT TCG CTT CAT GCC CTT
ACG GGG GGC GGC CAA CCC AGA AGG AGA TTC TCA b) une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence a) dans des conditions données ci-dessous.
Les conditions d'hybridation dont il est question ci-dessus peuvent être décrites comme suit :
On utilise par exemple une sonde déterminée à partir de la séquence avec laquelle on souhaite tester l'hybridation, marquée au 32p (106 cpm/ml) que l'on met en contact avec la séquence testée pendant 16 heures à 65"C dans une solution d'hybridation (formamide 50%, 5 x SSPE, DNA de sperme de saumon 200 μg/ml et 10 x Denhart) . Les membranes sur lesquelles est réalisée l'hybridation sont ensuite lavées deux fois pendant 30 minutes avec une solution ISSC, 0,1% SDS à température ambiante (20*C) puis lavées deux fois avec 0,1SSC, 0,1% SDS pendant 30 minutes à 65*C. Com osition de 5 x SSPE
Le nucleotide A marqué +1 correspond à un site d'initiation de transcription déterminé dans le cadre de l'invention et la séquence nucléotidique en amont de ce site comporte des éléments de reconnaissance et de fixation pour des ARN polymérases d'hôtes cellulaires (régions -35 et -10) chez lesquels la séquence est susceptible d'être utilisée comme promoteur pour le clonage ou l'expression de séquences d'acides nucléiques déterminées. Les régions -35 et -10 sont localisées par rapport au site +1.
Les séquences ci-dessus (séquences I et II) contiennent la séquence minimum nécessaire à l'initiation de la transcription définie ci-dessus ainsi que des fragments en amont et en aval de cette séquence, susceptibles de jouer un rôle dans la régulation de la transcription et/ou de l'expression. Par exemple ces séquences comportent un enchaînement de type séquence Shine Dalgarno [A AGG AG], intervenant dans la fixation du ribosome.
Une autre séquence nucléotidique susceptible de permettre l'expression dans un hôte cellulaire, d'un enchaînement nucléotidique est selon l'invention caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'ADN (III) choisie parmi : a) la séquence nucléotidique suivante :
+1 TC GAC AGG TAC ACA CAG CCG CCA TAC ACT TCG CTT CA
b) une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence a) dans des conditions ci-dessous,
c) toute partie de cette séquence intervenant dans l'activité de transcription d'un acide nucléique.
La séquence désignée sous b) définie par sa capacité d'hybridation avec I, II ou III donne dans chaque cas les variants de la séquence de l'invention qui tout en étant modifiés au niveau d'un ou plusieurs nucléotides conservent les propriétés des séquences I, II ou III de l'invention dans la transcription d'un acide nucléique. Les modifications susceptibles d'être introduites au niveau de variants sont par exemple des substitutions, des insertions, des délétions ou des inversions de nucleotides.
La séquence nucléotidique comprenant une des séquences I, II ou III ou un variant de I, II ou III, contient un enchaînement nucléotidique pouvant fonctionner comme promoteur pour l'expression de séquences données d'acide nucléique.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être aussi désignées dans la suite par l'expression "séquence contenant le promoteur" lorsqu'elles contiennent l'enchaînement III.
Le cas échéant, la séquence III peut être mise en oeuvre avec un fragment de la séquence I qui ne lui est pas nécessairement adjacent dans l'enchaînement I mais qui est susceptible d'intervenir avec I pour l'expression d'un acide nucléique donné.
Les susdites séquences peuvent être obtenues par extraction, purification à partir de l'ADN de M. paratuberculosis ou par synthèse chimique.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, tout variant d'une séquence nucléotidique comprenant les enchaînements I, II ou III ci-dessus décrits peut être défini par le fait qu'il conserve les propriétés fonctionnelles des enchaînements I, II ou III et notamment leur aptitude à remplir les fonctions de promoteur lors de la transcription de séquences nucléotidiques au sein d'un hôte donné.
Les éléments de la séquence nucléotidique I ou de la séquence II qui encadrent la séquence III peuvent être délétés au moins en partie et éventuellement substitués. Par exemple la séquence comprise entre les positions des nucleotides +2 et +41 par rapport au site d'initiation de transcription peut être remplacée pour tout ou partie, par une séquence exogène par rapport à la séquence présente naturellement en aval de la séquence III chez Mptb, cette séquence exogène comportant une séquence de Shine Dalgarno susceptible d'être reconnue par le ribosome chez un hôte déterminé. A titre d'exemple cette séquence comprise entre les positions +2 et +41 peut être remplacée par une séquence exogène d'origine bactérienne, par exemple de E.coli comportant une séquence de Shine Dalgarno.
L'invention vise aussi l'utilisation de toute partie de la séquence I ou II en dehors des régions -35 et -10 ou de la séquence de Shine Dalgarno (SD) , susceptible d'intervenir dans la transcription ou la traduction d'un acide nucléique donné.
L'invention vise également une séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique telle que définie plus haut et au moins une séquence d'acide nucléique, dont on souhaite obtenir le clonage et/ou l'expression dans un hôte cellulaire déterminé, sous le contrôle de ce promoteur.
Cette séquence peut être une séquence codant pour un peptide de Mptb, ou une séquence hétérologue codant pour un peptide ou un polypeptide d'origine différente. Une séquence d'acide nucléique est considérée comme séquence hétérologue, dès lors qu'elle ne correspond pas à la séquence naturellement adjacente aux séquences I ou II chez Mptb, une partie de cette séquence naturellement adjacente correspondant à l'enchaînement de 716 bp représenté à la figure 2.
Les moyens de l'invention peuvent donc être mis en oeuvre pour l'expression dans un hôte cellulaire différent de Mptb, d'une séquence d'acide nucléique codant pour un peptide ou un polypeptide de Mptb, sous le contrôle de la séquence nucléotidique de l'invention. La séquence recombinante peut être utilisée à la fois pour cloner une séquence codante dans un hôte déterminé par exemple dans une bactérie telle que E.coli et ensuite transférer cette séquence pour l'exprimer dans un hôte différent par exemple chez un Actinomycète et notamment chez une souche de mycobacterie, en particulier une souche BCG.
L'invention peut être mise en oeuvre pour cloner ou exprimer tout type de séquences d'acides nucléiques et en particulier des séquences codant pour des peptides, polypeptides ou protéines (cet ensemble pouvant être désigné par l'expression polypeptide) ayant un caractère antigénique.
L'invention a par exemple pour objet une séquence recombinante particulière répondant à la définition précédente, caractérisée en ce qu'au moins une séquence d'acide nucléique placée sous le contrôle d'une séquence nucléotidique de l'invention I, II ou II définie ci-dessus, code pour un peptide ou un polypeptide immunogène ou susceptible d'être rendu immunogène.
A titre d'exemple une séquence d'acide nucléique à exprimer, incorporée à la séquence recombinante de l'invention peut être une séquence caractéristique d'un organisme pathogène. Des agents pathogènes sont par exemple des virus, des parasites, des bactéries. On cite notamment M. leprae, M. tuberculosis, M. intracellulare, M. africanum, M. avium, les sporozoîtes et les érozoïtes de plasmodium, les bacilles responsables de la diphtérie, du tétanos, Leishmania, Salmonella, certains tréponèmes, la toxine de pertussis et d'autres micro-organismes pathogènes et viraux notamment le virus des oreillons, de la rubéole, de l'herpès, d'influenza, de Schistosoma, de Shigella, de Neisseria, de Borrelia, le virus de la rage, de la polio, de l'hépatite, du SIDA HIV, HTLV-I, HTLV-II et
SIV ainsi que des virus oncogènes.
La séquence d'acide nucléique à exprimer peut aussi coder pour une séquence immunogène par exemple de venin de serpent ou d'insecte.
La séquence nucléotidique recombinante peut ainsi contenir sous le contrôle de la même séquence nucléotidique de l'invention plusieurs séquences codantes d'antigènes, le cas échéant caractéristiques d'organismes différents.
De préférence l'invention vise une séquence recombinante caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique à exprimer code pour un peptide ou un polypeptide d'un rétrovirus HIV, par exemple un peptide ou un polypeptide d'enveloppe, ou un peptide ou un polypeptide de la protéine Nef, de HIV-1 ou de HIV-2.
D'autres séquences d'acide nucléique peuvent être mises en oeuvre dans le cadre de la réalisation de l'invention et on citera à titre d'exemple les antigènes ou les séquences immunogènes de mycobactéries, en particulier les protéines ou fragments des protéines correspondant à des gènes impliqués dans la virulence et des antigènes à potentiel protecteur. Un antigène est dit "à potentiel protecteur" s'il est susceptible de déclencher ou de favoriser une réponse immunitaire protectrice en particulier par production d'anticorps ou par induction d'une réponse immunitaire de type cellulaire, en particulier de type CTL.
On peut envisager de constituer une séquence recombinante dans laquelle la séquence nucléotidique de l'invention interviendrait dans le contrôle de l'expression d'un ou plusieurs haptènes ou épitopes déterminés, appartenant le cas échéant à des organismes différents. Par ailleurs ces haptènes ou épitopes peuvent être associés à une séquence codant pour un antigène ou de façon générale un polypeptide utilisable comme protéine porteuse, notamment pour l'expression à la surface d'un hôte cellulaire, voire la sécrétion du ou des haptènes ou épitopes.
On entend par association soit la formation d'une séquence codante hybride entre les différentes séquences présentes dans la séquence recombinante ou une association sous forme d'éléments codants d'un opéron, les différentes séquences codantes gardant dans ce cas leur individualité lors de l'expression dans un hôte cellulaire soit la formation d'une protéine fusion résultant de l'expression d'un gène fusion.
La séquence nucléotidique I, II ou III de l'invention peut être placée soit en amont de la séquence nucléotidique à exprimer et en phase avec cette séquence, soit en aval de la séquence d'acide nucléique à exprimer. Le choix de sa position relative par rapport à la séquence codante peut être déterminé en fonction du taux d'expression recherché dans un hôte déterminé.
Dans la séquence nucléotidique recombinante de l'invention, une séquence nucléotidique selon l'invention et la ou les séquence (s) d'acide nucléique à exprimer peuvent donc constituer un opéron de fusion. Dans ce cas si plusieurs acides nucléiques sont présents, ils sont exprimés sous le contrôle de la séquence mais sous forme de produit individualisé.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique I, II ou III et la ou les séquence (s) d'acide nucléique (s) à exprimer constituent un gène de fusion. Dans ce cas le produit de l'expression de ce gène est constitué par une protéine hybride ou protéine de fusion lorsque plusieurs acides nucléiques sont utilisés. L'invention concerne de façon générale l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon la description précédente pour le clonage et/ou l'expression de séquences d'acide nucléique, dans un hôte cellulaire différent de Mptb, en particulier chez des Actinomycètes et notamment des Mycobactéries et notamment chez M. bovis par exemple chez la souche avirulente BCG, chez des bactéries Grain-négatives telles que E.coli ou chez des bactéries Gram-positives telles que B. subtilis.
Entre également dans le cadre de l'invention, un vecteur de clonage et/ou d'expression, de type intégratif ou de type réplicatif, caractérisé en ce qu'il comprend, en un site non essentiel respectivement pour son intégration ou pour sa réplication, une séquence nucléotidique comprenant les enchaînements I, II ou III ou leurs variants, selon les définitions précédentes.
Ces vecteurs sont donc soit capables de se répliquer de façon extrachromosomale ou au contraire sous forme d'éléments intégrés au sein d'un chromosome ou plus généralement au sein d'un élément du génome d'un hôte auquel ils ont incorporés, y compris dans un plasmide ou un bactériophage présent dans cet hôte.
Un vecteur selon l'invention peut encore être caractérisé en ce qu'il est modifié en un site non essentiel respectivement pour son intégration ou pour sa réplication, par une séquence nucléotidique recombinante décrite ci-dessus.
Un vecteur particulier comprend outre le promoteur et une séquence hétérologue, au moins une partie de la séquence désignée par ORF2 de Mptb (figure 10) . Cette séquence est avantageusement placée en aval de la séquence contenant le promoteur, de préférence entre le promoteur et la séquence nucléique hétérologue. Avantageusement cette partie de ORF2 correspond à un enchaînement de 716 bp de Mptb tel que décrit à la figure 2.
A titre d'exemple de vecteurs satisfaisants pour réaliser l'invention, on peut citer les plasmides, les transposons, les phages ou tout autre vecteur utilisable pour l'expression d'une séquence. En particulier un plasmide intéressant, le cas échéant à titre de plasmide intermédiaire pour la réalisation de l'invention est une souche E.coli (Myc758) contenant le fragment de 716pb (Pstl/BamHI) clone dans le vecteur pUClδ, déposée à la Collection Nationale des Microorganismes à Paris, France, sous le numéro 1-1157 le 23 Octobre 1991.
Ce plasmide comprend notamment le promoteur de l'invention correspondant à la séquence II, délimité par les sites de restriction EcoRI/B lII (promoteur pan) ainsi qu'une séquence de liaison (linker) .
A titre d'exemple de vecteurs on pourra citer les plasmides dérivés de pAL5000 (Ranzier et al, 1988, Gène 71:315-321), RSF1010 (Hermans et al, 1991, Mol. Microbiol. 5_:1561-1566) , pNG2 (Radford et al, 1991, Plasmid 25:149-153), les transposons dérivés de Tn610 et de IS6100 (Martin et al, 1990, Nature 345:739-743) , IS900 (Green et al, Mol. Microbiol.), IS901 (Kunze et al, 1991, Mol. Microbiol. 5:2265-2272) , IS6110 (Thierry et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18_:pl88) et les phages L5 (Lee et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88_: 3111-3115), D29 (Tokunaga et al, 1964, J. Exptl. Med. , 119:139-149) .
D'autres éléments de séquences nucléotidiques peuvent être incorporés ou présents sur le vecteur de l'invention ; il peut s'agir par exemple de marqueurs d'expression et à cet égard on peut faire référence aux gènes de résistance à des antibiotiques tels que la kanamycine ou la viomycine. D'autres éléments de régulation peuvent être des séquences intervenant dans l'expression de la séquence codante et en particulier des séquences de type opérateur ou encore des éléments susceptibles de favoriser l'exportation, l'exposition au niveau de la membrane de l'hôte, l'excrétion ou la sécrétion du produit d'expression de la séquence hétérologue.
L'invention se rapporte également à un hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il est transformé par une séquence nucléotidique recombinante ci-dessus décrite ou par un vecteur ci-dessus décrit, dans des conditions permettant l'expression de la (des) séquence (s) d'acide nucléique (s) à exprimer contenue (s) dans la séquence recombinante ou dans le vecteur.
Un hôte cellulaire particulièrement avantageux pour la réalisation de l'invention est un hôte qui permet l'exposition à sa surface, voire l'excrétion ou la sécrétion du produit d'expression de la (des) séquence (s) d'acide nucléique (s) à exprimer qu'il contient ou sa synthèse dans des conditions de localisation intracytoplasmique.
Des hôtes particuliers sont par exemple les souches d'Actinomycètes de préférence des souches avirulentes comme par exemple la souche avirulente BCG de l'INSTITUT PASTEUR n* 1173P2 utilisée pour constituer le vaccin commercialisé sous le nom "Vaccin BCG Pasteur Mérieux".
Les inventeurs ont constaté cependant que la séquence contenant le promoteur spécifique de Mptb est susceptible de fonctionner dans d'autres souches que les Actinomycètes et par exemple peut fonctionner dans une bactérie à gram-négatif comme E.coli. Cette séquence est aussi susceptible d'être utilisée dans des bactéries à gram-positif telles que B. subtilis ou dans des Streptomyces.
Un procédé adapté pour la préparation d'hôtes cellulaires recombinants selon 1'invention est par exemple l'électroporation, conformément à la description de Snapper S. et al (1988, PNAS USA 85: 6985-6991) ou la conjugaison selon par exemple la technique de Lazraq R. et al (1990, FEMS Microbiol. Lett. 69: 135-138) .
Compte tenu des propriétés intéressantes de ce promoteur, et de la possibilité d'exprimer dans des souches choisies et notamment dans des souches avirulentes des antigènes ou des séquences immunogènes, l'invention propose une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un hôte cellulaire recombinant répondant aux critères précédents, en quantité suffisante pour déclencher la production d'anticorps, ou contribuer à la production d'anticorps de préférence protecteurs chez un hôte animal ou humain auquel elle est administrée.
Cette composition immunogène peut être mise en oeuvre pour le déclenchement d'une réponse protectrice contre un agent pathogène déterminé, par la production d'anticorps, et l'induction d'une réponse immunitaire de type cellulaire, dès lors que le produit d'expression de la séquence d'acide nucléique exprimée sous le contrôle des séquences I, II ou III est dans des conditions permettant de déclencher cette production. La composition immunogène peut également être utilisée à titre de composition de rappel pour stimuler une production d'anticorps initiés par une protéine ou un autre constituant.
La réponse engendrée à la suite de l'administration de la composition immunogène peut être de type cellulaire ; il peut s'agir en particulier d'une séquence de type CTL.
L'invention permet donc de préparer également des vaccins de type vaccin mixte, dans lesquels la production d'anticorps sera dirigée à la fois contre l'hôte cellulaire et notamment contre le bacille BCG et contre le produit d'expression de la séquence d'acide nucléique à exprimer.
Outre ses propriétés intéressantes pour la réalisation d'un vaccin, une composition comprenant un hôte cellulaire recombinant selon l'invention, est utilisable pour effectuer de l'immunothérapie.
Un tel vaccin ou composition pour l'immunothérapie peut être utilisé chez l'animal ou chez l'homme et administré par voie intradermique, souscutanée, orale, d'aérosols ou percutanée. Plusieurs administrations, peuvent être nécessaires, par exemple sous forme de rappel, pour obtenir une protection suffisante.
Un hôte cellulaire recombinant selon l'invention peut aussi être utilisé pour produire toute protéine ou peptide en particulier à l'échelle industrielle. On peut ainsi utiliser l'invention pour la production d'antibiotiques.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et dans les figures qui suivent.
I G U R E S
Figure 1 : Description schématique de la construction de pAM320
L'ADN de Mptb est représenté en grisé par un double trait et le gène lacZ par un double trait. pAM3 a été digéré avec BamHI/PstI donnant lieu à un fragment de 716 bp qui a été récupéré sur un gel d'agarose à 1% en utilisant le système Geneclean. Le fragment a été ligaturé au plasmide pNM482 digéré par BamHI/PstI, pour produire pAM310. Des souches compétentes E.coli MC1061 ont été transformées avec le produit de ligation et les cellules ont été étalées sur un milieu Luria-Broth (LB) contenant 100 μg/ml d'ampicilline. Les clones portant le plasmide recombinant pAM310 ont été récupérés en vérifiant la carte de restriction du plasmide. Le fragment de 3,8 kb obtenu à partir de pAM310 par digestion avec les enzymes Smal/Dral a été élue sur gel d'agarose à 0,8% et ligaturé par ses extrémités franches au site Seal de pRR3 pour produire pAM320. Dans cette construction le gène ApR (gène de résistance à l'ampicilline) a été interrompu. Les cellules E.coli MC1061 ont été transformées et les colonies ont été sélectionnées par le phénotype KmR Aps. L'ADN de ces recombinants a été préparé par lyse alcaline et utilisé pour transformer M. smegmatis mc2155 (Snapper et al, 1990, Molec. Microbiol. 4_:1911-1919) par électroporation.
Figure 2 : Séquence nucléotidique du fragment BamHI/PstI de 716 bp obtenu à partir de pλM3 et les 185 acides aminés N-terminaux de orf2
SD = Shine Dalgarno; +1= site d'initiation de transcription
Figure 3 : ELZSλ sur des sόrums de souris prélevés 40 jours après l'inoculation iv (intraveineuse)
Des souris Balb/C ont été immunisées par voie iv avec 107 CFU de r-BCG transformé avec pAM320, ou avec du BCG souche 1137P2. Plusieurs souris non immunisées ont été utilisées comme contrôle. Les sérums ont été prélevés 40 jours après immunisation et testés. Les anticorps anti-£-galactosidase ont été détectés par la méthode ELISA (Engval E. et Perlman P, 1971, Immunochemistry 8_Î 871-874) . Les plaques de microtitration ont été recouvertes avec 1 μg de 9-galactosidase par puits. Les anticorps anti-3-galactosidase ont été détectés avec des anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de souris marqués à la phosphate alcaline (Biosis) . Chaque valeur correspond à un pool de sérums de quatre ou cinq souris.
Figure 4 : Réponse proliférative des cellules de ganglions lymphatiques d'une souris Balb/C immunis e par voie sous- cutanée avec 107 CFU ou BCβ + pλM3 | , et la souche BCβ
Un groupe de souris immunisées a été inoculé avec 0,1 ml de IFA. Deux semaines plus tard, les réponses prolifératives des cellules LN (cellules de ganglions lymphatiques) à la 0-galactosidase, à APH3•, à la PPD et la ConA ont été testées.
Figure 5 : Prolifération des lymphocytes CD4+ et CD8+ spécifiques
Des souris Balb/C ot été immunisées par voie sous- cutanée avec 10 CFU de BCG 1173 P2 (a) et r-BCG + pAM320 (b). Deux semaines plus tard les réponses prolifératives de leurs cellules LN à la PPD (10 μg/ml) (a) et la £-galactosiâase (0,01 μg/ml) (b) ont été testées en présence d'anticorps monoclonaux anti-CD4 (0) ou anti-CD8 (O) . Figure 6 : Réponses en interferon-gama des cellules LN de souris
a) souris immunisées avec le BCG 1173P2 b) souris immunisées avec r-BCG (+ pAM320) après stimulation avec 1 μg/ml 8-gal (o) , 10 μg/ml PPD (o) , 2,5 μg/ml con A (Δ)
Figure 7 : Clonage du promoteur Pan adjacent à lacz
PCR sur pan
amorces :
PI = 5' CCCTCTAGAATTCCGTGACAAGGCCGAAGAGCCCGCGA 3'
P2 ≈ 5' AACATATGAGATCTTCTCCTTCTGGGTTGGCCGCCCC 3»
Conditions de la PCR : 35 cycles
Dénaturation 2 minutes à 95*C , appariement 2 minutes à
55°C, élongation 2 minutes à 72*C.
Volume de réaction 50 μl contenant 10 μM d'amorces, 10 nmol de dNTP, l'ADN cible de pAM3.
Figure 8 : Clonage du produit de PCR dans MC8 de pSL 1180
Le produit obtenu par PCR a été digéré avec Xbal/Ndel et ligaturé au pSL 1180 (Pharmacia) digéré avec Xpal/Ndel pour donner pWR30.
Figure 9a et 9b : Description schématique de la construction de pWR31, pWR32 et p R33 Pour les figures 7, 8, 9 et: la PCR (amplification génique) a été utilisée pour produire un fragment de 716 bp à partir de pAM3 en utilisant les amorces PI et P2. Ce fragment contenait le promoteur pam avec les sites Xbal et EcoRI à l'extrémité 5' et les sites BglII et Ndel à 1*extrémité 3• . Le fragment a été digéré avec Xbal et Ndel et clone dans le site multiple (MCS) de pSLllδO pour former le plasmide pWR30. Lors de la préparation pour le clonage de pan en un site adjacent au gène lacZ, le promoteur pi et le gène Cil ont été clones devant le gène tronqué lacZ de pNM482. Ceci permet de générer une protéine fusion CII-LacZ fonctionnelle sous le contrôle de séquences en amont contenant pL, ainsi qu'un polylinker permettant des constructions ultérieures. Le plasmide pTG952 a également été digéré avec XHOI et son extrémité complétée avec le fragment de Klenow. Un fragment de 530 pb a ensuite été récupéré à partir du plasmide après digestion avec BamHI et clone dans le site Smal/BamHI de pNM482. Le plasmide résultant pIPJN possédait ainsi un gène fonctionnel de £-galactosidase sous le contrôle du promoteur pi de lambda. Afin de cloner pan dans pIpJN une digestion par EcoRI/BglII a été faite sur pWR30. Le fragment de 159 bp a été purifié avec Geneclean et clone dans pIpJN digéré avec EcoRI/BglII pour donner pWR31. Quand les souches E.coli ont été transformées avec ce plasmide et cultivées en présence d'ampicilline et de X-gal, des colonies bleues ont été formées. L'opéron de fusion a ensuite été récupéré à partir de pWR31 par digestion par EcoRI/Dral. Le site EcoRI a été complété avec l'enzyme de Klenow et des dNTP puis ligaturé au plasmide pRR3 digéré par l'enzyme Seal. Les deux orientations de 1*opéron dans pRR3 ont été obtenues. La transformation de E.coli et M. smegmatis avec ces deux constructions (p R32, p R33) a permis la formation de colonies bleues lorsque les bactéries ont été cultivées en présence de substrat chromogène de X-gal.
Figure 10: séquence de orf 2,
Figure 11; réponse en anticorps à partir de sérum d'animaux immunisés avec le r-BCG exprimant la β- galactosidase.
Figure 12: construction des plasmides contenant les fusions pAN-ORF2-Nef(SIV) . Le plasmide pTG3148 est un vecteur dérivé de pTG959 (Guy et al, 1987, Nature 3_3j0:266-269) où un fragment BglII contenant le gène nef a été clone. Ce fragment a été isolé à partir de cellules de singes contenant le virus SIV (mac251) intégré comme provirus. Le plasmide pBlue/pAM712 est dérivé de pBluescriptIISK+ (Stratagene) où le fragment BamHI/PstI contenant pAN-ORF2 et excisé de pAMl a été clone entre les sites BamHI et PstI du polylinker.
Figure 13; Analyse de type Western de l'expression du polypeptide ORF2-Nef(SIV) . Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués à gauche de la ligne 1 ; Ligne 1: Extrait de baculovirus contenant la protéine Nef(SIV) ; Ligne 2: Extrait de BCG ; Lignes 3 et 4: Deux extraits de BCG recombinants portant le plasmide pSN25; Lignes 5 et 6: Deux extraits de BCG recombinant portant le plasmide pSN26.
Figure 14: Analyse des réponses prolifératives des cellules prélevées des ganglions lymphatiques de souris BALB/c inoculées avec du BCG recombinant portant le plasmide pSN25. Les protocoles d'immunisation sont les mêmes que ceux décrits à la conférence de Cold Spring Harbor ( Vaccine, Septembre 1991) et repris dans Winter et al, 1991 (Gène 109:47-54) . La prolifération a été mesurée après stimulation in vitro avec les différents peptides indiqués en ordonnée sur la figure 3 suivant leur localisation sur la protéine (du N au C-terminal) . Trois concentrations de peptides ont été utilisées (0,1/1 et 10 ug/ml) . Le maximum de prolifération a été observé pour l'une ou l'autre de ces concentrations suivant les peptides. C'est la valeur maximum qui est indiquée sur la figure 3. De façon analogue, la prolifération a été mesurée à partir de .souris immunisées avec du BCG non recombinant. Les valeurs obtenues ont toujours été inférieures à 2500cpm (sauf pour la stimulation avec le peptide 84-96 ou une valeur de 5000 cpm a été observée) . Les expériences réalisées avec des souris non immunisées ont donné des valeurs inférieures à 250 cpm.
Figure 15; Plasmide pTG5167. C'est un dérivé de pTG186 poly (Guy et al, 1987) où un fragment BglII-EcoRI portant le gène codant pour la protéine GP160 de HIV1/MN a été clone dans le polylinker. Figure 16: Construction des plasmides pLA12 et pLA13 portant la fusion pAN-0RF2-Env(HIVl/MN) . Figure 17: Expression du polypeptide ORF2-Env(HIVl/MN) par le BCG portant les plasmides pLA12 et pLA13. 1 protéine gpl20 de HIV-1 LAI ; 2 BCG standard, extrait cellulaire ; 3 BCG-pLA12, extrait cellulaire ; 4 BCG- pLA13 extrait cellulaire ; 5 BCG-pLA12, surnageant de culture ; 6 BCG-pIA 13, surnageant de culture. Figure 18: Réponses prolifératives des cellules extraites des ganglions lymphatiques des souris inoculées avec le BCG portant les plasmides pLA12 et pLA13. 4 souris Balb/c reçoivent une injection intradermique de 107 cfu de BCG-pLA12, 4 autres reçoivent du BCG- pLA13 et 4 reçoivent du BCG 1173 2 standard. Après 14
FEUILLE DE REMPLACEMENT jours les ganglions lymphatiques périphériques sont prélevés pour le test de prolifération. La protéine gpl20 de HIV1-LAI est utilisée pour induire la prolifération des cellules ganglionnaires qui ont été en contact avec la protéine de fusion ORF2-région V3 produite par le BCG recombinant.
Figure 19: Taux d'anticorps anti-peptide V3 mesurés par tests ELISA. 5 souris reçoivent une injection intraveineuse d'une préparation vaccinale qui contient 5 X 106 cfu de BCG transformés avec pLA12; 5 autres reçoivent la même quantité de BCG recombinant pLA13; 5 souris reçoivent une quantité similaire de BCG recombinants qui expriment le gène lacZ mais pas le gène ORF2-env'; des souris "naïves" ne reçoivent pas d'injection. Des prélèvements sanguins sont effectués après 14 jours, puis toutes les 2 semaines afin de mesurer l'évolution du taux d'anticorps spécifiques de la protéine de fusion ORF2-env*.
Lors du test ELISA, nous avons utilisé, comme antigène susceptible d'être reconnu par les anticorps présents dans les sérums, un peptide de 20 acides aminés de la boucle V3 de gp^O^ (aa306 à aa325) , reconnu par l'anticorps SC-D (K24-1) .
Figure 20: Plasmide pTG2103. C'est un dérivé de pTG959 (Guy et al, 1987) ou un fragment BglII/EcoRI portant le gène codant pour la protéine P24 de HIVl/LAI a été clone dans le polylinker.
Figure 21: Construction des plasmides pLA22 et pLA23 portant la fusion pAN-ORF2-gag(HIVl/LAI)
Figure 22: Expression du polypeptide ORF2-Gag(HIVl/LAI) par le BCG. M A T E R I E L S E T M E T H O D E S
Souches bactériennes, phages, plasmides et milieux de cultures
M. bovis BCG (BCG) souche Pasteur 1173 P2 appelé BCG (Calmette A. L'infection bacillaire et la tuberculose chez l'homme et chez les animaux. Processus d'infection et de défense. Etude biologique et expérimentale. Vaccination préventive. Ed Masson, Paris, 1928) a été utilisée en tant qu'hôte pour la construction de différents recombinants BCG (r-BCG) . D'autres bactéries, phages et plasmides utilisés dans les expériences rapportées ci-après sont décrits dans le Tableau I. Le BCG a été cultivé jusqu'à la formation de voiles sur un milieu de Sauton (Sauton B., Comptes Rendus Académie des Sciences 1912:155-1860 dans Calmette A. et al. Vaccination préventive par le BCG p 811 - Ed. Masson 1928) pour réaliser une préparation vaccinante classique ou sous forme d'une culture dispersée. Les clones bactériens de r-BCG ont d'abord été cultivés sur un milieu Lowenstein-Jensen (Jensen K., Towards a standard of laboratory methods, 4th Rep. Subcomm laboratory methods. Bull Union Internat, against Tuberc, 1957, 2_7:146-166) contenant 10 μg/ml de kanamycine, puis transférés sur milieu Sauton. Ces cultures ont été utilisées pour des analyses d'expression in vitro et pour l'immunisation des animaux. Les souches M. smegmatis et E.coli ont été cultivées selon la méthode décrite par Ranes et al (1990) J. Bact. 172.: 2793-2797.
Préparation de l'ADN de M. paratuberculosis 50 mg de souches M. paratuberculosis lyophilisées (Murray A. et al, NZ Vet Journal précité) ont été resuspendues dans un tampon d'homogénéisation (NaCl 0,1M, Tris-HCCL 0,03M, pH 7,5, EDTA 0,006M), mélangées avec 2 ml de billes de verre (diamètre 0,45-0,5 mm) et agitées dans un homogénéiseur à rotation Braun à la vitesse maximum pendant 2 minutes à 4"C. Après la centrifugation et l'extraction au phénol/chlorophorme, l'ADN a été précipité avec 95% d'éthanol et traité avec 0,1 mg/ml de DNAse sans de RNAse. Après une autre extraction au phénol/chlorophorme, et une précipitation à l'éthanol, l'ADN a été resuspendu dans l'eau (A260/280 ratio = 1,8).
Construction de la bangue de gènes de M. paratuberculosis
La méthode utilisée était fondée sur les protocoles décrits par Young et al (Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 8J2: 2583-2587) modifiés par Murray et al (NZ Vet. J. (1989) 37: 47-50) . La banque contenait 2,2.105 bactériophages recombinants. Après amplification dans E.coli Y1090, les recombinants représentaient approximativement 85% et correspondaient à un titre de 3.1011 PFU/ml.
Criblage de la bangue lambda gtll de M. paratuberculosis
La banque a été criblée par hybridation différentielle de l'ADN obtenu par transfert sur membrane à partir des boîtes de pétri contenant les phages de lyse (Young et al précité) en utilisant l'ADN chromosique complet de M. paratuberculosis (Mptb) et de M. phlei à titre de sondes. Le bactériophage recombinant qui a donné un signal positif après hybridation avec l'ADN de Mptb mais n'a pas hybride avec M. phlei a été conservé pour des analyses ultérieures. Il a été propagé en utilisant la méthode de lysat sur plaque telle que décrite par Maniatis et al (J. Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. N.Y. (1982)).
Manipulation de l'ADN
Les fragments d'ADN ont été séparés sur gels d'agarose à 0,8% ou 1% contenant 0,5% de bromure d'éthidium. L'ADN a été élue à partir des gels et purifié en utilisant le kit Geneclean II (BiolOl Inc La Jolla) selon les indications du fabricant.
Le clonage des fragments dans des plasmides et la transformation de E.coli ont été réalisés en utilisant les techniques standard de Maniatis et al publication précitée. La transformation de mycobactéries a été réalisée selon la description de Ranes et al précité.
Détermination de la séquence nucléotidique
L'ADN a été coupé au hasard par sonication et les fragments ont été clones en aveugle dans M13. Les clones ont été séquences par la méthode dideoxy de terminaison de chaîne en utilisant le kit Sequenase (USB) et le 7-deaza-dGTP, analogue du dGTP. Des chevauchements et l'analyse des données de séquences à partir des fragments obtenus au hasard ont été effectués en utilisant les programmes d'ordinateur décrits par Staden et al (Nucleic Acids Res. (1986) 14: 217-231) . Préparation de l'ARN
Une culture de 100 ml de souches M. smegmatis MYC760 a été cultivée jusqu'à la phase de mid-log dans un milieu 7H9, complété avec un enrichissement ADC Middlebrook (Difco) plus 25 μg/ml de kanamycine à 37βC. Les cellules ont été collectées après centrifugation, lavées avec le même milieu de croissance frais et resuspendues dans un milieu contenant 1% (p/v) de sulphonate de sodium triisopropylnaphthalène, et 6% (p/v) de 4-amino salycilate de sodium. 14 g de billes de verre (4,5-5,5 mm) ont été ajoutés, le mélange a été agité vigoureusement dans un appareil vortex pendant deux fois 2 minutes. Le surnageant a été extrait deux fois avec du phénol/chlorophorme et les acides nucléiques à l'intérieur de la phase aqueuse ont été précipités avec du propan-2-ol, en présence d'acétate de sodium 0,3 M à pH 6. Après la centrifugation pendant 10 minutes à 8000 rpm, le culot de centrifugation a été lavé avec 100% d'éthanol, séché à température ambiante pendant 10 minutes, et resuspendu dans 1 ml d'eau distillée traitée avec du DEPC. L'ARN a été précipité en présence de trois volumes d'acétate de sodium 4 M (pH 6) à -20°C pendant 18 heures, collecté par centrifugation et resuspendu dans de l'eau distillée (densité optique DO 260/280 2,0). L'ARN a été conservé à -20βC sous forme d'un précipité dans le propan-2-ol.
Cartographie des transcripts
Le plasmide pAM311 a été linéarisé avec BssHII pour produire des extensions 5' , et déphosphorylé avec de la phosphatase alcaline d'intestin de veau. Après purification du plasmide avec le kit Geneclean, l'ADN a été coupé avec l'enzyme de restriction PstI et le fragment de 3,1 kb a été isolé à partir du gel d'agarose 1%. L'extrémité 5* hydroxyle a été radiomarquée avec de l'ATP (gama32P) (activité spécifique 3000 Ci/nmol) en utilisant la polynucléotide kinase (10 unités) . Le marqueur non incorporé a été retiré par . passage à travers une colonne Nick (Pharmacia) .
L'ARN (40 μg) et la sonde d'ADN radiomarquée (0,1 μg) ont été mélangés dans un volume total de 30 μl d'eau distillée, 240 μl de formamide déionisé ont été ajoutés et le mélange a été chauffé à 100*C pendant 3 minutes. Après refroidissement rapide sur la glace, 30 μl de tampon d'hybridation 10 X (0,2 M PIPES-NaOH, pH 6,4, NaCl 4M, EDTA 20mM) ont été ajoutés et l'incubation a été poursuivie à 60"C pendant 3 heures. Les hybrides ADN/ARN ont été précipités avec trois volumes d'éthanol à -20'C pendant 16 heures. Après la centrifugation pendant 15 minutes à 4"C, le culot d'acide nucléique a été resuspendu dans 100 μl de tampon contenant de l'acétate de sodium 50 mM à pH 4,6, du NaCl 280 mM du ZnCl2 5 mM et 20 μg par ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. 2 μl de nucléase SI (472 unités) ont ensuite été ajoutés et la digestion a été poursuivie pendant 30 minutes à 20"C. La réaction a été arrêtée par addition de 25 μl d'une solution contenant du CH3COONH4 2,5 M et de l'EDTA 50 mM à pH 8. Les hybrides ADN/ARN ont précipité avec du propan-2-ol en présence de 1 μg d'ADN porteur (carrier) (ADN de sperme de saumon dénaturé) . Après un lavage dans 80% d'éthanol, le culot a été resuspendu dans 5 μl d'eau distillée et 7 μl de solution stop (95% v/v formamide, EDTA 20mM, 0,05% bleu de bromophénol, 0,05% Xylene cyanol FF) . Le mélange a été chauffé à 100"C pendant 5 minutes et ensuite chargé sur un gel de séquençage à 6% de polyacrylamide.
Tests sérologigues
Des sérums murins ont été testés par ELISA pour détecter des anticorps spécifiques dirigés contre la 9-galactosidase selon la technique suivante : des plaques microtitrées à 96 puits (Nunc) ont été recouvertes avec 10 μg/ml de 8-galactosidase purifiée dans du tampon PBS pendant 1 heure à 37*C et pendant 16 heures à 4°C. Après lavage trois fois avec du PBS contenant 0,1% de Tween 20, les sérums préabsorbés avec les extraits de BCG pendant 16 heures à 4*C ont été ajoutés aux puits dans un tampon de dilution (PBS + 0,1% de Tween 20, 1% de BSA) pendant 2 heures à 37"C. Après trois lavages, les titres en anticorps ont été déterminés par photométrie à 405 nm en utilisant une IgG de lapin anti-souris conjuguée à de la phosphatase alcaline (Biosys, Compiègne) et 1 mg/ml de phosphate de p-nitrophenyl à titre de substrat.
Test ff-galactosidase
L'activité 8-galactosidase a été mesurée dans des cellules E.coli traitées avec du toluène et dans des extraits de M. smegmatis soumis à un traitement aux ultrasons de selon la description de Cossart et al (J. Bacteriol. (1985) 161: 454-457).
Immunisation des animaux
Des souris femelles Balb/c, âgées de 6 semaines ont été obtenues de Iffa Credo. De façon à suivre les réponses immunitaires cellulaires, les souris ont été inoculées par voie sous-cutanée (SC) à la base de la queue avec 107 unités formant des colonies (CFU) de souches de BCG. Les cellules des ganglions lymphatiques ont été prélevées 14 jours après l'immunisation et les réponses prolifératives ont été étudiées. Un groupe contrôle de souris a reçu de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) dans une solution saline. Pour suivre la production dranticorps, un groupe de souris a été inoculé par voie intraveineuse (iv) avec 5.106 CFU des souches de BCG. Certaines souris ont subi un rappel de l'inoculation intraveineuse, trois fois à 21 jours d'intervalle avec 106 CFU ; les échantillons de sérum ont été prélevés 28 jours après l'immunisation et 14 jours après chaque rappel pour titrer les anticorps.
La stabilité des différentes souches de BCG a été anlysée par détermination du nombre de CFU BCG récupérées à partir de la rate deux mois après l'inoculation (iv) de 107 CFU de BCG.
Réponses prolifératives aux antigènes spécifigues
14 jours après l'immunisation, les suspensions cellulaires ont été préparées à partir des ganglions lymphatiques inguinaux (LN) prélevés à partir de trois souris et resuspendus dans du RPMI1690 (Gibco) contenant de la L-glutamine 2 mM, de la gentamicine 50 μg/ml, 5.105 M 2-mercaptoethanol et 10% de sérum de veau fétal (FCS) . Les cellules LN ont été cultivées à une concentration de 4.105 cellules par puit dans des plaques de culture à fond plat contenant 96 puits (Corning) en présence d'un antigène approprié. La concentration des antigènes utilisés était la suivante : 0,01 μg/ml de APH3' et 3-galactosidase et de 10 μg/ml d'un dérivé de protéine purifiée (PPD) . A titre de contrôle de réaction positive non spécifique, la concanavaline A (ConA) a été ajoutée à une concentration de 2,5 μg/ml. Certaines suspensions cellulaires sont restées non stimulées; Chaque test a été réalisé en trois exemplaires. Les cultures ont été incubées pendant cinq jours à 37*C, les dernières 22 heures en présence de thymidine méthyl tritiée (3H dThd lmCi = 37KB2 Amersham) 0,4 uci/puit dans une atmosphère d'air humidifié contenant 7% de C02. Les cellules ont ensuite été récoltées sur des filtres en fibre de verre (Automash 2000 Dynatch) et la radioactivité incorporée a été mesurée. Les résultats sont exprimés en fonction des coups par minute (cpm) moins le bruit de fond. Les erreurs standard de la moyenne pour les cultures en tripticat ont été déterminées. Les valeurs du bruit de fond des cultures contrôle non stimulées étaient inférieures à 104 cpm.
Anticorps monoclonaux anti-CD4 et anti-CD8
Afin de déterminer le ratio du sous-groupe de cellules T impliquées dans la prolifération, des anticorps monoclonaux contre les sous-groupes de cellules T ont été ajoutés aux cultures de cellules LN à différentes concentrations. Le L3T4 (CD4+) hybridome GK 1-5 de rat anti-souris CD4+ spécifique et LYT2 (CD8+) (hybridome H35 17-2 de rat anti-souris CD8+ spécifique) ont été produits selon la méthode décrite par (Dialynas D.P. et al, 1984, J. of Immunology Tome 31, p 2445-2451) . En bref pour obtenir des ascites d'anticorps monoclonaux, des souris nude ont été inoculées une première fois avec des cellules correspondant à 106 hybridomes. Les anticorps ont été collectés par précipitation dans le sulfate d'ammonium. La quantité de protéines a été testée par densité optique à 280 nm.
Mesure des cytokines
La synthèse d*interféron-gama a été mesurée dans le surnageant des cultures de cellules LN à la fin du test de prolifération. Le niveau d'interféron-gama a été déterminé par un test immunoenzymatique en phase solide en utilisant le principe du sandwich multiple (Genzyme) . Le surnageant a été dilué (1/2-1/10) . L'interféron-gama standard a été dilué pour obtenir des valeurs à l'intérieur de l'intervalle linéaire du test (128-8200 pg/ml) .
R E S U L T A T S
Isolement et caractérisation des bactériophages recombinants
Une banque genomique lambda gtll a été construite pour isoler des séquences spécifiques de M. paratuberculosis (Mptb) . Un phage recombinant qui hybridait fortement avec l'ADN chromosique de Mptb mais pas avec l'ADN de M. phlei a été repris individuellement et utilisé pour préparer les stocks de lysats de phages (Maniatis et al précité) . L'un de ces recombinants a été sélectionné au hasard pour des tests supplémentaires. Son génome contient une insertion de 3,8 kb. L'ADN de mycobactéries a été récupéré à partir de ce fragment par digestion avec les enzymes de restriction EcoRI et BamHI. Ceci a conduit à l'obtention de quatre fragments qui ont été séparés sur gel d'agarose. L'un de ces fragments, de 1,6 kb, a été élue à partir du gel et ligaturé au plasmide pGEM-2 digéré par EcoRI/BamHI. Des cellules compétentes de E.Coli DH5 alpha (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg MD USA) ont été transformées avec le mélange de ligation selon les instructions du fabricant puis ont été appliquées sur des plaques avec un milieu LB contenant 100 μg/ml d'ampicilline. Une seule colonie a été sélectionnée et utilisée pour préparer une quantité suffisante du plasmide recombinant qui a été désigné par pAM3, en utilisant la technique standard décrite par Maniatis et al précité.
Lorsque pAM3 a été marqué avec le kit de sonde chimique (Promega) et utilisé en tant que sonde dans un test dot-blot, l'hybridation s'est produite uniquement avec l'ADN extrait de M. paratuberculosis. Les différents isolats de Mptb testés incluaient la souche type M. paratuberculosis, des isolats de 23 Mptb d'origine bovine, ovine et caprine et un isolât d'un patient humain présentant la maladie de Crohn. Le plasmide pAM3 n'a pas hybride avec M. avium serovar 2 et 3, M. intracellulare, M. tuberculosis souche H37Rv, M. bovis, M. phlei, M. smegmatis ou N astéroïdes.
Analyse de séguence
La séquence nucléotidique du fragment BamHI/PstI de 716 bp est reportée à la figure 2. L'analyse de la séquence pour rechercher les signaux consensus pour le début de la transcription et de la traduction a permis de montrer une région potentielle à -35 (position 83-88) une région à -10 (position 106-111) et une séquence de Shine Dalgarno (SD) à la position 147-152. Une longue phase ouverte de lecture (ORF) désignée par ORF2 suit la séquence SD avec un codon d'initiation ATG en position 160. L'analyse de la séquence nucléotidique du fragment a révélé une homologie avec l'élément d'insertion IS900 M. paratuberculosis. Le segment 153-716 était identique à la séquence ntl451 à 888 de IS900 (Green et al (1989) Nucl. Acids. Res. 17: 9063-9073) . ORF2 est dans la direction opposée à la transcription de la transposase potentielle de cet élément, orfll97. Le segment 1-152 est en dehors de la séquence de IS900.
orf2 ne présente pas de similitude avec d'autres séquences si l'on se reporte aux séquences contenues dans les bases de données. Lorsque IS900 est utilisé comme sonde genomique pour des tests de Southern blot de différents isolats de Mptb, des schémas de bandes multiples presque identiques sont obtenus, indépendamment de l'origine des isolats (McFadden et al (1987) J. Clin. Microbiol. 25: 796-801) . Cette absence de polymorphisme suggère que IS900 s'intègre de façon prédominante au niveau de sites spécifiques à l'intérieur du génome de Mptb. Un nombre limité de séquences adjacentes à la terminaison de IS900 a été rapporté, il semble contenir des séquences nucléotidiques conservées (Green et al (1989) Nucl. Acids Res. 17: 9063-9073) . La séquence de Shine Dalgarno (SD) AAGGAG présentée à la figure 2 est adjacente à l'élément IS. La séquence inverse complémentaire de cette séquence SD (CTCCTT) est identique à la séquence flanquante,rapportée pour IS900 contenue dans le clone pMB22 dérivé de la banque genomique de l'isolât humain provenant d'un patient malade de la maladie de Crohn de Mptb.
Analyse et expression de ORF2 Pour étudier l'expression de ORF2 à un niveau transcriptionnel et traductionnel, le fragment BamHI/PstI de 716 bp de pAM3 a été clone dans entre les sites BamHI et PstI du fragment contenant plusieurs sites de clonage (MCS) du plasmide pNM482 (Minton et al (1984) Gène 3_1: 269-273) . Le MCS est adjacent d'un gène tronqué de 0-galactosidase (lacZ) dépourvu de ses 8 premiers acides aminés terminaux et de ses signaux de départ de transcription et de traduction. L'introduction d'un segment correctement aligné contenant des signaux de régulation appropriés et une séquence en aval codante, permet la formation d'un gène hybride qui confère le phénotype LacZ*. orf2 était en phase relativement au gène lacZ dont la construction décrite plus haut et le produit de traduction auraient dû pouvoir être exprimés sous forme d'une protéine de fusion orf2-?-galactosidase contenant 185 acides aminés de orf2. Cependant la transformation de E.coli MC1061 n'a pas produit de colonies transformées par Lac*. L'expression du gène de fusion orf2-lacZ dans un système mycobactérien a été étudiée. En conséquence le fragment de 3,8 kb Smal/Dral contenant le gène de fusion a été ligaturé sous forme de fragment à extrémité franche, au site Seal du plasmide pRR3, plasmide navette entre les mycobactéries et E.coli pour produire pAM320. La transformation de M. smegmatis avec ce plasmide par électroporation suivie d'une culture en présence de kanamycine et de X-gal a conduit à l'obtention de colonies bleues apparaissant dans les trois jours. Une expérience similaire pour transformer le BCG avec ce plasmide a également permis d'obtenir des colonies bleues qui sont apparues approximativement dans les 21 jours. Ainsi orf2 a pu être exprimé sous forme d'une protéine de fusion avec la ,9-galactosidase. Afin de quantifier l'expression de orf2, le niveau d'activité de la ^-galactosidase a été mesuré dans M. smegmatis et dans E.coli transformés avec pAM320 ou avec pRR3. Les résultats sont donnés dans le tableau III. 250 unités ont été trouvées dans M. smegmatis transformée avec pAM320 hébergeant le gène de fusion orf2-lacZ mais aucune activité trouvée dans la souche M. smegmatis transformée avec pRR3. Dans les souches E.coli transformées avec pAM320, un faible niveau d'activité a seulement été trouvé (5/7 unités). Ces résultats montrent que la fusion orf2-lacZ n'est pas exprimée dans E.coli et suggère que orf2 doit être spécifiquement exprimé dans les mycobactéries.
Analyse de transcription
Le site de départ de la transcription du gène de fusion orf2-lacZ à l'intérieur de pAM320 a été déterminé par cartographie haute résolution avec la nucléase SI. Les expériences ont démontré que le site de départ de la transcription de la séquence est situé en amont de orf2 à la position 119 (figure 4) . Un second site de démarrage est présent à l'extérieur de la séquence de mycobactéries. Deux explications peuvent être trouvées à cette observation. Tout d'abord ceci peut être dû à une hybridation de la sonde avec une petite quantité de plasmide navette qui a été co- précipité pendant la préparation de l'ARN, sinon ceci peut être dû à la lecture des résultats de transcription par l'intermédiaire du gène de résistance à 1•a picilline de pRR3. Ces résultats ainsi que l'expression de la protéine de fusion avec la β- galactosidase indiquent que l'élément promoteur Pan qui est adjacent à l'élément IS900 est capable de contrôler l'expression de orf2. Il s'agit là de la première démonstration de l'induction de l'expression d'un gène localisé à l'intérieur d'une séquence d'insertion, au moyen d'un promoteur chromosomique adjacent.
Construction de l'opéron de fusion orf2-lacZ
Afin de caractériser de façon plus précise l'activité du promoteur pan, orf2 a été délété et un opéron de fusion avec le gène lacZ a été construit (figures 7, 8, et 9) .
pWR32 et pWR33 sont des recombinants de pRR3 contenant la fusion pan-LacZ dans les deux orientations (figure 9) . La transformation soit de E. coli soit de M. smegmatis avec ces constructions, suivie d'une culture en présence de kanamycine et de X-gal a conduit à l'obtention de colonies bleues pour les deux espèces de bactéries. Ainsi pan est fonctionnel dans E.coli lorsqu'il est présent dans un opéron de fusion avec Lac-Z mais il n'est pas fonctionnel lorsqu'il est présent dans un gène de fusion avec orf2.
pWR32 a induit le même niveau d'activité β- galactosidase dans M. smegmatis que pAM320. Cependant le niveau d'activité avec pWR33 était 10 fois plus fort dans E.coli. Ceci doit être dû à l'activité constitutive d'un promoteur en amont du gène de fusion pAM-lacZ.
Réponse immunitaire cellulaire spécifigue
Des souris Balb/c ont été inoculées par voie sous-cutanée avec des recombinants BCG hébergeant le plasmide pAM320 exprimant la phosphotransférase APH3' sous le contrôle de sa propre région de régulation et lacZ sous le contrôle de pan. Les réponses prolifératives des cellules LN prises 14 jours après l'immunisation ont été analysées. Une réponse spécifique à une stimulation in vitro avec différents antigènes a été observée (figure 4) . Seules les cellules LN de souris immunisées avec r-BCG exprimant lacZ et APH3' ont proliféré en réponse à une stimulation in vitro par la j8-galactosidase et par l'aminoglycoside phosphotransférase (APH31). La prolifération cellulaire en réponse à un extrait de PPD (Protein Purified Derivative) a été similaire avec les cellules LN des souris immunisées avec la souche BCG non recombinante. Les cellules LN des animaux non immunisés ont proliféré uniquement en réponse à ConA. Cette prolifération non spécifique était du même ordre d'amplitude dans tous les groupes d'animaux.
On a démontré que les cellules T CD4+ et CD8+ sont impliquées dans les réponses prolifératives décrites plus haut par l'inhibition alternative de la prolifération, avec des anticorps monoclonaux anti-CD4+ et anti-CD8+. Les résultats apparaissent à la figure 5. Une inhibition de 70% de la réponse spécifique à la β- galactosidase est observée après l'addition d'anticorps anti-CD4 aux cultures de cellules LN. Dans des expériences similaires, une inhibition de 30% a été observée après addition des anticorps anti-CD8 aux cultures. Ces résultats montrent que la plus forte réponse est obtenue par le sous-groupe des cellules T CD4+. Deux populations différentes de cellules T CD4+ participent à la régulation de la réponse immune chez les souris. Un sous-groupe de cellules T CD4+ désigné par THl produit de l'interleukine-2 (IL2) et de 1*interferon-gama et active préférentiellement les macrophages pour tuer ou pour inhiber la croissance intracellulaire de l'agent pathogène. Un autre sous- groupe de cellules T CD4+ qui est désigné par TH2 produit d'autres lymphokines incluant 1»IL4, l'IL5, et est impliqué dans l'induction des réponses humorales. Une production significative d'interferon-gama a été détectée dans le surnageant des cultures de cellules LN stimlulées avec des antigènes spécifiques (figure 6) . Ces valeurs étaient légèrement plus basses que celles obtenues après la stimulation avec PPD ou conA. Cependant elles restent significatives puisque la valeur plancher des courbes standard était 100 pg/ml. La production d'interferon-gama par les cellules LN isolées à partir des animaux immunisés avec du BCG non recombinant a été uniquement observée après stimulation in vitro avec du PPD ou ConA.
Réponse en anticorps
Du sang a été prélevé quatre semaines après l'inoculation intraveineuse avec les deux souches de BCG et 14 jours après chacun des rappels iv. Les anticorps dirigés contre la jS-galactosidase ont été détectés par un test ELISA à partir de sérums d'animaux immunisés avec le r-BCG, exprimant la /9-galactosidase (figure 3) . Une augmentation de la réponse en anticorps a été observée après les différents rappels. Les résultats apparaissent sur la figure 11. Une augmentation importante du taux d'anticorps est observée après le premier puis le deuxième rappel. Un troisième rappel ne provoque pas d'augmentaiton du taux d'anticorps. Les anticorps dirigés contre la β- galactosiάase sont détectés dans les sérums d'animaux immunisés avec du BCG non recombinant. Cette réponse est beaucoup plus faible que la réponse induite par r- BCG exprimant la 0-galactosidase et peut être due à une activation polyclonale par le BCG. Aucun anticorps n'a été détecté chez les souris non immunisées. Ces résultats démontrent que la réponse humorale peut être déclenchée par le r-BCG exprimant un antigène étranger (hétérologue) sous le contrôle de pan. La β- galactosidase a été choisie comme système modèle mais elle peut être remplacée par tout type d'antigène intéressant à des fins de vaccination.
Stabilité in vivo des différentes souches de r-BCG
Les bacilles de BCG ont été récupérés à partir d'homogénats de rate deux mois après l'inoculation i.v. Le tableau II montre que les différents clones r-BCG utilisées dans cette étude ont un comportement similaire à celui de la souche de BCG non recombinant. Après étalement des souches r-BCG sur des milieux contenant de la kanamycine et X-gal 2,0.105 CFU bleues ont été obtenus par comparaison avec 7,4.105 CFU après culture dans un milieu en l'absence de sélection par la kanamycine. Donc envion 27% de la population r-BCG' est stable après deux mois de croissance in vivo. Cette proportion doit permettre la multiplication et la persistance du BCG dans les macrophages de l'organe cible, qui sont requises pour une stimulation immunogène à long terme.
Conclusion
Les résultats présentés ici démontrent que les souches de r-BCG hébergeant des plasmides codant pour APH3' sous sa propre région de contrôle et la β- galactosidase sous le contrôle de pan peuvent déclencher des réponses immunitaires cellulaire et humorale, spécifiques de ces antigènes, chez la souris. Ces antigènes polypeptidiques sont localisés dans le cytoplasme de r-BCG . Comme on l'a déjà décrit pour le BCG, les dérivés de r-BCG doivent se multiplier à l'intérieur des macrophages et présenter les peptides de la 3-galactosidase en association avec les molécules du CMH. Ceci conduit à la reconnaissance par les lymphocytes T qui répondent en proliférant. Les cellules LN ont montré une forte prolifération en réponse à une stimulation in vitro. Les cellules T CD4+ et CD8+ se sont avérées impliquées dans la réponse proliférative avec un pourcentage de 70% de cellules CD4+ et 30% de cellules CD8+. La production d'inféron- gama suggère un rôle efficace du sous-groupe de cellules THl. Ces cellules sont responsables de l'activâtion des macrophages requise pour l'élimination des agents pathogènes intracellulaires. Les titres en anticorps trouvés suggèrent également la coopération du sous-groupe de cellules T désigné par TH2 qui joue un rôle dans l'induction des réponses humorales.
Le fait que 27% de ces souches r-BCG sont récupérées sans réarrangement majeur, après deux mois de croissance in vivo chez les souris suggère qu'elles vont permettre l'induction d'une réponse immune à mémoire. Le clonage ultérieur des antigènes sur le chromosome en utilisant différentes méthodologies telles que la transposition, la recombinaison homologue, l'intégration médiée par un phage ou un plasmide permettront la construction de souches de r- BCG ayant une stabilité encore plus satisfaisante et induisant des réponses immunes plus persistantes à long terme dues à une stimulation continue. Tableau I
Souches bactériennes, phagea et plasmides
Bactéries Description Source ou Référence
M. paratuberculosis Souche bactérienne isolée chez un Université de Massay bovidé ayant la maladie de Johnes Nouvelle Zélande M. smegmatis mc2155 Mutant de me6 à haute efficacité Snapper et al de transformation M. bovis BCG Souche Pasteur BCG 1173P2 Institut Pasteur Paris E.coli Y1090 Souche réceptrice pour Commercialisé par Pro ega lambda gtll E.coli MC1061 Souche réceptrice pour la trans¬ Maniatis et al formation par les plasmides se répliquant chez E.coli
E.coli DH5α Souche réceptrice pour la trans¬ Maniatis et al formation par les plasmides se répliquant chez E.coli
Phage
Mptq lamda gtll Banque d'ADN genomique de Mptb Murray et al pUC1B Vecteur à nombre de copies élevé Murray et al
Souches bactériennes, phages et plasmides
(suite)
Bactόries Description Source ou Référence
pGEM-2 Vecteur plasmidique à nombre de Commercialisé par Promega copies élevé pNM482 Vecteur pour la détection de Minton et al promoteur pRR3 Vecteur navette E.coli- Ranes et al mycobactérie pAM-3 Recombinant pGEM-2 contenant un Décrit dans le texte fragment EcoRI/BamHI de 1,6 kb de Mptq pAM310 Recombinant pNM482 contenant un Décrit dans le texte fragment BamHI/PstI de 716 bp de pAM-3 pAM320 Recombinant pRR3 contenant un Décrit dans le texte fragment Dral/Smal de 3,8 kb de pAM310 pAM311 Recombinant pUCtβ contenant un Décrit dans le texte fragment BamHI/PstI de 716 bp de pAM-3 pAM312 Recombinant pUC18 contenant un Décrit dans le texte fragment EcoRI/BamHI de 1,6 kb de Mptq
Bouches bactériennes, phagea et plasmides
(suite)
Bactéries Description Source ou Référence
pSL 1180 Dérivé de pUC1β Pharmacia pWR30 Recombinant pSL 1180 contenant Décrit dans le texte le produit de digestion par PCR de Xbal/Ndel (168 bp) pTGT 959 Plasmide contenant le promoteur Transgene PL de lambda pIpJNI Recombinant pNM482 contenant le Décrit dans le texte fragment Xhol/BamHI de pTG 959 pWR31 Recombinant pIpJN contenant le Décrit dans le texte fragment EcoRI/Blqll de pWR30 (159 Bp) pWR32 + pWR33 Recombinants pRR3 contenant le Décrits dans le texte fragment EcoRI/Dral (3,8 kb) de pWR31 dans les 2 orientations
Tableau II
Stabilité in vivo de r-BCG (+ pAM320)
BCG CFU's récupéré à partir d'homogόnats de moelle osseuse murine, 2 mois apràs l'inoculation IV avec ιo7 CFU Kan-Kanamycine
Tableau III
Activité θ-galactosidase (unités/mg*)
Organisme hôte recombinant
Poids sec, déduit à partir de la densité optique à 600 nm (1 mg [poids sec] par ml = 3,7 unités de densité optique à 600 nm) N.D = non donné Exemples d'utilisation du promoteur pAN associé à ORF2: expression d'antigènes viraux et induction de réponses immunitaires spécifiques par le BCG exprimant ces antigènes.
Le promoteur PAN associé à la phase ouverte de lecture ORF2 a été utilisé pour exprimer plusieurs antigènes viraux dans le BCG. Des réponses immunitaires dirigées contre ces antigènes viraux ont été observées après inoculation à la souris des souches de BCG les exprimant.
Dans ces tests l' on a testé l'expression des antigènes viraux de SIV souche Mac251 et de HIV. Les séquences de SIV ou de HIV sont données par rapport à la publication "Human retrovirus and AIDS 1991"( a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid séquences, edited by Myers G. et al, published by Theoritical Biology and Physics, Group T-10, Mail Stop K710, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico 87545 USA)
1) Le gène nef de SIV
L'intégralité du gène nef de SIV a été inséré au site PstI de ORF2. Pour ce faire, un fragment contenant le gène nef de SIV a été synthétisé in vitro par PCR. Deux oligonucléotides SN1 (5'CCCCTGCAGAGATCTATGGGTGGA- GCTATT3') et SN2 (5'AAAAAGCTrraAGCσiT rTCTAACTT3•) ont été synthétisés par la société APPLIGENE. Ils ont servi à amplifier le gène nef de SIV à partir du plasmide pTG3148 le portant et provenant de TRANSGENE (Figure 12) . Le fragment amplifié porte les sites de restriction PstI et HindIII. Il est coupé par les enzymes de restriction correspondantes et clone dans le plasmide b/pAM712 (figure 12). Le plasmide recombinant portant nef de SIV a été appelé pSN24. A partir de ce plasmide, le fragment Xbal/HindIII portant le gène nef de SIV a été coupé par les enzymes Xbal et HindIII, les extrémités ont été remplies par les enzymes de Klenow et le fragment résultant a été clone dans le site Scal de pRR3, dans les deux orientations. Les plasmides résultants ont été appelés pSN25 et pSN26.
Les plasmides pSN25 et pSN26 ont été transférés chez M.smegmatis et le BCG par électroporation. Le polypeptide fusion ORF2-Nef est repéré par western blot en utilisant des sera de singes infectés par SIV. (figure 13) . Après inoculation de souris par le BCG exprimant ORF2-Nef(SIV) , une réponse immunitaire de type cellulaire dirigée contre Nef(SIV) a été observée en utilisant des tests de prolifération des cellules des ganglions lymphatiques après stimulation par des peptides Nef(SIV) . Les peptides proviennent de l'ANRS. Ce sont les peptides 1-15; 16-30; 40-60 et 221-235, pour lesquels les numéros correspondent à la localisation de l'acide aminé N-terminal et de l'acide aminé C-terminal sur la protéine Nef entière. L'amplitude des réponses obtenues avec les différents peptides est indiquée sur la figure 14. Il est vraisemblable qu'il s'agit là de lymphocytes T(CD4) et T(CD8) comme nous l'avions montré précédemment pour Nef de HIV1.
2) Le gène βnv de H V1, souche MN.
Pour ce faire le clonage a été réalisé d'une façon similaire au clonage de nef de SIV. Le fragment de gène codant pour le polypeptide de l'acide aminé 242 à 335 de la protéine GP120 a été synthétisé in vitro par PCR. Deux oligonucléotides JENVMN3;5»CGACTGTAAAAATGTACTGACGTCCCCC3' et JENVMN4:5'TAAAAGCTTTTACTCGGTGTCGTTCGTGTC3' ont été synthétisés par APPLIGENE. Ils ont servi à amplifier le gène env à partir du plasmide pTG5167 construit par Transgène (Figure 15) . Le fragment amplifié porte les sites de restriction PstI et HindIII. Il est coupé par les enzymes de restriction correspondantes et clone dans le plasmide b/pAM712 entre les sites PstI et HindIII (Figure 16) . Le plasmide résultant a été appelé pLAll. Il contient une fusion de gène ORF2-env contenant les 554 pb correspondant à la partie N- terminale de ORF2 et les 686 pb correspondant à la partie N-terminale du gène env. La fusion PAN-ORF2-env a été excisée de pLAll par une double coupure par les enzymes BamHI et HindIII. Les extrémités du fragment ont été remplies par la polymérase de Klenow. Le fragment résultant a été clone dans pRR3 au site Seal, donnant naissance aux plasmides pLA12 et pLA13 suivant l'orientation de l'insert. Les plasmides pLA12 et pLA13 ont été introduits par électroporation dans M.smegmatis et dans le BCG. L'expression de la fusion ORF2-Env a été détectée à l'aide de western blot en utilisant l'anticorps monoclonal SC-D(K24-1) de l'HYBRIDOLAB. Comme le montre la figure 17, une expression de polypeptide fusion du poids moléculaire attendu (45,5kDa) est observée.
Des souris ont été inoculées avec le BCG exprimant la fusion ORF2-Env. Quinze jours après l'inoculation, une réponse proliférative in vitro des cellules des ganglions lymphatiques a été observée après stimulation par la protéine GP120 (Figure 18). Il est vraissemblable qu'il s'agit là aussi de lymphocytes T (CD4) et T (CD8) . D'autres souris ont été inoculées par voie IV, et un rappel a été effectué au bout de 28 jours. Le sang a été prélevé à différents moments après injection. Quinze jours après le rappel un taux d'anticorps élevé a été détecté par test ELISA, en utilisant la protéine GP120 ou des peptides correspondant à la partie de Env exprimée par le BCG (Figure 19) .
3) Le gène gag de HIV1 souche LAI.
En utilisant des constructions similaires à celles exposées ci-dessus, la partie du gène gag codant pour la protéine P24 (les 217 premiers acides aminés) du virus HIV1 LAI a été insérée au site Xhol interne à ORF2. Pour ce faire un fragment contenant le gène gag a été synthétisé in vitro par PCR en utilisant les oligonucléotides EML3:
5'GGGCGCGCTCTCGAGTATGAGAACTTTAAATGCA3' et EML5:5•GTTCGAATTCTCACAAAACTCTTGC3* et le plasmide pTG2103 construit par Transgène (Figure 20) comme matrice. Ce fragment contenant le gène gag a été coupé par les enzymes Xhol et EcoRI et clone entre les sites Xhol et EcoRI du plasmide pAMI (Murray et al, 1992), réalisant ainsi une fusion ORF2-Gag et donnant naissance au plasmide pLA21 (Figure 21) . A partir de ce plasmide le fragment BamHI/EcoRI portant la fusion ORF2-Gag a été excisé de pLA21 en coupant par les enzymes EcoRI et BamHI. Les extrémités du fragment ont été remplies par la polymérase de Klenow et le fragment résultant a été clone dans pRR3 au site Seal pour donner naissance aux plasmides pLA22 et pLA23. Ces plasmides ont été transférés par électroporation dans M.smegmatis et le BCG. La fusion ORF2-Gag est exprimée sous la forme d'un polypeptide de 46,5 kDa par M.smegmatis et le BCG (Figure 22).

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Séquence nucléotidique susceptible de permettre l'expression dans un hôte cellulaire d'un enchaînement nucléotidique donné, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence I choisie parmi : a) la séquence suivante ou toute partie de cette séquence susceptible d'intervenir dans l'expression d'un acide nucléique qui serait placé sous son contrôle.
GAT CCC GTG ACA AGG CCG AAG AGC CCG CGA CCG TGC GGT CGT CGA CGA
(-35) CCG AGT GTG AGC AGA CCC CCT GGT GAA GGG TGA ATC GAC AGG TAC ACA
(-10) +1
CAG CCG CCA TAC ACT TCG CTT CAT GCC CTT ACG GGG GGC GGC CAA CCC
AGA AGG AGA TTC TCA ATG ACG TTG TCA AGC CGC CGC GGT AGT GGT TGC SD
GGG GTG GTA GAC AGC GTG GTC GCG CAG CAT GGC CCA CAG GAC GTT GAG
GCG GCG GCG GGC CAG GGC GAG GAC GGC TTG GGT GTG GCG TTT TCC TTC
GGT GCG TTT TCG GTC GTA GTA GGT GCG CGA GGA GGG GTC GGT GCG GAT
GCT GAC CAA GGC CGA CAG GTA GCA GGC GCG CAG CAG GCG CCG GTC GTA
GCG TCG GGG GCG TTT GAG GTT TCC GCT GAT GCG GCC GGA ATC TCG TGG
TAC CGG CGC CAG GCC GGC GAC GCC GGC GAG GCG GTC GGC GGA GGC GAA
TGC GGC CAT GTC CCC GCC GGT GGC GGC GAG GAA CTC AGC GCC CAG GAT
GAC GCC GAA TCC GGG CAT GCT CAG GAT GAT TTC GGC GTG GCG GTG GCG
GCG AAA TCG CTC CTC GAT CAT CGC GTC GGT GTC GCC GAT TTC GGT GTC
GAG GGC CAT CAC CTC CTT GGC CAG GCG GGC CAC CAC AGT GGC CGC CAG
TTG TTG GCC GGG CAC GAT GCT GTG TTG GGC GTT AGC GGC CTG CA b) une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence a) .
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence II choisie parmi : a) la séquence nucléotidique suivante ou toute partie de cette séquence contenant le site d'initiation de la transcription (position +1) et des éléments nécessaires à la reconnaissance et à la fixation des ARN polymérases d'un hôte cellulaire déterminé qui serait transformé par cette séquence, ces éléments comprenant en particulier les séquences [TAC ACT] en position -10 par rapport au site d'initiation de transcription et [TC GAC A] en position -35 par rapport à ce site :
GAT CCC GTG ACA AGG CCG AAG AGC CCG CGA CCG TGC GGT CGT
CGA CGA CCG AGT GTG AGC AGA CCC CCT GGT GAA GGG TGA ATC
+1 GAC AGG TAC ACA CAG CCG CCA TAC ACT TCG CTT CAT GCC CTT
ACG GGG GGC GGC CAA CCC AGA AGG AGA TTC TCA
b) une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence a) .
3. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2, susceptible de permettre l'expression dans un hôte cellulaire d'un enchaînement nucléotidique donné, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence III choisie parmi : a) la séquence nucléotidique suivante :
TC GAC AGG TAC ACA CAG CCG CCA TAC ACT TCG CTT CA
b) une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence a) , c) toute partie de cette séquence intervenant dans l'activité de transcription d'un acide nucléique.
4. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'au moins la séquence comprise entre les positions +2 et +41 par rapport au site d'initiation de transcription, est remplacée pour tout ou partie, par une séquence exogène par rapport à la séquence présente naturellement en aval de la séquence III selon la revendication 3, cette séquence exogène comportant une séquence de Shine Dalgarno.
5. Séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et au moins une séquence d'acide nucléique, dont on souhaite obtenir le clonage et/ou l'expression dans un hôte cellulaire déterminé, sous le contrôle de ce promoteur.
6. Séquence recombinante selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'au moins une séquence d'acide nucléique à exprimer, placée sous le contrôle de la séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, code pour un peptide ou un polypeptide immunogène ou susceptible d'être rendu immunogène.
7. Séquence recombinante selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique à exprimer code pour un peptide ou un polypeptide d'un rétrovirus HIV, par exemple un peptide ou un polypeptide d'enveloppe, ou un peptide ou un polypeptide Nef, de HIV-1 ou de HIV-2.
8. Séquence recombinante selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique à exprimer est une séquence codante de mycobacterie, de préférence une séquence codant pour des protéines impliquées dans la virulence ou des antigènes à potentiel protecteur.
9. Séquence recombinante selon 1'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique à exprimer code pour un ou plusieurs épitopes déterminés.
10. Séquence nucléotidique recombinante selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 est placée en phase, en amont de la séquence d'acide nucléique à exprimer.
11. Séquence nucléotidique recombinante selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et la ou les séquence (s) d'acide nucléique à exprimer constituent un opéron de fusion.
12. Séquence nucléotidique recombinante selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisée en ce que le promoteur et la ou les séquence (s) d'acide nucléique à exprimer constituent un gène de fusion.
13. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour le clonage et/ou l'expression de séquences d'acide nucléique, dans un hôte cellulaire différent de Mptb, en particulier chez des Actinomycètes et notamment chez M. bovis par exemple chez la souche avirulente BCG, chez des bactéries Gram-négatives telles que E.coli ou chez des bactéries Gram-positives telles que B. subtilis.
14. Vecteur de clonage et/ou d'expression, de type intégratif ou de type réplicatif, caractérisé en ce qu'il comprend, en un site non essentiel respectivement pour son intégration ou pour sa réplication, une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
15. Vecteur de clonage et/ou d'expression, de type intégratif ou de type réplicatif, caractérisé en ce qu'il est modifié en un site non essentiel respectivement pour son intégration ou pour sa réplication, par une séquence nucléotidique recombinante selon l'une quelconque des revendications 5 à 12.
16. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une partie de la séquence de Mptb désignée par ORF2, en aval de la séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
17. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide, d'un transposon ou d'un phage.
18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est contenu dans la souche E.coli contenant le fragment de 716pb (Pstl/BamHI) clone dans le vecteur pUC18, déposée à la Collection Nationale des Microorganismes, le 23 Octobre 1991 sous le n" 1-1157.
19. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 est en amont de la ou des séquence (s) d'acide nucléique qu'il contrôle.
20. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 est en aval de la ou des séquence (s) d'acide nucléique qu'il contrôle.
21. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisé en ce qu'il comporte un marqueur d'expression.
22. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 14 à 21, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des éléments de régulation de l'expression dans un hôte cellulaire donné de la ou des séquence (s) d'acide nucléique qu'il contient.
23. Hôte cellulaire recombinant, caractérisé en ce qu'il est transformé par une séquence nucléotidique recombinante selon 1'une quelconque des revendications 5 à 12 ou par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 14 à 22, dans des conditions permettant l'expression de la (des) séquence (s) d'acide nucléique contenue (s) dans la séquence recombinante ou dans le vecteur.
24. Hôte cellulaire recombinant selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il permet l'exposition à sa surface, voire l'exportation, la sécrétion ou l'excrétion du produit d'expression de la (des) séquence (s) d'acide nucléique qu'il contient.
25. Hôte cellulaire recombinant selon l'une quelconque des revendications 23 ou 24, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche d'Actinomycète, de préférence une souche avirulente de M. bovis telle que la souche BCG.
26. Hôte cellulaire recombinant selon l'une quelconque des revendications 23 ou 24, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie à Gram-négatif, par exemple E.coli.
27. Hôte cellulaire recombinant selon l'une quelconque des revendications 23 ou 24, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie à Gram-positif telle que B. subtilis ou Streptomyces.
28. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un hôte cellulaire recombinant selon 1'une quelconque des revendications 23 à 24 en quantité suffisante pour déclencher la production d'anticorps ou contribuer à la production d'anticorps de préférence protecteurs chez un hôte animal ou humain auquel elle est administrée et/ou d'une réponse immunitaire cellulaire, en particulier une réponse CTL.
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