î-lactamase recom-binante, utilisable en tant que molécule porteuse pour la préparation de compositions immunogènes.
La présente demande a pour objet de nouveaux moyens pour la préparation de compositions immunogènes et de préférence de compositions vaccinantes protectrices, susceptibles de se présenter sous forme de "vaccins vivants", de particules ou de molécules administrables à l'homme ou à l'animal.
L'un des buts de la présente invention est de proposer des moyens pour élaborer des compositions immunogènes susceptibles de déclencher chez l'homme ou chez l'animal une réponse immunitaire cellulaire et/ou humorale (par l'intermédiaire d'anticorps), contre des déterminants antigénigues et notamment des épitopes caractéristiques de différents agents pathogènes. Plus généralement 1'invention propose de nouveaux moyens pour déclencher ou favoriser une réponse immunitaire contre tout épitope déterminé pour produire des anticorps ou une réponse immunitaire cellulaire, et en particulier lorsque les déterminants antigéniques sont de type haptène et par conséquent incapables de déclencher par eux-mêmes cette réponse immunitaire. L'invention présente également un intérêt en vue de favoriser une réponse immunitaire suceptible d'être conférée par un antigène, et notamment d'en augmenter le niveau ou le caractère protecteur.
L'invention décrit à cet égard de nouvelles molécules susceptibles d'être utilisées comme vecteur de 1'antigénicité de différents épitopes, à la fois dans des compositions immunogènes contenant les molécules hybrides (recombinantes) ainsi formées ou dans des vaccins vivants.
Différents facteurs peuvent être déterminants dans le choix d'une molécule, en particulier d'une protéine capable de se comporter comme protéine porteuse (encore appelée vecteur) dans le but de conférer ou d'améliorer 1'immunogénicité d'un épitope hétérologue par rapport à cette molécule. On doit par exemple tenir compte des paramètres de taille de la protéine vecteur en tant que telle et de sa taille par rapport à celle de l'épitope qu'elle doit contenir ainsi que de la taille de 1'épitope en tant que tel. D'autres contraintes pour l'élaboration de vaccins, vivants ou non, faisant intervenir des molécules porteuses, sont par exemple 1'antigénicité de la molécule porteuse, sa toxicité pour un hôte cellulaire dans lequel elle serait produite ou pour le sujet auquel elle serait administrée. Il convient aussi de déterminer les sites potentiels d'insertion pour l'épitope, et de façon tout à fait importante lorsque cette protéine modifiée est utilisée dans le cadre de la préparation d'un vaccin vivant, sa capacité à être exportée voire sécrétée par l'hôte qui la produit, afin d'être accessible au système immunitaire du sujet auquel est administré le vaccin.
Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs se sont intéressés à des protéines de la famille des /3-lactamases, dont certaines propriétés ont été étudiées jusqu'à présent dans un contexte différent de celui de la présente invention.
Les 3-lactamases sont des enzymes réparties dans différentes classes, en fonction de leur activité enzymatique sur différents substrats. Elles sont produites par différents organismes et en particulier par des bactéries, par exemple des bactéries de type
E.coli, Staphylococcus aureus, ou encore par des mycobactéries. Ces enzymes sont étudiées pour leur capacité à protéger des bactéries contre les effets létaux des antibiotiques du type /3-lactams, et donc leur capacité à conférer à certaines bactéries la résistance à différents antibiotiques. C'est dans ce contexte d'étude de la résistance de bactéries aux antibiotiques que plusieurs auteurs ont publié des articles décrivant la purification de certaines β- lactamases.
Par exemple Choubey et al ont publié des résultats décrivant la purification jusqu'à l'homogénéité d'une 3-lactamase de Mycobacterium smegmatis (Microbiology, 1986, Vol.1 :171-175) . D'autres auteurs ont publié des données relatives à la caractérisation de la β- lactamase produite dans une souche de Mycobacterium fortuitum (J. Amicosante et al, Biochem. J., 1990, 271:729-734 ; L. Fattorili et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Septembre 1991, p. 1760-1764) . Dans cette seconde publication, les auteurs rappellent que les β- lactamases ont été décrites comme étant des enzymes périplasmiques chez les bactéries Gra - négatives. Chez les Grain-positives, puisqu'il existe une unique membrane cellulaire, ces enzymes sont exportées à la surface ou relarguées dans le milieu. Certaines sont retrouvées en grande quantité dans le milieu de culture, d'autres sont ancrées à la membrane bactérienne.Ces enzymes présentent un large spectre d'activité.
Le relargage de cette enzyme par les bactéries qui la produisent, serait donc lié en partie à des facteurs d'environnement ou à des facteurs propres à la
physiologie de la cellule productrice ou encore à des déterminants structuraux de la /3-lactamase.
Malgré les caractéristiques connues des β- lactamases, d'intervenir dans la résistance à certains antibiotiques, et en dépit du fait que le mode d'expression et notamment la possibilité de sécrétion de cette protéine par la cellule qui la produit n'étaient pas totalement caractérisés, les inventeurs se sont intéressés à la capacité de cette enzyme de se comporter comme un vecteur de 1'antigénicité d'un épitope qui lui serait hétérologue.
Par épitope hétérologue on entend ici une séquence d'acides aminés caractéristique d'une protéine et notamment d'un antigène différent d'une /3-lactamase, à tout le moins différent de la /3-lactamase choisie comme molécule porteuse.
Selon les inventeurs les propriétés connues de différentes /3-lactamases, telles que le fait qu'elles sont exportées et monomériques, ainsi que leurs propriétés structurales sont susceptibles de leur conférer de nombreux avantages pour être utilisées comme protéines vectrices de 1'antigénicité de différents épitopes. Elles se sont en outre révélées intéressantes dans le cadre de l'élaboration de vaccins vivants. Dans le but de définir les conditions à respecter pour la construction de protéines recombinantes à partir de la /3-lactamase, les inventeurs ont déterminé la séquence et 1 'organisation structurale du gène et prédit par modélisation la structure tridimensionnelle de la protéine /3-lactamase d'une mycobactérie, Mycobacterium fortuitum (désignée dans la suite M. fortuitum) . La connaissance de ce gène a permis de localiser des régions propres à contenir
compris entre les nucleotides 395 et 1274 de cette séquence.
Avantageusement, des séquences répondant aux définitions précédentes, sont constituées par les enchaînements nucléotidiques clones dans les plasmides contenus dans les souches E.coli déposées à la C.N.C.M. sous les numéros 1-1170 et 1-1171, ainsi que toute séquence nucléotidique hybridant dans des conditions stringentes avec ces enchaînements clones.
La séquence représentée à la figure 4 contient le gène codant pour la /3-lactamase de M. fortuitum, ainsi que les parties non codantes. La séquence nucléotidique du gène de la /3-lactamase de M. fortuitum n'est pas la seule séquence intéressante dans le cadre de 1 ' invention ; en effet des fragments ou partie de l'enchaînement représenté à la figure 4 peuvent être intéressants.
En particulier une séquence nucléotidique avantageuse dans le cadre de 1 ' invention est la séquence nucléotidique correspondant à l'extrémité 5' non codante du gène de la /3-lactamase, cette séquence contenant les signaux d'expression du gène de cette enzyme. Cette partie 5' de la séquence du gène peut être utilisée pour l'expression de séquences nucléotidiques variées dans des hôtes cellulaires de type mycobactéries. Elle convient par exemple pour l'expression dans des mycobactéries, de /3-lactamases issues d'organismes différents des mycobactéries, puisqu'elle contient des signaux d'expression reconnus par les mycobactéries.
D'autres fragments de la séquence nucléotidique représentée à la figure 4, utilisables dans le cadre de l'invention, sont les séquences codant pour une
8 protéine tronquée dont la structure globale est préservée, par rapport à la protéine native, en particulier dans des conditions telles que le produit d'expression de cette séquence nucléotidique est stable et notamment insensible aux protéases cellulaires de l'hôte qui le produit et/ou éventuellement du sujet auquel il est administré.
Par stabilité de la protéine on entend notamment la possibilité de la purifier ou la possibilité pour cette protéine d'être reconnue par un anticorps.
Une séquence nucléotidique avantageuse est une séquence présentant des similitudes avec l'enchaînement représenté à la figure 4. Par similitude, on entend notamment la capacité d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence de la figure 4.
Pour déterminer si une séquence nucléotidique est capable d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence codante contenue dans 1'enchaînement représenté à la figure 4, on peut mettre en oeuvre le test suivant :
On utilise par exemple une sonde déterminée à partir de 1 'enchaînement codant représenté à la figure 5 avec lequel on souhaite tester l'hybridation d'une séquence déterminée; cette sonde est marquée au 32p (106 cpm/ml) et on la met en contact avec la séquence testée pendant 16 heures à 65°C dans une solution d'hybridation (formamide 50%, 5 x SSPE, DNA de sperme de saumon 200 μg/ml et 10 x Denhart) . Les membranes sur lesquelles est réalisée l'hybridation sont ensuite lavées deux fois pendant 30 minutes avec une solution 1SSC, 0,1% SDS à te érature ambiante (20°C) puis lavées deux fois avec 0,1SSC, 0,1% SDS pendant 30 minutes à
0,1 x SSC :
NaCl : 15 mM
Na3 citrate : 0,1%
Selon une autre définition, une séquence nucléotidique de 1'invention est caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de type /3-lactamase comprenant l'enchaînement d'acides aminés représenté à la figure 4.
L'invention concerne par ailleurs une séquence nucléotidique recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend : une séquence nucléotidique répondant à l'une des définitions précédentes, codant pour une β- lactamase, modifiée par au moins un enchaînement nucléotidique hétérologue codant pour une séquence peptidique hétérologue comprenant au moins un épitope, la modification étant réalisée en au moins un site permettant, lorsque la séquence recombinante est exprimée, l'exposition de l'épitope à la surface de la /3-lactamase ou son accessibilité au solvant, une séquence nucléotidique répondant aux définitions précédentes, codant pour une β- lactamase tronquée, modifiée par au moins un
10 enchaînement nucléotidique hétérologue codant pour une séquence peptidique hétérologue comprenant au moins un épitope, la modification étant réalisée en au moins un site permettant, lorsque la séquence recombinante est exprimée, l'exposition de l'épitope à la surface de la /3-lactamase ou son accessibilité au solvant, et la protéine hybride exprimée conservant les caractéristiques structurales essentielles de la /3-lactamase native, en particulier celles qui lui confèrent sa reconnaissance par des anticorps dirigés contre le ou les épitopes, ou sa stabilité, lorsqu'elle est recombinée.
L'exposition au niveau de la protéine recombinante, de l'épitope hétérologue, correspond à l'accessibilité de cet épitope au solvant, en particulier aux molécules d'eau, ou à la disponibilité de cet épitope pour être présenté à des anticorps.
Selon la définition donnée dans le paragraphe précédent, la séquence nucléotidique codant pour la β- lactamase ou pour une /3-lactamase tronquée, peut être modifiée par au moins un enchaînement nucléotidique hétérologue. En effet de même que la taille de 1 *enchaînement nucléotidique hétérologue ne constitue pas un paramètre limitant a priori, on peut envisager d'insérer plusieurs séquences hétérologues au sein de la séquence codant pour la /3-lactamase ou pour une β- lactamase tronquée.
L'insertion de séquences hétérologues comprenant au moins un épitope et présentant une taille de quelques nucleotides peut paraître avantageuse dans la mesure où les problèmes pouvant résulter d'une déformation de la /3-lactamase modifiée codée par la
11 séquence nucléotidique recombinante de l'invention, sont limités. Cependant il est possible d'insérer en un ou plusieurs sites de la séquence nucléotidique codant pour la /3-lactamase, des enchaînements nucléotidiques hétérologues de séquences plus longues, dès lors qu'ils codent pour une séquence peptidique dont l'épitope ou les épitopes seront exposés à la surface de la protéine recombinante formée ou accessibles au solvant. De préférence l'hybride ainsi formé conserve les caractéristiques les plus importantes de sa structure, notamment sa capacité à être reconnu par des anticorps anti-/3-lactamase et des anticorps anti-séquence hétérologue, ainsi que sa capacité à être purifié.
Une protéine dite stable selon 1 ' invention présente au moins une des propriétés suivantes : l'activité enzymatique de la /3-lactaπtase, les cas échéant modifiée en intensité, la capacité à être reconnue par un anticorps notamment un anticorps anti-/3-lactaιnase, ou un anticorps dirigé contre un épitope hétérologue qu'elle contient, lorsqu'il s'agit de la protéine recombinante ou, une insensibilité à la dégradation par les protéases cellulaires, la possibilité d'être purifiée.
Différents enchaînements nucléotidiques hétérologues peuvent être choisis pour réaliser les séquences nucléotidiques recombinantes de l'invention. Un premier groupe d'enchaînements hétérologues est caractérisé en ce qu'il comprend des séquences codant pour un peptide ou un polypeptide, impliqué dans la virulence d'un agent pathogène ou de façon générale pour un antigène à potentiel protecteur contre un
12 facteur produit à la suite d'une infection. A cet égard une séquence caractéristique d'un organisme pathogène est par exemple une séquence de virus, de parasite, de bactérie ou de champignon (par exemple du genre Aspergillus) . En particulier on citera dans le cadre de la présente invention les séquences de bactéries telles que M. leprae, M. tuberculosis, M. intracellulare, M. africanum, M. avium, les bacilles responsables de la diphtérie, du tétanos, Salmonella, certains tréponèmes, la toxine de pertussis, des séquences d'autres microorganismes tels que les sporozoïtes et les mérozoïtes de plasmodium, les séquences de Leishmania ou Schistosoma, de Shigella, de Neisseria, de Borrelia, des séquences de virus notamment le virus des oreillons, de la rubéole, de la rougeole, de l'herpès, d'influenza, le virus de la rage, de la polio, de l'hépatite, du SIDA HIV, HTLV-I, HTLV-II et SIV ainsi que des virus oncogènes.
La séquence d'acide nucléique à exprimer peut aussi coder pour une séquence immunogène telle que celle de venin de serpent ou d'insecte.
A titre d'exemple un enchaînement nucléotidique hétérologue intéressant est par exemple un enchaînement codant pour une séquence peptidique d'un antigène de rétrovirus humain de type HIV, notamment un antigène d'enveloppe, de gag, nef ou pol d'un rétrovirus HIV-1 ou HIV-2.
D'autres séquences intéressantes sont les séquences immunogènes de mycobactéries, en particulier les protéines ou les fragments des protéines correspondant à des gènes impliqués dans la virulence et des antigènes à potentiel protecteur. Un antigène est dit à "potentiel protecteur" lorsqu'il est susceptible de déclencher ou de favoriser une réponse
13 immunitaire protectrice, en particulier par production d'anticorps ou par induction d'une réponse immunitaire à médiation cellulaire, en particulier de type CTL. Un tel antigène à potentiel protecteur peut être constitué par un épitope voire un haptène insuffisant en soi pour déclencher la réponse immunitaire.
L'invention permet ainsi la préparation de protéines recombinantes intéressantes notamment pour la constitution de compositions immunogènes, dans lesquelles l'épitope exposé à la surface de la protéine recombinante est caractéristique par exemple d'une hormone, ou de toute substance dont on cherche à atténuer, voire neutraliser les effets biologiques.
Avantageusement une séquence nucléotidique recombinante peut être constituée par une séquence nucléotidique codant pour la /3-lactamase ou une β- lactamase tronquée, telle que décrite précédemment dans laquelle serait inséré un enchaînement hétérologue codant pour la séquence peptidique V3 de l'antigène d'enveloppe des différents variants HIV-1 ou une séquence de plus grande taille de l'enveloppe d'un virus HIV. Cette séquence a été décrite dans la publication de K. Javaherian et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8_6:6768-6772, 1989). Avantageusement, l'enchaînement hétérologue codant pour la séquence peptidique V3 est inséré au site BglII de la séquence codant pour la β-lactamase.
L'invention vise également un vecteur recombinant • de clonage et/ou d'expression, réplicatif ou intégratif caractérisé en ce qu'il est modifié, en l'un de ses sites non essentiels pour sa replication ou son intégration, par une séquence nucléotidique recombinante ci-dessus décrite.
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De façon intéressante, la séquence nucléotidique recombinante contenue dans le vecteur est sous le contrôle du promoteur d'expression de la /3-lactamase correspondant à la séquence.
Lorsque ce vecteur est modifié par la seule séquence codante ou par une séquence codante partielle de la /3-lactamase, il peut comprendre également des signaux d'expression, de traduction et voire de sécrétion, d'origine différente de celle de la β- lactamase, choisis en fonction de l'hôte dans lequel on cherche à cloner ou à exprimer ce vecteur recombinant.
A titre d'exemple de vecteur pour la préparation de vecteurs recombinants selon l'invention, on peut citer les plas ides, les pliages ou les transposons.
En particulier un plasmide de l'invention est le plas ide pACYC184BlaM contenant le fragment SphI de l'enchaînement de la /3-lactamase de M. fortuitum présenté à la figure 4, et qui est déposé à la C.N.C.M. (Collection Nationale des Microorganismes, Paris, France) dans une souche E.coli HB101(pACYC184BlaM) , sous le numéro 1-1171 déposée le 11 Février 1992.
La plasmide pACYC184BlaM contient le fragment Sphl/SphI, d'environ 4,7 kb, de 1'ADN génomique de M. fortuitum D316 hybridant avec la sonde BlaOl. Ce fragment porte les 834 premières bases du gène codant pour une /3-lactamase de classe A, ainsi que ses régions régulatrices.
Le milieu de culture préconisé pour cette souche est un milieu L-Broth plus chloramphénicol (30μg/ml) et l'ensemencement est effectué sur milieu L-Broth, la température d'incubation étant d'environ 37°C sous agitation.
Un autre plasmide préféré selon 1rinvention contient le gène de la /3-lactamase de M. fortuitum ; il
15 s'agit du plasmide pIPJ39 contenu dans une souche de E.coli MC1061(pIPJ39) , déposée à la C.N.C.M. le 11 Février 1992 sous le numéro 1-1170.
Le plasmide pIPJ39 contient le fragment BamHI/BamIII, d'environ 6 kb, de 1'ADN génomique de M. fortuitum FC1 hybridant avec la sonde BlaOl. Ce fragment porte le gène codant pour une /3-lactamase de classe A, ainsi que des régions flanquantes.
Le milieu de culture préconisé pour cette souche est un milieu L-Broth plus ampicilline (lOOμg/ml) et l'ensemencement est effectué avec un milieu L-Broth et la température d'incubation est d'environ 37°C sous agitation.
L'invention a encore pour objet un hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il est transformé par une séquence nucléotidique recombinante décrite ci- dessus ou par un vecteur recombinant ci-dessus, dans des conditions permettant l'expression de la séquence nucléotidique recombinante sous la forme d'une protéine de fusion stable et son exposition ou son exportation, à la surface de l'hôte ou sa sécrétion dans le milieu extracellulaire.
De nombreux hôtes cellulaires peuvent être modifiés par une séquence nucléotidique recombinante ou un vecteur recombinant selon l'invention.
Un procédé adapté pour la préparation d'hôtes cellulaires recombinants selon l'invention est par exemple 1 'électroporation, conformément à la description de Snapper S. et al (1988, PNAS USA 85: 6985-6991) ou la conjugaison selon par exemple la technique de Lazraq R. et al (1990, FEMS Microbiol. Lett. 69_: 135-138) , ou selon la technique de Gormley E.P. et Davies J. (J. Bacteriol, 173:6705-6708) .
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Avantageusement on aura recours à des mycobactéries lorsque la séquence codant pour la β- lactamase est une séquence originaire de mycobactérie- En effet dans ce cas le transfert dans une souche de mycobactéries du gène codant pour une /3-lactamase de mycobactérie permet de faciliter l'expression de cette séquence, dans la mesure où les signaux de reconnaissance et d'expression, voire de sécrétion contenus dans le gène de la /3-lactamase sont reconnus par les mycobactéries hôtes. De façon générale on pourra avoir recours à une souche d'Actinomycètes et en particulier une souche avirulente ou rendue avirulente, en s'assurant que les signaux de reconnaissance sont appropriés pour l'expression de la séquence recombinante ou du vecteur recombinant introduit dans la souche.
De façon particulièrement préférée pour la réalisation de l'invention, on aura recours à la souche BCG. L'invention concerne donc une souche de BCG, transformée par une séquence nucléotidique recombinante ou un vecteur recombinant de l'invention permettant l'exposition à la surface de la cellule d'une protéine recombinante (protéine hybride) , dans des conditions assurant l'exposition de l'épitope ou des épitopes contre lesquels on cherche à induire une réponse immunitaire.
Une protéine hybride est dite exposée lorsqu'elle est extracellulaire mais qu'elle demeure ancrée en un point de la surface de la cellule qui la produit. De façon particulièrement intéressante on exprimera les séquences nucléotidiques de 1' invention de telle façon que les produits d'expression soient sécrétés à 1 'extérieur de la cellule qui les produit et par conséquent libérés dans le milieu.
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D'autres hôtes cellulaires selon l'invention sont des bactéries, une souche E.coli non virulente, ou une souche non virulente d'entérobactérie telle qu'une salmonelle avirulente, dès lors que la séquence nucléotidique recombinante ou le vecteur recombinant ci-dessus, transformant la bactérie, est placé sous le contrôle de signaux d'expression reconnus par cette bactérie.
D'autres icroorganismes intéressants sont par exemple des champignons tels que les Aspergillus.
Dans le cas de l'utilisation à titre d'hôte cellulaire, de cellules procaryotes ou eucaryotes n'appartenant pas au groupe des mycobactéries, on aura recours à l'utilisation de signaux d'expression reconnaissables par la cellule hôte, afin d'obtenir l'expression voire la sécrétion de la protéine recombinante contenant la /3-lactamase ou une β- lactamase tronquée ainsi que la séquence peptidique hétérologue.
D'autres systèmes pour l'expression de la β- lactamase recombinante selon l'invention peuvent être par exemple constitués par des cellules animales, par exemple des cellules d'insectes ou des cellules de mammifères comme des cell;ules CHO. Dans ce cas les vecteurs propres à l'insertion de l'ADN ou de 1ΑDNC ou encore de l'ARN dans ces cellules peuvent être des virus, ou des plasmides. D'autres systèmes tels que les systèmes de levures comme Saccharomyces Cerevisiae peuvent être également appropriés.
Par site exposé on entend un site qui permet l'accès ou la reconnaissance de la séquence peptidique hétérologue et en particulier l'accès à l'épitope ou aux épitopes ou leur reconnaissance, dans le but d'obtenir une réponse immunitaire. Un site exposé est
18 soit un site se trouvant à la surface de la protéine /3-lactamase soit un site contenu dans cette protéine dont l'épitope reste reconnu par les anticorps, par exemple même quand la protéine est dénaturée.
A titre d'exemple on peut mentionner la possibilité selon laquelle la séquence peptidique hétérologue est insérée en amont d'un site normalement non exposé à la surface de la protéine β-lactamase, ce site se trouvant exposé du fait de 1' insertion de la séquence hétérologue, par exemple à la suite d'un repliement résultant d'interactions entre la protéine /3-lactamase et la séquence hétérologue. En choisissant le site d'insertion dans la protéine /3-lactamase, on aura avantage à sélectionner des sites qui permettent de conserver la structure globale de la protéine et par conséquent sa stabilité.
Les connaissances acquises par les inventeurs sur la séquence du gène de la /3-lactamase de M. fortuitum leur ont permis de localiser les différentes régions du type hélices α et feuillets β responsables de la conformation tridimensionnelle de cette protéine. .En conséquence les inventeurs ont été en mesure de déterminer à l'aide de la structure tridimensionnelle de la /3-lactamase de S. aureus et de S. albus G, quels pouvaient être les domaines appropriés pour 1' insertion de séquences peptidiques hétérologues, évitant 1'altération de la structure de la protéine native dans des conditions qui auraient nui à son intérêt en tant que molécule porteuse. Ainsi les inventeurs ont établi la possibilité d'insérer de préférence les séquences peptidiques hétérologues dans un domaine d'une β- lactamase en dehors des régions structurées en hélices α ou en feuillet β .
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A titre préféré une séquence peptidique hétérologue est insérée dans la β-lactamase de M. fortuitum dans la région formant la jonction entre l'hélice α2 et l'hélice α3 de la β-lactamase.
D'autres sites d'insertion préférés sont constitués par les régions comprises entre le feuillet β2 et l'hélice α2, entre l'hélice o:3 et l'hélice α4 ou encore entre le feuillet β4 et le feuillet β5.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la séquence hétérologue peut également être insérée dans la partie C-terminale de la séquence de la β-lactamase.
Pour la préparation de protéines recombinantes faisant intervenir des β-lactamases d'origine différente, on déterminera avantageusement la localisation des hélices α et feuillets β leur conférant leur structure, par rapport aux données obtenues pour la β-lactamase de S. aureus.
De préférence l'insertion est réalisée de telle façon que la séquence peptidique hétérologue soit accessible aux molécules d'eau de l'environnement.
Les séquences hétérologues susceptibles d'être insérées dans la β-lactamase ou dans une β-lactamase tronquée sont les séquences qui ont été décrites plus haut dans la partie qui concerne les séquences nucléotidiques. Il s'agit par exemple de séquences du rétrovirus HIV, en particulier de séquences de la glycoprotéine d'enveloppe, des protéines gag, nef ou pol, d'un rétrovirus HIV-1 ou HIV-2. A titre d'exemple on citera le peptide V3 de l'enveloppe de HIV-1.
L'invention permet la réalisation de protéines β- lactamase recombinantes dans lesquelles 1 ' insertion de la séquence hétérologue comportant l'épitope s'accompagne d'une délétion d'une partie de la β-
20 lactamase. L'invention permet aussi selon un mode de réalisation avantageux, l'insertion de la séquence hétérologue sans délétion au niveau de la β-lactamase.
Par exemple, cette insertion peut être réalisée à l'extrémité C-terminale de la β-lactamase, sans délétion au niveau de la séquence de cette dernière.
L'invention a aussi pour objet une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend une souche BCG recombinante décrite ci-dessus, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique ent approprié pour son administration à 1'homme ou à 1'animal.
Une telle composition est susceptible de constituer un vaccin vivant. Elle peut être administrée par voie d'injection ou par toute autre voie adaptée. Une telle composition immunogène peut être utilisée pour déclencher la réponse immunitaire, par exemple pour déclencher la réponse cellulaire et éventuellement pour déclencher la production d'anticorps protecteurs, ou encore pour contribuer à la production de ces anticorps chez un hôte auquel elle est administrée. L'invention vise non seulement la fabrication de compositions vaccinantes administrables à l'homme mais également la préparation de compositions à des fins de vaccination en médecine vétérinaire.
La composition immunogène de l'invention peut aussi être utilisée à titre de composition de rappel pour stimuler la production d'anticorps initiée par 1'administration d'une protéine ou d'un autre constituant de 1'agent pathogène ou de façon plus générale de 1'agent contre lequel on recherche une réponse immunitaire.
A titre préféré 1'invention concerne une composition immunogène caractérisée en ce que la souche
21 recombinante qu'elle contient à titre de principe actif est une souche M. bovis de type BCG répondant aux définitions précédemment données. Une souche BCG particulière est la souche avirulente de l'INSTITUT PASTEUR n° 1137P2, utilisée pour le vaccin commercialisé contre la tuberculose.
A titre de véhicule pharmaceutique approprié pour la réalisation des compositions immunogènes de l'invention, on peut citer les excipients physiologique ent acceptables habituellement utilisés, notamment les excipients neutres ou acides et par exemple le stéarate de magnésium, la polyvinyle pyrrolidone ou les alcools. Cette composition immunogène peut également comprendre des adjuvants de la réponse immunitaire tels que l'adjuvant complet ou incomplet de Freund, l'hydroxyde d'aluminium, des dérivés de muramyl dipeptide, une huile métabolisante comme le squalène.
Dans le cas de l'utilisation d'un vaccin vivant, les doses habituelles pour la vaccination avec le BCG pourront être utilisées.
Une autre composition immunogène de l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine recombinante répondant aux définitions ci-dessus, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique approprié pour son administration. Cette composition, comme la composition immunogène formant le vaccin vivant, peut être utilisée pour déclencher la réponse immunitaire ou sous forme de composition de rappel.
D'autres avantages et caractéristiques de 1' invention apparaissent dans les exemples qui suivent et dans les figures qui sont décrites ci-dessous.
22 LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 :
Séquence nucléotidique de la sonde BlaMl
Figure 2 :
Plasmide pACYC184 recombiné avec un insérât d'environ 4,7 kb du gène de la β lactamase,
Figure 3 :
Plasmide pIPJ39 recombiné avec le gène de la β lactamase,
Figure 4 :
Séquence de la région génétigue portant le gène codant pour la β-lactamase de M. fortuitum.
La séquence nucléotidique est indiquée en lettres capitales et est numérotée dans la colonne de droite. La séquence peptidique de la β-lactamase est indiquée avec le code à trois lettres sous la séquence nucléotidique lui correspondant. La numérotation est indiquée sous la séquence.
La séquence nuléotidique de ntl à ntl061 a été déterminée à partir du plasmide pIPJ319.
Figure 5 :
MF : Mycobacterium fortuitum SA : Streptomyces albus AU : Staphylococcus aureus
La position des insertions à effectuer est indiquée par des traits pointillés.
La position des hélices a et β est indiquée sous la séquence de S. aureus.
23
Les prédictions de structure de M. fortuitum sont indiquées au dessus de sa séquence.
Figure 6 :
Position des motifs structuraux prédits pour la β- lactamase de M. fortuitum
Les différentes hélices α et feullets β sont indiqués par des rectangles. Sur cette figure sont également indiquées la séquence nucléotidique et la position de plusieurs sites de restriction.
Figure 7 - Construction du plasmide pIPJ46
Le plasmide pAL817 est un dérivé de pAL5000 et est décrit dans la publication Ranes et al, J. Bacteriol. 172 : 2793-2797 (1990) . La cassette contenant le gène de résistance à la kanamycine du transposon Tn903 et le plasmide pSL1180 proviennent de la Société Pharmacia.
Figure 8 - Construction des plasmides pIPJ64 et pIPJ65
L'amplification du fragment V3 est faite à partir du plasmide pTG5167 fourni par Transgene. Le plasmide pIPJ42 est un dérivé de pIPJ39 où le fragment BglII/BamHI, correspondant au promoteur et au fragment aminoterminal du gène codant pour la beta-lactamase de Mycobacterium fortui tum FC1, a été remplacé par le fragment BglII/BglII de pACYC184, correspondant au promoteur et au fragment aminoterminal du gène codant pour la beta-lactamase de Mycobacterium fortuitum D316. Le plasmide pTG5167 est un dérivé de pTG186poly (Guy et al, 1987) où un fragment BglII-EcoRI portant le gène codant pour la protéine GP160 de HIVl/MN a été clone dans le polylinker.
24 Figure 9 - Construction des plasmides pRJ27 et pRJ28
L'amplification du fragment gagll est faite à partir du plasmide pTG2103 fournis par Transgene. Le plasmide pTG2103 est un dérivé de pTG959 (Guy et al, 1987) où un fragment BglII/EcoRI portant le gène codant pour la protéine P24 de HIVl/LAI a été clone dans le polylinker.
Figure 10 - Construction des plasmides pRJ33 et pRJ34
L'amplification du fragment Gag p24 est faite à partir du plasmide pTG2103 fourni par Transgene.
Figure 11 - Construction des plasmides pSA1.5 et pSAIl.5
L'amplification du gène codant pour la protéine GP63 de Leishmania major est faite directement à partir du chromosome de ce parasite.
Figure 12 - Analyse du type Western de l'expression du polypeptide beta-lactamase-V3. Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués à gauche de la ligne 1.
Ligne 1 : protéine gpl20 ; ligne 2 : surnageant de BCG standard ; ligne 3 : extrait de BCG standard ; ligne 4 : surnageant de BCG recombinant portant le plasmide pIPJ64 ; ligne 5 : extrait de BCG recombinant portant le plasmide pIPJ64.
Figure 13 - Analyse du type Western de l'expression du polypeptide beta-lactamase-GaglI
25
Ligne 1 : marqueurs de poids moléculaire ; ligne 2 : protéine Gag P24 ; ligne 3 : extrait de BCG standard ; lignes 4 et 5 : extraits de BCG recombinants portant le plasmide pRJ28 ; lignes 6 et 7 : extraits de BCG recombinants portant le plasmide pRJ27.
Figure 14 - Analyse du type Western de l'expression du polypeptide beta-lactamase-Gag P24
Ligne 1 : extrait de BCG standard ; ligne 2 : protéine Gag P24 ; ligne 3 : marqueurs de poids moléculaire ; lignes 4 et 5 : extraits de BCG recombinants portant le plasmide pRJ33 et pRJ34, respectivement.
Ligne 15 - Analyse du type Western de l'expression du polypeptide beta-lactamase-GP63.
Ligne 1 : extrait de BCG standard ; ligne 2 : marqueurs de poids moléculaire ; ligne 3 : extrait de BCG recombinant portant pSAIl.5
Figure 16 - Réponses prolifératives des cellules extraites des ganglions lymphatiques des souris inoculées avec le BCG portant le plasmide pRJ28.
4 souris Balb/c reçoivent une injection intradermique de 107 cfu de BCG-pRJ28, 4 autres reçoivent du BCG 1173P2 standard. Après 14 jours, les ganglions lymphatiques périphériques sont prélevés pour le test de prolifération.
La protéine Gag P24 de HIVl-LAI est utilisée pour induire la prolifération des cellules ganglionaires qui ont été en contact avec la protéine de fusion BlaM-V3 produite par le BCG recombinant.
26 PARTIE EXERIMENTALE
Dans l'exemple qui suit on a utilisé une β- lactamase mycobactérienne, en vue de son expression dans M. bovis BCG, les signaux d'expression étant adaptés au contexte mycobactérien.
Une β-lactamase de M. fortuitum a été précédemment purifiée par Amicosante et al et Fattorili et al à partir d'une souche mutante produisant cette enzyme en quantité importante. La séquence N-terminale de la β- lactamase a été déterminée par Amicosante et al :
APIDDQLAELERRDNVLIGLYAANLQSGRRITHRPDEMFAMXSTFKGYV X correspond à une indétermination.
Afin d'isoler le gène codant pour cette protéine, une sonde ADN, BlaMl correspondant au fragment de gène codant pour cette partie N-terminale de la protéine a été synthétisée par PCR. Pour cela, deux mélanges d'oligonucléotides ont été synthétisés en utilisant la dégénérescence du code génétique, et l'utilisation préférentielle des codons chez les mycobactéries (J. Dale et A. Pakti, Molecular Biology of the Mycobacteria, Surrey University Press, Guilford, U , 1990, p. 173-198) . La séquence en acides aminés APIDDQ est donc vraisemblablement codée par une famille de séquences d'ADN dont la formule est indiquée par le consensus suivant :
5' GC(CθUG) CC(GouC) ATC GA(CouT) GA(COUT) CAG 3'
Les nucleotides sont indiqués en lettres capitales ; chaque oligonucléotide appartenant à la famille est déterminé en choisissant l'un des nucleotides indiqués entre parenthèses. Le mélange de ces oligonucléotides, appelé Moligol a été synthétisé chimiquement en incorporant 1 'un ou 1'autre des nucleotides indiqués entre parenthèses. Nous avons
une séquence nucléotidique hétérologue codant pour un peptide ou un polypeptide porteur d'au moins un épitope contre lequel on cherche à obtenir une réponse immunitaire et d'envisager la préparation de protéines recombinantes. Ces recherches ont en outre permis de définir quelles étaient les séquences codant pour une β-lactamase et les signaux nécessaires à l'expression de produits de fusion avec la β-lactamase, dans lesquels la β-lactamase est sous forme stable, et également les signaux nécessaires à l'exportation voire à la sécrétion, de la protéine recombinante produite chez un hôte cellulaire.
En outre l'obtention de la séquence du gène de la β-lactamase de M. fortuitum permet de prévoir l'utilisation d'autres β-lactamases de structure comparable, en particulier au niveau de leur structure tridimensionnelle, pour réaliser des protéines recombinantes dans le cadre de l'invention.
Dans le cadre de l'application particulière de ces protéines recombinantes à l'élaboration de vaccins vivants, les inventeurs se sont intéressés à des mycobactéries. Un candidat intéressant pour le développement de tels vaccins est la mycobactérie M. bovis BCG (le Bacille de Calmette et Guérin) , aussi désignée par la suite BCG, utilisée jusqu'à présent comme vaccin pour protéger contre la tuberculose. BCG est une bactérie avirulente, qui présente un tropisme pour les macrophages et est capable d'induire à la fois une réponse cellulaire B, T et CTL (par les lymphocytes T cytotoxiques) de forte amplitude. Sa paroi cellulaire fonctionne comme un adjuvant très efficace et une seule inoculation peut déclencher une immunité de longue durée.
La présente invention a permis de mettre en évidence que l'utilisation d'une protéine vecteur telle que la β-lactamase peut favoriser le clonage et l'expression chez des mycobactéries, en particulier chez le BCG, de déterminants antigéniques hétérologues. Avantageusement, dans le cas de l'utilisation de BCG comme hôte cellulaire pour l'expression de la β- lactamase, on aura recours à une β-lactamase exogène par rapport à celles qui préexistent naturellement dans le BCG, et ce afin d'éviter ou de minimiser les phénomènes de recombinaison.
L'invention concerne donc une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'un des enchaînements nucléotidiques suivants :
- la séquence du gène codant pour une β-lactamase, comprenant 1'enchaînement représenté à la figure 4,
- toute partie de 1'enchaînement nucléotidique représenté à la figure 4, participant à la structure de la β-lactamase, ou nécessaire à son expression dans un hôte cellulaire approprié, en particulier la séquence comprise entre les nucleotides 1 et 394 de l'enchaînement de la figure 4 contenant les signaux d'expression du gène, la séquence codante contenue dans l'enchaînement représenté à la figure 4, et comprenant les nucleotides 395 à 1274,
- toute séquence hybridant dans des conditions stringentes avec 1'enchaînement de la figure 4 et notamment avec 1'enchaînement compris entre les nucleotides 1 et 394 ou avec l'enchaînement
utilisé le synthétiseur d'oligonucléotides Cyclone (Biosearch USA) .
Le deuxième mélange d'oligonucléotides, appelé Moligo2 est constitué d'oligonucléotides correspondant aux brins complémentaires des séquences d'ADN codant pour la partie C-terminale du fragment N-terminal indiqué ci-dessus, c'est à dire : STFKGYV.
Avec la même nomenclature que ci-dessus, les oligonucléotides constituant le mélange Moligo2 répondent au consensus :
5'AG(CθUG) TG(COUG) AAG TTC CC(GOUA) AT(AouG) CA(GouC)3 '
L'un des mélanges contient des oligonucléotides de séquence identique ou très similaire à la partie 5' de BlaMl, le deuxième mélange contient des oligonucléotides complémentaires de la partie 3 ' de BlaMl. Ces deux mélanges sont utilisés pour synthétiser par PCR la sonde BlaMl à partir de l'ADN que nous avons extrait de M. fortuitum FC1 (C. Martin et al, Nature Vol. 345:739-743, 1990). La sonde BlaMl a été séquencée (figure 1) . A partir de cette séquence 1 ' oligonucléotide, BlaOl: 5 ' CTTGAAGGTCGAGCACATCGCGAACAT3 ' a été synthétisé et marqué radioactivement afin de l'utiliser comme sonde pour repérer dans une banque de gène de M. fortuitum D316 (Amicosante et al) un clone possédant un fragment portant le gène codant pour la β-lactamase. Cette banque a été construite en coupant l'ADN chromosomique de M. fortuitum D316 par l'enzyme de restriction SphI et en clonant les fragments au hasard dans le vecteur pACYC184. Les fragments SphI ont été insérés au site SphI de pACYC184 et la souche HB101 de E.coli a été transformée par ce mélange de ligation en présence de chlorure de calcium. Les souches transformantes ont été sélectionnées sur boîte de
milieu LB contenant 30μg/ml de chloramphénicol. Les souches résistantes obtenues ont été repiquées sur le milieu LB solide contenant 25μg/ml de tétracycline et seules celles sensibles à cet antibiotique ont été retenues. Un clone transformant contenant un fragment hybridant avec BlaOl a été isolé. Ce clone contient un plasmide pACYC184 recombinant avec un insert d'environ 4,7 kb hybridant avec BlaOl. La carte de restriction de ce plasmide a été effectuée (figure 2) et la région hybridant avec BlaOl a été séquencée. La séquence nucléotidique est indiquée à la figure 4. L'analyse de cette séquence montre une phase de lecture possédant des similarités avec d'autres β-lactamases de classe A. Nous en avons donc conclu qu'il devait s'agir du gène de structure de la β-lactamase de M. fortuitum. Le fragment SphI séquence ne contient qu'une partie du gène. Un fragment de restriction BglII-SphI (représenté en trait épais sur la figure 2) interne au gène, appelé Bla02 a été utilisé comme sonde ; 1'ensemble du gène a été clone à partir d'une banque de M. fortuitum FC1. Cette banque a été construite en clonant des fragments chromosomiques BamHI de 4 à 10 kb isolés par électrophorèse sur gel d'agarose et clones dans le site BamHI du plasmide pUC18 linéarisé par coupure à ce site et déphosphorylé. Les clones transformants ont été sélectionnés sur boîte de milieu LB contenant lOOμg/ml d'ampicilline. Un clone transformant hybridant avec la sonde Bla02 a été isolé. Il contient un plasmide recombinant portant un insert d'environ 6 kb hybridant avec la sonde Bla02. La carte de restriction de cet insert a été effectuée (figure 3) et la région hybridant avec la sonde a été séquencée. Elle contient l'extrémité C-terminale du gène (figure 4) . Les deux fragments de gènes obtenus à partir des banques SphI et
BamHI ont une partie commune qui permet de reconstituer l'ensemble du gène ; il est représenté à la figure 4 avec la séquence en acides aminés de la protéine déduite de la séquence nucléotidique. La séquence en acides aminés possède des similarités avec les séquences des autres β-lactamases de classe A connues. Un alignement des séquences des β-lactamases de M. fortuitum, de S. albus, de S. aureus est proposé à la figure 5. La position des différents motifs structuraux, hélices et feuillet β déterminés pour la β-lactamase de S. aureus est indiquée sur la structure primaire de cette enzyme sur la même figure. D'après les similarités entre la structure primaire de la β- lacta ase de M. fortuitum que nous venons de déduire du gène dont nous venons de déterminer la structure, et celle de S. aureus, la position des motifs structuraux est proposée à la figure 5. Sur la figure 6, les motifs structuraux de la β-lactamase de M. fortuitum ainsi que la séquence nucléotidique du gène sont aussi représentés. Une région formant la jonction entre l'hélice 2 et l'hélice α3 devrait correspondre à une région étendue à 1'intérieur de laquelle des épitopes pourront être introduits sans modifier la structure générale de la protéine. Le fragment du gène codant pour cette région, nt648 à nt719 contient un site BglII unique qui sera utilisé pour l'insertion de fragments d'ADN étrangers codant pour divers épitopes. Trois autres régions paraissent intéressantes pour l'insertion d'épitopes : la région nt585 à nt613, permettant une insertion entre le feuillet β2 et l'hélice α2, la région nt744 à nt748, permettant une insertion entre les hélices α3 et 4, et ntll52 à ntll67 qui permettront l'insertion d'épitopes entre les feuillets β4 et β5.
L'insertion d'épitopes en position C-terminale de la protéine, c'est à dire proche du nucleotide 1043 pourrait être aussi intéressante.
Pour analyser l'expression du gène BlaM, celui-ci a été fusioné avec la β-galactosidase, une enzyme facile à doser et dont l'expression chez les bactéries est facilement repérable sur boîte de Pétri. Pour ce faire, un fragment BglII-Pstl de 1598 pb, contenant une partie du gène blaM et de la région en amont, a été isolé et inséré entre les sites BamHI et Pstl du plasmide pNM482. La fusion blaM-lacZ résultante a ensuite été transférée à un vecteur navette E.coli- mycobactérie et cette construction a été utilisée pour transformer par électroporation E.coli et M. smegmatis.
L'expression du gène lacZ a été observée uniquement chez M. smegmatis. Ces résultast montrent que la région clonée située en amont du gène blaM est suffisante pour induire l'expression du gène et qu'elle doit par conséquent contenir la plupart des signaux d'initiation de la transcription et de la traduction. Ces signaux sont spécifiques des mycobactéries. Ils pourront donc de ce fait avantageusement être utilisés pour l'expression de tout gène clone sous leur contrôle, sous forme de fusion d'opéron ou de fusion de protéine.
Le fait que la fusion blaM-lacZ est fonctionnelle montre que la système blaM pourra être utilisé pour 1'expression de divers gènes ou fragments de gènes hétérologues chez les mycobactéries. Suivant les fusions de gènes réalisées, les protéines fusion résultantes pourront avoir une localisation cytoplasmique, être exportées à l'extérieur de la bactérie dans le milieu de culture, ou rester ancrées à la membrane externe.
Exemples d'utilisation du promoteur Pbla associé à tout ou partie du gène codant pour la beta-lactamase qu'il contrôle : expression d'antigènes ou de fragments d'antigènes viraux ou parasitaires et induction de réponses immunitaires spécifiques par le BCG exprimant l'un de ces antigènes.
Le promoteur Pbla (promoteur de la β-lactamase) associé au gène codant pour la beta-lactamase a été utilisé pour exprimer plusieurs motifs antigéniques viraux de HIV1. (Les séquences sont données par rapport à la publication "Hu an rétrovirus and AIDS 1991" a compilation and analysis of nucleic acid and aminoacid séquences, edited by Myers G. et al., published by Theoretical Biology and Physics, Group T-10, Mail Stop K710, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico 877545 USA) ou l'antigène GP63 de Leishmania . (Les séquences sont données par rapport à la publication : Button, L.L. and Me Master, W.R. (1988) Molecular cloning of the major surface antigen of Leishmania . J. Exp. 167. 724-729) dans M. smegmatis et/ou le BCG.
Le motif antigénique V3 de HIV1 souche MN et un fragment de env de cette même souche ont été exprimés dans M. smegmatis et/ou le BCG.
L'antigène Gag P24 de HIV1 souche LAI ainsi qu'un fragment de ce dernier (Gagll) ont été exprimés dans le BCG. La protéine majeure de surface de Leishmania major et de Leishmania infantum GP63 ont été également exprimés par le BCG.
Seuls sont rapportés les résultats des réponses immunitaires dirigées contre Gag dans le cas de
1'expression du fragment Gagll. Une réponse cellulaire spécifique a été observée.
1) Le fragment du gène env codant pour le déterminant V3 de l'acide aminé 303 à l'acide aminé 338 (HIV souche MN) a été inséré au site BglII du gène codant pour la beta-lactamase sur le plasmide pIPJ42. Pour ce faire, un fragment codant pour ce déterminant a été synthétisé par PCR. Deux oligonucléotides V3I
(ATTGGATCCTGGTACCCGAGGAGTGTACAAGACCCAACTACAATAA) et V3II
(TTTGGATCCCTCTAGACCCGTCGCCACAATGTGCTTGTCTTATAGTTCCT) ont été synthétisés par la société GENSET. Ils ont servi à amplifier le fragment de env à partir du plasmide pTG5167 le portant et provenant de TRANSGENE. (Figure 8) . Le fragment amplifié porte le site de restriction BamHI à ses extrémités. Il est coupé par 1'enzyme de restriction correspondante et clone dans le plasmide pIPJ42. Le plasmide recombinant portant le fragment codant pour le déterminant V3 s 'appelle pIPJ52. Dans ce plasmide, une cassette contenant l'origine de replication chez les mycobactéries (ori myco de pAL5000) et le gène de résistance à la kanamycine de Tn903 a été insérée entre les sites SplI et BamHI. Cette cassette est le fragment EcoRV/Hpal isolé du plasmide pIPJ46 (figure 8) . les plasmides résultants de 1'insertion du fragment EcoRV/Hpal dans pIPJ52 dans l'une ou l'autre des orientations sont pIPJ64 et pIPJ65.
Les plasmides pIPJ64 et pIPJ65 ont été transférés dans M. smegmatis et le BCG par électroporation. Le polypeptide fusion exprimé par les plasmides pIPJ64 et pIPJ65 consiste en 1 ' insertion du motif V3 entre les
hélices 2 et 3 de la beta-lactamase. Ce polypeptide est repéré dans le milieu de culture des souches de M . smegmatis et de BCG transformées par les plasmides pIPJ64 et pIPJ65, par Western blot en utilisant l'anticorps monoclonal F5-5 de 1,'Hybridolab de 1'Institut Pasteur.
2) Le fragment du gène codant pour la partie de Gag (HIV1 souche LAI) de l'acide aminé 233 à l'acide aminé 307 (Gagll) a été inséré au site PstI du gène codant pour la beta-lactamase sur le plasmide pIPJ42. Pour ce faire, un fragment contenant la partie du gène gag codant pour Gagll a été synthétisée in vitro par PCR. Deux oligonucléotides NG1
(AAACTGCAGGGATCCATGGGAAGTGACATAGCA) et NG2 (CCCTGAAGCTTACTCGGCTCTTAGAGTTTT) ont été synthétisés sur un synthétiseur d'ADN CYCLONE. Ils ont servi à amplifier le fragment codant pour Gagll à partir du plasmide pTG2103 le portant et provenant de TRANSGENE. Le fragment amplifié porte les sites PstI et HindIII. Il est coupé par les enzymes correspondantes et clone dans le plasmide pIPJ42 entre les sites PstI et HindIII. Le plasmide résultant s'appelle pRJ20. A partir de ce plasmide, le fragment Kpnl/Hin dm codant pour la fusion beta-lactamase-GaglI a été inséré au site Seal de pRR3 (Ranes, M. G., Rauzier, J., Lagranderie, M., Georghiu, M. and Gicquel, B. (1990) Functional analysis of pAL5000, a plasmid from Mycobacterium fortui tum : construction of a"mini" Mycobacterium- escherichia coli shuttle vector. J. Bacteriol . 172. 2793-2797) dans les deux orientations. Les plasmides résultant ont été appelés pRJ27 et pRJ28.
Les plasmides pRJ27 et pRJ28 ont été transférés dans M. smegmatis et le BCG par électroporation.
Le polypeptide fusion exprimé par les plasmides pR 27 et pRJ28 consiste en la fusion entre un fragment aminoterminal de 24 aminoacides de la beta-lactamase avec le fragment gagll puisqu'un codon stop se situe à l'extrémité de gagll. Le polypeptide fusion beta- lactamase-GaglI n'est pas retrouvé dans le milieu de culture de M. smegmatis ou du BCG transformés par pRJ27 et pRJ28, mais dans le cytoplasme de ces bactéries. Il est repéré par western blot dans les extraits bactériens (réalisé selon Winter, N. , Lagranderie, M., Rauzier, J. , Ti m, J. , Lecrec, C. , Guy, B. , Kieny, M.P., Gheorghiu, M., Gicquel, B. (1991) Expression of heterologous gènes in Mycobacterium bovis BCG : induction of a cellular response against HIV1 Nef protein. Gène 190, 47-54) en utilisant l'anticorps monoclonal 1542 de l'Hybridolab de l'Institut Pasteur.
Après inoculation de souris Balb/c par le BCG exprimant la fusion beta-lactamase-GaglI, une réponse immunitaire de type cellulaire dirigée contre Gag a été observée en utilisant des tests de prolifération de cellules des ganglions lymphatiques après stimulation par la protéine Gag P24. Le protocole utilisé est semblable à celui décrit par Winter et al. Les détails sont indiqués dans la figure 13.
Il est probable qu'il s'agisse de lymphocytes T(CD4) et T(CD8)
3) La protéine Gag P24 de HIV1 souche LAI.
Le fragment codant pour la protéine GagP24 a été inséré au site BglII du gène codant pour la beta-lactamase sur
le plasmide pIPJ42. Pour ce faire, un fragment codant pour Gag P24 a été synthétisé in vitro par PCR à partir du plasmide pTG2103, provenant de TRANSGENE, à l'aide des oligonucléotides JGAG1.
(CGAATTCAGATCTCAACTTTAAATGCATGGGTA) et EML5 (GTTCGAATTCTCACAAACTCTTGC) , synthétisés, au préalable, sur un synthétiseur CYCLONE. Le fragment amplifié porte les sites BglII et BamHI. Il est coupé par les enzymes correspondants et clone dans le plasmide pIPJ42 entre les sites BglII et BamHI. Le plasmide résultant s'appelle pRJ22. Comme dans le cas de la construction des plasmides pIPJ64 et pIPJ65, la cassette contenant l'origine de replication chez les mycobactéries (ori yco de pAL5000) et le gène de résistance à la kanamycine de Tn903 a été insérée entre les sites SplI et BamHI. C'est le fragment EcoRV/Hpal isolé du plasmide pIPJ46 (Figure 10) . Ces plasmides résultant de l'insertion du fragment EcoRV/Hpal s'appellent pRJ33 et pRJ34.
Les plasmides pRJ33 et pRJ34 ont été transférés dans M . smegmatis et le BCG par électroporation. Le polypeptide fusion exprimé par les plasmides pRJ33 et pRJ34 consiste en un fragment aminoterminal de 60 aminoacides de la beta-lactamase avec la protéine GagP24 puisqu'un codon stop se situe à l'extrémité du gène Gag P24 clone ici. D'une façon analogue à la fusion beta-lactamase-GaglI, le polypeptide fusion beta-lacatamase-Gag P24 n'est pas retrouvé dans le milieu de culture mais dans le cytoplasme. Il est repéré par Western blot en utilisant l'anticorps monoclonal 1113 de l'Hybridolab de l'Institut Pasteur.
4) L'antigène de surface GP63 de Leishmania infantum et Leishmania major .
Le fragment codant pour la protéine GP63 dépourvue de la partie C-terminale transmembranaire a été inséré au site BglII du gène codant pour la beta-lactamase sur le plasmide pIPJ42. Pour ce faire, un fragment codant pour l'antigène GP63 a été synthétisé in vitro par PCR. Deux oligonucléotides GP631
(GCGGGATCCTTATGCATGTGCGCGACGTGAACTGGGGC) et GP632 (CCGAATTCAAGCTTCTACGCCGTGTTGCCGCCGTCCTT) ont servi à amplifier ce fragment à partir de l'ADN chromosomique des souches de Leishmania infantum et Leishmania major. Les extrémités des fragments amplifiés possèdent les sites BamH et HindIII. Ils sont coupés par les enzymes correspondants et insérés entre les sites BglII et HindIII de pIPJ42. Le plasmide résultant s'appelle pLMl.5.
Comme dans le cas de la construction des plasmides pIPJ64 et pIPJ65, la cassette contenant 1'origine de replication chez les mycobactéries (oriMyco de pAL5000) et le gène de résistance à la kanamycine de Tn903 a été insérée entre les sites SplI et BamHI.
C'est le fragment EcoRV/Hpal isolé du plasmide pIPJ46 (Figure il) .
Les plasmides résultant de 1 ' insertion du fragment EcoRV/Hpal dans 1 'une ou 1 'autre des orientations s'appellent pSA1.5 et pSAI1.5.
Les plasmides pSA1.5 et pSAIl.5 ont été transférés dans M. smegmatis et le BCG par électroporation. Les polypeptides fusion exprimés par ces plasmides consistent en la fusion entre un fragment amino¬ terminal de 60 aminoacides de la beta-lactamase avec la protéine GP63 délétée de la partie C-terminale transmembranaire. Les polypeptides fusion beta- lactamase-Protéine GP63 sont comme dans le cas des
fusions avec Gag retrouvés dans le cytoplasme de M . smegmatis et du BCG transformés par les plasmides pSA1.5 et pSAI1.5. Ils sont repérés par un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine GP63 purifiée à partir d'extraits d'une souche de E. coli recombinante exprimant cette protéine. Cet anticorps monoclonal a été décrit par Hand an, L. Button, et R.W. McMaster [(1990) Leishmania major ; Production of recombinant gp63, its antigernicity and immunogenicity in mice Exp. Parasitol. 70, 427-435] (Figure 15).