EP0618928A1 - Composition pharmaceutique contenant des anticorps anti-allergenes, procede de purification de ces anticorps et anticorps ainsi obtenus - Google Patents

Composition pharmaceutique contenant des anticorps anti-allergenes, procede de purification de ces anticorps et anticorps ainsi obtenus

Info

Publication number
EP0618928A1
EP0618928A1 EP93902289A EP93902289A EP0618928A1 EP 0618928 A1 EP0618928 A1 EP 0618928A1 EP 93902289 A EP93902289 A EP 93902289A EP 93902289 A EP93902289 A EP 93902289A EP 0618928 A1 EP0618928 A1 EP 0618928A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
antibodies
allergens
immunoglobulins
pharmaceutical composition
pollen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP93902289A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bertrand Basuyaux
Alain Laroze
Thierry Batard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FONDATION NATIONALE DE TRANSFUSION SANGUINE
Original Assignee
FONDATION NATIONALE DE TRANSFUSION SANGUINE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FONDATION NATIONALE DE TRANSFUSION SANGUINE filed Critical FONDATION NATIONALE DE TRANSFUSION SANGUINE
Publication of EP0618928A1 publication Critical patent/EP0618928A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an anti-allergic composition, comprising purified immunoglobulins specifically directed against the constituents of an aqueous crude extract of grass pollen, in particular cocksfoot (dactylis glomerata).
  • the mechanism of allergy involves the interaction of the immune system with the inflammatory system. Upon first contact with the pollen grains, these penetrate the respiratory tract and release their antigens on contact with the mucous membranes, the secretions of which are essentially aqueous. The body will then synthesize class E immunoglobulins (or IgE) directed specifically against some of these antigens, then called allergens. These IgEs will bind to mast cells (tissues) and basophils (circulating) which have membrane receptors for the constant part (or Fc) of class E immunoglobulins. During subsequent contacts of the body with pollen allergens , the latter being recognized by IgE fixed to mast cells and basophils will effect bridging between these immunoglobulins.
  • IgE class E immunoglobulins
  • Immune complexes were injected into patients suffering from the same allergy, formed by the association of grass pollen allergens with purified immunoglobulins specifically directed against these allergens.
  • the immunoglobulins in question were purified from their own plasma (autologous immunoglobulins) after elimination of the class M immunoglobulins (IgM). If this clinical trial has led to a lasting improvement in the disease in patients treated with UC. MACHIELS et al. 1990. Clin. Exp. Allergy 20: 653-660), its application on a large scale seems impractical, for practical reasons (purification of a different batch of immunoglobulins for each patient) and cost (realization of a different purification column for each sick, due to possible contamination).
  • the present invention specifically aims to overcome these drawbacks; it consists in purifying immunoglobulins directed specifically against grass pollen antigens, which are obtained from a pool of plasmas from naturally immunized voluntary donors. More particularly, the subject of the present invention is a pharmaceutical composition rich in specific immunoglobulins intended for the treatment and / or prevention of allergic symptoms linked to one or more allergens, characterized in that said immunoglobulins are a mixture containing primary anti- allergen and secondary anti-isotype IgE secondary antibodies obtained from non-selected human plasmas or sera, purified by affinity chromatography on specific immobilized antigens.
  • Such preparation has many advantages; firstly, such a preparation could be available in a lyophilized form, suitable for long storage.
  • this preparation by intravenous route would allow the injection of significant amounts of active product with a limited loss in the body.
  • a nebulizable form could also be considered, very suitable for local treatment of the respiratory tract, sites of manifestation of symptoms.
  • the present invention precisely makes it possible to implement these objectives. It consists of preparing compositions rich in specific immunoglobulins for therapeutic or prophylactic uses, with a view not only to eliminating allergic symptoms during the pollen season but also to treating the disease itself, by intervening at the level of the system. immune.
  • the implementation of this invention consists in practicing an affinity chroma ⁇ tography which implements an immobilization of the water-soluble dactyl pollen antigens on an immuno-affinity support.
  • the media containing these immunoglobulins are biological liquids which can be of various sources, but more particularly human plasmas or sera. Plasmas or human sera not selected are particularly suitable for implementing the invention.
  • the antigens immobilized on the support come from a water-soluble extract of cocksfoot pollen allergens, but water-soluble extracts of pollen allergens from other grasses (timothy, fescue, ryegrass ...) can perfectly be suitable since major allergens are common to all grasses. ''
  • the resin used carries carboxyl functions and the antigens are linked to the support by their amine function.
  • the specific anti-pollen activity of the mixture is 1000 to 10,000 times greater than the starting biological fluid, this is due to the fact that each of the classes of immunoglobulins in the mixture exhibits biological activity in vitro, as we demonstrate in the examples.
  • each immunoglobulin subclass has an activity, whereas, in the scientific literature, it was admitted that only IgE and subclass • + of IgG (IgG) had an anti-allergenic effect.
  • IgG IgG
  • the second surprising factor is that, in the different classes of immunoglobulins, both the primary antibodies directed against the allergens and the secondary antibodies directed against the constant Fc part of the IgE are effective, which leads to an inhibition of the degranulation of the basophils by IgE.
  • the anti-pollen antibodies which are the subject of the present invention can be administered to humans, alone or in combination with another compound in a pharmaceutical composition. They are especially useful in preventing or treating symptoms related to grass pollen allergy.
  • compositions can be intended for general administration by systemic route, or local in nebulizable form suitable for the respiratory tracts.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing, as active principle, anti-pollen antibodies according to the invention.
  • FIGURE 1 Inhibition of histamine release by an immunopurified fraction from plasmas rich in IgG --- anti-pollen.
  • FIGURE 2 Inhibition of histamine release by an immunopurified fraction from non-preselected plasmas.
  • FIGURE 3 In vitro activity of the fractions of chromatography on immobilized Anti-IgE.
  • EXAMPLE 1 Purification by Anti-Pollution Antibody by Immuno-Affinity Chromatography
  • cocksfoot pollen (Institut Pasteur, France) are incubated in 15 ml of distilled water with stirring for 1 hour at room temperature. After centrifugation for 5 minutes at 9000 g, the supernatant is recovered and then filtered on a 5 ⁇ m Minisart filter then 0.22 ⁇ m (Sa ⁇ orius): 14 ml at 5 mg of proteins per ml are thus recovered (the concentration is evaluated using the dosage by BCA, PIERCE kit) or 70 mg of proteins.
  • the gel is then drained on sintered glass and then washed successively with 50 ml of 0.1 M glycine citrate buffer pH 2.5 and 50 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.5.
  • the test was carried out on an IBF 25 column containing 25 ml of the above-mentioned gel.
  • the chromatic system consists of:
  • a peristaltic pump (Gilson, type minipuls 2); a UV detector, DO: 280 nra (Pharmacia, S.P.M. UV - 1), equipped with an HR-10 cell; a recorder (Pharmacia, REC - 482).
  • the source to be purified is 700 ml of a mixture of plasmas diluted to half with 0.1 M phosphate buffer pH 7.5 (ie 1400 ml in total ) .
  • the 1400 ml of diluted plasma (approximately 25 g "l " 1 of protein) were injected into the column at a flow rate of 70 ml per hour, ensuring a residence time of about twenty minutes.
  • specific antibodies are eluted with citrate / glycine buffer 0.1 M pH
  • Glucose-Dextran 3% (w / v) in physiological saline.
  • Tris-albumin buffer, for washing cells 25 mM Tris, 5 mM NaCl, 5 mM KC1, 0.03% human albumin (w / v) in distilled water
  • Tris-albumin buffer - Ca 2+ - Mg 2 + for cell incubations in the histamine release experiment proper: Tris 25 mM / 5 mM NaCl, 5 mM KC1 / CaCl2, 2 H2 0 0.6 mM / Mg Cl2. 6 H2 0 1 mM, human albumin 0.03% (w / U), in distilled water
  • Cocksfoot pollen (dactylis glomerata) allergic patients were sampled for the isolation of human basophils.
  • a mixture of 26 rich plasmas anti-pollen antibodies and a fraction COMPOR t ant IgG, IgM and IgA after normal plasmas were immunopurified using the technique described in Example 1. During 2 hours under stirring and at room t Empera t ure, these immunopurified fractions are preincubated for differen t es concentrations of total immunoglobulins with cocksfoot pollen extract concentrated to 2.5 or 25 ng / ml total protein, according the
  • the histamino-release technique used is that described by May et al.
  • the fluorometric assay of histamine is carried out according to the technique of Shore et al. (1959 J. Pharmac. Exp. Ther. 121: 182-186) on an automatic chain developed by B. Lebel et al. (1983 - Anal. Biochem. 121: 25 16-29).
  • the method comprises a double extraction of histamine with butanol saturated with NaCl in an alkaline medium, then with hydrochloric acid. After alkalization, orthophthaldehyde forms a fluorochrome with histamine.
  • the first fraction tested consists of immunopurified dactyl pollen immunoglobulins from a batch of 26 plasmas preselected by ELISA method for their richness in specific IgG4.
  • the inhibitory effect of this fraction 5 is observed from a concentration 10 " ⁇ g / 1 in total immunoglobulins. This inhibitory effect increases with the concentration of immunoglobulins to be total (100% inhibition) from 10" 2 g / 1- ( Figure 1).
  • the second fraction consists of immunopurified dactyl pollen immunoglobulins from a plasma sub-fraction from a batch of non-preselected plasmas (product IgGAM, BioTransfusion France).
  • This fraction shows an inhibitory effect from the concentration of 10 "-5 g / 1 in total immunoglobulins. This inhibition is dose-dependent and almost total for an immunoglobulin concentration of 0.4 g / 1 ( Figure 2).
  • control tests were carried out, on one side with non-immunopurified immunoglobulin fractions and without specific specificity, on the other side with a sample of the batch of 26 plasmas rich in specific IgG4, not immunopurified.
  • Non-specific immunoglobulin fractions have no inhibitory effect on histamine release for total immunoglobulin concentrations ranging from 10 " ⁇ to 1 g / 1, while the sample of the batch of specific plasmas shows slight inhibition for a concentration of 1 g 1 of immunoglobulins (and more).
  • the test was carried out on an IBF 11 column containing 5.5 ml of the above-mentioned gel.
  • the chromatographic system is identical to that described in Example 1.
  • the source to be purified is a mixture of eluates containing the anti-pollen antibodies purified according to Example 1, which has been concentrated (8 ml at a rate of 1.05 g / 1 of IgG / 0.45 g 1 of IgM / 0.13 g / 1 IgA and 10 mg / 1 IgE) and dialysis 16 hours at + 4 ° C against 0.1 M phosphate buffer pH 7.5.
  • the source was injected into the column at a rate of 14 ml per hour, ensuring a residence time of about twenty minutes.
  • the retained antibodies were eluted with 0.1 M citrate / glycine buffer pH 2.5 (see Example 1).
  • the eluate is neutralized extemporaneously with solid Tris.
  • the IgG, IgM and IgA present in the eluate with the IgE are secondary antibodies or autoantibodies. This was confirmed when immunoblotting was carried out with a fraction of this eluate heated for 2 hours at 56 ° C. (destruction of Fc from IgE): the secondary antibodies no longer recognize the immobilized allergens.
  • the IgG, IgM and IgA present in the filtrate are on the other hand primary antibodies, really directed against the allergens of the pollen of da ⁇ yle (these are well revealed in immuno-imprints).
  • EXAMPLE 4 Biological Activity in Vitro of Primary Anti-Pollen Antibodies and Secondary Antibodies
  • Example 3 The biological activity of the primary and secondary anti-pollen antibodies whose preparation is described in Example 3 was evaluated in the same manner as in Example 2.
  • the fraction purified by chromatography on immobilized allergen (so-called starting fraction); - the filtrate, that is to say fraction not retained after passage through the column comprising immobilized anti-human IgE antibodies, of the starting fraction; of the eluate, that is to say the fractions retained after passage through the column comprising immobilized human anti-IgE antibodies, of the starting fraction.
  • the fraction "primary antibodies” is the fraction not retained (filtrate). It is considerably depleted in IgE, as indicated in Example 3.
  • FIG. 3 indicates an in vitro biological effect of this fraction, equivalent to that of the starting fraction (despite an absence of activity at 10 " 4 g / 1).
  • the “secondary antibody” fraction which contains the cocksfoot anti-pollen IgE is the retained fraction (eluate).
  • Figure 3 also indicates that the biological effect of this fraction is little different from that of the starting fraction
  • This activity is provided by all classes of immunoglobulins, namely IgG, IgM, IgA and IgE.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une compositon pharmaceutique riche en immunoglobulines spécifiques destinée au traitement et à la prévention des symptomes allergiques liés à un ou plusieurs allergènes, caractérisée en ce que lesdites immunoglobulines sont un mélange contenant des anticorps primaires anti-allergène et des anticorps secondaires principalement anti-isotype d'IgE obtenus à partir de plasmas ou sérums humains, non sélectionnés, purifiés par chromatographie d'affinité sur des antigènes spécifiques immobilisés. Elle concerne également un procédé de purification de ces anticorps et les anticorps ainsi obtenus.

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE CONTENANT DES ANTICORPS ANTI- ALLERGENES, PROCEDE DE PURIFICATION DE CES ANTICORPS ET ANTICORPS AINSI OBTENUS.
La présente invention se rapporte à une composition anti-allergique, comportant des immunoglobulines purifiées spécifiquement dirigées contre les constituants d'un extrait brut aqueux de pollen de graminées, en particulier de dactyle (dactylis glomerata).
En Europe occidentale, environ 15% de la population sont atteints d'allergie de type I (ou hypersensibilité immédiate), la moitié souffrant d'une allergie au pollen de graminées. Les espèces de graminées impliquées sont essentiellement les herbacées (par opposition aux céréales) dont le dactyle (dactylis glomerata), en France, est la plus allergénique. Les symptômes vont de la rhinite allergique saisonnière (rhume des foins) à l'asthme o bronchique, jusqu'au choc anaphylactique (pouvant être mortel).
Le mécanisme de l'allergie met en jeu l'interaction du système immunitaire avec le système inflammatoire. Lors d'un premier contact avec les grains de pollen, ceux-ci pénètrent dans les voies respiratoires et libèrent leurs antigènes au contact des 5 muqueuses, dont les sécrétions sont essentiellement aqueuses. L'organisme va alors synthétiser des immunoglobulines de classe E (ou IgE) dirigées spécifiquement contre certains de ces antigènes, alors appelés allergènes. Ces IgE vont se fixer sur les mastocytes (tissulaires) et les basophiles (circulants) qui possèdent des récepteurs membranaires pour la partie constante (ou Fc) des immunoglobulines de classe E. Lors 0 de contacts subséquents de l'organisme avec les allergènes de pollen, ces derniers étant reconnus par les IgE fixées aux mastocytes et basophiles vont réaliser des pontages entre ces immunoglobulines. Ces pontages induisent la libération de médiateurs chimiques contenus par les mastocytes et basophiles, principalement l'histamine, suite à une cascade de réactions biochimiques complexes. L'histamine entraîne alors une hyperperméabilité 5 vasculaire suivie d'une extravasation de constituants sanguins (cas de la rhinite allergique), voire une hypersécrétion de mucus dans les poumons avec bronchoconstriction (cas de l'asthme bronchique).
Pour enrayer les symptômes de l'allergie, certains traitements qui agissent sur le système 0 inflammatoire ou -sur le système respiratoire sont efficaces ; il s'agit des anti- histaminiques et des corticoïdes (action sur le système inflammatoire), ou des bronchodilatateurs (action sur le système respiratoire). Mais ces traitements, s'ils ont un effet bien démontré sur les symptômes, ne soignent pas la maladie allergique elle-même. Dans cette voie, un traitement au niveau du système immunitaire semble plus promeneur. 5 Par ailleurs, les traitements de désensibilisation par injections intramus¬ culaires d'allergènes n'ont fait état d'aucune efficacité sérieuse ; toutefois, ils ont permis de mettre en évidence le rôle des immunoglobulines de la sous-classe G. (ou Ig G^) dans un éventuel pouvoir anti-allergique.
Précisément, l'injection d'immunoglobulines semble être une solution d'avenir. L'injection d'immunoglobulines sans spécificité particulière à des malades allergiques au pollen de graminées, avant et au tout début de la saison pollinique, entraîne une diminution des symptômes allergiques et de la prise d'anti-histaminiques lors de la saison pollinique, par rapport à un groupe de contrôle (3.P. GIRARD et al. 1988. Clin. Allergy JJ8 : 393-400).
A des malades souffrant de la même allergie ont été injectés des complexes immuns, formés par l'association d'allergènes de pollen de graminées avec des immunoglobulines purifiées spécifiquement dirigées contre ces allergènes. Pour chacun de ces malades, les immunoglobulines en question ont été purifiées à partir de son propre plasma (immunoglobulines autologues) après élimination des immunoglobulines de classe M (IgM). Si cet essai clinique a conduit à une amélioration durable de la maladie chez les patients traités CU. MACHIELS et al. 1990. Clin. Exp. Allergy 20 : 653-660), son application à une grande échelle semble peu envisageable, pour des raisons pratiques (purification d'un lot d'immunoglobulines différent pour chaque malade) et de coût (réalisation d'une colonne de purification différente pour chaque malade, en raison de possibles contaminations).
La présente invention a précisément pour but de pallier ces inconvénients ; elle consiste à purifier des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre les antigènes de pollen de graminées, lesquelles sont obtenues à partir d'un pool de plasmas de donneurs volontaires naturellement immunisés. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique riche en immunoglobulines spécifiques destinée au traitement et/ou à la prévention des symptômes allergiques liés à un ou plusieurs allergènes, caractérisée en ce que lesdites immunoglobulines sont un mélange contenant des anticorps primaires anti-allergène et des anticorps secondaires principalement anti-isotype d'IgE obtenus à partir de plasmas ou sérums humains, non sélectionnés, purifiés par chromatographie d'affinité sur des antigènes spécifiques immobilisés.
Une telle préparation présente de nombreux avantages ; tout d'abord, une telle préparation pourrait être disponible sous une forme lyophilisée, appropriée à une longue conservation.
L'administration de cette préparation par voie intraveineuse permettrait l'injection de quantités importantes en produit actif avec une perte limitée dans l'organisme. Une forme nébulisable pourrait également être envisagée, fort appropriée à un traitement local des voies respiratoires, sites de manifestation des symptômes.
La présente invention permet précisément de mettre en oeuvre ces objectifs. Elle consiste à préparer des compositions riches en immunoglo¬ bulines spécifiques pour des utilisations thérapeutiques ou prophylactiques, en vue non seulement d'éliminer les symptômes allergiques lors de la saison pollinique mais aussi de soigner la maladie elle-même, en intervenant au niveau du système immunitaire.
La mise en oeuvre de cette invention consiste à pratiquer une chroma¬ tographie d'affinité qui met en oeuvre une immobilisation des antigènes hydrosolubles de pollen de dactyle sur un support d'immuno-affinité. Les milieux contenant ces immunoglobulines sont des liquides biologiques qui peuvent être de source variée, mais plus particulièrement des plasmas ou sérums humains. Des plasmas ou sérums humains non sélectionnés convien¬ nent particulièrement à la mise en oeuvre de l'invention. De préférence, les antigènes immobilisés sur le support proviennent d'un extrait hydrosoluble d'allergènes de pollen de dactyle, mais des extraits hydrosolubles d'allergènes de pollen d'autres graminées (Phléole, Fétuque, Ray-grass...) peuvent parfaitement convenir puisque les allergènes majeurs sont communs à toutes les graminées. '
De manière préférée, la résine utilisée porte des fonctions carboxyles et les antigènes sont liés au support par leur fonction aminé.
Une technique de couplage d'antigènes de pollen sur un support a certes déjà été décrite (3.3. MACHIELS et al. voir plus haut). Toutefois, elle ne concerne pas les constituants hydrosolubles de pollen de dactyle, elle comprend l'élimination des IgM contenues dans le milieu à purifier (ces IgM pouvant être le support d'un éventuel pouvoir anti-allergique) avant l'immunopurification elle-même, et montre une capacité très faible, d'où son caractère inadapté à une production d'immunoglobulines à grande échelle.
L'originalité de la technique utilisée selon la présente invention et décrite plus en détail ci-après permet, elle, d'obtenir de manière efficace et en une seule étape un mélange d'IgG, IgM, IgA et IgE, dirigés contre les antigènes hydrosolubles de pollen.
Après la chromatographie, l'activité spécifique anti-pollen du mélange est 1000 à 10000 fois plus importante que le liquide biologique de départ, cela tient au fait que chacune des classes des immunoglobulines du mélange présente une activité biologique in vitro, comme nous le démontrons dans les exemples.
Le caractère surprenant de cette activité anti-pollen importante tient à deux facteurs :
Le premier est que chaque sous-classe d'immunoglobuiine a une activité, alors que, dans la littérature scientifique, il était admis que seules les IgE et sous-classe •+ des IgG (IgG ) avait un effet anti-allergène. Le deuxième facteur surprenant est que, dans les différentes classes d'immunoglobulines, sont efficaces aussi bien les anticorps primaires, dirigés contre les allergènes, que les anticorps secondaires dirigés contre la partie constante Fc des IgE ce qui conduit à une inhibition de la dégranulation des basophiles par les IgE.
Compte tenu de leur pureté protéique, qui peut être supérieure ou égale à 50%, les anticorps anti-pollen, objets de la présente invention peuvent être administrés à l'homme, seuls ou en combinaison avec un autre composé dans une composition pharmaceutique. Ils sont tout particulièrement utiles dans la prévention ou le traitement des symptômes liés à l'allergie au pollen de graminées.
Ces compositions peuvent être destinées à une administration générale par voie systemique, ou locale sous forme nebulisable adaptée aux voies respiratoires.
La présente invention se rapporte également aux compositions pharma¬ ceutiques contenant à titre de principe actif, des anticorps anti-pollen selon l'invention.
Les exemples et figures donnés ci-après à titre non limitatif, en particulier pour le support qui peut être toute phase solide pouvant présenter des fonctions carboxyles convenable pour être greffée avec les allergènes décrits, permettent de démontrer les caractéristiques du produit et de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes : FIGURE 1 : Inhibition de la libération d'histamine par une fraction immunopurifiée à partir de plasmas riches en IgG--- anti-pollen.
FIGURE 2 : Inhibition de la libération d'histamine par une f raction immunopurifiée à partir de plasmas non présélectionnés.
FIGURE 3 : Activité in vitro des f ractions de la chromatographie sur Anti-IgE immobilisés. Exemple 1 : purification par chromatographie d'immuno-affinité d'anticorps anti-pollçn
1 ) MATERIEL ET METHODES
1.1 Préparation du support
a) Extraction des allergènes du pollen
753 mg de pollen de dactyle (Institut Pasteur, France) sont mis en incubation dans 15 ml d'eau distillée sous agitation pendant 1 heure à température ambiante. Après centrifugation 5 minutes à 9000 g, le surnageant est récupéré puis filtré sur filtre Minisart 5 um puis 0,22 um (Saπorius) : 14 ml à 5 mg de protéines par ml sont ainsi récupérés (la concentration est évaluée à l'aide du dosage par BCA, kit PIERCE) soit 70 mg de protéines.
b) Préparation du gel
Parallèlement 6 g de gel sec BrCN-sépharose (Pharmacia) sont mis en suspension durant 15 minutes dans 1 litre d'une solution d'HCl l(h3 M.
Puis le gel est essoré sur verre fritte. Le gel est ensuite lavé avec 50 ml de tampon de couplage (tampon NaH CO30,1 M, NaCl 0,5 M, pH = 8,3) puis essoré sur verre fritte.
c) Couplage des allergènes
Dans une éprouvette de 50 ml permettant une fermeture hermétique, le gel puis les 14 ml d'allergènes et enfin 14 ml de tampon de couplage sont introduits successivement. L'éprouvette est fermée hermétiquement puis mise sous agitation (agitateur rotatif).; la réaction de couplage s'effectue 16 heures à +4°C
Le gel est ensuite essoré et lavé sur verre fritte avec 20 et 60 ml de tampon de couplage. Chaque filtrat est soigneusement récupéré : leur volume est précisé et leur concentration en protéines mesurée à l'aide du dosage par BCA (kit PIERCE). Ainsi, le rendement de couplage peut être déterminé = 48% (soit 2,8 mg de protéines par ml de gel). Puis le gel est introduit dans une nouvelle éprouverte de 50 mi et 25 ml d'une solution d'éthanolamine 1 M pH8 sont ajoutés. Les sites actifs résiduels non couplés aux allergènes sont ainsi saturés ; la réaction est réalisée 2 heures à température ambiante. Le gel est essoré sur verre fritte et subit 5 séries successives de lavage ; chaque série est réalisée avec 50 ml de deux tampons : tampon acétate de sodium 0;I M. NaCl 0,5 M, pH 8.
Le gel est ensuite essoré sur verre fritte puis lavé successivement avec 50 ml de tampon citrate glycine 0,1 M pH 2,5 et 50 ml de tampon phosphage 0,1 M pH 7,5.
1.2 Essai d'immunopurification
a) C rcmatQgraphis
L'essai a été réalisé sur une colonne IBF 25 contenant 25 ml de gel susmentionné. Outre la colonne, le système chro atographique se compose de :
. une pompe péristaltique (Gilson, type minipuls 2 ) ; un détecteur UV, DO : 280 nra (Pharmacia, S.P.M. UV - l), équipé d'une cellule HR-10 ; un enregistreur (Pharmacia, REC - 482).
La source à purifier est 700 ml d'un mélange de plasmas dilués au demi avec du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5 (soit 1400 ml au total). Les 1400 ml de plasma dilué (environ 25 g» l" 1 de protéines) ont été injectés dans la colonne à un débit de 70 ml par heure, assurant un temps de séjour d'une vingtaine de minutes. Après lavage avec du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5, les anticorps spécifiques sont élues par du tampon citrate/glycine 0,1 M pH
2,5 (21 g d'acide citrique de pM 210,14 + 6 g de glycine de PM 75, qsp 1 1 d'eau PPI). L'éluat est neutralisé extemporanément avec du Tris solide. b) Suivi analytique
Dosages des classes d'immunoglobulines G, M et A dans l'éluat. Ils sont effectués par néphélémétrie. On utilise un analyseur immunochimique (immuno-chemistry analyser ISC II Beckman). Dosages des Ig E dans l'éluat. Us sont réalisés à l'aide d'un kit EIA (Pharmacia). Electrophorese sur gel de polyacrylamide 4/30 (Pharmacia) en présence de SDS.
2) RESULTATS
Le tableau 1 présenté ci-après, rend compte des résultats obtenus :
Sachant que le volume total de l'éluat (après neutralisation) est de 58 ml, on a ainsi purifié à partir de 700 ml d'un mélange de plasma :
Exemple 2 : activité biologique in vitro des anticorps anti-pollen
L'activité biologique des anticorps anti-pollen purifiés à partir de plasmas sélectionnés ou non sélectionnés par la méthode décrite exemple 1. a été évaluée in vitro à l'aide du test de libération d'histamine par les basophiles de patients allergiques mis en présence d'allergènes, la capacité des anticorps à inhiber cette libération d'histamine a été évaluée sur ce modèle. 1 ) MATERIEL ET METHODES
a) Préparation des solutions et tampons
EDTA 125 mM pH 7,4 dans l'eau distillée.
Glucose-Dextrane : à 3% (p/v) dans du sérum physiologique.
Tampon Tris-albumine, pour le lavage des cellules : Tris 25 mM, NaCl 5 mM, KC1 5 mM, albumine humaine 0,03% (p/v) dans l'eau distillée
(pH 7,6).
Tampon Tris-albumine - Ca 2+ - Mg 2+, pour incubations des cellules dans l'expérience de libération d'histamine proprement dite : Tris 25 mM / NaCl 5 mM, KC1 5 mM / CaCl2, 2 H2 0 0,6 mM / Mg Cl2. 6 H2 0 1 mM, albumine humaine 0,03% (p/U), dans l'eau distillée
(pH = 7,6).
b) Patients
Des patients allergiques au pollen de dactyle (dactylis glomerata) ont été prélevés pour l'isolement de basophiles humains.
c) Extrait de pollen
50 mg de pollen de dactyle fournis par l'Institut Pasteur (Paris, France) sont incubés sous agitation avec 450 ul d'eau distillée pendant 1 h à température ambiante, puis centrifugés à 9 000 g. Le surnageant constitue l'extrait de pollen. d) Fractions d'immunoglobulines
Un mélange de 26 plasmas riches en anticorps anti-pollen et une fraction comportant des IgG, IgM et IgA issue de plasmas normaux (produit IgGAM commercialisé par BioTransfusion, France) ont été immunopurifies selon la technique décrite dans l'exemple 1. Pendant 2 heures sous agitation et à température ambiante, ces fractions immunopurifiees sont préincubées pour différentes concentrations d'immunoglobulines totales avec de l'extrait de pollen de dactyle concentré à 2,5 ou 25 ng/ml en protéines totales, selon la
1 0 sensibilité des basophiles testés (déterminée préalablement). Les dilutions sont réalisées dans du Tris-albumine-Ca -Mg . e) Expérience de libération d'histamine
15 La technique d'histamino-libération employée est celle décrite par May et al.
(1970 Allergy 4£ : 73-89).
Dans cet exemple, toutes les fractions sont testées sur des basophiles issus d'un même patient allergique.
20 f) Dosage d'histamine
Le dosage fluorométrique de l'histamine est effectué selon la technique de Shore et al. (1959 J. Pharmac. exp. Ther. 121 : 182-186) sur une chaîne automatique mise au point par B. Lebel et al. (1983 - Anal. Biochem. 121 : 25 16-29). La méthode comprend une double extraction de l'histamine par le butanol saturé en NaCl en milieu alcalin, puis par l'acide chlorhydrique. Après alcalinisation, l'orthophtaldéhyde forme un fluorochrome avec l'histamine.
302) RESULTATS
La première fraction testée consiste en des immunoglobulines anti-pollen de dactyle immunopurifiees à partir d'un lot de 26 plasmas présélectionnés par méthode ELISA pour leur richesse en IgG4 spécifiques. L'effet inhibiteur de cette fraction 5 est observé à partir d'une concentration 10"^ g/1 en immunoglobulines totales. Cet effet inhibiteur augmente avec la concentration en immunoglobulines pour être totale (100% d'inhibition) dès 10"2 g/1- (Figure 1). La seconde fraction consiste en des immunoglobulines anti-pollen de dactyle immunopurifiees à partir d'une sous-fraction plasmatique issue d'un lot de plasmas non présélectionnés (produit IgGAM, BioTransfusion France).
Cette fraction montre un effet inhibiteur dès la concentration de 10" -5 g/1 en immunoglobulines totales. Cette inhibition est dose-dépendante et quasi-totale pour une concentration en immunoglobulines de 0,4 g/1 (Figure 2).
Par ailleurs, des tests de contrôle ont été effectués, d'une pan avec des fractions d'immunoglobulines non immunopurifiees et sans spécificité particulière, d'autre pan avec un échantillon du lot de 26 plasmas riches en IgG4 spécifiques, non immunopurifié. Les fractions d'immunoglobulines non spécifiques n'ont aucun effet inhibiteur sur la libération d'histamine pour des concentrations en immunoglobulines totales allant de 10"^ à 1 g/1, alors que l'échantillon du lot de plasmas spécifiques montre une légère inhibition pour une concentration de 1 g 1 d'immunoglobulines (et plus).
Cette étude montre que la méthode d'immunopurification décrite permet d'isoler et de concentrer des immunoglobulines ayant un pouvoir inhibiteur sur la libération d'histamine à partir de basophiles humains mis en présence d'allergènes.
En outre, elle montre que la sélection de plasmas spécifiques n'augmente pas l'effet inhibiteur des immunoglobulines purifiées par la méthode de l'invention.
Exemple 3 : séparation des anticorps "primaires" anti-pollen et "secondaires" (anti IgE anti-pollen à partir d'une fraction d'anticorps anti-pollen immunopurifies issue d'un mélange de plasmas riches en anticorps spécifiques
1 ) MATERIEL ET METHODES
1.1 Préparation du support
a) Anticorps anri-IgE
Ce sont des immunoglobulines de chèvre dirigées contre le Fc des IgE humaines (Nordic Immunology).
20 mg de ces anticorps (sous 8 ml) sont dialyses contre 2 litres de tampon NaH CO3 0,1 M, NaCl 0,5 M pH 8,3, 16 heures à +4°C sous agitation. b) Préparation du gel et couplage des anticorps
La méthodologie est celle décrite exemple 1.
Chromatographie
L'essai a été réalisé sur une colonne IBF 11 contenant 5,5 ml du gel susmentionné. Le système chromatographique est identique à celui décrit exemple 1.
La source à purifier est un mélange d'éluats contenant les anticorps anti¬ pollen purifiés selon l'exemple 1, qui a été concentré (8 ml à raison de 1,05 g/1 d'IgG / 0,45 g 1 d'IgM / 0,13 g/1 d'IgA et 10 mg/1 d'IgE) et dialyse 16 heures à +4°C contre du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5.
La source a été injectée dans la colonne à un débit de 14 ml par heure, assurant un temps de séjour d'une vingtaine de minutes. Après lavage avec du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5, les anticorps retenus ont été élues par du tampon citrate/glycine 0,1 M pH 2,5 (cf exemple 1). L'éluat est neutralisé extemporanément avec du Tris solide.
Le filtrat et l'éluat sont récoltés soigneusement. Les dosages des différentes classe d'immunoglobulines sont effectués comme dans l'exemple 1.
2) RESULTATS
Le tableau 2 présenté ci-après, rend compte des résultats obtenus
Les IgG, IgM et IgA présentes dans l'éluat avec les IgE sont des anticorps secondaires ou auto-anticorps. Ceci a été confirmé lorsqu'on a réalisé des immuno- empreintes avec une fraction de cet éluat chauffée 2 heures à 56°C (destruction des Fc des IgE) : les anticorps secondaires ne reconnaissent plus les allergènes immobilisés.
Les IgG, IgM et IgA présentes dans le filtrat sont en revanche des anticorps primaires, réellement dirigés contre les allergènes du pollen de daαyle (ceux-ci sont bien révélés en immuno-empreintes). Exemple 4 : activité biologique in vitro des anticorps primaires anti-pollen et des anticorps secondaires
L'activité biologique des anticorps primaires et secondaires anti-pollen dont la préparation est décrite dans l'exemple 3 a été évaluée de la même manière que dans l'exemple 2.
Dans la figure 3, sont comparées les activités biologiques in vitro
de la fraction purifiée par chromatographie sur allergène immobilisée (dite fraction de départ) ; - du filtrat c'est-à-dire fraction non retenue après passage dans la colonne comportant des anticorps anti-IgE humaines immobilisés, de la fraction de départ; de l'éluat c'est-à-dire les fractions retenues après passage dans la colonne comportant des anticorps anti-IgE humaines immobilisés, de la fraction de départ.
La fraction "anticorps primaires" est la fraction non retenue (filtrat). Elle est considérablement appauvrie en IgE, comme l'indique l'exemple 3. La figure 3 indique un effet biologique in vitro de cette fraction, équivalent à celui de la fraction de départ (en dépit d'une absence d'activité à 10"4 g/1).
La fraction "anticorps secondaires" qui contient les IgE anti-pollen de dactyle est la fraction retenue (éluat). La figure 3 indique également que l'effet biologique de cette fraction est peu différent de celui de la fraction de départ
Ces résultats indiquent que le pouvoir inhibiteur de la libération d'histamine, de la fraction purifiée selon l'exemple 1, est porté à la fois par des immunoglobulines primaires dirigées, contre les allergènes de pollen et par des immunoglobulines secondaires ou auto-anticorps anti-IgE, et ce, de façon équivalente. CONCLUSION
L'ensemble des résultats présentés dans les exemples ci-dessus, indique qu'il est possible de purifier, à partir de plasmas humains, sélectionnés ou non, en une étape, un mélange d'immunoglobulines spécifiques d'allergènes et présentant une activité anti- o allergénique importante.
Cette activité est apportée par toutes les classes d'immunoglobulines à savoir IgG, IgM, IgA et IgE.
5 Elle est le fait en outre des anticorps primaires anti-allergènes et des anticorps secondaires ou auto-anticorps anti-IgE.
L'utilisation d'un tel mélange d'immunoglobulines purifiées à partir de plasmas normaux, est donc particulièrement prometteuse pour la prévention et le traitement de o l'allergie.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique riche en immunoglobulines 5 spécifiques destinée au traitement et à la prévention des symptômes allergiques liés à un ou plusieurs allergènes, caractérisée en ce que lesdites immunoglobulines sont un mélange contenant des anticorps primaires anti-aliergène et des anticorps secondaires principalement anti-isotype d'IgE obtenus à partir de plasmas ou sérums humains, non sélectionnés, 10 purifiés par chromatographie d'affinité sur des antigènes spécifiques immobilisés.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication I, caractérisée en ce que les anticorps sont dirigés contre la fraction hydrosoluble des allergènes de pollen de graminés.
I-5 3. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications
1 et 2, caractérisée en ce qu'elle contient un mélange d'IgG, IgM, IgA et
ι*. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient un mélange d'anticorps primaires 0 anti-pollen, et d'anticorps secondaires, principalement anti-isotype d'IgE, ou auto-anticorps.
5. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications l à *, caractérisée en ce que les anticorps présentent une pureté protéique supérieure ou égale à 50%. 5 6. Procédé de purification des anticorps, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de chromatographie d'immuno-affinité utilisant des allergènes communs aux pollens de graminées, immobilisés sur un support.
.7. Procédé de purification selon la revendication 6, caractérisé 0 en ce que les allergènes utilisés proviennent de préférence de dactylis glomerata.
8. Procédé de purification selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que les allergènes sont immobilisés sur un support de manière à laisser leurs épitopes accessibles aux anticorps. 9. Procédé de purification selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le support est une résine qui comporte des fonctions carboxyles et que les antigènes sont liés au support par leurs fonctions aminés.
10. Anticorps pouvant être obtenus par le procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisés en ce qu'ils sont utilisés pour la prévention ou le traitement des allergies.
EP93902289A 1991-12-03 1992-12-03 Composition pharmaceutique contenant des anticorps anti-allergenes, procede de purification de ces anticorps et anticorps ainsi obtenus Withdrawn EP0618928A1 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9114954 1991-12-03
FR9114954A FR2684384B1 (fr) 1991-12-03 1991-12-03 Anticorps anti-allergenes, procede de purification de ces anticorps et composition pharmaceutique les contenant.
PCT/FR1992/001139 WO1993011160A1 (fr) 1991-12-03 1992-12-03 Composition pharmaceutique contenant des anticorps anti-allergenes, procede de purification de ces anticorps et anticorps ainsi obtenus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0618928A1 true EP0618928A1 (fr) 1994-10-12

Family

ID=9419617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP93902289A Withdrawn EP0618928A1 (fr) 1991-12-03 1992-12-03 Composition pharmaceutique contenant des anticorps anti-allergenes, procede de purification de ces anticorps et anticorps ainsi obtenus

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0618928A1 (fr)
FR (1) FR2684384B1 (fr)
WO (1) WO1993011160A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08501799A (ja) * 1992-12-21 1996-02-27 タノックス バイオシステムズ インコーポレイテッド アレルゲン特異的ＩｇＡモノクローナル抗体及びアレルギー治療のための関連物質

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1336818C (fr) * 1987-04-16 1995-08-29 International Institute Of Cellular And Molecular Pathology Traitement contre l'allergie et composition utilisee
JPH0325366A (ja) * 1989-06-22 1991-02-04 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 特異抗体の測定法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9311160A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1993011160A1 (fr) 1993-06-10
FR2684384A1 (fr) 1993-06-04
FR2684384B1 (fr) 1995-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
van Ree et al. Lol p XI, a new major grass pollen allergen, is a member of a family of soybean trypsin inhibitor-related proteins
Dessaint et al. Quantitative determination of specific IgE antibodies to Echinococcus granulosus and IgE levels in sera from patients with hydatid disease.
EP0498854A1 (fr) Serums antivenimeux et leurs procedes de fabrication
WO2000074717A1 (fr) NOUVELLES FRACTIONS D'Ig POSSEDANT UNE ACTIVITE IMMUNOMODULATRICE
CA2084876A1 (fr) Antigenes specifiquement reconnus par des anticorps specifiques de la polyarthrite rhumatoide, leurs proteines constitutives, leur preparation et leurs applications
WO1993011160A1 (fr) Composition pharmaceutique contenant des anticorps anti-allergenes, procede de purification de ces anticorps et anticorps ainsi obtenus
RU2114636C1 (ru) Противоядие, способ его получения, фармацевтическая композиция, способ противодействия яду и комплект
FR2543300A1 (fr) Reactif serologique
EP3449256A1 (fr) Anticorps anti il17
WO1991011463A1 (fr) Facteur endogene cerebral, procede d'obtention et applications therapeutiques et diagnostiques
EP0243390B1 (fr) Nouvelle proteine de mammifere ayant une activite immunomodulatrice et progestative
EP0527768B1 (fr) Anticorps purifies specifiquement diriges contre les lipopolysaccharides (lps) des bacteries gram negatif
WO2002050550A2 (fr) Fractions de ldl oxydees
CN113637072B (zh) 一种抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法及其应用
WO1987007303A1 (fr) Nouvelle lymphokine suppressive de l'activation plaquettaire
WO1986005099A1 (fr) Preparations d'immunoglobulines presentant des titres eleves en anticorps bloquants
EP0100734B1 (fr) Procédé de séparation ou de purification d'un facteur favorisant le sommeil à partir d'un milieu biologique par une réaction immunologique du type antigène-anticorps
US6613326B1 (en) Antitoxins and methods for making antitoxins
RU2304587C2 (ru) СПОСОБ СЕЛЕКТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ IgY ИЗ ЯИЧНОГО ЖЕЛТКА ПТИЦ ОТРЯДА ГУСЕОБРАЗНЫХ (ВАРИАНТЫ)
FR2507478A1 (fr) Procede pour preparer l'antigene de surface de l'hepatite b pur a partir du plasma humain
FR2641538A1 (fr) Facteur inhibiteur du complement, sa caracterisation et ses applications
JPS63500592A (ja) ウロモドゥリンの製造方法
FR3108515A1 (fr) Colonne d’aphérèse pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde
WO2021074376A1 (fr) Nouveaux anticorps monoclonaux therapeutiques humains et leurs utilisations
Malley et al. Allergen-Reagin-Mediated Histamine Release Reactions: I. Role of the Alternate Complement Pathway

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19940620

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 19980701