WO2002050550A2 - Fractions de ldl oxydees - Google Patents

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WO2002050550A2
WO2002050550A2 PCT/EP2001/015279 EP0115279W WO0250550A2 WO 2002050550 A2 WO2002050550 A2 WO 2002050550A2 EP 0115279 W EP0115279 W EP 0115279W WO 0250550 A2 WO0250550 A2 WO 0250550A2
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ldl
fraction
oxidized
antibody
monoclonal antibody
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PCT/EP2001/015279
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Alex Bollen
Nicole Moguilevsky
Yvon Carpentier
Jean Ducobu
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Henogen S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to the use of myeloperoxidases for obtaining oxidized lipoproteins and corresponding monoclonal antibodies, the oxidized LDL fractions and the new monoclonal antibodies obtained from these fractions, the lines producing these antibodies, the diagnostic use and therapeutic of these antibodies and lines, in particular a diagnostic test for determining the cardiovascular risk as well as diagnostic application kits.
  • MPO Myeloperoxidase
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • Patent document WO 98/59248 (PCT / BE98 / 59248) 2 discloses a method of immunodetection of LDL oxidized and modified by malondialdehyde (MDA) and associated antibodies. Oxidation does not, however, optimally simulate the natural process.
  • MDA malondialdehyde
  • One of the aims of the present invention is to propose a diagnostic test capable of measuring parameters allowing a more precise and earlier detection of patients at risk, by referring to an oxidative process of LDL occurring in vivo.
  • the present invention also provides antibodies monoclonals, as well as the corresponding hybridomas, capable of recognizing specific fractions of lipoproteins oxidized by hypochlorous acid, for example in the presence of myeloperoxidase, and therefore of being used for immunodetection and the determination of these oxidized lipoproteins.
  • Such a dosage can advantageously reflect a cardiovascular risk factor.
  • a test is generally proposed for determining the cardiovascular risk of a patient comprising the following steps which will be explained later:
  • a marker which can be for example a peroxidase coupled to the polyclonal antibody or a detection antibody, eg if the polyclonal antiapo-B antibody is a rabbit antibody, a goat anti-IgG (Fc) antibody rabbit coupled to alkaline phosphatase - determination of LDLox concentration.
  • a marker which can be for example a peroxidase coupled to the polyclonal antibody or a detection antibody, eg if the polyclonal antiapo-B antibody is a rabbit antibody, a goat anti-IgG (Fc) antibody rabbit coupled to alkaline phosphatase - determination of LDLox concentration.
  • the rate of LDL oxidation of a given patient constitutes a promising method for defining the propensity of this given patient to develop cardiovascular diseases.
  • one of the main factors intervening at an early stage in the formation of the atheromatosis lesion is the peroxidation of LDL.
  • oxidized LDL (oxLDL) are very quickly taken up by macrophages of the arterial wall, the measurement of their concentration alone may not be representative of their production in vivo.
  • the susceptibility of LDL, of a given subject to undergo peroxidative damage can be evaluated by an in-vitro test.
  • a test is proposed based on the detection of natural autoantibodies in the plasma, directed against LDLs naturally oxidized by myeloperoxidase.
  • an immunotherapeutic treatment method which consists in treating the blood of a patient in order to remove the oxidized LDL antigens therefrom.
  • This method consists in passing the blood, or a fraction of blood, of a patient through a system where he will come into contact with anti-fraction B antibodies immobilized by a fraction B of oxidized LDL, for example on a column of immunoadsorption, before being returned to the patient, the blood or the fraction of blood being at least partially rid of said oxidized LDL.
  • - Fig. 1 is an oxidized LDL chromatogram according to the invention showing the separation of the sub-fractions
  • - Fig. 2 represents a graph of the concentrations in sub-fractions as a function of the oxidation time
  • - Fig. 3 illustrates the recognition of the subfraction B by 3 monoclonal antibodies according to the invention
  • Figs. 4a to 4c illustrate the specificity of the antibodies with respect to the recognized epitopes, by means of competitive ELISA test
  • FIG. 5 illustrates the ELISA sandwich test results for measuring circulating oxidized LDL for 13 patients and a negative control
  • - - FIG. 6 is a diagram illustrating the procedure for a test for measuring sensitivity to ex-vivo oxidation of LDL
  • FIG. 7 illustrates the result of tests according to FIG. 6 for 33 patients compared to a control population.
  • One of the aims of the invention is to provide antibodies specifically directed against certain oxidized LDL subfractions as they are generated in biological systems.
  • These oxidized LDL fractions can be prepared by oxidation with the H 2 O 2 / chloride system generating hypochlorous acid in the presence of a myeloperoxidase.
  • the myeloperoxidase can be produced from the CHO clone producing the recombinant myeloperoxidase MPOr.
  • the clone which was used in the context of the present invention is clone 24-1-7-57 and was cultured in Opticell (Charles River). In this system, the cells adhere to a ceramic support (Opticore) with a surface area of 4,500 cm2 and the culture medium is continuously perfused.
  • Opticore ceramic support
  • pH, temperature, oxygen content, C02, and glucose concentration are constantly monitored.
  • the culture can be maintained for 2 months.
  • the maximum production is around 30 days.
  • the cells can be kept in culture in a "cell factory", the culture supernatant also being harvested every 3 days, and the culture can be kept for 2 months.
  • a filtration system composed of a high-flow peristaltic pump (Watson Marlow 505 s) and a tangential filter (Ultrasette, Filtron) were used.
  • This apparatus allows simultaneous filtration and concentration of culture supernatant before depositing on the column. After a concentration of 10 times, the supernatant is diluted approximately 2 times until reaching the resistivity of 4 mS / cm, equivalent to that of the column equilibration buffer. No loss of MPO was detected in the filtrate analyzed by Western blot, and on the other hand by ELISA, a loss of approximately 0.7% was noted there.
  • This tangential filtration system therefore proves to be extremely useful and reliable for the treatment of large volumes of culture supernatant to be purified.
  • the fractions were assayed for protein concentration (Lowry assay) and peroxidase activity (o-dianisidine as substrate). The most active fraction corresponds to the top of the elution and chlorination peak (with monchlorodimon as the substrate).
  • the two bands of 84 and 94 kDa correspond to forms of proMPO exhibiting different degrees of glycosylation.
  • the 84 kDa band would correspond mainly to the protein exhibiting mannose-rich glysosylated chains, while the 94 kDa form would present complex glycosylation chains, up to sialic acid.
  • Recombinant MPO appears in the form of 2 bands of 84 and 94 kDa, having the same protein sequence, but differing in the nature of their glycosylations.
  • the oxidative alterations that can occur at the LDL level are mainly of two types, on the one hand lipid peroxidation and on the other hand oxidative modifications at the apoB level.
  • One of the most commonly used models for triggering LDL oxidation in vitro is based on the use of copper (Cu ++) as an oxidizing agent (Esterbauer et al.). This model evaluates over time the increase in degradation products of the lipid components of LDL and provides information mainly on the antioxidant status of these lipoproteins.
  • Cu ++ copper
  • MPO oxidizing agents
  • H202 hydrogen peroxide
  • the supply of the hydrogen peroxide substrate was carried out in two ways: progressive production of hydrogen peroxide derived from the transformation of the glucose by glucose oxidase on the one hand, direct addition of hydrogen peroxide in the oxidation medium on the other hand.
  • the oxidation conditions at MPO are as follows:
  • the separation of the oxidized LDL subfractions can be carried out using a Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) type chromatography with an Mono Q anion exchange column.
  • FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
  • the different oxidation subfractions indeed have electronegative charges depending on their degree of alteration. It has been found that fractions (A, B, C, etc.) can thus be eluted from the column using buffers containing increasing concentrations of NaCl.
  • Fig. 1 illustrates the excellent separation of the oxidized fractions B, C and D obtained with elongation of the salt plates corresponding to the passage of the fractions.
  • the FPLC results clearly show that the oxidative damage linked to MPO occurs within the first 5 minutes regardless of the oxidative system (glucose / glucose oxidase or H 2 0 2 ).
  • Fig. 2 illustrates the kinetics of appearance of oxidized fractions with hydrogen peroxide (MP0 / H 2 0 2) to concentrations of H 2 0 2 179 microM. It is found that after 5 minutes, the reaction is almost complete.
  • Electrophoresis performed after oxidative stress shows that the damage caused by the system
  • MPO / Glucose oxidase mainly consist of fragments of the apoB protein whereas the MPO / H202 system gives rise mainly to aggregations.
  • Eicosapentaenoic acid (C20: 5n-3) 1.3 0.9 Docosahexaenoic acid (C22: 6 n-3) 4.6 3.1
  • the antigens against which the monoclonal antibodies of the present invention are directed consist of the various oxidized fractions of LDL, more particularly however against fraction B.
  • One of the aims of the invention is to be able to differentiate very oxidized fractions (fractions C and D) from fractions not or only slightly oxidized (fractions A and B) in order to LDL of patients appearing to oxidize more quickly than those of normal subjects. to be able to quantitatively determine the presence of fraction B.
  • the invention also relates to hybridomas which can be used for the production of the above-mentioned antibodies.
  • Hybridomas are obtained, for example, in a conventional manner by fusion of non-secreting myeloma cells P3 x 3Ag8.653 (ATCC CRL-1580) with the spleen cells of the immunized mouse, in the presence of polyethylene glycol 4.000.
  • the fused cells are distributed in boxes of 96 wells preincubated with mouse peritoneal macrophages in the presence of a selection medium containing hypoxantine, aminopterin and thymidine. The medium is replaced on day 7 by a non-selective medium. Two weeks after the fusion, the supernatants of the clones are screened for the presence of specific antibodies on each of the fractions A to D of oxidized LDL, as well as on MPO.
  • the purified antigen fraction of oxidized LDL
  • the supernatant alone or in competition with a purified fraction, is deposited on the plate.
  • the fixed antibody is then revealed by a second antibody directed against mouse IgG and coupled to alkaline phosphatase.
  • the two antibodies recognize different epitopes.
  • the anti-fraction B antibody would recognize an early alteration caused mainly by HOC1 while the anti-fraction C / D antibody would be directed against damage caused not only by HOCl but also by other radical reactions and / or rearrangements obtained by oxidation due to the MPO-glucose oxidase system. With the MPO / H 2 0 2 system, no D fraction is observed.
  • a monoclonal antibody directed against a poorly oxidized epitope of LDL (fraction B) was characterized.
  • the mice were immunized according to the same protocol as above, with the difference that the antigen fraction B was injected in the presence of aluminum hydroxide.
  • This fraction B was oxidized using MPO in the presence of H 2 0.
  • Four hybridomas AG9, AE2, EB2 and EF2 secreting monoclonal antibodies directed against fraction B of LDL were obtained.
  • the supernatants of the AE2, AG9, EB2 and EF2 subclones were tested not only for their antigenic specificity against the different fractions but also for their belonging to the different classes and subclasses of 1 immunoglobulins. These clones are of class IgG and of subclass IgG1, the light chain is of type K. These hybridomas secrete monoclonal antibodies of specificity directed against fraction B oxidized by rMPO. Three secretory hybridomas were gradually adapted to culture without serum in hybridoma medium SFM (Life Technologies).
  • the supernatants of these 3 secreting hybridomas were purified by passage through a column of Protein A-Sepharose CL-4B conditioned in PBS at pH 8. The elution was carried out in 0.1M citric acid at different pH, (6.5 15
  • the hybridomas AG948F4A2, EB2E9G621H2, EB2G3G2 and 14A2G6 were deposited at the BCCM (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms on December 19, 2001 under the following provisional numbers: 1) 14A2G6 -> LMBP 5828CB
  • the labeling of the antibodies with iodine 125 was carried out using IODO-Beads (Pierce) beads carrying chloramine-T. These labeled antibodies were purified on 5 ml columns of Sephadex-G25 Fine resin (Pharmacia) and characterized by TCA precipitation.
  • FIGS. 4a-bc represent the graphs of the ELISA tests of competition between a labeled antibody (AG948F4A2, EB2G3G2, 14A2G6) and the other unlabeled monoclonal antibodies. Given the inhibition of the signal, it can be concluded that the three antibodies directed against fraction B of oxidized LDL, although exhibiting different behavior, recognize at least part of the same epitope. On the other hand, the antibody 14A2G6 recognizes an epitope different from the other antibodies, its signal remaining constant in the presence of the other antibodies.
  • the affinity of several antibodies according to the invention was estimated by carrying out competitive ELISA tests as above, the only difference being the competition of the labeled antibody with its cold counterpart.
  • the antibodies have been observed to have an affinity of the order of 5 ⁇ 10 -8 M for EB2E9G621H2, EB22G3G2, AG948F4A2 and approximately 10 ⁇ 9 M for 14A2G6. These values were measured by taking the concentration of antibody inducing a percentage d 'inhibition equal to 50%.
  • the antibodies according to the invention keep very well at least for two years at 4 ° C, - 20 ° C and -80 ° C (in the presence of glycerol for -20 ° C). These antibodies will preferably be stored around -20 ° C or -80 ° C.
  • the LDLox according to the invention placed in a 50 mM Tris / HCl buffer solution pH 8.8 are deposited on a column (1.5 x 15 cm) of DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) and immediately, a gradient linear from Triton X-100 from 0 to 2% is applied (60ml). After elution of the lipids with the detergent, the apo LDL (apo BlOO ox) is eluted with the buffer 50 mM Tris / HCl pH 7.4, containing 1M NaCl.
  • Apo BlOO ox analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis, presents a single band immunoreactive with the anti apo BlOO antiserum and with monoclonal antibodies.
  • the dose-response curve of native LDL (at plasma concentration) was also tested in parallel with the corresponding original plasma. As expected, increasing concentrations of native LDL cause a proportional increase in the signal. However, the response obtained for plasma is zero or clearly lower than that of native LDL. This indicates that one (or more) component (s) of the plasma can inhibit the recognition of LDLox by the monoclonals.
  • the reliability of the test was confirmed, by verifying that the apoB not modified by MPO, and present on LDL as well as on VLDL, could not compete with the modified apoB, at the level of the monoclonal antibody.
  • the dose-response curve for native LDLs shows a signal that may correspond to the presence of a small proportion of oxidized LDLs in these native LDLs.
  • albumin does not interfere with the antibody-antigen bond.
  • the sample can be pre-purified using semi-permeable membranes allowing the elimination of molecules up to 100,000 Da.
  • IgG can be removed by immunoprecipitation techniques.
  • a preferred variant of the test for direct measurement of circulating naturally oxidized LDLs consists of a sandwich ELISA test described below:
  • the kinetic characteristics of the oxidation of LDL by myeloperoxidase are also advantageously used for diagnostic purposes.
  • LDL oxidation was thus carried out on a microplate in order to develop one of the tests according to the invention based on the kinetics of the oxidation.
  • This test includes 3 steps:
  • the assay procedure is illustrated in FIG. 6.
  • the patients with a sensitivity to oxidation higher than the “normal” it was particularly interesting to note that some did not present classic risk factors such as as high cholesterol and / or triglycerides, or more recent as small and dense LDL or Lp (a), and that however they presented a severe coronary artery disease (unstable angina, infarction, ).
  • FIG. 7 thus illustrates a comparison of the sensitivity to LDL oxidation of 33 patients compared to a control population, the results being expressed as a percentage relative to the control.
  • a test is proposed based on the detection of natural antibodies (hereinafter called autoantibodies) in the plasma, directed against LDL oxidized by myeloperoxidase.
  • autoantibodies natural antibodies
  • the plasma contains autoantibodies directed specifically against the LDL fractions oxidized by myeloperoxidase in the presence of H 2 0 2 , and not against the fractions obtained by oxidation with other agents such as copper sulphate, the AAPH or an azoinitiator.
  • the level of autoantibodies recognizing these oxidized LDLs is a reflection of the oxidative status insofar as the modification of LDLs results in the appearance of new epitopes making the lipoproteins more antigenic.
  • This assay also makes it possible to evaluate the capacity of the immune system to respond to the appearance of these modified LDLs.
  • an ELISA type test is therefore proposed, making it possible to quantitatively determine the presence of autoantibodies against specific subfractions in patients with cardiovascular pathology.
  • the invention therefore demonstrates the feasibility and the advantages of the LDL assay modified by the action of MPO in the circulation. 7. Therapeutic and preventive applications
  • an immunotherapeutic treatment method which consists in treating the blood of a patient in order to remove the antigens (fractions of oxidized LDL, in particular fraction B).
  • This method consists in passing the blood, or a fraction of blood, of a patient through a system where he will come into contact with anti-fraction B antibodies immobilized by a fraction B of oxidized LDL, for example on a column of specific immunoabsorption, before being returned to the patient, the blood or the fraction of blood being freed from said autoantibodies.
  • passive immunization is proposed by administration to a patient at risk of antibodies according to the invention, by injection or perfusion.
  • This type of treatment could be applied, for example, after a bypass surgery.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de myéloperoxydases pour l'obtention de lipoprotéines oxydées et des anticorps monoclonaux correspondants. Différentes fractions de LDL oxydées sont isolées et de nouveaux anticorps monoclonaux sont obtenus à partir de ces fractions. Ces anticorps sont aptes à être utilisés dans un but diagnostique, préventif ou thérapeutique. Plusieurs lignées productrices de ces anticorps ont également été isolées et caractérisées. L'invention propose aussi des tests et des kits associés pour le diagnostic et la détermination du risque cardiovasculaire.

Description

Fractions de LDL oxydées, anticorps correspondants, procédé d' obtention et utilisation à but diagnostique ou thérapeutique
La présente invention concerne l'utilisation de myeloperoxydases pour l'obtention de lipoprotéines oxydées et des anticorps monoclonaux correspondants, les fractions de LDL oxydées et les nouveaux anticorps monoclonaux obtenus à partir de ces fractions, les lignées productrices de ces anticorps, l'utilisation diagnostique et thérapeutique de ces anticorps et lignées, en particulier un test diagnostique pour la détermination du risque cardio-vasculaire ainsi que des kits d'application diagnostique.
La myéloperoxydase (MPO) est une enzyme présente dans les neutrophiles et monocytes, apte à catalyser les réactions d'oxydation dans l'espace sous-endothélial . Il est bien connu que cette oxydation fait intervenir, à partir de peroxyde d'hydrogène, l'acide hypochloreux produit en présence de la MPO et de chlorure.
Par ailleurs on sait que les lipoprotéines de faible densité (Low Density Lipoprotein, LDL) , sous forme oxydées, sont impliquées dans certaines affections cardiovasculaires, en particulier l'athérosclérose. On a ainsi rapporté la présence de LDL modifiées par l'acide hypochloreux dans des lésions athéromateuses .
Le test basé sur ces lipoprotéines actuellement utilisé pour définir la propension d'un patient donné à développer des maladies cardiovasculaires fait appel à un agent pro-oxydant très puissant et non physiologique, le sulfate de cuivre (CuS04) . Ce test est toutefois peu précis et se déroule dans des conditions très éloignées des conditions in vivo.
De nombreuses autres méthodes de diagnostic et d'analyse se basant sur les produits d'oxydation des LDL ont été divulguées. On peut citer à titre d'exemple les documents de brevet 5.874.313, WO 98/21581, WO 99/08109, WO 98/12561 et W0 98/10294. Ce dernier document propose une méthode diagnostique basée sur la mesure de la concentration en 3-chlorotyrosine dans les liquides biologiques et les tissus, cette substance étant produite spécifiquement par le système MP0/C1/H202. On mentionne dans ce document que la mesure peut éventuellement être menée par immunoessai à l'aide d'anticorps produits contre la 3-chlorotyrosine .
Le document de brevet WO 98/59248 (PCT/BE98/59248 ) 2 divulgue un procédé d' immuno-détection de LDL oxydées et modifiées par la malondialdéhyde (MDA) et des anticorps associés. L'oxydation ne simule cependant pas de manière optimale le processus naturel.
Un des buts de la présente invention est de proposer un test diagnostique capable de mesurer des paramètres permettant une détection plus précise et plus précoce des patients à risque, en se référant à un processus oxydatif des LDL survenant in vivo.
La mise au point de ce test a fait intervenir une myéloperoxydase. On peut en particulier utiliser une myéloperoxydase recombinante humaine aux propriétés identiques à celles de la myéloperoxydase naturelle.
La présente invention propose également des anticorps monoclonaux, ainsi que les hybridomes correspondants, capables de reconnaître des fractions spécifiques de lipoprotéines oxydées par l'acide hypochloreux, par exemple en présence de myéloperoxydase, et donc d'être utilisés pour 1 ' immunodétection et le dosage de ces lipoprotéines oxydées. Pareil dosage peut avantageusement refléter un facteur de risque cardio-vasculaire .
Selon un aspect de l'invention, on propose de manière générale un test pour la détermination du risque cardio-vasculaire d'un patient comprenant les étapes suivantes qui seront explicitées ultérieurement :
- fixation d'un anticorps monoclonal anti-fraction B sur une plaque - extraction des LDL oxydées du plasma par adsorption sur l'anticorps monoclonal
- reconnaissance des LDL fixées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-apoB
- révélation par un marqueur qui peut être par exemple une peroxydase couplée à l'anticorps polyclonal ou un anticorps de détection, p.e. si l'anticorps polyclonal antiapo-B est un anticorps de lapin, un anticorps de chèvre anti-IgG(Fc) de lapin couplé à la phosphatase alcaline - détermination de la concentration en LDLox.
Selon un autre aspect de l'invention, on a constaté que la vitesse d'oxydation des LDL d'un patient donné constitue une méthode prometteuse pour définir la propension de ce patient donné à développer des maladies cardiovasculaires. Comme déjà évoqué, un des principaux facteurs intervenant à un stade précoce dans la formation de la lésion d' athéromatose est la peroxydation des LDL. Comme les LDL oxydées (oxLDL) sont très rapidement captées par les macrophages de la paroi artérielle, la mesure de leur concentration seule pourrait n'être pas représentative de leur production in vivo. Par contre, la susceptibilité des LDL, d'un sujet donné à subir des dommages peroxydatifs peut être évaluée par un test in-vitro.
Selon encore un autre aspect de l'invention on propose un test basé sur la détection d' autoanticorps naturels dans le plasma, dirigés contre des LDL oxydées naturellement par la myéloperoxydase
Selon encore un autre aspect de l'invention, on propose une méthode de traitement immunotherapeutique consistant à traiter le sang d'un patient pour en retirer les antigènes LDL oxydées. Cette méthode consiste à faire passer le sang , ou une fraction de sang, d'un patient dans un système ou il entrera en contact avec des anticorps anti-fraction B immobilisés par une fraction B de LDL oxydée, par exemple sur une colonne d' immunoadsorption, avant d'être retourné au patient, le sang ou la fraction de sang étant au moins partiellement débarrassé desdites LDL oxydées.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention est décrite plus en détail en se référant à des modes particuliers de réalisation décrits ci-après et aux figures annexées à titre d'exemple non-limitatifs.
Dans ces annexes,
- la Fig. 1 est un chromatogramme de LDL oxydée selon l'invention montrant la séparation des sous-fractions
B, C, D,
- la Fig. 2 représente un graphique des concentrations en sous-fractions en fonction du temps d'oxydation, - la Fig. 3 illustre la reconnaissance de la sous- fraction B par 3 anticorps monoclonaux selon l' invention,
- les Figs. 4a à 4c illustrent la spécificité des anticorps vis à vis des épitopes reconnus, au moyen de test ELISA de compétition,
- la Fig. 5 illustre les résultats de test ELISA sandwich de mesure de LDL oxydées circulantes pour 13 patients et un témoin négatif, - - la Fig. 6 est un schéma illustrant la procédure pour un test de mesure de sensibilité à l'oxydation ex-vivo de LDL
- la Fig. 7 illustre le résultat de tests selon la Fig. 6 pour 33 patients par rapport à une population contrôle.
Un des buts de l'invention est de proposer des anticorps spécifiquement dirigés contre certaines sous-fractions de LDL oxydées telles qu'elles sont générées dans les systèmes biologiques. Ces fractions de LDL oxydées peuvent être préparées par oxydation avec le système H202/chlorure générant l'acide hypochloreux en présence d'une myéloperoxydase.
On décrit ci-après l'obtention de myéloperoxydase, l'oxydation de LDL, la séparation des fractions obtenues, la production d' hybridomes et la production d'anticorps spécifiques aux fractions oxydées, ainsi que l'utilisation de ces anticorps pour le détection et le dosage de LDL oxydée dans un but diagnostic ou thérapeutique. 1. Production de la myéloperoxydase
La myéloperoxydase peut être produite à partir du clone CHO producteur de la myéloperoxydase recombinante MPOr. Le clone qui a été utilisé dans le cadre de la présente invention est le clone 24-1-7-57 et a été mis en culture Opticell (Charles River) . Dans ce système les cellules adhèrent à un support de céramique (Opticore) de 4.500 cm2 de surface et le milieu de culture est perfusé en continu. Plusieurs paramètres sont contrôlés en permanence: le pH, la température, la teneur en oxygène, en C02, et la concentration en glucose.
Chaque jour, les concentrations du milieu en lactate et en glucose sont mesurées ainsi que l'activité peroxydasique due à la myéloperoxydase synthétisée et sécrétée dans le milieu.
La culture peut être maintenue pendant 2 mois. Le maximum de production se situe aux environs de 30 jours.
Tous les 3 jours environ, l'entiereté du milieu de culture est récoltée, centrifugée et conservée.
Alternativement, les cellules peuvent être maintenues en culture en « cell factory », le surnageant de culture étant aussi récolté tous les 3 jours, et la culture pouvant être maintenue 2 mois.
Avant chaque purification, il est nécessaire de purifier les surnageants de culture afin d'en éliminer les débris cellulaires. A cette fin, un système de filtration composé d'une pompe péristaltique à haut débit (Watson Marlow 505 s) et d'un filtre tangentiel (Ultrasette, Filtron) ont été utilisés. Cet appareillage permet la filtration et la concentration simultanées de surnageant de culture avant le dépôt sur la colonne. Après une concentration de 10 fois, le surnageant est dilué environ 2 fois jusqu'à atteindre la résistivité de 4mS/cm, équivalente à celle du tampon d'équilibrage de la colonne. Aucune perte en MPO n'a été détectée dans le filtrat analysé par Western blot, et par contre par ELISA, une perte d'environ 0,7% y a été relevée.
Ce système de filtration tangentielle s'avère donc extrêmement utile et fiable pour le traitement de grands volumes de surnageant de culture à purifier.
A chaque purification, environ 10 1 de surnageant de culture filtrés, concentrés et équilibrés au niveau du pH et de la force ionique sont déposés sur une colonne de Q Sepharose Fast Flow (10 cm x 20 cm, 1570 ml de gel) équilibrée en tampon de phosphate 20 mM pH 7,5. Cette colonne échangeuse d'anions, retenant les contaminants - principalement les protéines sériques, est directement connectée à une colonne de CM-Sepharose (3,5 cm x 15 cm), échangeuse de cations sur laquelle la MPOr est retenue et est éluée à l'aide d'un Gradient de NaCl de 0 à 0,6 M (900 ml) . La MPOr est décrochée à la concentration d'environ 0,28 M NaCl et sort sous forme d'un pic protéique unique. L'activité peroxydasique est parfaitement superposable au pic mesuré à 280 nm.
L'analyse de la pureté des fractions éluées a été réalisée par électrophorèse sur gel en conditions non réductrices et en présence de SDS. A la coloration au bleu de Coomassie, la NIPOR apparaît sous forme de 2 bandes de 84 et 94 kDa. Cette seconde bande de 94 kDa est immunoréactive et correspond à une fraction mineure de la MPO .
Les fractions ont été dosées pour la concentration en protéines (dosage de Lowry) et en activité peroxydasique (o-dianisidine comme substrat) . La fraction la plus active correspond au sommet du pic d'élution et de chloration (avec le monchlorodimédon comme substrat) .
Selon les analyses des sucres déjà effectuées, les deux bandes de 84 et 94 kDa correspondent à des formes de proMPO exposant des degrés de glycosylation différents. La bande de 84 kDa correspondrait majoritairement à la protéine exposant des chaînes glysosylées riche en mannose, tandis que la forme de 94 kDa présenterait des chaînes de glycosylation complexe, allant jusqu'à l'acide sialique .
A partir de 80 1 de surnageant de culture, 370 mg de MPO pure ont été obtenus, soit environ 4,5 mg/1. La MPO recombinante apparaît sous forme de 2 bandes de 84 et 94 kDa, ayant la même séquence protéique, mais différant par la nature de leurs glycosylations .
2 Production de sous-fractions de LDL oxydées par la myéloperoxydase
Les altérations oxydatives pouvant survenir au niveau des LDL sont principalement de deux types, d'une part la peroxydation des lipides et d'autre part des modifications oxydatives au niveau de l'apoB. L'un des modèles utilisé le plus couramment pour déclencher une oxydation des LDL in vitro est basé sur l'utilisation du cuivre (Cu++) comme agent oxydant (Esterbauer et al.). Ce modèle évalue au cours du temps l'augmentation des produits de dégradation des composants lipidiques des LDL et renseigne principalement sur le statut en antioxydant de ces lipoprotéines. Cependant, l'utilisation du Cu++ comme agent pro-oxydant reste très controversée étant donné que son implication au niveau des pathologies cardiovasculaires n'a pas été démontrée de façon formelle. Par contre, d'autres agents oxydants tels que l'acide hypochloreux, généré par la MPO, semble bien figurer parmi les principaux initiateurs de la formation des cellules spumeuses et donc dans le développement de plaques d'athéromes. En effet, l'implication de la MPO dans l'oxydation in vivo et dans la pathogénie des maladies cardio-vasculaires est fortement suggérée par la présence de MPO et de dérivés oxydés de la tyrosine, notamment la dityrosine ou encore la 3-chlorotyrosine, dans les lésions athéromateuses . La MPO utilise en fait le peroxyde d'hydrogène (H202) comme substrat pour oxyder les halogènures tels que les ions chlorure, permettant ainsi la formation d'acide hypochloreux, agent très toxique et microbicide. Il est important de noter que, contrairement au cas des ions métalliques, les dégâts oxydatifs engendrés par la MPO concernent principalement les protéines et particulièrement 1 ' apoprotéine B dans le cas des LDL.
Conditions d'oxydation des LDL
Afin d'illustrer l'aspect de l'invention basé sur des altérations de LDL engendrées par la MPO, l'apport du substrat peroxyde d'hydrogène a été effectué suivant deux voies : production progressive de peroxyde d'hydrogène dérivant de la transformation du glucose par la glucose-oxydase d'une part, ajout direct de peroxyde d'hydrogène dans le milieu d'oxydation d'autre part. Les conditions d'oxydation à la MPO sont les suivantes :
Système MPO/Glucose-oxydase 278 mg prot . LDL 40 U MPO (unités peroxidasiques, avec
1 ' o-dianisine comme substrat) 90 min à 30°C
Système MPO/H202 1,6 mg protéine LDL 8 U MPO 1 mM H202 5 min à 37°C
La séparation des sous-fractions de LDL oxydées peut être effectuée en utilisant une chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q. Les différentes sous-fractions de l'oxydation présentent en effet des charges électronégatives en fonction de leur degré d'altération. On a constaté que des fractions (A, B, C ... ) peuvent ainsi être éluées de la colonne en utilisant des tampons contenant des concentrations croissantes en NaCl .
Après optimalisation des conditions d'élution, les coefficients de variation obtenus pour les différentes fractions de LDL oxydées ont montré une bonne reproductibilité de la technique utilisée (CV<5 % pour des pics majoritaires).
La Fig. 1 illustre l'excellente séparation des fractions oxydées B, C et D obtenues avec allongement des plateaux salins correspondant au passage des fractions. Les résultats de FPLC montrent clairement que les dégâts oxydatifs liés à la MPO surviennent dans les 5 premières minutes quelque que soit le système oxydatif (glucose/ glucose oxydase ou H202) .
La Fig. 2 illustre la cinétique d'apparition des fractions oxydées avec le peroxyde d'hydrogène (MP0/H202) pour des concentrations d' H202 de 179 μM. On constate qu'après 5 minutes, la réaction est pratiquement terminée.
Caractérisation des sous-fractions de LDL oxydées
Electrophorèse sur gel
Les électrophorèses pratiquées après un stress oxydatif montrent que les dégâts causés par le système
MPO/Glucose-oxydase consistent surtout dans des fragmentations de la protéine apoB alors que le système MPO/H202 donne principalement lieu à des agrégations.
Dans le système MPO / glucose-oxydase, on constate une diminution de la proportion en acides gras polyinsaturés au niveau des phospholipides de la fraction D par rapport à la fraction native.
Altération de la composition en acides gras
% dans fraction native fraction D
Acide Arachidonique (C20:4 n-6) 8,2 6,3
Acide Eicosapentaénoïque (C20:5n-3) 1,3 0,9 Acide Docosahexaénoïque (C22:6 n-3) 4,6 3,1
Les fractions oxydées obtenues par le système MPO/H202 ne montrent, quant à elles, aucune modification significative de la composition en acides gras. Ces résultats indiquent que l'oxydation induite par la glucose-oxydase cause des dégâts peroxydatifs au niveau des acides gras polyinsaturés des LDL, ce qui n'est pas le cas pour le système MPO/H202.
On ne note pas de différences de composition au niveau des esters de cholestérol, ni des triglycérides dans les 2 systèmes d'oxydation.
On a constaté que les fractions issues de l'oxydation par le système MPO/ Glucose-oxydase sont le résultat d'une attaque de la MPO suivie de diverses réactions radiculaires tandis que les fractions dérivant de l'oxydation par le système MPO/H202, semblent être tout-à- fait spécifiques d'une attaque par la MPO.
Ce dernier système sera donc préféré pour la réalisation de 1 ' invention .
3. Production et caractérisation des anticorps monoclonaux
Les antigènes contre lesquels sont dirigés les anticorps monoclonaux de la présente invention sont constitués par les différentes fractions oxydées des LDL, plus particulièrement cependant contre la fraction B.
Les LDL de patients semblant s'oxyder plus rapidement que celles de sujets normaux, un des buts de l'invention est de pouvoir différencier les fractions très oxydées (fractions C et D) de fractions pas ou peu oxydées (fractions A et B) afin de pouvoir déterminer quantitativement la présence de la fraction B.
L'invention concerne également les hybridomes utilisables pour la production des anticorps susmentionnés. Les hybridomes sont obtenus par exemple de manière classique par fusion de cellules de myélome non sécrétrices P3 x 3Ag8.653 (ATCC CRL-1580) avec les cellules spléniques de la souris immunisées, en présence de polyéthylène glycol 4.000.
Les cellules fusionnées sont réparties dans des boîtes de 96 puits préincubées avec des macrophages péritonéaux de souris en présence d'un milieu de sélection contenant de 1 ' hypoxantine, aminoptérine et thymidine. Le milieu est remplacé au jour 7 par un milieu non sélectif. Deux semaines après la fusion, les surnageants des clones sont criblés pour la présence d'anticorps spécifiques sur chacune des fractions A à D de LDL oxydée, ainsi que sur la MPO.
Dans ces tests, l'antigène purifié (fraction de LDL oxydée) est fixé sur la plaque et le surnageant, seul ou en compétition avec une fraction purifiée, est déposé sur la plaque. L'anticorps fixé est ensuite révélé par un 2ème anticorps dirigé contre les IgG de souris et couplé à la phosphatase alcaline.
On a ainsi pu obtenir deux types d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement des LDL altérées par la MPO. L'un reconnaît la sous-fraction B, l'autre reconnaît la sous-fraction C et la sous-fraction D.
Au vu de la caractérisation des fractions obtenues par les deux systèmes d'oxydation ( H202, glucose oxydase), les deux anticorps reconnaissent des épitopes différents.
En effet, l'anticorps anti-fraction B reconnaîtrait une altération précoce engendrée principalement par 1 ' HOC1 alors que l'anticorps anti-fraction C/D serait dirigé contre des dégâts engendrés non seulement par l'HOCl mais aussi par d'autres réactions et/ou réarrangements radicalaires obtenus par l'oxydation due au système MPO-glucose oxydase. Avec le système MPO/H202 on n'observe pas de fraction D.
Production d'anticorps monoclonaux de spécificité anti-fraction B
Un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope peu oxydé des LDL (fraction B) a été caractérisé. Les souris ont été immunisées selon le même protocole que précédemment, à la différence que l'antigène fraction B a été injecté en présence d'hydroxyde d'aluminium. Cette fraction B a été oxydée à l'aide de MPO en présence d'H20 . Quatre hybridomes AG9, AE2, EB2 et EF2 sécréteurs d'anticorps monoclonaux dirigés contre la fraction B des LDL ont été obtenus .
Les surnageants des sous-clones de AE2, AG9, EB2 et EF2 ont été testés non seulement pour leur spécificité antigénique contre les différentes fractions mais aussi pour leur appartenance' aux différentes classes et sous- classes d1 immunoglobulines . Ces clones sont de classe IgG et de sous-classe IgGl, la chaîne légère est de type K. Ces hybridomes sécrètent des anticorps monoclonaux de spécificité dirigée contre la fraction B oxydée par la rMPO. Trois hybridomes sécréteurs ont été adaptés progressivement à la culture sans sérum en milieu hybridoma SFM (Life Technologies) .
Les surnageants de ces 3 hybridomes sécréteurs ont été purifiés par passage sur une colonne de Protéine A-Sepharose CL-4B conditionnée en PBS à pH 8. L'élution a été réalisée en acide citrique 0,1M à différents pH, (6,5 15
IgGl - 4,5 IgG2a - 3 IgG2b)
Production des IgG monoclonales spécifiques de la fraction B
clone mg totaux AG948F4A2 Fraction 1 1, 3 mg Fraction 2 2, 6 mg
EB2E9G62IH2 4,53 mg EB2G3G2 2, 6 mg
La reconnaissance de l'antigène fraction B oxydée par les 3 anticorps monoclonaux est très semblable et est illustrée à la FIG. 3 (antigène Box)
Le tableau suivant présente les caractéristiques de quelques anticorps monoclonaux isolés dans le cadre de la présente invention en adoptant le processus susmentionné.
Figure imgf000016_0001
Les hybridomes AG948F4A2, EB2E9G621H2, EB2G3G2 et 14A2G6 ont été déposés au BCCM (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms le 19 décembre 2001 sous les numéros provisoires suivants : 1) 14A2G6 --> LMBP 5828CB
2) AG948F4A2 --> LMBP 5829CB
3) EB2E9G621H2 --> LMBP 5830CB
4) EB2G3G2 --> LMBP 5831CB
Caractérisation des anticorps monoclonaux
Spécificité de l'épitope
Des test ELISA compétitifs ont été menés afin de démontrer l'identité ou la différence des epitopes reconnus par les anticorps selon l'invention.
Ces test ont été réalisés sur une plaque couverte de LDLox. On ajoute un anticorps marqué mis en compétition avec des concentrations croissantes des autres anticorps non marqués. Une diminution du signal signifie une compétition pour le même épitope. Par contre si l'anticorps marqué reconnaît un épitope différent de celui du compétiteur, il n'y aura aucune inhibition du signal.
Le marquage des anticorps à l'iode 125 a été réalisé à l'aide de billes IODO-Beads (Pierce) porteuse de chloramine-T. Ces anticorps marqués ont été purifiés sur des colonnes de 5ml de résine Sephadex-G25 Fine (Pharmacia) et caractérisé par précipitation au TCA.
Les figures 4a-b-c représentent les graphiques des tests ELISA de compétition entre un anticorps marqué (AG948F4A2, EB2G3G2, 14A2G6) et les autres anticorps monoclonaux non marqués. Etant donnée l'inhibition du signal, on peut conclure que les trois anticorps dirigés contre la fraction B des LDL oxydées, quoique présentant un comportement différent, reconnaissent au moins une partie du même épitope. Par contre, l'anticorps 14A2G6 reconnaît un épitope différent des autres anticorps, son signal restant constant en présence des autres anticorps.
Affinité des anticorps
L'affinité de plusieurs anticorps selon l'invention a été estimée en réalisant des test ELISA compétitifs comme ci- dessus, la seule différence étant la mise en compétition de l'anticorps marqué avec son homologue froid. On a observé que les anticorps ont une affinité de l'ordre de 5xl0~8 M pour EB2E9G621H2, EB22G3G2, AG948F4A2 et d'environ 10"9 M pour 14A2G6. Ces valeurs ont été mesurées en prenant la concentration en anticorps induisant un pourcentage d'inhibition égal à 50%.
Spécificité de la reconnaissance des anticorps monoclonaux
On a démontré que les quatre anticorps monoclonaux susmentionnés sont spécifiques des LDL oxydées par le système myéloperoxydase . Des test ELISA ont été effectués avec des LDLs fraîches et âgées de 2 jours, des LDL en présence d'HOCl et de LDL oxydées par du H202 ( ImM et 2mM) , chaque fois en absence de rMPO, ainsi qu'avec l'ApoBlOO native et oxydée, les HDL , l'Apo A-I native ou oxydées par la MPO, et les VLDL natives et les VLDL oxydées. Seul l'oxydation par le H0C1 fournit des produits reconnaissables par ces anticorps. On a noté cependant que l'anticorps 14A9G6 est moins spécifique et reconnaît aussi les VLDL oxydées par la myéloperoxydase .
On sait par ailleurs que ces anticorps ne reconnaissent pas non plus la fraction B des LDL oxydées au cuivre ou au MDA.
On a observé par ailleurs une équivalence des reconnaissances des LDLox et de l'ApoBlOOox , ce qui démontre que l'oxydation des LDL par la MPO dans les conditions décrites, provoque l'oxydation de la partie protéique des LDL. Cette équivalence permet par ailleurs, de manière avantageuse, d'utiliser l'ApoBlOOox comme standard dans les tests diagnostics faisant intervenir les anticorps selon l'invention.
On a également démontré que les anticorps selon l'invention se conservent très bien au moins pendant deux ans à 4°C, - 20°C et -80°C (en présence de glycérol pour -20°C) . Ces anticorps seront de préférence conservés aux environs de -20°C ou de -80°C.
4. Test ELISA des LDL naturellement oxydées circulantes dans le plasma
Des tests ELISA mesurant les LDL oxydées par la MPO dans la circulation ont ainsi été développés dans le cadre de la présente invention.
Ces tests ne faisant pas appel à un oxydation ex vivo des LDL (constituant une phase très délicate) , peuvent être réalisés en routine.
Un des tests selon une mise en oeuvre de l'invention peut se résumer de la façon suivante : - fixation de l'anticorps monoclonal anti-fraction B sur la plaque
- extraction des LDL oxydées du plasma par adsorption sur l'anticorps monoclonal - reconnaissance des LDL fixées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-apoB couplé à la peroxydase
- révélation par un mélange d'H202 / ortho-phénylène diamine (lecture de la densité optique à 490 nm)
- détermination de la concentration en LDLox dans l'échantillon grâce à une gamme standard de la fraction B de LDL oxydées par la MPO et isolées par FPLC (fraction Box) ou grâce à une gamme d'ApoBlOO oxydée.
Pour confirmer la faisabilité du test selon l'invention, un standard de la fraction (Box) de LDL oxydées a été appliqué à des concentrations croissantes (de 0 à 24 μg de protéine par puits). Les 3 anticorps monoclonaux (EB2E9G621H2, EB2-g3g2 et AG948F4A2) reconnaissant la fraction B oxydée ont été testés.
Les résultats montrent une bonne réponse des 3 anticorps vis-à-vis des concentrations croissantes de standards, linéaire dans une première phase et atteignant un plafond pour les concentrations plus élevées. Ce plateau peut être expliqué par la limite supérieure de détection du test et/ou par une perturbation due à la présence de NaCl dans la fraction Box (plus importante lorsque la concentration en Box augmente) . Chaque courbe a été reproduite plusieurs fois avec la même fraction Box et montre une bonne reproductibilité .
Cependant, des fractions Box dérivant de deux oxydations différentes ne génèrent pas des courbes standards identiques. En fait, la séparation par FPLC permet une séparation en fonction de la charge électrique, mais ne renseigne pas sur la nature chimique de l' épitope,
Afin d'obtenir un standard pur pour les analyses de fraction Box, standard reconnu spécifiquement par les anticorps monoclonaux, selon l'invention, on propose d'utiliser des LDLox délipidés, ce qui correspond à l'Apo BlOO oxydée purifiée à partir de LDL oxydées par la MPO, selon le protocole suivant (décrit par Socorro et Camero, J. Lipid Research : 20, 631, 1979) .
Les LDLox selon l'invention, mises dans une solution de tampon 50 mM Tris/HCl pH 8,8 sont déposées sur une colonne (1,5 x 15 cm) de DEAE- Sépharose CL-6B (Pharmacia) et immédiatement, un gradient linéaire de Triton X-100 de 0 à 2% est appliqué (60ml). Après élution des lipides avec le détergent, l'apo LDL (apo BlOO ox) est éluée par le tampon 50 mM Tris/HCl pH 7.4, contenant 1M NaCl.
L'apo BlOO ox, analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide présente une bande unique immunoréactive avec l' antisérum anti apo BlOO et avec les anticorps monoclonaux .
Par ailleurs, la conservation des fractions peut être favorablement effectuée en présence de glycérol ou de sucrose .
La courbe dose-réponse de LDL natives (à concentration plasmatique) a également été testée en parallèle avec le plasma original correspondant . Comme attendu, des concentrations croissantes de LDL natives engendrent une augmentation proportionnelle du signal. Cependant, la réponse obtenue pour le plasma est nulle ou nettement inférieure à celle des LDL natives. Ceci indique qu'un (ou plusieurs) composant (s) du plasma peu(ven)t inhiber la reconnaissance des LDLox par les monoclonaux.
Parmi les composants plasmatiques susceptibles d'influencer la liaison de LDLox avec le monoclonal, on peut distinguer deux grandes catégories :
-les lipoprotéines, et notamment les particules contenant de l'apoB (LDL natives et VLDL) -les protéines
On a confirmé la fiabilité du test, en vérifiant que 1 ' apoB non modifiée par la MPO, et présente sur les LDL ainsi que sur les VLDL, ne pouvait entrer en compétition avec 1 ' apoB modifiée, au niveau de l'anticorps monoclonal.
La courbe dose-réponse pour les LDL natives montrent un signal qui pourrait correspondre à la présence d'une petite proportion de LDL oxydées dans ces LDL natives.
On a également vérifié que l'albumine n'interfère pas au niveau de la liaison anticorps-antigène.
Plusieurs solutions sont proposées pour éliminer ou minimiser les interférences observées dans le plasma.
Tout d'abord, l'échantillon peut être pré-purifié en utilisant des membranes semi-perméables permettant d'éliminer des molécules jusqu'à 100.000 Da . D'autre part, les IgG peuvent être écartées par des techniques d ' immunoprécipitation.
On a cependant observé que les interférences peuvent être limitées par la dilution de l'échantillon. En effet, il a été observé une augmentation de l'interférence pour de faibles dilutions du plasma, alors que des dilutions plus importantes tendent à limiter ces perturbations. D'autre part, en parallèle avec une dilution de l'échantillon, différentes techniques connues en soi permettent d'amplifier le signal.
A titre d'exemple une variante préférée du test de mesure directe de LDLs naturellement oxydées circulantes consiste en un test ELISA sandwich décrit ci-après :
- revêtement de plaques F 96 maxisorb nunc immuno plate No 4 4 2 3 0 4 avec les anticorps monoclonaux (100 μl/puits)
plaque no 1 Mab AG 948 F4 A2 (anti B) à 5,3 ng/puits plaque no 2 Mab EB 2 A 9 G 6 21 H2 (anti B) , à 5,3 ng/puits plaque no 3 Mab EB2 G3 G2 (anti B) à 5,3 ng/puits
dans le tampon 50 mM carbonate/bicarbonate, pH 9,6
- Saturation des plaques en caséine 0,1 % après lavage en TBS Tween, 60 min à 37 deg C
- disposition des échantillons: plasma dilué 10 fois dans du PBS pH 7,5 (H20 HPLC) , 60 min à 37 deg C, puis lavage par TBS Tween. Idéalement un témoin négatif et un standard B oxydé sont également disposés sur la plaque.
- fixation du 2ème anticorps : anticorps polyclonal de lapin anti apolipoprotéine B 100 à 1 μg/ml, 60 min à 37 deg - fixation de l'anticorps couplé : anticorps de chèvre anti IgG(Fc) de lapin couplé à la phosphatase alcaline (Proméga, cat no S3731), dilué 7500 fois dans le tampon de caséine,
- révélation : à l'aide du substrat de la phosphatase alcaline : para nitrophényl phosphate à 1 mg/ml dans le tampon diéthanolamine pH 9,8.
On constate que les 3 anticorps fournissent des résultats comparables .
Un exemple de résultats est repris à la FIG. 5 pour 13 patients et un témoin négatif (50 min de révélation) en utilisant l'anticorps EB 2 A 9 G 6 21 H2 déjà mentionné.
En reproduisant le test avec des échantillons de plasma dilués 50 x les résultats sont identiques.
5. Test de type ELISA de mesure de sensibilité à l'oxydation ex-vivo des LDL
Selon l'invention, les caractéristiques cinétiques de l'oxydation des LDL par la myéloperoxydase sont également avantageusement exploitées dans un but de diagnostic.
On a ainsi réalisé une oxydation du LDL sur microplaque afin de mettre au point un des tests selon l'invention basé sur la cinétique de l'oxydation.
Ce test comprend 3 étapes :
1) Fixation des LDL du plasma sur un anticorps polyclonal anti-apo B
2) Oxydation des LDL par le système MPO / peroxyde d'hydrogène. 12,5 mU MPO ont été utilisés en présence de 40μM H202 par puits, ces conditions ayant été ensuite modifiées pour ralentir l'oxydation, en réduisant de 5 fois la quantité d'agents pro-oxydants et en utilisant 2,5 mU MPO et 8μM H202 par puits. 3) Reconnaissance d'un épitope spécifique de LDL oxydées par un anticorps monoclonal selon l'invention
4) Reconnaissance de l'anticorps monoclonal par des IgG couplées à la phosphatase alcaline, anti IgG de souris.
Afin d'optimiser les conditions d'oxydation discriminant les patients des personnes saines, on a utilisé les deux anticorps monoclonaux obtenus (anti fraction B et anti fraction C/D) à notre disposition.
La procédure du dosage est illustrée à la FIG. 6 .
Plusieurs séries d'oxydation ont été réalisées sur des plasma provenant de volontaires sains et de patients. L'oxydation des LDL a été suivie au cours du temps par l'apparition des epitopes B et C. Il est apparu rapidement nécessaire de déterminer une valeur seuil d'oxydation définissant une oxydation normale ou pathologique. A cet effet, la mesure d'un rapport C/B peut constituer un standard interne de la réaction.
Vingt-cinq échantillons provenant de volontaires sains ont été testés afin de déterminer une valeur moyenne «normale » du rapport C/B, la moyenne obtenue correspond à un rapport C/B de 1,26 et l'écart-type est de 0,16. La gamme « normale » établie correspond donc à un rapport C/B allant de 0,94 à 1,58 (moyenne ± 2 SD) .
Les plasmas de 33 patients ont été testés et ont été comparés à la gamme «normale » établie sur des plasmas de personnes « saines ». Onze d'entre eux se distinguaient de la «normale» (FIG. 6). Parmi les patients présentant une sensibilité à l'oxydation supérieure à la « normale », il était particulièrement intéressant de noter que certains ne présentaient pas de facteurs de risque classiques tels que cholestérol et/ou triglycérides élevés, ou plus récents comme les LDL petites et denses ou la Lp(a), et que cependant il présentaient une coronaropathie sévère (angor instable, infarctus, ... ) .
Ce test s'est donc révélé d'un grand intérêt en prévention primaire en mettant en évidence un risque potentiel alors que les autres paramètres utilisés couramment s'avèrent négatifs .
La FIG. 7 illustre ainsi une comparaison de la sensibilité à l'oxydation des LDL de 33 patients par rapport à une population contrôle, les résultats étant exprimés en pourcentage par rapport au contrôle.
La reproductibilité intra essai, testée par la réalisation de plusieurs cinétiques sur une même plaque, est tout à fait acceptable. Par contre, la reproductibilité inter-essais, testés par comparaison des résultats obtenus pour un même échantillon sur des plaques différentes, est médiocre. On introduira donc un échantillon contrôle sur chaque plaque pour pouvoir interpréter les résultats obtenus sur différentes plaques.
Les cinétiques obtenues montrent qu'avec l'anticorps anti-fraction B, les résultats sont très reproductibles alors que ceux obtenus avec l'anti C/D présentent des variations. Il a en effet été vérifié qu'un même individu pris à différent moments donnait des résultats comparables, en effectuant 3 prises de sang à plusieurs jours d'intervalle chez un même volontaire.
On peut donc conclure que la mesure de la cinétique d'oxydation des LDL peut être effectuée dans de bonnes conditions en utilisant l'anticorps anti-fraction B. 6. Test Elisa de mesure d' autoanticorps circulants dirigés contre les LDL oxydées (fraction B) .
Selon encore un autre aspect de l'invention on propose un test basé sur la détection des anticorps naturels (dénommés ci-après autoanticorps) dans le plasma, dirigés contre des LDL oxydées par la myéloperoxydase.
On a en effet observé que le plasma contient des autoanticorps dirigés spécifiquement contre les fractions de LDL oxydées par la myéloperoxydase en présence de H202, et non contre les fractions obtenues par oxydation avec d'autres agents tels que le sulfate de cuivre, l'AAPH ou un azoinitiateur .
Le taux d ' autoanticorps reconnaissants ces LDL oxydées est un reflet du statut oxydatif dans la mesure où la modification des LDL résulte en l'apparition de nouveaux epitopes rendant les lipoprotéines plus antigéniques . Ce dosage permet également d'évaluer la capacité du système immunitaire à répondre à l'apparition de ces LDL modifiées .
Selon l'invention on propose donc un test de type ELISA permettant de déterminer quantitativement la présence d' autoanticorps contre des sous-fractions spécifiques chez des malades présentant une pathologie cardio-vasculaire.
Un des tests selon une mise en œuvre de l'invention peut se résumer de la façon suivante : fixation des LDL oxydées ou des VLDL oxydées par la MPO sur la plaque addition des sera dilués 1/10 et 1/50 reconnaissance des anticorps fixés à l'aide d'un anticorps polyclonal de chèvre anti IgG humaine (chaîne lourde et légère) couplé à la phosphatase alcaline - révélation par le substrat de la phosphatase alcaline (paranitrophénylphosphate dans un tampon diéthanolamine) . lecture à 410 nm, avec la référence à 630 nm
Le tableau suivant indique les réponses observées pour 5 patients, sous la forme des rapports entre le signal obtenu avec des LDL oxydées de différentes manières et celui du blanc correspondant, c'est à dire pour les LDL natives. Un rapport de 1 (ou <1) signifie que l'échantillon ne contient pas d ' autoanticorps dirigés contre les LDL oxydées. A l'inverse, on peut postuler qu'un rapport > 2 traduit la présence d ' autoanticorps .
patient LDL oxydées par Cu par AAPH P<ar MPO
1 1,37 1,34 3,27
2 <1 1, 18 <1
3 <1 1,25 3,91
4 <1 1,47 3,74
5 1,04 1,22 <1
Sur 3 des 5 sujets, on observe la présence d ' autoanticorps dirigés contre les LDL oxydées par la MPO, alors qu'aucun sujet ne paraît contenir d' autoanticorps contre les LDL oxydées par le cuivre ou l'AAPH.
L'invention démontre donc la faisabilité et les avantages du dosage de LDL modifiées par l'action de la MPO dans la circulation. 7. Applications thérapeutiques et préventives
Selon un autre aspect de l'invention on propose une méthode de traitement immunotherapeutique consistant à traiter le sang d'un patient pour en retirer les antigènes (fractions de LDL oxydées, en particulier fraction B) . Cette méthode consiste à faire passer le sang , ou une fraction de sang, d'un patient dans un système ou il entrera en contact avec des anticorps anti-fraction B immobilisés par une fraction B de LDL oxydée, par exemple sur une colonne d' immunoabsorption spécifique, avant d'être retourné au patient, le sang ou la fraction de sang étant débarrassé desdits autoanticorps.
Selon encore un autre aspect de l' invention on propose une immunisation passive par administration à un patient à risque d'anticorps selon l'invention, par injection ou perfusion. Ce type de traitement pourrait s'appliquer, par exemple, après une opération de pontage coronarien.
Enfin selon un dernier aspect de l'invention, on propose d'injecter à un patient des protéines ApoBlOOox apte à susciter une réponse immunitaire favorable.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition constituée d'au moins une fraction oxydée de LDL obtenue par oxydation in vitro de LDL par l'acide hypochloreux ou par un système biologique ou chimique générateur d'acide hypochloreux.
2. Composition selon la revendication précédente caractérise en ce que l'oxydation est effectuée par action du peroxyde d'hydrogène et de myéloperoxydase.
2. Composition constituée d'au moins une fraction oxydée de LDL telle que pouvant être obtenue par le peroxyde d'hydrogène ou le couple glucose/glucose-oxydase en présence de myéloperoxydase et d'ions chlorures.
4. Composition selon la revendication 1, 2 ou 3 purifiée par chromatographie .
5. Composition selon la revendication précédente obtenue en utilisant une séparation par chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC).
6. Composition selon la revendication précédente obtenue en utilisant des tampons de concentrations croissantes en sels .
7. Fraction B de LDL oxydée telle que pouvant être obtenue par une chromatographie de type FPLC à partir de LDL oxydée en présence de myéloperoxydase comme illustré à la Fig. 1.
8. Composition selon n'importe laquelle des revendications précédentes qui a également été purifiée par immunoaffmité .
9. Composition selon la revendication précédente purifiée par immunoaffinité en utilisant une colonne composée d'un anticorps monoclonal couplé à une matrice et dirigé contre ladite fraction.
10. Composition selon la revendication précédente dans laquelle la colonne est une colonne de Sepharose activé ou de billes de verre.
11. Composition selon n'importe laquelle des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle constitue ou est identique à une sous-fraction (B) , sous- fraction des LDL oxydées la plus proche des LDL natives (A) en chromatographie du type Fast Protein Liquid
Chromatography avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q.
12. Composition selon n'importe laquelle des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle est identique ou constitue une sous-fraction (C) , sous- fraction des LDL oxydées qui suit la sous-fraction (B) en chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q.
13. Composition constituée d'une fraction oxydée de LDL obtenue par oxydation in vitro de LDL par le couple glucose/glucose oxydase en présence de myéloperoxydase caractérisée en ce qu'elle comprend la sous-fraction D, sous-fraction des LDL oxydées la plus éloignée des LDL natives en chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q.
14. Composition selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un mélange des sous-fractions C et D.
15. Composition selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle la myéloperoxydase utilisée est une myéloperoxydase recombinante humaine.
16. Anticorps monoclonal dirigé contre un ou plusieurs composant d'une composition selon n'importe laquelle des revendications 1 à 15.
17 - Procédé d'obtention de fractions oxydées de LDL caractérisé en ce que les LDL sont oxydées par addition de peroxyde d'hydrogène en présence de myéloperoxydase et la fraction oxydée résultante est séparée puis fractionnée par chromatographie de type Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) en utilisant des tampons de concentration croissantes en sels.
18 - Utilisation des fractions d'oxydation selon n'importe laquelle des revendications 1-15 ou obtenues selon la revendication précédente pour l'obtention d'anticorps monoclonaux.
19 - Antigène constitué par une fraction d'oxydation isolée selon le procédé de la revendication 14.
20 - Antigène selon la revendication précédente constituée par la fraction B, fraction des LDL oxydées la plus proche des LDL natives en chromatographie du type Fast Protein Liquid Chromatography avec une colonne échangeuse d'anions Mono Q.
21 - Antigène selon la revendication 16 constitué par la fraction C ou la fraction B, ou un mélange de ces fractions d'oxydation de LDL.
22 - Anticorps monoclonal dirigé contre un des antigènes des revendications 19 à 21.
23 - Anticorps monoclonal produit par l'hybridome AG948F4A2 déposé au BCCM sous le numéro LMB 5829CB le 19 décembre 2001.
24 - Anticorps monoclonal produit par l'hybridome EB2G3G2 déposé au BCCM sous le numéro LMBP 5831CB le 19 décembre 2001.
25 - Anticorps monoclonal produit par l'hybridome
EB2E9G621H2 déposé au BCCM sous le numéro LMBP 5830CB le 19 décembre 2001.
26 - Anticorps monoclonal produit par l'hybridome 14A2G6 déposé au BCCM sous le numéro LMBP 5831CB le 19 décembre
2001.
27 - Hybridome AG948F4A2 déposé au BCCM sous le numéro le 19 décembre 2001.
28 - Hybridome EB2G3G2 déposé au BCCM sous le numéro le 19 décembre 2001.
29 - Hybridome EB2E9G621H2 déposé au BCCM sous le numéro le 19 décembre 2001.
30 - Hybridome 14A2G6 déposé au BCCM sous le numéro le 19 décembre 2001. 31 - Utilisation d'un anticorps selon n'importe laquelle des revendications 16 ou 22 à 26 pour un test d'oxydation ex vivo de LDL d'un patient.
32 - Utilisation d'un anticorps selon une des revendications 16 ou 22 à 26 pour un test de mesure de LDLox circulantes dans le sang humain.
33 - Utilisation d'une fraction de LDL oxydée isolée comme standard pour la détermination d ' autoanticorps antifraction oxydée chez un patient.
34 - Utilisation selon la revendication 33 dans laquelle la fraction oxydée est la fraction B.
35 - Test , notamment pour la détermination du risque cardio-vasculaire d'un patient, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- fixation d'un anticorps monoclonal anti-fraction B sur un substrat solide
- extraction des LDL oxydées du plasma par adsorption sur l'anticorps monoclonal
- reconnaissance des LDL fixées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-apoB - révélation quantitative de l' anti-corps polyclonal - détermination de la concentration en LDLox.
36 - Test selon la revendication 24 dans laquelle la révélation quantitative se fait par action de la phosphatase alcaline couplé à un anticorps dirigé contre l'anticorps polyclonal anti-apo B.
37 - Test selon la revendication précédente dans lequel l'anticorps polyclonal anti-apo B est un anticorps de lapin et l'anticorps couplé à la phosphatase alcaline est un anticorps de chèvre anti-IgG(Fc) de lapin.
38 - Test selon la revendication 35 dans lequel l'anticorps polyclonal anti-apoB est couplé à une peroxydase .
39 - Test selon la revendication 35 dans lequel la concentration de LDLox dans l'échantillon est déterminée par comparaison avec un échantillon ou une gamme standard soit de la fraction B de LDL oxydée par la MPO et isolée par FPLC (fraction Box), soit de ApoBlOOox oxydée par l'acide hypochloreux ou un système générant de l'acide hypochloreux.
40 - Test selon la revendication 35 ou 39 dans lequel le plasma est préalablement dilué entre 5 et plus de 40 fois.
41 - Test selon n'importe laquelle des revendications 35 à 40 dans lequel les IgG du plasma sont éliminées par des techniques d ' immunoprécipitation.
42 - Procédé de détermination du taux circulant de LDL oxydées caractérisé en ce qu'il utilise des anticorps monoclonaux obtenus à partir d'au moins une fraction des LDL oxydées ex-vivo par la myéloperoxydase.
43 - Procédé de détermination du taux d ' autoanticorps dirigés contre les LDL oxydées caractérisé en ce qu'il utilise des fractions de LDL oxydées selon n' importe laquelle des revendications 16 ou 22 à 26.
44 - Procédé de détermination de la sensibilité à l'oxydation par la MPO des LDL présentes dans le plasma caractérisé en ce qu'il utilise des anticorps monoclonaux selon n'importe laquelle des revendications 16 ou 22 à 26.
45 - Procédé de diagnostic pour la prévention des accidents cardiovasculaires faisant intervenir au moins une des trois procédés des revendications 42 à 44.
46 - Procédé de diagnostic pour apprécier la sévérité d'un risque cardio-vasculaire d'un patient caractérisé en ce qu'il est basé sur les trois paramètres suivants :
- taux circulant de LDL oxydées par la myéloperoxydase
- taux d' autoanticorps dirigés contre les LDL oxydées par la MPO
- sensibilité à l'oxydation par la MPO des LDL présentes dans le plasma du patient.
47 - Standard pur de la fraction B oxydée par la myéloperoxydase caractérisée en ce qu'il est obtenu à partir de ladite fraction par passage sur une colonne d1 immunoaffinité comprenant un anticorps monoclonal anti-fraction B.
48 - Protéine ApoBlOOox telle que pouvant être obtenue et purifiée à partir d'une LDL oxydée par action de HOC1.
49 - Protéine selon la revendication précédente purifiée par passage sur une colonne d' immunoaffinité comprenant un anticorps monoclonal anti-fraction B.
50 - Standard utilisé dans des tests de diagnostic basés au moins partiellement sur la présence de LDL oxydées comportant une protéine selon n'importe laquelle des trois revendications précédentes.
51 - Kit d'application diagnostique comprenant au moins - un anticorps monoclonal selon n'importe laquelle des revendications 16 et 22 à 24.
52 - Kit selon la revendication 35 comprenant également un standard ou une gamme de standards consistant en une ou des compositions selon les revendications 1 à 15 et 47 à 50.
53 - Test , notamment pour la détermination du risque cardio-vasculaire d'un patient, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- fixation de LDL oxydées sur un substrat solide
- fixation d'un anticorps monoclonal anti-fraction B à ladite LDL oxydée fixée - association des LDL oxydées du plasma audit anticorps et libération de l'anticorps monoclonal dudit substrat
- détermination de l'anticorps monoclonal restant fixé
- détermination de la concentration en LDL oxydées du plasma .
54 - Procédé de traitement consistant à traiter le sang ou des portions de sang d'un patient pour en retirer les composants fractions oxydées de LDL, avec des anticorps selon n'importe laquelle des revendications 16 et 22 à 24, immobilisés sur support, par exemple sur une colonne d ' immunoadsorption, avant d'être retourné au patient.
54 - Procédé de traitement consistant à traiter le sang ou des portions de sang d'un patient pour en retirer la fraction B de LDL oxydées par contact avec des anticorps anti-fraction B immobilisés sur un support d ' immunoadsorption, avant d'être retourné au patient.
55 - Procédé de traitement thérapeutique ou préventif consistant à administrer à un patient, par injection ou perfusion, des anticorps selon n'importe laquelle des revendications 16 ou 22 à 24.
56 - Procédé de traitement thérapeutique ou préventif consistant à administrer à un patient, par injection ou perfusion, une protéine selon n' importe laquelle des revendications 48 ou 49.
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