EP0197974A1 - Proteines de differenciation acino-foetales associees au cancer du pancreas, antiserum et anticorps monoclonaux contre ces proteines, procedes de preparation - Google Patents

Proteines de differenciation acino-foetales associees au cancer du pancreas, antiserum et anticorps monoclonaux contre ces proteines, procedes de preparation

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EP0197974A1
EP0197974A1 EP85904826A EP85904826A EP0197974A1 EP 0197974 A1 EP0197974 A1 EP 0197974A1 EP 85904826 A EP85904826 A EP 85904826A EP 85904826 A EP85904826 A EP 85904826A EP 0197974 A1 EP0197974 A1 EP 0197974A1
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EP
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proteins
antiserum
differentiation
pancreas
fetal
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Withdrawn
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EP85904826A
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Maria Juana Escribano-Crespo
Pierre Burtin
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ETABLISSEMENT PUBLIC DIT: CENTRE NATIONAL DE LA R
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/813—Cancer

Definitions

  • ACINOFOETAL DIFFERENTIATION PROTEINS ASSOCIATED WITH PANCREAS CANCER, ANTISERUM AND ONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THESE PROTEINS, METHODS OF PREPARATION.
  • the present invention relates to acino-fetal differentiation proteins associated with pancreatic cancer, their purification, a specific antiserum and its preparation, monoclonal antibodies specific for these proteins and their preparation process as well as the compositions for diagnostic use and for therapeutic use containing them.
  • Panereatic oncofetal antigen (P0A-1) (banwo O., Versey J. and Hobbs JR, New ncofetal antigen for human pancreas. Lancet, 1: 643-645, 1974; Hobbs JR, Knapp, ML and Branfoot AG Panereatic oncofetal antigen (POA): its frequency and localization in humans. Oncod. Biol. And Medicine, 1: 37-48, 1980), 800 and 900 KD (POA-2) (Gelder FB , Resse CJ, Moossa AR, Hall T. and Hunter R. Purification partial characterization and clinical evaluation of a pancreatic oncofétal antigen.
  • the present invention relates to proteins of differention-fetus acion associated with pancreatic cancer, characterized in that they are manosid glycoproteins, of apparent molecular ⁇ pyenne mass chosen from: 120 KD, 94 KD,
  • the present invention also relates to a method
  • the process for preparing these antigens includes
  • a homogenate of soluble human fetal pancreas is prepared, b) the homogenate is treated by chromatography on an affinity column on concanavalin A coupled to a gel
  • the proteins in question are eluted, and d) optionally, the proteins obtained are purified.
  • the preparation of the homogenate is described in the example
  • Sepharose gel 4B was used coupled with concanavalin A, marketed by Pharmacia. The unbound fraction is eliminated, the fixed fraction is eluted, using a specific ligand, ar
  • the present invention also relates to an antiserum against the antigens according to the invention.
  • this antiserum recognizes, in fetal pancreas extracts, 4 constituents of average apparent molecular mass 120, 94, 75 and 58 KD (to within 10%).
  • the present invention relates to spreading a process for the preparation of this antiserum comprising the following steps: a) an animal is injected with an extract of human fetal pancreas less than 6 months old, b) the animal is bled and an antiserum is recovered , c) this antiserum is decomplemented, d) the decomplementary antiserum is absorbed, e) the absorbed decomplementary antiserum is centrifuged, and f) the specific antiserum is recovered.
  • the animal is injected with an extract of the fetal pancreas less than 5 months old.
  • This antiserum is prepared according to the protocol described in Example 2 against crude pancreatic extracts prepared as described in Example 1. In the particular embodiment described in Example 1, only the grooves No. 4 and 5 are positive in an antibody test. In one embodiment of the invention, the extract was injected into a rabbit. Mice and hens, for example, can also produce antiserum against these extracts.
  • the antiserum To decomplement the antiserum, it is heated in a water bath at about 56 ° C for 1/2 hour, according to a conventional technique. The antiserum is then made specific to the fetal pancreas by absorption of various extracts, for example extracts from normal adult pancreas, normal serum, red blood cells A, O, B, and possibly other organs.
  • pancreas comes from donor young people who died accidentally.
  • the decomplemented antiserum absorbed is purified by a conventional centrifugation technique.
  • the purified absorbed antiserum was tested for its ability to detect antigens by two techniques:
  • NEF technique This technique is described in 1 * example 3. It makes it possible to detect very small quantities of one or more antigens in complex mixtures, for example extracts gross organs, pathological seru s. This technique can detect approximately up to 0.1 ⁇ g of differentiation proteins per ml in crude organ extracts or body fluids.
  • the sensitivity varies with the antigen-antibody system and can go up to 0.01 ⁇ g of antigens per ml, or 0.0005% when, as for the tests collected in table 1, the extracts are analyzed from 20 mg / ml.
  • the antiserum was positive for fetal pancreatic extracts, pancreatic tumors and liver metastases from primary pancreatic cancer.
  • other extracts from adult organs were negative. or fetuses detailed in Table I.
  • the extracts are "pools" of organs used in decreasing concentration from 20 mg / ml.
  • the sera are used at lg2 dilutions from the normal concentration.
  • Chronic panereatitis 11 Chronic pancreatitis is a special case because they are generally negative, but in some cases we observe a marking similar to that found in the p ritumoral areas.
  • the antiserum according to the invention therefore makes it possible to detect serum and tissue levels which are too low to be assayed by precipitation, the sensitivity threshold of which is around 10 ⁇ g / ml.
  • the Applicant has demonstrated that the proteins according to the invention appear not only in pancreatic tumors, but also in pretumoral lesions. These differentiation proteins therefore also have the value of pretumoral markers.
  • the Applicant has carried out the preparation of monoclonal antibodies specific for the differentiation proteins according to the invention.
  • the present invention relates to monoclonal antibodies specific for proteins of apparent molecular mass differentiation 120 KD, 94 KD, 75 KD and 58 KD.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of these monoclonal antibodies, characterized in that it comprises the following steps: a) a mouse is immunized with at least one of the differentiation proteins, b) a cell fusion of cells is carried out spleen of these mice, with an SP ⁇ myeloma, c) the hybridomas obtained are cultured in an appropriate medium, d) the cultures are screened, e) the hybridomas positive for screening are cloned and cloned specifically with the fetal pancreas, and, f) isolating and optionally purifying the monoclonal antibody.
  • the conventional hybridization technique is therefore used, as developed by Kohler and Milstein in 1975, by immunizing mice, for example BALB / C mice with the fraction of a homogenate of fetal pancreas. under 6 months purified on Concanavalin A previously prepared.
  • differentiation proteins prepared according to the invention were used to immunize the mice from fetal pancreas 3 to 4 months old.
  • the NIF technique is used for example. The cultures are tested with various extracts, for example extracts from normal adult pancreas, normal adult and fetal serum, and an extract from fetal pancreas, in order to keep only the cultures which react specifically with the fetal pancreas. .
  • the monoclonal antibodies are then selected by conventional techniques. It is thus possible to use the "Immuno Blot” technique using SDS-PAGE (example 5), a technique also known by the name of "Western Blot” and described by Towbin et al. (Electrophoretic Transfer of proteins from polyacrylamides gels to nitrocellular sheets procedure and some application, Prot. Nat. Acad. Sci. USA 7_, 1979 page 350-354).
  • the monoclonal antibodies are then isolated in the supernatant of the cultures of selected hybridomas, by a usual technique.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained from ascites by injecting the producing cell, monoclonal antibody, into mice.
  • the Applicant has thus isolated two monoclonal antibodies specific for the differentiation protein according to the invention with an average molecular mass of 120 KD.
  • the antibodies can then be isolated by affinity chromatography on protein A fixed on sepharose, for example, eluting at a pH between 3 and 6.
  • the present invention therefore also relates to compositions for diagnostic use containing, as active element, at least one differentiation protein or a monoclonal antibody according to the invention and an acceptable substrate, for example in the form of immunodiagnostic kits. according to a mechanism based on antibody-antigen reactions.
  • the differentiation proteins and monoclonal antibodies according to the invention are also useful as specific tumor and pretumoral markers which can be used for imaging.
  • compositions for diagnostic use comprising the differentiation proteins or the monoclonal antibodies according to the labeled invention.
  • the labeling can be carried out either by any marker, in particular fluorescent, radioactive or paramagnetic markers.
  • compositions for therapeutic use comprising at least one differentiation protein or a monoclonal antibody according to the invention conjugated to an active principle.
  • fetal pancreatic extracts From fetuses in good condition, after therapeutic abortion, at 3 to 4 months of gestation, the pancreas which is rapidly immersed in an antiprotease solution containing aminocaproic acid (0.4 %) and aprotinin (40 units of Kallikreine / ml), for example aprotinin Trasylol ⁇ sold by Sigma.
  • the pancreas at a rate of 100 mg / ml of antiprotease solution, is ground as soon as possible after removal with a Ultraturax mill for a few minutes in the cold.
  • the extract is centrifuged at 20,000 rpm for 1/2 hour, the supernatant is aliquoted and stored at -80 ° C.
  • pancreas extract is injected into a rabbit according to the following protocol:.
  • Day 1 1 ml of extract + 1 ml of complete Freund's adjuvant in intradermal injections on several points on the back. .
  • Day 24 Same operation as Day 1.
  • Day 44 Test bleed n ° 1..
  • Day 54 Re-immunization as Days 1 and 24.. Day 78; Test bleed # 2.
  • Day 150 Intravenous injection without adjuvant (clear centrifuged solution).
  • Day 156 Test bleed n ° 4.
  • Day 186 New intravenous injection.
  • the serum is then decomplemented, by bringing it to a water bath at 56 ⁇ C for approximately 30 minutes, then absorbed by extracts of normal adult pancreas, normal serum and red blood cells A, 0, B.
  • Rinse with P.B.S. Incubate for 1 hour at 4 ° C in a saturated protein solution (2% egg white ovalbumin solution, in distilled water, marketed by Sigma) to block the binding sites of the membrane not occupied by l 'antigen. . Rinse with P.B.S. Incubate with antiserum.
  • Organ sections fixed either with ethanol, formaldehyde or Bouin's liquid, are included in the paraffin. Deparaffinize, hydrate and inhibit endogenous peroxidase.
  • the SDS-PAGE technique is used in 10% acrylamide gels in a Tris-glycine pH 8.3 buffer containing 0.1% SDS (Laenmli UK cleavage and structural proteins during assembly of head of the bacteriophage Nature (Lond. 227: 680-5 (1970)).
  • nitrocellulose membranes are transferred to a Biorad transfer cell at 4 ° C. at 100 mA at constant current for 16 h at pH 8.3 (Towbin).
  • the tasks are revealed as in the NIF technique.
  • the adult pancreas were not colored.

Abstract

Protéines de différenciation acino-foetales associées au cancer du pancréas, caractérisées en ce qu'il s'agit de glycoprotéines manosidées, de masse moléculaire apparente moyenne choisie parmi: 120 KD, 94 KD et 58 KD. L'invention concerne également un procédé de préparation de ces protéines, un antisérum contre ces protéines et son procédé de préparation, des anticorps monoclonaux contre ces protéines et leur procédé de préparation et des compositions à usage diagnostique ou thérapeutique contenant ces protéines ou anticorps.

Description

PROTEINES DE DIFFERENCIATION ACINOFOETALES ASSOCIEES AU CANCER DU PANCREAS, ANTISERUM ET ANTICORPS ONOCLONAUX CONTRE CES PROTEINES, PROCEDES DE PREPARATION.
La présente invention concerne des protéines de différenciation acino-foetales associées au cancer du pancréas, leur purification, un antisérum spécifique, et sa préparation, des anticorps monoclonaux spécifiques de ces protéines et leur procédé de préparation ainsi que les com¬ positions à usage diagnostique et à usage thérapeutique les contenant.
La mise en évidence de la présence, dans des extraits de pancréas foetal, d'antigènes analogues à ceux des cellu- les pancréatiques tumorales est connue.
Des antigènes pancréatiques oncofoetaux humains ont été identifiés, ayant pour poids moléculaire 40 KD (P0A-1) (banwo O., Versey J. et Hobbs J.R., New ncofétal antigen for human pancréas. Lancet, 1 : 643-645, 1974 ; Hobbs J.R., Knapp, M.L. et Branfoot A.G. Panereatic oncofétal antigen (POA) : its frequency and localisation in humans. Oncod. Biol. and Medicine, 1 : 37-48, 1980), 800 et 900 KD (POA-2) (Gelder F.B., Resse C.J., Moossa A.R., Hall T. et Hunter R. Purification partial characterization and clinical evalua- tion of a pancreatic oncofétal antigen. Cancer Res. 38 : 313-324, 1978) et 1 000 KD (PCAA) (Shimano T.,Loor R.M. Papsidero L.D. et al. Isolation, characterization and clinical évaluation of a pancréas cancer assoclated antigen. Cancer., Supplément, 47 : 1602-1620, 1981). Cependant, aucun de ces antigènes n ' est spécifique du cancer du pancréas car ils se retrouvent dans des tissus différents des tumeurs cancéreuses pancréatiques .
La présente invention concerne des protéines de diffé- _ 5 rënciation acion-foetales associées au cancer du pancréas , caractérisées en ce qu'il s'agit de glycoprotéines manosid es, de masse πoléculaire apparente πpyenne choisie parmi : 120 KD, 94 KD,
75 KD et 58 KD.
La présente invention concerne également un procédé
10 de préparation de ces protéines, caractérisé en ce qu'on prépare un homogénat de pancréas foetal humain soluble et que l'on isole une fraction constituée par des glyco¬ protéines manosidees.
Le procédé de préparation de ces antigènes comporte
15 les étapes suivantes : a) on prépare un homogénat de pancréas foetal humain soluble, b) on traite l'homogénat par chromatographie sur colonne d'affinité sur concanavaline A couplée à un gel
20 afin de fixer lesdites protéines, c) on élue les protéines en cause, et d) éventuellement, on purifie les protéines obtenues. La préparation de l'homogénat est décrite à l'exemple
1.
25 On utilise des foetus jeunes de moins de 6 mois de gestation, de préférence de moins de 5 mois , parce que les protéines selon l ' invention n' apparaissent pas dans le pan¬ créas adulte et que des lapins injectés avec du pancréas de foetus âgés de plus de 6 mois n ' ont pas produit d ' anti-
30 corps décelables .
Dans un mode particulier de réalisation, on a utilisé du gel de Sépharose 4B couplé à la concanavaline A, commer¬ cialisé par Pharmacia . La fraction non fixée est éliminée , la fraction fixée est éluée , à l'aide d'un ligand spécifique, ar
35 ex- , l'α-méthylmanoside 0,2 M. On alise alors la fraction fixée éluée par une technique classique et on sépare les protéines par exemple par électrophorèse préparative. On a préalable¬ ment repéré les pics correspondant aux protéines selon l'invention par électrophorèse qualitative. Les fractions de gel d'acrylamide chargées en pro¬ téines selon l'invention sont alors prélevées, et les pro¬ téines en sont extraites par électroélution dans un boyau de dialyse contre un tampon au phosphate P.B.S. (solution saline 0,15 M NaCl tamponnée à pH 7 avec tampon phosphate de potassium 0,01 M final) . On dialyse contre de l'eau distillée et on lyophilise. Une caractérisatiαi des protéines selon l'invention est dé¬ crite à l'exemple 6.
Pour séparer les protéines de différenciation, on peut également utiliser les techniques d'i_τπ_nofixation sur les anticorps monoclαnaux. La présente invention concerne également un antisérum contré les antigènes selon l'invention.
Par la technique de "blotting" (après électrophorèse en gel d'acrylamide - PAGE -, on transfert électrophoréti- quement les protéines ayant migré dans le gel à une feuille de nitrocellulose ; cette feuille est ensuite traitée comme dans la technique du NIF.) , cet antisérum reconnaît, dans les extraits de pancréas foetal, 4 constituants de masse moléculaire apparente moyenne 120, 94, 75 et 58 KD ( à 10 % près) . La présente invention concerne étalement un procédé de préparation de cet antisérum comportant les étapes sui¬ vantes : a) on injecte à un animal un extrait de pancréas foetal humain de moins de 6 mois, b) on saigne l'animal et on récupère un antisérum, c) on décomplémente cet antisérum, d) on absorbe l'antisérum décomplémente, e) on centrifuge l'antisérum décomplémente absorbé, et f) on récupère l'antisérum spécifique. De préférence, on injecte à l'animal un extrait de pancréas foetal de moins de 5 mois.
On prépare cet antisérum selon le protocole décrit à l'exemple 2 contre des extraits pancréatiques bruts préparés comme le décrit l'exemple 1. Dans le mode parti¬ culier de réalisation décrit à l'exemple 1, seules les saignées n° 4 et 5 sont positives dans un test de présence d'anticorps. Dans un mode de réalisation de l'invention, on a injecté l'extrait à un lapin. Les souris et les poules, par exemple, peuvent également produire un antisérum contre ces extraits.
Pour décomplémenter 1*antisérum, on chauffe au bain- marie à environ 56° C pendant 1/2 heure, selon une technique classique. On rend ensuite l'antisérum spécifique du pan¬ créas foetal par absorption de différents extraits, par exemple des extraits de pancréas adulte normal, du sérum normal, des globules rouges A, O, B, et éventuellement d'autres organes.
Pour ceci, on ajoute 2 ml de sérum normal par ml d'antisérum et 250 mg d'extraits de pancréas adulte normal lyophilisé par ml d'antisérum.
Pour obtenir l'extrait de pancréas adulte normal, on procède comme à l'exemple 1, le pancréas provient de donneur jeunes morts accidentellement.
On purifie l'antisérum décomplémente absorbé par une technique classique de centrifugation.
On a testé 1*antisérum absorbé purifié pour sa faculté à déceler les antigènes par deux techniques :
A) Immunofixation sur membranes de nitrocellulose
(technique NIF) Cette technique est décrite à 1*exemple 3. Elle permet de déceler de très faibles quantités d'un ou plusieurs anti- gènes dans les mélanges complexes, par exemple des extraits bruts d'organes, des séru s pathologiques. Cette technique permet de déceler approximativement jusqu'à 0,1 μg de protéines de différenciation par ml dans les extraits bruts d'organes ou les liquides biologiques.
La sensibilité varie avec le système antigène-anticorp et peut aller jusqu'à 0,01 μg .d'antigènes par ml, soit 0,0005 % lorsque, comme pour les tests rassemblés dans le tableau 1 , les extraits sont analysés à partir de 20 mg/ml.
Par cette technique, l'antisérum s'est révélé positif pour les extraits de pancrés foetal, les tumeurs de pancréas et des métastases hépatiques d'un cancer primitif du pancréa Par contre, ont été révélés négatifs, d'autres extraits d'organes adultes ou foetaux détaillés dans le tableau I.
TABLEAU I
EXTRAITS D ' ORGANES NORMAUX ET SERUM NORMAL
Organes Foetal adulte Pancréas +
Foie Estomac Poumon
Intestin - -
Rein Rate
Sérum normal - -
. Les extraits sont des "pools" d ' organes utilisés à concentration décroissante à partir de 20 mg/ml .
. N .T . = Non Testé
Par cette même technique, 100 % des sérums de malades atteints de cancers du pancréas ont été positifs (N=17) alors que le sérum de patients ayant d'autres tumeurs était négatif (voir tableau II) .
TABLEAU II
SERUMS PATHOLOGIQUES
SerunSpathologiques Noβbre testés Nombre positif8
Cancer pancréas 17 17
" estomac 2 0
" colon 2 0
" poumon 2 0
" rein 2 0
. Les sérums sont utilisés à des dilutions lg2 à partir de la concentration normale.
B) Immunohistologie sur coupes fixées à l'éthanol ou au liquide de Bouin La méthode utilisée est décrite à l'exemple 4. En utilisant soit la technique d'immunofluorescence soit 1'immunopéroxydase indirecte, l'antisérum marque les cellules acineuses foetales jusqu'à environ le 6ème mois de la gestation et est négatif pour d'autres organes foetaux ou adultes. Il a marqué tous les cancers du pancréas analysés et a été négatif pour une large variété d'autres types de cancer. Les résultats de 1'immunohistologie sont détaillés dans le tableau III.
TABLEAU III
Réaction de l'antisérum anti-pancréas foetal en NIF et imπunohistologie.
Cancer Nombre testés Positifs Négatifs
Pancréas 18 18 0
Foie 11 0 11
Estomac 8 0 8
Colon 10 0 10
Glandes salivaires 4 0 4
Poumon 4 0 4
Vessie 6 0 6
Vésicule biliaire 6 0 6
Sein 3 0 3
Prostate 7 0 7
Tissus normaux
Pancréas foetal 20 18 2 (± ) 6 mois et moins
Pancréas foetal 16 8 8 plus de 6 mois
Pancréas adulte
Duodénum
Estomac
Vésicule biliaire (canaux)
Glandes salivaires
Paneréatite 11 chronique Les pancréatites chroniques constituent un cas à part car elles sont en général négatives, mais dans certains cas on observe un marquage similaire à celui trouvé dans les zones p ritumorales. L'antisérum selon l'invention permet donc de déceler des taux sériques et tissulaires trop faibles pour être dosés par précipitation dont le seuil de sen¬ sibilité se situe autour de 10 μg/ml.
La Demanderesse a mis en évidence que les protéines selon l'invention apparaissent non seulement dans les tu¬ meurs pancréatiques, mais encore dans les lésions prétumo¬ rales. Ces protéines de diff renciation ont donc en outre valeur de marqueurs prétumoraux.
En effet, au cours de la cancérogénèse chimique expérimentale chez le hamster, ils sont exprimés vers le deuxième mois alors que les premières tumeurs ne sont décelées à l'histologie que vers le 8ème mois.
Chez l'homme, ces antigènes l'expriment intensément non seulement dans les cancers mais encore dans les mar - queurs prétumoraux.
Le tableau suivant présente d'autres résultats d'analyse montrant la spécificité de ces protéines de différenciation pour d'autres tissus normaux foetaux et adultes, par les techniques du NIF et d'immunohistologie.
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TABLEAU IV
Tissus Foetal Adulte NIF Hist NIF Hist
Pancréas +
Foie -
Poumon -
Estomac -
Colon -
Intestin grêle -
Glandes salivaires NT NT NT
Vessie II
Vésicule biliaire II
Muscle -
Peau - NT NT
Cerveau -
Rate -
Rein -
Sérum —
+ réaction positive ; - réaction négative ; NT non testé Ces protéines de différenciation selon l'invention peuvent également être appliquées à l'élaboration d'anti¬ corps spécifiques.
Ainsi, la Demanderesse a réalisé la préparation anticorps monoclonaux spécifique des protéines de différen¬ ciation selon l'invention.
C'est pourquoi, la présente invention concerne des anticorps monoclonaux spécifique des protéines de diffé¬ renciation de masse moléculaire apparente 120 KD, 94 KD, 75 KD et 58 KD.
La présente invention concerne également un procédé de préparation de ces anticorps monoclonaux, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) on immunise une souris avec au moins une des protéines de différenciation, b) on réalise une fusion cellulaire de cellules de rate de ces souris, avec un myélome SP~, c) on cultive les hybridomes obtenus dans un milieu approprié, d) on sélectionne les cultures par criblage, e) on conservé et on clone les hybridomes positifs au criblage spécifiquement avec le pancréas foetal, et, f) on isole et éventuellement on purifie l'anticorps monoclonal. Pour préparer les anticorps, on utilise donc la technique classique de l'hybridation, telle que mise au point par Kohler et Milstein en 1975, en immunisant des souris, par exemple des souris BALB/C avec la fraction d'un homogénat de pancréas foetal de moins de 6 mois purifiée sur Concanavaline A préalablement préparée. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, on a utilisé pour immuniser les souris, des protéines de différencia¬ tion préparées selon l'invention à partir de pancréas foetaux âgés de 3 à 4 mois. Pour le criblage, c'est-à-dire la sélection des hybridomes producteurs, on utilise par exemple la technique du NIF, déjà décrits. On teste les cultures avec divers extraits, par exemple des extraits de pancréas adulte normal, du sérum adulte normal et foetal, et d'un extrait de pan¬ créas foetal, pour ne conserver que les cultures qui réa¬ gissent spécifiquement avec le pancréas foetal.
Les anticorps monoclonaux sont alors sélectionnés par des techniques classiques. On peut ainsi utiliser la technique "Immuno Blot" mettant en oeuvre du SDS-PAGE (exemple 5) , technique également connue sous le nom de 'Western Blot" et décrite par Towbin et al. (Electro - phoretic Transfer of proteins from polyacrylamides gels to nitrocellular sheets procédure and some application, Prot. Nat. Acad. Sci. USA 7_ , 1979 page 350-354) .
On isole alors les anticorps monoclonaux dans le surnageant des cultures d*hybridomes sélectionnées, par une technique usuelle.
On peut aussi obtenir des anticorps monoclonaux à partir des ascites en injectant à des souris la cellule productrice, de l'anticorps monoclonal.
La Demanderesse a ainsi isolé deux anticorps mono¬ clonaux spécifiques de la protéine de différenciation selon l'invention de masse moléculaire moyenne 120 KD.
Par typage, on met en évidence qu'il s'agit d'anticorps de type Ig G.
On peut alors isoler les anticorps par chromatogra- phie d'affinité sur protéine A fixée sur sépharose, par exemple, en éluant à un pH compris entre 3 et 6. La présente invention concerne donc également des compositions à usage diagnostique contenant à titre d'élément actif au moins une protéine de différenciation ou un anticorps monoclonal selon l'invention et un subs- trat acceptable, par exemple sous forme de kits d'immunodia- gnostic selon un mécanisme basé sur des réactions anticorps- antigène.
Les protéines de différenciation et les anticorps monoclonaux selon l'invention sont également utiles en tant que marqueurs spécifiques tumoraux et prétumoraux pouvant être utilisés pour l'imagerie.
C'est pourquoi la présente invention concerne les compositions à usage diagnostique comportant les protéines de différenciation ou les anticorps monoclonaux selon l'in- vention marqués.
Pour cette utilisation, le marquage peut être réa¬ lisé soit par tout marqueur, en particulier les marqueurs fluorescent, radioactif ou paramagnétique.
Enfin, la présente invention concerne également les compositions à usage thérapeutique comportant au moins une protéine de différenciation ou un anticorps monoclonal selon l'invention conjugué à un principe actif.
EXEMPLE 1
Préparation d'extraits de pancréas foetal On prélève sur des foetus en bon état, après avortement thérapeutique, à 3 à 4 mois de gestation, le pancréas qui est rapidement plongé dans une solution d'antiprotéase contenant de l'acide aminocaproïque (0,4 %) et de l'aprotinine (40 unités de Kallikreine / ml), par exemple l'aprotinine Trasylol^ commercialisée par Sigma. Le pancréas, à raison de 100 mg/ml de solution d'antiprotéase, est broyé le plus tôt possible après le prélèvement avec un broyeur-Ultraturax pendant quelques minutes à froid.
L'extrait est centrifugé à 20000 tours/minute pendant 1/2 heure, le surnageant est aliquoté et conservé à - 80°C.
Ces extraits contiennent entre 5 et 8 mg de protéines par ml. EXEMPLE 2
Préparation de l'antisérum L'extrait de pancréas ci-dessus décrit est injecté à un lapin selon le protocole suivant : . Jour 1 : 1 ml d'extrait + 1 ml d'adjuvant complet de Freund en injections intradermiques sur plusieurs points au dos. . Jour 24 : Même opération que Jour 1. . Jour 44 : Saignée d'essai n° 1. . Jour 54 : Re-immunisation comme Jours 1 et 24. . Jour 78 ; Saignée d'essai n° 2.
. Jour 98 : Nouvelle injection comme précédemment. . Jour 110: Saignée d'essai n° 3.
. Jour 150: Injection intraveineuse sans adjuvant (solution bien claire centrifugée) . . Jour 156: Saignée d'essai n° 4.
. Jour 186: Nouvelle injection intraveineuse.
. Jour 192: Saignée n° 5.
Le sérum est alors décomplément , en le portant au bain-marie à 56βC pendant 30 minutes environ, puis absorbé par des extraits de pancréas adulte normal, du sérum normal et des globules rouges A, 0, B.
EXEMPLE 3
Technique de NIF . Découper une pièce de nitrocellulose de dimensions appropriées (membranes de nitrocellulose BA85,
Schleicher et Schiill - Dassel, R.D.A.).
. Déposer la solution dans laquelle l'antigène est recherché en microgouttes de 1 à 5 μl. La concentration est choisie en fonction de la sensibilité désirée. Les dilutions des antisérums sont faites dans une solution à
2 % d'ovalbumine de blanc d'oeuf, dans l'eau distillée, commercialisée par Sigma.
. Laisser sécher. Rincer avec du P.B.S. . Incuber 1 heure à 4°C dans une solution de protéine saturante (solution à 2 % d'ovalbumine de blanc d'oeuf, dans l'eau distillée, commercialisée par Sigma) pour bloquer les sites de fixation de la membrane non occupée par l'antigène. . Rincer avec du P.B.S. Incuber avec 1'antisérum.
Dans ce cas, pour le sérum anti-pancréas foetal absorbé, on l'utilise dilué 1/1000 pendant une nuit à 4°C.
. Laver abondamment le filtre pour éliminer complètement 1'antisérum. . Incuber avec l'anticorps anti IgG de lapin conjuguée à la péroxydase (Institut Pasteur Production) , dilué 1/2000 pendant 2 heures à 4°C. . Laver à nouveau abondamment avec du P.B.S.
. Révéler la réaction enzymatique par incubation dans le substrat de la péroxydase : H.O. 0,01 % et le chromogène.; Celui-ci peut être soit le chloronaphtol . (Sigma) : coloration bleue, soit le 3,3 ' -diaminobenzidine (:D.A.B., Merck) : coloration marron. Le premier est dissous à 3 mg/ml dans le méthanol puis dilué 5 fois dans le P.B.S. Le deuxième ( D.A:B.).es . issous directement dans le P.B.S. (0,5 mg/ml) . Dans les deux cas, ajouter du peroxyde d'hydrogène à concentration finale de 0,01 % comme indiqué plus haut.
. Lorsque la réaction est développée (stabilisa¬ tion de la couleur), laver à l'eau distillée et pour le
_2 D D..AA..BB..,, ffixer la couleur- par lavage au HC1 10 M. EXEMPLE 4
Immunohistologie
Les coupes d'organes, fixées soit à l'éthanol, soit au formol, soit encore au liquide de Bouin, sont incluses dans la paraffine. Déparaffiner, hydrater et inhiber la péroxydase endogène.
1 ) Incuber avec de la sérumalbumine bovine (B.S.A.) à 2 % dans de l'eau distillée, 1 heure à 4°C.
2) Incuber avec de l'antisérum anti-pancréas foetal dilué 1/25 dans B.S.A. 1 %, 4 heures, à 4°C. 3) Laver 3 fois 10 minutes dans P.B.S.
4) Incuber avec les anticorps anti IgG de lapin conjugués à la péroxydase (Institut Pasteur Production) dilués 1/100 dans du P.B.S.
5) Laver 3 fois 10 minutes dans P.B.S. 6) Révéler la réaction enzymatique dans un bain de H20« 0,01 % et amino-éthylcarbazole. EXEMPLE 5 : Immunoanalyse sur tâches de nitrocellulose après SDS-électrophorèse sur gel d'acrylamide.
On met en oeuvre la technique SDS-PAGE dans des gels à 10 % d'acrylamide dans un tampon Tris-glycine pH 8,3 contenant 0,1 % de SDS (Laenmli U.K. cleavage and structural protéins during assembly of head of the bacteriophage Nature (Lond. 227 : 680-5 (1970) ) .
On transfert aux membranes de nitrocellulose dans une cellule de transfert Biorad à 4° C sous 100 mA en courant constant pendant 16 h à pH 8,3 (Towbin) . Les tâches sont révélées comme dans la technique du NIF.
EXEMPLE 6 :
Caractérisation des protéines de différenciation spécifi¬ que des pancréas par la technique des immunoblots après électrophorèse sur gel acrylamide.
Des homogénats de pancrés adultes tumoraux et foetaux (17, 20, 25 et 32 semaines) sont soumis à une analyse par SDS-PAGE et sont colorés avec du bleu de Coomassie ou transférés aux membranes de nitrocellulose. Plus tard, le sérum anti-pancréas foetal a révélé plusieurs bandes correspondant aux différentes protéines de différenciation.
D'après l'intensité de la coloration, la plupart des protéines sont presque absentes dans les pancréas de 32 semaines.
Les pancréas adultes n'ont pas été colorés.
Dans une tumeur, deux protéines sont présentes, alors que dans une autre est exprimée principalement la protéine de masse moléculaire 120 K. L'évaluation de l'intensité de la coloration par rapport à la référence indique que dans tous les cas, les protéines - de différenciation. sont présentes en faible quanti¬ té par rapport à la quantité totale de protéines dans les homogénats bruts.

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Protéines de différenciation acdno.-foetales associées au cancer du pancréas, caractérisées en ce qu'il s'agit de glycoprotéines manosidees, de masse molé¬ culaire apparente moyenne choisie parmi : 120 KD, 94 KD, 75 KD et 58 KD.
2) Procédé de préparation de protéines selon la revendication 1 , caractérisé en ce que 1'on prépare un homogénat de pancréas foetal humain soluble et que l'on isole une fraction constituée par des glycoprotéines mano- sidées.
3) Procédé de préparation de protéines de diffé¬ renciation acino -foetales associées au.. cancer du pan¬ créas à partir d'extraits pancréatiques foetaux humains selon la revendication 2, comportant les étapes suivantes : a) on prépare un homogénat de pancréas foetal humain soluble, b) on traite l'homogénat par chromatographie sur colonne d'affinité sur concanavaline A couplée à un gel afin de fixer lesdites protéines, c) on élue les protéines en cause, et d) éventuellement, on purifie les protéines obtenues.
4) Procédé selon la revendication 2 ou 3 , carac¬ térisé en ce que le pancréas foetal humain est âgé de moins de 6 mois, de préférence moins de 5 mois.
5) Antisérum polyclonal contre les protéines selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu' il est spécifique du cancer pancréatique.
6) Procédé de préparation d'un antisérum selon la revendication 5, comportant les étapes suivantes : a) on injecte à un animal un extrait de pancréas foetal humain de moins de 6 mois, b) on saigne l'animal et on récupère un anti¬ sérum, — - c) on décomplémente cet antisérum, d) on absorbe l'antisérum décomplémente, e) on centrifuge l'antisérum décomplémente absorbé, et f) on récupère l'antisérum spécifique.
7. Procédé de préparation d'un antisérum selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on injecte un extrait de pancréas foetal humain du foetus âgé de moins de 5 mois.
8. Procédé de préparation d'un antisérum selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on absorbe
1*antisérum, en particulier sur globules rouges A, O, B, le sérum normal et/ou du pancréas normal.
9. Anticorps monoclonal spécifique d'une protéine selon la revendication 1.
10. Procédé de préparation d'un anticorps mono¬ clonal spécifique d'une protéine selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) on immunise une souris avec au moins une des protéines de différenciation, b) on réalise une fusion cellulaire de cellules de rate de ces souris, avec un myélome SP-, c) on cultive les hybridomes obtenus dans un milieu approprié, d) on sélectionne les cultures par criblage, e) on conserve et on clone les hybridomes posir tifs au criblage spécifiquement avec le pancréas foetal, et, f) onrisole et éventuellement on purifie l'anticorps monoclonal. 11) Procédé selon la revendication 10, carac¬ térisé en ce que les protéines de différenciation provien¬ nent d'un foetus âgé de 3 à 4 mois. 2) Composition à usage diagnostique contenant à titre d'élément actif au moins une protéine de différen¬ ciation ou un anticorps monoclonal selon l'une des reven¬ dications 1 ou 9 et un substrat acceptable.
13) Composition selon la revendication 12, carac¬ térisée en ce que la protéine de différenciation ou l'anti¬ corps est marqué.
14) Composition selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un marquage radioactif, paramagnétique ou fluorescent.
15) Composition à usage thérapeutique comportant au moins une protéine de différenciation selon la revendi¬ cation 1 ou un anticorps monoclonal selon la revendication 9 conjugué à un principe actif.
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