EP0073514B1 - Creatinin-Antikörper - Google Patents

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EP0073514B1
EP0073514B1 EP82107973A EP82107973A EP0073514B1 EP 0073514 B1 EP0073514 B1 EP 0073514B1 EP 82107973 A EP82107973 A EP 82107973A EP 82107973 A EP82107973 A EP 82107973A EP 0073514 B1 EP0073514 B1 EP 0073514B1
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EP
European Patent Office
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creatinine
antibody
conjugate
antiserum
substance
Prior art date
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EP82107973A
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English (en)
French (fr)
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EP0073514A1 (de
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Ulrich Dr. Neumann
Joachim Dr. Ziegenhorn
Hans-Georg Dr. Batz
Helmut Dr. Lenz
Joachim Dr. Siedel
Brigitte Pautz
Winfried Dr. Albert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Priority to AT82107973T priority Critical patent/ATE14630T1/de
Publication of EP0073514A1 publication Critical patent/EP0073514A1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies
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    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to an antibody against creatinine, its production, its use for the determination of creatinine on an immunological basis and a reagent suitable therefor.
  • the determination of creatinine is one of the most important methods for the diagnosis of kidney function.
  • it has the decisive advantage that the concentration of creatinine in the serum remains practically unaffected by the diet, in particular by the intake of protein-rich food.
  • the concentration of creatinine in the serum in the decision area (upper limit of the normal values 1.10 mg / dl for men and 0.90 mg / dl for women) is extremely low. Therefore, the sensitivity and specificity of a creatinine test must meet high requirements.
  • This method does not require deproteinization of the serum sample and is specific for creatinine. Because of the relatively low measurement signal, even when using larger sample volumes, the sensitivity of the test is limited in the low creatinine concentration range; in addition, the need to determine the sample blank value makes it very difficult to use the method in automatic analyzers.
  • the invention is therefore based on the object of eliminating the disadvantages of the previous methods for determining creatinine.
  • this problem is solved by a specific antibody against creatinine.
  • the creatinine antibody according to the invention is characterized in that it is specific with Creatinine forms a hapten-antibody complex.
  • creatinine is a substance which is widespread in the body of all organisms which produce antibodies and which itself cannot trigger the formation of antibodies. Also, because of the relatively small molecular size and the high serum concentration, it could not be expected that creatinine as a conjugate with a haptic carrier substance could trigger the formation of antibodies which are so specific that they do not even cross-react to any appreciable extent with substances which have essential structural features with the Creatinine are common such. B. creatine and urea and which are therefore suitable for a quantitative determination method.
  • the preparation of the antibody according to the invention is characterized in that a conjugate of creatinine and a material suitable for antiserum formation, such as. B. a protein, which is connected via an aliphatic or araliphatic carboxylic acid as a bridge, used as an immunogen for antiserum formation.
  • a material suitable for antiserum formation such as. B. a protein, which is connected via an aliphatic or araliphatic carboxylic acid as a bridge, used as an immunogen for antiserum formation.
  • the creatinine conjugate used in the immunization method according to the invention is produced by binding the creatinine to an aliphatic or araliphatic carboxylic acid and then linking the carboxyl group of the part derived from the carboxylic acid to a haptic carrier substance which can cause the formation of antiserum.
  • the fatty acids with at least 3 carbon atoms, preferably with 4 to 16 carbon atoms, and aromatic carboxylic acids bearing alkyl side groups have proven suitable for this.
  • Benzoic acid derivatives with an alkyl group of 1 to 4 carbon atoms on the aromatic ring are particularly suitable. Typical examples are methylbenzoic acid, ethylbenzoic acid and propylbenzoic acid. Also suitable are the oligomers of these araliphatic carboxylic acids such as. B. methylbenzoate-methylbenzoic acid.
  • the bond between creatinine, which is to be regarded immunologically as hapten here, and the carboxylic acid can be produced by methods known per se using activated carboxylic acid derivatives.
  • Halogenated carboxylic acids in particular the w-bromocarboxylic acids, are preferably used in an aqueous alcoholic medium or, in the case of the corresponding halogenated carboxylic acid esters, in an anhydrous medium with subsequent hydrolysis.
  • the best results were achieved with the tU-bromocarboxylic acid esters with subsequent saponification, yields of up to 50% being obtained.
  • the reaction with the creatinine takes place at an elevated temperature, advantageously at the boiling point.
  • carboxylic acid esters are used, polar organic solvents such as dimethylformamide, formamide and tetrahydrofuran are advantageously used as solvents.
  • the reaction is advantageously carried out in the presence of an amine, for example a mono-, di- or trialkylamine.
  • the saponification of the product can be carried out with gentle heating in an aqueous alkaline medium.
  • the coupling can also take place via the CH z group by diazotization with p-benzoic acid diazonium salt.
  • the coupling with the haptic carrier substance is advantageously carried out in an aqueous organic medium in the presence of an amine and a chloroformate.
  • Water / dioxane proved to be particularly suitable as the reaction medium.
  • the creatinine conjugate thus obtained is used as an immunogen for antiserum formation.
  • it is applied according to the methods of the selected animal species known to the person skilled in the art.
  • the application can be intradermal, intramuscular or subcutaneous.
  • the immunogen is preferably used together with Freund's adjuvant to enhance the formation of antiserum.
  • the following immunization scheme has proven to be well suited for sheep:
  • the antiserum obtained in this way which contains the antibody according to the invention, can after dialysis, in which u. a. serum creatinine bound to the antibodies is also removed from the outset, for which creatinine determination is used.
  • the antibody is preferably enriched or purified.
  • the protein fraction precipitating up to 1.8 mol / l of ammonium sulfate is advantageously isolated and freed from low molecular weight constituents by dialysis.
  • a further fine cleaning can be done by immunosorbtion.
  • the antibody preparation is given over carrier-bound creatinine conjugate.
  • the antibody is adsorbed on creatinine conjugate and eluted again with a creatinine solution after washing out impurities.
  • the complex formed can be cleaved again by dialysis against acid or saline solution and pure antibodies can be isolated.
  • Another suitable cleaning method is dialysis of the 1.8 mmol / l ammonium sulfate fraction against common salt, addition of creatinine and subsequent incubation with carrier-bound creatinine.
  • the creatinine-specific antibody complex runs through the column and can thus be separated from antibodies of undesired specificity (e.g. against spacers or haptic carrier substance).
  • Another object of the invention is the use of the new antibody for the determination of creatinine. It is based on the fact that the binding reaction between a creatinine conjugate and the antibody which is directed against a creatinine conjugate with either the same but preferably with a different haptic carrier substance is inhibited by creatinine in a concentration-dependent manner.
  • the antibodies can e.g. B. in the form of antiserum or the immunoglobulin fraction obtained therefrom, which have previously been treated by a suitable pretreatment such.
  • B. Dialysis against dilute propionic or hydrochloric acid was freed from adhering serum creatinine. (see R. K, Hindawi et al., J. Immunol. Methods 37, 57-70 (1980).
  • the method according to the invention for the immunological determination of creatinine is therefore characterized in that the creatinine antibody is incubated with a creatinine-containing sample solution, then a conjugate of creatinine with a cap carrier substance is added, one of the two components, antibody or conjugate, in solid or dissolved form , the other component is in dissolved form, and the inhibition of the binding reaction between the antibodies and the creatinine conjugate is measured.
  • the creatinine conjugate used to obtain the antibody and the one used to determine the binding reaction can contain different but alternatively the same haptic carrier substances (e.g. serum albumin), in the latter case cross-reactions against the haptic carrier substance can be selectively concealed in the test by Antibody fraction before determining the binding reaction with the hapten which is actually of interest adds the haptic carrier substance in the concentration necessary for the precipitation of the antibody directed against the hapten carrier substance, the test result for the determination of turbidity formation (TINIA, NINIA) which is initially caused by the cross-reaction of the creatinine Conjugate antibodies with the cap carrier substance precipitates are removed, e.g. B. by centrifugation or filtration.
  • TINIA, NINIA turbidity formation
  • the inhibition of binding between antibody and creatinine conjugate is stronger, the more creatinine was added to the antibody before mixing with the creatinine conjugate.
  • the inhibitory effect is already pronounced in a concentration range of creatinine in the sample solution to be measured below 1 mg / dl, that is to say the range in which the usability of the known creatinine determination methods which have been used to date is very limited.
  • haptic carrier substances are suitable as haptic carrier substances.
  • examples of this are all foreign proteins that do not occur in the host animal that is used for antibody formation, for example serum albumin of various origins, as well as keyhole lymphocyanine, (lipo) polysaccharides, agarose, polylysine, activated carbon.
  • examples of other known carrier substances for haptens are given in Handbook of Experimental Immunology, Blackwell, Scientific Publications, 3rd ed. (1978), pp. 1-11. Suitable known methods for linking carrier substance and hapten can also be found there.
  • Preferred haptic carrier substances are serum albumin of various origins, for example bovine serum albumin, human serum albumin and edestin.
  • antibody means both purified antibodies and antisera, immunoglobulin fractions obtained from the latter, and antibody fragments such as F (ab) 2 , Fab and Fv fragments.
  • all antibody-forming organisms can be used for antibody formation. Sheep are preferred.
  • the enzymes successfully used for this purpose such as ⁇ -galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and luciferase, can be mentioned.
  • coenzymes z.
  • a preferred method among the methods mentioned above is turbidity measurement. It consists in determining the inhibition of the binding reaction by measuring the immunoprecipitation in a predetermined time interval, both the nephelometric measurement method (scattered light measurement) and the turbidimetric measurement method (transmitted light measurement) being applicable.
  • Another preferred method consists in determining the inhibition of the binding reaction by back-titration of unbound haptic carrier-creatinine conjugate with labeled antibodies, particularly preferably enzyme-labeled antibodies, and measurement of the bound or unbound portion of the marked substance.
  • labeled antibodies particularly preferably enzyme-labeled antibodies
  • RIA radioactive substances
  • EIA enzymes or coenzymes
  • FIA fluorescence
  • spin labeling cf. Nature New Biology, Vol. 236 (1972), pp. 93/94.
  • labeled antibodies can be labeled anti-antibodies can be used (double antibody method).
  • Another object of the invention is a reagent for the immunological determination of creatinine, which is characterized in that it contains creatinine antibodies, a conjugate of creatinine with a haptic carrier substance and buffer substance.
  • the reagent according to the invention preferably also contains a substance which promotes immunoprecipitation.
  • Polyethylene glycol is particularly suitable for this purpose, alone or optionally together with a surface-active substance.
  • Suitable polyethylene glycol is one having a molecular weight between 200 and 20,000, preferably a molecular weight of 6,000 ⁇ 2,000.
  • Suitable concentrations for polyethylene glycol in the reagent are between 0.1 and 8% by volume.
  • a reagent is preferred according to the invention which contains 0.5 to 500 ⁇ g / ml conjugate of creatinine and human serum albumin in a molar ratio creatinine: human serum albumin of 2 to 60, antibodies against creatinine in a molar ratio of 0.1 to 10, based on the conjugate , 0.1 to 8 wt .-% polyethylene glycol, buffer substance of ionic strength 0.03 to 0.4 pH 4 to 10, contains.
  • EMIT method reagent of this invention preferably contains 10- 4 to 10- 14 mol / I antibody against creatinine, with respect to active receptor sites, 10- 4 to 10- 14 mol / I malate dehydrogenase creatinine conjugate, 0.05 to 50 mmol / I oxaloacetic acid, 5 to 200 mmol phosphate buffer, pH 6 to 8.5 and 0.05 to 0.4 mmol / I NADH.
  • the known buffer substances which are effective in the pH range from 4 to 10, preferably 6 to 9, can be used as buffer substances.
  • the buffer concentration in the dissolved reagent should be between 0.005 and 1.0 mol / l, preferably 0.01 to 0.1 mol / l. The range from 0.03 to 0.07 mol / l is particularly preferred.
  • the antibody concentration in the test should expediently be between about 10- 4 and 10- 14 mol / l, preferably between 10 -6 and 10 -12 mol / l, here mol / l means active receptor sites.
  • the solution to be analyzed can be added directly to the reagent. If the creatinine is present in high concentrations, the sample should be diluted with water beforehand.
  • the determination can generally be carried out at temperatures between 10 and 50 ° C., in particular between 15 and 40 ° C.
  • the creatinine conjugates can be prepared by known methods, for example by the procedure of the mixed anhydrides described in J. Biol. Chem. 228 (1957), pp. 713-727. The same applies to labeling with an enzyme.
  • the substance is obtained as a hydrobromide.
  • the ester is immediately saponified by dissolving it in water. To this solution is added dropwise 1N sodium hydroxide solution at 40-50 ° C. while keeping the pH constant at pH 10. If the pH no longer drops, neutralize with 1N hydrochloric acid. The solution is then evaporated to dryness and taken up in acetone. It will filtered off from the undissolved and concentrated again. Then it is recrystallized from isopropanol. The substance is in the form of hydrochloride.
  • bovine serum albumin 3.6 g bovine serum albumin are dissolved in 250 ml water / dioxane (1: 1), to this is added 5.6 ml 1N NaOH, whereby solution occurs. It is then cooled to 4 ° C. A solution of 1.7 g of creatinine-butyric acid, 1.7 ml of tributylamine and 0.95 ml of isobutyl chloroformate in 60 ml of dioxane and 3 ml of DMF is added dropwise to this solution.
  • the mixture is stirred at 4 ° C. for 24 hours, then dialyzed against flowing, demineralized water for 36 hours. The solution is then lyophilized.
  • the antiserum obtained according to Example B) is dialyzed against 1 mol / 1 propionic acid, then against 1 mmol / I HCl, then neutralized with bicarbonate.
  • the antiserum is diluted with TINAQUANT®-FN buffer (the precipitate may be centrifuged off again after 15 min after dilution).
  • FIG. 1 of the drawing shows a calibration curve determined in this way, in which the extinction difference is plotted against the creatinine concentration.
  • Microtiter plates are coated with 200 ⁇ l creatinine-HSA conjugate (50 ⁇ l / ml HSA / blank value 200 ⁇ l HSA (50 ⁇ l / ml) incubated at room temperature for about 16 h and then aspirated. Then 300 ⁇ l, lP are added, incubated, and aspirated again Then add 300 ⁇ l WP and suck it out again. Then load with creatinine antiserum.
  • 200 ⁇ l creatinine-HSA conjugate 50 ⁇ l / ml HSA / blank value 200 ⁇ l HSA (50 ⁇ l / ml) incubated at room temperature for about 16 h and then aspirated. Then 300 ⁇ l, lP are added, incubated, and aspirated again Then add 300 ⁇ l WP and suck it out again. Then load with creatinine antiserum.
  • 1000 ⁇ l antiserum is diluted 1: 200 to 1: 2000 in IP, with 10 ⁇ l creatinine sample or 10 ⁇ l lP (for the blank value ) Incubated at room temperature for 30 minutes, then 200 .mu.l of the antiserum dilution thus obtained are added to the coated microtiter plates, sealed for 60 minutes (plastic bag), left to stand, sucked out, 300 .mu.l WP added and sucked out again.
  • the enzyme activity ( ⁇ U / min) is measured spectrophotometrically at 340 nm and 30 ° C.

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Description

  • Die Erfindung betrifft einen Antikörper gegen Creatinin, seine Herstellung, seine Verwendung zur Bestimmung von Creatinin auf immunologischer Basis und ein hierfür geeignetes Reagenz. In der klinischen Chemie stellt die Bestimmung des Creatinins eine der wichtigsten Methoden zur Diagnostik der Nierenfunktion dar. Gegenüber der Harnstoffbestimmung hat sie den entscheidenden Vorteil, daß die Konzentration des Creatinins im Serum von der Ernährungsweise, insbesondere von der Zufuhr proteinreicher Nahrung, praktisch unbeeinflußt bleibt.
  • Allerdings ist im Vergleich zum Harnstoff die Konzentration des Creatinins im Serum im Entscheidungsbereich (Obergrenze der Normalwerte 1,10 mg/dl bei Männern bzw. 0,90 mg/dl bei Frauen) außerordentlich gering. Deshalb müssen an die Empfindlichkeit und Spezifität eines Creatinin-Tests hohe Anforderungen gestellt werden.
  • Wegen der Bedeutung des Creatinin-Tests als Standarduntersuchungsmethode im klinischen Labor sollte dieser aber gleichzeitig mit möglichst geringem Arbeitsaufwand durchführbar und besonders für den Einsatz an Analysenautomaten geeignet sein.
  • Die bisher gebräuchlichste Bestimmungsmethode für Creatinin beruht auf der von M. Jaffe gefundenen Farbreaktion von Creatinin mit Pikrinsäure im alkalischen Medium. Hierbei wird nach saurer Enteiweißung der Probe (z. B. mit Trichloressigsäure oder mit Pikrinsäure) im Überstand nach Zugabe von Pikrinsäure und Alkalisieren eine rote Färbung entwickelt und photometrisch gemessen. Dieses an sich einfache Verfahren ist jedoch mit einer Reihe wesentlicher Nachteile behaftet.
  • Es hat sich gezeigt, daß die Jaffe-Reaktion von über 50 ebenfalls chromogenen Substanzen beeinflußt wird [Literatur: Clin. Chem. 26, 1119-1126 (1980)], insbesondere von natürlicherweise im Serum vorkommenden Bestandteilen wie Glucose, Pyruvat, Acetoacetat und Aceton und somit nicht für Creatinin spezifisch ist. Diese »Nichtcreatinin Chromogene« stören vor allem bei niedrigen Creatinin-konzentrationen ( 5 1 mg/dl) was zu einer Limitierung der unteren Erfassungsgrenze für Creatinin führt (»creatininblinder« Bereich).
  • Auch führen schon geringe Verschiebungen des pH-Wertes im Reaktionsmilieu zu einer Veränderung der Farbtiefe. Schließlich stellt auch die Verwendung teilweise ätzender und giftiger Reagentien eine Gefahrenquelle bei der Handhabung dar. Eine Reihe von Modifikationen der Jaffe-Reaktion verbessert zwar die Präzision und Durchführbarkeit, ohne jedoch diese prinzipiellen Mängel vollständig zu beheben.
  • Eine weitere, bekannte Methode wandelte Creatinin unter Zusatz von o-Nitrobenzaldehyd in Methylguanidin um, welches dann nach der Sakaguchi-Reaktion bestimmt wird. Bekannt ist auch eine Farbreaktion zwischen Creatinin und Kalium-Quecksilber-Thiocyanat. Beide Methoden erwiesen sich jedoch für das klinische Labor als ungeeignet.
  • Bekannt ist ferner, durch Kombination der Jaffe-Reaktion mit enzymatischen Teilschritten Störungen durch unspezifische Chromogene zu umgehen. Dabei wird die mit der Serumprobe vor und nach Behandlung mit Creatininamidohydrolase/Creatinkinase/ATP erhaltene Färbung in der Jaffe-Reaktion bestimmt und aus der Differenz der Extinktionen der Creatinin-Gehalt berechnet (Arch. Pharm. 3, 893-896 (1980). Diese Methode ist zwar spezifisch, die Durchführung jedoch sehr umständlich und nur schwer automatisierbar.
  • Ferner sind Verfahren zur Creatininbestimmung bekannt, in denen der aus Creatinin durch Einwirkung der Creatinin-Iminohydrolase freigesetzte Ammoniak bestimmt wird, entweder mit ammoniakselektiven Elektroden (Anal. Chem. 46, 246-249 (1976)) oder fluorimetrisch über den NADH-Verbrauch in der nachgeschalteten Glutamatdehydrogenase-Reaktion (Clin. Chim. Acta 100, 21 -23 (1980)). Wegen der möglichen Gegenwart vergleichsweise großer Mengen an freiem Ammoniak im Probenmaterial erscheint es jedoch fraglich, ob derartige Messungen hinreichend störungsfrei gestaltet werden und damit Eingang in die Routinediagnostik finden können.
  • In neuester Zeit wurde ein vollenzymatischer Creatinintest beschrieben, bei dem Creatinin in Creatin umgewandelt, letzteres mit ATP zu Creatinphosphat umgesetzt und das dabei entstehende ADP in einer gekoppelten Reaktion mit Pyruvatkinase und Lactatdehydrogenase (LDH) photometrisch über die Abnahme des NADH-Gehaltes in der Reaktionslösung gemessen wird [Scand. J. clin. Lab. Invest., suppl. 29, p. 126 (1972)].
  • Diese Methode erfordert keine Enteiweißung der Serumprobe und ist spezifisch für Creatinin. Wegen des relativ geringen Meßsignals, selbst bei Einsatz größerer Probevolumina, ist jedoch die Empfindlichkeit des Tests im niedrigen Creatinin-Konzentrationsbereich limitiert; zudem ist durch die Notwendigkeit einer Probenleerwertbestimmung eine Anwendung der Methode in Analysenautomaten sehr erschwert.
  • Es besteht daher der Bedarf an einem einfachen und automatisierbaren, gleichzeitig sehr spezifischen und aus den o. g. Gründen ganz besonders im Konzentrationsbereich < 1 mg/dl Creatinin (»creatininblinder« Bereich) sehr empfindlichen Test für Creatinin.
  • Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bisherigen Methoden zur Bestimmung von Creatinin zu beseitigen.
  • Gelöst wird dieses Problem erfindungsgemäß durch einen spezifischen Antikörper gegen Creatinin.
  • Der erfindungsgemäße Creatinin-Antikörper ist dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch mit Creatinin einen Hapten-Antikörper-Komplex bildet.
  • Es ist überraschend, daß ein Antikörper gegen Creatinin herstellbar ist, da Creatinin eine im Körper aller Organismen, die Antikörper bilden, weit verbreitete Substanz darstellt, die selber eine Antikörperbildung nicht auslösen kann. Auch konnte wegen der relativ geringen Molekülgröße sowie der hohen Serumkonzentration nicht erwartet werden, daß Creatinin als Konjugat mit einer Haptenträgersubstanz die Bildung von Antikörper auslösen kann, die so spezifisch sind, daß sie in nennenswertem Umfang nicht einmal mit Substanzen kreuzreagieren, denen wesentliche Strukturmerkmale mit dem Creatinin gemeinsam sind wie z. B. Creatin und Harnstoff und die sich deswegen für eine quantitative Bestimmungsmethode eignen. Hierauf dürfte auch zurückzuführen sein, daß immunologische Testmethoden zwar seit etwa 40 Jahren bekannt sind und ebenfalls seit langer Zeit ein Bedarf an einer besonders im niedrigen Konzentrationsbereich verbesserten Creatininbestimmungsmethode bestanden hat, ohne daß es bisher gelungen wäre, eine derartige wirklich spezifische immunologische Creatinin-Bestimmungsmethode aufzufinden.
  • Die Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Konjugat von Creatinin und einem zur Antiserumbildung geeigneten Material, wie z. B. einem Protein, das über eine aliphatische oder araliphatische Carbonsäure als Brückenglied verbunden ist, als lmmunogen zur Antiserumbildung verwendet.
  • Das im erfindungsgemäßen Verfahren zur Immunisierung verwendete Creatinin-Konjugat wird hergestellt, indem man das Creatinin an eine aliphatische oder araliphatische Carbonsäure bindet und dann die Carboxylgruppe des von der Carbonsäure stammenden Teils mit einer Haptenträgersubstanz, welche die Antiserumbildung bewirken kann, verknüpft. Als geeignet erwiesen sich hierfür die Fettsäuren mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen sowie Alkylseitengruppen tragende aromatische Carbonsäuren. Besonders geeignet sind Benzoesäurederivate mit einer Alkylgruppe von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen am aromatischen Ring. Typische Beispiele sind Methylbenzoesäure, Äthylbenzoesäure und Propylbenzoesäure. Ebenfalls geeignet sind die Oligomeren dieser araliphatischen Carbonsäuren wie z. B. Methylbenzoat-methylbenzoesäure.
  • Die Bindung zwischen Creatinin, das hier immunologisch als Hapten anzusehen ist, und der Carbonsäure kann nach an sich bekannten Methoden unter Verwendung aktivierter Carbonsäurederivate hergestellt werden. Bevorzugt verwendet man halogenierte Carbonsäuren, insbesondere die w-Bromcarbonsäuren in wässrig alkoholischem Medium oder im Falle der entsprechenden halogenierten Carbonsäureester in wasserfreiem Medium mit anschließender Verseifung. Die besten Ergebnisse wurden mit den tU-Bromcarbonsäureestern mit anschließender Verseifung erzielt, wobei Ausbeuten bis 50% erhalten wurden. In wässrig alkoholischem Medium erfolgt die Umsetzung mit dem Creatinin bei erhöhter Temperatur, zweckmäßig am Siedepunkt. Verwendet man die Carbonsäureester, so werden als Lösungsmittel zweckmäßig polare organische Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Formamid und Tetrahydrofuran verwendet. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in Gegenwart eines Amins, beispielsweise eines Mono-, Di- oder Trialkylamins. Die Verseifung des Produktes kann unter gelindem Erwärmen in wässrig alkalischem Medium durchgeführt werden. Die Kupplung kann außer über den Stickstoff auch über die CHz-Gruppe durch Diazotierung mit p-Benzoesäure-diazoniumsalz erfolgen.
  • Die Kupplung mit der Haptenträgersubstanz erfolgt zweckmäßig in wässrig organischem Medium in Gegenwart eines Amins und eines Chlorameisensäureesters. Als besonders geeignet erwies sich Wasser/Dioxan als Reaktionsmedium.
  • Das so erhaltene Creatinin-Konjugat wird als Immunogen zur Antiserumbildung verwendet. Hierzu wird es nach den dem Fachmann bekannten Methoden der ausgewählten Tierspezies appliziert. Die Applikation kann beispielsweise intradermal, intramuskulär oder subkutan erfolgen. Vorzugsweise wird das Immunogen zusammen mit Freund'schem Adjuvanz zur Verstärkung der Antiserumbildung verwendet. Beim Schaf erwies sich folgendes Immunisierungsschema als gut geeignet:
    Figure imgb0001
  • Das so gewonnene Antiserum, welches den erfindungsgemäßen Antikörper enthält, kann nach Dialyse, bei der u. a. auch von vorn herein an die Antikörper gebundenes Serumcreatinin entfernt wird, für die Creatininbestimmung eingesetzt werden. Vorzugsweise erfolgt jedoch eine Anreicherung bzw. Reinigung des Antikörpers. Dabei wird günstig die bis 1,8 Mol/I Ammonsulfat ausfallende Proteinfraktion isoliert und durch Dialyse von niedermolekularen Bestandteilen befreit.
  • Eine weitere Feinreinigung kann durch Immunosorbtion erfolgen. Hierbei wird das Antikörperpräparat über trägergebundenes Creatininkonjugat gegeben. Der Antikörper wird dabei an Creatininkonjugat adsorbiert und nach Auswaschen von Verunreinigungen mit einer Creatininlösung wieder eluiert. Durch Dialyse gegen Säure oder Salzlösung kann der gebildete Komplex wieder gespalten und reiner Antikörper isoliert werden.
  • Eine andere geeignete Reinigungsmethode besteht in einer Dialyse der 1,8 mMol/I Ammonsulfatfraktion gegen Kochsalz, Zusatz von Creatinin und anschließendes Inkubieren mit trägergebundenem Creatinin. Hierbei läuft der creatinin-spezifische Antikörperkomplex durch die Säule und kann so von Antikörpern unerwünschter Spezifität (z. B. gegen Spacer oder Haptenträgersubstanz) abgetrennt werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des neuen Antikörpers zur Bestimmung von Creatinin. Sie beruht darauf, daß die Bindungsreaktion zwischen einem Creatinin-Konjugat und dem Antikörper, der gegen ein Creatinin-Konjugat mit entweder derselben, bevorzugt aber mit einer anderen Haptenträgersubstanz gerichtet ist, durch Creatinin in konzentrationsabhängiger Weise gehemmt wird. Die Antikörper können z. B. in Form von Antiserum bzw. der daraus gewonnenen Immunglobulinfraktion eingesetzt werden, die zuvor durch eine geeignete Vorbehandlung wie z. B. Dialyse gegen verdünnte Propion- oder Salzsäure von anhaftendem Serum-Creatinin befreit wurde. (s. R. K, Hindawi et al., J. Immunol. Methods 37, 57-70 (1980).
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Creatinin ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man den Creatinin-Antikörper mit einer creatininhaltigen Probelösung inkubiert, danach ein Konjugat von Creatinin mit einer Haptenträgersubstanz zusetzt, wobei eine der beiden Komponenten, Antikörper oder Konjugat, in fester oder gelöster Form, die andere Komponente in gelöster Form vorliegt, und man die Hemmung der Bindungsreaktion zwischen den Antikörpern und dem Creatinin-Konjugat mißt.
  • Das zur Antikörpergewinnung verwendete und das zur Bestimmung der Bindungsreaktion eingesetzte Creatinin-Konjugat können verschiedene, alternativ aber auch dieselben Haptenträgersubstanzen enthalten (z. B. Serumalbumin), wobei in letzterem Fall Kreuzreaktionen gegen die Haptenträgersubstanz im Test dadurch selektiv kaschiert werden können, daß man der Antikörperfraktion vor Bestimmung der eigentlich interessierenden Bindungsreaktion mit dem Hapten die Haptenträgersubstanz in der zur Fällung der gegen die Haptenträgersubstanz gerichteten Antikörper notwendigen Konzentration zusetzt, wobei bei der Durchführung des Tests über die Bestimmung von Trübungsbildungen (TINIA, NINIA) die zunächst durch die Kreuzreaktion der Creatinin-Konjugat-Antikörper mit der Haptenträgersubstanz entstandenen Niederschläge entfernt werden, z. B. durch Zentrifugation oder Filtration.
  • Die Bindungshemmung zwischen Antikörper und Creatinin-Konjugat ist um so stärker, je mehr Creatinin dem Antikörper vor dem Vermischen mit dem Creatinin-Konjugat zugesetzt wurde. Der Hemmungseffekt ist bereits in einem Konzentrationsbereich des Creatinins in der zu messenden Probelösung unter 1 mg/dl, also dem Bereich, in dem die Brauchbarkeit der bisher vorzugsweise angewendeten bekannten Creatininbestimmungsmethoden bereits sehr eingeschränkt ist, stark ausgeprägt.
  • In der Literatur sind zwar bereits zahlreiche Fälle beschrieben, bei denen ein Hapten selbst bei der immunologischen Bindungsreaktion zwischen einem zugehörigen Haptenkonjugat und dem dagegen gerichteten Antiserum als Inhibitor wirkt und diese Eigenschaften auch zur quantitativen Bestimmung des freien Haptens nach verschiedenen Testverfahren (z. B. RIA, EMITO, ELISA, TINIA oder NINIA) herangezogen wird. Bisher wurde in der Literatur jedoch nur die Gewinnung von Antikörpern gegen niedermolekulare Substanzen wie Hormone beschrieben, die im Körper des immunisierten Tieres nur in sehr geringer Menge vorkommen [10-2-10-12 mol/I; vgl. auch R. K. Hindawi et al., J. Immunolog. Methods 37,57-70 (1980), Anlage].
  • Als Haptenträgersubstanzen eignen sich die in der Immunologie hierfür bekannten Stoffe. Beispiele hierfür sind im Prinzip alle artfremden Proteine, die im Wirtstier, welches zur Antikörperbildung herangezogen wird, nicht vorkommen, beispielsweise Serumalbumine verschiedlichen Ursprungs, sowie Key-hole-Lymphocyanin, (Lipo)-Polysaccaride, Agarose, Polylysin, Aktivkohle. Beispiele für weitere bekannte Trägersubstanzen für Haptene sind in Handbook of Experimental Immunology, Blackwell, Scientific Publications, 3. Aufl. (1978), S. 1-11 angegeben. Dort finden sich auch geeignete bekannte Methoden zur Verknüpfung von Trägersubstanz und Hapten.
  • Bevorzugte Haptenträgersubstanzen sind Serumalbumine verschiedener Herkunft, beispielsweise Rinderserumalbumin, Humanserumalbumin und Edestin.
  • Unter dem Begriff Antikörper werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl gereinigte Antikörper als auch Antiseren, aus letzteren gewonnene Immunoglobulinfraktionen sowie Antikörperfragmente, wie F(ab)2-, Fab- und Fv-Fragmente verstanden.
  • Für die Antikörperbildung können generell alle antikörperbildenden Lebewesen verwendet werden. Bevorzugt werden Schafe verwendet.
  • Die Hemmungswirkung des Creatinins auf die Bindungsreaktion zwischen dem Creatinin-Konjugat und den Antikörpern kann nach an sich bekannten immunologischen Methoden direkt gemessen werden. Als Beispiele seien erwähnt die Methoden unter Verwendung markierter Antikörper bzw. Antigene, wie RIA oder EIA, letzteres mit den Ausführungsformen ELISA oder EMIT, die Trübungsmessung der Hemmung der Immunpräzipitation zwischen Konjugat und Antikörper (TINIA-Prinzip) bzw. die entsprechende nephelometrische Methode (NINIA-Prinzip). Ferner sind anwendbar Agglutiniations-Inhibitions-Tests (PACIA=Particel Counting Immuno-Assay) und Komplementbindungsreaktionen. Diese Methoden sind dem Fachmann sämtlich bekannt und brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden. Lediglich beispielsweise wird für Ausführungsformen der EIA auf Clin. Chim. Acta, 81 (1977), S. 1-36 und J. Clin. Chem. Biochem. 18 (1980), S. 197-208 verwiesen.
  • Im Falle der Enzymmarkierung können die hierfür erfolgreich verwendeten Enzyme, wie ß-Galactosidase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und Luciferase erwähnt werden. Für eine Markierung mit Coenzymen kommen z. B. NAD oder NADP bzw. deren reduzierte Stufen in Betracht. Markiert kann sowohl Antikörper als auch Hapten sein.
  • Eine bevorzugte Methode unter den oben genannten Methoden ist die Trübungsmessung. Sie besteht darin, daß man die Hemmung der Bindungsreaktion durch Messung der Immunpräzipitation in einem vorgegebenen Zeitintervall bestimmt, wobei sowohl die nephelometrische Meßmethode (Streulichtmessung) als auch die turbidimetrische Meßmethode (Durchlichtmessung) anwendbar sind.
  • Eine weitere bevorzugte Methode besteht darin, daß man die Hemmung der Bindungsreaktion durch Rücktitration von nichtgebundenem Haptenträgersubstanz-Creatinin-Konjugat mit markierten Antikörpern, besonders bevorzugt enzymmarkierten Antikörpern, und Messung des gebundenen oder des nichtgebundenen Anteils der markierten Substanz bestimmt. Hierfür eignet sich z. B. die Markierung mit radioaktiven Substanzen (RIA), Enzymen bzw. Coenzymen (EIA), Fluoreszenz (FIA), Spinmarkierung (vgl. Nature New Biology, Vol. 236 (1972), S. 93/94. Als markierte Antikörper können auch markierte Anti-Antikörper verwendet werden (Doppelantikörpermethode).
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur immunologischen Bestimmung von Creatinin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es Creatinin-Antikörper, ein Konjugat von Creatinin mit einer Haptenträgersubstanz und Puffersubstanz enthält.
  • Das erfindungsgemäße Reagenz enthält vorzugsweise auch eine Substanz, welche die Immunpräzipitation fördert. Besonders geeignet ist hierfür Polyäthylenglykol, allein oder gegebenenfalls zusammen mit einer oberflächenaktiven Substanz. Als Polyäthylenglykol eignet sich ein solches mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 20 000, bevorzugt wird ein Molekulargewicht von 6000 ± 2000. Geeignete Konzentrationen für Polyäthylenglykol im Reagenz liegen zwischen 0,1 und 8 Vol.-%. Hinsichtlich des Antikörperbestandteils und der angewandten Markierung gelten die obigen Ausführungen für das erfindungsgemäße Reagenz entsprechend.
  • Für die turbidimetrische Bestimmungsmethode wird erfindungsgemäß ein Reagenz bevorzugt, welches 0,5 bis 500 gg/ml Konjugat aus Creatinin und Humanserumalbumin im molaren Verhältnis Creatinin : Humanserumalbumin von 2 bis 60, Antikörper gegen Creatinin im Molverhältnis 0,1 bis 10, bezogen auf das Konjugat, 0,1 bis 8 Gew.-% Polyäthylenglykol, Puffersubstanz der lonenstärke 0,03 bis 0,4 pH 4 bis 10, enthält.
  • Für die EMIT-Methode enthält das erfindungsgemäße Reagenz vorzugsweise 10-4 bis 10-14 Mol/I Antikörper gegen Creatinin, bezogen auf aktive Rezeptorstellen, 10-4 bis 10-14 Mol/I Creatinin-Malat- dehydrogenase-Konjugat, 0,05 bis 50 mMol/I Oxalessigsäure, 5 bis 200 mMol Phosphatpuffer, ph 6 bis 8,5 und 0,05 bis 0,4 mMol/I NADH.
  • Als Puffersubstanzen können im Rahmen der Erfindung die bekannten, im pH-Bereich von 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 9 wirksamen, verwendet werden. Die Pufferkonzentration im gelösten Reagenz sollte zwischen 0,005 und 1,0 Mol/I, vorzugsweise 0,01 bis 0,1 Mol/I, liegen. Besonders bevorzugt wird der Bereich von 0,03 bis 0,07 Mol/I.
  • Die Antikörperkonzentration im Test sollte zweckmäßig zwischen etwa 10-4 und 10-14 Mol/I, vorzugsweise zwischen 10-6 und 10 -12 Mol/I liegen, wobei hier unter Mol/l aktive Rezeptorstellen verstanden werden.
  • Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung kann die zu analysierende Lösung unmittelbar dem Reagenz zugesetzt werden. Liegt das Creatinin in hohen Konzentrationen vor, wird die Probe zweckmäßig vorher mit Wasser verdünnt.
  • Die Bestimmung kann im allgemeinen bei Temperaturen zwischen 10 und 50°C, insbesondere zwischen 15 und 40° C durchgeführt werden.
  • Die Herstellung der Creatinin-Konjugate kann nach bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise nach der in J. Biol. Chem. 228 (1957), S. 713-727 beschriebenen Arbeitsweise der gemischten Anhydride. Gleiches gilt für die Markierung mit einem Enzym.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Die darin verwendeten Abkürzungen haben die nachstehend angegebene Bedeutung:
    Figure imgb0002
    TINAQUANT-FN-Puffer:
    Figure imgb0003
    • A) Herstellung des Immunogens 1. p-(N-creatinyl)-methyl-benzoesäure
  • 11,3 g (100 mMol) Creatinin und 21,5 g (100 mMol) p-Brom-methyl-benzoesäure werden in 250 ml Wasser-Athanol-Mischung (1 : 1) eine Stunde am Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen fällt nicht umgesetzte Brommethylbenzoesäure aus. Sie wird abfiltriert, das Filtrat wird bis auf etwa 100 ml eingeengt und dann auf eine lonenaustauschersäule gegeben (Dowex® (Fa. SERVA) 148; 200-400 mesh, Gegenion Formiat). Bei Elution mit Wasser wird das gewünschte Produkt in Reinsubstanz gewonnen.
  • Fp: > 250° C, Ausbeute 2,5 g (9,5%).
  • Rf-Wert (Butanol/Eisessig/Wasser 60/15/25) =0,43 mit einem Rf-Wert von 0,48 Wert als weiteres Creatinin-derivat p-(Creatinyl)-methyl-benzoat-methyl-benzoesäure isoliert, die ebenfalls als Hapten eingesetzt werden kann.
  • Die NMR-Spektren der beiden Substanzen bestätigen die angenommenen Strukturen.
    • 2.3(N-Creatinyl)-buttersäure
  • 11,3 g (100 mMol) Creatinin werden in 150 ml DMF suspendiert und auf ca. 80-100°C erwärmt. Zu dieser Lösung werden unter Rühren langsam gleichzeitig 17,4 ml (120 mMol) Brombuttersäureäthylester und 16,5 ml (120 mMol) Triäthylamin getropft. Es wird dann noch 35 Stunden gerührt, wobei die Lösung fast klar wird. Die Lösung wird filtriert und das erhaltene Filtrat eingeengt. Danach wird der Rückstand in Wasser aufgenommen und mit Aktivkohle versetzt. Nach kurzem Aufkochen wird von der A-Kohle abfiltriert und erneut eingeengt. Der Rückstand wird getrocknet und anschließend aus Isopropanol umkristallisiert.
  • Fp:176-178°C; Ausbeute 10,5 g (35%).
  • Rf=0;75 (Propanol/Ammoniak/Wasser=5 : 3 : 1).
  • Die Substanz wird dabei als Hydrobromid erhalten. Der Ester wird sofort verseift, indem er in Wasser gelöst wird. Zu dieser Lösung wird bei 40-50° C unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf pH 10 1 n Natronlauge zugetropft. Wenn kein Abfall des pH-Wertes mehr eintritt, wird mit 1 n Salzsäure neutralisiert. Die Lösung wird dann zur Trockene eingeengt und mit Aceton aufgenommen. Es wird vom Ungelösten abfiltriert und erneut eingeengt. Dann wird aus Isopropanol umkristallisiert. Die Substanz liegt als Hydrochlorid vor.
  • Ausbeute: 5,1 g (65%).
  • Rf=0,66 (Methanol/Chloroform 1 : 1).
    • 3. Kupplung von Creatinyl-3-buttersäure an Rinderserumalbumin
  • Figure imgb0004
  • 3,6 g Rinderserumalbumin werden in 250 ml Wasser/Dioxan (1 : 1) angelöst, dazu werden 5,6 ml 1n NaOH gegeben, wobei Lösung eintritt. Anschließend wird auf 4° C gekühlt. Zu dieser Lösung wird eine Lösung von 1,7 g Creatinin-buttersäure, 1,7 ml Tributylamin und 0,95 ml Chlorameisensäureisobutylester in 60 ml Dioxan und 3 ml DMF getropft.
  • Der Ansatz wird 24 Stunden bei 4° C gerührt, dann gegen fließendes, entsalztes Wasser 36 Stunden lang dialysiert. Danach wird die Lösung lyophilisiert.
  • 4. Die Methode von 3. wird wiederholt, jedoch unter Verwendung der äquimolaren Menge von nach 1. erhaltener Creatinyl-methyl-benzoesäure. Man erhält so das entsprechende Konjugat mit Methyl- benzoesäure als Brückenglied zwischen Creatinin und Albumin.
    • B) Herstellung des Antiserums
  • Die Immunisierung der für die Antiserumgewinnung benutzten Tiere wird wie folgt durchgeführt:
    • Tierspecies: Schaf
    • Immunogen: Creatinin-3-p-Methylbenzoesäure-RSA (Konjugat)
    • Immunisierungsschema:
      Figure imgb0005
      1. Probeblutung: Tag 45
    C) Aufbereitung des Antiserums
  • Schaf-Antiserum bei Raumtemperatur mit 1% Aerosil® versetzen, ca. 2 h rühren, abzentrifugieren, Niederschlag verwerfen.
  • Zum Überstand langsam festes Ammonsulfat zusetzen bis auf 1,8 mol/I und mehrere Stunden bei 4°C rühren. Mischung abzentrifugieren, Überstand verwerfen. Niederschlag in 75% des Ausgangsvolumens aufnehmen (50 mmol K-P04 und 100 mMol/I Nacl mit 0,05% NaN3 pH 7,0), dann ca. 24 h gegen 0,15 Mol/l Nacl dialysieren, anschließend ggf. abzentrifugieren.
  • Die Lösung kann wie folgt weiterbehandelt werden:
    • a) Dialyse gegen 3 mMol/1 HCI, ca. 8 bis 10 h, dazwischen ein Wechsel der Dialysierlösung (1 : 100-Volumenverhältnis), Niederschlag abzentrifugieren und verwerfen. Dialyse der Lösung gegen 10 mMol/l P04 und 150 mMol/1 Nacl < 12 h, (Volumenverhältnis 1 : 100). Niederschlag abzentrifugieren.
      Alternative:
    • b) Dialyse gegen 1 ml Propionsäure/I, Dauer > 2 h, dann gegen 1 mMol/l HCI (Volumenverhältnis 1 : 100), Dauer > 2 h, Neutralisation mit NaHC03. Niederschlag abzentrifugieren und verwerfen.
    Beispiel 1 TINIA-Prinzip a) Reagentien
  • Es wird das Konjugat der Creatinin [3-p-methylbenzoesäure], hergestellt gemäß Beispiel A) mit Edestin und mit Rinderserumalbumin verwendet.
  • Das gemäß Beispiel B) gewonnene Antiserum wird gegen 1 Mol/1 Propionsäure, dann gegen 1 mMol/I HCI dialysiert, dann mit Bicarbonat neutralisiert. Alternativ kann gegen 3 mmol HCI/I, dann gegen ein Gemisch von 10 mMol/1 Phosphatpuffer und 150 mMol/l NaCI (pH =7) dialysiert werden. Der Niederschlag wird abzentrifugiert.
  • Die Antiserumverdünnung erfolgt mit TINAQUANT®-FN-Puffer (nach 15 min nach Verdünnung wird der Niederschlag ggf. nochmals abzentrifugiert).
  • Creatininlösungen:
    • Konzentrationen von 0,2 bis 100 mg/dl TINAQUANT®-FN-Puffer.
    b) Testansatz
  • In Kuevetten (d=1 1 cm) werden zu je 1 ml Anti-RSA-Creatinin-Antiserum bzw. Anti-Edestin-Creatinin-Antiserum vom Schaf (1 : 5 bis 1 : 50 mit TINAQUANT®-FN-Puffer verdünnt) 100 µl der Creatininlösung verschiedener Konzentrationen bzw. 100 µl Puffer (für den Leerwert) hinzupipettiert und 5 bis 15 Minuten bei 25° C inkubiert.
  • Dann werden jeweils 20 µl einer Lösung von 1 bis 3 mg HSA- oder RSA-Creatinin-Konjugat/ml TINAQUANT®-Puffer hinzugemischt und die Zunahme der Trübung photometrisch bei 336 nm nach Zugabe des HSA-Creatinin- bzw. RSA-Creatinin-Konjugats gemessen (Ei vor Start, E2 10 min nach Start). Figur 1 der Zeichnung zeigt eine so ermittelte Eichkurve, in der die Extinktionsdifferenz gegen die Creatininkonzentration aufgetragen ist.
    • Beispiel 2 ELISA-Prinzip (analog dem Verfahren von J. of Immunology, 123 (1979), 1548-1550) a) Verwendete Reagenzien
    • 1. BPBeschichtungspuffer
      • 0,2 Mol Na2C03/1, pH 9,3 bis 9,5
    • 2. IP Inkubationspuffer 0,05 mol Phosphat, pH 7,2 (28,5 ml KH2P04/71,5 ml K2HP04)
      • 0,1 mol NaCI/I, 5,85 g/I
      • 1% Glycin
      • 0,05% Tween 20
      • 0,02% NaN3
    • 3. WP Waschpuffer
      • 0,15 mol NaCl/l, 8,76 g/I
      • 0,05% Tween 20
      • 0.02% NaN3
    • 4. SP Substratpuffer
      • AP-Test
      • 1 Tabl./76 ml Puffer oder
      • 17 mg PNPP-Na2/10 ml Puffer aus 123 854
    b) Testansatz
  • Mikrotiterplatten werden mit 200µl Creatinin-HSA-Konjugat (50 µl/ml HSA/Leerwert 200 µl HSA (50 µl/ml) beschichtet bei Raumtemperatur ca. 16 h inkubiert und dann ausgesaugt. Dann werden 300 µl,lP zugegeben, inkubiert, nochmals ausgesaugt, danach 300 µl WP zugegeben und erneut ausgesaugt. Anschließend erfolgt die Beladung mit Creatinin-Antiserum. Hierzu werden 1000 µl Antiserum 1 : 200 bis 1 : 2000 in IP verdünnt, mit 10 µl Creatinin-Probe bzw. 10 µl lP (für den Leerwert) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann 200 µl der so erhaltenen Antiserumverdünnung auf die beschichteten Mikrotiterplatten gegeben, 60 Minuten verschlossen (Plastikbeutel), stehengelassen, ausgesaugt, 300 µl WP zugegeben und erneut ausgesaugt.
  • Zur Konjugatbeschichtung werden nunmehr 200 µl Kaninchen-Anti-Schaf-IgG-AP enthaltend 150 mU AP/ml (50 µl mit AP markiertem Antiantikörper (pro) 15 ml lP auf die behandelten Mikrotiterplatten gegeben, für 2 bis 3 h bei 37° C gehalten, dann ausgesaugt und mit 300 µl WP zweimal gewaschen. Zur Farbentwicklung werden 200 µl Substratpuffer (17 mg PNPP/10 ml Puffer) zugesetzt und die Mischung 30 bis 60 Minuten inkubiert. Die Auswertung erfolgt, indem man 150 µl Testlösung mit 500 µl NaOH, 0,1 mol/I bei 405 nm gegen Leerwert mißt. Fig. 2 der Zeichnung zeigt eine mit verschiedenen Creatinin-Konzentrationen erhaltene Eichkurve.
    • Beispiel 3
  • Zu 2,00 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) werden nacheinander hinzugemischt:
    • 0,002 ml Probe (oder H20 für den Leerwert)
    • 1,00 ml 7 x 10-3 Mol/l Oxalessigsäure in Pufferlösung (50 mMol/l Phosphat, pH 7,5)
    • 0,01 ml4 x 10-7 Mol/l CREATININ-RSA-Antiserum oder γ-Globulin (Bindungsstellenkonzentration)
    • 0,05 ml 1 x 10-8 Mol/I CREATININ-Malat-dehydrogenase-Konjugat in Pufferlösung
    • 0,040 ml 1,4 x 10-2 Mol/I NADH in Wasser.
  • Nach Zugabe der NADH-Lösung wird die Enzymaktivität (△E/min) spektrophotometrisch bei 340 nm und 30° C gemessen.
    • Beispiel 4
  • Es wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, vorgegangen, jedoch wird anstelle der Oxalessigsäure Glucose-6-phosphat in gleicher Menge und anstelle des CREATININ-MDH-Konjugats ein Konjugat aus Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und CREATININ eingesetzt sowie statt der NADH-Lösung eine NAD -Lösung.

Claims (22)

1. Creatinin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch mit Creatinin einen Hapten-Antikörper-Komplex bildet.
2. Verfahren zur Herstellung des Creatinin-Antikörpers nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Konjugat von Creatinin und einem zur Antiserumbildung geeigneten Protein, die über eine aliphatische oder araliphatische Carbonsäure als Brückenglied verbunden sind, als Immunogen zur Antiserumbildung verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Konjugat verwendet, bei dem die Carbonsäurebrücke mindestens 3 Kohlenstoffatome enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat als Brückenglied eine Alkyl(Ci -C4)-Phenyl-Carbonsäure oder ein Oligomeres davon enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat als Protein Serumalbumin oder Edestin enthält.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Konjugat zusammen mit Freund'schem Adjuvans zur Antiserumbildung appliziert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Reinigung aus dem gebildeten Antiserum die bis 1,8 mMol/I Ammoniumsulfat ausfallende Eiweißfraktion isoliert, dialysiert und gegebenenfalls durch Immunosorbtion an trägergebundenem Creatininkonjugat und Elution mit ungebundenem Creatinin einer Feinreinigung unterwirft.
8. Verwendung des Antikörpers von Anspruch 1 zur immunologischen Bestimmung von Creatinin, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper mit einer creatininhaltigen Probelösung inkubiert, mit einem Konjugat vom Creatinin mit einer Haptenträgersubstanz, umsetzt, wobei eine der Komponenten Antikörper und Konjugat in fester Phase oder gelöster Form, die andere Komponente in gelöster Form vorliegt, und die Hemmung der Bindungsreaktion zwischen dem Antikörper und dem Creatinin-Konjugat mißt.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper in Form eines Antiserums, einer daraus gewonnenen Immunglobulinfraktion oder als Antikörperfragment einsetzt.
10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hemmung der Bindungsreaktion durch Trübungsmessung der Immunpräzipitation in einem vorgegebenen Zeitintervall bestimmt.
11. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hemmung der Bindungsreaktion durch Rücktitration von nichtgebundenem Haptenträgersubstanz-Creatinin-Konjugat mit markierten Antikörpern und Messung des gebundenen oder des nichtgebundenen Anteils der markierten Substanz bestimmt.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man enzym- oder coenzymmarkierte Antikörper verwendet.
13. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man radioaktiv- oder fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Creatinin- Konjugat verwendet, dessen Haptenträgersubstanz mit der zur Gewinnung des Antikörpers als Haptenträgersubstanz verwendeten Materials nicht wesentlich kreuzreagiert.
15. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Creatinin-Konjugat verwendet, welches eine Haptenträgersubstanz enthält, die mit der zur Antikörpergewinnung verwendeten Haptenträgersubstanz kreuzreagiert, freie Haptenträgersubstanz mit der Antikörperlösung mischt, den dabei gebildeten Niederschlag abtrennt und den erhaltenen Überstand als Antikörperlösung in den Test einsetzt.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Schafantikörper verwendet.
17. Reagenz zur immunologischen Bestimmung von Creatinin, dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper gegen Creatinin gemäß Anspruch 1, ein Konjugat von Creatinin mit einer Haptenträgersubstanz und Puffersubstanz enthält.
18. Reagenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es Polyäthylenglykol enthält.
19. Reagenz nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper als Antiserum, Immunglobulinfraktion oder Antikörperfragmente vorliegen.
20. Reagenz nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper markiert sind.
21. Reagenz nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,5 bis 500 µg/ml Konjugat aus Creatinin und Serumalbumin im molaren Verhältnis Creatinin: Serumalbumin von 1 : 1 bis 1 30, Antikörper gegen Creatinin im Molverhältnis 0,1 bis 10, bezogen auf das Konjugat, 0,1 bis 8 Gew.-% Polyethylenglykol und Puffersubstanz der Ionenstärke 0,03 bis 0,4 pH 4 bis 10 enthält.
22. Reagenz nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es 10-4 bis 10-14 Mol/I Antikörper gegen Creatinin-Haptenträgerkonjugat, bezogen auf aktive Rezeptorstellen, 10-4 bis 10-14 Mol/I Creatinin-Malatdehydrogenase-Konjugat, 0,05 bis 50 mMol/I Oxalessigsäure, 5 bis 200 mMol/I Phosphatpuffer, pH 6 bis 8,5,0,05 bis 0,4 mMol/I NADH enthält.
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