EA046390B1 - Новый гибридный белок cbd-hs-es-glp1, рекомбинантная плазмида для его получения, продуцирующий его штамм-продуцент escherichia coli и способ получения полипептида glp-1 - Google Patents
Новый гибридный белок cbd-hs-es-glp1, рекомбинантная плазмида для его получения, продуцирующий его штамм-продуцент escherichia coli и способ получения полипептида glp-1 Download PDFInfo
- Publication number
- EA046390B1 EA046390B1 EA202291910 EA046390B1 EA 046390 B1 EA046390 B1 EA 046390B1 EA 202291910 EA202291910 EA 202291910 EA 046390 B1 EA046390 B1 EA 046390B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- glp1
- cbd
- polypeptide
- escherichia coli
- glp
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 107
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 105
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 50
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 16
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 title claims 5
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 57
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 37
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 37
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 30
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 29
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 24
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 21
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 21
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 21
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 19
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 18
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 15
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 15
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims description 14
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 14
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 14
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 claims description 12
- 108091033454 Hok/sok system Proteins 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 claims description 4
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091016366 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 claims description 3
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 claims 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 79
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 59
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 6
- 101100278012 Escherichia coli (strain K12) dnaG gene Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100165173 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) basS gene Proteins 0.000 description 6
- 101100421924 Thermus thermophilus (strain ATCC BAA-163 / DSM 7039 / HB27) spo0C gene Proteins 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 101150004979 flmA gene Proteins 0.000 description 6
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 6
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 6
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 6
- 101150048892 parB gene Proteins 0.000 description 6
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 4
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 3
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 3
- 101001012451 Homo sapiens Enteropeptidase Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101150033100 Mok gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 101150072105 hok gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000000859 incretin Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102100035043 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Human genes 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710129616 Protein glp-1 Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Description
Область техники настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности. Более конкретно, настоящее изобретение относится к гибридному белку CBD-HS-ES-GLP1, предназначенному для получения полипептида GLP-1, рекомбинантным плазмидам pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 для экспрессии указанного гибридного белка, штамму-продуценту BL21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1, продуцирующему указанный гибридный белок, а также способу получения полипептида GLP-1.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Полипептид GLP-1, имеющий последовательность SEQ ID NO 1, является одним из инкретинов, понижающих уровень глюкозы путём модуляции секреции инсулина бета-клетками печени [Baggio LL, Drucker DJ (2007) Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology 132:2131-2157]. GLP-1 и его аналоги используются для стимуляции секреции инсулина у больных инсулинонезависимым диабетом. Более того, GLP-1 и его аналоги ингибируют секрецию глюкагона, что приводит к значительному понижению уровня глюкозы в крови.
Известен способ получения полипептида GLP-1 с применением пептидного синтеза [СА 2778047, СО7К 14/605, опубл. 15.06.2000]. Данный метод обладает всеми недостатками, присущими химическому синтезу полипептидов. Выход продукта получается низким, что приводит к большим расходам на реагенты и большому количеству отходов. Метод является времязатратным, что также негативно сказывается на возможности его эффективного применения для крупномасштабного производства.
Более перспективно получение полипептида GLP-1 с применением технологии рекомбинантной ДНК. Так, известен метод получения глюкагоноподобных полипептидов с использованием конструкции, кодирующей слитый белок [US 7847063, C12N 15/8257, опубл. 08.02.2007]. Основным недостатком данного способа является применение бромциана, что делает его не подходящим для использования в качестве фармацевтического препарата в виду токсичности бромциана и сложности полной очистки продукта от примесей данного соединения.
Известен способ получения полипептида GLP-1 в виде слитого белка, содержащего аффинную метку [US 8796431, С12Р 21/06, опубл. 12.05.2011]. Несмотря на простоту процедуры очистки, достигающейся применением аффинной хроматографии, конечный выход продукта довольно низкий. Кроме того, на стадии расщепления слитого белка применяется кислотный гидролиз, который приводит к образованию большого количества побочных продуктов.
Известен метод получения полипептида GLP-1 в конструкции, содержащей несколько копий соответствующего гена [СА 3057252, СО7К 14/605, опубл. 27.09.2018]. Недостатком данного метода является применение сразу двух протеаз на этапе расщепления слитого белка, что удорожает процесс производства и усложняет дальнейшую очистку. Кроме того, в данном методе не предложен подход к очистке, которая в виду особенностей применяемой конструкции будет сложная и ресурсоёмкая.
Наиболее близким к описываемому изобретению является способ получения полипептида GLP-1 в слитом белке, содержащем интеиновую последовательность [WO 2018/136572, СО7К 14/605, опубл. 26.07.2018]. В этом методе применяется слитый белок, содержащий хитин-связывающий домен, интеин, спейсер, сайт распознавания TEV-протеиназы и полипептид GLP-1. Основным недостатком данного метода является применение интеиновой технологии, которая приводит к низкому выходу конечного белка. При этом используется также расщепление слитого белка TEV-протеиназой, что приводит к усложнению процесса и увеличению количества стадий производства. Ещё одним недостатком является отсутствие полноценной схемы очистки. В изобретении описана только стадия очистки слитого белка от белков клетки-продуцента.
Таким образом, техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, состояла в преодолении вышеуказанных недостатков существующих способов получения полипептида GLP-1, а именно в повышении эффективности и снижении трудоемкости и сложности способа получения полипептида GLP-1, в частности в повышении выхода полипептида GLP-1, по сравнению со способами, известными из уровня техники. Технический результат настоящего изобретения состоит в достижении повышенного выхода полипептида GLP-1, составляющего по меньшей мере 30% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата по меньшей мере 95%. Согласно одному конкретному варианту осуществления изобретения достигается чистота препарата, равная 99%. Согласно одному конкретному варианту осуществления изобретения достигается выход полипептида GLP-1, равный 35%. Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения достигается выход полипептида GLP-1, равный 40%.
Указанная техническая проблема решается настоящим изобретением посредством обеспечения нового гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, предназначенного для получения полипептида GLP-1, новой рекомбинантной плазмиды pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 для экспрессии указанного гибридного белка, нового высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента BL21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1, продуцирующего указанный гибридный белок, а также способа получения полипептида GLP-1, позволяющего получать полипептид GLP-1 с высоким выходом и высокой степенью чистоты.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к гибридному белку CBD-HS-ES-GLP1, предназначенному для
- 1 046390 получения полипептида GLP1, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и содержащему аминокислотную последовательность X1X2YX3, хитин-связывающий домен (CBD), специфический сайт узнавания энтеропептидазы (ES), гексагистидиновый домен (HS), полипептид GLP-1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где X1X2YX3 представляет собой аминокислотную последовательность, в которой X1 выбрана из группы, состоящей из A, R, N, D, С, Q, E, G, H, I, L, K, М, F, R, Р, О, S, U, Т, W, Y и V, Х2 выбрана из K или N и X3 отсутствует или выбрана из Н или Q.
Согласно одному из вариантов осуществления указанного гибридного белка аминокислотная последовательность X1X2YX3 представляет собой VKY.
Согласно одному варианту осуществления указанного гибридного белка аминокислотная последовательность X1X2YX3 представляет собой VNY.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантной плазмидной ДНК pET23b-CBD-HS-ESGLP1, предназначенной для экспрессии указанного гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, состоящей из следующих ключевых генетических элементов:
промотора Т7 и оператора lacO;
синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, кодирующей гибридный белок согласно настоящему изобретению CBD-HS-ES-GLP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;
гена устойчивости к антибиотику для проведения отбора рекомбинантных клеток;
ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori).
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения указанная рекомбинантная плазмидная ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 имеет длину 3953 п.о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор), и имеет расположение элементов, как показано на фиг. 1.
Согласно другому варианту осуществления указанная рекомбинантная плазмидная ДНК pET23bCBD-HS-ES-GLP1 имеет длину 3820 п.о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику канамицину (KanR), и имеет расположение элементов, как показано на фиг. 2. Согласно настоящему изобретению плазмидная ДНК согласно такому варианту осуществления также упоминается как pET23bKanR-CBD-HS-ES-GLP1.
Согласно другому варианту осуществления указанная рекомбинантная плазмидная ДНК pET23bCBD-HS-ES-GLP1 представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pET-parB-CBD-HS-ES-GLP1, имеет длину 4391 п. о., содержит модуль hok/sok, стабилизирующий плазмиды [Т, Gerdes K. Mechanism of post-segregational killing by the hok/sok system of plasmid R1. Sok antisense RNA regulates hok gene expression indirectly through the overlapping mok gene. J Mol Biol. 1992 Jan 5;223(1):41-54. doi: 10.1016/00222836(92)90714-u. PMID: 1370544], и имеет расположение элементов, как показано на фиг. 3.
Настоящее изобретение также относится к штамму Escherichia coli BL21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1, продуцирующему гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 (SEQ ID NO: 2), и содержащему указанную рекомбинантую плазмиду ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1.
Согласно другому варианту осуществления изобретения указанный штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 содержит рекомбинантую плазмиду ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1, которая имеет длину 3953 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор), а расположение ее генетических элементов показано на фиг. 1.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения указанный штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 содержит рекомбинантую плазмиду ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1, которая имеет длину 3820 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику канамицину (KanR), а расположение ее генетических элементов показано на фиг. 2. Согласно настоящему изобретению штамм Escherichia coli согласно такому варианту осуществления также упоминается как BL21(DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP1.
Согласно другому варианту осуществления указанная рекомбинантная плазмидная ДНК pET-parBCBD-HS-ES-GLP1 имеет длину 4391 п. о., содержит в модуль hok/sok, стабилизирующий плазмиды [Т, Gerdes K. Mechanism of post-segregational killing by the hok/sok system of plasmid R1. Sok antisense RNA regulates hok gene expression indirectly through the overlapping mok gene. J Mol Biol. 1992 Jan 5;223(1):4154. doi: 10.1016/0022-2836(92)90714-u. PMID: 1370544], и имеет расположение элементов, как показано на фиг. 3. Согласно настоящему изобретению штамм Escherichia coli согласно такому варианту осуществления также упоминается как BL21(DE3)/parB/CBD-HS-ES-GLP1. Согласно настоящему изобретению штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 получен путём трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазми-дой согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способу получения полипептида GLP1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, включающему стадии:
a) культивирования штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 согласно настоящему изобретению с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 согласно настоящему изобретению;
- 2 046390
b) выделения гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 согласно настоящему изобретению из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);
c) ферментативного расщепления гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, полученного на стадии b), с образованием полипептида GLP-1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1;
d) очистки полипептида GLP-1, полученного на стадии с).
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения на стадии b) осуществляют отделение клеток от культуральной жидкости, дезинтеграцию клеток, выделение тел включений из полученного дезинтеграта и солюбилизацию тел включения.
Согласно другому варианту осуществления на стадии b) при выделении тел включения из полученного дезинтеграта добавляют сульфат аммония
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 на стадии а) проводят в ростовой среде на протяжении по меньшей мере 7 ч.
Согласно другому варианту осуществления на стадии а) проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 осуществляют через 3 ч после начала культивирования при помощи изопропил-в-О-1-тиогалактоприанозида.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения на стадии с) расщепление гибридного белка осуществляют энтеропептидазой.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения на стадии d) очистку полипептида GLP-1 осуществляют с использованием одной стадии хроматографии.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения на стадии d) очистку полипептида GLP-1 осуществляют с использованием нескольких стадий хроматографии.
Согласно другому варианту осуществления на стадии d) очистку гибридного белка CBD-HS-ESGLP1 осуществляют хроматографически на металл-хелатном сорбенте.
Согласно другому варианту осуществления на стадии b) очистку гибридного белка CBD-HS-ESGLP1 осуществляют хроматографически на катионообменном сорбенте.
Согласно другому варианту осуществления на стадии b) очистку гибридного белка CBD-HS-ESGLP1 осуществляют хроматографически на хитиновом сорбенте.
Согласно другому варианту осуществления на стадии d) очистку полипептида GLP-1 осуществляют с использованием обращенно-фазовой хроматографии.
Согласно другому варианту осуществления на стадии d) очистку полипептида GLP-1 осуществляют с использованием гель-фильтрационной хроматографии.
Согласно другому варианту осуществления на стадии d) очистку полипептида GLP-1 осуществляют при помощи осаждения сульфатом аммония и экстракции примесей буферным раствором.
Согласно другому варианту осуществления на стадии d) очистку гибридного белка CBD-HS-ESGLP1 осуществляют хроматографически на хитиновом сорбенте.
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что полученные ими и обладающие уникальной новой структурой гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 и плазмидная ДНК pET23b-CBDHS-ES-GLP1 для экспрессии указанного гибридного белка обеспечивают достижение повышенного выхода полипептида GLP-1, составляющего по меньшей мере 30% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата по меньшей мере 95% в ходе разработанного авторами настоящего изобретения нового способа получения полипептида GLP1. Указанный технический результат полностью подтвержден Примерами, приведенными в настоящем документе ниже.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: Карта плазмиды, где приведенные обозначения имеют следующие значения: f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1, AmpR - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы), ori ориджин репликации colE1, T7 promoter - промотор бактериофага Т7, CBD-HS-ES-GLP1 - ген гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, включающий полипептид GLP-1, гексагистидиновую и хитин-связывающую последовательности, T7 terminator - терминатор бактериофага Т7.
Фиг. 2: Карта плазмиды, где приведенные обозначения имеют следующие значения: f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1, KanR - ген резистентности к канамицину (ген аминогликозидфосфотрансферазы), ori - ориджин репликации colE1, T7 promoter - промотор бактериофага Т7, CBD-HSES-GLP1 - ген гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, включающий полипептид GLP-1, гексагистидиновую и хитин-связывающую последовательности, T7 terminator - терминатор бактериофага Т7.
Фиг. 3: Карта плазмиды, где приведенные обозначения имеют следующие значения: f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1, KanR - ген резистентности к канамицину (ген аминогликозидфосфотрансферазы), ori - ориджин репликации colE1, T7 promoter -промотор бактериофага Т7, parB hok/sok локус, CBD-HS-ES-GLP1 - ген гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, включающий полипептид GLP-1, гексагистидиновую и хитин-связывающую последовательности, Т7 terminator - терминатор бактериофага Т7.
Фиг. 4: Электрофоретический анализ тотального клеточного лизата, где приведенные обозначения
- 3 046390 имеют следующие значения: 1 - в момент индукции, 2 - 2 ч после индукции, 3-4 ч после индукции, 4-5 ч после индукции, 5 - стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610.
Фиг. 5: Электрофоретический анализ гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, где приведенные обозначения имеют следующие значения: 1 - стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610, 2-3 - гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 до инкубирования с энтеропептидазой, 4-5 - реакционная смесь, содержащая полипептид GLP-1, получаемая после инкубирования с энтеропептидазой.
Фиг. 6: Хроматограмма, полученная в ходе хромато-масс-спектрометрического анализа полипептида GLP-1.
Фиг. 7: Масс-спектр, полученный в ходе хромато-масс-спектрометрического анализа полипептида GLP-1.
Фиг. 8: Электрофоретический анализ тотального клеточного лизата, где приведенные обозначения имеют следующие значения: 1- культура до индукции, 2 - в момент индукции, 3-4 ч после индукции, 4 стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat #26610
Фиг. 9: Электрофоретический анализ тотального клеточного лизата, где приведенные обозначения имеют следующие значения: 1 - стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610, 2 - 1 ч после индукции, 3 - 2 ч после индукции, 4 - 4 ч после индукции.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к гибридному белку CBD-HS-ES-GLP1 для получения полипептида GLP1, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, содержащему аминокислотную последовательность X1X2YX3, хитин-связывающий домен (CBD), специфический сайт узнавания энтеропептидазы (ES), гексагистидиновый домен (HS), полипептид GLP-1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где XiX2YX3 представляет собой аминокислотную последовательность, в которой X1 выбрана из группы, состоящей из A, R, N, D, С, Q, E, G, H, I, L, K, М, F, R, Р, О, S, U, T, W, Y и V, Х2 выбрана из K или N, и X3 отсутствует или выбрана из Н или Q.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантной плазмидной ДНК pET23b-CBD-HS-ESGLP1 для экспрессии указанного гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, состоящей из следующих ключевых генетических элементов:
промотора Т7 и оператора lacO;
синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, кодирующую гибридный белок согласно настоящему изобретению, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2;
гена устойчивости к антибиотику для проведения отбора рекомбинантных клеток;
ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori).
Согласно одному варианту осуществления указанная рекомбинантная плазмидная ДНК pET23bCBD-HS-ES-GLP1 имеет длину 3953 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику - ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор), а расположение ее генетических элементов показано на фиг. 1.
Согласно другому варианту осуществления указанная рекомбинантная плазмидная ДНК pET23bCBD-HS-ES-GLP1 имеет длину 3820 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику канамицину (KanR), а расположение ее генетических элементов показано на фиг. 2. Согласно настоящему изобретению плазмидная ДНК согласно такому варианту осуществления также упоминается как pET23bKanR-CBD-HS-ES-GLP1.
Согласно другому варианту осуществления указанная рекомбинантная плазмидная ДНК pET-parBCBD-HS-ES-GLP1 имеет длину 4391 п. о., содержит модуль hok/sok, стабилизирующий плазмиды, и имеет расположение элементов, как показано на фиг. 3. Согласно настоящему изобретению плазмидная ДНК согласно такому варианту осуществления также упоминается как pET-parB-CBD-HS-ES-GLP1.
Настоящее изобретение также относится к штамму Escherichia coli BL21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1, продуцирующему гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 (SEQ ID NO: 2), содержащему указанную рекомбинантную плазмиду ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения указанный штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 содержит рекомбинантую плазмиду ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1, которая имеет длину 3953 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику - ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор), а расположение указанных ее генетических элементов показано на фиг. 1.
Согласно одному варианту осуществления указанный штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/CBD-HSES-GLP1 содержит рекомбинантую плазмиду ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1, которая имеет длину 3820 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику канамицину (KanR), а расположение ее генетических элементов показано на фиг. 2. Согласно настоящему изобретению штамм Escherichia coli согласно такому варианту осуществления также упоминается как BL21 (DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP 1.
- 4 046390
Согласно одному варианту осуществления указанный штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/CBD-HSES-GLP1 содержит рекомбинантую плазмиду ДНК pET-parB-CBD-HS-ES-GLP1, которая имеет длину 4391 п. о., содержит модуль hok/sok, стабилизирующий плазмиды, а расположение ее генетических элементов показано на фиг. 3. Согласно настоящему изобретению штамм Escherichia coli согласно такому варианту осуществления также упоминается как BL21(DE3)/parB/CBD-HS-ES-GLP1.
Согласно настоящему изобретению штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 получен путём трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидой согласно настоящему изобретению.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения полипептида GLP-1 (SEQ ID NO 1), включающий стадии:
a) культивирования штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 по любому из пп.7-10 с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок CBDHS-ES-GLP1 согласно настоящему изобретению;
b) выделения гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 согласно настоящему изобретению из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);
c) ферментативного расщепления гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, полученного на стадии b), с образованием полипептида GLP-1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1;
d) очистки полипептида GLP-1, полученного на стадии с).
На стадии b) осуществляют отделение клеток от культуральной жидкости, дезинтеграцию клеток, выделение тел включений из полученного дезинтеграта, солюбилизацию тел включения.
Культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 в ростовой среде осуществляют на протяжении по меньшей мере 6 ч.
Индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ESGLP1 осуществляют через 2-5 ч после начала культивирования при помощи изопропил-в-Э-1тиогалактоприанозида.
Отделение культуральной жидкости от клеток осуществляют центрифугированием.
Дезинтеграцию клеток осуществляют при помощи ультразвукового дезинтегратора.
Выделение тел включения из дезинтеграта осуществляют центрифугированием.
Выделение гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 из полученных солюбилизированных тел включения осуществляют хроматографически на металл-хелатном, хитиновом или ионообменном сорбенте.
Определения и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше, а также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины включает и включающий интерпретируются как означающие включает, помимо всего прочего. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как состоит только из.
Как используется в настоящем документе, термин полипептид GLP-1 относится к пептиду, имеющему следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Термин энтеропептидаза в настоящем документе означает протеолитический фермент с шифром КФ 3.4.21.9, а также все его фрагменты и аналоги, обладающие специфической протеолитической активностью в отношении фрагментов аминокислотных последовательностей, включающих -Asp-Asp-AspAsp-Lys- (SEQ ID NO: 6) и -Asp-Asp-Asp-Asp-Arg- (SEQ ID NO: 4).
Варианты осуществления настоящего изобретения
Далее будут приведены варианты осуществления изобретения, путем приведения нескольких примеров. Каждый пример предоставлен посредством объяснения изобретения и не может являться ограничением изобретения. Фактически, специалистам в данной области техники будет понятно, что в изобретение могут быть внесены различные модификации и изменения без изменения объёма прав или сущности изобретения. Например, признаки, показанные или описанные как один вариант осуществления, могут быть использованы в другом варианте осуществления для получения ещё одного варианта осуществления.
Таким образом, предполагается, что модификации и изменения, подпадающие под объём прилагаемых пунктов формулы изобретения и их эквивалентов, охватываются настоящим изобретением. В случае предоставление диапазона параметров, предполагается, что в данный диапазон также включается каждая из конечных точек такого диапазона. Специалисту в данной области техники следует понимать, что настоящее исполнение представляет собой описание только приведённых в качестве примера вариантов осуществления и не предполагается в качестве ограничения более широких аспектов настоящего изобретения, более широкие аспекты которого являются осуществленными приведёнными в качестве примера схемами, конструкциями, техниками и процедурами.
- 5 046390
Создание экспрессионной плазмиды
Поставленная задача данного изобретения решается за счёт конструирования экспрессионной плазмиды pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 длиной 3953 п. о., обеспечивающую экспрессию гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 в клетках Escherichia Coli, трансформированных указанной плазмидой.
Указанная плазмида, далее обозначаемая как pET23b-CBD-HS-ES-GLP1, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с фиг. 1:
гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter);
ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
промотора Т7 и оператора lacO;
синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, кодирующей гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 (SEQ ID NO: 2), содержащий полипептид GLP-1 (SEQ ID NO: 1), сайт узнавания энтерокиназы SEQ ID NO: 4, лидерный полипептид (SEQ ID NO: 3), имеющий в составе гексагистидиновый участок HS и участок связывания хитина CBD.
В вышеуказанной плазмиде, строение которой раскрыто на фиг. 1 настоящего описания, ген AmpR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia Coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter) предназначен для его экспрессии.
Ориджин репликации бактериофага f1/Analysis of Genes and Genomes, John Wiley & Sons, 2004, S. 140/широко используется для создания экспрессионных векторов.
Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ ID NO: 5 является полипептид последовательности SEQ ID NO: 2, включающий лидерный полипептид SEQ ID NO: 3, имеющий в составе гексагистидиновый участок HS и участок связывания хитина CBD, сайт узнавания энтеропептидазы человека ES (SEQ ID NO: 4), полипептид GLP-1.
Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из указанных ключевых генетических элементов, представлена на фиг. 1.
Плазмиду согласно изобретению получают из плазмидного вектора рЕТ-23Ь, описанного в предшествующем уровне техники /https://www.merckmillipore.com/RU/ru/product/pET-23b+-DNANovagen,EMD_BIO-69746/. Для получения плазмиды по изобретению последовательность SEQ ID NO: 5, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор рЕТ-23Ь по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.
Также для целей настоящего изобретения для создания плазмиды, представленной на фиг. 1, могут использоваться и другие методы генной инженерии, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод создания плазмиды.
Создание экспрессионной плазмиды с геном устойчивости к канамицину Поставленная техническая проблема данного изобретения может быть решена также за счёт конструирования экспрессионной плазмиды pET23bKanR-CBD-HS-ES-GLP1 длиной 3820 п. о., обеспечивающую экспрессию гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 в клетках Escherichia Coli, трансформированных указанной плазмидой.
Указанная плазмида, далее обозначаемая как pET23bKanR-CBD-HS-ES-GLP1, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с фиг. 2:
гена устойчивости к антибиотику канамицину (KanR) и бактериального промотора гена устойчивости к канамицину;
ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
промотора Т7 и оператора lacO;
синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, кодирующей гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 (SEQ ID NO: 2), содержащий полипептид GLP-1 (SEQ ID NO: 1), сайт узнавания энтерокиназы SEQ ID NO: 4, лидерный полипептид (SEQ ID NO: 3), имеющий в составе гексагистидиновый участок HS и участок связывания хитина CBD.
В вышеуказанной плазмиде, строение которой раскрыто на фиг. 2 настоящего описания, ген KanR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia Coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к канамицину предназначен для его экспрессии.
Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ ID NO: 5 является полипептид последовательности SEQ ID NO: 2, включающий лидерный полипептид SEQ ID NO: 3, имеющий в составе гексагистидиновый участок HS и участок связывания хитина CBD, сайт узнавания энтеропептидазы человека ES (SEQ ID NO: 4), полипептид GLP-1.
Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из указанных ключевых генетических элементов, представлена на фиг. 2.
Плазмиду согласно изобретению получают из плазмидного вектора рЕТ-23й. В данном векторе ген устойчивости к антибиотику канамицину, известный из уровня техники /https://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetail.do?vectorid=319#:~:text=Name%3A,pET28a,pET28%2C%20pET%2D28a/ встраивают предпочтительно, но без ограничения, по сайтам рест
- 6 046390 рикции PciI и PsiI с получением плазмиды pET23b/KanR. Для получения плазмиды по изобретению последовательностью SEQ ID NO 5, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор pET-23b/KanR по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.
Также для целей настоящего изобретения для создания плазмиды, представленной на фиг. 2, могут использоваться и другие методы генной инженерии, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод создания плазмиды.
Создание экспрессионной плазмиды со стабилизирующим модулем hok/sok
Поставленная техническая проблема данного изобретения может быть решена также за счёт конструирования экспрессионной плазмиды pET-parB-CBD-HS-ES-GLP1 длиной 4391 п. о., обеспечивающую экспрессию гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 в клетках Escherichia Coli, трансформированных указанной плазмидой.
Указанная плазмида, далее обозначаемая как pET-parB-CBD-HS-ES-GLP1, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с фиг. 3:
гена устойчивости к антибиотику канамицину (KanR) и бактериального промотора гена устойчивости к канамицину;
ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
промотора Т7 и оператора lacO;
parB - hok/sok локуса;
синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, кодирующей гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 (SEQ ID NO: 2), содержащий полипептид GLP-1 (SEQ ID NO: 1), сайт узнавания энтерокиназы SEQ ID NO: 4, лидерный полипептид (SEQ ID NO: 3), имеющий в составе гексагистидиновый участок HS и участок связывания хитина CBD.
В вышеуказанной плазмиде, строение которой раскрыто на фиг. 3 настоящего описания, ген KanR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia Coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к канамицину предназначен для его экспрессии. hok/sok локус предназначен для повышения стабильности плазмиды, в том числе для выращивания клеток-продуцентов в большом объёме без использования антибиотика.
Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ ID NO: 5 является полипептид последовательности SEQ ID NO: 2, включающий лидерный полипептид SEQ ID NO: 3, имеющий в составе гексагистидиновый участок HS и участок связывания хитина CBD, сайт узнавания энтеропептидазы человека ES (SEQ ID NO: 4), полипептид GLP-1.
Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из указанных ключевых генетических элементов, представлена на фиг. 3.
Плазмиду согласно изобретению получают из плазмидного вектора рЕТ. В данном векторе ген устойчивости к антибиотику канамицину, известный из уровня техники, встраивают предпочтительно, но без ограничения, по сайтам рестрикции PciI и PsiI с получением плазмиды pET/KanR. Последовательность SEQ ID NO: 7, содержащую hok/sok локус, известный из уровня техники, встраивают предпочтительно, но без ограничения в плазмидный вектор pET/KanR по сайтам рестрикции PciI и XmaI с получением плазмиды рЕТ/parB. Для получения плазмиды по изобретению последовательностью SEQ ID NO: 5, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор рЕТ/parB по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.
Также для целей настоящего изобретения для создания плазмиды, представленной на фиг. 3, могут использоваться и другие методы генной инженерии, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод создания плазмиды.
Получение штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 Штамм BL21(DE3)/CBD-HSES-GLP1 получают трансформированием клеток Escherichia Coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидой pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 размером 3953 п. о., кодирующей гибридный белок SEQ ID NO: 2, состоящей из следующих ключевых генетических элементов:
гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter);
ориджина репликации бактериофага f1;
промотора Т7 и оператора lacO;
синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, кодирующей гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 (SEQ ID NO: 2), содержащий полипептид GLP-1 (SEQ ID NO: 1), сайт узнавания энтерокиназы SEQ ID NO: 4, лидерный полипептид (SEQ ID NO: 3), имеющий в составе гексагистидиновый участок HS и участок связывания хитина CBD.
Исходным материалом для создания штамма-продуцента по изобретению является известный из уровня техники штамм Е. Coli BL21 (DE3)/Haeyoung Jeong, Valerie Barbe, Choong Hoon Lee, David Valle
- 7 046390 net, Dong Su Yu, Sang-Haeng Choi, Arnaud Couloux, Seung-Won Lee, Sung Ho Yoon, Laurence Cattolico, Cheol-Goo Hur, Hong-Seog Park, Beatrice Segurens, Sun Chang Kim, Tae Kwang Oh, Richard E. Lenski, F. William Studier, Patrick Daegelen, Jihyun F. Kim, Genome Sequences of Escherichia coli В strains REL606 and BL21(DE3), Journal of Molecular Biology, Volume 394, Issue 4, 2009, 644-652/. Экспрессионной плазмидой длиной 3953 п. о., состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (д), расположенных друг относительно друга так, как представлено на фиг. 1, трансформируют клетки штамма E.Coli BL21 (DE3).
Предпочтительно (без ограничения), для введения указанной плазмиды в клетки штамма Е. Coli BL21 (DE3) используют метод электропорации, известный из уровня техники /Tamara Kleber-Janke, Wolf-Meinhard Becker, Use of Modified BL21(DE3) Escherichia coli Cells for High-Level Expression of Recombinant Peanut Allergens Affected by Poor Codon Usage, Protein Expression and Purification, Volume 19, Issue 3,2000, 419-424/ и включенный в настоящее описание посредством ссылки. Специалисту понятно, что в других воплощениях настоящего изобретения для введения плазмиды в клетки is. Coli BL21 (DE3) могут использоваться и другие методы трансформации, известные из уровня техники, например, метод с использованием полиэтиленгликоля, кальций-хлоридный метод. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки Е. Coli BL21 (DE3) плазмиды, представленной на фиг. 1, могут использоваться и другие методы трансформации, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансформации клеток.
Трансформированные клетки рассевают на чашки Петри с агаризованной средой с добавлением селекционного агента ампициллина до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл клетки. Из клонов, устойчивых к ампициллину, выделяют ДНК плазмиды pET23b-CBD-HS-ES-GLP1, которую анализируют путём секвенирования.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах; при росте на агаризованной среде LB (на 1 л 10 г пептон, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 20 г агара) - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие, серые, край ровный.
Физико-биологические признаки: клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения, включающие пептон, триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам: клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Получение штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP1 Штамм BL21(DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP1 получают трансформированием клеток Escherichia Coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидой pET23bKanR-CBD-HS-ES-GLP1 размером 3820 п. о., кодирующей гибридный белок SEQ ID NO 2, состоящей из следующих ключевых генетических элементов:
гена устойчивости к антибиотику канамицину (KanR) и бактериального промотора гена устойчивости к канамицину;
ориджина репликации бактериофага f1;
промотора Т7 и оператора lacO;
синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, кодирующей гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 (SEQ ID NO: 2), содержащий полипептид GLP-1 (SEQ ID NO 1), сайт узнавания энтерокиназы SEQ ID NO: 4, лидерный полипептид (SEQ ID NO: 3), имеющий в составе гексагистидиновый участок HS и участок связывания хитина CBD.
Исходным материалом для создания штамма-продуцента по изобретению является известный из уровня техники штамм Е. Coli BL21 (DE3). Экспрессионной плазмидой длиной 3820 п. о., состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (д), расположенных друг относительно друга так, как представлено на фиг. 2, трансформируют клетки штамма E.Coli BL21 (DE3).
Предпочтительно (без ограничения) для введения указанной плазмиды в клетки штамма Е. Coli BL21 (DE3) используют метод электропорации, известный из уровня техники и включенный в настоящее описание посредством ссылки. Специалисту понятно, что в других воплощениях настоящего изобретения для введения плазмиды в клетки Е. Coli BL21 (DE3) могут использоваться и другие методы трансформации, известные из уровня техники, например, метод с использованием полиэтиленгликоля, кальций-хлоридный метод. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки Е. Coli BL21 (DE3) плазмиды, представленной на фиг. 2, могут использоваться и другие методы трансформации, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансформации клеток.
- 8 046390
Трансформированные клетки рассевают на чашки Петри с агаризованной средой с добавлением селекционного агента ампициллина до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл клетки. Из клонов, устойчивых к ампициллину, выделяют ДНК плазмиды pET23bKanR-CBD-HS-ES-GLP1, которую анализируют путём секвенирования.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP1 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах.
При росте на агаризованной среде LB (на 1 л 10 г пептон, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 20 г агара) - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие, серые, край ровный.
Физико-биологические признаки: клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения, включающие пептон, триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам: клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 500 мкг/мл).
Получение, выделение и очистка гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1
Способ получения гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 включает культивирование клеток штаммапродуцента Escherichia coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1, полученной путём трансформации клеток Escherichia coli BL21 (DE3) раскрытой на фиг. 1 плазмидой длиной 3953 п. о., состоящей из указанных ключевых генетических элементов, на ростовой среде с получением культуральной жидкости, отделение биомассы клеток от культуральной жидкости, дезинтеграцию клеток, выделение тел включений из полученного дезинтеграта, солюбилизацию тел включения и выделение гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 из полученных солюбилизированных тел включения.
Другой способ получения гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 включает культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli BL21 (DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP1, полученной путём трансформации клеток Escherichia coli BL21 (DE3) раскрытой на фиг. 2 плазмидой длиной 3820 п. о., состоящей из указанных ключевых генетических элементов, на ростовой среде с получением культуральной жидкости, отделение биомассы клеток от культуральной жидкости, дезинтеграцию клеток, выделение тел включений из полученного дезинтеграта, солюбилизацию тел включения и выделение гибридного белка CBDHS-ES-GLP1 из полученных солюбилизированных тел включения.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1, в ростовой среде осуществляют на протяжении по меньшей мере 7 ч.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 осуществляют на 3 ч культивирования при помощи изопропил-в-О-1-тиогалактоприанозида.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, отделение культуральной жидкости от клеток осуществляют центрифугированием.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, дезинтеграцию клеток осуществляют при помощи ультразвукового дезинтегратора.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, выделение тел включения из дезинтеграта осуществляют центрифугированием.
В предпочтительном воплощении, однако также без ограничения, выделение гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 из полученных солюбилизированных тел включения осуществляют хроматографически. В более предпочтительных воплощениях, но без ограничения ими, выделение гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 из солюбилизированных тел включения осуществляют на металл-хелатном хроматографическом сорбенте.
Расщепление гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 в предпочтительном воплощении, однако также без ограничения, осуществляют при помощи энтеропептидазы, исходя из соотношения 1 ед. фермента на 1 мг гибридного белка.
Наконец, в предпочтительном воплощении, однако также без ограничения, дальнейшую очистку полипептида GLP-1, проводят при помощи хроматографических методов.
Осуществление заявляемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами, не ограничивающими объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-Н-ацил2'-дезоксинуклеозид-3'-О-(в-цианэтилдиизопропиламино)фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30
- 9 046390 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.
Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ23Ь (450 мкг, 150 пмоль) обрабатывают в 6 мл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (1000 ед. акт.), а затем - в 6 мл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (1000 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 30 мл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 7,5 мкл буфера NE.
Олигонуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 8 - SEQ ID NO: 145, кодирующие гибридный белок SEQ ID NO: 2, получают полным нуклеотидным синтезом в нескольких вариантах, где последовательность X1X2YX3 представляла собой: AKY, RKY, NKY, DKY, CKY, QKY, EKY, GKY, HKY, IKY, LKY, KKY, MKY, FKY, RKY, PKY, OKY, SKY, UKY, TKY, WKY, YKY, VKY, ANY, RNY, NNY, DNY, CNY, QNY, ENY, GNY, HNY, INY, LNY, KNY, MNY, FNY, RNY, PNY, ONY, SNY, UNY, TNY, WNY, YNY, VNY, AKYH, RKYH, NKYH, DKYH, CKYH, QKYH, EKYH, GKYH, HKYH, IKYH, LKYH, KKYH, MKYH, FKYH, RKYH, PKYH, OKYH, SKYH, UKYH, TKYH, WKYH, YKYH, VKYH, ANYH, RNYH,
NNYH, DNYH, CNYH, QNYH, ENYH, GNYH, HNYH, INYH, LNYH, KNYH, MNYH, FNYH, RNYH,
PNYH, ONYH, SNYH, UNYH, TNYH, WNYH, YNYH, VNYH, AKYQ, RKYQ, NKYQ, DKYQ, CKYQ, QKYQ, EKYQ, GKYQ, HKYQ, IKYQ, LKYQ, KKYQ, MKYQ, FKYQ, RKYQ, PKYQ, OKYQ, SKYQ,
UKYQ, TKYQ, WKYQ, YKYQ, VKYQ, ANYQ, RNYQ, NNYQ, DNYQ, CNYQ, QNYQ, ENYQ, GNYQ,
HNYQ, INY, LNYQ, KNYQ, MNYQ, FNYQ, RNYQ, PNYQ, ONYQ, SNYQ, UNYQ, TNYQ, WNYQ, YNYQ или VNYQ.
При этом получали следующие варианты гибридного белка, имеющего аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 146 - SEQ ID NO: 283
Полученные варианты синтетических последовательностей SEQ ID NO: 8 - SEQ ID NO: 145 по отдельности обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Синтетический фрагмент после электрофореза в 15 % агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Все описанные выше полученные синтетические фрагменты в количестве 2 пмоль прибавляют по отдельности к растворам 1 мкг, полученного из ДНК плазмиды рЕТ23Ь, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Помещают на лёд пробирки с компетентными клетками (XL1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчёта одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученную после обработки Т4ДНК-лигазой алкивоту реакционной смеси, аккуратно перемешивают содержимое лёгким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20-30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (42°С) на 30-45 с.
Быстро переносят пробирки из водяной бани в лёд и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объёмов предварительно подогретой до 37-42°С среды SOB или SOC (Becton Dickinson), перемешивают содержимое и инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин в орбитальном шейкере-инкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диаметром 60 мм (Перинт).
Аликвоты полученной плазмидных ДНК используют для трансформации компетентных клеток E.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pET23b-CBD-HS-ES-GLP1. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.
Пример 2. Получение штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 и характеристика его продуктивности
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 получают трансформацией компетентных клеток E.coli BL21 (DE3) плазмидой, получение которой описано в примере 1.
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой ампициллина до конечной концентрации ампициллина 100 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Ерленмейера (1 л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-в-О-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-в-О-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инку
- 10 046390 бируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Результаты представлены на фиг. 4, 4 - клеточный лизат, 5 - стандарты молекулярных масс. Выход полипептида GLP-1 по результатам денситометрического анализа составляет 35% относительно суммарного белка клетки.
Пример 3. Получение полипептида GLP-1
После окончания культивирования по примеру 2 клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе (Elma) в буферном растворе (50 мМ Трис/HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8). Добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 200 г, инкубируют в течение 1-2 ч и отделяют тела включения центрифугированием (15000 g, 45 мин). Тела включения экстрагируют в буфере (50 мМ Tris рН 11 8М Urea). Солюбилизированый белок наносят на металл-хелатный сорбент (Profinity IMAC, Ni-charged, Bio-Rad) и элюируют белок ступенью буферного раствора 0,250 М имидазол, 0,025 мМ Трис, 2 М мочевина, 0,1 M NaCl, рН8.
Элюат концентрируют на ультрафильтрационной мембране 3 кДа и добавляют энтеропептидазу, исходя из соотношения 1 ед. фермента на 1 мг гибридного белка, тем самым инициируя расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течение 14-19 ч. Из полученной смеси отбирают пробу в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим инкубируют 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Результаты представлены на фиг. 5. 1 - стандарты молекулярных масс, 2-3 - до инкубирования, 4-5 - после инкубирования. После инкубирования при 22°С в течение 13-19 ч доводят рН раствора соляной кислотой до 3.0 и центрифугируют. Дальнейшую очистку и анализ полипептида GLP-1 проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. Подлинность полученного полипептида GLP-1 подтверждали методом ВЭЖХ МС. Проводили хроматографическое разделение на колонке Phenomenex Aeris PEPTIDE 1.7u XB-C18150*2.1 mm с использованием хроматографической системы Accela UPLC (Thermo) в режиме градиентного элюирования (линейный градиент концентрации ацетонитрила 5-55%). Для масс-спектрометрического анализа использовали сопряжённый детектор типа ионная ловушка LCQ Deca XP Plus (Thermo Finnigan) в режиме электрораспылительной ионизации. Детектирование производили в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне масс 200-2000 Да. На фиг. 6 и 7 представлен результат хромато-массспектрометрического анализа полипептида GLP-1. Чистота препарата составляет 99% согласно хроматограмме на фиг. 6.
Пример 4. Конструирование экспрессионной плазмиды с геном устойчивости к канамицину
Полученные в примере 1 варианты ДНК плазмиды pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 в количестве 3 мкг (1 пмоль) каждая по отдельности обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой PsiI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой PciI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторные фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
ДНК плазмиды рЕТ28а (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 6 мл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой PsiI (1000 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой PciI (1000 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 3 мл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 7,5 мл буфера NE.
Описанный выше полученный фрагмент плазмиды рЕТ28а в количестве 2 пмоль прибавляют по отдельности к растворам 1 мкг, полученных из ДНК плазмиды рЕТ23b-CBD-HS-ES-GLP1, описанных выше векторных фрагментов в 10 мкл буфера (20 мМ трис-НС1, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Помещают на лёд пробирки с компетентными клетками (XL1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчёта одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученную после обработки Т4ДНК-лигазой алкивоту реакционной смеси, аккуратно перемешивают содержимое лёгким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20-30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (42°С) на 30-45 с. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лёд и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объёмов предварительно подогретой до 37-42°С среды SOB или SOC (Becton Dickinson), перемешивают содержимое и инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин в орбитальном шейкереинкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диамтером 60 мм (Перинт).
Аликвоту полученных плазмидных ДНК используют для трансформации компетентных клеток E.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды
- 11 046390 pET23bKanR-CBD-HS-ES-GLP1. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.
Пример 5. Получение штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP1 и характеристика его продуктивности
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP1 получают трансформацией компетентных клеток E.coli BL21 (DE3) плазмидой, получение которой описано в примере 4.
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/KanR/CBD-HS-ES-GLP1 культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой канамицина сульфата до конечной концентрации добавкой канамицина сульфата 50 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Ерлен-мейера (1 л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-в-О-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-в-Э-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инкубируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Результаты представлены на фиг. 8. 4 - клеточный лизат, 5 стандарты молекулярных масс. Выход полипептида GLP-1 по результатам денситометрическо-го анализа составляет 35% относительно суммарного белка клетки.
Пример 6. Конструирование экспрессионной плазмиды с модулем повышения стабильности генетической конструкции
Полученные в примере 4 варианты ДНК плазмиды pET23b-KanR-CBD-HS-ES-GLP1 в количестве 3 мкг (1 пмоль) каждая по отдельности обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XmaI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой PciI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторные фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Синтетическую последовательность SEQ ID NO 7 (60 пмоль) обрабатывают в 6 мл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XmaI (1000 ед. акт.), а затем - в 6 мл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой PciI (1000 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 3 мл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE. Описанный выше полученный фрагмент синтетической последовательности SEQ ID NO 145 в количестве 2 пмоль прибавляют по отдельности к растворам 1 мкг, полученных из ДНК плазми-ды pET23b-KanR-CBD-HSES-GLP1, описанных выше векторных фрагментов в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и ли-гируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Помещают на лёд пробирки с компетентными клетками (XL1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчёта одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученную после обработки Т4ДНК-лигазой алкивоту реакционной смеси, аккуратно перемешивают содержимое лёгким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20-30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (42°С) на 30-45 с. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лёд и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объёмов предварительно подогретой до 37-42°С среды SOB или SOC (Becton Dickinson), перемешивают содержимое и инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин в орбитальном шейкереинкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диамтером 60 мм (Перинт).
Аликвоту полученных плазмидных ДНК используют для трансформации компетентных клеток E.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pET-parB-CBD-HS-ES-GLP1. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.
Пример 7. Получение штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/parB-CBD-HS-ES-GLP1 и характеристика его продуктивности
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/parB-CBD-HS-ES-GLP1 получают трансформацией компетентных клеток E.coli BL21 (DE3) плазмидой, получение которой описано в примере 6.
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/parB-CBD-HS-ES-GLP1 культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой канамицина сульфата до конечной концентрации добавкой канамицина сульфата 50 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Ерлен-Мейера (1 л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культураль
-
Claims (13)
- ной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-в-О-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-в-Э-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инкубируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Результаты представлены на фиг. 9. 4 - клеточный лизат, 5 стандарты молекулярных масс. Выход полипептида GLP-1, по результатам денситометрического анализа составляет 40% относительно суммарного белка клетки.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1, предназначенный для получения полипептида GLP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, содержащий аминокислотную последовательность X1X2YX3, хитин-связывающий домен (CBD), специфический сайт узнавания энтеропептидазы (ES), гексагистидиновый домен (HS), полипептид GLP-1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где X1X2YX3 представляет собой аминокислотную последовательность, в которой X1 выбрана из группы, состоящей из A, R, N, D, С, Q, E, G, H, I, L, K, М, F, R, Р, О, S, U, T, W, Y и V, Х2 выбрана из K или N, и X3 отсутствует или выбрана из Н или Q.
- 2. Гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность X1X2YX3 представляет собой VKY.
- 3. Гибридный белок CBD-HS-ES-GLP1 по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность X1X2YX3 представляет собой VNY.
- 4. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 для экспрессии гибридного белка по п.1, состоящая из следующих ключевых генетических элементов:промотора Т7 и оператора lacO;синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, кодирующей гибридный белок по п.1;гена устойчивости к антибиотику для проведения отбора рекомбинантных клеток;ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori).
- 5. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 по п.4, отличающаяся тем, что имеет длину 3953 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) и имеет расположение элементов, как показано на фиг. 1.
- 6. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 по п.4, отличающаяся тем, что имеет длину 3820 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику канамицину (KanR) и имеет расположение элементов, как показано на фиг. 2.
- 7. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 по п.4, которая представляет собой рекомбинантную плазмиду pET-parB-CBD-HS-ES-GLP1, отличающаяся тем, что имеет длину 4391 п. о., содержит в качестве гена устойчивости к антибиотику ген устойчивости к антибиотику канамицину (KanR), дополнительно содержит hok/sok локус, стабилизирующий плазмиды, и имеет расположение элементов, как показано на фиг. 3.
- 8. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1, продуцирующий гибридный белок по п.1, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 по п.4.
- 9. Штамм Escherichia coli по п.8, отличающийся тем, что получен путём трансформации клеток штамма Escherichia coli В 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 по п.5.
- 10. Штамм Escherichia coli по п.8, отличающийся тем, что получен путём трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 по п.6.
- 11. Штамм Escherichia coli по п.8, отличающийся тем, что получен путём трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET23b-CBD-HS-ES-GLP1 по п.7.
- 12. Способ получения полипептида GLP1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, включающий стадии:a) культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/CBD-HS-ES-GLP1 по любому из пп.8-11 с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок CBDHS-ES-GLP1 по п.1;b) выделение гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1 по п.1 из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);c) ферментативное расщепление гибридного белка CBD-HS-ES-GLP1, полученного на стадии b), с образованием полипептида GLP-1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1;d) очистка полипептида GLP-1, полученного на стадии с).
- 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что на стадии b) осуществляют отделение клеток от культу-
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2023/000203 WO2024010489A2 (en) | 2022-07-08 | 2023-07-06 | New hybrid protein cbd-hs-es-glp1, recombinant plasmid for its production, escherichia coli producer strain and method of producing glp-1 polypeptide |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046390B1 true EA046390B1 (ru) | 2024-03-07 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1874932B1 (en) | Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein | |
| Yang et al. | Native chemical ubiquitination using a genetically incorporated azidonorleucine | |
| CN107245494A (zh) | Aβ42在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化方法 | |
| US20160304571A1 (en) | Synthesis of Site Specifically-Linked Ubiquitin | |
| EP4328316A1 (en) | Preparation method for polypeptide | |
| US8080387B2 (en) | Method for preparing soluble and active recombinant proteins usins PDI as a fusion partner | |
| KR20030031993A (ko) | 무세포 단백질 합성용 전사주형의 설계와 구축 및 이를이용하는 희석회분식 밀배아 무세포 단백질 합성방법 | |
| WO2010062279A1 (ru) | Способ получения рекомбинантного инсулина человека | |
| WO2018090288A1 (zh) | 一种高效合成α-氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用 | |
| CN103820410B (zh) | 3-甲硫酪氨酸翻译系统及其应用 | |
| CN113354745B (zh) | 一种组合物及规模化生产成纤维细胞生长因子的方法 | |
| US5795767A (en) | Epimerase | |
| EA046390B1 (ru) | Новый гибридный белок cbd-hs-es-glp1, рекомбинантная плазмида для его получения, продуцирующий его штамм-продуцент escherichia coli и способ получения полипептида glp-1 | |
| CN114933658B (zh) | 一种短肽元件及其应用方法 | |
| CN110982808A (zh) | Kex2酶的变体及稳定表达的方法 | |
| WO2024144431A1 (ru) | Новый штамм-продуцент escherichia coli, продуцирующий гибридный белок cbd-hs-es-glp1, и способ получения полипептида glp-1 | |
| WO2024010489A2 (en) | New hybrid protein cbd-hs-es-glp1, recombinant plasmid for its production, escherichia coli producer strain and method of producing glp-1 polypeptide | |
| JPWO2002008443A1 (ja) | コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いるタンパク質の一般的標識手段 | |
| RU2447149C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pMSIN4, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД - ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ BL21(DE3)/pMSIN4-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| CN111019927B (zh) | 用于表达tev蛋白的重组质粒、重组工程菌，以及制备和纯化tev蛋白的方法 | |
| CN110577958B (zh) | 核酸、重组质粒、转化株、乙酰胆碱酯酶及其制备方法 | |
| ES2338074T3 (es) | Microorganismo, enzima lactamasa obtemida a partir del mismo, y su uso. | |
| CN113621629A (zh) | 一种基于丙二酰辅酶a再生的柚皮素体外酶促合成方法 | |
| US20180118800A1 (en) | Method of preparing glucagon-like peptide-2 (glp-2) analog | |
| RU2798545C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pSMT3_HCRG21, кодирующая гибридный белок SMT3-HCRG21, штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 - продуцент анальгетического пептида HCRG21 и способ получения рекомбинантного анальгетического пептида HCRG21 |