EA044700B1 - Рекомбинантный человеческий коллаген и способ его конструирования - Google Patents
Рекомбинантный человеческий коллаген и способ его конструирования Download PDFInfo
- Publication number
- EA044700B1 EA044700B1 EA202292048 EA044700B1 EA 044700 B1 EA044700 B1 EA 044700B1 EA 202292048 EA202292048 EA 202292048 EA 044700 B1 EA044700 B1 EA 044700B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- human collagen
- recombinant human
- collagen
- amino acids
- protein
- Prior art date
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims description 93
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims description 93
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 49
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 19
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001788 irregular Effects 0.000 claims description 4
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- -1 hexafluorophosphate Chemical compound 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241001673391 Entandrophragma candollei Species 0.000 description 1
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CAVKXZMMDNOZJU-UHFFFAOYSA-N Gly-Pro-Ala-Gly-Pro Natural products C1CCC(C(O)=O)N1C(=O)CNC(=O)C(C)NC(=O)C1CCCN1C(=O)CN CAVKXZMMDNOZJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000001160 methoxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N o-biphenylenemethane Natural products C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3C2=C1 NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000002407 tissue scaffold Substances 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантному человеческому коллагену и способу его конструирования.
Уровень техники
Коллаген является наиболее распространенным белком у млекопитающих, на его долю приходится около 30% общего белка. Он широко присутствует в коже животных, хрящах, кровеносных сосудах, а также других тканях и органах, участвует в росте, развитии, дифференцировке клеток, адгезии, реакции связывания антиген-антитело и других важных жизненных процессах организмов. На сегодняшний день у позвоночных и высших беспозвоночных обнаружено 28 различных типов коллагена. Среди этих типов коллагена коллаген типа I является наиболее распространенным у позвоночных. Он соединяется с другими молекулами в разных пропорциях, образуя различные тканевые каркасы, такие как базальная мембрана, связки, сухожилия, кожа и кровеносные сосуды, что придает им высокую механическую прочность.
Наиболее типичная структура коллагена представляет собой волокнистый белок, образованный намоткой пептидных цепей с трехцепочечной спиральной структурой. Упорядоченная агрегация трехнитевых спиральных молекул делает его молекулярную структуру очень стабильной, а волокна обладают хорошей ударной вязкостью. В то же время эта спиральная структура из трех нитей может улучшить механическую прочность коллагена. Расположение аминокислот в первичной структуре коллагена соответствует периодическому закону глицин-X-Y (где X, Y - любая аминокислота, кроме глицина).
Коллаген широко используется в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности из-за его превосходных биологических характеристик, таких как низкая иммуногенность, хорошая биосовместимость и биоразлагаемость. В последние годы коллаген широко используется в медицине в виде мембран, губок, инъекций, эмболии и других аспектов косметологии, ортопедии, восстановлении после ожогов, травм, восстановления твердых тканей и так далее. Однако природный коллаген нерастворим в воде, а свойства коллагена, выделенного из животных, неодинаковы, что затрудняет дальнейшую переработку. На данный момент коллаген в основном извлекают из соединительной ткани животных, такой как кожа свиньи, воловья кожа или кожа рыбы, кислотным методом, щелочным методом и различными методами ферментативного гидролиза. Тем не менее, коллаген из животных имеет много скрытых опасностей вируса, и он будет вызывать реакцию отторжения при воздействии на организм человека; вовторых, коллаген, синтезированный химическими методами, не может не потерять свою биологическую активность, а технология сложна, методы экстракции не являются экологически чистыми, а стоимость высока, поэтому применение коллагена во многих областях, например, в медицине, сильно ограничено.
С бурным развитием современной молекулярной биологии люди стали обращать внимание на использование технологий генной инженерии для получения рекомбинантного человеческого коллагена с использованием различных клеток-хозяев, таких как насекомые, трансгенные мыши, кишечная палочка и так далее. Например, Фан Дайди из Северо-Западного университета и другие исследователи использовали культуру ферментации кишечной палочки высокой плотности для производства человеческого коллагена, однако экспрессия белка составляла менее 30%, а бактериальная система экспрессии имела проблемы с биобезопасностью, например, из-за наличия эндотоксина и пирогена, а белок, полученный при экспрессии, часто существует в виде телец включения, которые трудно очистить, поэтому продукт не является чистым и поэтому его трудно применять в клинической практике. Поэтому в настоящее время все больше и больше ученых начинают использовать инженерные бактерии пичиа пасторис для ферментации и культивирования рекомбинантного человеческого коллагена. Хотя он имеет преимущества отсутствия источника тепла и внеклеточной секреции продуктов, он также имеет много недостатков, таких как длительный цикл ферментации, низкая эффективность производства и низкая степень чистоты. Поэтому в технической области получения рекомбинантного человеческого коллагена необходимо срочно разработать метод с высокой степенью чистоты, высоким уровнем безопасности, высоким выходом, коротким циклом, высокой гидрофильностью и простым массовым производством; более того, для лучшего клинического применения, во избежание отторжения человеческим организмом необходимо разработать низкоиммуногенный рекомбинантный человеческий коллаген.
Суть изобретения
Техническая задача, решаемая настоящим изобретением, заключается в том, чтобы предложить рекомбинантный человеческий коллаген и способ его конструирования с учетом недостатков вышеупомянутого предшествующего уровня техники. Рекомбинантный человеческий коллаген имеет короткий пептидный сегмент, может быть синтезирован напрямую, подходит для крупномасштабного производства, прост в использовании, имеет хорошую растворимость в воде и не содержит антигенных детерминант.
Для решения вышеупомянутых технических проблем техническое решение, принятое в настоящем изобретении, следующее.
В первом аспекте мы предлагается рекомбинантный человеческий коллаген с аминокислотной последовательностью код посл. № 1, которая выглядит следующим образом:
GPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFP.
Среди них структура рекомбинантного человеческого коллагена представляет собой одноцепочеч- 1 044700 ную односпиральную структуру, демонстрирующую характеристики последовательности коллагена глицин-X-Y (где X и Y - любые аминокислоты, кроме глицина), общая длина составляет 30 аминокислот, которые представляют собой пептиды коллагена I типа человека.
При этом молекулярная масса рекомбинантного человеческого коллагена составляет 2526,71 Да, а теоретическая изоэлектрическая точка - 5,84.
При этом рекомбинантный человеческий коллаген не имеет сигнального пептида и трансмембранного домена и является водорастворимым.
При этом рекомбинантный человеческий коллаген был проанализирован с помощью инструмента прогнозирования антигенных эпитопов Прогнозируемые антигенные пептиды, и антигенные детерминанты не были обнаружены.
При этом рекомбинантный человеческий коллаген с наибольшей вероятностью образует неправильную извилистую структуру (беспорядочный клубок) при оперативном анализе с помощью SOPMA.
При этом рекомбинантный человеческий коллаген является новым белком без субклеточной локализации.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ конструирования рекомбинантного человеческого коллагена, включающий:
этап (1) получить последовательность белка человеческого коллагена типа I в базе данных NCBI;
этап (2) анализ антигенных детерминант белка человеческого коллагена типа I с помощью онлайнинструмента прогнозирования антигенных эпитопов. Прогнозируемые антигенные пептиды и выполнение скрининга для получения областей с низким уровнем антигенной детерминанты;
этап (3) с помощью онлайн-прогнозирования антигенных детерминантов BitGene выбирается область с низким уровнем антигенных детерминантов (в сочетании с пятью алгоритмами антигенности, гидрофильности, гибкости, доступности поверхности и предсказания β-поворота), и определяется аминокислотная последовательность синтезируемого рекомбинантного человеческого коллагена.
Кроме того, он также включает этап (4), подтверждающий иммуногенность синтезируемого рекомбинантного человеческого коллагена с помощью онлайн-инструмента прогнозирования антигенных детерминант прогнозируемые антигенные пептиды.
Последовательность белка человеческого коллагена типа I, полученная из базы данных NCBI, как описано на этапе (1) выше, выглядит следующим образом:
выполнить поиск человек и коллаген типа I в базе данных Ген NCBI и загрузить последовательность белка человеческого коллагена типа I NP_000079.2, длина которой составляет 1464 аминокислоты.
Процесс получения области с низким уровнем антигенной детерминанты, описанный на вышеприведенном этапе (2), выглядит следующим образом:
вышеупомянутый белок человеческого коллагена I типа человека длиной 1464 аминокислоты использовали для анализа его антигенных детерминант с помощью онлайн-инструмента прогнозирования антигенных детерминант прогнозируемые антигенные пептиды (URL:http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl), отобрали 171 аминокислоту в области низкой антигенной детерминанты 230-400.
Процесс определения синтезируемого рекомбинантного человеческого коллагена на этапе (3) выше, выглядит следующим образом:
используют выбранный выше человеческий коллаген длиной 171 аминокислоты, анализ проводят с использованием BitGene с пятью стандартными методами онлайн-антигенности Антигенность Коласкара и Тонгаонкара, гидрофильности Гидрофильность Паркера, гибкость Гибкость Карплюса и Шульца, доступности Доступность поверхности Эмини, β-поворота Бета-поворот Чоу и Фасмана прогнозирования антигенных эпитопов.
Выбирают с низким уровнем антигенных детерминант, высокой гидрофильностью в сочетании с характеристиками последовательности коллагена, то есть демонстрирующие правило расположения глицин-X-Y (где X, Y представляет собой любую аминокислоту, кроме глицина), предпочтительно получить низкоиммуногенные, гидрофильные рекомбинантные последовательности человеческого коллагена.
Согласно настоящему изобретению сегмент рекомбинантного пептида коллагена человека является коротким, может быть синтезирован напрямую, имеет высокий выход, короткий цикл, высокую степень чистоты, не содержит скрытой вирусной опасности и является водорастворимым.
Кроме того, последовательность рекомбинантной ДНК (КОД ПОСЛ. №2) для получения рекомбинантного человеческого коллагена также представлена следующим образом:
GGCCCTGCTGGTGCTCGTGGAAATGATGGTGCTACTGGTGCTGCCGG
GCCCCCTGGTCCCACCGGCCCCGCTGGTCCTCCTGGCTTCCCT.
По сравнению с предшествующим уровнем техники рекомбинантный человеческий коллаген и способ его конструирования, предусмотренные изобретением, имеют следующие преимущества.
1. Пептидный сегмент рекомбинантного человеческого коллагена по изобретению является коротким и имеет длину всего 30 аминокислот. Он может быть синтезирован напрямую компанией без прока-
- 2 044700 риотической или эукариотической экспрессии. Он прост в использовании и позволяет легко получать большое количество белков; кроме того, нет скрытой опасности вируса, а степень чистоты, определяемая с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, достигает 95% и более.
2. Согласно настоящему изобретению рекомбинантный человеческий коллаген обладает низкой иммуногенностью и является водорастворимым. Его аминокислотный состав такой же, как и соответствующая часть аминокислотной последовательности природного коллагена. Он не вызывает иммунного отторжения при использовании в организме человека и может широко применяться в клинической практике.
Описание прилагаемых чертежей
Фиг. 1 представляет собой диаграмму анализа сигнальных пептидов рекомбинантного человеческого коллагена в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
фиг. 2 представляет собой диаграмму анализа трансмембранного домена рекомбинантного человеческого коллагена в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
фиг. 3 представляет собой диаграмму анализа гидрофильности рекомбинантного человеческого коллагена в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
фиг. 4 представляет собой диаграмму структурного анализа рекомбинантного человеческого коллагена в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
фиг. 5 представляет собой карту прогнозирования антигенной детерминанты рекомбинантного человеческого коллагена в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
фиг. 6 представляет собой схему локализации клеток рекомбинантного человеческого коллагена в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
фиг. 7 представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматограмму рекомбинантного коллагена человека в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
Конкретные варианты осуществления
Изобретение более подробно описано ниже в сочетании с прилагаемыми чертежами и вариантами осуществления.
Пример 1.
Способ конструирования рекомбинантного человеческого коллагена, включающий:
(1) получить последовательность белка человеческого коллагена типа I в базе данных NCBI;
(2) анализ антигенных детерминант белка человеческого коллагена типа I с помощью онлайнинструмента прогнозирования антигенных эпитопов Прогнозируемые антигенные пептиды и выполнение скрининга для получения областей с низким уровнем антигенной детерминанты;
(3) с помощью онлайн-прогнозирования антигенных детерминантов BitGene выбирается область с низким уровнем антигенных детерминантов (в сочетании с пятью алгоритмами антигенности, гидрофильности, гибкости, доступности поверхности и предсказания β-поворота), и определяется аминокислотная последовательность синтезируемого рекомбинантного человеческого коллагена;
(4) подтверждение иммуногенности синтезируемого рекомбинантного человеческого коллагена с помощью онлайн-инструмента прогнозирования антигенных детерминант прогнозируемые антигенные пептиды.
Последовательность белка человеческого коллагена типа I, полученная из базы данных NCBI, как описано на этапе (1) выше, выглядит следующим образом:
выполнить поиск человек и коллаген типа I в базе данных Ген NCBI и загрузить последовательность белка человеческого коллагена типа I NP_000079.2, длина которой составляет 1464 аминокислоты.
Процесс получения области с низким уровнем антигенной детерминанты, описанный на вышеприведенном этапе (2), выглядит следующим образом:
вышеупомянутый белок человеческого коллагена I типа человека длиной 1464 аминокислоты использовали для анализа его антигенных детерминант с помощью онлайн-инструмента прогнозирования антигенных детерминант.
Прогнозируемые антигенные пептиды (URL:http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl), отобрали 171 аминокислоту в области низкой антигенной детерминанты 230-400.
Процесс определения синтезируемого рекомбинантного человеческого коллагена на этапе (3) выше, выглядит следующим образом:
используют выбранный выше человеческий коллаген длиной 171 аминокислоты, анализ проводят с использованием BitGene с пятью стандартными методами онлайн-антигенности Антигенность Коласкара и Тонгаонкара, гидрофильности Гидрофильность Паркера, гибкость Гибкость Карплюса, доступности Доступность поверхности Эмини, β-поворота Бета-поворот Чоу и Фасмана прогнозирования антигенных эпитопов.
Выбирают с низким уровнем антигенных детерминант, высокой гидрофильностью в сочетании с характеристиками последовательности коллагена, то есть демонстрирующие правило расположения глицин-X-Y (где X, Y представляет собой любую аминокислоту, кроме глицина), предпочтительно получить низкоиммуногенные, гидрофильные рекомбинантные последовательности человеческого колла- 3 044700 гена (код посл. № 1), например:
GPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFP.
Пример 2. Способ синтеза рекомбинантного человеческого коллагена.
Способ синтеза рекомбинантного человеческого коллагена, включающий следующие стадии.
1. Набухание твердой смолы дихлорметаном в течение 15 мин, удаление раствора, удаление флуоренового метоксикарбонила 20% раствором пиперидина/диметилформамида в течение 15 мин, промывание диметилформамидом 9 раз, взвешивание защитной аминокислоты, обензотриазолтетраметилмочевины гексафторфосфата, 1-гидроксибензотриазол, N,Nдиизопропилэтиламин для реакции конденсации в течение 40 мин, смолу промывают диметилформамидом 6 раз после достижения точки, затем берут небольшое количество смолы и наблюдают за реакцией с раствором нингидрина, результат показывает отсутствие цвета. Реакция завершена.
2. Дефлуоренметоксикарбонил дефторируют 20% раствором пиперидина/диметилформамида в течение 15 мин, промывают диметилформамидом 9 раз, взвешивают защитную аминокислоту, обензотриазол тетраметилмочевину гексафторфосфат, 1-гидроксибензотриазол, N,Nдиизопропилэтиламин для реакции конденсации в течение 40 мин, промывают смолу диметилформамидом 6 раз после того, как реакция достигнет точки, затем берут небольшое количество смолы с раствором нингидрина для мониторинга реакции, результат показывает отсутствие цвета и завершение реакции. И так до завершения реакции до последней аминокислоты.
3. Пептид смолы подкисляют и расщепляют смесью 95% трифторуксусной кислоты/воды в течение 2 ч, отфильтровывают и удаляют смолу, добавляют маточный раствор к эфиру для отделения пептида и центрифугируют раствор для получения пептида. Неочищенный полипептид очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией и лиофилизируют для получения чистого полипептида.
Чистота синтезированного рекомбинантного человеческого коллагена по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии составила более 95% (как показано на фиг. 7).
Под микроскопом наблюдают приготовленный рекомбинантный человеческий коллаген, который представляет собой неправильную извилистую завитую структуру.
Тест на растворимость в воде рекомбинантного человеческого коллагена выглядит следующим образом:
растворяют 32 мг рекомбинантного человеческого коллагена в 8 мл воды, не перемешивая, чтобы образовался прозрачный раствор без цвета, осадков и плавающих частиц. Результат показывает, что рекомбинантный человеческий коллаген, полученный согласно изобретению, обладает хорошей растворимостью в воде и подтверждается, что он является гидрофильным белком.
Рекомбинантный человеческий коллаген, синтезированный по изобретению, имеет высокую чистоту, отсутствие скрытой вирусной опасности и высокую экспрессию. Белок может быть широко использован в биомедицине, регенеративной медицине, тканевой инженерии, а также в косметике, продуктах для здоровья, туалетных принадлежностях и других сопутствующих продуктах.
Пример 3. Анализ основных свойств рекомбинантного человеческого коллагена.
Рекомбинантный человеческий коллаген, его последовательность (код посл. № 1) следующая:
GPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFP.
Структура рекомбинантного человеческого коллагена представляет собой одноцепочечную односпиральную структуру, демонстрирующую характеристики последовательности коллагена G-X-Y (где X и Y представляют собой любые аминокислоты, отличные от глицина), общая длина составляет 30 аминокислот, является пептидом человеческого коллагена I типа.
Молекулярная масса рекомбинантного человеческого коллагена составляет 2526,71 Да, а теоретическая изоэлектрическая точка - 5,84.
Как показано на фиг. 1, рекомбинантный белок человеческого коллагена был проанализирован с помощью инструмента прогнозирования SignalP, который показал, что белок не содержит сигнального пептида; как показано на фиг. 2, рекомбинантный белок человеческого коллагена не имеет трансмембранного домена по анализу прогнозирования ТМНММ; как показано на фиг. 3, рекомбинантный белок человеческого коллагена является гидрофильным белком согласно анализу ExPASY; как показано на фиг. 4, рекомбинантный человеческий коллаген, скорее всего, образует неправильную извилистую структуру (беспорядочный клубок) с помощью онлайн-анализа SOPMA.
Пример 4. Анализ антигенных детерминант рекомбинантного человеческого коллагена.
Рекомбинантный человеческий коллаген, его последовательность (код посл. № 1) следующая:
GPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFP
Антигенная детерминанта белка проанализирована с помощью онлайн-инструмента предсказания эпитопов прогнозируемые антигенные пептиды (URL: http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl), ее средняя антигенность составила 0,9687, антигенные детерминанты не были обнаружены (показаны на фиг. 5).
Пример 5. Клеточная локализация рекомбинантного человеческого коллагена.
Рекомбинантный человеческий коллаген, его последовательность (код посл. № 1) следующая:
GPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFP
Белок анализировали онлайн с помощью PredictProtein (веб-сайт:
- 4 044700 https://www.predictprotein.org/home) Онлайн-анализ показал, что белок был новым белком, субклеточной локализации обнаружено не было (как показано на фиг. 6).
Список последовательностей <110> Наныун Университи <120> Разновидность рекомбинантного человеческого коллагена и способ его изготовления <160> 2 <170> Список последовательностей SIPO 1.0 <210> 1 <211> 30 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Коллаген rh <400> 1
Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly
10 15
Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro
25 30 <210> 2 <211> 90 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Последовательность рекомбинантной ДНК < 400> 2 ggccctgctg gtgctcgtgg aaatgatggt gctactggtg ctgccgggcc ccctggtccc accggccccg ctggtcctcc tggcttccct 90
Claims (6)
1. Рекомбинантный человеческий коллаген, структура которого представляет собой одноцепочечную, односпиральную аминокислотную последовательность с расположением аминокислот в первичной структуре коллагена, соответствующим периодическому закону G-X-Y, где G - глицин, X и Y - любые аминокислоты, кроме глицина, представляющую собой пептид коллагена I типа человека, при этом общая длина структуры составляет 30 аминокислот, при этом аминокислотная последовательность представляет собой GPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFP (SEQ ID NO: 1).
2. Рекомбинантный человеческий коллаген по п.1, отличающийся тем, что молекулярная масса рекомбинантного человеческого коллагена составляет 2526,71 Да, а теоретическая изоэлектрическая точка 5,84.
3. Рекомбинантный человеческий коллаген по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный человеческий коллаген не имеет сигнального пептида и трансмембранного домена и является гидрофильным.
4. Рекомбинантный человеческий коллаген по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный человеческий коллаген не имеет антигенных детерминант и является низкоиммуногенным.
5. Рекомбинантный человеческий коллаген по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный человеческий коллаген образует неправильную извилистую завитую структуру.
6. Способ конструирования рекомбинантного человеческого коллагена с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 по п.1, причем способ включает:
этап (1) получения последовательности белка человеческого коллагена типа I длиной 1464 аминокислоты, этап (2) анализа антигенных детерминант белка человеческого коллагена типа I с помощью инструмента прогнозирования антигенных эпитопов и отбора для получения областей с низким уровнем антигенной детерминанты области из 171 аминокислоты в области низкой антигенной детерминанты при 230-400 в белке человеческого коллагена типа I, этап (3) выбора с помощью прогнозирования антигенных детерминант в сочетании с пятью следующими методами определения: методом определения антигенности Коласкара и Тонгаонкара, методом определения гидрофильности Паркера, методом определения гибкости Карплюса, методом определения доступности поверхности Эмини и методом определения β-поворота Чоу и Фасмана, в области из 171 аминокислоты области длиной 30 аминокислот с низким уровнем антигенных детерминант, высокой гидрофильностью в сочетании с характеристиками расположения аминокислот в первичной структуре коллагена, соответствующего периодическому закону G-X-Y, где G - глицин, X и Y - любые аминокислоты, кроме глицина, для определения аминокислотной последовательности синтезируемого рекомбинантного человеческого коллагена;
этап (4) подтверждения низкой иммуногенности и гидрофильности синтезируемого рекомбинантного человеческого коллагена.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010331037.8 | 2020-04-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044700B1 true EA044700B1 (ru) | 2023-09-25 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7261511B2 (ja) | 組換えヒトコラーゲン及びその構築方法 | |
| CN110606896B (zh) | 重组人源III型胶原蛋白α1链及其应用 | |
| CN113621052B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 | |
| Mecham et al. | The elastic fiber | |
| Ninomiya et al. | Differential expression of two basement membrane collagen genes, COL4A6 and COL4A5, demonstrated by immunofluorescence staining using peptide-specific monoclonal antibodies. | |
| CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| CN113717290B (zh) | 一种复合透皮重组纤连蛋白及其应用 | |
| CN112745394B (zh) | 一种重组类人胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN111944057A (zh) | 一种重组人胶原蛋白肽及其应用 | |
| CN114805551B (zh) | 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法 | |
| CN114276435B (zh) | 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其应用 | |
| TW200526683A (en) | Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine | |
| CA2629821A1 (en) | Production of recombinant collagen like proteins | |
| CN113683679A (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l6t及其制备方法和用途 | |
| JP7459362B1 (ja) | 組換えヒト型化コラーゲンおよびその応用 | |
| KR101677959B1 (ko) | 리파아제 활성이 증대된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체 및 이의 용도 | |
| CN101309934B (zh) | 修饰的伴侣蛋白10 | |
| EA044700B1 (ru) | Рекомбинантный человеческий коллаген и способ его конструирования | |
| CN104726461A (zh) | 甲鱼胶原蛋白基因功能片段及其重组蛋白和应用 | |
| CN109942694A (zh) | 草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用 | |
| CN1865286A (zh) | 双功能表皮生长因子及其制备方法和用途 | |
| CN100500844C (zh) | 重组胸腺素α1在大肠杆菌中的高分泌表达和分离纯化 | |
| CN116102637B (zh) | 一种稳定的i型重组胶原蛋白及其应用 | |
| CN115991763B (zh) | 一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| Adolph | The zebrafish thrombospondin 3 and 4 genes (thbs3 and thbs4): cDNA and protein structure |