EA043204B1

EA043204B1 - Адамантановое производное и его применение

Info

Publication number: EA043204B1
Application number: EA201891688
Authority: EA
Inventors: Сигеки Моригути; Кодзи Фукунага; Йосихару Ивабути
Original assignee: Тохоку Юниверсити
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2017-01-26
Publication date: 2023-04-28

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к адамантановому производному и его фармацевтически приемлемой соли. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей такое соединение, и способу лечения или профилактики заболевания с использованием такого соединения.

Предпосылки создания изобретения

АТФ-чувствительный K+ канал (К_атф канал) представляет собой K+ канал внутреннего выпрямления, соединяющий внутриклеточный метаболизм и возбуждение клеточной мембраны и известный как имеющий гетерологичную октамерную структуру, состоящую из рецептора сульфонилмочевины (SUR), относящегося к ABC семейству белков, и две трансмембранные субъединицы Kir6.1 и Kir6.2. Активность К_атф канала контролируется различными типами открывателей, ингибиторов K+ канала или внутриклеточными нуклеотидами. Все из них имеют активные сайты в SUR субъединицах. Сообщалось о том, что их реакции различаются в зависимости от подтипа SUR (NPL 1).

Некоторые из адамантановых производных, имеющих структуру типа клетки, используют в качестве медицинских препаратов. Амантадин используют в качестве антивирусного лекарственного средства и терапевтического средства от болезни Паркинсона. Мемантин гидрохлорид одобрен в качестве терапевтического средства от умеренной/тяжелой деменции альцгеймеровского типа даже в Японии. Мемантин представляет собой неконкурентный ингибитор NMDA-рецептора и, как сообщалось, имеет механизм действия, который предотвращает гибель нервных клеток из-за чрезмерного выделения глутаминовой кислоты, вызванного ишемией (NPL 2).

Адамантановые производные, обладающие активностью в качестве медицинского препарата, описаны в различной литературе (патентная литература 1-3).

Перечень ссылочных документов

Патентная литература.

Патентная литература 1: национальная публикация международной патентной заявки № 2011-529057.

Патентная литература 2: японская выложенная патентная заявка № 2010-522203.

Патентная литература 3: национальная публикация международной патентной заявки № 2009-508956.

Непатентная литература.

Непатентная литература 1: Folia pharmacologica Japonica, 126, 311 to 316 (2005).

Непатентная литература 2: Folia pharmacologica Japonica, 124, 145 to 151 (2004).

Сущность изобретения

Техническая задача.

Терапевтический и профилактический способ, обеспечивающий достаточный эффект на когнитивное заболевание или расстройство, такое как болезнь Альцгеймера, до сих пор отсутствует, и, таким образом, необходима разработка нового терапевтического и профилактического средства, отличающегося механизмом действия от существующих медицинских препаратов. Кроме того, очень желательна разработка нового терапевтического и профилактического средства от диабета.

В одном аспекте целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для применения в лечении или профилактике когнитивного заболевания или расстройства. Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения или профилактики когнитивного заболевания или расстройства с использованием заранее определенного адамантанового производного.

В одном аспекте целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для применения в лечении или профилактике диабета или диабетического осложнения. Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения или профилактики диабета или диабетического осложнения с использованием заранее определенного адамантанового производного.

АТФ-чувствительный K+ канал (К_атф канал) содержит субъединицы Kir6.1 и Kir6.2, и известно, что он служит в качестве активного сайта, например, антидиабетического лекарственного средства.

В одном аспекте целью настоящего изобретения является обеспечение ингибитора канала против Kir6.1 или ингибитора канала против Kir6.2 канала К_атф. Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для применения в лечении или профилактике заболевания, связанного с каналом Kir6.1 или каналом Kir6.2 канала К_атф. Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения или профилактики заболевания, связанного с каналом Kir6.1 или каналом Kir6.2 канала К_атф, с использованием заранее определенного адамантанового производного.

Решение задачи.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью достижения указанных выше целей. В результате они обнаружили, что адамантановое производное обладает ингибиторной активностью в отношении Kir6.2 канала, ингибиторной активностью в отношении Kir6.1 канала, терапевтическим эффектом на когнитивное заболевание или расстройство и гипогликемическим эффектом. На основании этого было создано настоящее изобретение. В описании раскрываются следующие изобретения, представленные в [1-1]-[1-20].

- 1 043204

[1-1] Соединение, представленное формулой (I)

(I)

Химическая формула 1 где R¹ представляет собой атом водорода или (C₁.₆алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;

R² представляет собой атом водорода или (C₁.₆алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;

X представляет собой О или NR⁵;

R³ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹, 5- или 6-членный гетероарил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹, или COOR⁶;

R⁴ представляет собой атом водорода, атом галогена, азидо, -OR⁷ или -NHR⁸;

R⁵ представляет собой атом водорода или C_1-6алкил;

R⁶ представляет собой атом водорода или C_1-6алкил;

R⁷ представляет собой атом водорода, C_1-6алкил, C_1-6алкокси-C_1-6алкил или (C_1-6алкил) карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;

R⁸ представляет собой атом водорода, C_1-6алкил или (€_1-6алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена; и

X¹ представляет собой C_1-6алкил, атом галогена, C_1-6алкокси, нитро или циано, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль.

[1-2] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с [1-1], где R⁴ представляет собой атом хлора или азидо.

[1-3] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с [1-1] или [1-2], где R¹ представляет собой трифторацетил.

[1-4] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с любым из [1-1]-[1-3], где R² представляет собой (C_1-6алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена.

[1-5] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с [1-4], где R² представляет собой трифторацетил.

[1-6] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с любым из [1-1]-[1-5], где R³ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹, или пиридил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹.

[1-7] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с [1-1], выбранное из (R)-(( 1 R,2S,3R,5R,7 S)-5-азидо-1 -гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метилацетата;

этил (S)-2-ацетамидо-2-(( 1 R,2S,3R,5R,7R)-5-хлор-1 -гидроксиадамантан-2-ил)ацетата;

этил (R)-2-ацетамидо-2-((1R,2S,3R,5R,7R)-5-хлор-1-гидроксиадамантан-2-ил)ацетата;

(1R,2S,3R,5R,7R)-5-хлор-2-((S)-2-метокси-2-оксо-1-(2,2,2-трифторацетамидо)этил)адамантан-1-ил 2,2,2-трифторацетата;

(1S,2R,3S,5S,7S)-5-хлор-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1-ил 2,2,2трифторацетата;

(S)-2-амино-2-((1R,2S,3R,5R,7S)-1,5-дигидроксиадамантан-2-ил)уксусной кислоты;

N-((R)-((1S,2R,3S,5S,7S)-5-хлор-1-гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метил)-2,2,2-трифторацетамид;

(1S,2R,3S,5R,7S)-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1-ил 2,2,2трифторацетата;

(1 S,2R,3S,5S,7R)-5-(2-метоксиэтокси)-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1 -ил 2,2,2-трифторацетата;

N-((R)-((1S,2R,3S,5S,7S)-5-хлор-1-гидроксиадамантан-2-ил)(пиридин-3-ил)метил)-2,2,2трифторацетамида;

2,2,2-трифтор-N-((R)-((1S,2R,3S,5R,7S)-1-гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метил)ацетамида; и (1S,2R,3S,5S,7R)-5-метокси-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1-ил 2,2,2трифторацетата; или энантиомера, диастереомера или фармацевтически приемлемой соли такого соединения.

[1-8] Фармацевтическая композиция, содержащая соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из [1-1]-[1-7].

[1-9] Фармацевтическая композиция в соответствии с [1-8] для применения в лечении или профилактике когнитивного заболевания или расстройства.

- 2 043204

[1-10] Фармацевтическая композиция в соответствии с [1-9], где когнитивное заболевание или расстройство выбрано из деменции альцгеймеровского типа, цереброваскулярной деменции, деменции с тельцами Леви, фронтотемпоральной деменции, болезни Паркинсона, психического заболевания и нейродегенеративного заболевания.

[1-11] Фармацевтическая композиция в соответствии с [1-8] для применения в лечении или профилактике диабета или диабетического осложнения.

[1-12] Ингибитор Kir6.2 канала, содержащий соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из [1-1]-[1-7].

[1-13] Ингибитор Kir6.1 канала, содержащий соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из [1-1]-[1-7].

[1-14] Способ лечения или профилактики когнитивного заболевания или расстройства, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения, его энантиомера, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из [1-1]-[1-7].

[1-15] Способ в соответствии с [1-14], где когнитивное заболевание или расстройство выбрано из деменции альцгеймеровского типа, цереброваскулярной деменции, деменции с тельцами Леви, фронтотемпоральной деменции, болезни Паркинсона, психического заболевания и нейродегенеративного заболевания.

[1-16] Способ лечения или профилактики диабета или диабетического осложнения, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения, его энантиомера, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из [1-1]-[1-7].

[1-17] Способ лечения или профилактики заболевания, связанного с Kir6.1 каналом или Kir6.2 каналом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения, его энантиомера, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из [1-1]-[1-7] в качестве ингибитора Kir6.1 канала или ингибитора Kir6.2 канала.

[1-18] Способ в соответствии с [1-17], где заболевание, связанное с Kir6.1 каналом или Kir6.2 каналом, представляет собой когнитивное заболевание или расстройство или диабет или диабетическое осложнение.

[1-19] Способ в соответствии с [1-17] или [1-18], где заболевание, связанное с Kir6.1 каналом или Kir6.2 каналом, представляет собой когнитивное заболевание или расстройство, выбранное из деменции альцгеймеровского типа, цереброваскулярной деменции, деменции с тельцами Леви, фронтотемпоральной деменции, болезни Паркинсона, психического заболевания и нейродегенеративного заболевания.

[1-20] Способ в соответствии с [1-17] или [1-18], где заболевание, связанное с Kir6.1 каналом или Kir6.2 каналом, представляет собой диабет или диабетическое осложнение.

В описании раскрываются следующие изобретения, представленные в [2-1]-[2-12].

[2-1] Соединение, представленное формулой (I)

(I)

Химическая формула 2 где R¹ представляет собой атом водорода или (C₁.₆алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;

X представляет собой О или NR⁵;

R³ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹, или COOR⁶;

R⁴ представляет собой атом водорода, атом галогена, азидо,-OR⁷ или -NHR⁸;

R⁵ представляет собой атом водорода или C₁.₆алкил;

R⁶ представляет собой атом водорода или C₁.₆алкил;

R⁷ представляет собой атом водорода, C₁.₆алкил или (C₁.₆алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;

R⁸ представляет собой атом водорода, C₁.₆алкил или (C₁.₆алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена; и

X¹ представляет собой C₁.₆алкил, атом галогена, C₁.₆алкокси, нитро или циано, его энантиомер, его диастереомер, или его фармацевтически приемлемая соль.

[2-2] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с [2-1], где R⁴ представляет собой атом хлора или азидо.

[2-3] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с [2-1] или [2-2], где R¹ представляет собой трифторацетил.

[2-4] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в

- 3 043204 соответствии с любым из [2-1]-[2-3], где R² представляет собой трифторацетил.

[2-5] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с любым из [2-1]-[2-4], где R³ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹.

[2-6] Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с [2-1], выбранное из (R)-((1R,2S,3R,5R,7S)-5-азидо-1-гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метилацетата;

этил (S)-2-ацетамидо-2-((1R,2S,3R,5R,7R)-5-хлор-1-гидроксиадамантан-2-ил)ацетата;

(1S,2R,3S,5S,7S)-5-хлор-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1-ил 2,2,2трифторацетата; и (S)-2-αмuно-2-((1R,2S,3R,5R,7S)-1,5-дuгuдроксuадαмαнтαн-2-uл)уkсусной кислоты, или энантиомера, диастереомера или фармацевтически приемлемой соли такого соединения.

[2-7] Фармацевтическая композиция, содержащая соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из [2-1]-[2-6].

[2-8] Фармацевтическая композиция в соответствии с [2-7] для применения в лечении или профилактике когнитивного заболевания или расстройства.

[2-9] Фармацевтическая композиция в соответствии с [2-8], где когнитивное заболевание или расстройство выбрано из деменции альцгеймеровского типа, цереброваскулярной деменции, деменции с тельцами Леви, фронтотемпоральной деменции, болезни Паркинсона, психического заболевания и нейродегенеративного заболевания.

[2-10] Фармацевтическая композиция в соответствии с [2-7] для применения в лечении или профилактике диабета или диабетического осложнения.

[2-11] Ингибитор Kir6.2 канала, содержащий соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из [2-1]-[2-6].

[2-12] Ингибитор Kir6.1 канала, содержащий соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с любым из [2-1]-[2-6].

Полезные эффекты изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для применения в лечении или профилактике когнитивного заболевания или расстройства. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает ингибитор Kir6.1 канала или Kir6.2 канала К_атф канала.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет график, показывающий CaMKII активность, усиленную соединением по настоящему изобретению, в клетках (Neuro2A клетки), сверхэкспрессирующих Kir6.2 канал. Все показатели, относящиеся к значимой разнице, указаны по отношению к контролю (С: Kir6.2 экспрессирующие клетки, не обработанные лекарственным средством). На чертежах в настоящей заявке значимая разница, помеченная как ** или ++, означает Р<0,01; или значимая разница, помеченная как + или *, означает Р<0,05.

Фиг. 2а показывает (результаты) экспрессию Kir6.2 канала в N2A клетках, которую контролируют, применяя иммуноблоттинг с использованием анти-Kir6.2 канал антитела к Kir6.2 каналсверхэкспрессирующим клеткам. Случай, имеющий значимую разницу с не обработанной лекарственным средством группой (-), указан как **.

Фиг. 2b показывает результаты анализа пэтч-кламп методом в формате целой клетки, показывающие, что ТР-014 подавляет выходящий ток калия в Kir6.2 канал-сверхэкспрессирующих клетках. Результаты показывают, что ТР-014 ингибирует Kir6.2 канал и уменьшает ток калия.

Фиг. 3а показывает результаты анализа кальций-визуализирующим методом, показывающие, что внутриклеточная концентрация кальция в Kir6.2 канал-сверхэкспрессирующих клетках повышается при введении ТР-014. Изменение концентрация-зависимого количества кальция с течением времени (4 мин) контролировали в случаях обработки соединением по настоящему изобретению и мемантином. Результаты показывают, что ТР-014 ингибирует Kir6.2 канал и повышает внутриклеточную концентрацию кальция.

Фиг. 3b показывает результаты анализа методом визуализации кальция, показывающие, что внутриклеточная концентрация кальция в Kir6.2 канал-сверхэкспрессирующих клетках повышается при введении ТР-014. Количество кальция измеряли через 4 мин после обработки мемантином и соединением по настоящему изобретению. Подтверждали, что группа, где использовали Kir6.2-экспрессирующие клетки (Neuro2A клетки), имела значимую разницу по сравнению с не обработанной лекарственным средством группой (-). Результаты показывают, что ТР-014 ингибирует Kir6.2 канал и повышает внутриклеточную концентрацию кальция.

Фиг. 4а показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с бо

- 4 043204 лезнью Альцгеймера (АРР23 мыши) (возраст 12 месяцев) в течение двух месяцев и анализ осуществляли методом Y-образного лабиринта, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшалась.

Фиг. 4b показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с болезнью Альцгеймера (АРР23 мыши) (возраст 12 месяцев) в течение двух месяцев и анализ осуществляли методом Y-образного лабиринта, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. Случай, имеющий значимую разницу между мышами дикого типа (WT) и АРР23 в проценте правильных ответов (изменение) при обучении запоминанию, указан как **; и случай, имеющий значимую разницу между АРР мышами и контролем (необработанная группа), указан как ++.

Фиг. 4с представляет график, показывающий результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с болезнью Альцгеймера (АРР23 мыши) (возраст 12 месяцев) в течение двух месяцев и анализ осуществляли при помощи теста на распознавание новых объектов, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. Случай значимой разницы между Новым (новый объект) и Знакомым (тот же самый объект) в каждой группе мышей указан как **

Фиг. 4d показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с болезнью Альцгеймера (АРР23 мыши) (возраст 12 месяцев) в течение двух месяцев и анализ осуществляли при помощи испытания методом условно-рефлекторного замирания, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. В испытаниях способности запоминания случай, имеющий значимую разницу с WT, указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с АРР23 мышами, указан как +.

Фиг. 4е показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с болезнью Альцгеймера (АРР23 мыши) (возраст 12 месяцев) в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащий показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом.

Фиг. 4f показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с болезнью Альцгеймера (АРР23 мыши) (возраст 12 месяцев) в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащий показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом.

Фиг. 4g показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с болезнью Альцгеймера (АРР23 мыши) (возраст 12 месяцев) в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащего показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом. Случай, имеющий значимую разницу с WT, указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с АРР23 мышами, указан как ++ или +.

Фиг. 5а показывает полосы (изображение), полученные при помощи электрофореза иммуноблотов, показывающие результаты фосфорилирования белков, которые анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против CaMKII, CaMKIV и ERK.

Фиг. 5b показывает результаты количественного анализа интенсивности сигнала полос (на фиг. 5а), полученных электрофорезом иммуноблотов. Случай, имеющий значимую разницу с WT(-) (группа, не обработанная лекарственным средством), указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с группой АРР23 мышей, не обработанных лекарственным средством (-), указан как +.

Фиг. 5с показывает полосы (изображение), полученные при помощи электрофореза иммуноблотов, показывающие результаты фосфорилирования белков, которые анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против CaMKII, CaMKIV и ERK.

Фиг. 5d показывает результаты количественного анализа интенсивности сигнала полос (на фиг. 5с), полученных электрофорезом иммуноблотов. Случай, имеющий значимую разницу с WT(-) (группа, не обработанная лекарственным средством), указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с группой АРР23 мышей, не обработанных лекарственным средством (-), указан как ++.

Фиг. 6а показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с нейродегенеративным заболеванием, т.е. мышам с удаленными обонятельными луковицами (ОВХ мыши), в течение двух месяцев и анализ осуществляли методом Y-образного лабиринта, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается.

Фиг. 6b показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с нейродегенеративным заболеванием, т.е. мышам с удаленными обонятельными луковицами (ОВХ мыши), в течение двух месяцев и анализ осуществляли методом Y-образного лабиринта, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. У ОВХ мышей, случай, имеющий значимую разницу с WT в проценте правильных ответов (изменение) при обучении запоминанию, указан как **; и случай, имеющий значимую разницу между контрольными (необработанная группа) и ОВХ мышами, указан как ++.

Фиг. 6с показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с нейродегенеративным заболеванием, т.е. мышам с удаленными обонятельными луковицами (ОВХ мыши), в течение двух месяцев и анализ осуществляли при помощи теста на распознавание новых объектов, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. Случай значимой разницы между Новым (новый объект) и Знакомым (знакомый объект) в каждой группе мышей, указан как **

Фиг. 6d показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с нейродегенеративным заболеванием, т.е. мышам с удаленными обонятельными луковицами (ОВХ мыши), в

- 5 043204 течение двух месяцев и анализ осуществляли при помощи испытания методом условно-рефлекторного замирания, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. В испытаниях способности запоминания случай, имеющий значимую разницу с WT, указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с ОВХ мышами, указан как +.

Фиг. 6е показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с нейродегенеративным заболеванием, т.е. мышам с удаленными обонятельными луковицами (ОВХ мыши), в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащий показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом.

Фиг. 6f показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с нейродегенеративным заболеванием, т.е. мышам с удаленными обонятельными луковицами (ОВХ мыши), в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащий показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом.

Фиг. 6g показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили модельным мышам с нейродегенеративным заболеванием, т.е. мышам с удаленными обонятельными луковицами (ОВХ мыши), в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащий показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом. Случай, имеющий значимую разницу с имитацией, указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с ОВХ мышами, как ++ или +.

Фиг. 7а показывает полосы (изображение), полученные при помощи электрофореза иммуноблотов, показывающие результаты фосфорилирования белков, которые анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против CaMKII, CaMKIV и ERK.

Фиг. 7b показывает результаты количественного анализа интенсивности сигнала полос (на фиг. 7а), полученных электрофорезом иммуноблотов.

Фиг. 7с показывает полосы (изображение), полученные при помощи электрофореза иммуноблотов, показывающие результаты фосфорилирования белков, которые анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против CaMKII, CaMKIV и ERK.

Фиг. 7d показывает результаты количественного анализа интенсивности сигнала полос (на фиг. 7с), полученных электрофорезом иммуноблотов. Случай, имеющий значимую разницу с WT(-)(группа, не обработанная лекарственным средством), указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с группой ОВХ мышей, не обработанных лекарственным средством (-), указан как ++.

Фиг. 8а представляет график, показывающий результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили Kir6.2 канал-дефицитным мышам в течение двух месяцев и анализ осуществляли методом Y-образного лабиринта, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается.

Фиг. 8b показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили Kir6.2 канал-дефицитным мышам в течение двух месяцев и анализ осуществляли методом Y-образного лабиринта, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. Случай, имеющий значимую разницу между Kir6.2-дефицитными мышами и WT в проценте правильных ответов (изменение) при обучении запоминанию, указан как * или **.

Фиг. 8с представляет график, показывающий результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили Kir6.2 канал-дефицитным мышам в течение двух месяцев и анализ осуществляли при помощи теста на распознавание новых объектов, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. Случай значимой разницы между Новым (новый объект) и Знакомым (знакомый объект) в каждой группе мышей, указан как **.

Фиг. 8d представляет график, показывающий результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили Kir6.2 канал-дефицитным мышам в течение двух месяцев и анализ осуществляли при помощи испытания методом условно-рефлекторного замирания, показывающие, что когнитивная функция эффективно улучшается. В испытаниях способности запоминания случай, имеющий значимую разницу с WT, показан как *.

Фиг. 8е показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили Kir6.2 канал-дефицитным мышам в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащий показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом.

Фиг. 8f показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили Kir6.2 канал-дефицитным мышам в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащий показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом.

Фиг. 8g показывает результаты эксперимента, в котором ТР-014 вводили Kir6.2 канал-дефицитным мышам в течение двух месяцев и анализ осуществляли на феномен длительной потенциации (LTP), служащий показателем формирования памяти, электрофизиологическим методом. Случай, имеющий значимую разницу с WT, указан как ** или *.

Фиг. 9а показывает полосы (изображение), полученные при помощи электрофореза иммуноблотов, показывающие результаты фосфорилирования белков, которые анализировали иммуноблоттингом с использованием антител против CaMKII, CaMKIV и ERK.

Фиг. 9b показывает результаты количественного анализа интенсивности сигнала полос (на фиг. 9а), полученных электрофорезом иммуноблотов. Случай, имеющий значимую разницу с WT(-) (группа, не

- 6 043204 обработанная лекарственным средством), указан как ** или *.

Фиг. 10 показывает результаты окрашивания секций срезов мозга АРР23 мыши, показывающие эффект соединения по настоящему изобретению на Ae агрегацию.

Фиг. 11а показывает результаты испытания, которое исследует, обладает или нет соединение по настоящему изобретению эффектом улучшения депрессия-подобного симптома у ОВХ мышей. Случай, имеющий значимую разницу с имитацией (контрольная группа), указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с ОВХ мышами, указан как +.

Фиг. 11b показывает результаты испытания, которое исследует, обладает или нет соединение по настоящему изобретению эффектом улучшения депрессия-подобного симптома у ОВХ мышей. Случай, имеющий значимую разницу с имитацией (контрольная группа), указан как **, а имеющий значимую разницу с ОВХ мышами указан как +.

Фиг. 12а показывает результаты испытания, которое исследует, обладает или нет соединение по настоящему изобретению эффектом улучшения на депрессию путем ингибирующего действия на Kir6.1 канал. Случай, имеющий значимую разницу с WT (контрольная группа), указан как **.

Фиг. 12b показывает результаты испытания, которое исследует, обладает или нет соединение по настоящему изобретению эффектом улучшения на депрессию путем ингибирующего действия на Kir6.1 канал. Случай, имеющий значимую разницу с WT (контрольная группа), указан как **.

Фиг. 13а показывает результаты испытания, которое исследует, действительно ли соединение по настоящему изобретению ингибирует Kir6.1 канал и активирует CaMKIV, оказывая таким образом улучшающее действие на депрессию. Случай, имеющий значимую разницу с WT (контрольная группа), указан как **.

Фиг. 13b показывает результаты испытания, которое исследует, действительно ли соединение по настоящему изобретению ингибирует Kir6.1 канал и активирует CaMKIV, оказывая таким образом улучшающее действие депрессия-подобный симптом. Случай, имеющий значимую разницу с WT (контрольная группа), указан как **.

Фиг. 14 показывает результаты испытания, которое исследует, обладает или нет соединение по настоящему изобретению гипогликемическим эффектом. Термин недели относится к периоду времени длительного введения, случай, имеющий значимую разницу между ob/ob (солевой раствор) на каждой неделе, указан как *.

Фиг. 15 представляет иллюстрацию, показывающую механизм действия ТР-014. Когда Kir6.2 канал, локализованный в спинном мозге, ингибируется, калий, присутствующий в клетках, не может вытектать из них, повышая порог клеточной мембраны. В результате, кальций вне клетки быстрее поступает в клетку, активирует CaMKII, активирует GluA1 (Ser-831)(АМРА акцептор) на пути ниже от CaMKII и предположительно улучшает когнитивную функцию. ТР-014 подобным образом ингибирует Kir6.1 канал, расположенный в теле нервной клетки. В результате кальций проникает в клетки аналогичным механизмом. Приток кальция активирует CaMKIV, активирует CREB (Ser-133) и предположительно индуцирует нейрогенез, улучшая депрессию. ТР-014 представляет собой новое улучшающее когнитивную функцию лекарственное средство, обладающее как эффектом улучшения когнитивной функции (главный симптом болезни Альцгеймера) на основании ингибирующего Kir6.2 канал действия, так и эффектом улучшения депрессии (периферический симптом болезни Альцгеймера) на основании ингибирующего Kir6.1 действия.

Фиг. 16 показывает структуру плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.2.

Фиг. 17-1 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.2.

Фиг. 17-2 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.2.

Фиг. 17-3 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.2.

Фиг. 17-4 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.2.

Фиг. 17-5 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.2.

Фиг. 18а представляет график, показывающий активность CaMKIV, усиленную соединением по настоящему изобретению в клетках (Neuro2A клетки), сверхэкспрессирующих Kir6.1 канал. Все случаи, имеющие значимую разницу с контролем (С: Kir6.1 экспрессирующие клетки, не обработанные лекарственным средством), отмечены.

Фиг. 18b показывает результаты экспрессии Kir6.1 канала в N2A клетках, которую контролируют, применяя иммуноблоттинг с использованием анти-Kir6.1 канал антитела к Kir6.1 каналсверхэкспрессирующим клеткам. Случай, имеющий значимую разницу с не обработанной лекарственным средством группой (-), указан как **.

Фиг. 18с показывает результаты определения тока калия, вытекающего из клеток, проверяемого с использованием Kir6.1 канал-сверхэкспрессирующих клеток и измеренного обычным пэтч-кламп методом.

Фиг. 19а показывает результаты анализа чувствительности групп мышей (используемых в испытании) к беспокойству методом приподнятого крестообразного лабиринта. Что касается времени пребывания мыши в открытом рукаве лабиринта, случай, имеющий значимую разницу с WT(-), указан как ** или *; и случай, имеющий значимую разницу с WT (CORT), указан как ++.

- 7 043204

Фиг. 19b показывает фотографию аппарата, используемого в методе приподнятого крестообразного лабиринта.

Фиг. 19с показывает результаты метода испытания свет/темнота. Случай, имеющий значимую разницу с WT(-), указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с WT (CORT), указан как ++.

Фиг. 19d показывает фотографию устройства, используемого в методе испытания свет/темнота.

Фиг. 19е показывает результаты испытания методом закапывания шариков. Случай, имеющий значимую разницу с WT(-), указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с WT (CORT), указан как +.

Фиг. 19f показывает фотографию устройства, используемого в методе закапывания шариков.

Фиг. 19g показывает результаты испытания методом открытого поля. Случай, имеющий значимую разницу с WT(-), указан как **; и случай, имеющий значимую разницу с WT (CORT), указан как ++.

Фиг. 19h показывает фотографию устройства, используемого в методе открытого поля.

Фиг. 19i показывает результаты испытания методом условно-рефлекторного замирания. Случай, имеющий значимую разницу с WT(-), указан как ** или *; и случай, имеющий значимую разницу с WT (CORT), указан как ++.

Фиг. 20 показывает структуру плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.1.

Фиг. 21-1 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.1.

Фиг. 21-2 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.1.

Фиг. 21-3 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.1.

Фиг. 21-4 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.1.

Фиг. 21-5 показывает последовательность плазмидного вектора: pcDNA3.1-Kir6.1.

Описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение более конкретно описано ниже.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения или профилактики когнитивного заболевания или расстройства, содержащая соединение, представленное формулой (I), его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль. Более конкретно, соединение по настоящему изобретению включает соединение, представленное следующими формулами (I) и (II).

Химическая формула 3

В описании изобретения C_1-6алкил относится к линейной, разветвленной, циклической или частично циклической алкильной группе, содержащей 1-6 атомов углерода. Примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, 3-метилбутил, 2-метилбутил, 1-метилбутил, 1-этилпропил, н-гексил, 4-метилпентил, 3-метилпентил, 2-метилпентил, 1-метилпентил, 3-этилбутил и 2-этилбутил, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклопропилметил. Например, C_1-4алкил и C_1-3алкил также включены.

В описании изобретения C_1-6алкокси относится к алкилокси группе [-O-(C_1-6алкил)], содержащей алкильную группу с 1-6 атомами углерода, определенную выше. Примеры включают метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, изобутокси, трет-бутокси, н-пентокси, 3-метилбутокси, 2-метилбутокси, 1-метилбутокси, 1-этилпропокси, н-гексилокси, 4-метилпентокси, 3-метилпентокси, 2-метилпентокси, 1-метилпентокси, 3-этилбутокси, циклопентилокси, циклогексилокси и циклопропилметилокси. Например, C_1-4алкокси и C_1-3алкокси также включены. В описани изобретения, C_1-4алкокси включает, например C_1-3алкокси.

В описании изобретения азидо относится к -N₃.

В описании изобретения (C_1-6алкил)карбонил относится к алкилкарбонильной группе, содержащей C_1-6алкильную группу, определенную выше. Примеры включают метилкарбонил(ацетил), этилкарбонил, трет-бутилкарбонил и (C_1-3 алкил)карбонил.

В описании изобретения 5- или 6-членный гетероарил конкретно не ограничивается, при условии, что он представляет собой гетероарил, состоящий из 5-членного кольца или 6-членного кольца, содержащий по меньшей мере один гетероатом, выбранный из атома кислорода, атома азота и атома серы. Примеры включают пиридил, пиримидил, пиридазинил, пиразил, фуранил (фурил), тиофенил (тиенил), оксазолил, оксадиазолил, пирролил, имидазолил, пиразолил, триазолил и тетразолил.

В описании изобретения C_1-6алкокси-С_1-6алкил относится к C_1-6алкилу, содержащему заместитель C_1-6алкокси, определенный выше, и алкильная часть C_1-6алкила является такой, как определено выше. Примеры включают метоксиметил, этоксиметил, 2-метоксиэтил, 1-метоксиэтил, 3-метоксипропил, 2-метоксипропил и 1-метоксипропил.

Примеры атома галогена включают атом фтора, атом хлора, атом брома и атом иода.

В описании изобретения примеры (C_1-6алкил)карбонила, необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогена включают трифторацетил, дифторацетил, 2,2,2-трифторэтилкарбонил и

- 8 043204 перфторэтилкарбонил.

Если соединение, представленное формулой (I), образует сольват, такой как гидрат, настоящее изобретение может быть осуществлено с использованием сольвата. Кроме того, соединение по настоящему изобретению может быть соответствующим образом осуществлено с использованием соединения в состоянии смеси или раствора или кристаллического полиморфизма.

В описании изобретения замещенный одним или несколькими заместителями включает, например, замещение 1-3 заместителями.

Настоящее изобретение, относящееся к соединению, представленному формулой (I), включает таутомер, геометрический изомер, различные стереоизомеры, такие как оптический изомер, и диастереомер и их смесь. Примеры соединения, представленного формулой (I), включают соединение, представленное следующими формулами (Ia)-(Ih).

Химическая формула 4

В качестве соединения по настоящему изобретению можно использовать, например, соединение, описанное в примерах в настоящем описании. Более конкретно, можно использовать следующие соеди нения:

(R)-((1R,2S,3R,5R,7S)-5-азидо-1-гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метилацетат (ТР-009);

этил (S)-2-ацетамидо-2-((1R,2S,3R,5R,7R)-5-хлор-1-гидроксиадамантан-2-ил)ацетат (ТР-010);

этил (R)-2-ацетамидо-2-((1R,2S,3R,5R,7R)-5-хлор-1-гидроkсиадамантан-2-ил)ацетат (ТР-011);

(1 R,2S,3R,5R,7R)-5-хлор-2-((S)-2-метокси-2-оксо-1 -(2,2,2-трифторацетамидо)этил)адамантан-1 -ил 2,2,2-трифторацетат (ТР-012);

(1 S,2R,3S,5 S,7 S)-5-хлор-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1 -ил 2,2,2трифторацетат (ТР-014);

(S)-2-амино-2-(( 1 R,2S,3R,5R,7 S)-1,5-дигидроксиадамантан-2-ил)уксусная кислота (ТР-015);

N-((R)-(( 1 S,2R,3S,5 S,7 S)-5-хлор-1 -гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метил)-2,2,2-трифторацетамид (ТР-048);

(1 S,2R,3S,5R,7 S)-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1 -ил 2,2,2-трифторацетат (ТР-049) ;

(1 S,2R,3S,5 S,7R)-5-(2-метоксиэтокси)-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1 -ил 2,2,2-трифторацетат (ТР-050) ;

N-((R)-(( 1 S,2R,3S,5 S,7 S)-5-хлор-1 -гидроксиадамантан-2-ил)(пиридин-3-ил)метил)-2,2,2трифторацетамид (ТР-051);

2,2,2-трифтор-N-((R)-(( 1 S,2R,3S,5R,7 S)-1 -гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метил) ацетамид (ТР-052); и (1 S,2R,3S,5 S,7R)-5-метокси-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1 -ил 2,2,2трифторацетат (ТР-053).

Фармацевтически приемлемая соль соединения, представленного формулой (I), конкретно не ограничивается, при условии, что она представляет собой соль, которую можно использовать в качестве фармацевтического продукта.

Примеры соли, образованной соединением по настоящему изобретению и основанием, включают соль с неорганическим основанием, таким как натрий, калий, магний, кальций и алюминий; и соль с органическим основанием, таким как метиламин, этиламин и этаноламин. Соль может быть кислотноаддитивной солью. Примеры кислотно-аддитивной соли включают соль с минеральной кислотой, такой как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, иодистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота и фосфорная кислота; и кислотно-аддитивную соль с органической кислотой, такой как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, метансульфоновая кислота и этансульфоновая кислота.

Атомы (например, атом водорода, атом углерода, атом кислорода, атом азота и атом серы), содер

- 9 043204 жащиеся в соединении, представленном формулой (I), могут быть атомами изотопов, отличными от тех, которые наиболее часто встречаются. Атомы изотопов могут представлять собой радиоактивные изотопы. Более конкретно, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается соединение, представленное формулой (I), уже определенное в описании и меченное атомом изотопа, или его соль. Мечение изотопом может представлять собой, например, мечение радиоактивным изотопом (например, ³Н, ¹⁴С, ³²Р). Чтобы легко получить соединение, мечение при помощи ³Н является предпочтительным.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединение, представленное формулой (I), его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль вводят в виде пролекарства с преобразованием в активное соединение in vivo.

В настоящем изобретении примеры лечения когнитивного заболевания или расстройства включают лечение деменции альцгеймеровского типа, цереброваскулярной деменции, деменции с тельцами Леви, фронтотемпоральной деменции, болезни Паркинсона, психического заболевания и нейродегенеративного заболевания. В настоящем изобретении фармацевтическую композицию можно применять для улучшения дисфункций мозга, например, дисфункции головного мозга, вызванной сердечно-сосудистыми заболеваниями, черепно-мозговой травмой, опухолью головного мозга, вирусным энцефалитом, гипоксической энцефалопатией и алкогольной интоксикацией. Настоящее изобретение можно применять, в частности, для когнитивных дисфункций, таких как нарушение памяти, дефицит внимания, расстройство исполнительной функции и нарушение социального поведения. Примеры когнитивной дисфункции включают нейродегенеративное заболевание (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Пика и болезнь Гентингтона и т.д.), психическое заболевание (шизофрения, биполярное расстройство, депрессия, фобия, расстройство сна, наркомания и т.д.) и общее расстройство развития (аутизм, синдром Аспергера, умственная отсталость, расстройство гиперактивности, тиковое расстройство и т.д.).

В настоящем изобретении примеры диабетического осложнения включают гипергликемию, диабетическую кому, кетоновую кому, некетотическую гиперосмолярную кому, лактоацидоз, гипогликемическую кому, острую инфекцию, микроангиопатию, диабетическую ретинопатию, диабетическую нефропатию, диабетическую невропатию, макроангиопатию, церебральные сосудистые заболевания, ишемическую болезнь сердца, диабетическую гангрену, гиперлипидемию, хроническую инфекцию, желчекаменную болезнь и катаракту.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединение, представленное формулой (I), его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль используют в качестве ингибитора канала Kir6.2 или ингибитора канала Kir6.1. Более конкретно, соединение, представленное формулой (I), его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль можно использовать для лечения или профилактики заболевания, в которое вовлечен канал Kir6.2, такого как когнитивное заболевание или расстройство, гипергликемия, диабет и диабетическое осложнение; и для лечения или профилактики заболевания, в которое вовлечен канал Kir6.1, такого как когнитивное заболевание или расстройство, гипергликемия, диабет, диабетическое осложнение и психическое заболевание.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может иметь различные лекарственные формы. Примеры лекарственных форм для перорального введения включают таблетку, капсулу, порошкообразный препарат, гранулу, пилюлю, жидкий препарат, эмульсию, суспензию, раствор, спрей, сироп, экстракт и эликсир. Примеры лекарственных форм для парентерального введения включают инъекцию, такую как подкожная инъекция, внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, внутрибрюшинная инъекция; чрескожное введение или пластырь, а также мазь или лосьон. Примеры лекарственных форм для интраорального введения включают сублингвальную форму и пероральный пластырь. Примеры назального введения включают аэрозоль. Однако лекарственные формы не ограничиваются этим. Эти препараты можно получить способами, известными в данной области и обычно используемыми для формулирования лекарственных средств.

Фармацевтическая композиция может содержать различные обычно используемые компоненты; например, может содержать по меньшей мере один тип фармакологически приемлемого эксципиента, разрыхлителя, разбавителя, смазывающего вещества, ароматизатора, красителя, подсластителя, корригента, суспендирующего вещества, смачивающего вещества, эмульгатора, диспергирующего вещества, адъюванта, консерванта, буфера, связующего, стабилизатора и агента покрытия. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может представлять собой форму пролонгированного действия или форму замедленного высвобождения.

Дозу терапевтического средства, профилактического средства или фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно соответствующим образом выбрать в зависимости от, например, способа введения, размера тела, возраста, физического состояния пациента, тяжелого или слабого симптома заболевания и периода заболевания после начала заболевания. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать терапевтически эффективное количество и/или профилактически эффективное количество соединения, представленного формулой (I). В настоящем изобретении соединение, представленное формулой (I), можно использовать обычно при дозе 1-1000 мг/день для взрослого пациента или от 0,01 до 20 мг/день/кг массы тела. Введение фармацевтической композиции

- 10 043204 может быть разовым или с использованием нескольких доз.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать, если необходимо, компоненты, известные в данной области, такие как краситель, консервант, химический ароматизатор, отдушка, агент покрытия, антиоксидант, витамин, аминокислота, пептид, белок и минерал (железо, цинк, магний, йод и т.д.). Терапевтическое средство или профилактическое средство по настоящему изобретению может иметь лекарственные формы, подходящие, например, для фармацевтической композиции, функциональной пищи, здоровой пищи, напитка и добавки, например, твердые препараты, такие как гранула (включая сухой сироп), капсула (мягкая капсула, твердая капсула), таблетка (включая жевательную лекарственную форму), порошкообразная лекарственная форма (порошок) и пилюля, или жидкие препараты, такие как раствор для внутреннего введения (включая жидкое лекарственное средство, суспензию, сироп). Терапевтическое средство или профилактическое средство по настоящему изобретению можно использовать непосредственно, например, в виде фармацевтической композиции, функционального пищевого продукта, здорового питания и добавки.

Примеры добавок для формулирования лекарственного продукта включают эксципиент, смазывающее вещество, связующее, разрыхлитель, разжижающую добавку, диспергирующее вещество, смачивающее вещество, консервант, загуститель, модификатор рН, краситель, ароматизатор, поверхностноактивное вещество и солюбилизирующее вещество. Для формулирования жидкого лекарственного средства можно добавить в смесь загуститель, такой как пектин, ксантановая камедь и гуаровая камедь. Кроме того, таблетки с покрытием можно получить с использованием агента покрытия, и может быть образован пастообразный клей. В случае других лекарственных форм лекарственные продукты можно получить в соответствии с обычным способом.

Примеры

Настоящее изобретение будет более конкретно описано при помощи примеров; однако, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Пример 1.

о

H₃C

^ph и ^ptLiCI, THF;

TMSCI

о

X

N СН_}

ЕЮОС

TMSOTf

CH₂CI₂

TiCI₄

СН₂С1₂ о

н₃с

С1

Н₃С

ТР-010

CI

Химическая формула 5

К раствору бис((R)-1-фенилэтил)амина (1,8 г, 18 ммоль) в THF (30 мл) добавляли по каплям раствор n-BuLi в гексане (1,56 М, 4,8 мл, 7,33 ммоль) при охлаждении льдом. Реакционный раствор перемешивали в течение 30 мин при этой же температуре, реакционный раствор охлаждали до температуры -78°С. Затем добавляли триметилсилилхлорид (TMSCl, 1,7 мл, 13,3 ммоль) и после этого добавляли раствор 7-метиленбицикло[3.3.1]нонан-3-она (1,0 г, 16,6 ммоль) в THF (5 мл) через канюлю. После перемешивания в течение 1 ч к реакционному раствору добавляли воду и раствор экстрагировали диэтиловым эфиром. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=9:1) с получением целевого вещества, TMS енолового эфира (1,24 г, 84%) в виде бес цветного масла.

Полученный TMS еноловый эфир (400 мг, 1,80 ммоль) и этил (Е)-2-(ацетилимино)ацетат (5,4 ммоль), полученный в соответствии со способом, раскрытым в литературе (Kobayashi S et al., J. Combi. Chem., 2001, 3, 401), растворяли в дихлорметане (9 мл). Реакционный раствор охлаждали до 0°С. К этому раствору добавляли триметилсилилтрифторметансульфонат (TMSOTf, 240 мл, 900 ммоль). Раствор перемешивали при этой же температуре в течение 1 ч и затем добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ для остановки реакции. Реакционный раствор экстрагировали этилацетатом. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением неочищенного продукта (410 мг, масло) реакции Манниха. Неочищенный продукт (400 мг) растворяли в дихлорметане (7 мл) и охлаждали до -30°С. К раствору добавляли TiCl₄ (120 мл, 1,09 ммоль). После перемешивания раствора в течение 1 ч при этой же температуре добавляли воду для остановки реакции. Раствор экстрагировали диэтиловым эфиром. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и затем сушили над MgSO4, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=10:1 до 9:1) с получением ТР010 (148 мг, 25%) и

- 11 043204

ТР-011 (228 мг, 52%).

ТР-010 (84% эи): аморфный;

[a]D²⁹=3,4 (c=1,832, CHCl₃); (1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 6,15 (д, J=8,8 Гц, 1Н), 4,90 (т, J=9,6 Гц, 1Н), 4,22-4,15 (м, 2Н), 3,00 (с, 1Н), 2,29 (шир.с, 1Н), 2,15-1,95 (м, 8Н), 2,04 (с, 3Н), 1,85-1,78 (м, 2Н), 1,50 (шир.д, J=12,7 Гц, 1Н), 1,37 (шир.д, J=13,4 Гц, 1Н), 1,28 (т, J=7,3 Гц, 3Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl₃): δ 173,1, 170,3, 70,8, 66,6, 61,8, 56,7, 51,8, 51,7, 47,9, 46,6, 37,7, 33,3, 31,8, 29,4, 23,4, 14,0;

ИК (без растворителя, см^-1): 3336, 1725, 1654;

MS (EI): m/z 329 (М⁺), 256 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₁₆H₂₄NO₄Cl (M+) 329,1394, найдено 329,1399.

ТР-011 (84% эи): т. пл. 65-68°С (Et₂O-н-гексан);

[a]D²⁹=-2,4 (с=1,72, CHCl3);

1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,64 (шир.с, 1Н), 4,42 (д, J=10,1, 3,9 Гц, 1Н), 4,20 (кв., J=7,1 Гц, 2Н), 3,70 (с, 1Н), 2,30 (шир.с, 1Н), 2,20-1,88 (м, 9Н), 1,98 (с, 3Н), 1,88 (шир.д, J=13,9 Гц, 1Н), 1,57 (шир.д, J=12,5 Гц, 1Н), 1,38 (шир.д, J=12,5 Гц, 1н), 1,28 (т, J=7,1 Гц, 3Н);

13С-ЯМР (100 МГц, CDCl₃): δ 171,7, 170,4, 72,6, 66,0, 61,1, 56,6, 55,1, 48,9, 47,3, 46,2, 38,3, 34,3, 31,8, 29,0, 22,9, 14,1;

ИК (без растворителя, см^-1): 3377, 1739, 1650;

MS (EI): m/z 329 (М⁺), 256 (100%);

HRMS (EI) : рассчитано для C₁₆H₂₄NO₄Cl (M+) 329,1394, найдено 329,1415.

Пример 2.

ТР-013 о о кат. RuCI₃-3H₂O сАш Д. H₂N пн

НЮ₄-2Н₂О ^F3^C 00CF₃ 2MNaOH

MaCN СП Η о- ^Г MeO₂CrA0 THF Lil

Μ6ϋΐΜ-υυΐ4-ΓΊ2νΛ f I ch₂n₂ ZkA^cl

Et₂O

TP-012 TP-015

Химическая формула 6

К раствору (1R,2S,5S)-2-((R)-гидрокси(фенил)метил)-7-метиленбицикло[3.3.1]нонан-3-она (750 мг,

2,9 ммоль), который был получен в соответствии со способом, описанным в J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 17591-17600, дифенилфосфатазида (DPPA, 820 мл, 3,81 ммоль) и трифенилфосфина (1,20 г, 4,4 ммоль) в THF (15 мл) добавляли при охлаждении льдом диизопропилазодикарбоксилат (DIAD, 2,2 мл, 4,4 ммоль).

После перемешивания в течение 1 ч при этой же температуре растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли дихлорметан (15 мл) и добавляли при охлаждении льдом TiCl₄ (820 мл, 2,3 ммоль). После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение 4 ч добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом. Реакционный раствор фильтровали через Целит (зарегистрированная торговая марка). Фильтрат экстрагировали диэтиловым эфиром. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат= 10:1) с получением (1 R,2S,3R,5R,7R)-2-((S)-азидо(фенил)метил)-5-хлорадамантан-1 -ола (756 мг, 92%) в виде белого твердого вещества.

К раствору полученного азидного соединения (750 мг, 2,67 ммоль) в THF (14 мл) добавляли LiAlH₄(300 мг, 8,00 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания в течение 1 ч при этой же температуре к реакционному раствору добавляли водный раствор аммиака. Реакционный раствор фильтровали через Целит (зарегистрированная торговая марка), растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли дихлорметан (15 мл) и затем добавляли при охлаждении льдом триэтиламин (2,2 мл, 16,0 ммоль) и безводную трифторуксусную кислоту (TFAA, 1,2 мл, 8,0 ммоль). После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение ночи добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ раствор. Реакционный раствор экстрагировали дихлорметаном. Полученный органический слой сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток подвергали коло

- 12 043204 ночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=15:1) с получением ТР-013 (871 мг, 56%) в виде белого твердого вещества.

Т. пл. 83-85°С (бесцветные игольчатые кристаллы, н-гексан-Et₂O);

[α%³¹=-84,1 (c=1,08, CHCI3);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,35-7,27 (м, 5Н), 6,63 (д, J=11,1 Гц, 1Н), 5,44 (т, J=10,4 Гц, 1Н), 3,26 (д, J=11,1 Гц, 1Н), 2,99 (д, J=11,1 Гц, 1Н), 2,45-2,41 (м, 3Н), 2,26-2,13 (м, 5Н), 1,96 (шир.д, J=12,4 Гц, 2Н), 1,47 (шир.д, J=14,0 Гц, 1Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl₃): δ 156,2 (кв., J=37,4 Гц), 154,9 (кв., J=42,3 Гц), 139,1, 129,2, 128,7, 127,1, 115,8 (кв., J=288,1 Гц), 113,3 (кв., J=287,3 Гц), 86,6, 65,1, 53,4, 50,2, 48,0, 46,9, 46,1, 35,6, 34,6, 31,7, 28,5;

ИК (без растворителя, см^-1): 3296, 2945, 1775, 1698;

MS (EI): m/z 483 (М⁺), 202 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₂₁H₂₀ClF₆NO₃ (M⁺) 483,1036, найдено 483,1046.

К раствору, содержащему ТР-013 (550 мг, 1,14 ммоль) в ацетонитриле (1,8 мл)-тетрахлориде углерода (1,8 мл)-воде (1,8 мл) добавляли при охлаждении льдом RuCl₃x3H₂O (114 ммоль) и Н1О₄х2Н₂О (3,6 г, 16,0 ммоль). Реакционный раствор интенсивно перемешивали при этой же температуре в течение 8 ч. К реакционному раствору добавляли воду. Реакционный раствор экстрагировали дихлорметаном. К полученному органическому слою добавляли раствор диазометана в диэтиловом эфире при охлаждении льдом, пока раствор не стал желтым. Через 30 мин раствор продували азотом для удаления диазометана и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=15:1) с получением ТР-012 (235 мг, 44%) в виде белого твердого вещества.

[a]D²⁴=-22,7 (с=1,84, CHCI3);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDC13): δ 7,10 (д, J=9,8 Гц, 1Н), 5,02 (д, J=10,1 Гц, 1Н), 3,76 (с, 3Н), 2,92 (дд, J=10,3, 2,0 Гц, 1Н), 2,74 (д, J=11,5 Гц, 1Н), 2,69 (дд, J=11,5, 1,7 Гц, 1Н), 2,43 (шир.с, 1Н), 2,30-2,10 (м, 7Н), 1,86 (д, J=14,1 Гц, 1Н), 1,46 (д, J=14,1 Гц, 1Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDC13): δ 171,1, 157,1 (кв., J=37,9 Гц), 155,2 (кв., J=41,2 Гц), 115,5 (кв., J=285,4 Гц), 113,8 (кв., J=284,6 Гц), 87,0, 64,8, 53,0, 51,3, 49,8, 47,6, 46,5, 45,9, 34,2, 33,5, 31,7, 28,8;

ИК (без растворителя, см-¹): 3319, 1780, 1714;

MS (EI): m/z 406 (М-СО2СН3);

HRMS (EI): рассчитано для C₁₅H₁₅NO₃F₆Cl (M+) 406,0645, найдено 406,0651.

К раствору ТР-012 (256 мг, 550 ммоль) в THF (2,0 мл) добавляли водный раствор NaOH (2 М, 2,0 мл) при охлаждении льдом. Реакционный раствор перемешивали в течение 2 ч. THF отгоняли, затем реакционный раствор нейтрализовали 10% водным раствором HCl, подвергали ионообменной хроматографии (DOWEX50), элюировали 0,23 N водным раствором хлорида аммония и подвергали лиофилизации с получением ТР-015 (48,5 мг, 34%) в виде белого твердого вещества.

[a]_D ²⁸=-46,3 (с=0,78, МеОН);

¹Н-ЯМР (600 МГц, CD3OD): δ 3,87 (д, J=9,6 Гц, 1Н), 2,26 (шир.с, 1Н), 2,19 (шир.с, 1Н), 2,12 (д, J=10,9 Гц, 1Н), 2,08 (д, J=12,4 Гц, 1Н), 1,80-1,62 (м, 5Н), 1,66 (шир.с, 2Н), 1,50 (шир.д, J=12,4 Гц, 1Н), 1,37 (шир.д, J=13,1 Гц, 1Н);

¹³С-ЯМР (150 МГц, CD3OD): δ 174,6, 70,3, 68, 6, 54,7, 53,8, 49,4, 44,3, 43,4, 38,7, 32,9, 30,9, 29,2;

ИК (без растворителя, см-¹): 3336, 1730;

MS (FAB): m/z 242 (M+1);

HRMS (FAB): рассчитано для C₁₂H₂₀NO₄ (M+1) 242,1387, найдено 252,1383.

Пример 3.

^н9 н о ^Ас2° ^Ас9 н о ^tmsn3 ^Ас9 н 9^н

Et₃N, DMAP BF₃OEt₂O сн₂С1₂ CH₂ci₂

TP-009

Химическая формула 7

К раствору (1R,2S,5S)-2-((R)-гидрокси(фенил)метил)-7-метиленбициkло[3.3.1]нонан-3-она (256 мг, 1,00 ммоль) в дихлорметане (5 мл) добавляли триметиламин (0,42 мл, 3 ммоль), диметиламинопиридин (DMAP, 12 мг, 0,1 ммоль) и безводную уксусную кислоту (0,14 мл, 1,5 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение 20 мин добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом и экстрагировали дихлорметаном. Полученный органический слой сушили над MgSO₄ и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=4:1) с получением (1R,2S,5S)-2-((R)-ацетокси(фенил)метил)-7-метиленбициkло[3.3.1]нонан-3-она (289 мг, 97%) в виде белого твердого вещества.

К раствору полученного продукта (75,2 мг, 0,252 ммоль) в дихлорметане (2,5 мл) добавляли триметилсилилазид (TMSN3, 0,10 мл, 0,76 ммоль) и BF₃xOEt₃ (0,04 мл, 0,30 ммоль) при -20°С. Температуру

- 13 043204 реакционного раствора постепенно повышали до комнатной температуры и реакционный раствор перемешивали в течение 3 ч. После этого к реакционному раствору добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом. Полученный реакционный раствор экстрагировали дихлорметаном. Полученный органический слой сушили над MgSO₄ и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=2:1) с получением ТР-009 (33,5 мг, 39%) в виде белого твердого вещества.

Т. пл. 114°С (бесцветные кристаллы, H-гексан-Et₂O);

[a]D¹⁹=+56,0 (с=0,67, CHCl₃);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,37-7,31 (м, 5Н), 6,01 (д, J=10,6 Гц, 1Н), 2,95 (шир.с, 1Н), 2,27 (шир.с, 1Н), 2,25 (д, J=10,6 Гц, 1Н), 2,15 (д, J=13,0 Гц, 1Н), 2,01 (с, 3Н), 1,89-1,83 (м, 2Н), 1,76-1,61 (м, 7Н), 1,18 (д, J=13,0 Гц, 1Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl₃): δ 169,6, 138,9, 128,7, 128,5, 127,3, 77,0, 71,3, 60,0, 51,9, 50,7, 41,6, 40,4, 38,8, 32,5, 30,6, 29,3, 21,6;

ИК (без растворителя, см^-1): 3460, 2931, 2091, 1732;

MS (EI): m/z 323 (М+-Н2О), 107 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₁₉H₂₁N₃O₂ (М+-Н2О) 323,1634, найдено: 323,1613.

Пример 4.

TP-014

Химическая формула 8

К раствору бис ((S)-1-фенилэтuл)амина (10,0 мл, 44 ммоль) и хлорида лития (3,4 г, 80 ммоль) в THF (100 мл) добавляли по каплям раствор н-бутиллития в гексане (1,56 М, 28,2 мл, 44 ммоль) при охлаждении льдом. Реакционный раствор перемешивали при этой же температуре в течение 30 мин и затем охлаждали до -78°С. К реакционной смеси добавляли раствор 7-метиленбицикло[3.3.1]нонан-3-она (6,00 г, 40 ммоль) в THF (60 мл) через канюлю. После перемешивания реакционного раствора в течение 1 ч добавляли раствор бензальдегида (6,1 мл, 60 ммоль) в THF (40 мл) через канюлю. После перемешивания реакционного раствора в течение 2 ч к реакционному раствору последовательно добавляли уксусную кислоту и насыщенный водный раствор хлорида аммония. Реакционный раствор экстрагировали диэтиловым эфиром. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=4:1) с получением (1S,2R,5R)-2-((S)-гидрокси(фенил)метил)7-метиленбицикло[3.3.1]нонан-3-она (8,3 г, 81%) в виде белого твердого вещества. Это вещество перекристаллизовывали из диэтилового эфира с получением бесцветных игольчатых кристаллов.

Т. пл. 122°С;

[a]_D ²¹=-17,9 (c=0,32, CHCl₃);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,38-7,25 (м, 5Н), 4,79 (д, J=1,8 Гц, 1Н), 4,76 (д, J=1,8 Гц, 1Н), 4,71 (д, J=6,8 Гц, 1Н), 2,90 (с, 1Н), 2,64 (дд, J=15,7, 6,8 Гц, 1Н), 2,48-2,18 (м, 6Н), 2,01 (шир.д, J=14,3 Гц, 1Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl₃): δ 211,0, 141,6, 128,8, 127,6, 114,8, 74,6, 62,7, 45,7, 42,2, 41,3, 32,4, 31,9, 28,4;

ИК (без растворителя, см^-1): 3390, 1711;

MS (EI): m/z 256 (М⁺), 95 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для С₁₇Н₂₀О₂ (M+) 256,1463, найдено 256,1450.

К раствору (1S,2R,5R)-2-((S)-гидрокси(фенuл)метил)-7-метиленбицикло[3.3.1]нонан-3-она (2,00 г, 7,5 ммоль), DPPA (2,3 мл, 11 ммоль) и трифенилфосфина (3,0 г, 11 ммоль) в THF (38 мл) добавляли DIAD (2,2 мл, 11 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания в течение 1 ч при этой же температуре растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли дихлорметан (38 мл) и добавляли при охлаждении льдом TiCl₄ (0,8 мл, 7,5 ммоль). После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение 4 ч добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом. Реакционный раствор фильтровали через Целит (зарегистрированная торговая марка) и фильтрат экстрагировали диэтиловым эфиром. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и к остатку добавляли тетрагидропиран (ТНР, 40 мл). К смеси добавляли LiAlH₄ (430 мг, 11 ммоль) при охлаждении

- 14 043204 льдом. Реакционную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 30 мин и к реакционному раствору добавляли водный раствор аммиака. Реакционный раствор фильтровали через Целит (зарегистрированная торговая марка) и растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли дихлорметан (40 мл) и затем добавляли триэтиламин (6,3 мл, 45 ммоль) и TFAA (3,2 мл, 23 ммоль) при охлаждении льдом. Полученный реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ и затем экстрагировали дихлорметаном. Полученный органический слой сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=15:1) с получением неочищенного продукта в виде белого твердого вещества. Это вещество перекристаллизовывали из диэтилового эфира-гексана с получением ТР-014 (1,27 г, 35%) в виде белого твердого вещества.

Т. пл. 89°С;

[α] d²¹=+89,1 (с=0,31, CHCl₃);

ИК (без растворителя, см-¹): 3296, 2945, 1775, 1698;

MS (EI): m/z 483 (М⁺), 202 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₂₁H₂₀ClF₆NO₃ (M⁺) 483,1036, найдено 483,1046;

Анал.: рассчитано для C₂₁H₂₀ClF₆NO₃: С, 52,13; Н, 4,17;

N, 2,89; найдено С, 52,27; Н, 4,18; N, 2,88.

Пример 5.

ТР-014 ТР-048

Химическая формула 9

К раствору ТР-014 (84,7 мг, 0,175 ммоль) в THF (2 мл) добавляли 0,5 М водный раствор NaOH (1 мл) при охлаждении льдом. Реакционный раствор перемешивали при этой же температуре в течение 15 мин и добавляли насыщенный водный раствор NH4Cl и экстрагировали этилацетатом. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=8:1 до 4:1) с получением ТР-048 (65,5 мг, 96%) в виде белого твердого вещества.

[a]D²⁶=+109,2 (c=0,772, CHCI3);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCI3): δ 7,41-7,32 (м, 5Н), 6,98 (шир., 1Н), 5,34 (т, J=9,7 Гц, 1Н), 2,36-2,29 (м, 3Н), 2,19-2,00 (м, 7Н), 1,77 (шир.д, J=11,6 Гц, 1Н), 1,41-1,33 (м, 2Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCI3): δ 156,2 (кв., J=37,1), 140,5, 129,4, 128,6, 127,4, 115,8 (кв., J=288,1 Гц), 72,3, 66,1, 56,7, 54,2, 52,4, 47,7, 46,3, 38,6, 34,4, 31,8, 28,8;

ИК (без растворителя, см-¹): 3553, 3297, 2940, 1698, 1552, 1208, 1183, 1165;

MS (EI): m/z 387 (М⁺), 202 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₁₉H₂₁C1F₃NO₂ (M+) 387,1213, найдено 387,1196.

Пример 6.

о 9 о о о

X А у А А

F₃C^O H^HN ^CF3 f3Ao hhn CF3 ho h^hn cf3 rvA^Ph AIBN, <^Me3^s')3^SiH А-фАрь °·^{5 M Na0H водн}· гАт Ph толуол, vJA ^THF AjA обратный холодильник ^TP’⁰¹⁴ TP-049 TP-052

Химическая формула 10

К раствору ТР-014 (30,0 мг, 0,062 ммоль) в толуоле (2 мл) добавляли трис(триметилсилил)силан (29 мл, 0,095 ммоль) и азобисизобутиронитрил (AIBN, 2,0 мг, 0,012 ммоль) при комнатной температуре. Реакционный раствор нагревали с обратным холодильником в течение ночи, затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=15:1) с получением ТР-049 (23,0 мг, 83%) в виде белого твердого вещества.

[a]D²⁹=+106,4 (c=0,385, CHCI3);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCI3): δ 7,33-7,27 (м, 5Н), 6,31 (шир.д, J=10,1 Гц, 1Н), 5,50 (дд, J=10,9, 10,1 Гц, 1Н), 3,20 (шир.д, J=10,9 Гц, 1Н), 2,60 (шир.д, J=11,6 Гц, 1Н), 2,45 (шир.д, J=12,1 Гц, 1Н), 2,28-2,27 (м,

- 15 043204

3Н), 2,04-1,80 (м, 6Н), 1,72 (шир.с, 2Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCI3): δ 156,0 (кв., J=37,1 Гц), 155,1 (кв., J=41,8 Гц), 139,8, 129,0, 128,4, 127,2, 115,8 (кв., J=288,1 Гц), 113,5 (кв., J=287,3 Гц), 87,5, 53,6, 49,4, 41,3, 37,2, 36,1, 33,0, 30,6, 30,4, 30,2;

ИК (без растворителя, см^-1): 3335, 2927, 1775, 1700, 1556, 1218, 1169;

MS (EI): m/z 449 (М⁺), 202 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₂₁H21F₃NO₃ (М⁺) 449,1426, найдено 449,1447.

К раствору ТР-049 (61,5 мг, 0,137 ммоль) в THF (1,4 мл) добавляли водный раствор NaOH (0,5 М, 0,5 мл) при охлаждении льдом. После перемешивания реакционного раствора при этой же температуре в течение 5 мин к реакционному раствору добавляли 2 М хлористоводородной кислоты. Реакционный раствор экстрагировали этилацетатом. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=4:1 до 2:1) с получением ТР-052 (49,4 мг, количественн.) в виде белого твердого вещества.

ТР-052: [α] d¹⁴=+130, 7 (с=0,243, СНС1з);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,39-7,31 (м, 5Н), 6,77 (шир.д, J=8,9 Гц, 1Н), 5,40 (дд, J=9,7, 8,9 Гц, 1Н), 2,32 (шир.д, J=9,7 Гц, 1Н), 2,31-2,07 (м, 4Н), 1,85-1,79 (м, 2Н), 1,72-1,57 (м, 5Н), 1,52-1,44 (м, 2Н), 1,29 (шир., 1Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl3): δ 156,1 (кв., 37,1 Гц), 140,7, 129,4, 128,5, 127,5, 115,9 (кв., 288 Гц), 77,2, 54,3, 53,0, 50,5, 48,5, 41,4, 39,6, 39,4, 33,2, 30,6, 29,6;

ИК (без растворителя, см^-1): 3566, 3291,2919, 1698, 1183;

MS (EI) : m/z 353 (М⁺), 151 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₁₉H₂2F₃NO2 (М⁺) 353,1603, найдено 353,1604.

Пример 7.

Химическая формула 11

К раствору (1S,2R,5R)-2-(R-азидо(фенил)метил)-7-метиленбицикло[3.3.1.]нонан-3-она (57,4 мг, 0,204 ммоль) в дихлорметане (2 мл) последовательно добавляли 2-метоксиэтанол (78 мл, 1,0 ммоль) и трифторметансульфонат скандия (5,0 мг, 0,01 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение двух дней добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом. Реакционный раствор экстрагировали дихлорметаном. Полученный органический слой сушили над MgSO₄ и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=1:2 до 1:1) с получением (1S,2R,3S,5S,7S)-2-((R)-азидо(фенил)метил)-5-(2-метоксиэтокси)адамантан-1-ола (41,2 мг, 56%) в виде бесцветного масла.

К раствору полученного азидного соединения (39,6 мг, 0,111 ммоль) в THF (1 мл) добавляли LiAlH₄(8,0 мг, 0,21 ммоль) при охлаждении льдом. Температуру реакционного раствора постепенно повышали до комнатной температуры и реакционный раствор перемешивали в течение 1 ч. Реакционный раствор охлаждали льдом и затем добавляли LiAlH4 (8,0 мг, 0,21 ммоль). После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение 1 ч к реакционному раствору добавляли водный раствор аммиака при охлаждении льдом. Реакционный раствор фильтровали через Целит (зарегистрированная торговая марка). Фильтрат сушили над Na₂SO₄ и растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли дихлорметан (1 мл), затем добавляли триэтиламин (77 мл, 0,56 ммоль) и безводную трифторуксусную кислоту (TFAA, 47 мл, 0,33 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение 5 ч добавляли насыщенный водный раствор NaHCO3 при охлаждении льдом. Реакционный раствор экстрагировали дихлорметаном. Полученный органический слой сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=1:4 до 1:2) с получением ТР-050 (31,6 мг, 54%) в виде бесцветного масла.

[α]π²⁵=+72,1 (c=0,965, СНС1з);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,34-7,23 (м, 5Н), 6,33 (шир.д, J=9,9 Гц, 1Н), 5,44 (дд, J=10,9, 9,9 Гц, 1Н), 3,59-3,56 (м, 2Н), 3,51-3,48 (м, 2Н), 3,37 (с, 3Н), 3,17 (шир.д, J=10,9 Гц, 1Н), 2,65 (шир.д, J=10,6 Гц, 1Н), 2,43-2,37 (м, 3Н), 1,95-1,81 (м, 7Н), 1,38 (шир.д, J=11,6 Гц, 1Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl3): δ 156,1 (кв., J=37,4 Гц), 154,9 (кв., J=42,1 Гц), 139,4, 129,1, 128,5, 127,2, 115,8 (кв., J=288,1 Гц), 113,4 (кв., J=287,3 Гц), 87,6, 73,7, 72,3, 60,2, 59,1, 53,5, 48,5, 45,0, 41,1, 39,9, 36,3, 30,5, 29,2;

ИК (без растворителя, см^-1): 3303, 2936, 1775, 1698, 1554, 1221, 1172;

- 16 043204

MS (EI): m/z 523 (М+), 202 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₂₄H₂₇F₆NO₅ (M+) 523,1793, найдено 523,1797.

Пример 8.

TP-053

Химическая формула 12

К раствору (1S,2R,5R)-2-(R-азидо(фенил)метил)-7-метиленбицикло[3.3.1.]нонан-3-она (238 мг, 0,848 ммоль) в метаноле (8,5 мл) добавляли трифторметансульфонат скандия (20 мг, 0,04 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение 18 ч к реакционному раствору добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом. Реакционный раствор экстрагировали этилацетатом. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄ и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=1:4 до 1:2) с получением (1S,2R,3S,5S,7S)-2-((R)-азидо(фенил)метил)-5-метоксиадамантан-1-ола (225 мг, 85%) в виде бес цветного масла.

К раствору полученного азидного соединения (225 мг, 0,716 ммоль) в THF (4 мл) добавляли LiAlH₄(41 мг, 1,1 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания в течение 1 ч при этой же температуре к реакционному раствору добавляли водный раствор аммиака. Реакционный раствор фильтровали через Целит (зарегистрированная торговая марка) и растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли дихлорметан (4 мл) и добавляли при охлаждении льдом триэтиламин (497 мл, 3,86 ммоль) и безводную трифторуксусную кислоту (TFAA, 299 мл, 2,15 ммоль). После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение 40 ч добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом. Реакционный раствор экстрагировали дихлорметаном. Полученный органический слой сушили над MgSO₄ и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=1:8 до 1:2) с получением ТР-053 (262 мг, 75%) в виде белого твердого вещества.

[a]D¹⁴=+97,2 (с=0,179, CHCl₃);

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,33 (м, 5Н), 6,35 (шир.д, J=9, 9 Гц, 1Н), 5,45 (дд, J=10,6, 9,9 Гц, 1Н), 3,25 (с, 3Н), 3,17 (шир.д, J=10,6 Гц, 1Н), 2,61 (br d J=10,6 Гц, 1Н), 2,45-2,37 (м, 3Н), 1,97-1,73 (м, 7Н), 1,39 (шир.д, J=13,5 Гц, 1Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl3): δ 156,0 (кв., J=37,4 Гц), 155,0 (кв., J=41,8 Гц), 139,4, 129,1, 128,6, 127,1, 115,8 (кв., 288,1 Гц), 113,4 (кв., 287,0 Гц), 87,7, 75,5, 53,5, 48,7, 48,6, 44,5, 40,8, 39,5, 36,3, 33,3, 30,4, 29,3;

ИК (без растворителя, см^-1): 3299, 2941, 1776, 1697, 1221, 1172;

MS (EI): m/z 479 (М⁺), 202 (100%);

HRMS (EI): рассчитано для C₂₂H₂₃F₆NO₄ (М⁺) 479,1531, найдено 479,1486.

Пример 9.

о

ТР-051

Химическая формула 13

К раствору бис((S)-1-фенилэтил)амина (2,5 мл, 11 ммоль) и хлорида лития (850 мг, 20 ммоль) в THF (25 мл) добавляли по каплям раствор н-бутиллития в гексане (1,56 М, 7,1 мл, 11 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания реакционного раствора при этой же температуре в течение 30 мин реакционный раствор охлаждали до -78°С. К реакционной смеси добавляли раствор 7-метиленбицикло[3.3.1]нонан3-она (1,52 г, 10 ммоль) в THF (15 мл) через канюлю. После перемешивания реакционного раствора в течение 30 мин добавляли раствор никотинальдегида (1,1 мл, 12 ммоль) в THF (10 мл) через канюлю. После перемешивания реакционного раствора в течение 40 мин к реакционному раствору последовательно добавляли уксусную кислоту и насыщенный водный раствор хлорида аммония. Реакционный раствор экстрагировали этилацетатом. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над K2CO3. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали

- 17 043204 колоночной хроматографии на силикагеле (гексан-ацетон=3:2 до 1:2) с получением (1S,2R,5R)-2-((S)гидрокси(пиридин-3-ил)метил)-7-метиленбицикло[3.3.1]нонан-3-она (2,7 г, 81%) в виде белого твердого вещества. Это вещество перекристаллизовывали из этилацетата с получением бесцветны кристаллов (99% эи).

К раствору полученного спирта (258 мг, 1,0 ммоль), дифенилфосфатазида (DPPA, 237 мл, 1,1 ммоль) и трифенилфосфина (239 мг, 1,1 ммоль) в THF (5 мл) добавляли диизопропилазодикарбоксилат (DIAD, 214 мл, 1,1 ммоль) при охлаждении льдом. Температуру реакционного раствора постепенно повышали до комнатной температуры. После перемешивания реакционного раствора в течение 5 ч растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=4:1 до 2:1) с получением (1S,2R,5R)-2-((R)-азидо(пиридин-3-ил)метил)-7метиленбицикло[3.3.1]нонан-3-она (187 мг, 66%) в виде бесцветного масла.

К раствору полученного азидного соединения (187 мг, 0, 66 ммоль) в дихлорметане (7 мл) добавляли TiCl₄ (300 мл, 0,27 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания реакционного раствора при комнатной температуре в течение 3 ч добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом. Реакционный раствор экстрагировали диэтиловым эфиром. Полученный органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и полученное твердое вещество промывали холодным диэтиловым эфиром с получением (1S,2R,3S,5S,7S)-2-((R)-азидо(пиридин-3-ил)метил)-5-хлорадамантан-1-ола (98,5 мг, 92%).

К раствору полученного соединения (75,4 мг, 0,257 ммоль) в THF (2 мл) добавляли LiAlH₄ (23 мг, 0,61 ммоль) при охлаждении льдом. После перемешивания реакционного раствора в течение 1 ч при этой же температуре к реакционному раствору добавляли водный раствор аммиака при охлаждении льдом. Реакционный раствор фильтровали через Целит (зарегистрированная торговая марка) и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (СНС1₃:метанол=1:0 до 4:1) с получением неочищенного амина.

К полученному неочищенному амину добавляли дихлорметан (2 мл) и затем добавляли при охлаждении льдом триэтиламин (17 8 мл, 1,28 ммоль) и безводную трифторуксусную кислоту (TFAA, 107 мл, 0,76 ммоль). Температуру реакционного раствора повышали до комнатной температуры. После перемешивания реакционного раствора в течение 4 часов добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃ при охлаждении льдом. Реакционный раствор экстрагировали дихлорметаном. Полученный органический слой сушили над Na₂SO₄. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=2:1 до 1:4) с получением ТР-051(48,8 мг, 49%) в виде белого твердого вещества.

[a]D²⁰=+53,9 (с=0,379, CHCI3);

1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 8,57 (д, J=1,0 Гц, 1Н), 8,50 (дд, J=4,9, 1,5 Гц, 1Н), 7,72 (шир.д, J=7,8 Гц, 1Н), 7,41 (шир.д, J =9,8 Гц, 1Н), 7,32 (дд, J=7,8, 4,9 Гц, 1Н), 5,35 (дд, J=9,8, 9,3 Гц, 1Н), 2,40-2,38 (м, 2Н), 2,29 (шир.с, 1Н), 2,22-1,99 (м, 7Н), 1,75 (шир., 1Н), 1,68 (шир.д, J=13,7 Гц, 1Н), 1,48 (шир.д, J=13,2 Гц, 1Н), 1,42 (шир.д, J=13,2 Гц, 1Н);

¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl₃): δ 156,4 (кв., J=37,1 Гц), 148,2, 147,7, 138,3, 136,5, 124,0, 115,8 (кв., J=287,8 Гц), 71,9, 66,1, 57,3, 52,6, 51,7, 47,6, 46,3, 38,3, 34,3, 31,6, 28,6;

ИК (без растворителя, см^-1): 3292, 2938, 1700, 1558, 1212, 1184, 1161, 759;

MS (EI): mz 388 (М⁺), 203 (100%);

HRMS (EI) : рассчитано для C₁₈H₂₀ClF₃N₂O2 (M+) 388,1165, найдено 388,1177.

Пример испытаний 1.

Плазмидный вектор, содержащий кДНК Kir6.2 канала, встроенную в него: pcDNA3.1-Kir6.2, получали от Dr. Toru Ishizuka (Graduate School of Life Sciences, Tohoku University). Плазмидный вектор, pcDNA3,1-Kir6.2, кондиционировали в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору GenElute HP Plasmid Maxiprep Kit (изготовитель Sigma-Aldrich). Культуральный раствор (композиция: DMEM культуральный раствор 450 мл, содержащий 50 мл бычьей сыворотки и 100 единиц пенициллина/стрептомицина) Neuro2A клеток (N2A клетки, National Instituted of Biomedical Innovation), культивированных в DMEM культуральном растворе (Gibco), обменивали с Opti-Mem (Gibco)(содержит Липофектамин R2000 (1 мг/1 мл)), содержащим pcDNA3.1-Kir6.2 (1 мг/мл), кондиционированный, как указано выше, и культивировали в течение 5 ч с получением N2A клеток, сверхэкспрессирующих Kir6.2 канал. Снова осуществляли обмен с DMEM культуральным раствором и культивирование осуществляли в течение двух дней. Затем в культуральные растворы (DMEM, Gibco) добавляли мемантин (изготовитель Sigma-Aldrich) и соединение по настоящему изобретению (n=4 на группу) для получения концентрации 10 нМ в расчете на культуральный раствор, и культуральные растворы оставляли выстаиваться в течение 1 ч. Затем сверхэкспрессирующие Kir6.2 канал клетки N2A собирали и к N2A клеткам добавляли SDS буфер для образца с получением суспензии. Суспензию подвергали иммуноблоттингу, используя антифосфорилированное CaMKII антитело (Fukunaga K. et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 22527-22533) в качестве первичного антитела и анти-кроличье IgG антитело (изготовитель SouthernBiotech) в качестве вторичного антитела (другие условия, за исключением того, что указанные выше антитела были такими же,

- 18 043204 которые используют в обычном иммуноблоттинге), для исследования активации CaMKII. В результате, в ТР-009, ТР-010, ТР-011, ТР-012, ТР-014, ТР-015, ТР-048, ТР-049, ТР-050, ТР-051, ТР-052, ТР-053 были получены полосы, показывающие реакцию с антителом против фосфорилированного CaMKII. Было подтверждено, что активация CaMKII усиливается. Результаты показаны на фиг. 1. На фиг. 1 результат для случая (контроль: с), где испытываемое соединение не добавляли, считается за 100%. Активация CaMKII в случаях, содержащих мемантин, ТР-009, ТР-010, ТР-011, ТР-012, ТР-014, ТР-015, ТР-048, ТР-049, ТР-050, ТР-051, ТР-052, ТР-053 (соответствуют, 9, 10, 11, 12,12, 15, 48, 49, 50, 51, 52 и 53 М соответственно), показана на фиг. 1.

Пример испытаний 2.

С использованием Kir6.2 канал-сверхэкспрессирующих клеток, полученных в примере испытаний 1, ток калия, вытекающий из клеток, измеряли обычным пэтч-кламп методом. Результаты показаны на фиг. 2. АТФ-чувствительный калиевый канал (Kir6.2 канал) был локализован в клеточной мембране нервных клеток. Если канал ингибируется и закрывается, порог мембраны нервной клетки повышается, приводя к состоянию, которое аналогично состоянию, где потенциал действия временно генерируется, в результате ток калия вытекает из клетки наружу, а вместо этого ток кальция втекает в клетку снаружи. Фиг. 2а показывает, что Kir6.2 канал сверхэкспрессируется в N2A клетках (верхняя фиг. показывает окрашенные изображения, полученные методом иммуноблоттинга; тогда как нижняя фиг. количественно выражает интенсивность сигнала полос). Это было подтверждено с применением иммуноблоттинга (использовали такие же условия, как в Примере испытаний 1, за исключением анти-Kir6.2 канал антитела, n=5) с антиKir6.2 канал антителом (полученным обычным способом) к Kir6.2 канал-сверхэкспрессирующим клеткам (полученным описанным выше способом). Никакого изменения не наблюдали в конститутивном генном продукте, т.е. β тубулине (анти-β тубулиновое антитело получали от Sigma-Aldrich, и другие условия такие же, как в детекции Kir6.2). Фиг. 2b (подтвержденные результаты) показывает, что, если Kir6.2 канал-сверхэкспрессирующим клеткам дают выстояться в электрофизиологическом экспериментальном буфере, содержащем ТР-014, для получения концентрации 10 нМ, ток калия, который вытекает наружу, когда мембранный потенциал нервных клеток изменяется в сторону плюса, подавляется (n=5 на группу). Результаты показывают, что ТР-014 ингибирует Kir6.2 канал и ингибирует ток калия, вытекающий из клеток.

Пример испытаний 3.

С использованием таких же Kir6.2 канал-сверхэкспрессирующих клеток, как в примере испытаний 1, количество кальция, которое втекает в клетки снаружи при обработке ТР-014, измеряли методом визуализации кальция. Результаты показаны на фиг. 3. Метод визуализации кальция представляет собой измерение количества кальция на основании интенсивности флуоресценции культивированных нервных клеток, которые обрабатывали в культуральном растворе, содержащем кальциевый флуоресцентный краситель (Fura2, изготовитель Dojindo Laboratories) в концентраци 4 мкМ. Визуализацию осуществляли при помощи визуализирующего устройства (LAMBDA10-2, изготовитель SUTTER INSTRUMENT) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к устройству. Фиг. 3а показывает изменение ТР-014 концентрация-зависимого количества кальция с течением времени (в течение 4 мин), когда обработку осуществляли при помощи ТР-014 (1-100 нМ) и мемантина (100 нМ). Фиг. 3b показывает результаты измерений количества кальция, когда измерение осуществляли через 4 мин после обработки мемантином (100 нМ) и ТР-014 (1-100 нМ) (n=5 на группу). ТР-014 имеет больший эффект повышения концентрации кальция, чем мемантин. Было подтверждено, что количество кальция в клетках существенно повышается при обработке при помощи ТР-014 в результате ингибирования вытекания калия из клеток, подтвержденного в примере испытаний 2.

Пример испытаний 4.

Модельным мышам с болезнью Альцгеймера (АРР23 мыши, Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 13287-13292) (возраст 12 месяцев) перорально вводили ТР-014 (1 мг/кг) раз в день в течение двух месяцев (длительное лечение). В результате был подтвержден значимый эффект улучшения когнитивной функции. Результаты показаны на фиг. 4. Фиг. 4a-4d показывают результаты анализа поведения. фиг. 4а и 4b показывают функцию внимания, анализируемую на WT мышах (C57BL/6J, Japan SLC) и АРР23 мышах (n=5 на группу) обычным методом Y-образного лабиринта. В результате было подтверждено, что эффект существенного улучшения функции внимания проявляется при обработке ТР-014. Метод Y-образного лабиринта представляет собой метод, позволяющий мыши свободно перемещаться в трех рукавах лабиринта в течение 8 мин. Рукава будут условно обозначены как А, В, С соответственно. Мышь находящаяся в А, будет перемещаться в В или С (рукав). Случай, где мышь перемещается в В и затем перемещается в С, вкратце случай последовательного перемещения А-В-С считается правильным ответом; тогда как случай, где мышь перемещается А-В-А и уклоняется от выбора нового рукава, считается неправильным ответом. Рукава, в которые мышь заходила, регистрировали в хронологическом порядке и подсчитывали сколько раз мышь заходила в каждый из рукавов в течение определенного времени и определяли как общее количество заходов в рукава. Из них количество случаев правильного ответа (случай, где мышь последовательно выбирает три разные рукава) подсчитывали и определяли как количество альтернирующих поведений (№ альтернаций). Отношение № альтернаций к числу, полу

- 19 043204 ченному путем вычитания 2 из общего количества заходов в рукава, выражают как альтернацию (%) и используют в качестве индекса нормального альтернационного поведения (процент правильных ответов пространственной рабочей памяти).

Мыши отдают предпочтение новому (незнакомому) объекту. Обычные мыши дают правильный ответ в 70% случаев; однако АРР2 3 мыши дают правильный ответ лишь в около 50% случаев. На основании этих процентов анализируют функцию внимания (когнитивная функция).

Фиг. 4с показывает результаты запоминания нового (незнакомого) объекта для WT мышей и АРР23 мышей (обе группы, n=5), которых оценивали обычным методом узнавания нового объекта. Испытание на распознавание новых объектов осуществляли следующим образом. Два идентичных по форме конструкционных элемента помещают в клетку и мышам позволяют играть с ними в течение 10 мин (это называется обучающим испытанием). Через час один из конструкционных элементов заменяют конструкционным элементом другой формы. Поскольку нормальные мыши проявляют интерес к новому объекту, они дольше играют с имеющим другую форму конструкционным элементом. Мыши с болезнью Альцгеймера (модельные) по-видимому имеют нарушение памяти, поскольку они не могут распознать новый объект (конструкционный элемент). Мышам позволяют свободно играть еще 5 мин с двумя конструкционными элементами разными по форме (это называется испытанием сохранения в памяти). В обучающем испытании и испытании сохранения в памяти подсчитывали сколько раз мышь контактировала с каждым из двух объектов. Рассчитывали отношение (%)количества контактов с имеющим другую форму конструкционным элементом к общему количеству контактов в испытании сохранения в памяти и использовали в качестве индекса дискриминации.

Фиг. 4d показывает результаты запоминания чувства страха, которое анализировали обычным методом условно-рефлекторного замирания (n=5 на группу). Метод условно-рефлекторного замирания представляет собой анализ, использующий преимущество предрасположенности мыши к темному месту, а не к светлому месту. День 1: мышь помещают в светлое место. Поскольку мышь любит темное место, мышь заходит в темное место (темный ящик). Когда в это время на мышь воздействуют электрической стимуляцией, мышь удивляется и возвращается в светлое место и никогда не заходит в темное место. День 2: мышь помещают в светлое место (то же самое место, что и в день 1), а затем, заходит ли мышь в темное место или нет, наблюдают в течение 5 мин. Если мышь сразу попадает в темное место, это определяют как уменьшение у мыши памяти чувства страха. Латентность означает период времени (секунды), пока мышь, помещенная в светлое место, не зайдет в темное место (темную комнату) в день 2. Поскольку мыши АРР23 сразу заходили в темное место, это подтверждало, что память чувства страха снизилась; однако у мышей, получавших ТР-014 в течение двух месяцев, был подтвержден эффект улучшения.

Фиг. 4е-4g показывают результаты анализа феномена длительной потенциации (LTP)(служащего как индекс формирования памяти) электрофизиологическим методом. Гиппокамп в головном мозге играет важную роль в запоминании. Гиппокамп разрезали на секции (толщиной 400 микрон). Срезы помещали в искусственную спинномозговую жидкость (126 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 26 мМ NaHCO₃, 1,3 мМ MgSO₄-7H₂O, 1,26 мМ KH2PO4, 2,4 мМ CaCl₂-2Н₂О, 10 мМ глюкозы), насыщенную 95% О₂/5% СО₂ газом при 34°С в течение 2 ч и восстанавливали. Срезы гиппокампа переносили в измерительную камеру и перфузировали искусственной цереброспинальной жидкостью, содержащей ТР-014. Регистрировали активность нервных клеток при применении электрической стимуляции и измеряли возбуждающий постсинаптической потенциал (fEPSP). На основании этого оценивали степень улучшения LTP. Зарегистрированные формы сигналов показаны на фиг. 4е. После этого прилагали электрическую стимуляцию (100 Гц) к гиппокампу, чтобы вызвать выборочное изменение (считается, что память формируется выборочным изменением в гиппокампе). Было подтверждено, что скорость роста нейронального возбуждения снижается у мышей АРР23; тогда как скорость улучшается у мышей, получавших длительное лечение ТР-014. Показано, что обучение памяти эффективно улучшается за счет улучшения LTP.

Пример испытаний 5.

Гиппокамп мыши АРР23 вырезали. К срезам гиппокампа добавляли SDS буфер для образца с получением суспензии, которую подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против CaMKII, CaMKIV и ERK (CaMKII: Fukunaga et al., J. Biol., Chem., 1992, 267, 22527-22533, CaMKIV: Kasahara et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 24044-24050, ERK: изготовитель Sigma-Aldrich). Таким образом анализировали фосфорилирование отдельных белков. Результаты показаны на фиг. 5а и 5b. CaMKII, CaMKIV и ERK представляют собой молекулы, которые, как считается, играют важную роль в формировании памяти. В результате было обнаружено, что фосфорилирование CaMKII уменьшается у обычных мышей АРР23; тогда как у мышей АРР23, получавших длительное лечение ТР-014 (условия обработки такие же, как в Примере испытаний 4), фосфорилирование CaMKII ускоряется. На основании этого результата показано, что активация CaMKII имеет важное значение для эффективного улучшения памяти у мышей АРР23 при обработке при помощи ТР-014.

GluA1 (Ser-831), синапсин I (Ser-603) и CREB (Ser-133) представляют собой молекулы, которые, как известно, активируются, если активируется CaMKII. Эти молекулы анализировали путем иммуноблоттинга срезов гиппокампа, суспендированных в SDS буфере для образцов. Антитела против отдельных мо

- 20 043204 лекул были получены от Millipore. Результаты показаны на фиг. 5с и 5d. Показано, что активация GluAl (Ser-831) и CREB (Ser-133) индуцируется активацией CaMKII. На фиг. 5а и 5с показаны полосы (изображение), действительно полученные электрофорезом иммуноблотов. Фиг. 5b и 5d показывают результаты анализа, количественно показывающие интенсивности сигналов полос, показанных на фиг. 5а и 5с.

Пример испытаний 6.

Такой же эксперимент, который показан на фиг. 4, осуществляли с использованием мышиных моделей нейродегенеративных заболеваний, то есть мышей с удаленной обонятельной луковицей (ОВХ мышей). Результаты показаны на фиг. 6а-6g. Когнитивная дисфункция у ОВХ мышей значительно улучшалась при длительном введении (2 недели) ТР-014. Для получения ОВХ мышей использовали DDY мышей мужского пола возраста 10 недель (Nippon SLC, Hamamatsu, Japan). Операцию по удалению обонятельной луковицы проводили под анестезией пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, интраперитонеально; Dainippon, Osaka, Japan). Мышь фиксировали на фиксирующем приспособлении для операций на головном мозге и череп над обонятельной луковицей просверливали для получения отверстия диаметром 1 мм. Обонятельную луковицу удаляли всасывающим насосом, чтобы не повредить префронтальную кору. Группу имитации подготавливали, подвергая мышей такой же операции, как в группе ОВХ, за исключением удаления обонятельной луковицы всасыванием.

Пример испытаний 7.

Внутриклеточный механизм когнитивной дисфункции у ОВХ мышей исследовали так же, как на фиг. 5. Результаты показаны на фиг. 7а-7d. Было обнаружено, что активация CaMKII и CaMKIV имеет важное значение в гиппокампе, который играет важную роль в формировании памяти. Кроме того, было подтверждено, что активация GluA1 (Ser-831) и CREB (Ser-133), которые являются расположенными на пути ниже молекулами CaMKII и CaMKIV при активации, также имеет важное значение. Антитела против GluA1 (Ser-831) и CREB (Ser-133) были получены из Millipore. Из результатов, показанных на фиг. 47, было обнаружено, что важно ускорить активацию CaMKII и CaMKIV для эффекта улучшения когнитивной функции ТР-014. Поскольку когнитивная дисфункция не наблюдается у CaMKIV ген-дефектных мышей, CaMKII играет важную роль в улучшении когнитивных функций.

Пример испытаний 8.

Для подтверждения, что действие ТР-014 является Kir6.2-ингибирующим действием, сайт действия ТР-014 был идентифицирован с использованием такого же поведенческого эксперимента, как на фиг. 4 (фиг. 8а и 8b: метод Y-лабиринта, фиг. 8с: метод распознавания нового объекта, фиг. 8d: метод условнорефлекторного замирания, фиг. 8е-8g: оценка улучшения LTP, n=5 на группу) с использованием Kir6.2 канал-дефицитных мышей. Результаты показаны на фиг. 8. Было подтверждено, что когнитивная дисфункция индуцируется у Kir6.2 канал-дефицитных мышей. Результаты показывают, что канал Kir6.2 имеет важное значение для формирования памяти. Было также показано, что нарушение памяти и ослабление LTP у Kir6.2-дефектных мышей не улучшаются при длительном лечении ТР-014 (два месяца). Результат показывает, что сайт действия ТР-014 представляет собой Kir6.2 канал. Аналитические методы такие же, как в Примерах испытаний 4-7. Следует отметить, что Kir6.2-дефектных мышей получали от Professor Susumu Seino, School of Medicine of Kobe University (Miki T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95, 10402-10406).

Пример испытаний 9.

Активацию CaMKII исследовали таким же образом, как на фиг. 4-7. Кроме того, исследовали GluA1 (Ser-831), который известен как молекула, активируемая путем активации CaMKII. Срезы гиппокампа суспендировали в SDS буфере для образцов с получением суспензии, которую подвергали иммуноблоттингу. Таким образом анализировали внутриклеточный механизм когнитивной дисфункции у Kir6.2дефектных мышей. Результаты показаны на фиг. 9 (фиг. 9а: изображения полос, полученных методом иммуноблоттинга, фиг. 9b: результаты количественной оценки интенсивности сигналов полос). В гиппокампе Kir6.2-дефектных мышей активация CaMKII была ускорена. Даже в случае длительного лечения при помощи ТР-014 никакого влияния не наблюдалось. Аномалию наблюдали в гомеостазе внутриклеточного и внеклеточного кальция (баланс) при дефекте канала Kir6.2, и фосфорилирование CaMKII ускорялось. Было продемонстрировано, что ТР-014 не влияет на активацию CaMKII, что предполагает, что сайтом действия ТР-014 является канал Kir6.2

Пример испытаний 10.

Гипотеза, что амилоид-р (Ав) является причиной болезни Альцгеймера, по-прежнему остается важной. Агрегация Ав, которая происходит у АРР23 мышей (возраст 14 месяцев), была подтверждена иммуноокрашиванием. Головной мозг WT (контрольная мышь) и АРР23 мышей разрезали на секции толщиной 50 микрон. Срезы окрашивали 6Е10 (Ав антитело, изготовитель Abcam) и тиофлавином. Результаты (индекс для оценки агрегатов) показаны на фиг. 10. Условия, помимо вышеуказанных, были такими же, как и в обычном методе иммуноокрашивания. Было обнаружено, что агрегация Ae ускорялась у АРР23 мыши, в частности, много агрегатов наблюдали в коре головного мозга (PFC). Напротив, агрегация практически не наблюдалась в гиппокампе (СА1). Агрегация Ав ингибировалась при длительном лечении при помощи ТР-014. Результат показывает, что ТР-014 обладает ингибиторным эффектом против Ав

- 21 043204 агрегации.

Пример испытаний 11.

Улучшающий эффект ТР-014 на депрессия-подобный симптом проверяли с использованием мышей ОВХ в качестве мышиной модели депрессии. Результаты показаны на фиг. 11. Мыши ОВХ были первоначально установлены как мышиная модель депрессии, хотя наблюдалось ухудшение когнитивной функции. Депрессию анализировали методом подвешивания за хвост (а) и методом принудительного плавания (b). Метод подвешивания за хвост - это способ защемления хвоста мыши и подвешивания мыши головой вниз. Если у подвешенной мыши есть депрессия, время неподвижности длительное. Поскольку нормальная мышь двигается, даже если она висит, время неподвижности короткое. В методе принудительного плавания мышь вынуждена плавать в воде в стакане. Мышь с депрессией не плавает и не движется (просто держится на поверхности). Таким образом измеряют время неподвижности. Время неподвижности было долгим у мышей ОВХ как в методе подвешивания за хвост (а), так и в методе принудительного плавания. Время неподвижности группы длительного введения ТР-014 (2 недели, тот же метод введения, который указан выше) улучшалось. На основании результатов было продемонстрировано, что ТР-014 обладает эффектом улучшения депрессия-подобного симптома у мышей ОВХ (n=5 на группу).

Пример испытаний 12.

Время неподвижности у Kir6.1-дефектных мышей (гетеротип, n=5 на группу) измеряли методом подвешивания за хвост (а) и методом принудительного плавания (b) таким же образом, как на фиг. 11. Гетеротипные мыши являются мышами, у которых уровень экспрессии канала Kir6.1 составляет половину (у гомотипных мышей развивается аритмия после рождения, и они умирает) в отличие от гомотипных мышей (полностью дефектных мышей). Результаты показаны на фиг. 12. У Kir6. 1-дефектных мышей наблюдали гиперактивированный депрессия-подобный симптом. Результаты показали, что Kir6.1 является важной молекулой для депрессии. Длительное лечение при помощи ТР-014 неэффективно. Было подтверждено, что ТР-014 имеет эффект улучшения депрессии через ингибирующее Kir6.1 канал действие. Kir6.2 1-дефектных мышей получали от Professor Susumu Seino, School of Medicine of Kobe University (Miki T. et al., Nature Medicine, 2002, 8, 466-472).

Пример испытания 13.

CaMKIV, индуцируемый каналом Kir6.1, анализировали с использованием CaMKIV-дефектных мышей (n=5, на группу *) таким же образом, как на фиг. 12. Результаты показаны на фиг. 13. Наблюдали ускорение развития депрессия-подобного симптома также у CaMKIV-дефектных мышей. На основании этого результата было установлено, что CaMKIV имеет важное значение для механизма развития депрессии. ТР-014 не имел никакого эффекта на CaMKIV депрессия-подобный симптом (увеличение времени неподвижности). Было обнаружено, что ТР-014 ингибирует Kir6.1 канал и имеет эффект улучшения депрессии посредством активации CaMKIV. CaMKIV-дефектных мышей получали от professor, Hiroyuki Sakagami, Kitasato University School of Medicine (Takao K. et al., PLoS One, 2010, 5, e9460).

Пример испытаний 14.

Гипогликемический эффект ТР-014 проверяли путем измерения уровня глюкозы в крови с помощью набора для анализа (изготовитель Technicon International со). Результаты показаны на фиг. 14. Измерения осуществляли в течение 4 недель. В результате длительного лечения при помощи ТР-014 (1 мг/кг) в течение 4 недель уровень глюкозы в крови значительно снижался даже по прошествии 3 недель. В качестве контроля использовали толбутамид. Канал Kir6.2 связывается с SUR1 (рецептор мочевины) на клеточной мембране с образованием канала. Механизм действия рассматривается в связи с ингибирующим Kir6.2 канал действием. Толбутамид связывается с SUR1, ингибируя Kir6.2 канал.

Пример испытания 15.

Плазмидный вектор, содержащий кДНК канала Kir6.1, встроенную в него: pcDNA3.1-Kir6.1, был получен от professor Toru Ishizuka of Graduate School of Life Sciences, Tohoku University. Клетки N2A, сверхэкспрессирующие Kir6.1 канал, получали таким же образом, как и в получении N2A клеток, сверхэкспрессирующих Kir6.2 канал примера испытаний 1, за исключением того, что использовали вышеуказанную плазмиду.

Активацию CaMKIV анализировали (измеряли) с использованием полученных Kir6.1 каналэкспрессирующих клеток. В качестве метода анализа использовали тот же иммуноблоттинг, что и в Примере испытаний 1. В качестве первичного антитела использовали антитело против фосфорилированного CaMKIV (Kasahara J. et al., J. Biol., 2001, 276, 24044-50). В качестве вторичного антитела использовали анти-кроличье IgG антитело (изготовитель SouthernBiotech).

С использованием полученных Kir6.1 канал-сверхэкспрессирующих клеток ток калия, вытекающий из клеток, измеряли обычным пэтч-кламп методом. Результаты показаны на фиг. 18. АТФ-чувствительный калиевый канал (Kir6.1 канал) был локализован в клеточной мембране нервных клеток. Если канал ингибируется и закрывается, порог мембраны нервной клетки повышается, приводя к состоянию, которое аналогично состоянию, где потенциал действия временно генерируется, в результате ток калия вытекает из клетки наружу, а вместо этого ток кальция втекает в клетку снаружи. Фиг. 18а показывает, что Kir6.1 канал сверхэкспрессируется в N2A клетках (верхняя фигура показывает окрашенные изображения, полу

- 22 043204 ченные методом иммуноблоттинга; тогда как нижняя фигура количественно выражает интенсивность сигнала полос). Это было подтверждено с применением иммуноблоттинга (использовали такие же условия, как в примере испытаний 1, за исключением анти-Kir6.1 канал антитела, n=5) с анти-Kir6.1 канал антителом (полученным обычным способом) к Kir6.1 канал-сверхэкспрессирующим клеткам (полученным описанным выше способом). Никакого изменения не наблюдали в конститутивном генном продукте, т.е. β тубулине (анти-β тубулиновое антитело получали от Sigma-Aldrich, и другие условия такие же, как в детекции Kir6.1). Фигура показывает, что, если Kir6.2 канал-сверхэкспрессирующим клеткам дают выстояться в электрофизиологическом экспериментальном буфере, содержащем ТР-014, для получения концентрации 10 нМ, ток калия, который вытекает наружу, когда мембранный потенциал нервных клеток изменяется в сторону плюса, подавляется (n=5 на группу). Результаты показывают, что ТР-014 ингибирует Kir6.1 канал и ингибирует ток калия, вытекающий из клеток.

Пример испытаний 16.

С использованием мышей WT (C57BL/6J, Japan SLC, возраст два месяца), которым вводили кортикостерон (дозу 5 мг/кг вводили один раз в день в течение 2 недель); и Kir6.1-дефектных мышей, которым вводили кортикостерон, в качестве мышиной модели заболевания с проявлением симптомов беспокойства, осуществляли пять поведенческих испытаний, касающихся поведения, связанного с беспокойством. Следует отметить, что Kir6.1-дефектные мыши были получены от Professor Susumu Seino, School of Medicine of Kobe University (Miki T. et al., Nature Medicine, 2002, 8, 466-472).

WT мышам и Kir6.1-дефектным мышам, которым вводили кортикостерон, ТР-014 (1 мг/кг) вводили пероральным путем один раз в день в течение 2 недель (длительное лечение). В результате было подтверждено, что был получен значительный улучшающий эффект ускорения симптомов беспокойства. Результаты показаны на фиг. 19.

На фиг. 19а показаны результаты анализа подверженности каждой группы (n=5 на группу) беспокойству, осуществляесого методом приподнятого крестообразного лабиринта (фиг. 19b). В устройстве, используемом в данном испытании, крестообразное устройство с рукавами обеспечивается в высоком положении, а отдельные рукава либо открыты (видимы), либо закрыты. Мыши, подверженные беспокойству, долгое время остаются в закрытом рукаве; тогда как мыши, устойчивые к беспокойству, остаются в открытом рукаве (видимые). Время удерживания в открытом рукаве указано на вертикальной оси фиг. 19а.

Фиг. 19с показывает результаты испытания свет/темнота (фиг. 19d) (n=5 на группу). Измеряли время до того момента, когда мышь, помещенная в черный ящик (темное место), почувствует стремление к свету и выйдет из ящика на освещенное место. Время до момента, когда мышь выходит (вход в открытое отделение), указано на вертикальной оси фиг. 19с.

Фиг. 19е показывает результаты испытания методом закапывания шариков (фиг. 19f) (n=5 на группу). В клетку для мыши вносили подстилку из древесных стружек и 20 шариков располалали так, чтобы мышь могла их видеть. Мыши позволяли свободно перемещаться в течение 30 мин. Количество шариков, закопанных и спрятанных в подстилке из древесных стружек, подсчитывали. Поскольку мышь не любит светящийся объект, мыши, устойчивые к беспокойству, контактируют со многими шариками. Количество закопанных шариков указано на вертикальной оси фиг. 19е.

Фиг. 19g показывает результаты испытаний методом открытого поля (фиг. 19h) (n=5 на группу). Мышь помещают в квадратный ящик и позволяют перемещаться в течение 30 мин внутри ящика. Обычно мышь, которая испытывает сильное беспокойство, как правило, перемещается по краю ящика; тогда как мышь с сильной устойчивостью к беспокойству часто бегает в центральной части ящика. Такую тенденцию используют в качестве эталона. Время пребывания в центральной части ящика указано на фиг. 19h.

Фиг. 19i показывает результаты испытаний методом условно-рефлекторного замирания (n=5 на группу). Используя то же устройство, что и в методе свет/темнота, мышь помещают в темное место, а затем звук (верхний) генерируют в течение 30 с, после чего осуществляют электрическую стимуляцию в течение 3 с. После звуковой осуществляют электрическую стимуляцию три раза. В этом случае мышь запоминает, что после звука будет подаваться электрическая стимуляция. На следующий день звук продолжается в течение 5 мин. Мышь, если она чувствует страх/беспокойство, не двигается. Измеряется время неподвижности мыши. Время неподвижности указано на вертикальной оси фиг. 19i.

Все вышеуказанные результаты испытаний подтвердили, что длительное введение (2 недели) ТР-014 улучшает ускорение симптома, подобного беспокойству. Kir6.1-дефектные мыши, которым вводили кортикостерон, проявляют беспокойство-подобные симптомы; однако при введении ТР-014 никакого эффекта улучшения не получали. Результаты подтвердили, что улучшающий эффект соединения по настоящему изобретению на ускорение беспокойство-подобных симптомов проявляется посредством Kir6.1.

Необходимо отметить, что на чертежах в настоящей заявке указания значимой разницы ** или ++ означают Р<0,01; тогда как указания значимой разницы + или * означают Р<0,05.

Claims

1. Соединение, представленное формулой (I)

(I)

Химическая формула 1 где R¹ представляет собой атом водорода или (C_1-6алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;

R² представляет собой атом водорода или (C_1-6алкил) карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;

X представляет собой О или NR⁵;

R³ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹, 5- или 6-членный гетероарил, содержащий по меньшей мере один гетероатом, выбранный из атома кислорода, атома азота и атома серы, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹, или COOR⁶;

R⁴ представляет собой атом водорода, атом галогена, азидо или -OR⁷;

R⁵ представляет собой атом водорода;

R⁷ представляет собой атом водорода, C_1-6алкил или C_1-6алкокси-C_1-6алкил;

X¹ представляет собой C_1-6алкил или атом галогена, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, где R⁴ представляет собой атом хлора или азидо.

3. Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль по п.1 или 2, где R¹ представляет собой трифторацетил.

4. Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп.1-3, где R² представляет собой (C_1-6алкил)карбонил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена.

5. Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль по п.4, где R² представляет собой трифторацетил.

6. Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп.1-5, где R³ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹, или пиридил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из X¹.

7. Соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, выбранное из (R)-(( 1 R,2S,3R,5R,7 S)-5-азидо-1 -гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метилацетата;

(1 R,2S,3R,5R,7R)-5-хлор-2-((S)-2-метокси-2-оксо-1 -(2,2,2-трифторацетамидо)этил)адамантан-1 -ил 2,2,2-трифторацетата;

(1 S,2R,3S,5S,7S)-5-хлор-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1 -ил 2,2,2трифторацетата;

(S)-2-амино-2-(( 1 R,2S,3R,5R,7 S)-1,5-дигидроксиадамантан-2-ил)уксусной кислоты;

N-((R)-(( 1 S,2R,3S,5S,7S)-5-хлор-1 -гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метил)-2,2,2-трифторацетамида;

N-((R)-(( 1 S,2R,3S,5S,7 S)-5-хлор-1 -гидроксиадамантан-2-ил)(пиридин-3-ил)метил)-2,2,2трифторацетамида;

2,2,2-трифтор-N-((R)-(( 1 S,2R,3S,5R,7 S)-1 -гидроксиадамантан-2-ил)(фенил)метил)ацетамида;

(1 S,2R,3S,5S,7R)-5-метокси-2-((R)-фенил(2,2,2-трифторацетамидо)метил)адамантан-1 -ил 2,2,2трифторацетата; или энантиомера, диастереомера или фармацевтически приемлемой соли такого соединения.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей Kir6.2 канал и Kir6.1 канал К_атф канала активностью, содержащая терапевтически эффективное количество соединения, его энантиомера, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемые добавки.

- 24 043204

9. Применение фармацевтической композиции по п.8 для лечения или профилактики заболевания, связанного с Kir6.1 каналом или Kir6.2 каналом К_атф канала.

10. Применение по п.9, где заболевание, связанное с Kir6.1 каналом или Kir6.2 каналом К_атф канала, представляет собой когнитивное заболевание или расстройство.

11. Применение по п.10, где когнитивное заболевание или расстройство выбрано из деменции альцгеймеровского типа, цереброваскулярной деменции, деменции с тельцами Леви, фронтотемпоральной деменции, болезни Паркинсона, психического заболевания и нейродегенеративного заболевания.

12. Применение по п.9, где заболевание, связанное с Kir6.1 каналом или Kir6.2 каналом К_атф канала, представляет собой диабет или диабетическое осложнение.

13. Ингибитор Kir6.2 канала К_атф канала, представляющий собой соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-7.

14. Ингибитор Kir6.1 канала К_атф канала, представляющий собой соединение, его энантиомер, его диастереомер или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-7.