EA040708B1

EA040708B1 - Препараты и способы для обработки фотосинтезирующих организмов и повышения их качества и урожайности с помощью препаратов композитов гликанов

Info

Publication number: EA040708B1
Application number: EA201892477
Authority: EA
Inventors: Артур М. Нономура
Original assignee: ИННОВЕЙШН ХАММЕР ЭлЭлСи
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2022-07-20

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 62/329226, зарегистрированной 29 апреля 2016 г., содержание которой включено в настоящее изобретение путем ссылки на нее.

Область техники, к которой относится изобретение

Раскрытые в изобретении варианты осуществления относятся к способам обработки фотосинтезирующих организмов, например, полей с фотосинтезирующими организмами, в том числе с сельскохозяйственными культурами, и/или усиления их роста с помощью препаратов, которые включают композиции композитов гликанов, содержащие компоненты разветвленного дегликозилированного гликана с компонентами координационного соединения. Более того, в случае жидких композиций, указанные выше препараты могут включать один или более консервантов, которые обеспечивают стабильность препаратов при их транспортировке и хранении. Раскрытые в изобретении варианты осуществления включают системы доставки смесей гликанов в фотосинтезирующие организмы.

Уровень техники

Раскрытые в изобретении варианты осуществления относятся к нанесению на фотосинтезирующие организмы препаратов композита гликана, состоящих из одного или более разветвленных дегликозилированных гликанов и координационных соединений переходных металлов²⁺.

Жизнеспособность фотосинтезирующих организмов в сельскохозяйственных культурах зависит от биологического производства ими первичных продуктов фотосинтеза, в частности, Сахаров, и композиции по настоящим вариантам осуществления повышают возможность использования этих первичных продуктов фотосинтеза для улучшения жизнеспособности и роста сельскохозяйственных культур. Недавно достигнутые значительные успехи в повышении урожайности сельскохозяйственных культур относятся к описанным в патентной литературе водорастворимым глюкозидам. Эти глюкозиды доказали свою эффективность при некорневом применении при нормах расхода в диапазоне нескольких килограммов на гектар, но существует потребность в препаратах, которые являются более активными и эффективными при нормах расхода в диапазоне нескольких граммов на гектар и которые раскрыты в вариантах осуществления настоящего изобретения. Разветвленные дегликозилированные гликаны по настоящему варианту осуществления имеет более высокую активность по сравнению с традиционными композициями, при этом компоненты координационного соединения переходного металла²⁺ композитов гликанов дополнительно повышают активность. Кроме того, в результате воздействия на движение нектара сока, композиты гликанов повышают производительность по потоку образующихся первичных продуктов фотосинтеза у сельскохозяйственных культур. Более того, способы и композиции композитов гликанов могут быть применяться для повышения качества и/или урожайности культур при длительном сохранении активности композита гликана.

Сущность изобретения

Целью раскрытых в изобретении вариантов осуществления является создание способов и препаратов, содержащих композит гликана для улучшения жизнеспособности сельскохозяйственных культур и роста фотосинтезирующих организмов, для обработки фотосинтезирующих организмов и повышения качества и урожайности сельскохозяйственных культур. Препараты включают разветвленный дегликозилированный гликан с терминальным лигандом из гликопиранозы или ацилгликозамина в смеси с координационным соединением Са²⁺ и одним или более координационным соединением D-переходных металлов²⁺.

Еще одной целью раскрытых в изобретении вариантов осуществления является создание жидких препаратов, включающих один или более препаратов композитов гликанов с консервантами для сохранения высокой активности.

Еще одной целью раскрытых в изобретении вариантов осуществления является создание способа улучшения жизнеспособности сельскохозяйственных культур и роста фотосинтезирующих организмов в результате усиления дыхательного метаболизма первичных продуктов фотосинтеза путем обработки фотосинтезирующих организмов, таких как растения, и для усиления роста фотосинтезирующего организма, например, в растительных культурах, путем применения препарата композита гликана.

Еще одной целью раскрытых в изобретении вариантов осуществления является создание препаратов композита гликана, в которых одно или более координационных соединений D-переходных металлов²⁺ включают как компоненты металлов²⁺, так и один или более анионных компонентов, выбранных из группы, состоящей из хелатообразующих полидентатных алкиламидов, аконитатов, цитратов, фумаратов, глутаратов, малатов, оксалоацетатов, сукцинатов, их кислот, солей и эфиров.

Еще одной целью раскрытых в изобретении вариантов осуществления является создание препаратов композита гликана, включающих растворимые координационные соединения D-переходных металлов²⁺.

Еще одной целью является создание способов обработки фотосинтезирующих организмов, в частности, растений, и препаратов для роста фотосинтезирующих организмов, включающих препараты композита гликана, расфасованные в жидкой и/или сухой форме, которые являются доступными и обладают проникающей способностью при использовании транскутикулярного, трансэпидермального и/или

- 1 040708 трансмембранного транспорта, при поглощении семенами, листвой и корнями из жидкой фазы, при прорастании, и/или которые поддерживают рост в условиях низкой освещенности.

Еще одной целью является создание препаратов для обработки и роста фотосинтезирующих организмов и их частей, и, в частности, применительно к сельскохозяйственным культурам.

Еще одной целью является создание препаратов для обработки цветов и/или плодов, включающих композит гликана, для контроля качества роста фотосинтезирующих организмов, в частности, применительно к корням, листве, цветам и/или плодам, которые прикреплены к растению до сбора урожая, к сорванным цветам и/или плодам после сбора урожая, и/или для улучшения вкусовых качеств.

Еще одной целью является создание новых регуляторов роста растений на основе композиций гликанов для контроля дыхания фотосинтезирующих организмов.

Еще одной целью является создание среды на основе композиции гликанов для фотосинтезирующих организмов при культивации, способствующей дыханию при низкой интенсивности освещенности в условиях от затененности до темноты.

Еще одной целью является создание среды, обеспечивающей ускорение дыхания для фотосинтезирующих организмов при культивации, путем обработки с помощью композитов гликанов. В некоторых вариантах осуществления корни в любое время суток или ночью и/или побеги в ночной темноте подвергают воздействию ускорителей дыхания, которые повышают уровень кислорода (O2) в окружающей среде либо при обработке фотосинтезирующего организма газообразным O2 с концентрацией >25%, либо путем применения O₂-генераторов. Кроме того, еще одной целью является создание среды, способствующей дыханию, для фотосинтезирующих организмов при культивации путем обработки с помощью композитов гликанов, в которой фотосинтезирующие организмы при культивации путем обработки композитами гликанов могут подвергаться воздействию ускорителей дыхания.

Еще одной целью является создание среды, способствующей накоплению первичных продуктов фотосинтеза, для фотосинтезирующих организмов при культивации путем обработки композитами гликанов. Фотосинтезирующие организмы при культивации путем обработки композитами гликанов могут быть подвергнуты воздействию замедлителей дыхания, способствующих накоплению первичных продуктов фотосинтеза.

Еще одной целью является создание композитов гликанов и/или их компонентов для применения в качестве природных биостимуляторов для повышения эффективности использования питательных веществ, повышения толерантности к абиотическому стрессу и/или для повышения урожайности и качества сельскохозяйственных культур.

В конкретных вариантах осуществления, например, таком как удобное использование в полевых условиях, препарат, содержащий композит гликана, удобен для нанесения на фотосинтезирующие организмы и совершенно безопасен для фотосинтезирующих организмов в результате приготовления препаратов, расфасованных в жидкой и/или сухой форме, и может быть использован в качестве добавки при обработках сельскохозяйственных культур.

Еще одной целью является создание способов обработки и композиций для фотосинтезирующих организмов, включающих композиции экзогенных композитов гликанов, для контроля эндогенной деконъюгации первичных продуктов фотосинтеза, которые повышают качество и количество собранных урожаев в сельском хозяйстве.

Еще одной целью является создание препарата для обработки и роста фотосинтезирующих организмов, включающего композиции экзогенных композитов гликанов, для обработки эндогенных первичных продуктов фотосинтеза, которые повышают вкусовые характеристики собранных урожаев культур в сельском хозяйстве.

Еще одной целью является создание препарата для обработки и роста фотосинтезирующих организмов, включающего композиции экзогенных композитов гликанов, которые предохраняют от порчи для хранения с помощью одного или более безвредных для растений консервантов.

Еще одной целью является создание препарата для обработки и роста фотосинтезирующих организмов, включающего системы композитов гликанов, для улучшения роста культур при выращивании их методом гидропоники.

Еще одной целью является создание препарата для обработки и роста фотосинтезирующих организмов, включающего композиты гликанов в форме синергетических систем, для улучшения эстетического вида сельскохозяйственных культур за счет снижения частоты случаев солнечных ожогов.

Еще одной целью является создание способа обработки фотосинтезирующих организмов, который повышает питательную ценность нектара сока полевых цветущих растений, включающего нанесение композитов гликанов на используемые в качестве пищи цветущие растения для значительного повышения их пользы для здоровья опылителей и пасущегося скота.

В конкретных вариантах осуществления, композит гликана приготавливают в форме комплекса, состоящего из одного или более компонентов метил-а-О-маннопиранозила (Man)i_₃, координационного соединения цитрат-Са²⁺ и с одним или более D-переходными металлами²⁺, и/или дополнительно приготавливают с одним или более консервантами.

- 2 040708

В конкретных вариантах осуществления композит гликана приготавливают в форме комплекса, состоящего из одного или более компонентов метил-α-D-Man₁.₃, координационного соединения малат-Са²⁺, в смеси с одним или более D-переходными металлами²⁺, и/или с одним или более консервантами.

В конкретных вариантах осуществления композит гликана приготавливают в форме комплекса, состоящего из одного или более компонентов метил-α-d-Man₁.₃, координационного соединения сукцинатСа²⁺ и с одним или более D-переходными металлами²⁺ и/или дополнительно с одним или более консервантами.

В конкретных вариантах осуществления, композит гликана приготавливают в форме комплекса, состоящего из одного или более компонентов Manl.зN-связанного-гликана, компонента координационного соединения цитрат-Са²⁺ и с одним или более d-переходными металлами²⁺, и/или дополнительно с одним или более необязательными консервантами.

В конкретных вариантах осуществления, композит гликана приготавливают в форме комплекса, состоящего из одного или более компонентов Manl.зN-связанного-гликана, компонента координационного соединения Са²⁺ с одним или более d-переходными металлами²⁺, и/или дополнительно с одним или более необязательными консервантами.

В конкретных вариантах осуществления, композит гликана приготавливают в форме комплекса, состоящего из одного или более компонентов метил-α-D-Glc₁, компонента координационных соединений цитрат-Са²⁺, с одним или более d-переходными металлами²⁺, и/или дополнительно с одним или более необязательными консервантами.

В конкретных вариантах осуществления, композит гликана приготавливают в форме комплекса, состоящего из одного или более компонентов дегликозилированного О-связанного гликана из смол растительного происхождения, компонентов координационных соединений Са²⁺ с одним или более dпереходными металлами²⁺, и/или дополнительно с одним или более необязательными консервантами.

В конкретных вариантах осуществления, композит гликана приготавливают в форме комплекса, состоящего из одного или более компонентов дегликозилированного N-связанного гликана из инвертазы, компонентов координационных соединений Са²⁺ с одним или более d-переходными металлами²⁺, и/или дополнительно с одним или более необязательными консервантами.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 схематично представлены поочередно сверху вниз процессы, которые лежат в основе способов и композиций для обработки фотосинтезирующих организмов с помощью композита гликана в соответствии с конкретными вариантами осуществления. В примере, изображенном на фиг. 1, нанесение композита гликана приводит к воздействию раствора на растительную клетку, что повышает качество и урожайность сельскохозяйственных культур. Композит гликана доставляется в клетку, метаболизируется, в результате чего происходит передача энергии. Этот метаболический путь, определяемый композитом гликана, направленный на высвобождение первичных продуктов фотосинтеза из хранимого запаса и запуск дыхания O₂ ^ СО₂, приводит к увеличению продуктивности растений при повышении их качества и урожайности.

На фиг. 2 графически представлены примеры разветвленных дегликозилированных гликанов, которые могут применяться для приготовления композитов гликанов. Основная структура в верхнем левом углу страницы соответствует триманнопиранозил-N-гликану, в то время как другие структуры являются примерами гликанов с более высокими степенями разветвления. Показанные основные структуры инвертазы подходят для выбора одного или более разветвленных дегликозилированных гликанов с предпочтительными концевыми лигандами композита гликана. Примеры N-гликанов, содержащих высокое количество маннопиранозила, с концевыми маннопиранозильными лигандами характеризуются тенденцией к более высокой степени разветвления сверху вниз на странице. Изображенная в верхнем левом углу страницы структура Man₃GlcNAc₂ соответствует Ethan в примерах 1, 6, 9, 16 и 17. Используемые условные сокращенные обозначения: Glc - глюкопиранозил, Man -маннопиранозил, NAc - N-ацетил.

Подробное описание изобретения

Если не указано иначе, то все используемые в изобретении технические и научные термины имеют их традиционное для данной области техники значение. Используемые в изобретении термины имеют следующие значения.

М обозначает молярную концентрацию, мкМ обозначает микромолярную концентрацию и мМ обозначает миллимолярную концентрацию.

кДа обозначает килодальтон

PGR обозначает регулятор роста растений.

Процент или % представляет собой процент по массе, если не указано иначе.

Ppb обозначает частей на миллиард по массе.

Ppm обозначает частей на миллион по массе.

Ppt обозначает частей на тысячу по массе.

Номенклатура - ботанические названия обычно приводятся в форме обычных названий, которые

- 3 040708 могут быть отнесены к научной номенклатуре, применяемой в большинстве научных публикаций.

Статистика - сравнение средних значений с помощью критерия Стьюдента (двустороннего) показывает значимость при р<0,05.

Усиленный рост или усиление роста означает промотирование, повышение или улучшение скорости роста фотосинтезирующего организма, такого как растение, и/или увеличение или промотирование увеличения размера и/или выхода, и/или повышение качественных характеристик фотосинтезирующего организма или его частей, регуляцию потока первичных продуктов фотосинтеза, увеличение потока первичных продуктов фотосинтеза для дыхания, улучшение органолептических свойств, повышение гидростатического давления, улучшение аромата, накопление первичных продуктов фотосинтеза в фотосинтезирующем организме и/или улучшение вкусовых характеристик фотосинтезирующего организма, в частности содержания сахара по шкале Брикса (Brix) в его семенах, плодах, цветках, нектаре, корнях, стволе или его частях.

Фотосинтезирующий организм обозначает жизненные формы, которые синтезируют первичные продукты фотосинтеза, включающие растения с С₃-, C₄- и САМ-фотосинтезом, и фотосинтезирующие эукариоты, включающие, но этим не ограничивая, эукариоты из следующих предпочтительных супергрупп: Archaeplastida (архепластидовые водоросли), такие как Plantae, Chlorophyta (зеленые водоросли) и Rhodophyta (красные водоросли), и Chromoveolata (хромальвеоляты), такие как Phaeophyta (бурые водоросли). Фотосинтезирующие организмы могут также обозначать растения, травяной покров и декоративные растения, культуры, включающие продовольственные, кормовые, волокнистые, пищевые и сельскохозяйственные культуры и их урожаи, и растения, как высшие, так и низшие растения, и подобные растениям организмы. Системы, способы и препараты могут успешно применяться в случае любых видов фотосинтезирующих живых организмов.

Композиции могут применяться в случае практически любого вида живых фотосинтезирующих организмов. Фотосинтезирующие организмы, на которые может оказываться благоприятное воздействие, включают, но этим не ограничивая, все виды Plantae, в частности, виды растений во всех группах культур, признанные Управлением по охране окружающей среды США (2012: 40 CFR 180.41), например, такие как люцерна, перец душистый, амарант, дудник, анис, аннато, руккола, bach ciao, мелисса, ячмень, базилик, бобы, свекла, бурачник, хлебное дерево, брокколи, брюссельская капуста, лопух, кровохлебка, капуста, канталупа, каперсы, тмин, кардамон, кардон, морковь, маниок, клещевина, цветная капуста, кавалио, брокколи, сельдерей душистый, сельдерей салатный, спаржевый салат, зерновые злаки, мангольд, чайот, кервель, нут, цикорий, шнитт-лук, кинза, коричное дерево, гвоздика, клевер, кофейное дерево, листовая капуста, кориандр, кукуруза, хлопчатник, клюква, кресс, огурец, тмин, карри, дайкон, лилейник, укроп, эндивий, молочай, баклажан, фенхель, пажитник, лен, кормовое растение, рябчик, корнишон, тыква бутылочная, виноград, хлебный злак, чеснок, хьюар, трава для сена, конопля, шандра, хоста, иссоп, канавалия мечевидная, хикама, хохоба, капуста кормовая, кольраби, кудзу, лук-порей, гиацинтовый боб, лаванда, зеленолистные овощи, лук-порей, бобовое растение, лемонграсс, чечевица, леспедеца, салат-латук, люпин, мускатный орех, майоран, дыня, просо, мята, мизуна, момордика, дыня мускусная, горчица, настурция, мускатный орех, овес, лук, лебеда, петрушка, пастернак, пастбищные растения, горох, арахис, перец, перечная мята, перилла, кукуруза лопающаяся, картофель, мак, тыква, портулак, радиккио, редис, рапс зеленый, ревень, рис, розмарин, брюква, рожь, сафлор, шафран, шалфей, эспарцет, козлобородник, поручейник сахарный, кунжут, лук-шалот, сорго, соя, шпинат, тыква крупноплодная столовая, стевия, земляника, подсолнечник, лавр благородный, сладкий картофель, сахарная свекла, сахарный тростник, листовая свекла, канавалия мечевидная, колоказия, таро, полынь, чайное растение, теосинте, тимьян, табак, помидор, клевер, тритикале, куркума, турнепс, ваниль, вернония, вика, арбуз, пшеница, водяной рис, грушанка, ясменник, полынь, ямс, кабачок и другие подобные растения; плодоносящие растения, такие как миндаль, яблоня, абрикосовое дерево, авокадо, боярышник азароль, банановое дерево, буковый орешник, ежевика, голубика, бразильский орех, хлебное дерево, орех серый, орех кешью, вишня, каштан, каштан карликовый, цитрусовое растение, дерево какао, кокона, кофейное дерево, смородина, питахайя, бузина, инжир, орешник, заманиха, крыжовник, грейпфрут, гуава, орех гикори, черника, киви, кумкват, лимон, лайм, логанова ягода, мушмула японская, орех макадамия, манго, мангостан, мартиния, боярышник летний, наранхилла, нектарин, нопалес, орех, окра, маслина, апельсиновое дерево, папайя, маракуйя, персиковое дерево, грушевое дерево, орех-пекан, перец, фисташковое дерево, слива, плумкот, слива домашняя, помелло, айва, малина, розелла, танжело, мандарин, тангор, боярышник мексиканский, мексиканский томат, агли, грецкий орех, пряности и другие подобные растения; цветочные и декоративные растения, такие как тысячелистник, адениум, агава, агератум, алоэ, алиссум, анемон, аквилегия, астра, азалия, бегония, стрелиция, дицентра великолепная, бурачник, семейство бромелиевых, бугенвилия, буддлея, кактус, календула, камелия, колокольчик, осока, гвоздика садовая, целозия, хризантема, клематис, клеоме, колеус, космос, шафран, кротон, цикламен, георгин, желтый нарцисс, маргаритка, одуванчик, красноднев, дельфиниум, гвоздика, диэтес, дигиталис, мандевилла, щавель, василек, бересклет, незабудка, фремонтодендрон, фуксия, гардения, газания, герань, гербера, глоксиния, гладиолус, гибискус, гортензия, бальзамин, жасмин, лилия, сирень, лизиантус, лобелия, бархатцы, мезембриантемум, губастик, незабудки, нарцисс, бальзамин Хокера, кувшинка, ослинник, олеандр, орхидея, декора- 4 040708 тивные растения, оксалис, анютины глазки, пенстемон, пион, петуния, плюмерия, пуансеттия, синюха, гречиха, мак, портулак, примула, лютик, рододендрон, роза, шалфей, крестовник, додекатеон, антирринум, паслен, золотарник, маттиола, ti, торения, тюльпан, вербена, барвинок, растение семейства фиалковых, фиалка, юкка, цинния и другие подобные растения; комнатные цветы и растения, такие как африканская фиалка, аглаонема переменчивая, суккулент, диффенбахия, драконник, фикус, хоста, спатифиллум, филодендрон, сциндапсус, гевея, сансевиерия, хлорофитум и другие подобные растения; деревья, такие как пихта, осина, береза, кедр, коричник, кизил, саговниковидные деревья, кипарис, метасеквойя, вяз, фиговое дерево, ель, гинкго, голосеменные растения, лиственные деревья, палисандр, джакаранда, можжевельник, лавр, бобовое растение, лириодендрон, магнолия, красное дерево, клен, дуб, пальмовое дерево, ель, смолосемянник, подорожник, тополь, секвойя вечнозеленая, розовое дерево, цереус гигантский, ива, платан, тис, тиковое дерево, ива, тиссовое дерево, рождественское дерево, деревья для производства пиломатериалов, деревья для производства бумаги и другие подобные растения; травы, такие как газонная трава, дерн, мятлик луговой, полевица, бермудская трава, костер, вейник, осока, полевица болотная, пырейник, овсяница, овсец, императа, мискантус, молина, просо, паспалум, пеннисетум, канареечник, роа, семена луговых трав и другие подобные растения; карликовые растения; привитые растения; черенки; гибриды и другие подобные растения. Помимо указанных выше культур, препараты могут быть также нанесены на вторичные метаболиты источников фотосинтезирующих организмов, такие как просо прутьевидное, ятрофа, молочай, табак, лишайник, бурая водоросль, диатомовая водоросль, цианобактерии, бактерии, дуналиелла, наннохлоропсис, хлорелла, гематококк, эухеума; мхи, такие как лишайник и папоротник, и другие подобные растения. Этот список следует рассматривать только в качестве примера, и он не является исчерпывающим. Специалисты в этой области могут легко определить и другие фотосинтезирующие организмы, на которые может оказываться благоприятное воздействие в результате применения композиций и способов по настоящим вариантам осуществления. Раскрытые в изобретении способы и препараты могут быть использованы для усиления роста ювенильных и зрелых фотосинтезирующих организмов, а также черенков, тканей, семян, меристем, каллюс, клеток и при вегетативном размножении. Композиты гликанов могут быть применены при вымачивании и нанесении покрытия на семена перед посевом при расходе в диапазоне 10-1000 мкг композитов гликанов на семя, предпочтительно в диапазоне 20-300 мкг/семя.

В качестве варианта семена, клубни, луковицы, подземные побеги и черенки могут быть обработаны в борозде одновременно с посевом. Обычно анатомическая локализация, на которую наносят композицию способом по изобретению, должна иметь достаточно большую поверхность, для того чтобы фотосинтезирующий организм мог абсорбировать композицию. Например, желательно охватывать проросшую семядолю (то есть, семядолю), подземный побег картофеля, луковицу, клубень или другие большие поверхности, которые способствуют протеканию процесса абсорбции, такие как ярко выраженные листья и корни. Плодоносящие растения могут быть обработаны до и после начала появления почек, плодов и образования семян. Для растений, таких как однолетние растения, многолетние растения, деревья, орхидеи, семейство геснериевых и кактусы, у которых могут быть обработаны стебли, корни и/или стволы, способы нанесения включают обработку побегов распылением и/или обработку побегов и корней одновременно распылением и орошением или нанесение путем окунания или путем раздельного нанесения на корни и побеги. На выращиваемые в промышленном масштабе водные и морские культуры, такие как спирулина, аонори, лавер, морская капуста, макроцистис, нори и вакаме, композиты гликанов могут быть нанесены путем аэрозольного орошения, распыления, нанесения кистью или погружения в стерильные растворы в пресной или морской воде с содержанием 10 ppb - 3% композитов гликанов в течение времени 15-90 мин, достаточного для осуществления процесса абсорбции.

Композит гликана

Способы и препараты в соответствии с конкретными раскрытыми в изобретении вариантами осуществления предназначены, например, для обработки любых из упомянутых выше фотосинтезирующих организмов, таких как растения, и для повышения качества, усиления роста и/или повышения качества и урожайности выращиваемых культур. Это может быть достигнуто путем нанесения препаратов композита гликана, состоящего из следующих компонентов: один или более разветвленных дегликозилированных гликанов с конкретными координационными соединениями переходных металлов²⁺. Препараты могут быть нанесены в сухой или жидкой форме непосредственно на фотосинтезирующие организмы. В конкретных вариантах осуществления жидкие препараты дополнительно могут включать консервант для предотвращения их порчи во время транспортировки и хранения. Раскрытые в изобретении способы делают композиты гликанов легко доступными для усвоения фотосинтезирующими организмами.

Компонент разветвленного дегликозилированного гликана

В конкретных раскрытых в изобретении вариантах осуществления предлагаются разветвленные дегликозилированные гликаны, которые являются компонентами композита гликана. Далее в описании изобретения этот компонент разветвленного дегликозилированного гликана будет обозначаться как компонент гликана или дегликозилированного гликана композита гликана.

Химически синтезированные гликаны являются достаточно дорогими веществами и, за исключением некоторых из вариантов осуществления изобретения, их применение в сельском хозяйстве не может

- 5 040708 быть экономически оправдано. Однако в раскрытых в изобретении вариантах осуществления предлагается ряд экономически эффективных продуктов, получаемых в результате дегликозилирования макромолекул конкретных недорогих веществ, и эти продукты могут применяться в качестве компонентов гликана в композите гликана. Благодаря этому, применение конкретных разветвленных дегликозилированных гликанов делает обработку сельскохозяйственных культур экономически оправданной.

Подходящие гликаны могут быть получены путем расщепления, то есть дегликозилирования субъединиц гликана в их исходной молекуле. Обычно макромолекулы с молекулярной массой больше чем несколько 1000 кДа представляют собой химические структуры, которые являются слишком крупными для обработки и усвоения фотосинтезирующим организмом, поэтому, предпочтительными компонентами разветвленного дегликозилированного гликана являются дегликозилированные гликаны с молекулярной массой меньше чем несколько 10 кДа. Дегликозилированные гликаны обычно получают из таких макромолекул, как белки, гликопротеины, макромолекулы N-связанного-гликана и/или макромолекулы O-связанного-гликана. Они могут представлять собой продукты гидролиза или других известных процессов, образующихся в результате воздействия кислот, оснований, ферментов и/или микроорганизмов, разрывающих химические связи. Биосинтез компонентов разветвленных гликанов с помощью растения или дрожжей может быть экономически эффективным по сравнению с получением продуктов методом химического синтеза и их очисткой, затраты в случае которых является слишком высокими. Например, стоимость чистых высоко разветвленных N-связанных гликанов маннана может составлять несколько $1000 за грамм, в то время как подходящие высоко разветвленные N-связанные гликаны маннана, полученные дегликозилированием из белков в соответствии с раскрытыми в изобретении вариантами осуществления, могут стоить несколько центов за грамм.

Растительные источники подходящих субъединиц гликана включают следующие: Cyanaposis tetragonalobus и Cyanaposis psoraloides, гуаровые камеди, GalMan2; Caesalpinia spinosa, камеди тары, GalMan₃; Ceratonia siliqua, камеди бобов рожкового дерева, GalMan_1-8; Amorphophallus konjac, конжаковые камеди, Glc2Man2; Canavalia ensiformis, канавалия мечевидная, N-связанные гликаны; плод фителефаса, Mann; рожковое дерево; кофейные бобы; пажитник греческий; ячмень; пальмы, лилии, касатики и бобовые растения, ткани эндосперма, Mann; древесина хвойных пород и кора различных деревьев; береза; голосемянные растения; ель обыкновенная и зеленые водоросли хлорофитум, такие как Dasycladales, Characeae, Codium fragile, Caulerpa и Acetabularia acetabulum содержащие маннан водоросли. Кроме того, структуры производных разветвленного маннана, такие как представленные на фиг. 2, могут обнаруживаться в грибках, таких как Hansenula holstii, Rhodotorula acheniorum, в гликопротеинах, таких как конканавалинах и ферментах; и, предпочтительно, в инвертазах. Другие природные источники включают микробов, бактерии, грибы, животных, таких как членистоногие, ракообразные, моллюски, рыбы, криль и насекомые, и отходы, такие как гуано, потроха, кровь, костный мозг, печень, органы животных, кора, древесные опилки, древесина, кости, наружный скелет, опара, прилов и навоз.

Упомянутые выше камеди, белки и другие макромолекулы могут быть подвергнуты дегликозилированию с помощью известных в промышленности процессов. Например, некоторые макромолекулы разветвленных гликанов могут быть микробиологически переработаны с помощью строго регулируемой ферментации, а другие макромолекулы могут быть подвергнуты другим различным известным процессам ферментативной переработки, и в результате чего, макромолекулы разветвленных гликанов могут быть частично гидролизованы с расщеплением камедей с молекулярной массой >100000 кДа до дегликозилированного гликана со средними молекулярными массами 0,2-10 кДа. В результате, дегликозилированные гликаны с значительно меньшими молекулярными массами могут усваиваться растениями. При сравнении с различными природными источниками, разветвленные дегликозилированные гликаны из инвертаз продемонстрировали наилучшие технико-экономические показатели, характеризуясь низкой стоимостью и высокой активностью, что делает возможным их производство в промышленном масштабе, смотрите табл. 1.

Таблица 1. Сравнение природных источников для получения разветвленных дегликозилированных гликанов. Сравнивали относительные активности и стоимости после получения конечных продуктов из различных источников. В большинстве случаев, более высокая активность обуславливала более низкую стоимость. Инвертаза являлась источником с самой низкой стоимостью и с самой высокой активностью дегликозилированных гликанов, подходящих для производства.

Источник	Активность	Относительная стоимость
Инвертаза	1000-1000000	$
Растительные камеди	10-100	$$$
Моллюски	5-10	$$$$
Древесные опилки	1	$$$$

Активность гликанов зависела в очень большой степени от их терминальных лигандов, что давало

- 6 040708 основание считать очень важным моментом идентифицирование этой части структуры гликана. Подходящие концевые лиганды гликана идентифицировали в гликопиранозах, таких как галактопиранозы, глюкопиранозы и, предпочтительно, маннопиранозы, в их алкил-, ацил- и арилзамещенных производных и в ацилгликозаминах. Из этого следовало, что подходящими гликанами являются катионные, анионные и нейтральные полимеры, альдозилы и/или кетозилы, и разветвленные гликаны с любым из вышеуказанных терминальных лигандов. Величины молекулярных масс обычно изменялись в диапазоне от 0,1 до >500 кДа, предпочтительно от 0,2 до 10 кДа и наиболее предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 2 кДа.

Используются следующие условные сокращенные обозначения гликанов:

Gal обозначает галактопиранозил;

Glc обозначает глюкопиранозил;

GlcNAc обозначает N-ацетилглюкозаминозил;

GalNAc обозначает N-ацетилгалактозаминозил;

Gly обозначает гликопиранозил;

Lac обозначает лактозил;

Ara обозначает арабинозил;

Man обозначает маннопиранозил и

Mann обозначает поли-Мап.

j, m, n подстрочные индексы обозначают соответствующие длины цепей, где m=1-24 и n=1-24, если не указано иначе. Например, GalGlcMann обозначает галактопиранозилглюкопиранозилманнопиранозил_nи GlcmMann обозначает глюкопиранозил_mманнопиранозил_n.

Написанные через дефис числа указывают диапазон величин. Например, Man₈.₁₄GlcNAc1.₂ обозначает разветвленный маннопиранозил₈-₁₄ N-ацетилглюкозамин₁.₂, в котором Man₈_₁₄ обозначает диапазон от 8 до 14 единиц Man в разветвленной цепи.

Примеры предпочтительных разветвленных цепей включают MannGly с алкилом, ацилом, арилом, полиацилом, полиалкилом, амином или без замещения; альдосилы; кетосилы; GlcNAcn; алкилGlc_n; метилGlc_n; метилGlcGly_n; алкилMan_n; Gal_nMan₂; пентозы; арабинозы; рибозы; ксилозы; гексозы; маннозы, маннозиды, маннаны; глюкозы, глюкозиды, глюканы; галактозы, галактозиды, галактаны, раффинозы; Gly₂, например, Glc₂ сахарозы, трегалозы, мальтозы, гентиобиозы, целлобиозы, GalGlc лактозы, ксилобиозы, ламинарибиозы; GalmMann; Gal_mGlCjMan_n; GlCjMann; XyloMann; AraMann; AraGaln; фруктофуранозил_mGlCi; Lac; мальтопиранозилы; Man_1-3, такие как Man1, метил-α-D-Man, метил-a-DMan1_₃, метил-α-D-Man₃Gal; триозилы, такие как Man₃; и их производные и комбинации.

Подходящими гликанами в смеси дегликозилированных гликанов композита гликана являются, например, Man1, Man₃, метил-D-Mann и метил-D-GlCn. Дегликозилированные гликаны могут быть выбраны из коротких цепей, таких как Mann, где n представляет собой число от 1 до 8, предпочтительно Man1_₃; Освязанные-разветвленные-цепи, такие как Man_m__nGly, Man_m__nGlc, Man_m__nGal и Man_m__nGalGlc, где m представляет собой число от 1 до 8, и n представляет собой число от 1 до 8. Еще более подходящие гликаны представляют собой цепи с молекулярной массой >1 кДа, такие как, например, Gal_mMan_n, Gal_nMan_n, Glc_mMan_n, GaljGlc_mMan_n, j = 1-24, m=1-24, n=1-24; предпочтительными являются дегликозилированные гликаны с молекулярной массой <1 кДа, где j = 1-8, m=1-8, n=1-8, такие как, например, Gal₂Man₂, и в их комбинациях и смесях.

Предпочтительными дегликозилированными гликанами являются O-связанные гликаны и Nсвязанные гликаны с Gly_m._n, где m=1-8 и n=1-8. Дополнительные примеры включают следующие основные структуры Mann, такие как α-маннобиозы, маннотетрозы, маннопентозы; аминофункционализированные-маннозы, например глицилMan_n, аланилMan_n и аминилMan_n, где n=1-24.

Предпочтительные разветвленные дегликозилированные гликаны могут включать один или более N-связанных-гликанов, таких как, например, Man_nGlcNAc1_₃ и Man_m._nGlyNAc1.₃, например Man₈_₁₅GlcNAc₂. Предпочтительные N-связанные-гликаны выбирают из низкомолекулярных MannNгликанов, поэтому, Man₃GlcNAc1_₃ и триманнопиранозил-N-гликаны являются самыми предпочтительными. Подходящие производные могут иметь более высокие степени разветвления, такие как Man_m_ _nGalNAc1_₃, например, Man₈_₁₅GlcNAc₁_₂ и Man₉.₂₀GlcNAc1.₃, и такие производные, как N-гликан, ацил-, алкил-и арилзамещенные. Кроме того, подходящие разветвленные GalGlcManN-гликаны включают Glc:Gal:Man при соотношениях 1:2:16-9:2:20, как например, Gal₄Man₁₀GlcNAc₂. Кроме того, Nацетилгликозаминил-терминальные лиганды, такие как N-ацетилгалактозамины, N-ацетилглюкозамины и N-ацетилнейроамины, могут быть выбраны из GalNAc1_₃, GlcNAc1_₃, GlcNAc₂, Man₁_₈GlcNAc₁_₃, их производных и комбинаций.

Компоненты координационного соединения переходных металлов²*

В раскрытых в изобретении вариантах осуществления предлагаются композиции координационного соединения переходного металла²* композита гликана. В конкретных вариантах осуществления, координационное соединение переходного металла²* состоит из компонента металлов²* и одного или более анионных компонентов. Определенные металлы²* вводят в структуру голопротеина для надежного связывания гликанов. В отсутствии определенных металлов^2*, структура белка является незавершенной, не об

- 7 040708 ладающей конфигурацией для конъюгирования. Поэтому эти предпочтительные металлы²⁺ включают кальций (Са²⁺) и марганец (Mn²⁺) , и предпочтительным является их совместное использование, так как и Са²⁺ и Mn²⁺ встречаются в связывающих сайтах природного голопротеина. Однако помимо Mn²⁺ могут быть добавлены, использованы вместо или введены в препарат другие подходящие переходные металлы²⁺, включая один или более D-переходных металлов²⁺, выбранных из кобальта (Со²⁺) , никеля (Ni²⁺) и цинка (Zn²⁺) и их комбинаций, но всегда в присутствии Са²⁺. Кроме того, присутствие железа (Fe²⁺) и магния (Mg²⁺) и/или одного или более из упомянутых выше d-переходных металлов²⁺ может дополнительно поддерживать структурную конформацию голопротеина при воздействии Са²⁺ и Mn²⁺. Эти металлы²⁺ и/или их водорастворимые соли могут вводиться в композит гликана в форме жидких или твердых веществ, например, с содержанием в диапазонах 0,1-100 ppm Са²⁺, 0,1-100 ppm Mg²⁺, 0,1-10 ppm Fe²⁺, 0,110 ppm Mn²⁺, 0,1-10 ppm Zn²⁺, 0,001-1 ppb Co²⁺ и 0,001-0,1 ppb Ni²⁺.

Предпочтительные анионные компоненты упомянутых выше координационных соединений переходных металлов²⁺ композитов гликанов могут быть выбраны из секвестирующих анионов, дополнительно действующих как ускорители дыхания, которые приведены далее: оксалоацетаты, ацетаты, аконитаты, цитраты, изоцитраты, фумараты, глутараты, кетоглутараты, малаты и сукцинаты. Подходящие кислоты для их производных, указанные в изобретении, но не исключая и другие, выбирали из аконитовой, лимонной, фумаровой, глутаровой, яблочной, щавелевоуксусной, янтарной и других подобных кислот для координационных соединений переходных металлов²⁺, и, предпочтительно, при мольных соотношениях анион:катион 10:1 или более, в диапазоне от 100 ppb до 30% по массе. Аконитовые кислоты включают аконитаты, цис- и транс-аконитовые кислоты, соли и другие подобные соединения.

Лимонные кислоты включают цитраты, лимонную, изолимонную и метиллимонную кислоты, ангидриды лимонных кислот, цитратфосфаты, соли и другие подобные соединения. Фумаровые кислоты включают фумараты, фумаровые кислоты, алкилфумараты соли и другие подобные соединения. Глутаровые кислоты включают глутараты, кетоглутараты, глутаровую кислоту, глутаровый ангидрид, алкилглутараты, глутаматы, соли и другие подобные соединения. Яблочные кислоты включают малаты, яблочные кислоты, малеиновые кислоты, малеаты, малеиновые ангидриды, алкилмалеиновые ангидриды, малеилпротеины, соли и другие подобные соединения. Щавелевоуксусные кислоты включают ацетаты, уксусные кислоты, такие как ледяная уксусная кислота и vinegar, ацетил-СоА; ацетилфосфат, уксусные ангидриды; алкилацетаты, алкилацетоацетаты, оксалоацетаты, соли и другие подобные соединения. Янтарные кислоты включают сукцинаты, янтарные кислоты, алкилянтарные кислоты, сукциниловый ангидрид, соли и другие подобные соединения. Упомянутые выше соли включают одно или более координационных соединений Са, Mg, Na и переходного металла²⁺ с упомянутыми выше кислотами. Анионные компоненты координационных соединений переходного металла²⁺ могут быть предпочтительно выбраны из их фосфатов, таких как, например, малат-фосфаты, цитрат-фосфаты и другие подобные фосфаты. Обычно компоненты чистых координационных соединений переходного металла²⁺ производятся промышленностью большими партиями. Анионные компоненты координационных соединений переходного металла²⁺ могут быть выбраны из подходящих полидентатных хелатообразующих реагентов, таких как алкиламидные хелатообразующие реагенты, приведенные далее: аммониевые, натриевые и/или калиевые соли алкиламидных хелатообразующих реагентов, таких как этилендиаминтетрауксусные кислоты (EDTA), N-гидроксиэтилэтилендиаминтетрауксусные кислоты (HeEDTA), этилендиамин-N,N'-бис-2гидроксифенилуксусные кислоты (EDDHA), ди(ортогидроксибензил)этилендиаминдиуксусные кислоты (HBED), диэтилентриаминпентауксусные кислоты (DTPA); метилглицин N,N-диуксусные кислоты (MGDA); глутаминдиуксусные кислоты (GLDA) и другие подобные соединения. Анионные компоненты обычно добавляют в жидкие растворы металлов при минимальном мольном соотношении анион:катион 7:1 и предпочтительно 10:1 или более.

Предпочтительные соли координационных соединений переходного металла²⁺ могут быть получены реакцией металла²⁺ и анионных компонентов. Кроме того, подходящие выпускаемые промышленностью соли включают производные N, P, K, S, C, H, O, Cl, их вторичные производные и питательные микроэлементы, и другие применяемые в сельском хозяйстве комбинации известных соединений. Например, N в форме аминов, амидов, нитратов, полиациламинов; C в форме карбонатов; Cl в форме хлоридов; P в форме фосфатов, фосфитов; S в форме сульфатов; H в форме кислот; ОН в форме оснований и в форме других подобных соединений.

Влияние взятых в качестве примеров компонентов на функциональные характеристики композитов гликанов

Композиты гликанов (GC) состоят из нескольких соединений, имеющих отличающиеся химические характеристики, каждое из которых вносит свой вклад в требуемые свойства композитов в целом. Лучше всего это подтверждается тем фактом, что при раздельном нанесении компонентов композита гликана на сельскохозяйственные культуры в поле, их действия не согласованы друг с другом. Непосредственное нанесение каждого компонента на раздельные группы растений возможно, но оно не является предпочтительным из-за отсутствия положительного эффекта. Поэтому, проводились эксперименты по исследованию функциональных характеристик взятых в качестве примеров композиты гликанов и, наряду с этим, доказывалось, что каждый в отдельности из компонентов не обладает действием, адекватным дей

- 8 040708 ствию композита.

Рост фотосинтезирующих сельскохозяйственных культур происходит в результате дыхательного метаболизма первичных продуктов фотосинтеза, обеспечивающего формирование, существование и воспроизводство. Однако соотношение дыхания к фотосинтезу составляет менее одной трети. Для повышения этого соотношения использовалось регулирование роста сельскохозяйственных культур за счет более эффективного использования первичных продуктов фотосинтеза для дыхания, чем раньше, путем применения композитов гликанов в соответствии с раскрытыми в изобретении вариантами осуществления. Этому способствовало эффективная обработка с помощью композитов гликанов в темноте (то есть в окружающей среде, которая не подвергается воздействию солнечного света), например, либо семян и корней под землей в течение дня, либо корней и/или всходов ночью. Для сельского хозяйства принесло бы большую пользу повышение урожайности за счет оптимизации обработки с помощью композитов гликанов семян, плодов, цветов, нектара сока, первичных продуктов фотосинтеза, корней, стеблей и/или стволов, то есть путем нанесения на всходы и/или корни этих новых систем. В совокупности, применение композитов гликанов для достижения положительного эффекта реализуется с помощью раскрытых в изобретении вариантов осуществления.

В отличие от фотосинтезирующих листьев семена являются полностью респираторными. Вследствие этого ускорение прорастания семян достигалось в результате нанесения на них чрезвычайно низких доз GC по сравнению с регулированием образования питательных веществ. Ответные реакции роста на ранних стадиях при применении раздельных компонентов сравнивали с применением комплексных GC, и проводили анализ результатов на статистическую значимость сравниваемых средних значений. Было четко показано, что раздельные компоненты не работают, но вместе они вносили свой вклад в общую эффективность. Кроме того, координационные соединения переходного металла²⁺ по варианту осуществления, которые включали полный набор d-переходных металлов²/ улучшали характеристики композитных препаратов.

Дыхание зависит от доступного кислорода (O₂), и поступление O₂ усиливали путем совместного нанесения или же путем обработки сельскохозяйственных культур с помощью GC для повышения O₂. Направленное повышение O₂ в конкретных местах, в частности, в корнях или семенах, более эффективно достигалось в полевых условиях путем применения O₂-генерирующих соединений, таких как пероксиды. Подходящие недорогие пероксиды включают Н₂О₂ и пероксиды карбамида, при этом хорошо известные O₂-генерирующие гранулированные соединения, такие как СаО₂ и/или MgO₂, медленно высвобождали O₂при обработке сельскохозяйственных культур с помощью GC. СаО₂ и MgO₂ обеспечивали создание обогащенных O2 окружающих сред, которые поддерживали дыхание, в частности, при нанесении на семена или корни в качестве отдельных источников кислорода в сочетании с препаратами по варианту осуществления. Пероксиды представляют собой O₂-генерирующие компоненты, которые могут быть введены в сухие препараты, но предпочтительно, чтобы их хранили и наносили на растение до, во время или после обработки с помощью GC. Пероксиды имеют тенденцию дестабилизировать и разлагать GCконцентраты, сокращая в результате срок их хранения.

Приводимый в качестве примера способ совместного применения для генерирования O₂ заключался в следующем. До обработки с помощью GC, жидкий Н₂О₂, 10-100 г гранулированного СаО₂ и/или MgO₂вводили в почву на глубину 15-30 см при расходе 50 кг/га в период вегетации, и/или раствор 10-20 г/л вводили с перемешиванием в заливочные среды или посадочные ямки в почве перед пересадкой. GC наносили путем подкормки в междурядье или орошения обрызгиванием на фотосинтезирующий организм на той же самой посевной площади. Затем, после обработки растения с помощью GC, пероксид медленно высвобождал О₂, усиливая дыхание в сочетании с действиями GC. Может быть осуществлено введение газообразного О2, главным образом, путем барботирования через жидкие среды до насыщения. Совместное применение O₂-генераторов с композитами гликанов давало синергетический эффект, что приводило к увеличению урожайности.

В условиях, когда содержание О2 не может быть повышено, применялись альтернативные способы создания способствующей дыханию среды, в которой фотосинтезирующие организмы подвергаются культивации. Так, например, обработка композитами гликанов проводилась в сочетании с воздействием на культуры ускорителей дыхания либо путем их добавления, либо путем включения в композиты гликанов. Ускорители дыхания выбирали из следующих реагентов: iP, такие как, например, соли фосфорной кислоты, такие как фосфаты аммония, калия и натрия; глифосфаты, такие как Gly-фосфаты, такие как Glc-фосфаты и Man-фосфаты, Glc₂-фосфаты, такие как маннобиоза-фосфаты, сахароза-фосфаты, трегалозо-фосфаты и ксилобиоза-фосфаты; регуляторы роста растений, такие как ауксины, и щавелевоуксусная, аконитовая, лимонная, фумаровая, глутаровая, яблочная и янтарная кислоты. Упомянутые выше кислоты также служат в качестве анионных компонентов координационных соединений, добавляемых при минимальном соотношении анион:катион 10:1.

Материалы и методы

Исследовали ответные реакции при воздействии различных компонентов композитных препаратов на прорастание и начальный рост дигибридной сахарной кукурузы Burpee Sweet Corn cv. Bi-Licious Hybrid. Экспресс-исследования роста всходов проводили с использованием гидропонного культивирования,

- 9 040708 при которых водные среды стерилизовали и охлаждали. Перед обработкой, семена проверяли с целью исключения слишком крупных, мелких или поврежденных семян. Растения выдерживали в темноте для дыхания при 30°С. Ровно 48 семян высевали в стерильную одноразовую пластиковую чашку Петри диаметром 15 см на кружках из ватманской бумаги, смоченной контрольным питательным веществом или растворами для обработки. Число репликаций равнялось 8 на одну обработку (n=8). Факт прорастания определяли по обнаружению появления первичных корешков у 50% контрольных семян через 30 ч. Растворы для обработки и контрольные растворы готовили путем растворения питательных веществ в деионизированной сверхчистой воде. Вместо сосудов и мешалок из нержавеющей стали использовали пластиковую лабораторную посуду для предотвращения попадания в растворы Ni²⁺ и других металлов. Взаимные загрязнения одних питательных веществ другими питательными веществами предотвращали путем утилизации пластмассовой лабораторной посуды сразу после использования. Исходные растворы готовили из химически чистых соединений. Исходные водные растворы гликанов для приготовления GC в этом исследовании содержали 1-15% дегликозилированных гликанов Mann, которые получали путем ацетолиза муки из плода фителефаса в смеси уксусная кислота:уксусный ангидрид:серная кислота 25:25:1. Растворы 0,0001-5% Са²⁺ и переходных металлов Fe²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ и Ni²⁺ (обозначаемых сокращенно как Cat) получали путем комплексообразования в смеси 1 мМ цитрата, 5 мМ малата и 1 мМ сукцината, обозначаемых сокращенно CMS. GC применяли при концентрации 10 мкМ Mann. Соли Са- и Mn-EDTA представляют собой связанные ионы, обозначаемые сокращенно EDTA. Другие применяемые концентрации составляли 1 мкМ Man₃ и 100 мкМ Man1. Man1-CatCMS приготавливали вместе с координационными соединениями переходных металлов²⁺ Cat-CMS для сравнения с Man1-EDTA и другими подобными. Воду использовали в качестве отрицательного контроля.

Результаты

Как показано в табл. 2, семена кукурузы, обработанные с помощью композита гликана GC, показали высоко значимое ускорение средних значений количества прорастаний (р=0,000) по сравнению с отдельными компонентами, Cat, гликаном, CMS, используемыми в одиночку. Количества прорастаний в случае CMS, гликанов и Cat были такими же, как и в случае воды, и не обнаруживалось никаких различий между водой и Cat. Композит гликана GC со всеми входящими в него компонентами показывал значимое улучшение по сравнению с G-EDTA. Композит гликана GC показывал незначительное значимое улучшение по сравнению с использованием гликана вместе с CaMn-CMS, что указывает на то, что все Cat повышали эффективность GC в большей степени, чем связанные ионы. Таким образом, как Cat, так и CMS в композите гликана GC способствовали прорастанию. Кроме того, композитные препараты, в которых гликаны были заменены на Man1 или Man₃ с Cat CMS, показывали значимое улучшение прорастания по сравнению с препаратами Man1 или Man₃ со связанными ионами и солями EDTA, которые не усиливали дыхание.

Выводы

В случае композита гликана GC со всеми входящими в него компонентами, компоненты оказывали положительное влияние на дыхание и рост, однако, напротив, применяемые раздельно индивидуальные компоненты не давали эффекта. Полный комплект переходных металлов²⁺ в Cat, в частности, в координационных соединениях переходных металлов²⁺ CMS, значимо улучшал характеристики продукта по сравнению с составами со связанными ионами. Выбор подходящих анионных компонентов для координационных соединений переходных металлов²⁺, которые облегчали дыхание, значимо улучшал характеристики композита гликана GC по сравнению с EDTA, которая не обладала таким эффектом. Примечательно, что активность композитов гликанов и Man₃ была на порядок выше активности композита Man1, что проявлялось прорастанием семян при гораздо более низких дозах обоих композитов, по сравнению с композитом Man1. Было обнаружено, что применение композитов приводит к значительным улучшениям препаратов Man1 и Man₃, что является неожиданным результатом исследований. А именно, применение композитов гликана GC с алкиламидными координационными соединениями переходных металлов²⁺после прорастания семян приводило к накоплению первичных продуктов фотосинтеза, в частности, в окружающей среде с пониженным парциальным давлением кислорода. Например, применение GCCaMnEDDHA за 1 неделю до сбора листьев салата-латука приводило к большему значению градусов по шкале Брикса, чем в случае композита гликана GC со всеми входящими в него компонентами и контрольных веществ.

Таблица 2. Воздействие компонентов препаратов на прорастание кукурузы показало, что композиты гликанов со всеми входящими в них компонентами имеют наилучшие функциональные характеристики. Статистическая значимость различий между средними показателями проросших семян, выращенных при обработке различными компонентами, по сравнению с обработкой унифицированным композитом гликана составляла приведенные в таблице значения, где Cat=нехелатированные Са²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Со²⁺ и Ni²⁺; CMS=цитрат, малат, сукцинат; EDTA=соли Ca-EDTA+соли Mn-EDTA; GC=GC CatCMS; G-CaMnCMS=гликан и Ca²⁺-Mn²⁺-CMS; подсчет=среднее число проросших семян; n=8 для всех репликаций и р=статистическая значимость.

- 10 040708

Сравниваемые методы обработки	Подсчет	Р
GC против гликана	46 против 23	0, 000
GC против CMS	46 против 23	0, 000
GC против Cat	46 против 23	0, 000
Cat против воды	23 против 23	0, 601
GC против G-EDTA	46 против 36	0, 043
GC против G-CaMnCMS	46 против 38	0, 054
Man₁CatCMS против Man₃EDTA	39 против 27	0, 025
Man₃CatCMS против Man₃EDTA	45 против 29	0, 016

Консерванты для жидких концентратов

Часто является выгодным производить продукты композита гликана в форме 10 ppm - 30% концентратов, которые можно транспортировать в сухой или жидкой форме и, кроме того, хранить в холодных, сухих, темных условиях, но для органических соединений, которые входят в состав композитов гликанов, является присущем то, что комплекс потреблялся различными и разнообразными микробами, а также клетками растений. Поэтому должны приниматься меры для предохранения композиций от порчи, особенно водных продуктов. В случае хранения, особенно жидких композиций, в состав могут быть включены подходящие консерванты для повышения стабильности продуктов. Выпускаемые промышленностью консерванты включают биоциды и гермициды, такие как, например, пероксиды, гипохлориты натрия, отбеливающие вещества, кислоты, основания, окислители, высвобождающие формальдегид консерванты, такие как 1,3-диметилол-5,5-диметилгидантоин, кватерний-15, бронопол, диазолидинил мочевина, Na-гидроксиметилглицинат, серебро, ацетат меди, перманганаты, динитроморфолины, фенольные соединения, такие как 4-хлор-3-метилфенол и 2-фенилфенол, тиазолиноны и предпочтительные изотиазолиноны (IT), такие как бензоизотиазолиноны (BIT), метилсхлоризотиазолиноны и метилизотиазолиноны (MIT). IT представляет собой растительный противомикробный препарат, применяемый в концентрациях в диапазоне 1-800 ppm. Консерванты рекомендуется для введения в состав жидких концентратов композитов гликана в диапазоне концентраций, указанных на этикетках, от 1 ppm до 1%. Например, BIT был безопасным и эффективным при содержании его в жидких концентратах в диапазоне от 50 до 750 ppm, предпочтительно, от 100 до 300 ppm. Таким образом, жидкий препарат композита гликана может быть смешан с любым противомикробным средством, и эти средства должны быть выбраны из растительных консервантов в соответствии с раскрытыми в изобретении вариантами осуществления. В продукте композита гликана, представляющего собой концентрат композиции с содержанием от 10 ppm до 30% композита гликана для разбавления перед нанесением на культуры фотосинтезирующих организмов для повышения их урожайности, подходящий концентрат включает один или более дегликозилированных гликанов в диапазоне концентраций от 1 ppm до 20% и одно или более координационных соединений переходных металлов²* в диапазоне концентраций от 1 ppm до 10% и консервант в диапазоне концентраций от 50 ppm до 1% по массе.

Взятый в качестве примера консервант сохраняет активность композитов гликанов

Сравнивали влияние консервантов на активность композитов гликанов в качестве регуляторов роста растений. В экспериментах количественно оценивали рост корней. Результаты показали, что активность препаратов с консервантами сохранялась после хранения в течение одного месяца. В отличие от этого препараты без консервантов теряли свою активность.

Материалы и методы

Исследовали рост корней на ранней стадии всходов листовой свеклы (Beta vulgaris subspecies cicla L., cultivar Fordhook® Giant) на ответную реакцию при обработке композитами гликанов (GC), дополненных консервантом BIT. В предварительных экспериментах были исключены консерванты, которые имели узкий спектр противомикробного действия, не подходили для использования в пищевых продуктах или которые были токсичными для растений в диапазоне противомикробных доз. Корни всходов листовой свеклы демонстрировали ответные реакции по увеличению роста в длину в течение недели нанесения GC и это согласовывалось с увеличениями массы. Был выбран разветвленный N-связанный гликан, 100 ррт дегликозилированного Man₃GlcNAc₂, для получения смеси композита гликана путем перемешивания в воде. Кроме того, композит гликана приготавливали путем перемешивания анионного компонента 5 mмM яблочной кислоты в водном растворе гликана с водорастворимыми нитратными солями металла²*, что давало в результате 5 мМ координационного соединения малата переходного металла²* с содержанием 1-5 ppm Са²* и переходных металлов 1-3 ppm Fe²*, 0,1-0,5 ppm Mn²*, 0,2-1 ppm Zn²*, 0,01-0,1 ppb Co²* и 0,001-0,01 ppb Ni²*. Из IT противомикробных веществ выбирали консервант Proxel™ GXL и использовали его при приготовлении продуктов жидких концентратов от 1 ppm до 30% для хранения в диапазоне концентраций консерванта 100-200 ppm. Препараты хранили в течение месяца при 35°С перед испытанием. Концентрированные препараты разбавляли в необходимом объеме воды непосредственно перед обработкой всходов. В растворы вводили химически чистые соединения других требуемых эле

- 11 040708 ментов.

Экспресс-исследования роста корней основывались на модифицированных методах упомянутого выше гидропонного культивирования на увлажненных кружках из ватманской бумаги Whatman 598 Seed Culture, и растворы для обработки и водные среды не стерилизовали перед применением. Массы корней в миллиграммах определяли путем взвешивания на поверенных цифровых весах Mettler. Используемая в изобретении терминология обозначает неприменение или применение питательных веществ следующим образом: GC=10 мкМ композита гликана без IT, GC-IT=GC с IT; Man1=100 мкМ Man1-GC без IT, Man1IT=Man_rGC с IT; MG=375 мМ метил-D-GlcrGC без IT, MG-IT=MG с IT; Man₃=1 мкМ Man₃-GC без IT, Man₃-IT=Man₃-GC с IT.

Консерванты сохраняют активность находящихся на хранении препаратов

При обработке после прорастания всходов листовой свеклы композитом гликана без консерванта, его активность была в два раза меньше активности того же самого препарата с IT. Результаты в виде средних значений±стандартная погрешность (SE) представлены в табл. 3. Удвоение (2Х) концентрации препаратов композита без IT приводило к более высокой массе корней по сравнению с контролем, но при 20% снижении массы по сравнению 1X концентрациями композита гликана с IT. Препараты без консерванта теряли, по меньшей мере, половину их активности после 1 месяца хранения. Сохранение исходной активности препаратов GC с консервантами демонстрирует четко выраженное улучшение всех продуктов, которые должны храниться до их продажи конечным потребителям и до их применения.

Таблица 3. Влияние композитов, содержащих или не содержащих консервант IT, на рост корней всходов листовой свеклы характеризуется в таблице массой корней. Препараты исследовали после 1 месяца хранения, и препараты с IT демонстрировали более высокие результаты, чем препараты без IT. Средние величины массы корней в случае препаратов без IT были эквивалентны результатам в случае воды в качестве контроля. Величины представляют собой среднее значения измеренной в миллиграммах (мг) массы корней±стандартная погрешность (SE). Сокращения: GC=GC без IT, GC-IT=GC с IT; и так далее. Man1=Man_rGC; MG=метил-D-GlC1-GC; Man3=Man3-GC.

Обработка	Среднее значение + SE (мг)
GC-IT	12 + 0,3
Man₃-IT	12 + 0,4
Мап₃-1Т	11 + 0,5
MG-IT	11 + 0,6
2X GC	10 + 0,5
2X Man₃	10 + 0,6
GC	8 + 0,4
Man₃	8 + 0,5
Man₃	8 + 0,6
MG	8 + 0,6
Вода	8 + 0,5

В примере, изображенном на фиг. 1, клетка растения подвергалась воздействию раствора композита гликана, который доставлялся внутрь клетки. В соответствии с аффинностью и специфичностью связывания гликопротеина, композит гликана вытеснял первичные продукты фотосинтеза из хранилища, делая их доступными для процессов дыхания, роста и прорастания. Этот перенаправленный поток энергии приводил в результате к согласованному более быстрому прорастанию, чем в случае с контрольными питательными веществами, наряду с другими важными характеристиками.

Подходящий метод приготовления композита гликана заключается в следующем. В конкретных вариантах осуществления, композит гликана приготавливали с одним или более из упомянутых выше переходных металлов²⁺. Для приготовления координационного соединения переходного металла²⁺, один или более соответствующих анионных компонентов, таких как, например, 0,1-5 мМ лимонной кислоты, яблочной кислоты, янтарной кислоты и/или щавелевоуксусной кислоты, добавляли и растворяли в воде, и затем ppb - ppm количества подходящих компонентов металлов²⁺ компонентов координационных соединений переходных металлов²⁺ перемешивали для растворения в водном препарате. Таким образом, например, добавленными компонентами металлов²⁺ являлись 1-10 ppm Са²⁺ и 0,1-1 ppm Mn²⁺, один или более из 1-10 ppm Mg²⁺, 1-3 ppm Fe²⁺ и 0,2-1 ppm Zn²⁺, и 0,01-0,1 ppb Co²⁺ и 0,001-0,01 ppb Ni²⁺. Для образования соответствующих координационных соединений переходных металлов²⁺ необходимо обеспечивать соответствующие соотношения катион переходного металла²⁺:анион, по меньшей мере, 1:10, и, предпочтительно, 1:25. Приготовление композита гликана заканчивалось добавлением координационных соединений переходных металлов²⁺ к количеству гликана от 1 мкМ до 500 мМ. Препараты, которые должны были храниться в течение более одного дня перед их нанесением на растения, включали указанные на этикетке количества консерванта широкого спектра действия, выбранного из IT, BIT, MIT, гидантоина и других подобных консервантов. Метод может также включать стадию добавления одного или

- 12 040708 более поверхностно-активных веществ/эмульгаторов сельскохозяйственного назначения и/или других агрономических добавок/вспомогательных веществ в указанных на этикетке количествах, которые позволяют достигать, по меньшей мере, критических концентраций мицеллообразования, в частности, для некорневого внесения.

Подходящие поверхностно-активные вещества и эмульгаторы включают анионные, катионные, неионные и цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества, например, амины, этоксилаты алкилфенолов, фосфатные эфиры, полиалкиленоксиды, полиалкиленгликоли, эфиры полиоксиэтилена (РОЕ) с жирными кислотами, РОЕ с жирными диглицеридами, РОЕ полимеры, POP полимеры, PEG полимеры, белковые поверхностно-активные вещества, эфиры сорбита с жирными кислотами, этоксилаты спиртов, этоксилаты эфиров сорбита с жирными кислотами, этоксилированные алкиламины, четвертичные амины, этоксилированные эфиры сорбита, замещенные полисахариды, алкилполиглюкозиды (APG), APGцитраты, алкилгликозиды, такие как метилглюкозиды, алкилманнозиды, метилманнозиды, этилацетоацетаты, N-ацетилглюкозамины, меглумины, глюкамиды, диметилглюкамины, сополимеры, силоксаны, амины из говяжьего и бараньего жира и их смеси. При нанесении композитов гликанов на листья, препарат может дополнительно включать один или более водных поверхностно-активных веществ, и нанесение полученной смеси на листву растения осуществляют путем разбрызгивания, аэрозольного орошения, мелкокапельного опрыскивания или электростатическим методом в количестве приблизительно от 1 до 100 галлонов (от 3,78 до 378 л) на акр (4047 м²), предпочтительно, от 10 до 80 галлонов (от 37,8 до 302,8 л) на акр (4047 м²).

Смеси GC с питательными веществами поддерживали жизнеспособность растений, способствовали развитию корневых систем, усиливали рост растения, улучшали внешний вид цветочных растений, способствовали плодоношению и улучшали вкус и запах плодов, обеспечивая воздействие, которое было особенно важным для почв и воды с дефицитом питательных веществ. Главные первичные элементы включают N-P-K. Главные вторичные питательные элементы включают Са, Mg и S. Главные питательные микроэлементы включают В, Cl, Со, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Si, Na и Zn. Предпочтительные питательные вещества выбирают не для того, чтобы исключить другие элементы, ионы или соли, и, в зависимости от ситуации, они могут быть доступны в почве и в воде, в частности, в таком изобилии, при котором подкормка для повышения урожайности не нужна, поэтому, подкормку питательными веществами применяют в соответствии с нормами, согласованными с органами государственного регулирования и контроля в сельском хозяйстве, следуя инструкциям на этикетках. Подходящие источники включают обычно хорошо известные соли и минералы. Например, самый предпочтительный выбор питательных микроэлементов для композиций может включать 0,5-5 ppm хелатированных Fe и/или Zn и нанесение подходящего количества полученной смеси на одно или более растений.

Фосфорсодержащее питательное вещество для растений может быть получено из одного или более из следующих источников: iP, фосфорная руда, фосфорные кислоты, фосфаты, фосфиты, пирофосфаты, Steric P, гуано, навоз, экстракты из морских водорослей, птичий помет, отходы рыбоводства, птицеводства и животноводства и другие подобные источники. Органические источники P как правило являются слишком дорогими для применения на полях с концентрациями в диапазоне 1-20% iP, однако при концентрациях ниже 1% они часто оказываются эффективными в качестве ускорителей дыхания. Органические источники P, включавшие, например, глицерофосфаты и упомянутые выше фосфаты Сахаров использовали в диапазоне концентраций от 0,1 ppm до 800 ppt.

Азот может быть получен из одного или более из следующих источников: нитратный N, такой как азотная кислота и ее соли, аммонийный N, такой как аммиак, мочевино-аммониевый нитрат (UAN), нитрат аммония, сульфат аммония; N мочевины, такой как метиленмочевина, формальдегидмочевина, мочевина, мочевина с низким и предпочтительно предельно низким содержанием карбамилмочевины; N аминов/амидов/амино, таких как аланин, аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамат, глутамин, глицин, орнитин, пролин, селеноцистеин, таурин, тирозин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин; соли, такие как глутамат натрия или калия; производные; смеси и другие подобные соединения; и смеси аминокислот; белки, такие как белки из глютенов, казеинов, рыбы и крови; гексамины и их комбинации. Питательные элементы метаболизировались до всех биохимических компонентов, компонентов роста, репродуктивных и структурных компонентов фотосинтезирующих организмов.

Применение композитов гликанов предоставляет возможность восполнить дефицит питательных веществ в растениях путем использования баковых смесей или путем применения препаратов композитов гликанов с выбранными добавками. Количества питательных веществ для растений наносили в соответствии с приведенными на этикетке данными гарантийного анализа, проводимого органами управления, при известных нормах расхода. Подкормка включала стадии растворения компонентов питательных веществ для растений в водном растворе с получением в результате смеси, включающей композиты гликанов. Например, в конкретных вариантах осуществления, в композиты гликанов добавляли 100-2000 ppm N, 50-250 ppm P, 50-2000 ppm K, 1-100 ppm Са, 1-10 ppm Fe, 0,5-6 ppm Mn и/или 0,5-5 ppm Zn. Различные препараты композитов гликана могут быть отнесены к биостимуляторам растений, которые могут повышать эффективность использования питательных веществ растениями, повышать устойчивость

- 13 040708 растений к абиотическому стрессу и увеличивать урожайность. Биостимуляторы обычно включают природные продукты, такие как, например, растения, водоросли, метаболиты процесса ферментации и метаболиты животных организмов, гуматы, продукты жизнедеятельности микробов, биохимические продукты и другие подобные природные продукты. Другие препараты композитов гликана могут быть отнесены к элиситорам, которые обычно включают природные продукты, такие как, например, водоросли, метаболиты процесса ферментации и метаболиты животных организмов, белки, ферменты, продукты жизнедеятельности микробов и другие подобные природные продукты.

Раскрытые в изобретении варианты осуществления применительно к сельскохозяйственным культурам представляют собой композиты гликанов, приготовленные в форме композиций, соединения которых сами по себе служат в качестве средств для контроля фотосинтезирующих организмов, в том числе живых фотосинтезирующих эукариотов, и, в значительной мере, сельскохозяйственных архепластидовых растений. В связи с этим, композит гликана может быть соответствующим образом приготовлен с агрохимикатами и использован в форме водных композиций, которые способствуют росту фотосинтезирующих организмов, в частности, выращиваемых цветковых растений. Раскрытые в изобретении способы могут быть применены для безопасного усиления сбалансированного метаболизма экзогенных компонентов, которые способствуют повышению урожайности фотосинтезирующих организмов. Вместе с тем одновременно, они могут представлять собой способы применения композиций композита гликана для приносящих положительный эффект обработок фотосинтезирующих организмов, которые, кроме того, могут быть проведены для усиления нормального роста и повышения качества сельскохозяйственных культур.

Не приводя в качестве подтверждения какую-либо теорию, автор изобретения, тем не менее, предполагает, что композиты гликанов по раскрытым в изобретении вариантам осуществления действуют в соответствии со специфическим механизмом замка и ключа. Гликан с подходящим терминальным лигандом проявляет высокую аффинность связывания к специфическому рецептивному гликопротеину. Замком является гликопротеин, а ключом является терминальный лиганд. Переключателями гликопротеина-замка являются внутренние участки структур кальция и марганца. При открытии замка гликановым ключом происходит вытеснение первичных продуктов фотосинтеза с целью их накопления или переноса для участия в процессе дыхательного метаболизма, и, в результате, открывается возможность для выбора ускорителей дыхания в анионных компонентах координационного соединения переходного металла²⁺. В дневное время корни потребляют эти первичные продукты фотосинтеза. В результате дыхания корней образуется углекислый газ, часть которого (от 10 до 20%) переносится вверх в побеги, в силу чего улучшаются результаты фотосинтетической фиксации углерода. Таким образом, композит гликана может применяться для снижения энергетических потерь при фотодыхании путем проведения этих обработок фотосинтезирующих организмов с воздействием на нектар сока, который модулирует качество сахаристости, измеряемое по шкале Брикса. В частности, композит гликана может оказывать положительное воздействие на урожайность, когда, например, растения выращивают в условиях окружающей среды с фотореспираторными стрессами, таких как интенсивные солнечные лучи, засуха и жара. Кроме того, в вариантах осуществления предлагаются системы композита гликана для регулирования накопления первичных продуктов фотосинтеза путем снижения скорости дыхания с целью улучшения органолептических и питательных характеристик, воспринимаемых потребляющими сельскохозяйственную продукцию людьми, домашним скотом, домашней птицей, а также собираемого насекомыми-опылителями нектара.

В соответствии с раскрытыми в изобретении вариантами осуществления, предлагается новая система регуляции роста растений, которая улучшает фотосинтезирующее выделение для запуска накопления фотосинтезирующими организмами первичных продуктов фотосинтеза. Это инициируется, например, путем создания новых воздействий на сельскохозяйственные культуры композитов гликанов, которые могут быть нанесены на фотосинтезирующие организмы. Композиты гликанов могут состоять из разветвленных гликанов с соединениями переходных металлов²⁺ с полидентатными анионами. Предпочтительными анионами этого варианта осуществления являются алкиламиды, выбранные из солей EDTA, EDDHA, HeEDTA, DTPA, HBED, MGDA, GLDA и других подобных кислот. Кроме того, могут быть созданы обедненные по кислороду окружающие среды при пониженном парциальном давлении кислорода в диапазоне 0-10% О₂ с помощью физических методов снижения скорости дыхания, таких как заливка корней ирригационной водой, выдерживание растений или их частей в атмосфере азота или повышение концентраций СО₂. В качестве варианта, снижающие скорость дыхания вещества могут быть выбраны из подходящих регуляторов роста растений, совместно применяемых в соответствии с известными разрешенными в сельском хозяйстве методами, например, регуляторы роста растений в дозах 1-750 ppm выбирали из различных подходящих цитокининов, салициловых кислот и/или гибереллинов и их производных и других подобных соединений.

Фотосинтезирующие организмы дают соответствующую ответную реакцию на применение компонентов композитов гликана, предпочтительно, соответствующим образом приготовленных и превращенных в активные препараты, благодаря чему они способствуют росту и повышению качества фотосинтезирующих организмов, а также обеспечивают совокупность положительных физиологических воздействий, что повышает их рыночную привлекательность.

- 14 040708

В соответствии с раскрытыми в изобретении вариантами осуществления состоящие из компонентов комплексы по вариантам осуществления могут быть нанесены раздельно, последовательно или одновременно. Более того, особенно в условиях физиологического стресса, в результате воздействия композитов гликанов на нектар сока фотосинтезирующего организма повышалась урожайность за счет увеличения потока первичных продуктов фотосинтеза в направлении протекания респираторного метаболизма в фотосинтезирующих организмах в соответствии с упомянутым выше механизмом замка и ключа по раскрытым в изобретении вариантам осуществления.

В конкретных вариантах осуществления, продукты концентратов композитов гликана в композициях, включающих, по меньшей мере, дегликозилированные гликаны в диапазоне концентраций от 0,1 ppm до 30% и одно или более координационных соединений переходных металлов²⁺ в диапазоне концентраций от 0,1 ppm до 20%, могут быть легко приготовлены для применения путем растворения количества композитов гликанов в предпочтительном носителе воде. Альтернативные носители включают, например, растительные и минеральные масла, алкилацетоацетаты или алифатические спирты. Поэтому для сельхозпроизводителя является удобным смешать готовый раствор, содержащий композиты гликанов, с водой, которая является предпочтительным носителем для конечного разбавления. В большинстве случаев перемешивание и нагревание при 25-80° облегчает растворение сухого продукта в носителе. Композит гликана может применяться в аграрных системах на водной основе, таких как гидропонное и водное культивирование, путем дозированного введения с помощью насосов в среду, путем погружения корней в разбавленные композиты гликанов или путем некорневой обработки.

Используемые препараты могут включать любые из большого разнообразия применяемых в агротехнике добавок, вспомогательных веществ или других удовлетворяющих агротехническим требованиям ингредиентов и компонентов (далее называемые добавками), которые могут улучшать или, по меньшей мере, не ухудшать положительные воздействия композита гликана при указанных на этикетке его норм расхода при нанесении. Общепринятые добавки для агротехнического применения периодически вносятся в перечень Управления по охране окружающей среды США. В частности, композиции для некорневого применения могут содержать вещества-распределители, присутствующие в количестве, достаточном для дополнительного промотирования смачивания, эмульгирования, равномерного распределения и проникновения активных веществ. Веществами-распределителями обычно являются органические алканы, алкены или полидиметилсилоксаны, которые обеспечивают при обработке покрывающее действие на филлоплане. Подходящие вещества-распределители включают парафиновые масла и упомянутые выше поверхностно-активные вещества. Пенетранты включают, например, алкилацетоацетаты, додецилсульфат натрия, формамиды, диметилсульфоксид и спирты.

Приведенные в изобретении варианты осуществления могут применяться при смешении или приготовлении баковой смеси с различными средствами для обработки растений, такими как удовлетворяющие агротехническим требованиям пестициды, инсектициды, гербициды, регуляторы роста растений, фунгициды, гермициды, биоциды, элиситоры, биостимуляторы, антагонисты, антитранспиранты, синергисты, системные препараты, поверхностно-активные вещества, вещества-распределители, клейкие заполнители, витамины, минералы, соли, растворители, генетические препараты, биопрепараты и другие подобные средства. Гербициды, действие которых основано на метаболизме аммиака, например, глюфосинаты, Ignite®, Rely® и Liberty®, становится более безопасными в использовании в результате применения композитов гликанов, снижающих фитотоксичность в отношении гербицид-резистентных генномодифицированных сельскохозяйственных культур, при нанесении с указанными на этикетке нормами расхода.

Примеры подходящих добавок и вспомогательных веществ включают минералы, такие как известняк, железные опилки и другие подобные вещества; соли, такие как нитрат аммония, сульфат аммония, фосфат калия, перманганат кальция, фосфаты кальция, ацетаты кальция, аконитаты кальция, цитраты кальция, цитраты фосфаты кальция, фумараты кальция, малат кальция, малонат кальция, малеат кальция, малат фосфат кальция, глюконаты кальция, глутараты кальция, СаО2, сукцинаты кальция, хелаты кальция, нитрат кальция, глицерофосфат кальция, фосфаты марганца, ацетаты марганца, цитраты марганца, фумараты марганца, глутараты марганца, родохрозит, карбонаты марганца, оксиды марганца, MgO₂, малат марганца, малонат марганца, малеат марганца, сукцинаты марганца, хелаты марганца и другие подобные соли; сорастворители, такие как спирты, кетоны, масла, липиды, вода и другие подобные сорастворители; генетически модифицированные организмы и генетические материалы, такие как Bt, гены, последовательности, РНК, ДНК, плазмиды, геномы и другие подобные организмы и материалы; биоорганизмы, такие как микробы, дрожжи, бактерии, вирусы, векторы и другие подобные организмы; и окрашивающие вещества, красители и пигменты, такие как аннатто, метиленовые красители, кобальтовая синь и индикан. Другие компоненты, которые могут быть добавлены в композиции, включают структурообразователи почвы, антибиотики, регуляторы роста растений, генно-модифицированные продукты, геннотерапии и другие подобные компоненты. Среди регуляторов роста растений, которые могут быть добавлены в препараты по настоящему изобретению, необходимо упомянуть ауксины, брассинолиды, цитокинины, гибереллины, салицилаты, бензиладенин, аминокислоты, бензоаты, карбоновые кислоты,

- 15 040708 витамины, углеводы, гербициды, такие как, фосфонометилглицины, галогенсульфуроналкилы, селективные гербициды, такие как сетоксидимы и сульфонилмочевины, их соли, эфиры, фосфаты, гидраты и производные и генетические композиции.

Технология обработки композитом гликана предназначена для применения на сельскохозяйственных культурах, но без ограничения, в темных и затемненных условиях в течение периодов максимального дыхания растений, а также в условиях воздействия прямых солнечных лучей. Обычно, композиты гликанов легко наносятся непосредственно на всходы и/или корни и/или семена, и/или их части, включая кутикулу, кожицу, цветок, плод, сок, нектар, кору, ствол, листья, хвою, листовую пластинку, филлоплану, сердцевину дерева, трихому, корневой волосок, стержневой корень, семядолю, шишку и другие подобные объекты. Концентрация композитов гликанов в препаратах, наносимых на фотосинтезирующие организмы, должна, как правило, составлять приблизительно от 1 ppb до 1% и более предпочтительно приблизительно от 10 ppb до 500 ppm. Для конкретных применений, концентрация в месте нанесения может быть ниже в случае корней, чем в случае всходов, так, например, в случае нанесения на корни, концентрации составляют 1 ppb - 300 ppm. Композиты гликанов могут быть нанесены на среду укоренения и затем пролиты водой или могут сначала быть разбавлены в водном носителе и затем нанесены на среду. На листве обработку обычно проводят путем применения аэрозольного орошения, образования тумана, распыления, капельного орошения, струйного орошения, погружения, нанесения слоя покрытия или совместного распыления и пропитки при концентрациях композита гликана от 1 ppb до 1%. При разбавлении в водном носителе, полученный разбавленный композит гликана наносят на фотосинтезирующий организм в количестве приблизительно от 1 до 500 галлонов/акр (от 3,78 до 1892 л/4047 м²).

Далее приводятся примеры для иллюстрации раскрытых в изобретении вариантов осуществления и их ни в коем случае не следует рассматривать в качестве ограничений для настоящего изобретения. В этих примерах очищенную воду получали методом обратного осмоса, компоненты координационного соединения переходного металла²⁺ и поверхностно-активные вещества приобретали в фирме Brandt. Условные сокращенные обозначения, используемые в следующих далее примерах, определяются следующим образом: ° обозначает °С; Sil обозначает смесь органосилоксан/сополимер; 12-26-26 обозначает Brandt 12-26-26 Micro, N-P-K с В, Cu, Fe, Mn, Mo и Zn; aManda обозначает метил-a-D-Mann, n=1-3; GG обозначает комбинации разветвленных О-связанных Gal1-12Man2 из частично гидролизованной гуаровой камеди; Ag обозначает GlcNAc1-3; Ethan обозначает разветвленные Man3GlcNAc2 (фиг. 2); Cat обозначает смесь растворимых 1 ppm Fe²⁺, 0,5 ppm Mn²⁺, 0,5 ppm Zn²⁺, 0,01 ppb Co²⁺ и 0,01 ppb Ni²⁺; CMS обозначает координационное соединение переходного металла²⁺ с 0,1-5 мМ цитрата, малата, малеата и/или сукцината; IT обозначает изотиазолиноновые консерванты; MnCO3 обозначает карбонат марганца; AMS обозначает сульфат аммония; MKP обозначает монокалийфосфат; DKP обозначает дикалийфосфат; MAP обозначает моноаммонийфосфат; DAP обозначает диаммонийфосфат; NH4OH обозначает гидроксид аммония; KOH обозначает гидроксид калия; Са(ОН)₂ обозначает гидроксид кальция; л обозначает литр; мл обозначает миллилитр; мг обозначает миллиграмм; г обозначает грамм; кг обозначает килограмм; мМ обозначает миллимоль; питательные микроэлементы обозначают следовые количества растворимых В, Са, Со, Cu, Fe, Mg, Mn, Mo, Ni, Zn и KOH, Ca(OH)₂, NH4OH, MnCO₃, MAP, DAP, MKP и DKP являются питательными веществами для растений и буферными веществами.

Далее приводится примеры конкретных препаратов, которые могут быть успешно использованы в способах для обработки фотосинтезирующих организмов, таких как растения, и для усиления роста растений. Приведенные далее примеры предназначены для того, чтобы облегчить специалистам в этой области понимание настоящего изобретения, и они не представляют исчерпывающий перечень препаратов, которые входят в объем раскрытых вариантов осуществления.

Пример 1. Препарат композита гликана для корневого нанесения

Ингредиент

Диапазон концентраций г/л

Предпочтительная концентрация г/л

Ethan	От 10 ppb до 1 ppm	100 ppb
Аконитовая кислота	0,001-10	0, 05
	Диапазон концентраций ppm	Предпочтительная концентрация ppm
Са²⁺	1-10	5
Cat	0,01-10	3

Этот препарат может быть дополнительно дополнен компонентами координационных соединений переходных металлов²⁺, выбранных из цитратов, фумаратов, глутаратов, малатов, оксалоацетатов, сукцинатов и Mg.

Композиты гликанов для корневого нанесения растворяли в 1 л воды при перемешивании при ком- 16 040708 натной температуре от 25 до 35 °С и доводили величину рН до 5-7 путем титрования с помощью KOH.

Приготовленный препарат наносили как можно ближе к корням либо в междурядье, либо путем капельного орошения, при норме расхода от 50 до 450 галлонов/акр (от 189 до 1703 л/4047 м²). При использовании полива обработку проводили путем пролива почвы в направлении корней с целью повышения качества и количества первичных продуктов фотосинтеза.

Пример 2. Препарат композита гликана для некорневого нанесения

Ингредиент	Диапазон концентраций г/л	Предпочтительная концентрация г/л
Яблочная кислота	0,7-50	3,5
GG	0,001-10	1
AMS	0, 6-3	3
Sil	0, 3-3	0,8
	Диапазон концентраций	Предпочтительная
	ppm	концентрация ppm
Са²⁺	1-100	1-5
Cat	0,1-6	1-3

Са и Cat растворяли вместе с яблочной кислотой в 1 литре воды. Добавляли другие ингредиенты, растворяя последовательно каждый в отдельности, и величину рН раствора доводили до 5-5,5 путем титрования с помощью DKP/MAP, в случае необходимости. Координационные соединения переходных металлов²⁺ выбирали из 0,01 ppb Ni и Со, и координационные соединения переходных металлов²⁺ могут включать в количестве от ppm до ppt аконитаты, цитраты, фумараты, глутараты, оксалоацетаты и/или сукцинаты. Нанесение на листья путем обрызгивания проводили до появления на них блеска при норме расхода приблизительно 75-100 галлонов/акр (284-378 л/4047 м²), что давало в результате увеличение первичных продуктов фотосинтеза, повышение качества и урожайности.

Пример 3. Препарат композита гликана для нанесения на поля и на цветущие растения

	Предпочтительная концентрация	Верхний предел концентраций
Ингредиент	г/л	г/л
12-26-26	0,3	10
Ад	0,1	0, 5
Са²⁺	0, 005	1
Янтарная кислота	0,7	5, 0
Препарат для нанесения на поля и на цветущие растения
Компоненты предварительно смешивали в форме сухих концентратов для приготовления набора, в виде которого сухие компоненты хранили и позже растворяли в воде.
Для приготовления смеси, компоненты перемешивали в 1 л воды до их полного растворения. Раствор наносили непосредственно на корни. Подкормку с помощью 0,5-3 г/л CMR или других аграрных увлажняющих средств проводили путем

некорневого нанесения

Препарат для нанесения на поля предпочтительно наносили путем орошения листьев всходов растений при норме расхода от 50 до 100 галлонов/акр (от 189 до 378 литров/4047 м²) для увеличения первичных продуктов фотосинтеза, повышения качества и урожайности.

Кроме того, в этот раствор могут быть добавлены координационные соединения переходных металлов²⁴, выбранных из N1, Со; аконитовая, лимонная, фумаровая, глутаровая, яблочная и щавелевоуксусная кислоты; EDTA, EDDHA, HeEDTA, DTPA, HBED, MGDA, GLDA; Mg и другие подобные компоненты.

- 17 040708

Пример 4. Концентрат для некорневого нанесения

Ингредиент	Диапазон концентраций г/л	Предпочтительная концентрация г/л
aManda	1-20	5-15
Cat	1-10	5
Са²⁺	0,001-5	0, 03
Лимонная кислота	1-50	5-15
МКР/DAP, pH 5	1-25	5-15
Консервант BIT	0,01-0,8	0, 1

Кроме того, в этот препарат могут быть добавлены анионные компоненты координационных соединений переходных металлов²⁺, такие как, например, ускорители дыхания, выбранные из аконитовой, фумаровой, глутаровой, яблочной, щавелевоуксусной, янтарной кислот и других подобных соединений. В качестве варианта, для накопления первичных продуктов фотосинтеза, анионные компоненты выбирали из полидентатных хелатообразующих веществ, таких как EDTA, EDDHA, HeEDTA, DTPA, HBED, MGDA, GLDA и другие подобные вещества.

Все компоненты смешивали до гомогенности в водном растворе при быстром перемешивании до полного растворения и доводили величину рН до 5-5,5 с помощью MKP/DAP. Для некорневого нанесения, в этот препарат добавляли 0,05% Sil для обработки всходов при норме расхода 20-100 галлонов/акр (75,7-378 л/4047 м²) для усиления образования первичных продуктов фотосинтеза и дыхания у сельскохозяйственных культур.

Эксперимент по некорневому внесению в этом примере проводили следующим образом. Отбирали подходящую рассаду болгарского перца и содержали в пластиковых контейнерах с объемом около 2 л, в каждом из которых рассада была разделена на две равные группы, подвергаемой обработке препаратом композита гликана и подвергаемой обработке контрольными питательными веществами. Композит гликана из этого примера разбавляли до 1% водой и наносили на всходы в подвергаемой обработке группе путем некорневого орошения, в то время как всходы в контрольной группе подвергали орошению водным раствором минеральных питательных веществ с той же концентрацией. С точки зрения всех других параметров, контрольную и подвергаемую обработке группы выращивали рядом друг с другом в одинаковых полевых условиях. При сборе урожая, в подвергнутой обработке группе урожай плодов болгарского перца в среднем превышал на 35% урожай в контрольной группе, что подтверждалось статистической значимостью р=0,001 при n=30. Кроме того, в подвергнутой обработке группе отсутствовали плоды с солнечным ожогом, в то время как в контрольной группе потери плодов от солнечного ожога составляли 1-5%, что снижало их рыночную реализацию вследствие непривлекательного вида. Таким образом, усиление потока первичных продуктов фотосинтеза приводило к повышению товарного урожая, обусловленного улучшением эстетического вида конечного продукта в результате обработки препаратом композита гликана.

Регулирование потока первичных продуктов фотосинтеза с помощью композитов гликанов, состоящих из aManda, кроме того, осуществлялась путем необязательного совместного внесения ускорителя дыхания при норме расхода 10-100 г СаО₂ в почву около корней для повышения качества и урожайности.

- 18 040708

Пример 5. Пример регулятора роста растений (PGR) для некорневого применения

Компонент	Диапазон концентраций %	Предпочтительная концентрация %
GG	0,01-10	1
Яблочная кислота: малеиновый ангидрид	0,7-50	1
Вода	5-80	53
КОН	pH 5-7	pH 5, 5
Cat-малат	0,01-1	0, 1
Са-глутарат	0,01-0,3	0, 1
Sil	0,3-3	0, 8
Инструкции по смешению
Для лизиса в яблочной кислоте, в 50% водный раствор смеси яблочная кислота:малеиновый ангидрид 1:1 добавляют GG и 1% серную кислоту и нагревают до 70°С в течение 8-24 часов. Добавляют оставшиеся сухие кристаллы в 0,5 л воды при перемешивании, и после полного растворения добавляют раствор жидкости в водный раствор при быстром перемешивании, например, перемешивании с помощью мешалки. Доводят суммарный объем до 1 л путем добавления воды. Доводят до требуемой величины pH с помощью NH₄OH или КОН.
После смешения компонентов, их разбавляют водой, если это необходимо, и наносят на листву всходов растений методом опрыскивания, предпочтительно, при норме расхода 10-100 галлонов/акр (37,8-378 литров/4047 м²). В этот раствор могут быть добавлены анионные компоненты координационных соединений переходных металлов²⁴, выбранных из аконитатов,
цитратов, фумаратов, глутаратов, малатов, оксалоацетатов, сукцинатов и хелатообразующих полидентатных алкиламидов, для увеличения первичных продуктов фотосинтеза, повышение качества и урожайности.

Пример 6. Система для ускорения всхожести

Ингредиент	Диапазон концентраций г/л	Предпочтительные концентрации
Глутаровая кислота	0,07-10	3
Ethan	10 ppb - 1 ppm	100 ppb
КОН	pH 5-7,5	pH 5, 5
Cat	0,01-5	0, 1
Са²⁺	0,01-1	0, 05

Кроме того, в этот раствор могут быть добавлены анионные компоненты координационных соединений переходных металлов²⁺, выбранных в диапазоне ppm-ppt количеств из аконитовой, лимонной, фумаровой, яблочной, щавелевоуксусной и янтарной кислот, в диапазоне ppm-ppt количеств из хелатообразующих полидентатных алкиламидов и Mg в диапазоне ppm-ppt количеств.

Семена редиски, по 25 семян на чашку, высевали в 16 блюдцах Госселина для проращивания семян на кружках из специальной ватманской бумаги Whatman 598 Seed Culture, смоченных раствором контрольного питательного вещества или раствором композита гликана. Семена выдерживали при постоянной температуре 27° в темноте только для их дыхания. Фактом прорастания считали момент времени, при котором наблюдалось появление первичного корешка у 50% семян, G₅₀. Результаты продемонстрировали ускорение прорастания в случае композита гликана со средним значением G5₀=15 ч по сравнению со средним значением для контрольного питательного вещества G₅₀=22 ч, n=8, р=0,001. Обработка редиса путем нанесения на семена слоя композита гликана с нормой расхода 20-50 мкг/семя в расчете на массу сухого композита гликана доказала высокую эффективность такой обработки, значительно ускоряю- 19 040708 щей всхожесть по сравнению с контрольными питательными веществами в результате усиления потока первичных продуктов фотосинтеза. Аналогичное ускорение всхожести наблюдали для семян редиски, на которые предварительно наносили слой композита гликана при норме расхода 20-50 мкг композит гликана/семя и сушили, по сравнению с контрольными питательными веществами.

Пример 7. Система для увеличения массы корней

Компонент	Диапазон концентраций %	Предпочтительная концентрация %
Фумаровая кислота	0,001-20	0, 03
GG	0,001-1	0, 1
Cat	0,01-5	0, 01
Са²⁺	0,01-1	0, 05

Кроме того, в этот раствор могут быть добавлены анионные компоненты координационных соединений переходных металлов²⁺, выбранные из аконитовой, лимонной, фумаровой, яблочной, щавелевоуксусной и янтарной кислот, хелатообразующих полидентатных алкиламидов, и Mg в диапазоне ppm-ppt количеств.

Семена болгарского перца высевали на 12 делянках с однородной суглинистой почвой с указанными на этикетке нормами 12-26-26. Готовили композит гликана в воде и доводили значение рН раствора до 5,5 с помощью DAP, и также корректировали контрольный раствор до эквивалентного содержания P с помощью DAP/MAP. Через две недели после прорастания, шесть выбранных случайным образом делянок подвергали одновременной пропитке и распылению композита гликана, направленному на посадки, и при этом ко всем 12 делянкам с болгарским перцем применялась одинаковая обработка для поддержания роста растений. Для того чтобы избежать скученности, каждая делянка содержала 20 растений, расположенных друг от друга на 50 см. Через 2 недели, собирали урожай растения вместе с неповрежденными корнями, затем отсекали корни от побегов, тщательно отмывали их от остатков почвы и высушивали в сушильном шкафу. Определяли сухую массу корней каждого из растений. Результаты показали, что средняя величина сухой массы корней в случае обработки композитом гликана составляет 1,2 г по сравнению со средней величиной 1,0 г в случае обработки с помощью контрольного раствора питательного вещества, n=6, p=0,02. Обработка композитом гликана значительно увеличивала сухую массу корней по сравнению с контрольной обработкой. В случае контрольной обработки присутствовали плоды с солнечными ожогами, в то время как они отсутствовали в случае обработки растений композитом гликана, что указывало на увеличение первичных продуктов фотосинтеза и на повышение качества собранного урожая.

Пример 8. Пример повышения композитом гликана гидростатического давления

Поля цветов плюмерии (Plumeria) традиционно подвергают культивации при высокой интенсивности света ~1500-1700 микроэйнштейн/м²/с и при величине влажности от низких до средних значений ~20-30%. При этих условиях окружающей среды, ежедневные показания гидростатического давления регистрировали после полудня. Обычно, рано утром цветущие растения имеют высокое гидростатическое давление, но к середине дня листья начинают опускаться. Этот цикл полуденного увядания, характеризующийся изменением гидростатического давления от высокого значения до низкого значения, был визуально различим, так как поднятие листьев изменялось от верхнего положение до нижнего положения приблизительно на величину от 5 до 20 миллиметров (мм). Увеличение гидростатического давления является необходимой предпосылкой для роста, и гидростатическое давление измеряли по изменению поднятия листвы, особенно в полдень. Задачей исследования являлась регистрация изменения гидростатического давления у плюмерии путем измерения в миллиметрах изменения поднятия листьев и сравнение воздействия контрольного водного раствора питательных веществ с воздействием отдельной обработки корней с помощью 1-25 мл композита гликана 0,1-5 ppm Ethan. Состав композита гликана соответствовал составу из приведенного выше примера 6, но для повышения гидростатического давления могут, необязательно, применяться и другие приведенные в качестве примеров композиты гликанов. Например, в 8 часов утра наносили на корни эффективное количество 1-200 мл 0,1-5 ppm частично гидролизованных дегликозилированных инвертаз, и затем в полдень регистрировали величину поднятия листвы, характеризующую повышенное гидростатическое давление, в то время как результаты воздействия контрольного раствора указывали на снижение гидростатического давления. Относящуюся к тупоконечным растениям плюмерию тупую (Plumeria obtusa L.) выдерживали в пластиковых контейнерах объемом 4 л в течение недели с целью акклиматизации в условиях окружающей среды при воздействии прямого солнечного света, и затем изучали взаимосвязь суточных изменений гидростатического давления с вечерним поливом один раз в неделю. В середине недели между поливом, измеряли исходное положение листьев поздним утром и отмечали его на измерительных линейках, и позже, сравнивали с величинами поднятия этих же листьев через 5 ч после обработки.

- 20 040708

Результаты.

Поднятие листвы служило визуально различимым признаком повышенного гидростатического давления. В случае обработки композитом гликана, средняя величина поднятия листьев увеличивалась на 15 мм и была статистически значимой (n=6, р=0,003), в то время как при обработке листвы контрольным раствором питательного вещества средняя величина поднятия листьев уменьшалась на 5 мм. После обработки с помощью композитов гликанов с содержанием от 10 ppb до 800 ppm, поднятие листвы был выше у растений, обработанных позже полудня после 15 ч, в то же время, обработка листвы контрольным раствором характеризовалась наиболее четко выраженной потерей гидростатического давления и уменьшением поднятия листвы, обусловленного циклом полуденного увядания.

В заключение необходимо отметить, что плюмерия положительно реагировала на обработку с целью повышения гидростатического давления, тогда как обработка контрольным раствором показывало снижение гидростатического давления. Подобное повышение качества сельскохозяйственных культур при повышении гидростатического давления происходило и в случае болгарского перца, декоративной капусты, тыквы, семечковых плодов и корнеплодов, обработанных композитами гликанов, приготовленных с подходящими анионными компонентами координационных соединений переходных металлов²⁺. Например, анионные компоненты выбирали из одной или более аконитовой, фумаровой, глутаровой, яблочной, щавелевоуксусной и янтарной кислот, при их содержании 10-900 ppm и хелатообразующих полидентатных алкиламидов, таких как EDTA, EDDHA, HeEDTA, DTPA, HBED, MGDA, GLDA и других подобных, при их содержании 10-900 ppm. Рост и развитие всех фотосинтезирующих организмов зависят от роста клеток, инициированного повышенным гидростатическим давлением. Когда в результате применения систем композитов гликана раскрытых в изобретении вариантов осуществления в течение длительного времени увеличивалось гидростатическое давление, результаты характеризовались значительным усилением роста и развитием подвергнутого обработке фотосинтезирующего организма. Системы композитов гликанов, применяемые совместно с ускорителями дыхания, повышали урожайность сельскохозяйственных культур.

Пример 9. Пример системы композита гликана для условий с низкой интенсивностью света

Воздействие контрольных питательных веществ на вегетативный рост канолы в тени сравнивали с выращиваемыми в тени группами канолы, обработанными композитом разветвленного N-связанного гликана и, кроме того, подвергнутые обработки композитом гликана и контрольными питательными веществами группы канолы выращивали в незатененных условиях с целью определения благоприятной возможности повышения урожайности в условиях относительно пониженной освещенности. Семена канолы высевали в 36-луночных пластиковых поддонах и через 1 месяц они демонстрировали рост даже в случае помещения растений, подвергнутых обработке контрольным раствором и композитом гликана в условиях тени, под ткани на 50% затеняющие свет. Растения, которые не были затенены, находились в условиях естественного полуденного освещения с интенсивностью в диапазоне 1500-1800 микроэйнштейн/м²/с, а под тканью на 50-85% затеняющей свет низкая интенсивность света находилась в диапазоне от 100 до 900 микроэйнштейн/м²/с или составляла менее половины полной интенсивности света. Проводили некорневую обработку с использованием поверхностно-активных веществ путем распыления или обрызгивания при норме расхода 100 галлонов/акр (378,5 литров/4047 м²). Результаты, полученные при полном дневном свете и при обработке контрольными питательными веществами, сравнивали с результатами, полученными при нанесении композита гликана на листья канолы в тех же условиях. Композицию композита гликана растворяли в воде в следующем порядке: 1-100 мкМ Ethan; 0,1-25 мМ цитрата; 0,1-2 ppm Mn-CMS Mn-CMS; 1-25 ppm Ca-CMS, и доводили величину рН до 5,5 с помощью DAP, DKP или KOH. Урожай растений собирали через две недели и сушили при низкой температуре в сушильном шкафу при 70° в течение 48 ч. Высушенные побеги каждого из растений взвешивали и заносили в приведенную ниже таблицу средние массы побегов в сухом состоянии и значения критериев Стьюдента для проверки равенства средних значений в группах.

В заключение необходимо отметить, что группа канолы в условиях контрольного затенения характеризовалась пониженной урожайностью по сравнению с группами в условиях контрольного полного дневного освещения и группами в условиях затенения, которые обрабатывались композитами гликанов. Более того, при обработке композитами гликанов затененных растений, повышения качества и урожайности по сравнению с контрольной группой в условиях затенения были статистически значимыми.

Контрольная	Обработанная	Контрольная
группа в	композитом	группа в
условиях	гликана	условиях полной
затененности	группа в	освещенности
	условиях

- 21 040708

		затененности
Средняя величина сухой массы (г)	0,214	0,256	0,270
Увеличение массы по сравнению с контрольной группой в условиях затененности		19, 5%	20%
Статистическая значимость		р=0,000

Пример 10. Пример процесса получения дегликозилированных гликанов из гликопротеинов

Многие гликопротеины содержат гликаны, которые могут быть получены из семян бобовых растений, таких как канавалия мечевидная, или путем дегликозилирования из ряда ферментов. Инвертаза представляет собой производимый промышленностью фермент из пекарских дрожжей с подходящими гликановыми компонентами внутреннего ядра или внешних протрузий, которые могут составлять до трех четвертей от суммарной массы гликопротеина. Инвертаза содержит предпочтительные разветвленные гликаны с терминальными Man-лигандами, такие как GalManбелки; Mann, такие как Man_1-6, маннотриозы, маннотетрозы и маннопентозы; GalnMann, такие как Gal2Man и Gal₂Man₂; GalnMann-N-гликаны, такие как Gal₂Man₄GlcNAc и Gal₄Man₁₀GlcNAc₂; Mann-N-гликаны, такие как Man₃GlcNAc, и предпочтительные Man_1-15GlcNAc₂ и другие подобные гликаны. Гликопротеин с молекулярной массой 270 кДа был слишком крупным, для того чтобы проникать в листву. Поэтому, для установления начального уровня для сравнения ферментативного расщепления, сначала проводили лабораторный эксперимент по высвобождению дегликозилированных гликанов из гликопротеинов, предпочтительно, из инвертазы.

Инвертазу денатурировали в разбавленном 0,2N растворе NH4OH, рН 12, 80° в течение 10 мин и нейтрализовывали путем титрования с помощью 0,2N раствора HCl, подготавливали к расщеплению с помощью обработки 3% трипсином при 37° в течение ночи и затем денатурировали путем кипячения в течение 10 минут. Эти обработанные протеазой образцы характеризовались умеренной 50 мкМ активностью прорастания в композите гликана. Образцы дегликозилировали путем инкубации с 200 миллиединицами эндоглюкоаминидазы Н при 37° в течение дня и денатурировали в разбавленном NH4OH при рН 12 при 80° в течение 10 мин. Оставшиеся белок и пептиды осаждали и удаляли.

Дегликозилированные гликаны обычно включали смеси О-связанных и N-связанных маннанов, и, в качестве гликановых компонентов композита гликана, изоляты или смеси гликана проявляли активность в диапазоне 0,01-1 ppm по массе.

Упомянутое выше дегликозилирование с помощью протолитических и глюколитических ферментов было относительно мягким, и, кроме того, включало использование дорогих биохимических реагентов. В результате проведения этих экспериментов было обнаружено, что начальная денатурация гликопротеинов с помощью основания значительно сокращает продолжительность последующего нагревания в кислоте, и, с точки зрения экономии энергии, является предпочтительной. Поэтому, предпочтительный процесс представлял собой гидролиз гликопротеинов в средах, которые выпускались промышленностью в больших количествах с относительно низкой стоимостью. Были испытаны предпочтительные методы, которые могут быть использованы, такие как обработка с помощью кислоты/основания, гидролиз, гидразинолиз и/или ферментация. Например, ацетолиз (уксусная кислота:уксусный ангидрид:серная кислота 25:25:1) инвертазы давал активные дегликозилированные гликаны, которые характеризовались активностью при достаточно низкой концентрации 1-100 ppb. Необязательно, но и применяли новый лизис в малеиновой кислоте по варианту осуществления путем инкубации инвертазы в смеси малеиновая кислота:уксусный ангидрид:азотная кислота 25:25:10 при 60-80° в течение 1-24 ч. В качестве варианта, инвертазу инкубировали в смеси лимонная кислота:фосфорная кислота 25:1; в насыщенном растворе лимонной и/или янтарной кислоты и/или в 0,1-3N растворе выбранной минеральной кислоты, такой как серная кислота, и, предпочтительно, дегликозилировали прямым нитролизом в 1-3 N растворе азотной кислоты и инкубировали при перемешивании в течение 1-24 ч при 40-80°.

Предпочтительный метод частичного гидролиза инвертазы заключался в следующем. 10-30% инвертазы растворяли в щелочном водном растворе, таким как 0,2-1 N KOH и/или 0,2 N NH4OH, при нагревании до 40-80° в течение 1-24 ч; перемешивали с 50-60% лимонной кислотой и инкубировали 1-24 ч при 40-80°. После инкубации с кислотой, доводили величину рН раствора до 3-6. Приготавливали препарат частично гидролизованной инвертазы, теперь уже дегликозилированной, для применения на полях, по меньшей мере, с 1-5 ppm Са²⁺, 0,5-1 ppm Mn²⁺ и, предпочтительно, с 0,01-6 ppm d-переходными металлами²⁺, выбранными из Fe²⁺, Ni²⁺, Со²⁺, Zn²⁺, и с 1-5 ppm Mg²⁺. Анионные компоненты координационных соединений переходных металлов²⁺ выбирали из одного или более аконитатов, цитратов, фумаратов, глутаратов, оксалоацетатов и сукцинатов. В качестве варианта, анионные компоненты могут быть выбраны из упомянутых выше полидентатных хелатообразующих соединений. Для хранения растворов

- 22 040708 добавляли один или более консервантов. Повышение качества и урожайности культур фотосинтезирующих организмов было обусловлено обработкой указанных культур с помощью упомянутых выше растворов, содержащих от 1 ppb до 10 ppm дегликозилированной инвертазы. Например, когда композит гликана, содержащий дегликозилированную инвертазу, наносили на фотосинтезирующие организмы при содержании частично гидролизованной инвертазы 100 ppb, доза составляла 0,1 мг/л.

Все упомянутые выше методы дегликозилирования позволяли получать композиты гликанов с одинаковой активностью. Исключение любого одного из компонентов композита гликана снижало активность. Композиты гликанов, состоящие из дегликозилированной инвертазы, характеризовались на порядок более высокой активностью, чем полученные их растительных камедей по вариантам осуществления. Кроме того, процессы получения гликанов путем гликозилирования инвертазы были более простыми и более экономически эффективными, чем процессы получения гликанов из других источников. Регулирование потока первичных продуктов фотосинтеза с помощью композитов гликанов, состоящих из дегликозилированной инвертазы, осуществлялось, кроме того, путем необязательного совместного применения с замедлителями дыхания в ppm количествах для улучшения вкусовых качеств или с ускорителями дыхания для повышения урожайности.

Пример 11. Пример концентрата композита гликана, применяемого в присутствии насекомых опылителей

Инвертазу денатурировали в водном растворе основания путем перемешивания 200 г инвертазы в 1 литре водного 0,2 N раствора KOH и стерилизации паром в течение 4 ч. Добавляли при перемешивании 50% лимонную кислоту и раствор нагревали до 80°С в течение 12 ч. После охлаждения раствор титровали до рН 6 с помощью NH₄OH и затем добавляли 1% Са, 1% Mg, 1% Cat и воду до суммарного объема 2 литра. Конечный 10% частично гидролизованный раствор инвертаза содержал смесь 3-7% разветвленных О-связанных и N-связанных дегликозилированных гликанов, включая гликаны, которые показаны на фиг. 2. Корректировали величину рН этого концентрата до 4-8, предпочтительно, до рН 5, путем добавления соответствующих объемов оснований и/или кислот, выбранных из таких питательных веществ, как KOH, NH4OH, Ca(OH)₂, MnCO₃, карбонат кальция, мука из морских раковин, HCl, H₂SO₄, фосфорная кислота, MAP, DAP, DKP, MKP и другие подобные вещества, и, предпочтительно, мука из устричных раковин. Бурный рост сельскохозяйственных культур поддерживался за счет присутствия питательных элементов, которые могут быть введены в препарат в следующих предпочтительных количествах: основные питательные вещества для растений N-P-K, каждое по 1-25%, второстепенные питательные вещества 0,1-1% Са, 0,05-0,5% Mg, 0,1-1% S, и/или питательные микроэлементы 0,0001-0,02% В, 0,0001-0,1% Cl, 0,0001 ppb - 0,005% Co, 0,001-0,05% Cu, 0,01-0,3% Fe, 0,02-0,1% Mn, 0,01 ppb - 0,005% Mo, 0,001-0,05% Zn, 0,001-0,1% Na и 0,0001-1 ppb Ni. В композиты гликанов могут быть предпочтительно дополнительно введены d-переходные металлы²⁺, выбранные из одного или более Fe, Mn, Ni, Co, Zn, и анионные компоненты, выбранные из ускорителей дыхания и полидентатных хелатообразующих веществ, и другие подобные вещества. Принимая во внимание необходимость хранения жидких концентратов, важным компонентом препарата жидкого концентрирована композита гликана являлся консервант, такой как, например, выбранный из упомянутых выше IT в диапазоне от 1 до 800 ppm, предпочтительно, BIT в диапазоне 100-200 ppm.

Для сельскохозяйственных культур является важным не только доступность полного набора питательных веществ для растений, но также и здоровье опылителей, таких как медоносные пчелы, бабочки, мотыльки, жуки, птицы и шмели, для обеспечения их полным спектром питательных веществ в процессе собирания ими нектара, содержащего витамины и минералы из растений. В культурах фотосинтезирующих организмов, Со²⁺ представляет собой d-переходный металл²⁺ по варианту осуществления, который метаболизируется в витамин В₁₂. Коррекция дефицита этого витамина в результате некорневого нанесения композитов гликанов, содержащих, например, Co-CMS, оказывала положительное влияние на здоровье, в частности, опылителей и травоядных животных, потребляющих фотосинтезирующие организмы и нектар сока, обогащенные В₁₂, и другие питательные вещества из здоровых фотосинтезирующих культур. Например, при введении в препарат 0,0005% Со в качестве подходящего переходного металла и нанесении препарата на цветущую культуру, его обогащенные метаболиты становились доступными от цветка до пчелы и до ее колонии. Непосредственно перед нанесением на культуру, концентрат разбавляли водой или другими применяемыми в сельском хозяйстве носителями в диапазоне от 1 ppb до 100 ppm, предпочтительно, от 10 ppb до 10 ppm. Полученный разбавленный водный раствор наносили путем разбрызгивания или наносили на корневую систему. Для некорневого нанесения, в композит гликана вводили одно или более из применяемых в сельском хозяйстве поверхностно-активных веществ и/или добавок. В течение сезона проводили одно или более нанесений, предпочтительно 1-2 раза в месяц. Для дальнейшей оптимизации потока первичных продуктов фотосинтеза с целью повышения сладости фотосинтезирующих организмов и увеличения продукции ими нектара, композиты гликанов применяли в течение недели цветения и сбора урожая в сочетании с замедлителями дыхания, с цитокининами в ppm количествах и гиббереллинами в ppm количествах, для эндогенного усиления вкуса и обогащения питательными веществами.

- 23 040708

Пример 12. Пример композита гликана на основе инвертазы (IGC)

Композиты гликанов на основе смесей гликанов, получаемых дегликозилированием инвертазы

Ингредиент	Диапазон концентраций %	Предпочтительная концентрация %
Дегликолизированная инвертаза	1 ppb - 100 ppm	0, 1-10 ppm
Cat	0,01-10	0, 05
Лимонная кислота	0,001-20	0,001-15
Са²⁺	0,001-1	0, 005
Мочевины	0,001-25	1-15
Консервант IT	0,001-0,2	0, 01
Вода, по балансу до 100%

В IGC могут быть добавлены компоненты координационных соединений переходных металлов²⁺, выбранные из d-переходных металлов, анионные компоненты и Mg в следовых количествах. Ускорители дыхания могут быть выбраны, например, из одной или более аконитовой, фумаровой, глутаровой, яблочной, щавелевоуксусной и янтарной кислот. Необязательно, анионные компоненты могут быть выбраны из одного или более полидентатных хелатообразующих веществ, таких как EDTA, EDDHA, HeEDTA, DTPA, HBED, MGDA, GLDA и другие подобные вещества.

IGC увеличивает урожайность и качество томатов

При стрессовых засушливых условиях для выращивания томатов, на растения наносили IGC и сравнивали с нанесением контрольных питательных веществ. IGC значительно улучшал общий рост, урожайность и качество обработанных томатов по сравнению с нанесением контрольных веществ. Семена томатов, обработанные с помощью IGC путем нанесения его слоя на семена, демонстрировали быст рую всхожесть.

Материалы и методы

Проращивали семена гибридного сорта томатов Steak Sandwich (Burpee®) в автоматически контролируемых условиях окружающей среды при температуре 32° в темноте. Через неделю после прорастания проростки переносили на открытый воздух для выращивания в засушливой среде 45°:32° LD (температура в светлое и темное время суток), относительная влажность 10%, продолжительность светлого и темного времени суток (LD) 16:8 ч и в основном солнечные дни с фотосинтетически активным излучением (PAR) до 1800 мкмоль фотонов на метр² в секунду в полдень. В процессе исследования, одновременно наносили растворы на испытуемые растения и контрольные растения, и все растения находились в одинаковых условиях, соответствующих надлежащей лабораторной практике. Поддерживали на достаточном уровне внесение удобрений с поливной водой, для того чтобы корни были равномерно увлажненными, но и достаточно сухими без признаков повреждения водой. Репликацию групп растений выращивали в пластиковых поддонах TLC Pro 606, каждый из которых имел 36 лунок объемом 125 мл, затем переносили в пластиковые горшки диаметром 33 см со средой, не содержащей почвы. Контрольные и обработанные томаты отбирали по размеру и активности роста, и недоростки, поврежденные или больные растения, и семена отбрасывали до начала исследования, для того чтобы получить однородные репликации. Нормы расхода для трех некорневых нанесений составляли 200 л/га с содержанием смеси 0,1-1 ppm полученных дегликозилированием инвертазы гликанов в наносимом композите гликана. Сладость, как показатель уровня вкуса, измеряли по шкале Брикса в нектаре сока, выжатого из отдельных томатов, с помощью калиброванного цифрового рефрактометра (Reichert).

IGC получали в соответствии со способами, описанными в примере 11, модифицированными для приведенной в таблице выше композиции концентрата IGC. Для некорневого нанесения, добавляли 0,030,05% поверхностно-активного вещества Sil для некорневого нанесения в соответствии с инструкциями на этикетке. Все растения получали одинаковые количества питательных веществ в результате применении одинаковых распылителей растворов для полива сверху.

Семена проращивали на увлажненной водой ватманской бумаге Whatman 598 в блюдцах Госселина по 20 семян/блюдце и 5 репликаций на обработку. На подвергаемые обработке семена наносили слой 0,1 мг IGC, высушивали на воздухе в течение 48 ч и семена высевали. Контрольные семена обрабатывали теми же самыми питательными веществами, но без IGC. Прорастание определяли по появлению корешков у 50% семян. Через 7 дней проростки пересаживали на поддоны.

Для проведения статистического анализа, каждый набор данных содержал результаты, полученные в параллельных экспериментах. Различия между подвергнутыми обработке группами и контрольными группами в каждом эксперименте были статистически значимыми, если не было указано иное, и планки погрешностей характеризовались 95% доверительными интервалами.

Результаты

Семена томатов с нанесенным слоем IGC характеризовались ускоренным прорастанием. Во всех

- 24 040708 репликациях подвергнутые обработке семена показывали 50% всхожесть через 60 ч. В отличие от этого контрольные семена показывали 50% всхожесть во всех блюдцах через 72 ч.

Целью экспериментов являлась определение воздействия IGC на качество плодов и урожайность в стрессовых засушливых условиях. Полевые обработки в упомянутых выше условиях, предусматривавшие использование замедлителя дыхания за 2 дня до сбора урожая, сравнивали с обработками контрольными питательными веществами для определения влияния на сладость. Независимо от цвета плодов, через 2 дня после обработки собирали двенадцать из самых больших томатов с диаметром >50 мм и регистрировали их живую массу. Половина томатов, подвергнутых контрольной обработке, имела красный цвет, тогда как все томаты, подвергнутые обработке, были красного цвета. В табл. 4 показано, что соответствующая обработка эндогенных первичных продуктов фотосинтеза нектара сока приводила к повышению качества плодов, выраженному как среднее значение 5,5 по шкале Брикса, которое было значимо выше (р=0,012), что выражалось улучшением вкуса, чем среднее значение 4,9 по шкале Брикса в случае обработки контрольными питательными веществами.

Таблица 4. Повышение вкусовых качеств томатов (средние значение по шкале Брикса)

Среднее значение по шкале Брикса	Среднее значение по шкале Брикса
Контроль	IGC	п=12
4,9	5, 5	р=0,012

Количество томатов на одном растении является показателем урожайности плодов, и в табл. 5 показано, что обработка с помощью IGC давала в результате среднее количество плодов, равное 3,2 на растении, которое было значимо (р=0,000, n=12) больше, чем среднее количество плодов, равное 1,6 на растении, подвергавшемся обработке контрольными питательными веществами. В результате обработки с помощью IGC повышалась урожайность, увеличивалось количество нектара в соке плодов и повышалась сладость и улучшались вкусовые качества при выращивании томатов в этой засушливой среде.

Таблица 5. Среднее количество плодов томатов на одном растении увеличивалось в результате обработки с помощью IGC

Среднее количество плодов на одном растении	Среднее количество плодов на одном растении
Контроль	IGC	п=12
1, б	3,2	р=0,000

Анализировали среднюю суммарную массу плодов томатов на одном растении в качестве меры урожайности в случаях обработки растений с помощью контрольных питательных веществ и с помощью IGC. В табл. 6 показано, что обработка с помощью IGC давала в результате среднюю урожайность плодов на одно растение 277 г влажной массы/14 г сухой массы, которая была значимо (р=0,002/р=0,004) выше, чем средняя урожайность плодов на одно растение 124 граммов влажной массы/7 г сухой массы в случае обработки контрольными питательными веществами.

Таблица 6. Масса плодов томатов с одного растения увеличивалась в результате обработки с помощью IGC

Средняя влажная масса плодов
Контроль	IGC	п=10
124 грамм/растение	277 грамм/растение	р=0,002
Средняя сухая масса плодов
Контроль	IGC	п=10
7 грамм/растение	14 грамм/растение	р=0,004

Исследовали воздействие обработки с помощью IGC на различные виды растений, и результаты представлены в табл. 7. Применение было эффективным в случае растений, по поводу которых известно, что они характеризуются С₃ и С₄ метаболизмом.

- 25 040708

Таблица 7. Перечень исследованных растений, на которые оказывало положительное воздействие обработка с помощью IGC

Растение	Способ обработки
Герань	Корневой
Петуния	Распыление и промачивание
Лантана	Корневой
Зеленый чай	Корневой
Бальзамин	Некорневой
Болгарский перец	Некорневой
Редис	Корневой
Кофейное дерево	Корневой
Газонная трава	Распыление и промачивание
Кукуруза	Нанесение слоя препарата на семена

Выводы

Быстрое прорастание семян после их обработки с помощью IGC указывало на усиление дыхания и, так как все растения дышат, объясняло, почему растения видов САМ, С3 и С4 характеризовались положительной ответной реакцией на воздействие композитов гликанов. Эндогенное модулирование потока первичных продуктов фотосинтеза под воздействием композита гликана обуславливало повышение нектара сока томатов, оцениваемое по шкале Брикса, с улучшением вкусовых качеств. При стрессе под влиянием факторов окружающей среды в засушливой зоне, культивирование томатов путем обработки их композитами гликанов демонстрировало повышение качества и урожайности по сравнению с контрольной обработкой. Регулирование потока первичных продуктов фотосинтеза с помощью IGC дополнялось необязательным совместным применением с замедлителями дыхания, с цитокинином в количестве 10-200 ppm, для усиления вкуса, или с ускорителями дыхания для повышения урожайности. Кроме того, в условиях кислородного голодания, добавление O₂-генератора, 30-100 мл H₂O₂ на одно растение, поддерживало в здоровом состоянии корневую систему, что обеспечивало постоянство высокого качества и высокой урожайности сельскохозяйственных культур.

Пример 13. Пример частично гидролизованной гуаровой камеди (GG)

Ингредиент	Диапазон концентраций %	Предпочтительная концентрация %
GG	1-90	3-20
Cat	1-10	5
Са²⁺	0,01-3	1
Яблочные кислоты	0,1-50	5-25
Мочевины	1-25	5-15
BIT	0,001-0,2	0, 05
Вода, по балансу до 100%	По балансу

В этот препарат могут быть дополнительно введены ppb-ppm количества компонентов координационных соединений d-переходных металлов²⁺, выбранных из Zn, Co, Ni, аконитовой, лимонной, фумаровой, глутаровой, щавелевоуксусной и янтарной кислот, хелатообразующих алкиламидов и Mg²⁺.

Фотосинтезирующие организмы, обработанные с помощью композитов гликанов, состоящих их дегликозилированных GG, характеризовались усиленным потоком первичных продуктов фотосинтеза, повышающим качество и урожайность сельскохозяйственных культур. Регулирование потока первичных продуктов фотосинтеза с помощью композитов гликанов, состоящих из GG, дополнялось необязательным совместным применением с замедлителями дыхания для усиления вкуса или с ускорителями дыхания для повышения урожайности.

Пример 14. Пример частично гидролизованной камеди тары (HTG)

Камеди тары производятся промышленностью в больших количествах, и это растение содержит

- 26 040708 крупные полимеры звеньев разветвленных GalMan₃, подходящих для дегликозилирования с помощью упомянутых выше процессов ацетолиза. А именно, дегликозилированные гликаны вырабатывали из пищевой камеди тары ацетолизом (уксусная кислота:уксусный ангидрид:серная кислота 25:25:1 по объему, 60-80°С, 24-96 ч) или нитролизом (лимонная кислота:уксусный ангидрид:азотная кислота 20:20:10), получая частично гидролизованные дегликозилированные разветвленные GalMan₃. Гликаны в форме частично гидролизованной дегликозилированной камеди тары (HTG) демонстрировали высокую активность в композитах гликанов в диапазоне концентраций 50-200 ppm. Исследования HTG в качестве гликанового компонента показали, что HTG проявляет активность только в присутствии компонентов композита гликана, при этом использовали следующие методы.

Капусту выращивали в контролируемых условиях окружающей среды, описанных выше, в пластиковых ящиках с 36 лунками для растений объемов 125 см³/лунка. Все водные растворы для некорневого внесения содержали 0,5 г Sil/л, рН 6, и в отдельные препараты вводили следующие компоненты: металлы²⁺ - 1 ppm сульфата марганца, 1 ppm сульфата железа (II) и 10 ppm нитрата кальция, растворенные в воде с 50 PPM DAP; анионный компонент координационных соединений переходных металлов²⁺ - 300 ppm α-кетоглутарата калия, сокращенно aKG; и 100 ppm HTG. Компоненты композита гликана и металлов²⁺ наносили раздельно и в смешанной друг с другом форме для исследования воздействия на рост растений отдельных компонентов по сравнению с полным составом композита гликана. Растворы aKG, HTG и aKG+HTG растворяли в водных растворах металлов²⁺, и, в результате чего, в растворах для обработки присутствовали координационные соединения переходных металлов²⁺, состоящие из aKG, Ca²⁺ и Mn²⁺. Металлы²⁺ служили в качестве контроля.

При распускании первых четко выраженных листьев, применяли некорневую обработку с нормой расхода 10 мл/ящик, n=36. Ростки с листьями собирали, сушили и взвешивали.

Результаты испытаний, приведенные в таблице HTG ниже, представлены в форме сравнения средней величины сухой массы ростков капусты при обработке со средней величиной сухой массы ростков капусты при обработке только раствором металлов²⁺, исходным раствором, в котором приготавливали все другие растворы для обработки. Ростки, обработанные с помощью aKG, значимо не отличались (n=36; р=0,057) с точки зрения выхода от контрольного раствора металлов²⁺; растворы HTG с металлами²⁺ характеризовались значимым (n=36, р=0,001) положительным воздействием по сравнению с растворами только одних металлов²⁺. И наконец, aKG+HTG+металлы²⁺ демонстрировали самое высоко значимое (n=36, р=0,000) повышение выхода по сравнению с металлами²⁺. Кроме того, полный состав композита гликана характеризовался высоко значимыми (aKG+HTG в сравнении с aKG, p=0,000; aKG+HTG в сравнении с HTG, р=0,000) повышениями выхода по сравнению со всеми другими вариантами обработки.

Таблица HTG

	Средняя величина сухой массы, грамм	Р
Металлы²*	0,56
aKG	0,59	0, 057
HTG	0, 61	0, 001
aKG+HTG	0, 63	0, 000

В заключение необходимо отметить, что композит гликана продемонстрировал наиболее высоко значимые улучшения при совместном приготовлении в форме полного состава композита гликана при нанесении на фотосинтезирующие организмы, с целью воздействия на первичные продукты фотосинтеза. Кроме того, положительные эффекты воздействия полных составов композитов гликанов подтверждались после дополнительного введения d-переходных металлов²⁺, Са²⁺ и Mg²⁺. Регулирование потока первичных продуктов фотосинтеза с помощью полных составов композитов гликанов, кроме того, дополнялось необязательным совместным применением с замедлителями дыхания для усиления вкуса или с ускорителями дыхания для повышения урожайности.

Пример 15. Пример частично гидролизованной камеди бобов рожкового дерева (PHLB)

Ингредиент	Диапазон концентраций %	Предпочтительная концентрация %
PHLB	0, 1-5	1-3
Cat	1-10	5

- 27 040708

Са²⁺	0,01-3	1
CMS	0,1-50	5-25
AMS	1-25	5-15
BIT	1-750 ppm	75-100 ppm
Вода, по балансу до 100%

В этот препарат PHLB могут быть дополнительно введены один или более d-переходных металлов²⁺, анионные компоненты и/или Mg²⁺. Обработка фотосинтезирующих организмов с помощью PHLB приводила в результате к усилению потока первичных продуктов фотосинтеза, что повышало качество и урожайность культур. Регуляцию потока первичных продуктов фотосинтеза с помощью композитов гликанов, состоящих из PHLB, дополнительно контролировали путем необязательного совместного применения замедлителя дыхания, 10-200 ppm салициловой кислоты, с целью улучшения вкусовых характери стик.

Пример 16. Методы и композиции для ускорения проращивания

Диапазон Предпочтительная

Ингредиент концентраций, г/л концентрация, г/л

Ethan	1 ppb - 1 ppm	10-100 ppb
Глутаровая кислота	0,0007-1	0,003
КОН	pH 5-7,5	pH 5, 5
Cat	0,01-5	0, 1
Са²⁺	0,01-1	0, 05

Для применения с целью более эффективного прорастания семян, в этот препарат могут быть добавлены анионные компоненты координационных соединений переходных металлов²⁺, которые являются ускорителями дыхания, выбранными из одной или более аконитовой, фумаровой, глутаровой, яблочной, щавелевоуксусной и янтарной кислот и их фосфатных солей.

Семена редиса, 25 семян на блюдце, высевали в 16 репликациях в блюдцах Госселина для проращивания семян на кружках ватманской бумаги Whatman 598 Seed Culture, смоченных контрольным раствором питательных веществ или раствором композита гликана. Семена выдерживали при постоянной температуре 27°С в темноте только для поддержания дыхания. Прорастание определяли в тот момент, когда появлялись корешки у 50% семян, G₅₀. Результаты показали ускорение всхожести в случае обработки композитом гликана, среднее значение G₅₀=15 ч по сравнению со средним значением G₅₀=22 ч, n=8, р=0,001 в случае обработки контрольным раствором питательных веществ. Обработка редиса путем нанесения слоя на семена с нормой расхода 20-50 мкг/семя в расчете на сухую массу композита гликана доказывала высокую активность и значимое ускорение всхожести по сравнению с обработкой контрольным раствором питательных веществ в результате усиления потока первичных продуктов фотосинтеза. Аналогично, всхожесть убыстрялась у семян редиса, на которые предварительно наносили слой и высушивали 20-50 мкг композита гликана/семя по сравнению с обработкой контрольным раствором питательных веществ.

Пример 17. Композиты N-связанных гликанов

Ингредиент	Диапазон концентраций, ppm	Предпочтительная концентрация, ppm
Ethan	0,001-1	0, 1
Лимонная кислота	0,001-5	0, 05
Ca²⁺	1-10	5
Cat	0,01-10	3

В этот препарат могут быть дополнительно введены анионные компоненты координационных соединений переходных металлов²⁺. Например, анионные компоненты могут быть выбраны из ускорителей дыхания и полидентатных хелатообразующих веществ.

Композиты гликанов для корневого нанесения готовили в 1 л воды при перемешивании при комнатной температуре от 25 до 35°С.

Препарат титровали с помощью KOH и/или NH4OH до рН 5-7,5 и наносили при норме расхода от 500 до 750 галлонов/акр как можно ближе к корням путем промачивания, разбрызгивания-промачивания, внесения в междурядье и/или путем внесения с поливной водой. При поливе обработку проводили путем

- 28 040708 промачивания почвы раствором препарата композита гликана в направлении корней для повышения качества и урожайности сельскохозяйственной культуры. Обработку проводили от одного раза в неделю до одного раза в месяц, по мере необходимости, в вегетационный период.

Пример 18. Жидкий концентрат инвертазы

Гликопротеины инвертазы состоят из белков ядра и полимеров Mann поверхности. Соответственно эти гликопротеины подвергали частичному гидролизу с получением дегликозилированных Mann. При приготовлении из дегликозилированной инвертазы композитов гликанов и нанесении их на фотосинтезирующие организмы, дегликозилированная инвертаза модулировала поток энергии от фотосинтеза к дыханию. Концентрированные препараты композита гликана, содержащие дегликозилированные Nсвязанные разветвленные цепи из инвертазы, разбавляли водой до полевых доз 10 ppb - 5 ppm для фотосинтезирующих организмов и применяли для исследования прорастания, в котором они характеризовались высокой активностью при содержаниях всего лишь 10 ppb дегликозилированной инвертазы.

Композиты гликанов, кроме того, приготавливали для регулирования потока первичных продуктов фотосинтеза с необязательным набором из замедлителей дыхания для повышения вкусовых качеств и из ускорителей дыхания для повышения урожайности. Координационные соединения переходных металлов²⁺ для дегликозилированной инвертазы могут быть дополнительно выбраны из анионных компонентов, которые являются ускорителями дыхания, из таких как ppm количества аконитовой, фумаровой, глутаровой, яблочной, щавелевоуксусной и янтарной кислот. Необязательно, но анионные компоненты могут быть выбраны из полидентатных хелатообразующих соединений, из таких как ррт количества EDTA, EDDHA, HeEDTA, DTPA, HBED, MGDA, GLDA и других подобных соединений.

Обработка с помощью композита гликана приводила в результате к повышению качества и урожайности сельскохозяйственных культур, например, голубики, листовых овощей, хлопка, зерновых культур, томатов, вишни, лука, кофе, бананов, цитрусов, дыни, зеленолистных овощей, орехов, семечковых плодов, ягод, плодовых деревьев, продовольственных культур, цветов, деревьев, газонных трав и декоративных культур.

Методы

К 40 мл сильного основания, предпочтительно выбранного из 0,2 N KOH, NH₄OH и Са(ОН)₂, добавляли при перемешивании 10-12 г сухого порошка инвертазы, предпочтительно с активностью 200000 единиц Самнера/г, и водный щелочной раствор нагревали паром до 60-80°С в течение 2-24 ч. Затем добавляли при перемешивании 20 г лимонной кислоты и раствор нагревали с помощью пара при 60-80°С в течение 3-12 ч. Чем ниже температура нагревания, тем более длительной должна быть инкубация, и после этого процесса следовало охлаждение до комнатной температуры. Добавляли при перемешивании подходящее основания, предпочтительно выбранное из KOH, NH₄OH и Са(ОН)₂, для доведения величины рН до 4-6. Доводили объем до 100 мл с получением 10% дегликозилированной инвертазы. Готовили исходный раствор 1-6 ppm Cat и 1 мл 10% дегликозилированной инвертазы разбавляли в 1 л исходного раствора Cat с получением жидкого концентрата дегликозилированной инвертазы с содержанием 100 ppm. Добавляли при перемешивании 100 ppm BIT с получением готового жидкого концентрата дегликозилированной инвертазы.

Разведения жидкого концентрата дегликозилированной инвертазы для применения в поле: 10 мл жидкого концентрата дегликозилированной инвертазы с содержанием 100 ppm разбавляли в 1 л воды с получением 1 ppm дегликозилированной инвертазы, затем путем последовательных разбавлений получали содержания 1, 10, и 100 ppb, по мере необходимости. При некорневом внесении требовалось добавление одного или более используемых в сельском хозяйстве поверхностно-активных веществ, таких как 0,5 г/л Sil.

Применение низких концентраций дегликозилированной инвертазы в диапазоне 10 ppb - 5 ppm было эффективным и характеризовалось значительно более ранним прорастанием и повышением качества и урожайности фотосинтезирующих организмов по сравнению с контрольной обработкой. Регулирование потока первичных продуктов фотосинтеза с помощью композитов гликанов, состоящих дегликозилированной инвертазы, дополнялось совместным применением замедлителя дыхания, 1-100 ppm гиббереллина, для улучшения вкусовых характеристик. Кроме того, в условиях кислородного голодания, добавление 1 л среды с 10 г СаО2 способствовало достижению высокого качества и высокой урожайности культур.

Пример 19. Пример частично гидролизованных растительных камедей

Растительные камеди выбирали из продуктов с высоким содержанием разветвленных цепей маннана, которые частично гидролизовали следующими методами: гуаровую камедь, конжаковую камедь, камедь бобов рожкового дерева, камедь тары и камедь фителефаса раздельно растворяли в воде при 60-80° при перемешивании в виде 1% по массе камеди. К каждому раствору камеди добавляли 1-3 N азотную кислоту и 5-25% уксусный ангидрид. Растворы выдерживали при 70-80° в течение 1-8 ч. Растворы охлаждали до 30-40° и титровали до рН 3,5-4 с помощью Са(ОН)₂, KOH и/или NH4OH. К растворам добавляли 30-50% лимонную кислоту до насыщения и нагревали до 60-80°С в течение 1-24 ч. Растворы охлаждали до комнатной температуры и титровали до рН 5-6 с помощью Са(ОН)₂, KOH, MnCO₃ и/или NH₄OH.

- 29 040708

Растворяли 10Х Cat в растворе частично гидролизованной камеди с получением 0,1% камеди. Последовательные разведения с помощью Cat давали образцы с различными дозами, и сравнивали их действие с действием контрольного раствора питательных веществ. Примеры компонентов для композитов гликанов, содержащих частично гидролизованные растительные камеди, приведены в таблице компонентов ниже.

Таблица компонентов

Компонент	Диапазон концентраций %	Предпочтительные концентрации %
Растительная камедь	0,01-3	0, 1
HNO3 :уксусный ангидрид : CMS	5:5:5-25:25:60	10:10:50
NH₄OH, КОН, Са(ОН)₂	pH 3-6	pH 5,5
Координационное соединение переходного металла²⁴	0,01-1	0, 1
Координационное соединение Са	0,01-3	0, 1

Исследование биологической активности

Семена редиса по 30 штук на блюдце высевали в 20 репликациях в блюдцах Госселина для проращивания семян на кружках ватманской бумаги Whatman 598 Seed Culture. Семена выдерживали при постоянной температуре 27° в темноте для поддержания только дыхания. Прорастание определяли в тот момент, когда появлялись корешки у 50% семян, G₅₀.

Результаты показали более быстрое прорастание со средней величиной G₅₀=15 ч в случае композита гликана по сравнению со средней величиной G₅₀=22 ч, n=10, р=0,001 в случае контрольного питательного вещества. Активности различных частично гидролизованных (РН) камедей характеризовались общими зависимостями концентраций, необходимых для достижения величины активности G₅₀, от содержания в них разветвленных маннанов. Наблюдаемые активности изменялись от низких значений для частично гидролизованных гуаровой камеди, конжаковой камеди, камеди рожкового дерева, камеди тары до высоких значений для частично гидролизованной камеди фителефаса, как это подробно представлено в таблице активных доз (ppm) частично гидролизованных (РН) камедей.

Обработка семян редиса с помощью композитов гликанов камедей из различных источников характеризовалась различными уровнями эффективности и значимо ускоряла всхожесть по сравнению с контрольными питательными веществами. Быстрая всхожесть была обусловлена эндогенным увеличением потока первичных продуктов фотосинтеза. Предпочтительные ускорители дыхания включали лимонную и яблочную кислоты. Кроме того, в условиях кислородного голодания, дополнительная обработка каждого корня с помощью 1 л среды с 20 г СаО₂ способствовала усилению роста корней, что приводило в результате к высокому качеству и высокой урожайности сельскохозяйственных культур.

Таблица активных доз (ppm) частично гидролизованных (РН) камедей

100 ppm GG

[30 ppm частично гидролизованной конжаковой камеди ppm частично гидролизованной камеди рожкового дерева ppm частично гидролизованной камеди тары

Claims

сверхнизким содержанием биурета, Са, Mn, Fe, Zn, Mg, эмульгатор из статистического блок-сополимера, такого как Plutonic L-62, низшие алифатические спирты, предпочтительно, пропанолы, консерванты, такие как BIT, концентрации каждого компонента приведены в таблице состава концентрата композита гликана из инвертазы. Аликвоту 5 мл 20% раствора гликана разбавляли в 10 л исходного концентрированного раствора металла⁺² с получением раствора 100 ppm композита гликана и титровали с помощью лимонной кислоты, KOH и/или NH4OH до величины рН в диапазоне 5-8. Этот продукт 100 ppm композита гликана приготавливали для разбавлений при применении на полях до 0,01-1% в воде для нанесения на фотосинтезирующие организмы. Например, 10 мл композита гликана в 1 л воды давал раствор с 1 ррт гликана и аналогично, 1 галлон/100 галлонов на акр или 3 жидких унции/1000 футов². Кроме того, применяли и последовательные разбавления, в случае необходимости.

Разбавленный для применения в поле композит гликана из дегликозилированной инвертазы проявлял эффективность в диапазоне от 0,01 до 10 гликана при корневом нанесении, и/или вместе с добавками в указанных на этикетке нормах расхода поверхностно-активных веществ при некорневом нанесении от 0,1 до 10 ppm, гликан доказывал свою эффективность при корневом нанесении.

Таблица состава концентрата композита гликана из инвертазы

Несмотря на то, что характерные признаки раскрытых в изобретении вариантов осуществления описаны применительно к одному примеру, но не для других примеров, тем не менее, это сделано только из соображений удобства и поэтому некоторые характерные признаки одного описанного примера могут быть объединены с одним или несколькими характерными признаками других примеров в соответствии с раскрытыми в изобретении способами и препаратами.

Для специалистов в данной области является очевидным возможность существования и других комбинаций способов и препаратов, раскрытых в изобретении вариантов осуществления, которые входят в объем приведенных далее пунктов формулы изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Препарат, содержащий композит гликана для улучшения жизнеспособности сельскохозяйственных культур и роста фотосинтезирующих организмов, включающий разветвленный дегликозилированный гликан с терминальным лигандом из гликопиранозы или ацилгликозамина в смеси с координационным соединением Са²⁺ и одним или более координационным соединением D-переходных металлов²*.
2. Препарат по п.1, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан представляет собой высокомолекулярный полимер маннан
3. Препарат по п.1, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан выбирают из группы, состоящей из O-связанных гликанов с Gly_m-n, где m=1-4 и n=1-4 и N-связанных гликанов с Gly_m-n, где m=1-4 и n=1-4.
4. Препарат по п.1, где разветвленный дегликозилированный гликан представляет собой высокомолекулярный маннан-N-гликан.
5. Препарат по п.1, дополнительно включающий один или более консервантов.
6. Препарат по п.5, где один или более консервантов выбирают из группы, состоящей из бензоизотиазолинонов, метилхлоризотиазолинонов, метилизотиазолинонов и их комбинаций.
7. Препарат по п.1, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан выбирают из группы, состоящей из O-связанных гликанов с Gly_m-n, где m=1-4 и n=1-4 и N-связанных гликанов с Gly_m-n, где m=1-4 и n=1-4, и где указанное одно или более координационных соединений D-переходных металлов²* включают как компоненты металлов²*, так и один или более анионных компонентов, выбранных из группы, состоящей из хелатообразующих полидентатных алкиламидов, аконитатов, цитратов, фумара-

- 31 040708 тов, глутаратов, малатов, оксалоацетатов, сукцинатов, их кислот, солей и эфиров.
8. Препарат по п.1, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан представляет собой триманнопиранозил-N-гликан.
9. Препарат по п.1, где указанный композит гликана присутствует в количестве от 1 ppm до 1% по массе и указанное одно или более координационных соединений переходных металлов²⁺ присутствуют в количестве от 0,1 ppb до 100 ppm по массе.
10. Препарат по п.1, где указанный композит гликана присутствует в форме продукта концентрированной композиции с концентраций композита гликана в диапазоне от 100 ч/млн до 10% для разведения перед нанесением на фотосинтезирующие организмы сельскохозяйственных культур для повышения дыхания; где указанный композит гликана продукта концентрированной композиции включает один или более дегликозилированных гликанов в диапазоне концентраций от 1 ppm до 20% и одно или более координационных соединений переходных металлов²⁺ в диапазоне концентраций 1 ppm-10% и консервант в диапазоне концентраций от 50 ppm до 1%.
11. Способ улучшения жизнеспособности сельскохозяйственных культур и роста фотосинтезирующих организмов в результате усиления дыхательного метаболизма первичных продуктов фотосинтеза, включающий нанесение на указанный организм от 1 ppm до 1% препарата по п.1.
12. Способ по п.11, где указанный дегликозилированный гликан выбирают из группы, состоящей из О-связанных гликанов с Gly_m__n, где m=1-4 и n=1-4 и N-связанных гликанов с Gly_m__n, где m=1-4 и n=1-4.
13. Способ по п.11, где одно или более координационных соединений D-переходных металлов²⁺включают как компоненты металлов²⁺, так и один или более анионных компонентов, выбранных из группы, состоящей из полидентатных алкиламидов, аконитатов, цитратов, фумаратов, глутаратов, малатов, оксалоацетатов, сукцинатов, их кислот, солей и эфиров.
14. Способ по п.11, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан имеет терминальный лиганд из маннопиранозила.
15. Способ по п.11, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан выбирают из группы, состоящей из O-связанных-гликанов с Gly_m__n, где m=1-4 и n=1-4.
16. Способ по п.11, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан выбирают из группы, состоящей из N-связанных-гликанов с Gly_m__n, где m=1-4 и n=1-4.
17. Способ по п.15, где указанный О-связанный-гликан в указанном композите гликана выбирают из группы, состоящей из арил (Gly)_n, ацил(Gly)_n, алкил(Gly)_n, где n=1-4.
18. Способ по п.11, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан выбирают из Nацетилгликозаминил-терминальных лигандов.
19. Способ по п.11, где указанное одно или более координационных соединений включают кальций, Са²⁺ и где указанный один или более переходных металлов²⁺ указанных координационных соединений переходных металлов²⁺ включают один или более D-переходных металлов²⁺, выбранных из группы, состоящей из Mn²⁺, Fe²⁺, Со²⁺, Ni²⁺ и Zn²⁺.
20. Способ по п.11, где указанный препарат дополнительно включает один или более консервантов.
21. Способ по п.11, где указанные разветвленные дегликозилированные гликаны выбирают из одного или более ферментов гликопротеинов, инвертаз, денатурированных инвертаз, частично гидролизованных инвертаз и дегликозилированных инвертаз, и их смесей.
22. Способ по п.11, где препарат включает одно или более координационных соединений Са²⁺Mn²⁺-координационных соединений и один или более разветвленных дегликозилированных Glc-NAc^.
23. Способ по п.11, где указанный фотосинтезирующий организм продуцирует нектар и где указанный препарат наносят для повышения нектара.
24. Способ по п.11, где указанный фотосинтезирующий организм представляет собой цветочное растение.
25. Способ по п.21, где указанные частично гидролизованные инвертазы дегликозилируют с помощью лимонной кислоты.
26. Способ по п.11, где указанный фотосинтезирующий организм продуцирует первичные продукты фотосинтеза и где указанный препарат наносят на указанный фотосинтезирующий организм для эндогенного улучшения вкусовых качеств.
27. Способ по п.13, где указанные один или более компонентов применяют совместно с O₂генерирующими веществами, выбранными из группы, состоящей из Н₂О₂, СаО₂ и MgO₂.
28. Способ по п.11, где нанесение указанного препарата на указанный фотосинтезирующий организм осуществляется в количестве от 10 ppb до 800 ppm для повышения гидростатического давления фотосинтезирующего организма.
29. Способ по п.11, где указанный разветвленный дегликозилированный гликан выбирают из одного или более видов частично гидролизованного растительного сырья, выбранного из фителефаса, гуаровой камеди, морских водорослей, содержащих маннан водорослей, ямса, плодов рожкового дерева, тары, канавалии мечевидной, рожкового дерева, ткани эндоспермы пальмового дерева и их смесей.
30. Способ по п.21, где указанные частично гидролизованные инвертазы дегликозилируют кислотами, выбранными из ускорителей дыхания.

-