EA039169B1 - СПОСОБ СНИЖЕНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ МОЛЕКУЛ СЫВОРОТОЧНОГО IgG У СУБЪЕКТА - Google Patents

СПОСОБ СНИЖЕНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ МОЛЕКУЛ СЫВОРОТОЧНОГО IgG У СУБЪЕКТА Download PDF

Info

Publication number
EA039169B1
EA039169B1 EA201790192A EA201790192A EA039169B1 EA 039169 B1 EA039169 B1 EA 039169B1 EA 201790192 A EA201790192 A EA 201790192A EA 201790192 A EA201790192 A EA 201790192A EA 039169 B1 EA039169 B1 EA 039169B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ides
igg
hours
serum
subject
Prior art date
Application number
EA201790192A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201790192A1 (ru
Inventor
Кристиан Челльман
София Ярнум
Лена Винстедт
Original Assignee
Ханса Биофарма Аб
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ханса Биофарма Аб filed Critical Ханса Биофарма Аб
Publication of EA201790192A1 publication Critical patent/EA201790192A1/ru
Publication of EA039169B1 publication Critical patent/EA039169B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4873—Cysteine endopeptidases (3.4.22), e.g. stem bromelain, papain, ficin, cathepsin H
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Abstract

Изобретение относится к способу увеличения преимуществ терапии для субъекта, при этом указанная терапия представляет собой трансплантацию органа. Данный способ включает введение субъекту белка, обладающего активностью IgG-цистеинпротеазы, который представляет собой IdeS, и последующее проведение указанной терапии у субъекта.

Description

Область изобретения
Изобретение относится к способу увеличения преимуществ терапии для субъекта, при этом указанная терапия представляет собой трансплантацию органа. Данный способ включает введение субъекту белка, обладающего активностью IgG-цистеинпротеазы, который представляет собой IdeS, и последующее проведение указанной терапии у субъекта.
Уровень техники
Антитела являются компонентами иммунной системы, которые привлекают другие элементы иммунной системы к конкретным мишеням в организме. Антитела являются специфическими для антигенов-мишеней за счет специфичности Fab-доменов. Антитела привлекают другие элементы иммунной системы путем взаимодействия кристаллизующегося фрагмента (fragment crystallisable, Fc) антитела с Fc-рецепторами (FcR), экспрессированными на поверхности иммунных клеток. Преобладающими антителами в сыворотке крови у млекопитающих, как правило, являются иммуноглобулины класса G (IgG): IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Эти антитела связываются с человеческими FcR: FcyRI, RyIIa, RyIIb, RyIIIa и FcyRn и с Fc-рецептором комплемента C1q. Эффективность привлечения клеточной иммунной системы молекулами IgG зависит от аффинности Fc к FcR. Взаимодействие между Fc-доменом антитела и FcR имеет большое значение как для действия антител, которые вводятся в качестве терапевтических агентов, так и для действия антител, которые играют патогенную роль в развитии различных аутоиммунных состояний, включая отторжение трансплантата, опосредованное антителами.
Сущность изобретения
Авторы данного изобретения неожиданно показали, что можно использовать агент для полного, быстрого, временного и безопасного устранения Fc-рецепторного связывания всеми или, по существу, всеми молекулами IgG в сыворотке пациента. Это устранение создает окно определенной длительности, в котором, если вводится терапевтическое антитело, оно будет иметь повышенную эффективность, так как ему не нужно будет конкурировать с эндогенными IgG за связывание Fc-рецепторов.
Окно определенной длительности также может быть использовано для проведения лечения, например, трансплантации органа, которое иначе было бы неэффективным из-за действия IgG-антител против донора, присутствующих в сыворотке крови пациента. Таким образом, в одном воплощении данный способ может быть использован для десенсибилизации пациента перед трансплантацией органа.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу увеличения преимуществ терапии для субъекта, который включает: (а) введение субъекту белка, обладающего активностью IgGцистеинпротеазы, который представляет собой IdeS; и (b) последующее проведение указанной терапии у субъекта, где указанная терапия представляет собой трансплантацию органа; количество вводимого указанного белка является достаточным для того, чтобы устранить Fc-рецепторное связывание, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке крови субъекта; а также этапы (а) и (b) разделены временным интервалом, который является достаточным для устранения Fc-рецепторного связывания, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке крови субъекта, и составляет от 1 до не более 6 ч;
где, кроме того, количество вводимого IdeS находится в диапазоне от 0,01 до 1 мг/кг массы тела, и где субъектом является человек.
В одном воплощении настоящего изобретения указанный белок вводят путем внутривенной инфузии.
В другом воплощении настоящего изобретения временной интервал между этапами (а) и (b) составляет от 1 до 2 ч, от 1 до 3 от 1 до 4 ч, от 1 до 5 ч, от 1 до 6 ч, от 2 до 3 ч, от 2 до 4 ч, от 2 до 5 ч, от 2 до 6 ч, от 3 до 4 ч, от 3 до 5 ч, от 3 до 6 ч, от 4 до 5 ч, от 4 до 6 ч или от 5 до 6 ч.
В другом воплощении настоящего изобретения трансплантация органа представляет собой трансплантацию почки, печени, сердца, поджелудочной железы, легкого или тонкого кишечника.
В другом воплощении настоящего изобретения способ также включает этап, проводимый во время или непосредственно перед трансплантацией, который включает индукцию супрессии Т-клеток и/или Вклеток у пациента.
В другом воплощении настоящего изобретения указанная индукция супрессии включает введение эффективного количества по меньшей мере одного из муромонаба, базиликсимаба, даклизумаба, антитела против тимоцитарного глобулина (ATG), лимфоцитарного иммуноглобулина, препарата глобулина против тимоцитов (ATGAM) или ритуксимаба.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - схематическое представление расщепления IgG посредством IdeS. Интактный человеческий IgG, независимо от изотипа, расщепляется посредством IdeS в два этапа. Первый этап образует однократно расщепленный IgG (single-cleaved IgG, scIgG) с одной интактной тяжелой цепью. Второй этап образует полностью расщепленные продукты, состоящие из одного F(ab')2-фрагмента и одного гомодимерного Fc-фрагмента, соединенных за счет нековалентных взаимодействий.
Фиг. 2 - протеинурию контролировали в качестве меры безопасности в ходе всего исследования на
- 1 039169 людях из примера 1. Multistix (Siemens) стандартным образом использовали в больнице, и у нескольких субъектов была обнаружена временная протеинурия, которая коррелировала с расщеплением IgG. А) субъекты, которые получали плацебо (n равно 9), В) субъекты, которые получали одну дозу 0,24 мг/кг массы тела IdeS (n равно 4).
Фиг. 3 - фармакокинетика IdeS в сыворотке. Концентрации IdeS в сыворотке определяли способом LC-MS/MS на основе четырех пептидов, полученных из IdeS. A) сравнение сывороточной концентрации IdeS за одну минуту до окончания инфузии по сравнению с уровнями доз IdeS (0,01, 0,04, 0,12 и 0,24 мг/кг массы тела) (логарифмическая шкала: круги - отдельные концентрации). Анализируемое вещество: пептид LFEYFK (n равно 20); В) сравнение профилей зависимости сывороточной концентрации средних значений четырех пептидов (aFPYLSTK, AIYVTDSDSNASIGMK, GGIFDAVFTR и LFEYFK) от времени в течение периода до 24 ч после инфузии 0,12 или 0,24 мг/кг массы тела IdeS (n равно 8).
Фиг. 4 - качественный фармакодинамический анализ с помощью SDS-PAGE показал быструю деградацию IgG. Анализ SDS-PAGE сыворотки от субъектов, которым вводили А) 0,12 мг/кг массы тела IdeS и В) 0,24 мг/кг массы тела IdeS, показал паттерны белковых полос в моменты времени до введения дозы, через 14 мин, 20 мин, 1, 2, 6 и 24 ч после введения дозы; С) восстановление IgG в сыворотке крови от одного субъекта в группе с введением 0,24 мг/кг массы тела в моменты времени до введения дозы, через 2 ч, 24 ч, 7, 14, 21, 28 и 35 дней после введения дозы. Стрелки справа на каждой фигуре показывают различные полосы в IgG-маркере, содержащем смесь человеческого IgG, scIgG, F(ab')2 и Fc. Линии слева на каждой фигуре показывают молекулярную массу стандарта в кДа. Гели показывают репрезентативного субъекта в группах, получавших IdeS в дозах 0,12 и 0,24 мг/кг массы тела.
Фиг. 5 - количественный фармакодинамический анализ путем ELISA показал быструю деградацию IgG. Уровни сывороточного IgG у отдельных субъектов, которым вводили IdeS в дозе 0,24 мг/кг массы тела, определяли с помощью валидированного способа ELISA (ИФА) (обнаружение интактных IgG и scIgG). Для того чтобы иметь возможность следить как за ранней быстрой деградацией, так и за восстановлением IgG, ось х разделяли на две части. Первая часть показывает время в часах (0-24 ч), а вторая показывает время в днях (7-64 дня).
Фиг. 6 - титрование IdeS in vitro на человеческой сыворотке. Образцы человеческой сыворотки от здоровых субъектов использовали в качестве субстратов для IdeS и титровали путем ELISA (n равно 20; столбцы ошибок, среднее ±SEM). Группа с самой высокой дозой IdeS 0,24 мг/кг массы тела соответствует примерно 6 мг/л IdeS in vitro, 0,12 мг/кг массы тела соответствует 3 мг/л, 0,04 мг/кг массы тела соответствует 1 мг/л, а 0,01 мг/кг массы тела соответствует 0,2 мг/л IdeS in vitro. Результаты представлены в виде процента оставшегося IgG на оси у по сравнению с исходным значением для каждого объекта. Доза IdeS в мг/л находится на оси х.
Фиг. 7 - антигенспецифическая фармакодинамика. Образцы человеческой сыворотки из группы, получавшей 0,24 мг/кг массы тела (n равно 4), направляли на анализ на наличие IgG против смеси антигенов (дифтерия, коклюш, столбняк, полиомиелит и инфекция Haemophilus influenza типа b). Результаты представлены в виде процента оставшегося IgG на оси у по сравнению с исходным значением для каждого субъекта. Для того чтобы иметь возможность следить как за ранней быстрой деградацией, так и за восстановлением IgG, ось х разделяли на две части. Первая часть показывает время в часах (0-24 ч), а вторая показывает время в днях (7-64 дня).
Фиг. 8 - сыворотка от субъектов, которым вводили IdeS, показала нарушенную способность к фагоцитозу. Способность к опсонизации IgG в человеческой сыворотке измеряли как процент эффекторных клеток по меньшей мере с одной поглощенной флуоресцентной гранулой. А) до и через 24 ч после введения IdeS в дозе 0,24 мг/кг массы тела по сравнению с субъектами, получавшими плацебо. Уровень фагоцитоза перед введением дозы для каждого индивидуума был принят за 100%, а фоном было спонтанное поглощение гранул в отсутствие сыворотки, n равно 4 в группе с IdeS, и n равно 2 в группе с плацебо; В) кинетика фагоцитарного потенциала в сыворотке показана для одного репрезентативного субъекта в группе, получавшей 0,24 мг/кг массы тела, в различные временные точки (до введения дозы, через 2, 6, 24, 48 ч, 4, 7 и 14 дней). Спонтанное поглощение гранул в отсутствие IgG показано в виде незаштрихованного прямоугольника. Р-значение рассчитывали с помощью критерия Манна-Уитни, *** = Р менее 0,01.
Фиг. 9 - антитела против IdeS исследовали до и в ходе всего исследования. Образцы человеческой сыворотки анализировали с использованием IdeS-специфического анализа CAP-FEIA (ImmunoCAP) (Thermo Fisher Scientific) на инструменте Phadia® 250. Отсечка (LLOQ) для IgG составляла 2 мг/л. А) образцы от 130 людей-доноров (референс) сравнивали с образцами от 78 здоровых мужчин, подвергшихся скринингу в этом исследовании (скрининг). Выделенные линии показывают медиану для референсной группы (6,1 мг/л) и скрининговой группы (10,6 мг/л); В) кинетика уровней IgG против IdeS показана как среднее значение для групп, получавших 0,12 и 0,24 мг/кг (n равно 8; столбцы ошибки, среднее значение ±SEM). Никакого увеличения IgG против IdeS не наблюдалось ни у одного из субъектов до 14-го дня; С) уровни IgG против IdeS показаны для отдельных групп на 14-й день, и D) на 182-й день. Линии показывают медианный уровень для каждой группы. Р-значения рассчитывали с использованием критерия Кру- 2 039169 скала-Уоллиса, одностороннего ANOVA и множественного сравнения с критерием Данна: *=Р<0,05 и **=Р<0,02.
Фиг. 10 - эффективность IdeS в сыворотке от двадцати проанализированных доноров (здоровые добровольцы и пациенты с 5 стадией CKD). Оставшийся IgG после обработки человеческих сывороток различными концентрациями IdeS определяли с помощью ELISA (ИФА). На фигуре показаны сигмоидальные кривые доза-ответ для отдельных человеческих сывороток, где оставшийся IgG нанесен на график в мг/мл в виде функции от дозы IdeS (г/л). Рассчитанные MABEL (от англ. Minimal Anticipated Biological Effect Level - доза, оказывающая минимальное ожидаемое биологическое действие) (0,0031 г/л) и MED (от англ. Minimum Effective Dose - минимальная действующая доза) (0,025 г/л) указаны на графиках (темно-синяя линия). Выбранные сыворотки от пациентов Р02, Р04, Р07, Р08 и Р09 выделены различными цветами.
Фиг. 11 - эффективность IdeS на IgG против HLA в сыворотке от сенсибилизированного пациента № Р02. График показывает MFI (от англ. Mean fluorescent intensity - средняя интенсивность флуоресценции) (необработанное значение) против отдельных антигенов для (верхний график) МНС класса I (А, В и С) и (нижний график) МНС класса II (DP, DQ и DR) после обработки имитационным контролем (синий) и IdeS (красный). MFI: средняя интенсивность флуоресценции.
Фиг. 12, 13, 14, 15 - эквивалент фиг. 11 для сенсибилизированных пациентов Р04, Р07, Р08 и Р09 соответственно.
Фиг. 16 - спленоциты Balb/c (гейт Р1) окрашивали сывороткой (10 мкл необработанных DTT) от субъектов 503 и 504, собранные перед введением дозы (черный), через 24 ч после введения дозы (красный), через 48 ч после введения дозы (зеленый) и через 96 ч после введения дозы (синий) IdeS или плацебо. Связывание обнаруживали с помощью вторичного реагента против человеческого Fcy. Для IdeS график перед введением дозы находится справа от всех трех графиков после введения дозы. Таким образом, происходит уменьшение способности сыворотки связываться с мышиными спленоцитами через 24 ч, и этот эффект сохраняется через 96 ч.
Фиг. 17 - ксеногенная перекрестная реакция между сывороткой от здорового субъекта (504), получившего IdeS в дозе 0,24 мг/кг массы тела, и клетками селезенки от мыши Balb/c. Образцы сыворотки собирали перед введением дозы и в указанные моменты времени после введения дозы. Сыворотки обрабатывали DTT, чтобы инактивировать IgM. Наложение фотографий лунок планшета Terasaki, показывающих живые клетки (зеленые/яркие) и мертвые клетки (красные/тусклые). Клетки селезенки, обработанные только PBS (от англ. phosphate-buffer saline - фосфатно-солевой буфер) (без сыворотки), использовали в качестве контроля спонтанной клеточной гибели.
Фиг. 18 показывает сравнение двух способов измерения уровней IgG (турбидиметрия и PD-ELISA) в сыворотке крови от субъекта (№ 101), получившего IdeS. Сыворотку собирали в различные моменты времени после введения дозы IdeS и измеряли, используя стандартный больничный турбидиметрический тест p-IgG, а также используя анализ PD-ELISA, разработанный авторами данного изобретения для различения интактного IgG и F(ab')2-фрагментов, образующихся при IdeS-расщеплении IgG. ULN - верхний предел нормальности, LLN - нижний предел нормальности для IgG у здоровых людей.
Фиг. 19 показывает, что IdeS расщепляет IgG-тип, но не IgM-тип BCR (от англ. В cell receptor - Вклеточный рецептор) на В-клетках. А - анализ путем проточной цитометрии анти-Fab-сигнала на клетках, экспрессирующих lgG-тип (Nu-DUL-1) и IgM-тип (Daudi) BCR, после обработки указанными количествами IdeS. Ось у показывает среднюю интенсивность флуоресценции в FL4. В - анализ путем проточной цитометрии анти-Fab и анти-Fc на поверхности клеток Nu-DUL-1 после обработки различными количествами IdeS.
Фиг. 20 показывает, что IdeS расщепляет IgG-тип BCR с такой же эффективностью, как и растворимый IgG. А - гепаринизированную периферическую кровь обрабатывали PBS или различными количествами IdeS. После инкубационного периода плазму выделяли и разделяли на геле SDS-PAGE. Интактный IgG, scIgG и F(ab')2-фрагменты показаны справа. В - РВМС, выделенные из той же крови, обработанной PBS или IdeS, дважды окрашивали на CD19+ и на анти-Fc или анти-Fab.
Фиг. 21 показывает, что IdeS расщепляет поверхностный IgG на В-клетках памяти. А - отрицательная селекция В-клеток с использованием RosetteSep привела к получению белее 90% CD19+-клеток. В F(ab')2-часть поверхностного IgG с CD19+/CD27+-kлеток эффективно расщепляется под влиянием IdeS. Количество клеточно-мембранных заякоренных Fc-эпитопов не меняется после обработки IdeS.
Фиг. 22 показывает восстановление клеток после обработки IdeS. А - анализ путем проточной цитометрии анти-Fab на поверхности клеток Nu-DUL-1 после обработки различными количествами IdeS. IdeS удаляли и клетки культивировали и анализировали через 1 ч и через 24 ч. В - клетки Nu-DUL-1 обрабатывали различными количествами IdeS или антипролиферативными контрольными веществами (цитохалазином D и пуромицином) и культивировали в течение 24 ч с последующим временем импульса BrdU 6 ч. С - клетки Nu-DUL-1 обрабатывали PBS или 30 мкг/мл IdeS в течение 24 ч с последующим анализом жизнеспособности на основе внутриклеточной гидрогеназной активности (ССК-8) в виде считывания.
Фиг. 23 показывает восстановление экспрессии IgG-типа BCR на ex vivo IdeS-обработанных РВМС.
- 3 039169
А - анализ путем проточной цитометрии aHTu-Fab-сигнала на CD19+-клетках сразу после обработки PBS или IdeS (30 мкг/мл) и через 16 ч культивирования без IdeS. Дважды положительные клетки обнаружены в R2. В - анализ путем проточной цитометрии анти-Fc-сигнала на CD19+-клетках сразу после обработки
PBS или IdeS (30 мкг/мл) и через 16 ч культивирования. Дважды положительные клетки обнаружены в
R2 и выражены в процентах клеток в гейте Р3.
Фиг. 24 показывает восстановление IgG-типа BCR на обогащенных В-клетках (RosetteSep, более 90% CD19+-клеток). А - анализ путем проточной цитометрии анти-Fab-сигнала на обогащенных Вклетках сразу после обработки PBS или IdeS (30 мкг/мл) и в указанные моменты времени после обработки. В - анализ путем проточной цитометрии анти-Fc-сигнала на обогащенных В-клетках сразу после обработки PBS или IdeS (30 мкг/мл) и в различные моменты времени после обработки.
Фиг. 25 показывает, что IdeS не влияет на жизнеспособность В-клеток. Обогащенные с помощью RosetteSep В-клетки, содержащие более 90% CD19+-клеток, содержали в культуре в течение нескольких дней после обработки PBS или IdeS (30 мкг/мл), и измеряли их жизнеспособность с помощью колориметрического анализа ССК-8.
Фиг. 26 показывает, что обработка IdeS ингибирует передачу сигналов (сигналинг) BCR. Клетки Nu-DUL-1 обрабатывали PBS или IdeS (30 мкг/мл) до сшивания с помощью F(ab')2-специфического антитела. А - фосфорилирование ERK1/2 исследовали в различные моменты времени после стимуляции с помощью фосфоспецифического антитела путем проточной цитометрии. В - фосфорилирование PLC-y2 исследовали в различные моменты времени после стимуляции с помощью фосфоспецифического антитела путем проточной цитометрии.
Фиг. 27 показывает, что IdeS специфически блокирует В-клеточное созревание IgGпродуцирующих клеток. РВМС обрабатывали IdeS и стимулировали рекомбинантным IL2 и R848 для активации В-клеток памяти и для их дифференцировки в Ig-продуцирующие клетки. Фильтровальные планшеты ELISPOT оценивали на количество IgG-продуцирующих клеток. А - в фильтровальный планшет засевали 50000 или 100000 клеток и обрабатывали их (или не обрабатывали) IdeS и rIL2/R848 в день 0. В одном случае IdeS добавляли на 3-й день стимуляции посредством R848 и IL2. В - число клеток, продуцирующих IgA, IgM и IgG, после стимуляции посредством rIL2/R848 в присутствии или в отсутствие IdeS в концентрации 30 мкг/мл в течение 96 ч. С - число IgG-продуцирующих клеток после стимуляции посредством rIL2/R848 в присутствии или в отсутствие IdeS в концентрации 0,3-30 мкг/мл в течение 72 ч. D - число IgG-продуцирующих клеток после предварительной обработки клеток в течение одного часа посредством IdeS в концентрации 0,3-30 мкг/мл с последующим удалением IdeS и стимуляцией клеток посредством rIL2/R848 в течение 72 ч.
Фиг. 28 показывает анализ путем проточной цитометрии CD19+/IgG+-клеток в различные моменты времени у здорового человека после однократного внутривенного введения IdeS в дозе 0,24 мг/кг массы тела. Выделенные РВМС гейтировали с использованием прямого светорассеяния (Р1), и В-клетки (CD19+) контролировали как М1 в Р1. Верхняя панель показывает дважды положительные клетки на CD19 (FL2) и Fc-часть IgG (FL4) перед введением дозы и в течение периода до 96 ч после введения дозы. Нижняя панель показывает дважды положительные клетки на CD19 (FL2) и Fab-часть IgG (FL4) перед введением дозы и в течение периода до 96 ч после введения дозы.
Фиг. 29 показывает, что IdeS расщепляет IgG-тип BCR in vivo у людей. Здоровым людям вводили IdeS в дозе 0,24 мг/кг массы тела и собирали РВМС в разные моменты времени после введения дозы. Процент дважды положительных клеток на CD19 и F(ab')2 анализировали путем проточной цитометрии. Часы после введения дозы показаны на оси x, а значение MFI х частота клеток показано на оси y.
Фиг. 30 показывает жизнеспособность В-клеток после сшивания антитела с IdeS-обработанными клетками (наверху) и PBS-обработанными клетками (внизу) в течение периода анализа длительностью 48 ч.
Описание последовательностей
SEQ ID NO: 1 показывает аминокислотную последовательность зрелого иммуноглобулин Gразрушающего фермента от S. pyogenes (IdeS). Этот белок иногда называют МАС1. Полная последовательность МАС1, включая сигнал секреции, доступна в GenBank под номером WP_010922160.1.
SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность зрелой эндогликозидазы S (EndoS). Полная последовательность, включая сигнал секреции, доступна в GenBank под номером AAK00850.1.
SEQ ID NO: 3 показывает аминокислотную последовательность зрелого МАС2, варианта IdeS. Полная последовательность MAC 2, включая сигнал секреции, доступна в GenBank под номером AFC67907.1.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что различные применения описанного способа могут быть адаптированы к конкретным потребностям в данной области. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, нужна только для описания конкретных воплощений изобретения и не предназначена для ограничения изобретения.
Кроме того, используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения понятия в единственном числе включают множественное число, если содержание явно не указывает на иное. Таким об- 4 039169 разом, например, ссылка на легкое включает легкие, ссылка на антиген включает два или более двух таких антигенов, ссылка на субъект включает двух или более двух таких субъектов и т.п.
Термины пациент и субъект используются как взаимозаменяемые и, как правило, относятся к человеку.
Используемый в данном документе термин агент, который уменьшает Fc-рецепторное связывание с молекулами сывороточного IgG применяется для обозначения агента, который достигает этого эффекта с помощью любого подходящего механизма. Как известно, различные агенты снижают Fcрецепторное взаимодействие молекул IgG. Эти агенты часто являются белками бактериального происхождения и могут действовать различными путями.
Например, такой белок может представлять собой IgG-цистеинпротеазу, которая расщепляет IgG таким образом, что антигенсвязывающие домены и Fc-взаимодействующие домены отделяются друг от друга. В таких случаях Fc-рецепторное взаимодействие сывороточных молекул IgG уменьшается, так как количество интактных молекул IgG в сыворотке снижается.
Используемый в данном документе термин молекула сывороточного IgG относится к любой молекуле γ-иммуноглобулина (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), которая присутствует в тканях человека перед выполнением способа согласно данному изобретению. Такие молекулы IgG могут продуцироваться эндогенно из В-клеток индивидуума или могут быть экзогенными γ-иммуноглобулинами, которые вводили пациенту до выполнения способа согласно данному изобретению.
Используемый в данном документе термин Fc-рецептор относится к Fc-рецепторам γиммуноглобулина (FcyR), которые присутствуют на клетках. У людей FcyR относится к одному, некоторым или всем представителям семейства рецепторов, включающего FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) и FcyRIIIB (CD16b). Используемый в данном документе термин FcyR включает встречающиеся в природе полиморфизмы FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) и FcyRIIIB (CD16b).
Все публикации, патенты и заявки на патенты, цитируемые в данном документе выше или ниже, включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Способы увеличения преимуществ терапии
Данное изобретение относится к способу увеличения преимуществ терапии для субъекта, который включает: (а) введение субъекту белка, обладающего активностью IgG-цистеинпротеазы, который представляет собой IdeS; и (b) последующее проведение указанной терапии у субъекта, где указанная терапия представляет собой трансплантацию органа; количество вводимого указанного белка является достаточным для того, чтобы устранить Fc-рецепторное связывание, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке крови субъекта; а также этапы (а) и (b) разделены временным интервалом, который является достаточным для устранения Fc-рецепторного связывания, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке крови субъекта, и составляет от 1 до не более 6 ч;
где, кроме того, количество вводимого IdeS находится в диапазоне от 0,01 до 1 мг/кг массы тела, и где субъектом является человек.
Сроки и порядок этапов (а) и (b).
Этап (а) проводят перед этапом (b), а этапы (а) и (b) разделены временным интервалом, достаточным для устранения Fc-рецепторного связывания всеми или, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке субъекта. Под термином по существу, все обычно понимается, что Fcрецепторное связывание сывороточными IgG снижается до уровня менее 5% от того уровня, который имел место перед этапом (а). Например, если агент, вводимый на (а), представляет собой протеазу (например, IdeS), то интервал будет представлять собой время, необходимое для того, чтобы агент расщепил по меньшей мере 95% сывороточного IgG у субъекта, измеренного с помощью любого подходящего анализа. Указанный интервал, как правило, может составлять не менее 30 мин и не более 21 дня.
Нижний предел временного интервала между этапами (а) и (b) определяется временем, которое требуется для того, чтобы агент, вводимый на этапе (а), устранил Fc-рецепторное связывание, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке субъекта. Это можно определить путем анализа образца сыворотки, взятого у индивидуума, с применением любого подходящего анализа. Некоторые иллюстративные подходящие анализы описаны в примерах.
Такой анализ может непосредственно проверить наличие молекул IgG в образце сыворотки, которые способны связываться с одним или более чем одним Fc-рецептором, например, в ELISA. В качестве альтернативы такой анализ может быть косвенным, при этом он может проверить наличие одного или более чем одного продукта реакции, который, как ожидается, образуется в результате воздействия на IgG агента, вводимого на этапе (а). Например, когда агент представляет собой фермент, который расщепляет белок IgG, образец сыворотки можно проанализировать на наличие интактных молекул IgG или фрагментов, которые образуются в результате расщепления. Это можно осуществить любым подходящим способом, например путем разделения молекул и фрагментов на основании их молекулярной массы, например, путем масс-спектрометрии или SDS-PAGE, или путем специфического обнаружения молекул
- 5 039169 или фрагментов, например путем ELISA. В качестве альтернативы IgG можно обнаружить путем смешивания сыворотки от субъекта с клетками, экспрессирующими FcyR, и мониторинга связывания IgG путем проточной цитометрии с использованием противочеловеческого IgG, конъюгированного с флуорохромом.
Традиционные способы оценки количества IgG в образце, таком как образец сыворотки, в клинических условиях основаны на нефелометрии и турбодиметрии из-за их скорости, простоты использования и точности. Как при нефелометрии, так и при турбодиметрии источник света проецируется через жидкий образец, находящийся в прозрачном контейнере. Турбидиметрия измеряет уменьшение интенсивности света, а нефелометрия измеряет рассеяние света при его прохождении через образец, которое пропорционально концентрации иммуноглобулина в растворе. Оба принципа основаны на добавлении антител против IgG, которые вступают в реакцию с антигеном в образце с формированием комплекса антиген/антитело (агглютинация). Добавление ПЭГ позволяет реакции быстро прогрессировать до конечной точки, повышает чувствительность, а также снижает риск получения ложно отрицательных результатов с образцами, содержащими избыток антигена. В случае IgG-анализа F(ab')2-часть IgG сшивают антителом против IgG и вызывают реакцию агглютинации. Тем не менее, такие способы могут быть неподходящими, если некоторые или все присутствующие IgG могут не быть интактными. Например, если IgGцистеинпротеаза (например, IdeS) была введена субъекту, от которого взят образец, например, в способе согласно данному изобретению, или если такая протеаза была введена в образец, то будут присутствовать фрагменты расщепления, такие как F(ab')2- и Fc-фрагменты. Это не влияет на реакцию агглютинации в традиционных способах нефелометрии и турбидиметрии до тех пор, пока F(ab')2-фрагменты все еще присутствуют в образце. Из-за более короткого периода полужизни F(ab')2-фрагментов по сравнению с интактным IgG агглютинация будет уменьшаться с течением времени, хотя не пропорционально количеству интактного IgG, присутствующего в образце. Таким образом, образцы, затронутые присутствием IgG-цистеинпротеазы (например, IdeS), нельзя оценить с помощью традиционных способов. Авторы данного изобретения разработали новый способ количественной оценки концентрации IgG, который совместим с образцами, затронутыми присутствием IgG-цистеинпротеазы (такой как IdeS), и может быть использован в любых клинических условиях, в том числе (но не ограничиваясь этим) может быть использован в сочетании с другими способами согласно данному изобретению.
Указанный способ позволяет различать интактный IgG и IdeS-образованные F(ab')2-фрагменты. Это было достигнуто путем использования антител, которые обнаруживают различные фрагменты, т.е. антител против Fab и антител против Fc. Антитела, используемые в данном анализе, не должны быть субстратом для IgG-цистеинпротеазы, воздействующей на образец (как правило, IdeS). Это позволяет избежать воздействия любой активной протеазы, которая может присутствовать в образце, на реагенты для анализа. Это может быть достигнуто путем анализа IgG от различных видов или с использованием фрагментов антител (т.е. Fab-фрагментов или F(ab')2-фрагментов) вместо целых антител. Как правило, антиF(ab')2-агент инкубируют с образцом в качестве реагента захвата. Реагент захвата, как правило, иммобилизируют, например, в лунках планшета для анализа. Затем связанный IgG обнаруживают путем инкубации с анти-Fc-агентом в качестве реагента для обнаружения. Таким образом, будет обнаруживаться только IgG, которые обладают и Fab-, и Fc-частями, в отличие от способов нефелометрии и турбидиметрии. Реагент для обнаружения, как правило, может быть конъюгирован непосредственно или косвенно с группировкой для облегчения обнаружения, такой как флуоресцентная метка или фермент, который вступает в реакцию с хромогенным субстратом. Реагенты для захвата и обнаружения могут представлять собой любую другую молекулу, которая специфически распознает Fab- или Fc-часть IgG, и могут быть использованы в обратном порядке, т.е. с захватом с помощью анти-Fc и обнаружением с помощью антиFab. Анализ может быть проведен в любом подходящем формате, например в стандартном формате ELISA или в формате Meso Scale Discovery.
В некоторых случаях, например, когда цистеинпротеаза IgG представляет собой IdeS, образец может включать промежуточные фрагменты, такие как scIgG, в которых только одна тяжелая цепь является расщепленной, a F(ab')2 остается прикрепленной к другой, интактной тяжелой цепи. В таких случаях фрагмент scIgG может быть неправильно идентифицирован в данном анализе как интактный IgG. Таким образом, способ может включать дополнительный этап оценки размеров фрагментов, присутствующих в образце. Так как между тяжелыми цепями ниже шарнирной области нет дисульфидных мостиков, Fcчасть тяжелой цепи во фрагменте scIgG будет отделяться от интактной тяжелой цепи в денатурирующих условиях в виде белка массой примерно 20-25 кДа. Различные размеры фрагментов можно обнаружить и количественно оценить с использованием любого подходящего способа, такого как SDS-PAGE. Конкретное воплощение способа, включая возможный дополнительный этап, описано в примере 1 (см. оценка эффективности). Этот способ является особенно полезным для оценки эффективности IdeS в клинических условиях.
Нижний предел временного интервала между этапами (а) и (b) может быть выбран среди следующих значений: по меньшей мере 1 ч, по меньшей мере 2 ч, по меньшей мере 3 ч, по меньшей мере 4 ч, по меньшей мере 5 ч или по меньшей мере 6 ч. Нижний предел может быть короче, чем любой из перечисленных выше, если будет установлено, что Fc-рецепторное связывание, по существу, всеми молекулами
- 6 039169
IgG, присутствующими в сыворотке субъекта, было устранено за более короткий период времени.
Верхний предел временного интервала между этапами (а) и (b) может быть выбран независимо от нижнего предела и может быть определен временем, которое требуется для эндогенной продукции IgG, чтобы начать заменять или полностью заменить молекулы IgG, присутствовавшие в сыворотке субъекта до осуществления указанного способа. Это можно определить путем анализа образца сыворотки, взятого у индивидуума, с применением любого подходящего анализа, такого как описан выше для определения нижнего предела. Вновь синтезированный IgG, как правило, начинает появляться в сыворотке в течение 3-4 дней, а полная замена завершается примерно в течение 3 недель (21 дня).
Верхний предел временного интервала между этапами (а) и (b) может быть выбран независимо от нижнего предела и может быть выбран среди следующих значений: не более 6 ч, не более 5 ч, не более 4 ч, не более 3 ч, не более 2 ч или не более 1 ч.
Предпочтительно временной интервал между этапами (а) и (b) составляет от 1 до 2 ч, от 1 до 3 ч, от 1 до 4 ч, от 1 до 5 ч, от 1 до 6 ч, от 2 до 3 ч, от 2 до 4 ч, от 2 до 5 ч, от 2 до 6 ч, от 3 до 4 ч, от 3 до 5 ч, от 3 до 6 ч, от 4 до 5 ч, от 4 до 6 ч или от 5 до 6 ч.
Этап (а).
На этапе (а) субъекту вводят эффективное количество агента, который уменьшает Fc-рецепторное связывание сывороточных молекул IgG у субъекта. Под термином эффективное количество подразумевается, что количество агента является достаточным для устранения Fc-рецепторного связывания, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке субъекта.
Агент.
Агент, как правило, представляет собой белок, как правило, бактериального происхождения. Данный агент может быть белком, который обладает активностью IgG-цистеинпротеазы, предпочтительно расщепляющим молекулу иммуноглобулина в шарнирной области. Примером такого белка является IdeS (Immunoglobulin G-degrading enzyme of S. pyogenes, иммуноглобулин G-разрушающий фермент от S. pyogenes). IdeS представляет собой стрептококковую протеазу с уникальной степенью специфичности; он расщепляет антитела иммуноглобулины G (IgG), но не расщепляет никакие другие субстраты (включая IgA, IgD, IgE и IgM). IdeS расщепляет человеческий IgG в F(ab')2- и Fc-фрагментах в определенном сайте с СООН-конца от шарнирной области (см. фиг. 1). Зрелая последовательность IdeS приведена как SEQ ID NO: 1. Данный агент может представлять собой белок, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, либо может быть его гомологом из альтернативной бактерии.
В качестве альтернативы данный агент может представлять собой вариант белка IdeS, который содержит или состоит из любой аминокислотной последовательности, которая обладает по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% идентичностью с SEQ ID NO: 1 и обладает активностью IgG-цистеинпротеазы. Предпочтительным вариантом является белок МАС2, полная последовательность которого доступна в GenBank под номером AFC67907.1. Последовательность МАС2 без сигнальной последовательности приведена как SEQ ID NO: 3. Данный агент может представлять собой белок, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, либо может быть его гомологом из альтернативной бактерии.
Вариант белка IdeS может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, в которой было сделано до 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 или более аминокислотных замен, вставок или делеций относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, при условии, что указанный вариант обладает активностью IgG-цистеинпротеазы. Указанные аминокислотные замены предпочтительно являются консервативными. Консервативные замены заменяют аминокислоты другими аминокислотами с похожей химической структурой, похожими химическими свойствами или похожим объемом боковой цепи. Вводимые аминокислоты могут иметь полярность, гидрофильность, гидрофобность, основность, кислотность, нейтральность или заряд, аналогичные таковым у аминокислот, которые они заменяют. В качестве альтернативы консервативная замена может ввести другую аминокислоту, которая является ароматической или алифатической, на место ранее существовавшей ароматической или алифатической аминокислоты. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области и могут быть выбраны в соответствии со свойствами 20 основных аминокислот, приведенных в табл. 1 ниже. Варианты, в которых аминокислоты имеют одинаковую полярность, можно определить по ссылке на шкалу гидрофобности для боковых цепей аминокислот в табл. 2.
- 7 039169
Таблица 1
Химические свойства аминокислот
Ala алифатическая, гидрофобная, нейтральная Met гидрофобная, нейтральная
Cys полярная, гидрофобная, нейтральная Asn полярная, гидрофильная, нейтральная
Asp полярная, гидрофильная, заряженная (-) Pro гидрофобная, нейтральная
Glu полярная, гидрофильная, заряженная (-) Gin полярная, гидрофильная, нейтральная
Phe ароматическая, гидрофобная, нейтральная Arg полярная, гидрофильная, заряженная (+)
Gly алифатическая, нейтральная Ser полярная, гидрофильная, нейтральная
His ароматическая, полярная, гидрофильная, заряженная (+) Thr полярная, гидрофильная, нейтральная
lie алифатическая, гидрофобная, нейтральная Vai алифатическая, гидрофобная, нейтральная
Lys полярная, гидрофильная, заряженная(+) Trp ароматическая, гидрофобная, нейтральная
Leu алифатическая, гидрофобная, нейтральная Tyr ароматическая, полярная, гидрофобная
Таблица 2
Шкала гидрофобности
Боковая цепь Гидрофобность
Не 4,5
Vai 4,2
Leu 3,8
Phe 2,8
Cys 2,5
Met 1,9
Ala 1,8
Gly -0,4
Thr -0,7
Ser -0,8
Trp -0,9
Tyr -1,3
Pro -1,6
His -3,2
Glu -3,5
Gin -3,5
Asp -3,5
Asn -3,5
Lys -3,9
Arg -4,5
В качестве альтернативы данный агент может быть белком, который содержит или состоит из фрагмента SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 и обладает активностью IgG-цистеинпротеазы, предпочтительно, где указанный фрагмент содержит от 100 до 300, от 150 до 300 или от 200 до 300 аминокислот в длину. Фрагмент может быть создан путем делеции одного или более чем одного аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. До 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30,
- 8 039169 или 50 или более остатков могут быть удалены. Удаленные остатки могут быть смежными друг с другом.
Введение и дозы.
На этапе (а) указанный агент предпочтительно вводится путем внутривенного вливания, но может быть введен любым подходящим способом, включая, например, внутрикожный, подкожный, чрескожный, внутримышечный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, внутрисуставной, внутрикостный или другие подходящие пути введения. Количество указанного агента, которое вводят, может находиться в пределах от 0,01 до 1 мг/кг массы тела, от 0,04 до 1 мг/кг массы тела, от 0,12 до 1 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,24 до 1 мг/кг массы тела и наиболее предпочтительно в пределах 1 мг/кг массы тела. Указанный агент может присутствовать, по существу, в выделенной форме. Он может быть смешан с носителями или разбавителями (как описано ниже), которые не будут мешать предполагаемому применению, и по-прежнему сможет рассматривать как, по существу, выделенный. Он также может находиться, по существу, в очищенной форме, и в этом случае он, как правило, содержит по меньшей мере 90%, например по меньшей мере 95, 98 или 99% белка в препарате.
Составы и композиции.
Указанный агент предпочтительно вводят вместе с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем и, возможно, одним или более чем одним другим терапевтическим ингредиентом. Носитель (носители) должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и безвредности по отношению к его реципиенту. Как правило, носители для инъекций и конечный состав являются стерильными и апирогенными.
Состав подходящей композиции может быть получен с использованием стандартных фармацевтических химических компонентов и методик, которые легко доступны квалифицированному специалисту. Например, агент может быть объединен с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем. В эксципиенте или носителе могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества и т.п. Эти эксципиенты, носители и вспомогательные вещества, как правило, представляют собой фармацевтические агенты, которые не индуцируют иммунный ответ у индивидуума, получающего композицию, и которые могут быть введены без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но не ограничиваясь ими, жидкости, такие как воду, физиологический раствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновую кислоту, глицерин, тиоглицерин и этанол. В данное изобретение также могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов, носителей и вспомогательных веществ доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Такие композиции могут быть приготовлены, упакованы или проданы в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Инъекционные композиции могут быть приготовлены, упакованы или проданы в единичной дозированной форме, например в ампулах или в многодозовых контейнерах, содержащих консервант. Композиции включают, но не ограничиваясь ими, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных носителях, пасты и имплантируемые с замедленным высвобождением или биоразлагаемые составы. Такие композиции дополнительно могут содержать один или более чем один дополнительный ингредиент, включая, но не ограничиваясь ими, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В одном из воплощений композиции для парентерального введения активный ингредиент находится в сухом виде (например, в виде порошка или гранул) для восстановления с помощью подходящего носителя (например, стерильной апирогенной воды) перед парентеральным введением восстановленной композиции. Композиции могут быть приготовлены, упакованы или проданы в виде стерильной инъекционной водной или масляной суспензии или раствора. Эта суспензия или раствор могут быть приготовлены в соответствии с известными в данной области методиками и могут включать в дополнение к активному ингредиенту дополнительные ингредиенты, такие как диспергирующие агенты, смачивающие агенты или суспендирующие агенты, описанные в данном документе. Такие стерильные инъекционные составы могут быть приготовлены с использованием нетоксичного разбавителя или растворителя, приемлемого для парентерального введения, например, такого как вода или 1,3-бутандиол. Другие приемлемые разбавители и растворители включают, но не ограничиваясь этим, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды.
Другие приемлемые для парентерального введения композиции, которые могут быть использованы, включают такие композиции, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме, в липосомальном препарате или в качестве компонента биоразлагаемых полимерных систем. Композиции для замедленного высвобождения или имплантации могут включать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы, такие как эмульсии, ионообменные смолы, труднорастворимый полимер или умеренно растворимая соль.
Этап (b).
На этапе (b) субъекту проводят терапию. Терапию, как правило, осуществляют или вводят точно
- 9 039169 таким же образом, как это было бы сделано, если бы вначале не проводился этап (а).
Терапия.
В другом воплощении терапия представляет собой трансплантацию органа. Орган может быть выбран среди почки, печени, сердца, поджелудочной железы, легкого или тонкого кишечника.
Субъект, подвергаемый лечению, предпочтительно может быть сенсибилизирован или сильно сенсибилизирован. Под термином сенсибилизированный подразумевается, что у субъекта выработались антитела к человеческим антигенам гистосовместимости (major histocompatibility, MHC) (также упоминаемым как антигены лейкоцитов человека (human leukocyte antigens, HLA)). Антитела против HLA происходят из аллогенно сенсибилизированных В-клеток и, как правило, присутствуют у пациентов, которые ранее были сенсибилизированы при переливании крови, предыдущей трансплантации или беременности (Jordan et al., 2003).
Является ли потенциальный реципиент трансплантата сенсибилизированным, можно определить любым подходящим способом. Например, можно использовать тест Panel Reactive Antibody (PRA), чтобы определить, является ли реципиент сенсибилизированным. Значение PRA более 30%, как правило, следует понимать как тот факт, что пациент имеет высокий иммунологический риск или является сенсибилизированным. В качестве альтернативы может быть проведен перекрестный тест, в котором образец крови потенциального донора трансплантата смешивают с образцом от предполагаемого реципиента. Положительная перекрестная реакция означает, что реципиент имеет антитела, которые вступают в реакцию с образцом донора, что указывает на то, что реципиент сенсибилизирован, и трансплантацию проводить нельзя. Перекрестные тесты, как правило, проводят в качестве окончательной проверки непосредственно перед трансплантацией.
Наличие высоких титров антител против антигенов МНС потенциального донора (т.е. донорспецифических антител (doNO:r specific antibodies, DSA)) является прямым противопоказанием к трансплантации из-за риска острого отторжения, опосредованного антителами. Вкратце, сенсибилизация к донорским антигенам МНС затрудняет выявление подходящего донора. Положительный перекрестный тест является однозначным препятствием для трансплантации. Поскольку примерно одна треть пациентов, ожидающих трансплантации почки, являются сенсибилизированными, при этом 15% из них являются высокосенсибилизированными, это приводит к накоплению пациентов, ожидающих трансплантации. В США среднее время в листе ожидания трансплантации почки в 2001-2002 гг. составляло 1329 дней для пациентов с оценкой по Panel Reactive Antibody (PRA) 0-9%, 1920 дней для пациентов с оценкой PRA 1079%, и 3649 дней для пациентов с оценкой PRA 80% или более (база данных OPTN, 2011).
Одной из принятых стратегий для преодоления барьера DSA является применение плазмафереза или иммуноадсорбции, часто в сочетании, например, с внутривенным введением γ-глобулина (IVIG) или ритуксимаба, чтобы снизить уровни DSA до уровня, при котором трансплантацию можно проводить (Jordan et al., 2004; Montgomery et al., 2000; Vo et al., 2008a; Vo et al., 2008b). Тем не менее, плазмаферез, иммуноадсорбция и введение IVIG имеют недостаток, заключающийся в неэффективности и необходимости строгого планирования, поскольку они включают повторное лечение в течение длительного периода времени. Когда орган от умершего донора будет доступен, он должен быть пересажен в течение нескольких часов, так как длительная гипотермическая ишемия является одним из наиболее важных факторов риска отсроченной функции трансплантата и потери трансплантата при трансплантации почек (Ojo et al., 1997).
Напротив, способ согласно данному изобретению делает возможным быстрое, временное и безопасное удаление DSA у потенциального реципиента трансплантата.
Введение агента непосредственно перед трансплантацией способно эффективно десенсибилизировать высокосенсибилизированного пациента, тем самым позволяя провести трансплантацию и избежать острого отторжения, опосредуемого антителами. Одна доза агента перед трансплантацией позволит провести трансплантацию тысячам пациентов с донор-специфическими антителами IgG.
Указанный способ альтернативно может быть описан как способ лечения органной недостаточности у субъекта, причем указанный способ включает (а) введение субъекту агента, который снижает Fcрецепторное связывание сывороточных молекул IgG у субъекта; и (b) последующую трансплантацию органа у субъекта; где количество вводимого указанного агента является достаточным для того, чтобы устранить Fcрецепторное связывание, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке субъекта; и этапы (а) и (b) разделены временным интервалом продолжительностью не менее 2 ч и не более 21 дня.
Это может быть описано как способ профилактики отторжения пересаженного органа у субъекта, в частности острого отторжения трансплантата, опосредованного антителами, причем указанный способ включает (в период не менее чем за 2 ч и не более чем за 21 день до трансплантации органа) введение субъекту агента, который уменьшает Fc-рецепторное связывание сывороточных молекул IgG у субъекта, где количество вводимого указанного агента является достаточным для того, чтобы устранить Fcрецепторное связывание, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке субъекта.
- 10 039169
Следует принять во внимание, что введение агента и последующая трансплантация разделены временным интервалом, который эквивалентен временному интервалу между этапами (а) и (b) в альтернативных формулировках способа, представленных выше. Таким образом, различные верхние и нижние пределы временного интервала между этапами (а) и (b), описанные выше, в равной степени применимы к этому временному интервалу. В этом воплощении особенно предпочтительно, что интервал времени является достаточно коротким, что позволяет осуществлять указанный способ в течение одного посещения больницы. Таким образом, предпочтительные интервалы составляют от 1 до 6 ч или от 1 до 12 ч.
В этом воплощении способ согласно данному изобретению может дополнительно включать этап, проводимый во время или непосредственно перед трансплантацией, который включает индукцию супрессии Т-клеток и/или В-клеток у пациента. Указанная индукция супрессии обычно может включать введение эффективного количества агента, который убивает или ингибирует Т-клетки, и/или введение эффективного количества агента, который убивает или ингибирует В-клетки. Агенты, которые убивают или ингибируют Т-клетки, включают муромонаб, базиликсимаб, даклизумаб, антитело против тимоцитарного глобулина (ATG) и лимфоцитарный иммуноглобулин, препарат глобулина против тимоцитов (ATGAM). Ритуксимаб, как известно, убивает или ингибирует В-клетки.
Следующие примеры иллюстрируют данное изобретение.
Пример 1. Доклинические исследования.
GLP-совместимые доклинические исследования, разработанные для исследования токсикологии и фармакологии GMP-полученного IdeS на новозеландских белых кроликах, показали, что IdeS расщеплял полный плазменный пул IgG в течение 5 мин после введения IdeS, при этом уровень менее 1% IgG сохранялся через один день после введения. Уровень IgG достигал самого низкого значения через 24-48 ч после введения IdeS, а затем постепенно повышался в течение последующих дней. Нормальные уровни IgG восстанавливались примерно через 3 недели после введения однократной дозы IdeS. Конечные продукты, т.е. F(ab')2- и Fc-фрагменты, имели значительно более короткие периоды полужизни по сравнению с интактным IgG, и только низкие уровни были обнаружены на следующий день после введения однократной дозы IdeS. IdeS имел быстрое распространение, показывал пропорциональную дозе фармакокинетику и многофазную элиминацию с периодом полужизни в плазме у кроликов примерно 1 ч. На основании токсикологических исследований с повторными введениями IdeS в дозе 2 мг/кг массы тела (BW) был установлен уровень отсутствия наблюдаемых побочных эффектов (NO:AEL). Данные не показаны.
Влияние IdeS in vitro и in vivo в экспериментах, описанных выше, было драматичным и послужило основой для дальнейшего исследования на здоровых добровольцах.
Исследования на людях.
Материалы и методы.
Дизайн исследования.
Это было двойное слепое, рандомизированное, одноцентровое испытание на здоровых субъектах мужского пола (№ EudraCT: 2012-000969-21), проводимое на первой фазе в Университетской больнице в Лунде, Швеция. Перед набором субъектов протокол был одобрен местным комитетом по этике, и все привлеченные субъекты подписывали информированное согласие перед проведением каких-либо процедур, связанных с испытанием. Основная цель заключалась в оценке безопасности и переносимости IdeS после внутривенного введения разовых возрастающих доз. Вторичные цели заключались в оценке эффективности (т.е. снижении IgG в сыворотке), фармакокинетики и иммуногенности IdeS у здоровых людей.
Разведенный инфузионный раствор GMP-произведенного IdeS (Hansa Medical AB, Швеция) получали в забуференном фосфатом изотоническом солевом растворе в аптеке больницы в инфузионном шприце с инфузионным набором, включающим фильтр с размером пор 0,2 мкм (В. Braun, Германия). Выбранная начальная доза 0,010 мг/кг массы тела была в 10 раз ниже предварительно клинически определенного минимального уровня предполагаемого биологического эффекта (MABEL) и в 200 раз ниже уровня отсутствия наблюдаемых побочных эффектов (NO:AEL), определенного в ходе токсикологического испытания на животных. Дизайн исследования позволял постепенно увеличивать дозу с интенсивным мониторингом безопасности.
Для того чтобы соответствовать критериям включения, субъекты должны были быть здоровыми в соответствии со скрининговым медицинским обследованием, находиться в возрасте 18-45 лет, иметь подходящие вены для пункции, индекс массы тела (BMI) от 19 до 30 кг/м2 и массу тела 50-100 кг. Из исследования исключались субъекты, которые имели (или имели в анамнезе) любой клинически значимый иммунодефицит, включая, но не ограничиваясь им, дефицит иммуноглобулина А, которые имели во время скрининга повышенные уровни IgG к IdeS (более 15 мг/л), положительный результат на поверхностный антиген сывороточного гепатита В, антитела против гепатита С, вирус иммунодефицита человека (HIV), текущий туберкулез, текущий сифилис, активную инфекцию вирусом простого герпеса или вирусом опоясывающего герпеса.
Каждый субъект имел трехдневный срок включения в клинические испытания и был рандомизирован в группу IdeS или плацебо (забуференный фосфатом солевой раствор) и получал препарат утром по
- 11 039169 сле приема. Двум субъектам в каждой группе вводили дозу препарата в первый день (один субъект в группе IdeS и один субъект в группе плацебо), а последующие субъекты в группе получали дозу препарата через одну неделю. После каждой когорты Комитет по наблюдению за данными оценивал данные по безопасности и принимал решение о следующем уровне дозы. Время от последнего введения на одном уровне дозы до начала введения на следующем уровне дозы составляло по меньшей мере 14 дней. Инфузии проводили в течение 30 мин первым двум субъектам в каждой группе и в течение 15 мин последующим субъектам в этих группах. В период включения выполняли интенсивный мониторинг безопасности и серийные заборы крови для анализа безопасности, фармакокинетики, эффективности и антител против лекарственного препарата. Субъектов выписывали на 4-й день, проводили по меньшей мере восемь последующих промежуточных посещений с медицинским обследованием и взятием образцов крови до конца испытания на 64-й день.
Все субъекты, участвующие в испытании, получали антибиотики (Spektramox, если не было гиперчувствительности к β-лактамам) в качестве профилактики бактериальных инфекций. Профилактическое лечение начинали в день введения дозы и продолжали до тех пор, пока уровни IgG в плазме не составляли более 4,5 г/л. В течение первых 28 дней после введения дозы не разрешали ни одно другое сопутствующее лечение или терапию, кроме парацетамола, если это не было предписано исследователем и не считалось необходимым для обеспечения безопасности и благополучия субъекта.
Оценка безопасности.
Побочные явления (adverse events, AE) собирали с момента включения и на протяжении всего периода исследования, включая период последующего наблюдения. Всю информацию об АЕ записывали, в том числе описание, время начала/завершения, степень критериев общей токсичности (согласно СТСАЕ), тяжесть, причинно-следственную связь (маловероятно, возможно или вероятно), принятые меры, прекращение терапии и исход. Жизненно важные признаки, температуру тела, частоту сердечных сокращений и артериальное давление в положении лежа на спине регулярно регистрировали в течение периода включения и при всех последующих посещениях. Кроме того, субъектов наблюдали с помощью телеметрической регистрации ЭКГ с 5 отведениями во время инфузии и в последующие 24 ч. Образцы для анализа безопасности анализировали на предмет клинической химии, гематологии, коагуляции, биомаркеров безопасности (IL-6, IL-8 и TNF-α) и IgG в плазме с использованием стандартных способов на Labmedicin Skane, Швеция. Анализ мочи (U-глюкоза, U-гемоглобин и U-белок) проводили с использованием Multistix (Siemens, Германия).
Образцы сыворотки для оценки эффективности, фармакокинетики и антител против IdeS.
Образцы крови, предназначенные для исследования эффективности, собирали в модифицированные CAT сывороточные пробирки BD vacutainers (BD DiagNO:stics, Нью-Джерси, США), содержащие 2 мМ иодуксусную кислоту, чтобы предотвратить дальнейшее протеолитическое расщепление под влиянием IdeS. Забор крови проводили в следующие временные точки: перед введением дозы, за 1 мин до окончания инфузии (через 14 или 29 мин), через 5 мин после окончания инфузии (через 20 или 35 мин) и через 45 мин после окончания инфузии (через 1 ч или 1 ч и 15 мин). Кроме того, собирали образцы через 2, 6, 24, 48 и 72 ч после начала инфузии, а также через 7, 14, 21, 28 и 64 дня после инфузии. Образцы крови, предназначенные для фармакокинетических исследований, собирали в обычные сывороточные пробирки BD vacutainers в следующие временные точки: перед введением дозы, за 1 мин до окончания инфузии, через 5 мин после окончания инфузии, через 45 мин после окончания инфузии и через 2, 6, 24, 48, 72 и 144 ч после введения дозы. Образцы крови, предназначенные для анализа антител против IdeS, собирали в обычные сывороточные пробирки BD vacutainers в день 1 (перед введением дозы), 2 (24 ч), 3 (48 ч), 4 (72 ч), 7 (1 неделя), 14 (2 недели), 21 (3 недели), 28 (4 недели) и 64 (2 месяца). Вне протокола исследования субъектам предлагалось дополнительно сдать образцы сыворотки в день 182 (6 месяцев) и 365 (1 год). Все образцы хранили при температуре ниже -60°С до проведения анализа.
Оценка эффективности.
Расщепление и процессинг IgG под влиянием IdeS исследовали с помощью различных способов; иммуносорбентные ферментные анализы (ИФА, ELISA) использовали для определения IgG и фрагментов IgG в сыворотке крови и для исследования динамики Fab- и Fc-содержащих фрагментов. Количественные анализы не смогли полностью дифференцировать продукты расщепления IdeS, т.е. F(ab')2, Fc и однократно расщепленный IgG (scIgG) (в котором расщеплена одна из тяжелых цепей). Анализ ELISA, измеряющий интактный IgG и scIgG, был разработан и проведен компанией Covance Ltd, Великобритания. Анализ Fab-ELISA измерял все Fab-содержащие фрагменты IgG, т.е. интактный IgG, scIgG и F(ab')2; а анализ Fc-ELISA измерял все Fc-содержащие фрагменты, т.е. интактный IgG, scIgG и свободный Fc.
Анализ, проводимый компанией Covance Ltd, Великобритания, был официально валидирован. Вкратце, образцы сыворотки анализировали с помощью ELISA, в котором IgG давали связываться с антителом захвата, козлиным противочеловеческим IgG F(ab')2 (№ 109-006-097, Jackson ImmuNO:Research Labs Inc., Пенсильвания, США). Количественный калибратор человеческого сывороточного белка (IgG) (X0908, Dako, Дания) использовали для изготовления стандартов и образцов качества. Связанный IgG обнаруживали путем последующего добавления конъюгированного с пероксидазой F(ab')2-фрагмента
- 12 039169 козлиного противочеловеческого IgG, специфического к Fcγ-фрагменту (№ 109-036-098, Jackson ImmuNO:Research Labs), и хромогенного субстрата (ТМВ). Нижний предел количественной оценки составлял 5 нг/мл (в 100% сыворотке). Анализы сыворотки проводили на Covance Laboratories Limited (Харрогейт, Великобритания).
В анализе Fc-ELISA использовали F(ab')2-фрагмент козлиного противочеловеческого IgG (специфического к Fcγ-фрагменту) (№ 109-006-098 Jackson ImmuNO:Research Labs Inc., Пенсильвания, США) в качестве антитела захвата и F(ab')2-фрагмент козлиного противочеловеческого IgG (специфического к Fcγ-фрагменту), конъюгированный с биотином (№ 109-066-098 Jackson ImmuNO:Research) в качестве детектора. В Fab-ELISA аффинно очищенное мышиное противочеловеческое антитело IgG, специфическое к F(ab')2-фрагменту (№ 209-005-097 Jackson ImmuNO:Research Labs Inc., Пенсильвания, США), использовали в качестве антитела захвата и биотинилированную матрицу CaptureSelect IgG-CH1 (№710.3120.100 ВАС B.V., Наарден, Нидерланды) в качестве детектора. Конъюгат стрептавидинпероксидазы хрена (SA-HRP), (№ 21126 Pierce, Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс) использовали для вторичного обнаружения. Калибратор и QC-образцы (ULOQ, LLOQ, H-OC, M-QC и L-QC) получали из человеческого γ-глобулина для внутривенного введения (IVIg, Octagam®). Все разведения проводили в PBS + 0,1% BSA, и плоскодонные 96-луночные планшеты для микротитрования Nunc MaxiSorp® (Nunc A/S, Роскилле, Дания) промывали PBS, содержащим 0,05% Tween 20. Образцы сывороток и QC-образцы анализировали в трех повторах. Однокомпонентный субстрат ТМВ One component HRP Microwell Substrate (TMBW-1000-01, BioFx Laboratories Inc., Мэриленд, США) использовали в качестве хромогенного субстрата и ферментативную реакцию останавливали добавлением 0,5М H2SO4. Оптическую плотность измеряли в планшетном ридере для ELISA (Multiscan EX, Thermo Electron Corp.) (программное обеспечение: Ascent Software версии 2.6) при λ=450 нм.
Сравнение Fab-ELISA и стандартного турбидиметрического анализа сывороточного IgG показано на фиг. 18. Как показано, турбидиметрический анализ обнаруживает лишь небольшое изменение уровня интактного IgG в течение долгого времени после окончания введения IdeS, так как он не может различить F(ab')2 и интактный IgG. Напротив, Fab-ELISA показывает почти полное удаление и восстановление уровней IgG в тот же период времени.
Для того чтобы дополнительно оценить количественные данные, полученные путем ELISA, образцы сывороток также анализировали с помощью качественных SDS-PAGE-анализов. SDS-PAGE-анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad Laboratories, Калифорния, США). Вкратце, 0,25 мкл сыворотки разделяли в заранее залитых 4-20% гелях Mini-PROTEAN®TGX™ (BioRad) при 200 В в течение 40 мин в невосстанавливающих условиях. Стандарт молекулярных весов SeeBlue MW (Life TechNO:logies) и смесь человеческих IgG, scIgG, F(ab')2 и Fc собственного изготовления использовали в качестве маркеров. Гели окрашивали реагентом GelCode Blue (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями изготовителя и гели сканировали.
Оценка фармакокинетики.
Четыре пептида, образованных под влиянием IdeS, т.е. AFPYLSTK, AIYVTDSDSNASIGMK, GGIFDAVFTR и LFEYFK, анализировали в образцах сыворотки с помощью подходящего LC-MS/MSанализа (Karlsson et al., 2012). Образцы для MS-анализа готовили так, как было описано ранее (Karlsson et al., 2012). Мониторинг выбранных реакций (SRM) выполняли на тройном квадрупольном массспектрометре TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США), снабженном колонкой PicoChip, заполненной Reprosil-PUR C18 (New Objective, Массачусетс, США), и системе Easy-nLC II (Thermo Fisher Scientific). Полученные данные обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения для SRM-анализа Skyline (MacLean et al., 2010) с ручной валидацией и проверкой результатов. Объем введения составлял 1 мкл, что соответствовало 12,5 нл сыворотки (т.е. 1 мкг общего белка). Ненормированные общие площади пиков пептидов из IdeS-пиковой сыворотки использовали для построения линейной кривой регрессии (количественная оценка немеченого белка). Концентрации отдельных пептидов в неизвестных человеческих образцах интерполировали из линейной регрессии. Коммерческую эквимолярную смесь триптических пептидов от 6 белков крупного рогатого скота (6 Bovine Tryptic Digest Equal Molar Mix, Michrom Bioresources) использовали в качестве QC-образца и запускали каждые 4-6 анализируемых образцов (Teleman et al., 2012).
Данные о сывороточной концентрации с течением времени анализировали с помощью некомпартментного анализа (NCA) в программном обеспечении Phoenix™ WinNO:nlin® версии 6.3, сборка 6.2.0.495 (Pharsight®, Сент-Луис, Миссури, США). Поскольку между номинальным и реальным временем взятия образца и дозами никаких серьезных отклонений (более 20%) обнаружено не было, для расчетов NCA использовали номинальные время взятия образцов и дозы. Анализ LC-MS/MS не был валидирован, и никакие формальные нижние пределы обнаружения (LLOQ) определены не были. Отсечку для расчетов PK устанавливали на 24 ч после введения дозы для всех четырех пептидов и индивидуумов.
Оценка IgG против IdeS.
Анализ CAP-FEIA (ImmuNO:CAP) для количественной оценки специфических IgG против IdeS был разработан в Thermo Fisher Scientific (Phadia®) в Упсале, Швеция. Первоначальный анализ показал, что
- 13 039169 возможен 3-логарифмический диапазон измерений, и с помощью анализа было показано, что предел обнаружения (LOD) для IgG в IdeS-специфическом CAP-FEIA-анализе в семь раз ниже предложенной нижней отсечки анализа (т.е. 2,0 мг/л). Анализ клинических образцов проводили на инструменте Phadia®
250 с использованием анализа с одним повтором согласно инструкции Phadia® 250. Анализ предназначен только для исследовательских целей.
Антигенспецифическая эффективность.
Анализ ELISA исследовательского класса был разработан в Hansa Medical AB с целью определения антигенспецифической эффективности в конце исследования. IgG-ответ субъектов на вакцину, включенную в календарь прививок для детей Швеции, использовали в качестве заменителя отсутствия аутоантигенов у здоровых субъектов, включенных в 1 фазу испытания. Вкратце, вакцину DTaP-IPV//PRP~T (Pentavac®/Pentaxim®-SaNO:fi Pasteur) разводили в 100 раз в PBS, а затем наносили на планшеты MaxiSorp (Nunc) при 4°С. Нормальный человеческий IgG (IVIg, Octagam®) использовали в качестве калибратора, а козлиный противочеловеческий Fc-специфический F(ab')2 конъюгированный с биотином-SP (Jackson № 109-066-098), использовали в качестве детектора. Кроме того, использовали SA-HRP (Pierce № 21126), а сигналы получали с помощью однокомпонентного субстрата ТМВ One component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories, № TMBW-1000-01), реакцию останавливали с помощью 0,5М H2SO4, и сигнал регистрировали при 450 нм.
Функциональный анализ in vitro.
Фагоцитарный анализ был разработан с модификациями из Ackerman et al., 2011. Флуоресцентные нейтравидиновые гранулы (№ F8776, Molecular Probes) покрывали в течение ночи биотинилированным CH1 против IgG (CaptureSelect, № 710.3120.100 ВАС B.V., Наарден, Нидерланды) в дозе 0,1 мг/мл. Реагент CaptureSelect специфичен для домена СН1 тяжелой цепи IgG человека, т.е. для интактного IgG, scIgG и F(ab')2-фрагментов, но IgM не будут захватываться этим белком. Покрытые гранулы промывали и смешивали с разведенной 1:100 сывороткой от субъектов в исследовании и инкубировали при 37°С в течение 2 ч, позволяя IgG в сыворотке связаться с покрытыми гранулами. Контроль получали путем смешивания покрытых гранул с буфером для разведения (PBS с 0,1% BSA). Все образцы готовили в двух повторах. После инкубации IgG-нагруженные гранулы промывали и смешивали с 75000 клеток ТНР1/образец и инкубировали в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 1,5-3 ч. После инкубации образцы фиксировали в ледяном 2% забуференном фосфатом формалине и флуоресцентное поглощение в клетках ТНР-1 контролировали с помощью проточного цитометра Accuri С6.
Статистический анализ.
Средние значения, медианные значения, стандартные отклонения и основной статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Калифорния, США).
Результаты.
Описание исследования.
Фаза I, первая на людях, рандомизированное двойное слепое исследование с разовыми возрастающими дозами IdeS, была проведена после утверждения шведскими нормативными и этическими органами. Цели заключались в оценке безопасности, эффективности, фармакокинетики и иммуногенности IdeS у здоровых людей после внутривенного введения.
В общей сложности 29 здоровых субъектов были включены и разделены на четыре группы с определенной дозировкой. Субъекты в каждой группе с определенной дозировкой были рандомизированы и получали либо IdeS, либо плацебо. Инфузии проводили внутривенно в течение 30 мин первым двум субъектам в каждой группе и в течение 15 мин последующим субъектам. Начальная доза составляла 0,01 мг/кг массы тела (NIdeS: 8 и N плацебо: 4), и после оценки Комитетом по мониторингу данных дозу ступенчато увеличивали до 0,04 мг/кг массы тела (NIdeS: 4 и N плацебо: 4), 0,12 мг/кг массы тела (NIdeS: 4 и N плацебо: 1) и, наконец, 0,24 мг/кг массы тела (NIdeS: 4 и N плацебо: 2). Субъектов наблюдали до 64 дня после введения дозы с более интенсивным наблюдением в течение первой недели. Все субъекты были мужчины европеоидной расы со средним возрастом 23 года (диапазон: 20-41 лет), весом 76 кг (диапазон: 59-100 кг) с BMI 23 кг/м2 (диапазон: 20-30 кг/м2), и между группами не было никакой статистически значимой разницы в демографических данных.
Оценка безопасности.
В общей сложности у 24 из 29 субъектов наблюдалось 77 побочных явлений (АЕ), при этом 39 АЕ (у 14 субъектов) были классифицированы как связанные (т.е. с возможной или вероятной связью) (табл. 1.1). Среди этих 39 АЕ 35 имели степень 1 по шкале критериев общей токсичности. Четыре АЕ имели степень 2, и все они имели место у одного субъекта (506), который испытал вероятную инфузионную реакцию. Симптомы разрешились в течение 15 мин после введения антигистаминового препарата (2 мг тавегила внутривенно) и кортикостероидов (8 мг бетапреда внутривенно), и инфузию IdeS не прерывали. Ни один из АЕ не был зарегистрирован как серьезный, не имел ограничивающих дозу критериев токсичности и не привел к отмене исследуемого лекарственного препарата.
Среди 77 АЕ наиболее часто встречающимися были назофарингит, головная боль и усталость. На- 14 039169 зофарингит сообщался у десяти из двадцати субъектов, получавших IdeS, и у шести из девяти субъектов, получавших плацебо. Семь субъектов сообщили о головной боли в девяти случаях (все в группе IdeS), и шесть субъектов (пять в группе IdeS и один в группе плацебо) сообщили о семи случаях усталости.
В анализах гематологии, клинической химии или коагуляции никаких клинически значимых изменений выявлено не было. Тем не менее, наблюдалась преходящая протеинурия через 24-48 ч у субъектов, получавших IdeS, что было вызвано значительным расщеплением IgG (фиг. 2). Этот пик, вероятно, отражает клиренс продуктов расщепления IgG из кровотока. Поскольку IdeS разрушает антитела IgG, первоначально было опасение, что субъекты в исследовании будут иметь повышенный риск инфицирования, и перед включением в исследование субъекты были обследованы на наличие наследственных иммуноглобулиновых нарушений, например дефицита IgA. Кроме того, была выражена обеспокоенность, что субъекты в исследовании могут быть субклиническими носителями бактериальных агентов (например, пневмококков) с повышенным риском инфицирования из-за уменьшения плазменного IgG. Поэтому субъекты получали антибиотикопрофилактику до того момента, пока сывороточные уровни IgG не возвращались к значению более 4,5 г/л. Все субъекты в исследовании дали согласие на лечение антибиотиками, и никаких признаков распространения инфекции не наблюдалось.
Таблица 1.1
Сводка побочных явлений по каждому субъекту
Доза Субъект Связь Действия Исход
0-24 ч 2-7 дни 8-21 дни 22-64 дни
001 103 Назофарингит (1) Усталость (1) Невнимательность (1) Звон в ушах (1) Возможно Нет Разрешение
106 Назофарингит (1) Эпитаксис (1) Дискомфорт в груди (1) Ночные кошмары (1) Возможно Нет Разрешение
206 Головная боль (1) Усталость (1) Тошнота (1) Г оловокружение (1) Возможно Нет Разрешение
004 303 Тошнота (1) Прилив (1) Возможно Нет Разрешение
304 Боль в ротоглотке (1) Возможно Нет Разрешение
- 15 039169
Назофарингит (1)
305 Волдырь (1) Головная боль (1) Возможно Нет Разрешение
012 404 Диарея (1) Вздутие живота (1) Возможно Нет Разрешение
024 501 Головная боль (1) Желудочнокишечный дискомфорт (1) Назофарингит (1) Возможно Нет Разрешение
504 Астения (1) Возможно Нет Разрешение
506 Прилив (2) Синусовая тахикардия (1) Дискомфорт в груди (2) Отек глотки (2) Назальная обструкция (1) Раздражение горла (1) Боль в ротоглотке (1) Миалгия (2) Вероятно Возможно Тавег ил Бета пред нет Разрешение
Плаце бо 101 Периферическое охлаждение (1) Реакция,связанная с инфузией (1) Усталость (1) Возможно Нет Разрешение
104 Дизгевзия Назальная обструкция (1) Возможно Нет Разрешение
201 Простой герпес (1) Возможно Нет Разрешение
302 Озноб (1) Возможно Нет Разрешение
Фармакокинетика IdeS.
Концентрации IdeS в сыворотке измеряли способом LC-MS/MS на основе четырех пептидов, образованных под влиянием IdeS, и данные о концентрации в сыворотке с течением времени анализировали с помощью некомпартментного анализа. Фармакокинетические параметры рассчитывали до 24 ч после введения дозы, а остальные концентрации были примерно на уровне или ниже рассчитанного количественного диапазона данного способа.
Из 29 субъектов девять получали плацебо, а 20 получали IdeS в группах с дозами 0,01, 0,04, 0,12 и 0,24 мг/кг массы тела. Ни один из анализируемых пептидов не был обнаружен в образцах, взятых перед введением дозы, или в образцах от девяти субъектов, получавших плацебо. Тем не менее, IdeS был обнаружен в образцах от 20 субъектов, получавших IdeS, тем самым подтверждая введение дозы. Концентрация IdeS увеличивалась с дозой, и увеличение концентрации в сыворотке за одну минуту до окончания инфузии было пропорционально дозе (фиг. 3А).
У субъектов, которым вводили 0,12 и 0,24 мг/кг массы тела, в общей сложности было собрано 10 образцов крови/субъект в течение 1 недели после введения дозы. Концентрация IdeS в сыворотке может быть описана как многофазная кривая элиминации, где основная фракция введенного вещества элиминировалась в течение первых 24 ч после введения дозы. В течение первых 6 ч после введения среднее t 1/2 составляло 4,1 (±2,6) ч при дозе 0,12 мг/кг массы тела и 4,9 (±2,8) ч при дозе 0,24 мг/кг массы тела. Cmax составляла 5,0 (±2,5) мг/л при дозе 0,12 мг/кг массы тела и 8,3 (±3,7) мг/л при дозе 0,24 мг/кг массы тела (фиг. 3В).
Эффективность и фармакодинамика IdeS.
Эффективность и фармакодинамику расщепления IgG под влиянием IdeS оценивали с помощью SDS-PAGE-анализа и ELISA образцов сыворотки от субъектов. IdeS расщепляет IgG в два этапа (Ryan et al., 2008; Vindebro et al., 2013). Первая реакция происходит очень быстро и эффективно расщепляет одну из двух тяжелых цепей, образуя однократно расщепленный IgG (scIgG), по-прежнему имеющий одну интактную из двух тяжелых цепей. scIgG является менее чувствительным, но все еще функциональным субстратом для IdeS, и это второе расщепление образует F(ab')2- и Fc-фрагменты.
Анализ SDS-PAGE показал, что IdeS имел полный или близкий к полному эффект в течение 6 ч у всех 8 субъектов, которым вводили дозу 0,12 или 0,24 мг/кг массы тела, т.е. пул IgG был переведен в F(ab')2- и Fc-фрагменты (фиг. 4А и В). Эффект был чрезвычайно быстрым, и пул IgG был переведен в scIgG уже во время введения дозы (через 14 мин после начала введения, т.е. за 1 мин до окончания введения полной дозы), и максимальный эффект достигался у всех субъектов через 2-6 ч после введения
- 16 039169 дозы. Вновь синтезированный интактный IgG обнаруживался в сыворотке через две недели после введения дозы, а через три недели уровень интактного IgG еще больше увеличился и составлял основную фракцию IgG в сыворотке крови (фиг. 4С).
Динамику Fab- и Fc-содержащих фрагментов в сыворотке крови анализировали с помощью одного Fab- и одного Fc-специфического способа ELISA. ELISA не полностью различал разные образцы IgG, т.е. F(ab')2, Fc, scIgG и интактный IgG. Fab-ELISA измерял все Fab-содержащие фрагменты IgG, т.е. интактный IgG, scIgG и F(ab')2, a Fc-ELISA измерял все Fc-содержащие фрагменты, т.е. интактный IgG, scIgG и свободный Fc.
F(ab')2-, а также Fc-фрагменты достигали нижних уровней через 1-7 дней после введения дозы, после чего у всех субъектов уровни повышались в результате синтеза интактного IgG (данные не показаны). Элиминация Fc-фрагментов была несколько более быстрой, чем элиминация F(ab')2-фрагментов, и уровни плато были достигнуты уже через один день после введения дозы. Быстрое расщепление человеческого IgG до F(ab')2 и Fc, обнаруживаемых с помощью анализа SDS-PAGE, подтвердили с помощью ELISA (фиг. 5), который показал, что через 2-6 ч после введения дозы низкий уровень плато был достигнут на уровне менее 5% оставшегося сигнала. Был сделан вывод о том, что этот сигнал в основном происходит от scIgG. Разрушение IgG у людей хорошо коррелирует с ранее протитрованными концентрациями IdeS, необходимыми для расщепления IgG в образцах сыворотки от 20 здоровых людей (фиг. 6).
IdeS и антигенспецифические IgG-антитела.
Большинство населения Швеции имеет IgG-антитела против антигенных компонентов вакцины DTaP-IPV//PRP~T (Pentavac®) (дифтерия, столбняк, коклюш, полиомиелит и Haemophilus типа b). Вакцина является частью шведского графика детских прививок, и большинство людей получили повторные инъекции этой или подобной вакцины. Это было использовано в диагностическом исследовании, в котором были измерены ранее существовавшие IgG против этих антигенов. Результаты показали, что IdeS влияет на антигенспецифический IgG таким же образом, как и на общий IgG у каждого индивидуума. Кроме того, повторное появление этих антигенспецифических IgG-антител было таким же, как общего IgG (фиг. 7).
Введение IdeS и фагоцитарная активность.
Для оценки функциональной активности оставшегося IgG после введения дозы IdeS сыворотку от субъектов тестировали в анализе фагоцитоза. IgG из образцов сыворотки, собранных перед введением и в различные моменты времени после введения дозы IdeS, захватывали на флуоресцентные гранулы, промывали и смешивали с эффекторными клетками, и фагоцитоз измеряли как процент эффекторных клеток по меньшей мере с одной фагоцитированной гранулой. В качестве фона в анализе использовали гранулы, не обработанные сывороткой, для мониторинга спонтанного поглощения пустых гранул эффекторными клетками. Анализ фагоцитоза показал, что все субъекты, которым вводили IdeS в дозе 0,24 мг/кг массы тела, достигали фоновых уровней фагоцитоза через 24 ч после введения дозы (фиг. 8А). Кроме того, он показал, что оставшиеся IgG или IgG-фрагменты в сыворотке от пациентов, получивших IdeS в дозе 0,24 мг/кг массы тела, имели значительно сниженную фагоцитарную активность уже через 2 ч после, и что фагоцитарная активность оставалась сниженной в течение 7 дней (фиг. 8В).
IdeS и иммуногенность.
Более ранняя работа показала, что значительная часть населения имеет уже сформированные IgGантитела против IdeS (Akesson et al., 2004). Можно предположить, что люди с уже сформированными антителами против IdeS имеют повышенный риск гиперчувствительности/инфузионоподобных реакций против IdeS. Таким образом, был разработан специфический тест in vitro для количественного измерения IdeS-специфических антител. Тест представляет собой иммуноферментный анализ CAP Fluoro enzyme immuNO:assay (CAP-FEIA/ImmuNO:CAP), и он был использован для скрининга субъектов в исследовании перед включением в него. Субъекты с повышенными титрами IgG-антител (более 15 мг/л) были исключены из этого исследования. Референсную группу из 130 людей обследовали с помощью этого теста до начала исследования. Результаты показаны на фиг. 9А (первый столбец). Десять из 130 имели IdeSспецифический IgG ниже линии отсечки (менее 2 мг/л). Средний уровень IgG против IdeS составил 6,1 мг/л (диапазон менее 2-78 мг/л; n равно 130) с 80% процентилем при 15 мг/л. Все 78 здоровых субъектов мужского пола, подвергнутых скринингу в данном исследовании, имели обнаруживаемый IgG против IdeS до введения препарата. Результаты показаны на фиг. 9А во втором столбце. Медианный уровень IgG против IdeS составил 10,6 мг/л (диапазон 2,1-90,8 мг/л). 28% испытуемых имели титр IgG против IdeS выше 15 мг/л и были исключены из исследования.
Большинство испытуемых ответили увеличением IgG против IdeS. Ответ не поддавался обнаружению через неделю после введения дозы, но достигал почти пиковых уровней через две недели после введения дозы, а затем медленно снижался (фиг. 9В). Медианный уровень IgG против IdeS перед введением дозы (у всех субъектов) составлял 5,3 мг/л (диапазон: 2,0-10,6 мг/л), а на 14-й день медианный уровень у всех субъектов, которым вводили IdeS, составлял 104 мг/л (диапазон: 3,1-1744 мг/л). Через два месяца после введения дозы уровни IgG против IdeS у большинства субъектов начинали снижаться, и медианный уровень IgG против IdeS у всех субъектов, которым вводили IdeS, составлял 87,8 мг/л (диапазон: 10,5-764 мг/л). Хотя индивидуальные различия в значении IgG против IdeS-ответа были большими, среди
- 17 039169 субъектов, получавших IdeS в дозе 0,12 или 0,24 мг/кг массы тела, ответ был явно более сильный по сравнению с субъектами, получавшими 0,01 или 0,04 мг/кг (фиг. 9С). В день 182 уровни IgG против IdeS у 19 из 20 субъектов, которым вводили IdeS, находились в нормальном диапазоне ранее проанализированных субъектов (диапазон менее 2-90,8 мг/л, n равно 208) (фиг. 9D). Только один субъект в день 182 все еще имел уровни IgG против IdeS немного выше нормального диапазона (101 мг/л). Этот субъект был из группы, получившей дозу 0,01 мг/кг, и в день 365 уровни IgG против IdeS для данного субъекта находились в нормальном диапазоне (40,5 мг/л). Можно сделать вывод о том, что IgG против IdeS-ответ очень похож по кинетике и величине реакции на описанный для других белковых препаратов бактериального происхождения, таких как стрептокиназа и стафилокиназа.
Обсуждение.
Это первое в своем классе клиническое испытание показывает, что IdeS превращает плазменный IgG в однократно расщепленный IgG (scIgG) уже через несколько минут после введения. Было продемонстрировано, что scIgG имеет ослабленные эффекторные функции со сниженной способностью к связыванию Fcγ-рецепторов и сниженной Fc-опосредованной цитотоксичностью (Brezski et al., 2009). Несмотря на отсутствие патогенных аутоантител у здоровых субъектов, включенных в исследование, нормальный IgG можно было контролировать как биомаркер, и IdeS показал впечатляющую эффективность в расщеплении IgG в тестируемом диапазоне доз. Полное или близкое к полному влияние на общий IgG, т.е. превращение его в F(ab')2- и Fc-фрагменты, наблюдалось у всех субъектов, которым вводили IdeS в дозе 0,12 и 0,24 мг/кг массы тела, и исследуемый лекарственный препарат показал благоприятный профиль безопасности. Уже через 6 ч после введения в крови можно было обнаружить только низкие концентрации IgG (менее 5%), и уровень IgG упорно оставался низким в течение более недели до тех пор, пока вновь синтезированный IgG не попадал в плазму. Эти результаты можно сравнить с результатами, обычно получаемыми, например, с помощью плазмафереза, когда замена одного объема плазмы приводила к уменьшению IgG до примерно 35% от исходного уровня, а через 24 ч после плазмафереза уровни IgG поднимались до 60%, главным образом, из-за лимфодренажа в сосудистое пространство (Ismail et al., 2001).
Как следствие того, что IdeS является бактериальным белком, и большинство людей имели ранее контакт с S. pyogenes, все субъекты имели ранее сформированные антитела IgG против IdeS и отвечали, как и ожидалось, уровнем IgG, который достигал максимума через 2-3 недели после инфузии IdeS. Амплитуда реакции против лекарственного препарата существенно различалась между отдельными лицами, хотя был отмечен характер доза - реакция. Через 6-12 месяцев после введения дозы у всех субъектов уровни антител против IdeS возвращались в пределы нормального диапазона (т.е. менее 2-91 мг/л), и, принимая во внимание потенциально нейтрализующие антитела и аспект безопасности, предполагается, что лечение IdeS можно повторять через 6-12 месяцев. IdeS-специфический тест CAP FEIA, разработанный параллельно с этим клиническим испытанием, может быть ценным инструментом для руководства врачей при рассмотрении вопроса о повторном введении препарата.
В дополнение к общему плазменному IgG в данном исследовании анализировали влияние IdeS на специфический биомаркер, используемый в качестве вакцины против дифтерии, столбняка, коклюша, полиомиелита и гемофильной палочки типа b в рамках шведского графика детских прививок. Результаты показали, что в антигенной специфичности касательно влияния IdeS на общий IgG не было каких-либо серьезных различий, и все субъекты полностью восстановили их антигенспецифические IgG к тому моменту, когда вернулся весь пул IgG.
В исследовании также оценивали функциональную значимость расщепления IgG под влиянием IdeS в анализе фагоцитоза, при котором взаимодействие с Fcy-рецептором, как ожидается, играет важную роль. Этот анализ показал, что уже через несколько часов после введения IdeS фагоцитарный эффект оставшихся IgG/IgG-фрагментов был значительно снижен у всех тестируемых субъектов, и этот эффект сохранялся семь дней спустя. Результаты показывают, что IdeS обладает способностью инактивировать Fc-опосредованную эффекторную функцию in vivo в организме человека.
Взятые вместе представленные здесь данные показывают, что разовая доза IdeS безопасно, быстро и эффективно инактивирует IgG в организме человека, и что этот эффект сохраняется в течение нескольких недель. IdeS сам по себе и/или в сочетании с другими истощающими В-клетки лекарственными препаратами (например, ритуксимабом или бортезумибом) является очень привлекательным терапевтическим подходом при многих состояниях, когда аутоантитела IgG способствуют развитию патологии. Иммуногенная природа IdeS, скорее всего, не позволит проводить хроническое лечение, но, скорее всего, повторное лечение будет возможным один или два раза в год. Тем не менее, применение продуманного терапевтического подхода с использованием высокой эффективности IdeS в сочетании с другими лекарственными препаратами или технологиями, такими как иммуноадсорбция или плазмаферез, должно обеспечить возможность поддержания низкого уровня патогенных антител в плазме крови в течение длительного периода времени.
Удаление IgG с помощью IdeS было временным, подтверждая, что его лучшее применение может быть при состояниях с однофазным курсом, таких как отторжение трансплантата, опосредованное анти
- 18 039169 телами. В настоящее время проводится испытание IdeS фазы II.
Ссылки.
Ackerman, М.Е., В. Moldt, R.T. Wyatt, A.S. Dugast, E. McAndrew, S. Tsoukas, S. Jost, C.T. Berger, G. Sciaranghella, Q. Liu, D.J. Irvine, D.R. Burton, and G. Alter. 2011. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J Immunol Methods 366:8-19.
Agniswamy, J., B. Lei, J.M. Musser, and P.D. Sun. 2004. Insight of host immune evasion mediated by two variants of group a Streptococcus Mac protein. J Biol Chem 279:52789-52796.
Brezski, R.J., O. Vafa, D. Petrone, S.H. Tam, G. Powers, M.H. Ryan, J.L. Luongo, A. Oberholtzer, D.M. Knight, and R.E. Jordan. 2009. Tumor-associated and microbial proteases compromise host IgG effector functions by a single cleavage proximal to the hinge. Proc Natl Acad Sci U S A 106:17864-17869.
Carapetis, J.R., A.C. Steer, E.K. Mulholland, and M. Weber. 2005. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis 5:685-694.
Collen, D., F. De Cock, E. Demarsin, S. Jenne, I. Lasters, Y. Laroche, P. Warmerdam, and L. Jespers. 1997. Recombinant staphylokinase variants with altered immunoreactivity. Ill: Species variability of antibody binding patterns. Circulation 95:455-462.
Declerck, P.J., S. Vanderschueren, J. Billiet, H. Moreau, and D. Collen. 1994. Prevalence and induction of circulating antibodies against recombinant staphylokinase. Thromb Haemost 71:129-133.
Ismail, N., R. Neyra, and R. Hakim. 2001. Plasmapheresis. In Handbook of dialysis, 3rd edn. J.T. Daugirdas, P.G. Blake, and T.S. Ing, editors. Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia. 231-262.
Iyer, S.P., L.E. Nikkei, K.K. Nishiyama, E. Dworakowski, S. Cremers, C. Zhang, D.J. McMahon, S. Boutroy, X.S. Liu, L.E. Ratner, D.J. Cohen, X.E. Guo, E. Shane, and T.L. Nickolas. 2014. Kidney Transplantation with Early Corticosteroid Withdrawal: Paradoxical Effects at the Central and Peripheral Skeleton. J Am Soc Nephrol.
Johansson, B.P., O. Shannon, and L. Bjorck. 2008. IdeS: a bacterial proteolytic enzyme with therapeutic potential. PLoS One 3:e1692.
Jordan, S.C., D. Tyan, D. Stablein, M. McIntosh, S. Rose, A. Vo, M. Toyoda, C. Davis, R. Shapiro, D. Adey, D. Milliner, R. Graff, R. Steiner, G. Ciancio, S. Sahney, and J. Light. 2004. Evaluation of intravenous immunoglobulin as an agent to lower allosensitization and improve transplantation in highly sensitized adult patients with end-stage renal disease: report of the NIH IG02 trial. J Am Soc Nephrol 15:3256-3262.
- 19 039169
Karlsson, C., L. Malmstrom, R. Aebersold, and J. Malmstrom. 2012. Proteome-wide selected reaction monitoring assays for the human pathogen Streptococcus pyogenes. Nat Commun 3:1301.
MacLean, B., D.M. Tomazela, N. Shulman, M. Chambers, G.L. Finney, B. Frewen, R. Kern, D.L. Tabb, D.C. Liebier, and M.J. MacCoss. 2010. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26:966-968.
Mainet, D., M. del Rosario, A. Toruncha, P. Prats, C. Valenzuela, and P. Lopez Saura. 1998. Similar, more than 6-months persisted, antibody and neutralizing activity responses in patients with acute myocardial infarction treated with recombinant or natural streptokinase. Fibrinolysis Proteol 12:301-309.
Montgomery, R.A., A.A. Zachary, L.C. Racusen, M.S. Leffell, K.E. King, J. Burdick, W.R. Maley, and L.E. Ratner. 2000. Plasmapheresis and intravenous immune globulin provides effective rescue therapy for refractory humoral rejection and allows kidneys to be successfully transplanted into cross-match-positive recipients. Transplantation 70:887-895.
Nandakumar, K.S., B.P. Johansson, L. Bjorck, and R. Holmdahl. 2007. Blocking of experimental arthritis by cleavage of IgG antibodies in vivo. Arthritis Rheum 56:3253-3260.
Ojo, A.0., R.A. Wolfe, P.J. Held, F.K. Port, and R.L. Schmouder. 1997. Delayed graft function: risk factors and implications for renal allograft survival. Transplantation 63:968-974.
Ryan, M.H., D. Petrone, J.F. Nemeth, E. Barnathan, L. Bjorck, and R.E. Jordan. 2008. Proteolysis of purified IgGs by human and bacterial enzymes in vitro and the detection of specific proteolytic fragments of endogenous IgG in rheumatoid synovial fluid. Mol Immunol 45:1837-1846.
Teleman, J., S. Waldemarson, J. Malmstrom, and F. Levander. 2013. Automated quality control system for LC-SRM setups. J Proteomics 95:77-83.
Tradtrantip, L., N. Asavapanumas, and A.S. Verkman. 2013. Therapeutic cleavage of anti-aquaporin-4 autoantibody in neuromyelitis optica by an IgG-selective proteinase. Mol Pharmacol 83:1268-1275.
Wenig, K., L. Chatwell, U. von Pawel-Rammingen, L. Bjorck, R. Huber, and P. Sondermann. 2004. Structure of the streptococcal endopeptidase IdeS, a cysteine proteinase with strict specificity for IgG. Proc Natl Acad Sci USA 101:17371-17376.
Vincents, B., U. von Pawel-Rammingen, L. Bjorck, and M. Abrahamson. 2004. Enzymatic characterization of the streptococcal endopeptidase, IdeS, reveals that it is a cysteine protease with strict specificity for IgG cleavage due to exosite binding. Biochemistry 43:15540-15549.
Vindebro, R., C. Spoerry, and U. von Pawel-Rammingen. 2013. Rapid IgG heavy chain cleavage by the streptococcal IgG endopeptidase IdeS is mediated by IdeS monomers and is not due to enzyme dimerization. FEBS Lett 587:1818-1822.
- 20 039169
Vo, A.A., M. Lukovsky, M. Toyoda, J. Wang, N.L. Reinsmoen, C.H. Lai, A. Peng, R.
Villicana, and S.C. Jordan. 2008a. Rituximab and intravenous immune globulin for desensitization during renal transplantation. Л/ Engl J Med 359:242-251.
Vo, A.A., E.A. Wechsler, J. Wang, A. Peng, M. Toyoda, M. Lukovsky, N. Reinsmoen, and S.C. Jordan. 2008b. Analysis of subcutaneous (SQ) alemtuzumab induction therapy in highly sensitized patients desensitized with IVIG and rituximab. Am J Transplant 8:144-149.
von Pawel-Rammingen, U., B.P. Johansson, and L. Bjorck. 2002a. IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G. EMBO J 21:1607-1615.
von Pawel-Rammingen, U., B.P. Johansson, H. Tapper, and L. Bjorck. 2002b.
Streptococcus pyogenes and phagocytic killing. Nat Med 8:1044-1045; author reply 1045-1046.
Yang, R., M.A. Otten, T. Hellmark, M. Collin, L. Bjorck, M.H. Zhao, M.R. Daha, and M.
Segelmark. 2010. Successful treatment of experimental glomerulonephritis with IdeS and
EndoS, IgG-degrading streptococcal enzymes. Nephrol Dial Transplant 25:2479-2486.
Akesson, P., M. Rasmussen, E. Mascini, U. von Pawel-Rammingen, R. Janulczyk, M.
Collin, A. Olsen, E. Mattsson, M.L. Olsson, L. Bjorck, and B. Christensson. 2004. Low antibody levels against cell wall-attached proteins of Streptococcus pyogenes predispose for severe invasive disease. J Infect Dis 189:797-804.
Пример 2.
Введение.
Трансплантация в присутствии донор-специфических антител (DSA) имеет риски, приводящие к опосредованному антителами гиперострому отторжению с быстрой потерей аллотрансплантата. Исследование в примере 1 показывает, что IdeS безопасен и хорошо переносится в дозе до 0,24 мг/кг массы тела. При этой дозе IdeS полностью расщеплял пул плазменных IgG в течение 14 мин после начала инфузии. Уровень интактного IgG снижался до менее 5% от первоначального уровня. Данные ясно показали, что одна доза IdeS превосходит как плазмаферез, так и иммуноадсорбцию в отношении эффективности и скорости восстановления плазменных IgG.
Поэтому введение IdeS сенсибилизированным пациентам непосредственно перед трансплантацией почки должно быстро и эффективно расщеплять IgG до F(ab')2- и Fc-фрагментов, тем самым снижая сывороточные уровни цитотоксических DSA до уровня, при котором возможна трансплантация от живого и умершего донора (LD и DD). Донор-специфические F(ab')2-фрагменты, все еще находящиеся в кровотоке в момент трансплантации, могут также предотвратить связывание, например, низкоаффинных IgM или остаточных IgG с трансплантатом, таким образом, дополнительно защищая орган от отторжения. Цель данного исследования состояла в том, чтобы проанализировать, может ли введение клинически релевантной дозы IdeS перевести положительный перекрестный тест в отрицательный с помощью сыворотки от сенсибилизированных пациентов, а также проанализировать корреляцию между снижением уровней общего IgG и IgG, специфического для HLA класса I и II.
Материал и методы.
Образцы сыворотки.
У исследуемых пациентов диагностировали CKD стадии 5 и вносили их в список ожидания на трансплантацию почки. Пациенты были сенсибилизированы и положительны на анти-HLA. Пациенты были набраны профессором Н. Ekberg в Блоке трансплантологии Отделения нефрологии и трансплантологии Университетской больницы Сконе в Мальмё, Швеция, и профессором G. Tufveson в Отделении трансплантационной хирургии Университетской больницы Упсалы, Швеция. Пациенты получали письменную информацию и подписывали информированное согласие перед началом каких-либо связанных с испытанием процедур. Сыворотку выделяли из 10 мл венозной крови в соответствии с больничной процедурой. Для обеспечения конфиденциальности главный исследователь делал личность пациентов недоступной исследующим ученым путем присвоения идентификационного номера (РХХ) образцам сыворотки. Образцы отправляли в Отдел клинический иммунологии Университетской больницы Упсалы для сохранения, и часть каждой сыворотки затем отправляли в Hansa Medical АВ в Лунде для IdeS-связанных анализов.
Расщепление IdeS в сыворотке от пациентов.
Сыворотки (100 мкл) от пяти пациентов (Р02, Р04, Р07, Р08 и Р09) обрабатывали IdeS (партия ВХ1001865; 9,9 г/л). Стоковый раствор IdeS с концентрацией 6 г/л готовили в PBS/0,1% BSA. 100 мкл сыворотки добавляли к 12 мкл 0,1М HCl для подведения рН сыворотки до физиологического уровня (рН 7,4), а затем добавляли 2,4 мкл стокового раствора IdeS (6 г/л), чтобы достичь конечной концентрации
- 21 039169
125 мкг/мл IdeS в 115 мкл. Все препараты готовили на льду. Расщепление проводили при 37°С (Thermomixer; Eppendorf) в течение 2 ч и останавливали, помещая образцы в морозильную камеру (-20°С) до дальнейших анализов. Контрольные образцы от каждого пациента представляли собой одинаковые имитационные контроли, обработанные буфером для разведения (PBS/0,1% BSA) вместо IdeS.
Количественная оценка человеческого IgG.
Образцы сыворотки отправляли в Отделение клинической химии Университетской больницы Сконе в Лунде, Швеция, для определения общей концентрации IgG. Образцы человеческих сывороток крови, обработанные IdeS, анализировали на интактный IgG с использованием анализа ELISA, разработанного Hansa Medical AB. 96-Луночные ELISA-планшеты MaxiSorp в течение ночи при +4-8°С покрывали F(ab')2-фрагментом козлиного противочеловеческого антитела, специфического в отношении F(ab')2 (Jackson № 109-006-097), в карбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 100 нг/лунка. Планшеты промывали PBS+Tween 20 (0,05%) и блокировали PBS+2% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре. Калибраторы и образцы разводили в PBS+0,1% BSA (буфер для разведения). После промывания разведенные калибраторы (М-1, сыворотка от здорового добровольца; конц. 11,2 г/л) и образцы сыворотки добавляли в планшет и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты снова промывали, добавляли 50 мкл биотин-SP-AffiniPure F(ab')2-фрагмента козлиного противочеловеческого IgG, специфического в отношении Fcy-фрагмента (Jackson № 109-066-098), разведенного 1:20000 в буфере для разведения, и инкубировали в течение 30 мин. После очередного промывания добавляли 50 мкл SA-HRP (Pierce № 21126), разведенного 1:40000 в буфере для разведения, и после 30-минутной инкубации планшет промывали и запускали реакцию с ТМВ (BioFX Laboratories № TMBW-1000-01), затем ее останавливали с помощью 0,5М H2SO4 и регистрировали сигнал при А равно 450 нм. Калибраторы формировали кривую с 4-параметрической логистической регрессией (y = b+(a-b)/(1+xc)-d) в анализируемом диапазоне, и разведения образцов, дающие OD-значения как можно ближе к значению IC50 стандартной кривой, предпочтительно использовали для количественной оценки.
Эффективность IdeS и оценка иммуногенности.
ELISA-анализ на эффективность IdeS проводили так, как описано в примере 1, как анализ CAP FEIA (ImmuNO:CAP) для ответов IdeS-специфических антител. Результаты использовались только для сравнения с результатами, представленными в примере 1, и не показаны.
Комплементзависимая цитотоксичность (CDC) и анализ одной антигенной гранулы (Single Antigen Bead, SAB) (Luminex).
Сыворотки, обработанные IdeS и плацебо, анализировали на IgG-антитела против HLA с использованием анализов SAB против антигенов панели МНС класса I и II (LABScreen Single Antigen, One Lambda). Сыворотки также тестировали и оценивали на реактивность в скрининговом тесте на комплементзависимую цитотоксичность (CDC) на Т- и В-клетках от 23 доноров. Т-клетки и В-клетки обогащали с использованием магнитных гранул с CD8 и МНС класса II (Dynal) соответственно. Анализы SAB и CDC проводил с использованием валидированных способов в клинических условиях доктор Mats Bengtsson в Отделе клинической иммунологии Отделения онкологии, радиологии и клинической иммунологии Лаборатории Rudbeck Университетской больницы Упсалы, Швеция. Реакции CDC оценивали в соответствии с процедурой международного семинара (Fuller et al., 1982).
Перекрестные тесты комплементзависимой лимфоцитотоксичности (CDC-СХМ).
Спленоциты получали от мышей Balb/c путем разделения в градиенте плотности фиколла. Клетки промывали в PBS (2 раза) и ресуспендировали до плотности 2x106 клеток/мл в DMEM:F12 (Difco) с 0,1% инактивированной нагреванием BSA. Образцы сывороток обрабатывали DTT, чтобы инактивировать IgM, путем смешивания 45 мкл сыворотки с 5 мкл 50 мМ DTT и инкубации в течение 30-45 мин при 37°С. СХМ-тест проводили путем добавления 1 мкл суспензии клеток (т.е. 2000 клеток) и 1 мкл образца (т.е. сыворотки или контролей) в 60-луночный планшет Terasaki (Nunc). После 30-минутной инкубации при комнатной температуре добавляли Baby Rabbit Complement (5 мкл) (Cedarlane) и смесь далее инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли FluoroQuench АО/ЕВ Stain Quench (5 мкл) (One Lambda inc.) и смесь инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Цитотоксичность оценивали (оценка 1-8) и записывали с помощью флуоресцентной микроскопии.
Обработка данных.
Графики строили с использованием GraphPad Prism версии 5.0d для Mac OS X, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com.
Результаты и обсуждение.
Обработка IdeS сывороток пациентов.
Сыворотку собирали от двенадцати сенсибилизированных патентов с CKD на стадии 5, ожидающих трансплантации почки. Дозу IdeS титровали в каждой сыворотке, чтобы определить эффективность введения IdeS, и был сделан вывод о том, что IdeS эффективно расщепляет IgG в сыворотках всех пациентов в исследуемом диапазоне концентраций, хотя имели место индивидуальные различия в минимальной концентрации IdeS, необходимой для достижения максимального эффекта (фиг. 10). Уровни общего IgG в сыворотках крови пациентов проанализировали и нашли их в пределах нормального диапазона (медиа- 22 039169 на: 9,3 г/л, диапазон 6,5-16,2 г/л). Кроме того, с помощью анализа IdeS-ImmuNO:CAP определили уровни антител против IdeS, и все 12 сывороток содержали низкие уровни (медиана: 4,5 мг/л, диапазон менее 214,8 мг/л) IgG против IdeS (Hmed Doc. № 2012-041). Между отдельными уровнями антител к IdeS или уровнями общего IgG и эффективностью IdeS никакой четкой корреляции выявлено не было. Пять репрезентативных сывороток, т.е. Р02, Р04, Р07, Р08 и Р09, были отобраны для дальнейшего анализа антител против HLA.
Сыворотки обрабатывали IdeS или плацебо (PBS) в течение 2 ч при температуре 37°С и анализировали на оставшиеся IgG с помощью описанного ELISA. В качестве сравнения мы провели истощающую иммуноадсорбцию на сефарозе с протеином А и проанализировали оставшийся IgG параллельно с образцами, обработанными IdeS. Результаты показали, что обработка IdeS снижает уровень IgG от 7,5-15,9 г/л до 0,17-0,4 г/л (табл. 2.1). Иммуноадсорбция в целом была менее эффективной с 0,18-1,5 г/л оставшегося IgG.
Таблица 2.1 Сыворотки от пяти пациентов (Р02, P04, Р07, Р08 и Р09), обработанные IdeS, PBS или подвергнутые иммуноадсорбции (IA), IgG в г/л.
Р02 Р04 Р07 Р08 Р09
PBS 11,0 7,5 11,6 15,9 12,0
IdeS 0,22 0,21 0,17 0,40 0,34
ΙΑ 0,50 0,31 0,18 1,5 0,80
Эти результаты следует сравнить с результатами, полученными с использованием, например, плазмафереза, когда замена одного объема плазмы приводила к уменьшению IgG до примерно 35% от исходного уровня, а через 24 ч после плазмафереза уровни IgG поднимались до 60%, главным образом, из-за лимфодренажа в сосудистое пространство (Ismail et al., 2001). Даже повторные, вплоть до пяти раз, циклы плазмафереза приводили к колеблющимся уровням IgG в пределах от 10% в конце процедуры до 2025% перед следующей процедурой. Доклинические исследования, описанные в примере 1, показали, что однократное внутривенное введение IdeS у кроликов приводит к быстрому (в течение 1 ч) уменьшению интактного IgG до 2-3% от исходного уровня, и что уровень IgG остается низким в течение нескольких дней после лечения. Аналогичные результаты были получены в I фазе клинических испытаний, описанной в примере 1, после введения IdeS здоровым людям. Пул плазменных IgG был полностью переведен в scIgG уже во время введения IdeS в дозе 0,24 мг/кг массы тела (через 14 мин после начала инфузии), а через 2 ч после введения препарата пул IgG был далее переведен в F(ab')2 и Fc. Данные показали, что уровни, соответствующие менее 5% от исходного уровня, большинство из которых состояли из scIgG, могут быть достигнуты уже между 2-6 ч после введения дозы, и что потребуется несколько дней для того, чтобы уровень начал постепенно повышаться.
CDC-анализы.
Обработанные IdeS и плацебо сыворотки от пациентов Р02, Р04, Р07, Р08 и Р09 подвергали скрининговому CDC-тесту против панели Т-клеток (т.е. клеток, обогащенных CD8+) и В-клеток (т.е. клеток, обогащенных МНС класса II+) от отобранных и хорошо охарактеризованных доноров. Результаты, представленные в табл. 2.2 и 2.3 (также см. краткое изложение результатов для отдельных пациентов, ниже), ясно показали, что обработка IdeS обладала способностью полностью отменять комплементзависимую цитотоксичность, опосредованную сывороткой, содержащей донор-специфический IgG. В анализе Тклеток, которые в основном направляли антитела против МНС класса I, обработка IdeS могла полностью десенсибилизировать пациентов Р02, Р04, Р07 и Р09 и значительно повысить степень сенсибилизации для пациента Р08 (табл. 2.2). В анализе В-клеток, которые направляли антитела против МНС класса I и класса II, обработка IdeS повышала степень сенсибилизации у всех пациентов (табл. 2.3). Можно сделать вывод о том, что обработка IdeS явно снижала реактивность CDC в отношении потенциальных доноров, тем самым увеличивая шансы найти подходящего донора для всех обследованных пациентов. Также было ясно из данных, представленных здесь, что обработка IdeS была способна перевести положительный предтрансплантационный перекрестный тест в отрицательный, тем самым делая сенсибилизированного пациента подходящим для трансплантации.
Анти-HLA-анализ.
Для того чтобы убедиться в том, что снижение общего IgG после обработки IdeS отражается в сокращении уровней антител против HLA в сыворотках от сенсибилизированных пациентов, образцы, обработанные IdeS или плацебо, подвергали SAB-анализам. Матрица включала 188 аллельных вариантов МНС, включая 97 антигенов МНС класса I (HLA-A, -В и -С) и 91 антиген МНС класса II (HLA-DP, -DQ и -DR). Результаты подтвердили, что обработка IdeS могла снижать уровни IgG против HLA в сыворотке от сенсибилизированных пациентов, и можно сделать вывод о том, что реакционная способность сыворотки от всех обследованных пациентов в отношении отдельных молекул МНС класса I и класса II была значительно снижена после обработки IdeS (фиг. 11-15 и приложение I и II). Порог MFI (необработанное значение) более 1000 (иногда более 2000) довольно часто используется в качестве отсечки для значительной реакционной способности против специфического антигена HLA при рассмотрении вопроса о
- 23 039169 трансплантации сенсибилизированному пациенту. Обработка IdeS у всех обследованных пациентов могла явно уменьшить количество HLA-антигенов, находящихся выше этих пороговых значений, как МНС класса I, так и МНС класса II (табл. 2.4 и 2.5; приложение I-II).
Введение IdeS способно переводить положительный СХМ в отрицательный.
Природные антитела против структур [Gal a-1,3-Gal] (анти-Gal-антитела) являются первичными эффекторами человеческого гиперострого отторжения (HAR) нечеловеческой ткани. В отличие от большинства млекопитающих люди не имеют функционального гена а-1,3-галактозилтрансферазы (GalT) и продуцируют много антител против Gal, предположительно в ответ на GalT+ энтеробактерии (Ding et al., 2008, и Pierson, 2009). Цель состояла в том, чтобы исследовать, может ли анти-Gal-реакционная способность примата и не примата быть использована в качестве псевдомаркера для анализа влияния IdeS с использованием клинических образцов сыворотки из фазы I испытания из примера 1.
Уровень IgG измеряли в последовательных образцах сыворотки крови, взятых до и после введения здоровым испытуемым людям IdeS в дозе 0,24 мг/кг, используя валидированный PD-ELISA (табл. 2.6). Данные показали, что через 2 ч после введения дозы препарата имело место примерно 10-кратное снижение IgG, а через 24 ч после введения дозы IdeS имело место 20-кратное снижение. PD-ELISA не позволяет различить интактный полностью функциональный IgG и scIgG с ослабленной Fc-эффекторной функцией. SDS-PAGE-анализы показали, что scIgG составлял доминирующую фракцию оставшегося IgG в этих сыворотках, подтверждая, что уровень полностью функционального IgG является низким уже через несколько минут после введения IdeS (см. пример 1).
Таблица 2.2
Скрининговый анализ сывороток от сенсибилизированных пациентов (Р02, P04, Р07, Р08 и Р09), получавших IdeS или плацебо (PBS), в отношении Т-клеток из панели доноров (n равно 23).
Реакционную способность оценивали путем присвоения значения 1-8, где 1 соответствует 0% цитотоксичности, а 8 соответствует более 80% цитотоксичности
Pi +PBS )2 +ldeS Pi +PBS 04 +ldeS Pi +PBS 07 +ldeS Pi +PBS 08 +ldeS Pi +PBS 09 +ldeS
РС:8 1 1 1 1 8 1 8 1 4 1
РС:10 1 1 1 1 8 1 8 1 1 1
РС:19 6 1 8 1 1 1 8 8 8 1
РС:20 1 1 1 1 8 1 8 1 1 1
РС:9В 8 1 1 1 8 1 8 8 1 1
РС:11 1 1 1 1 8 1 8 8 1 1
РС:24В 6 1 1 1 8 1 8 1 8 1
РС:25 1 1 1 1 4 6 8 1 8 1
РС:27 1 1 1 1 1 1 8 8 1 1
РС:29 1 1 1 1 1 1 8 2 1 1
РС:15 1 1 6 1 8 1 8 1 8 1
РС:4 1 1 1 1 8 1 8 1 8 1
РС:14 2 1 6 1 8 1 8 1 1 1
РС:30 1 1 8 1 8 1 8 6 1 1
РС:28 1 1 1 1 1 1 8 1 8 1
РС:26 1 1 1 1 8 1 8 8 1 1
РС:21 1 1 1 1 8 1 8 1 1 1
РС:22 1 1 1 1 8 1 8 1 1 1
РС:12 1 1 1 1 1 1 8 1 1 1
РС:17 1 1 8 1 8 1 8 8 1 1
РС:18 1 1 1 1 8 1 8 6 8 1
РС:13 1 1 1 1 1 1 8 1 1 1
РС:16 1 1 1 1 1 1 8 1 1 1
средн. 1 1 1 1 8 1 8 1 1 1
T-PRA (%) 17 0 Г 22 0 70 4 100 39 35 0
- 24 039169
Таблица 2.3
Скрининговый анализ сывороток от сенсибилизированных пациентов (Р02, Р04, Р07, Р08 и Р09), получавших IdeS или плацебо (PBS), в отношении В-клеток из панели доноров (n равно 23).
Реакционную способность оценивали путем присвоения значения 1-8, где 1 соответствует 0% цитотоксичности, а 8 соответствует более 80% цитотоксичности
Р02 Р04 Р07 Р08 P09
+PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS
РС:8 8 1 1 1 8 1 8 1 8 1
РС:10 8 1 1 1 8 1 8 6 8 4
РС:19 1 1 8 1 8 1 8 8 8 1
РС:20 1 1 1 1 8 8 8 8 8 1
РС:9В 8 6 2 4 8 6 8 8 8 4
РС:11 8 1 8 4 8 6 8 8 8 1
РС:24В 8 1 1 1 8 1 8 8 8 1
РС:25 1 1 1 1 6 4 8 1 8 1
РС:27 6 1 1 1 1 1 8 8 8 1
РС:29 1 1 2 2 1 1 8 6 8 1
РС:15 6 1 4 1 8 2 8 6 8 4
РС:4 2 1 1 1 8 6 8 6 8 1
РС:14 8 1 8 4 8 6 8 8 8 2
РС:30 8 1 4 2 8 2 8 8 8 1
РС:28 8 1 4 2 4 6 8 1 8 1
РС:26 6 4 8 1 8 6 8 8 8 4
РС:21 1 1 1 1 8 8 8 4 1 1
РС:22 8 1 8 4 8 4 8 4 8 4
РС:12 1 2 1 1 4 1 8 1 8 1
РС:17 8 1 8 1 8 1 8 8 8 1
РС:18 8 1 8 1 8 2 8 8 8 1
РС:13 8 1 8 1 1 2 8 1 6 1
РС:16 1 1 1 1 1 1 8 8 8 1
средн. 8 1 2 1 8 2 8 8 8 1
B-PRA (%) 70 13 57 30 83 61 100 78 96 26
Таблица 2.4 SAB-анализы в отношении 31 антигена HLA-A, 50 антигенов HLA-B и 16 антигенов HLA-C.
В таблице приведено число антигенов, имеющих MFI (необработанное значение) выше 1000 или выше
2000 у каждого пациента до и после введения IdeS. Пациенты Р02, Р04, Р07, Р08 и Р09
HLA-A HLA-B HLA-C
+PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS
P02 >1000 12 0 38 9 4 0
>2000 12 0 33 0 4 0
P04 >1000 9 0 44 18 12 2
>2000 5 0 42 3 8 0
P07 >1000 0 0 34 0 0 0
>2000 0 0 34 0 0 0
P08 >1000 29 3 48 0 16 4
>2000 24 1 44 0 16 0
P09 >1000 20 0 7 0 1 0
>2000 17 0 0 0 1 0
- 25 039169
Таблица 2.5
SAB-анализы в отношении 26 антигенов HLA-DP, 29 антигенов HLA-DQ и 36 антигенов HLA-DR.
В таблице приведено число антигенов, имеющих MFI (необработанное значение) выше 1000 или выше 2000 у каждого пациента до и после введения IdeS. Пациенты Р02, Р04, Р07, Р08 и Р09
HLA-DP HLA-DQ HLA-DR
+PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS
Р02 >1000 8 0 19 0 23 2
>2000 7 0 14 0 23 0
Р04 >1000 0 0 7 0 16 2
>2000 0 0 7 0 11 0
Р07 >1000 0 0 0 0 13 0
>2000 0 0 0 0 12 0
Р08 >1000 7 0 27 23 33 23
>2000 1 0 27 16 33 2
Р09 >1000 0 0 22 7 23 0
>2000 0 0 16 3 20 0
Таблица 2.6
Уровни IgG, измеренные в образцах сыворотки от здоровых субъектов, получивших плацебо (503) или IdeS (504-506), с помощью валидированного PD-ELISA, который измеряет интактный IgG (плюс scIgG)
[IgG] (r/n)
Перед введением Через 2 ч Через 24 ч
503 10,6 14,1 12,6
504 12,8 1,6 0,53
505 8,9 0,91 0,62
506 9,5 0,81 0,62
Для того чтобы исследовать, содержали ли образцы сыворотки человека IgG, который связывается с мышиными антигенами (например, анти-gal), клетки селезенки мыши окрашивали для FACS-анализов неразведенными последовательными образцами сыворотки, собранными до и в различные моменты после введения IdeS в дозе 0,24 мг/кг здоровым людям. Связывание IgG с клетками обнаруживали с помощью hFcγ-специфического реагента. Данные показали четкий сдвиг через 24 ч после введения IdeS, который сохранялся до 96 ч после введения (репрезентативный график на фиг. 16) в соответствии с продемонстрированным сокращением общего IgG. Продукты расщепления, т.е. F(ab')2- и Fcγ-фрагменты, имеют быстрое выведение из циркуляции и достигают низкого уровня плато через 1-2 дня после введения IdeS (см. пример 1). Следовательно, конкуренция между потенциально оставшимся интактным IgG и F(ab')2-фрагментами за связывание целевых антигенов, по-видимому, будет незначительной в этом анализе. Был сделан вывод о том, что образцы, собранные перед введением препарата в фазе I испытания, содержали IgG, который связывал мышиные клетки, и что введение IdeS уменьшало эту реакционную способность.
Было показано, что человеческая сыворотка обладает реакционной способностью в отношении Galантигенов, что является результатом фиксации комплемента IgG и IgM (Pierson, 2009). Это было подтверждено демонстрацией того, что сыворотка человека сильно реагировала в комплемент-зависимом перекрестном тесте (CDC-CXM) (тест Terasaki) против клеток селезенки мыши (Balb/c) (данные не показаны). Поскольку IdeS очень специфичен в отношении IgG, все образцы обрабатывали DTT для того, чтобы инактивировать IgM, присутствующий в анализируемых сыворотках. Последовательные образцы сыворотки, собранные перед введением препарата, через 2 ч после введения препарата и через 24 ч после введения препарата у трех здоровых субъектов (504, 505 и 506), которым вводили дозу 0,24 мг/кг массы тела, анализировали в CDC-CXM против клеток селезенки мыши Balb/c. Все образцы, собранные перед введением препарата, реагировали сильно (оценка 8), тогда как образцы, собранные через 2 ч и через 24 ч после введения IdeS, были полностью отрицательными (оценка 1) (табл. 2.7 и фиг. 17).
- 26 039169
Таблица 2.7
Ксеногенный перекрестный тест с сыворотками здоровых субъектов (504-506), которым вводили IdeS в дозе 0,24 мг/кг, и клетками селезенки мыши Balb/c. Реакционную способность оценивали путем присвоения значения 1-8, где 1 соответствует отсутствию цитотоксичности, а 8 соответствует максимальной цитотоксичности
Перед введением Через 2 ч Через 24 ч
504 8 1 1
505 8 1 1
506 8 1 1
Взятые вместе эти данные позволили сделать вывод о том, что введение IdeS может снизить сывороточный уровень специфических IgG со способностью связывать мышиные мишени клеточной поверхности, и что этот эффект сохраняется в течение нескольких дней после введения IdeS. Тот факт, что уровень IgG не восстановился уже в течение первых дней после введения IdeS, четко указывает на то, что IdeS расщеплял не только плазменный IgG, но также IgG, находящийся за пределами сосудистой системы, т.е. в межклеточной жидкости. Кроме того, сыворотка, собранная через 2 и через 24 ч после введения IdeS от пациентов, получавших IdeS в дозе 0,24 мг/кг, не могла опосредовать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) в отношении мышиных клеток-мишеней, ясно показывая, что IdeS может перевести положительный результат СМХ в отрицательный.
Краткое изложение результатов для отдельных пациентов.
Пациент Р02.
Сыворотка от пациента Р02 показала CDC-реактивность в отношении Т-клеток от 4 доноров, и введение IdeS могло полностью нейтрализовать эту реактивность (оценка: 1) (табл. 2.2). Кроме того, сыворотка перед введением реагировала против 16 из 23 доноров В-клеток, а после введения (сниженная) реакционная способность оставалась только против двух доноров (табл. 2.3), тогда как остальные реакции были отрицательными (оценка: 1). SAB-анализы показали, что перед введением IdeS сыворотка от пациента обладала реакционной способностью (т.е. MFI более 1000) против антигенов HLA-A, -В и -С, а также против антигенов HLA-DP, -DQ и -DR (табл. 2.4 и 2.5; фиг. 11). Введение IdeS снижало реакционную способность против всех антигенов, и очень немногие (т.е. два HLA-DR-антигена) имели реактивность выше MFI: 1000 (не превышали MFI: 2000) (табл. 2.4 и 2.5; фиг. 11). Общий вывод состоит в том, что IdeS мог почти полностью или полностью десенсибилизировать сыворотку от пациента Р02.
Пациент Р04.
Сыворотка от пациента Р04 реагировала против пяти доноров в Т-клеточном CDC-анализе, и введение IdeS могло полностью нейтрализовать эту реакционную способность (т.е. оценка: 1) (табл. 2.2). SABанализы для МНС класса I показали сильную реакционную способность в основном против антигенов HLA-B, но также и против некоторых антигенов HLA-A и HLA-C (табл. 2.4, фиг. 12). После введения IdeS сниженная, но значительная реакционная способность оставалась против некоторых антигенов HLA-B. Обратите внимание, что донор PC:17 имеет генотип HLA-B*35:01, и сыворотка Р04 сильно реагировала в анализе CDC против этого донора (табл. 2.3). Кроме того, в SAB-анализе сыворотка сильно реагировала с антигеном HLA-B*35:01 (MFI: 21463) (приложение I). Тем не менее, введение IdeS полностью нейтрализовало реакционную способность в отношении донора PC:17 (от 8 баллов до 1), даже если реакционная способность по отношению к антигену HLA-B*35:01 в анализе SAB все еще была одной из самых высоких (MFI: 2517).
В В-клеточном CDC-тесте сыворотка сильно реагировала (т.е. оценка: 8) с 8 из анализируемых 23 доноров, и введение IdeS снижало реакционную способность против всех этих доноров (табл. 3). Сыворотка от пациента Р04 была положительной в SAB-анализе против обоих антигенов HLA-DQ и HLA-DR (табл. 2.5, фиг. 12). Тем не менее, введение IdeS было очень эффективным, и после введения только два из анализируемых антигенов HLA-DR имели значительную реакционную способность. Общий вывод заключается в том, что введение IdeS является весьма эффективным для снижения реакционной способности против HLA в сыворотке от пациента Р04.
Пациент Р07.
Сыворотка от пациента Р07 имела широкую реакционную способность в CDC-тесте и демонстрировала сильную реакционную способность (т.е. CDC-оценка: 8) в отношении 15 из 23 доноров, протестированных в Т-клеточном CDC-тесте. Введение IdeS полностью нейтрализовало (т.е. оценка: 1) реакционную способность в отношении всех этих 15 доноров (табл. 2.2). SAB-анализы МНС класса I показали высокую реакционную способность в отношении 34 протестированных антигенов HLA-B, не имеющих реакционной способности в отношении антигенов HLA-A или -С (табл. 2.5, фиг. 13 и приложение I). После введения IdeS не было значимого сигнала от антигенов МНС класса I, т.е. измеренные MFI были ниже 1000.
В В-клеточном CDC-тесте сыворотка сильно реагировала (т.е. CDC-оценка: 8) в отношении 16 из протестированных 23 доноров и, за одним исключением (донор РС:19), это были те же доноры, которые
- 27 039169 были сильно положительными в Т-клеточном CDC-анализе (табл. 2.2 и 2.3). Это указывает на то, что большую часть реакционной способности можно было бы отнести к реакционной способности МНС класса I, так как В-клетки являются положительными и по классу I, и по классу II. Интересно отметить, что хотя IdeS уменьшает оценку против большинства протестированных доноров, IdeS не был столь же эффективен, как в соответствующем Т-клеточном CDC. Были два донора (РС:20 и РС:21), у которых IdeS полностью нейтрализовал оценку в Т-клеточном CDC, но не имел никакого эффекта в В-клеточном CDC. Возможным объяснением этого могут быть, например, очень высокие титры против антигенов класса II, или тот факт, что этот пациент имеет значительные титры антител IgM к антигенам класса II. Тем не менее, SAB-анализ ясно показывает, что пациент не имеет антител к HLA-DP или -DQ (табл. 2.5, фиг. 13 и приложение II). Пациент имеет реакционную способность от низкой до средней (т.е. MFI 1200-6500) в отношении 13 протестированных антигенов HLA-DR, и эта реакционная способность полностью нейтрализуется введением IdeS (MFI менее 160). Следовательно, трудно объяснить оставшуюся реакционную способность в В-клеточном тесте высокими титрами к антигенам II класса. Два донора (РС:20 и РС:21), у которых введение IdeS имело полный эффект в Т-клеточном CDC, но не имело никакого эффекта в Вклеточном CDC, несут следующие аллели HLA-DR: РС:20 - DRB1*11:01, DBR3*02:02 и РС:21 DRB1*01:01, DBR1*16:01:01, DRB5*0202. Все эти антигены присутствуют на матрице SAB. Сыворотка от пациента Р07 реагирует с промежуточной реакционной способностью против DRB1*11:01 (MFI: 4552) и слабо против DBR3*02:02 (MFI: 1203), но после введения IdeS сигнал становится ниже 100 для обоих антигенов. Сыворотка не имеет реакционной способности в отношении DRB1*01:01 DRB1*16:01:01 или DRB5*0202 ни до, ни после введения IdeS. Вывод состоит в том, что IgG против антигенов МНС класса II не может объяснить отсутствия эффекта в В-клеточном CDC с использованием этих доноров, и заманчиво предположить, что могут быть вовлечены IgM. Общий вывод состоит в том, что IdeS является весьма эффективным в снижении уровней антител против HLA в сыворотке крови от пациента Р07.
Пациент Р08.
Сыворотка от пациента Р08 обладает высокой реакционной способностью в отношении всех протестированных доноров в Т- и В-клеточном CDC-тесте (табл. 2.2 и 2.3). В Т-клеточном тесте есть 14 доноров, у которых IdeS может полностью нейтрализовать реакционную способность, и 6 доноров, у которых IdeS не имеет никакого измеримого эффекта. В В-клеточном тесте есть 5 доноров, у которых IdeS может полностью нейтрализовать реакционную способность, и поскольку IdeS также демонстрирует полную активность в Т-клеточном тесте с использованием тех же доноров, заманчиво предположить, что эта реакционная способность просто является реакционной способностью в отношении МНС класса I. Есть целый ряд доноров, у которых IdeS не оказывает никакого влияния ни в Т-клеточном, ни в Вклеточном тесте, или у которых IdeS имеет только частичный эффект в этих тестах. Тем не менее, есть также 3 донора (PC:14, PC:16 и РС:20), у которых IdeS имеет полный эффект в Т-клеточном тесте и никакого заметного эффекта в В-клеточном тесте.
SAB-анализы ясно показывают, что пациент Р08 имеет антитела к HLA-A, -В и -С, а также HLADP, -DQ и -DR. До введения IdeS сыворотка имеет широчайшую реакционную способность среди протестированных сывороток (табл. 2.4 и 2.5; фиг. 14). Кроме того, SAB-анализы показывают, что этот пациент имеет самые высокие титры антител против HLA (фиг. 15 и приложения I и II) среди протестированных пациентов. IdeS может явно снижать уровни антител против МНС класса I и класса II, хотя реакционная способность остается значительной (т.е. MFI более 1000) к довольно высокой доле антигенов HLA-DQ и -DR после введения. Следует отметить, что IdeS был наименее эффективен в сыворотке Р08 при измерении оставшегося общего IgG (0,4 г/л), и это, естественно, отражается на уровне оставшихся антител против HLA.
Пациент Р09.
Сыворотка от пациента Р09 имела сильную CDC-реактивность (т.е. CDC-оценка: 8) в отношении Тклеток от 7 доноров, и введение IdeS могло полностью нейтрализовать эту реакционную способность (табл. 2.2). Кроме того, сыворотка реагировала против 22 из 23 доноров В-клеток, и после введения (сниженная) реакционная способность оставалась против 6 доноров (табл. 2.3). SAB-анализы показали, что до введения IdeS сыворотка пациента имела реакционную способность (т.е. MFI более 1000), главным образом, в отношении HLA-A-антигенов, а также HLA-DQ- и -DR-антигенов (табл. 2.4 и 2.5; фиг. 15). IdeS снижал реакционную способность в отношении всех антигенов, и лишь несколько HLA-DQантигенов имели реакционную способность выше MFI: 1000 после введения. Общий вывод состоит в том, что IdeS может почти полностью десенсибилизировать сыворотку от пациента Р09.
Выводы.
Обработка сывороток от сенсибилизированных пациентов, страдающих от CKD стадии 5, клинически значимыми дозами IdeS могла быстро и существенно снизить уровень общего IgG. Кроме того, эта активность непосредственно отражалась в уменьшении уровней специфических и/или обладающих широкой реакционной способностью IgG против HLA в сыворотке от этих пациентов. SAB-анализы ясно показали, что введение IdeS снижало уровень IgG-антител ко всем МНС-антигенам, которые дали положительный результат в сыворотке от всех проанализированных пациентов. В большинстве случаев реакционная способность к отдельным МНС-антигенам после введения IdeS была ниже критической MFI, т.е.
- 28 039169 ниже 1000. В CDC-CXM против Т- и В-клеток от гипотетических доноров IdeS мог снизить реакционную способность во всех протестированных образцах сыворотки от пациентов и был способен перевести положительный перекрестный тест в отрицательный. Кроме того, сыворотка, собранная у здоровых субъектов до введения 0,24 мг/кг IdeS, сильно реагировала в CDC-СХМ с мышиными клетками-мишенями, в то время как сыворотки, собранные через 2 и через 24 ч после введения IdeS, были отрицательными, что также доказывает, что введение IdeS способно перевести положительный СХМ в отрицательный. Взятые вместе представленные здесь данные ясно показывают, что введение IdeS непосредственно перед трансплантацией имеет потенциал для десенсибилизации высокосенсибилизированного пациента, тем самым позволяя провести трансплантацию и избежать острого отторжения, опосредованного антителами.
Пример 2. Приложение I. Необработанные данные по MFI - антигены МНС класса I.
Таблица A
MFI (необработанные данные) против отдельных антигенов HLA-A, измеренные с помощью SAB-анализа
аллель специфичность Р02 Р04 Р07 Р08 РОЭ
+PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS
А*01:01, 64 12 258 19 368 16 23322 2047 3670 131
А*11:02, 76 12 1170 38 155 28 1012 46 647 30
А*11:01, 95 14 772 34 117 17 1127 40 332 30
А*02:01,-, 14010 754 471 28 123 16 377 25 4416 176
А*02:06, 13081 724 419 27 119 16 682 29 4549 184
А*02:03, 14679 848 336 22 93 12 3313 54 6714 266
А*23:01, 6931 184 140 21 170 18 20719 892 3438 118
А*24:02, 5720 163 146 22 167 19 18660 747 6522 261
А*24:03, 7963 218 147 23 134 17 3296 118 4950 171
А*25:01, 16017 708 5330 154 116 15 3941 110 214 29
А*26:01, 70 15 1792 60 156 19 11061 359 230 33
А*29:01, 237 19 498 46 179 20 16918 574 1055 67
А*29:02, 347 23 405 39 174 22 16535 551 763 53
А*03:01, 481 19 180 22 104 15 2809 114 98 24
А*30:01, 99 14 155 21 131 16 19053 697 181 26
А*30:02, 96 11 167 17 219 13 18951 642 156 25
А*31:01, 108 13 191 21 126 15 20556 975 1473 48
А*32:01, 15853 659 490 36 154 22 16963 377 378 41
А*33:03, 130 17 1432 47 114 22 5081 140 7330 243
А*33:01, 2084 40 297 25 117 18 4557 125 3851 101
А*34:02, 115 13 2330 63 147 15 12354 241 4128 130
А*34:01, 122 17 989 49 152 20 8166 164 3602 99
А*36:01, 97 13 258 26 190 19 21627 1463 1139 54
А*43:01, 169 19 1343 55 158 22 12911 445 304 33
А*66:02, 130 15 256 29 155 22 1733 51 4878 163
А*66:01, 107 16 6368 171 130 17 1510 47 2815 87
А*68:02, 3975 131 2415 80 166 18 2659 93 12805 656
А*68:01, 3940 124 2818 75 167 18 3653 110 13413 665
А*69:01, 10448 484 280 26 132 20 1798 55 12645 611
А*74:01, 107 13 271 26 115 16 14934 338 722 38
А*80:01. 82 14 279 27 182 19 21455 1273 3102 76
сумма 117431 5325 32402 1349 4728 564 311736 12941 110522 4671
реактивн. % 100% г 5% 100% ' 4% 100% г 12% 100% г 4% 100% 4%
- 29 039169
Таблица В
MFI (необработанные данные) против отдельных антигенов HLA-B, измеренные с помощью SAB-анализа
аллель специфичность Р02 Р04 Р07 Р08 P09
+PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS
-,-,В*13:01,-,-,- 6568 239 2156 96 11940 415 5049 134 612 52
В*13:02,-,-,- 10690 467 2597 102 14834 625 6532 140 602 43
В*18:01 13289 640 17859 955 9574 282 4412 116 1011 64
-,-,В*27:05,-,-,- 82 12 156 23 471 17 10312 295 609 36
-,-,В*27:08,-,-,- 74 13 152 21 283 18 6053 120 288 29
-,-,В*35:01 14040 735 21463 2517 14472 566 6441 146 175 62
-,-,В*37:01 6773 187 12918 476 8835 228 17098 655 206 60
-,-,В*38:01 14695 712 7209 189 11384 337 5136 90 307 55
-,-,В*39:01 625 21 10465 304 12569 424 5273 77 177 33
-,-,В*41:01 1423 40 2978 89 16496 839 3424 78 128 33
-,-,В*42:01 1565 51 422 29 123 16 7160 174 128 33
-,-,В*44:03,-,-,- 7408 286 4611 151 14513 614 17506 446 1576 62
-,-,В*44:02,-,-,- 12112 541 3225 108 11467 396 14585 306 318 52
-,-,В*45:01 905 25 7774 291 17110 907 20330 605 462 48
В*46:01 4880 123 16562 1035 169 30 17200 673 222 79
-,-,В*47:01 1700 41 1045 56 13404 535 2187 62 1193 58
-,-,В*48:01 2621 53 16060 597 14815 569 16613 811 1493 78
-,-,В*49:01 19412 1338 18626 1265 16059 743 10511 178 169 53
В*50:01 8854 343 20304 1509 17500 932 7763 155 121 48
-,-,В*51:01 19766 1510 20906 1895 9227 240 3099 72 159 73
-,-,В*51:02,-,-,- 20506 1611 20995 2547 13718 515 3801 86 183 87
-,-,В*52:01 19436 1585 20028 1726 10231 275 3682 71 160 61
-,-,В*53:01 18707 1261 21303 2272 12708 410 7582 160 267 86
-,-,В*54:01 770 28 12971 405 632 28 14088 316 835 71
В*55:01 2044 64 7628 186 691 22 16497 397 162 39
В*56:01 6751 224 17712 1039 385 22 3469 110 247 43
-,-,В*57:03,-,-,- 18455 1192 17761 1170 150 24 4147 107 274 59
-,-,В*57:01 19337 1338 18733 1350 136 21 4007 110 342 58
-,-,В*58:01 16725 911 15316 856 170 23 8670 196 294 55
-,-,В*59:01 15856 819 6399 177 8852 274 14144 330 653 80
-,-,В*40:01 372 19 8620 267 15827 738 14576 630 735 42
-,-,В*40:02,-,-,- 318 17 10941 289 16694 856 890 34 1354 55
-,-,В*40:06,-,-,- 304 26 5967 119 14189 594 2623 69 1283 60
-,-,В*15:01 9919 349 19678 1672 14553 640 529 33 337 63
-,-,В*15:16,-,-,- 17630 1094 16364 993 190 27 9578 210 199 63
-,-,В*14:01 7479 218 3726 105 5556 136 7704 162 292 62
-,-,В*14:02,-,-,- 8348 280 2889 81 3724 102 8668 175 256 68
В*67:01 1276 50 8260 329 219 30 13904 365 393 65
-,-,В*07:02,-,-,- 79 12 221 23 129 14 4083 89 93 29
-,-,В*15:10,-,-,- 10301 389 18614 1329 12626 454 1122 46 262 77
-,-,В*15:03,-,-,- 8867 311 18677 1297 13782 579 2173 38 126 48
-,-,В*73:01 95 16 1842 65 825 32 14648 466 789 51
-,-,В*15:11 10379 411 18185 1319 10037 356 3259 78 286 79
-,-,В*15:02,-,-,- 11482 478 19823 1615 12558 423 1327 39 287 59
-,-,В*15:12,-,-,- 2830 54 9906 508 12454 501 19323 713 843 52
-,-,В*15:13,-,-,- 18141 1108 18294 1317 10436 287 1812 55 241 69
-,-,В*78:01,-,-,- 15049 865 20478 1730 7461 217 1111 38 116 61
-,-,В*08:01,-,-,- 1581 36 168 23 7192 163 12749 426 181 35
-,-,В*81:01,-,-,- 81 13 10132 236 134 17 15231 590 1194 5447
-,-,В*82:01 166 21 407 28 439 24 14058 267 227 2830
сумма 410769 22178 559523 36782 421945 16539 416138 11738 22865 12%
реактивность % 100% 5% 100% 7% 100% 4% 100% 3% 100%
- 30 039169
Таблица С
MFI (необработанные данные) против отдельных антигенов HLA-C, измеренные с помощью SAB-анализа
аллель специфичность Р02 Р04 Р07 Р08 РОЭ
+PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS
-,-,-,-,С*01:02,- 144 27 10024 280 275 27 23683 1730 2036 89
-,-,-,-,С*03:02,- 4722 140 15280 894 193 32 2261 65 131 41
-,-,-,-,С*03:04,- 2668 75 16963 1176 222 31 2719 85 153 46
-,-,-,-,С*12:03,- 148 25 4439 133 166 24 16059 463 479 42
С* 14:02,- 122 32 6994 177 166 29 21253 1035 780 51
С* 15:02,- 5524 181 1606 70 277 34 21755 859 953 56
С* 16:01,- 141 29 2493 97 217 37 14945 414 347 64
С* 17:01,- 181 36 228 34 189 37 19817 1256 231 45
С* 18:02,- 159 31 1037 50 188 32 19501 786 651 61
-,-,-,-,С*02:02,- 186 28 239 32 198 31 12090 269 558 50
-,-,-,-,С*04:01,- 186 38 337 37 209 37 11939 315 293 49
-,-,-,-,С*05:01,- 164 26 1046 42 177 28 15526 424 435 46
-,-,-,-,С*06:02,- 170 32 1701 62 169 31 17296 491 598 50
-,-,-,-,С*07:02,- 173 33 396 37 204 31 23743 1643 599 54
-,-,-,-,С*08:01,- 145 21 8555 244 155 25 18497 558 650 49
-,-,-,-,С*03:03,- 2107 59 19947 1599 270 35 2816 84 148 64
сумма 16941 812 91284 4964 3274 500 243901 10477 9039 856
реактив-ть % 100% г 5% 100% г 5% 100% г 15% 100% г 4% 100% 9%
Пример 2. Приложение II. Необработанные данные по MFI - антигены МНС класса II.
Таблица D
MFI (необработанные данные) против отдельных антигенов HLA-DP, измеренные с помощью SAB-анализа
аллель специфичность Pl +PBS 12 +ldeS Pl +PBS 14 +ldeS Pl +PBS )7 +ldeS Pl +PBS 18 +ldeS Pl +PBS )9 +ldeS
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*01:01,- 256 28 426 45 273 32 499 31 177 42
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:03,-,DPBl*01:01,- 184 35 215 39 175 36 649 35 156 43
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*10:01,- 591 26 253 32 122 23 439 27 97 34
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:05,-,DPBl*ll:01,- 707 39 367 41 144 33 773 47 509 49
-,-,-,-,-, DPAl*01:03,-,DPBl*ll:01,- 283 42 434 56 184 41 1252 59 234 66
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:05,-,DPBl*13:01,- 303 39 323 46 148 43 1576 57 252 52
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*13:01,- 123 22 152 26 115 24 380 26 99 29
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*14:01,- 5844 156 305 40 148 30 558 31 115 33
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*15:01,- 198 37 571 103 236 53 583 66 172 87
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*17:01,- 6441 177 291 34 128 25 498 29 295 40
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*18:01,- 155 21 188 33 94 24 2631 21 94 29
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:04,-,DPBl*18:01,- 189 26 260 42 114 28 506 55 219 39
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:05,-,DPBl*18:01,- 213 28 529 69 184 34 575 40 151 48
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:03,-,DPBl*19:01,- 1084 64 921 147 216 51 920 55 183 64
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:03,-,DPBl*02:01,- 308 32 324 118 158 35 531 37 156 43
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*23:01,- 914 80 457 72 235 73 791 70 210 89
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*28:01,- 306 58 414 83 240 57 669 67 182 71
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:05,-,DPBl*28:01,- 283 38 373 60 166 40 1303 38 137 49
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:05,-,DPBl*03:01,- 5508 155 315 44 145 34 563 38 204 47
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:03,-,DPBl*03:01,- 6101 168 284 39 124 28 502 29 209 38
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*03:01,- 5481 148 352 46 173 34 1259 43 128 42
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:03,-,DPBl*04:02,- 250 27 613 72 232 24 317 41 127 54
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*01:03,-,DPBl*04:01,- 156 18 359 43 152 37 474 28 90 36
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*05:01,- 170 28 265 37 162 31 1319 41 173 39
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*06:01,- 5980 162 373 42 149 35 1342 42 359 55
-,-,-,-,-,-,-,-,DPAl*02:01,-,DPBl*09:01,- 7300 220 186 24 89 19 452 19 77 23
сумма . 49327 1874 9549 1435 4306 924 21360 1073 4806 1242
ПРЯИТИР-ТК % 100% r 4% 100% r 15% 100% r 21% 100% r 5% 100% 26%
- 31 039169
Таблица Е
MFI (необработанные данные) против отдельных антигенов HLA-DQ, измеренные с помощью SABанализа
аллель специфичность Pl +PBS 12 +ldeS Pl +PBS 14 +ldeS Pl +PBS 17 +ldeS Pl +PBS 18 +ldeS Pl +PBS 19 +ldeS
DQA1*O5:01,-, DQB1*O2:01,-,-,-,-,- 133 15 147 20 221 20 21824 3652 20118 3389
-,-,-,-, DQA1*O2:01,-, DQB1*O2:02,-,-,-,-,- 127 18 5588 206 99 23 20701 2023 16486 1044
-,-,-,-, DQA1*O2:01,-, DQB1*O2:01,-,-,-,-,- 112 14 4347 161 92 17 22333 1826 15483 844
-,-,-,-,DQAl*04:01,-,DQBl*02:01,-,-,-,-,- 124 23 162 26 120 26 22318 2785 18755 1598
-,-,-,-, DQA1*O3:01,-, DQB1*O2:01,-,-,-,-,- 114 18 112 18 103 20 22232 3023 19425 1575
-,-,-,-, DQA1*O2:01,-, DQBl*04:02,-,-,-,-,- 1331 49 5717 212 145 28 21762 1109 374 60
-,-,-,-,DQAl*02:01,-,DQBl*04:01,-,-,-,-,- 1473 49 5509 175 157 31 23347 1009 453 59
-,-,-,-,DQAl*04:01,-,DQBl*04:02,-,-,-,-,- 1235 43 220 26 102 20 20977 1724 14869 702
-,-,-,-, DQA1*O3:03,-, DQBl*04:01,-,-,-,-,- 2215 69 243 30 97 24 22189 2769 636 139
-,-,-,-, DQA1*O1:02,-, DQB1*O5:02,-,-,-,-,- 1250 52 191 25 122 27 331 29 2641 69
-,-,-,-,DQAl*01:01,-,DQBl*05:01,-,-,-,-,- 2344 78 266 24 102 21 660 19 6670 146
-,-,-,-, DQA1*O1:01,-, DQBl*06:02,-,-,-,-,- 4501 77 281 34 182 25 18442 380 234 47
-,-,-,-, DQA1*O1:03,-, DQBl*06:03,-,-,-,-,- 7767 181 286 32 136 38 17789 983 9668 281
-,-,-,-, DQA1*O1:02,-, DQBl*06:04,-,-,-,-,- 4760 127 280 59 192 55 21132 724 357 115
-,-,-,-, DQAl*01:02,-, DQBl*06:09,-,-,-,-,- 5321 100 164 25 158 24 20512 1107 543 103
-,-,-,-, DQA1*O1:02,-, DQBl*06:02,-,-,-,-,- 4236 68 234 37 169 31 21040 358 189 46
-,-,-,-, DQA1*O1:03,-, DQBl*06:01,-,-,-,-,- 8661 192 304 25 167 35 20774 1892 8624 290
-,-,-,-, DQA1*O2:01,-, DQB1*O3:01,-,-,-,-,- 328 27 7971 330 164 31 22290 2390 1494 234
-,-,-,-, DQAl*06:01,-, DQB1*O3:01,-,-,-,-,- 642 21 203 18 89 17 22598 3231 17969 1575
-,-,-,-, DQA1*O3:01,-, DQB1*O3:01,-,-,-,-,- 225 37 325 145 151 30 22928 2696 1477 274
-,-,-,-, DQA1*O5:03,-, DQB1*O3:01,-,-,-,-,- 216 22 594 37 169 27 22888 3371 20671 2742
-,-,-,-, DQA1*O5:05,-, DQB1*O3:01,-,-,-,-,- 222 26 529 35 161 27 22683 3319 20511 2678
-,-,-,-, DQA1*O2:01,-, DQB1*O3:02,-,-,-,-,- 2123 46 5785 212 141 30 21968 1912 1342 197
-,-,-,-, DQA1*O1:01,-, DQB1*O3:02,-,-,-,-,- 1509 41 195 32 143 30 21810 2125 1192 204
-,-,-,-, DQA1*O3:01,-, DQB1*O3:02,-,-,-,-,- 2522 39 158 23 109 22 22088 2364 1367 222
-,-,-,-, DQA1*O3:02,-, DQB1*O3:02,-,-,-,-,- 5925 85 145 24 102 28 22349 3391 3207 486
-,-,-,-, DQA1*O3:02,-, DQB1*O3:03,-,-,-,-,- 6583 91 424 21 84 17 22488 3351 2651 441
-,-,-,-, DQA1*O2:01,-, DQB1*O3:03,-,-,-,-,- 6720 109 10667 469 94 23 22211 2934 2710 464
-,-,-,-, DQAl*03:01,-, DQBl*03:03,-,-,-,-,- 2768 82 197 26 117 23 22331 2422 1364 243
сумма 75489 1800 51244 2505 3891 767 586994 58920 211481 20264
реактивность % 100% r 2% 100% r 5% 100% r 20% 100% 10% 100% 10%
Таблица F
MFI (необработанные данные) против отдельных антигенов HLA-DR, измеренные с помощью SAB-анализа
аллель специфичность P02 P04 P07 P08 P09
+PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS +PBS +ldeS
DRB1*O1 02,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 17110 487 675 42 115 20 431 25 255 32
DRB1*O1 01,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 18574 696 402 31 106 17 340 23 107 24
DRB1* 10 01, 21581 1351 327 28 691 26 23510 849 188 54
DRB1*O1 03,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 16759 508 2850 51 82 18 487 21 116 22
DRB1*U 04,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 216 37 1575 66 5395 140 22704 1252 3740 513
DRB1*11 01,-,-,-,-,-, -,-,-,-,-,- 159 20 705 33 4552 95 21697 956 3207 380
DRB1* 12 02,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 8815 293 7903 139 3381 63 23939 1668 2763 366
DRB1* 12 01,-,-,-,-,-, -,-,-,-,-,- 9541 322 13327 341 3622 67 23623 1761 2803 344
DRB1*13 03,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 207 16 4923 104 6523 156 23331 1541 4764 550
DRB1* 13 01, 409 22 269 22 5257 119 22827 1247 4399 430
DRBTT4 54,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 5152 115 319 55 4412 114 22371 1320 3796 471
DRB1* 14 01,-,-,-,-,-, -,-,-,-,-,- 6374 115 203 23 5847 135 23061 1611 4316 577
DRB1*14 02,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 2374 70 253 45 3609 96 21144 978 3310 336
DRB1*15 02,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 289 16 2435 68 94 16 22630 715 600 79
DRB1* 15 01, 363 18 3604 87 87 15 22151 929 845 102
DRBTT5 03,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 988 37 1943 72 150 35 22653 766 620 90
DRB1* 16 01,-,-,-,-,-, -,-,-,-,-,- 322 29 1946 70 151 30 22645 782 868 130
DRB1* 16 02,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 374 31 2495 80 142 28 22465 686 829 112
DRBl*03 01,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 264 20 182 22 6129 134 23891 2299 7907 778
DRBl*03 02,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 592 40 268 38 4394 104 22857 1681 5032 524
DRB1*O4 02,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 13287 377 970 45 920 33 21202 1269 2770 330
DRB1*O4 03,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 11768 304 927 79 762 41 22904 1174 2415 321
DRBl*04 05,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 13364 356 306 36 786 36 21299 1151 2439 318
DRB1*O4 04,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 14417 431 1125 67 933 35 21760 1426 2682 369
DRB1*O4 01,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 13713 413 807 60 897 36 21712 1323 2723 381
-,-,DRB5*01 01,-,-,-,-,-,-,-,-,- 13374 364 679 48 194 27 12086 140 147 37
-,-,DRB5*02 02,-,-,-,-,-,-,-,-,- 15426 490 1677 47 99 16 8798 241 692 37
-,-,DRB3*03 01,-,-,-,-,-,-,-,-,- 8925 415 927 95 667 103 22575 1013 1211 249
-,-,DRB3*01 01,-,-,-,-,-,-,-,-,- 8394 284 270 36 572 40 20467 1862 4190 479
-,-,DRB3*02 02,-,-,-,-,-,-,-,-,- 295 25 441 41 1203 45 22652 1251 1561 226
-,-,DRB4*01 03,-,-,-,-,-,-,-,-,- 21616 1327 247 32 104 32 23348 2341 439 213
-,-,DRB4*01 01,-,-,-,-,-,-,-,-,- 19130 944 686 64 304 22 23279 1917 870 196
DRB1*O7 01,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 16524 691 25134 1957 107 16 24193 1793 2057 301
DRB1*O8 01,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 171 29 2716 59 4588 100 22391 1101 4075 543
DRB1*O9 01,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,- 17862 712 15740 648 199 42 22643 1466 1650 257
DRB1*O9 02 ----------- 20587 820 19870 1099 133 28 23199 1416 3767 351
сумма 319416 12223 119123 5831 67208 2080 723269 41992 84154 10522
реактивность % 100% r 4% 100% 5% 100% r 3% 100% 6% 100% 13%
- 32 039169
Ссылки.
Ding JW, Zhou T, Zeng H, Ma L, Verbeek JS, Yin D, m.fl. Hyperacute rejection by antiGal lgG1, lgG2a, and lgG2b is dependent on complement and Fc-gamma receptors. J Immunol.
januari 2008; 180(1):261-8.
Jordan SC, Vo A, Bunnapradist S, Toyoda M, Peng A, Puliyanda D, Kamil E, Tyan D.
Intravenous immune globulin treatment inhibits crossmatch positivity and allows for successful transplantation of incompatible organs in living-donor and cadaver recipients. Transplantation 2003 Aug;76(4):631-636.
Moll S and Pascual M. Humoral rejection of organ allografts. Am. J. Transplant 2005
Nov; 5(11):2611-2618.
Montgomery RA, Hardy MA, Jordan SC, Racusen LC, Ratner LE, Tyan DB, Zachary AA.
Consensus opinion from the antibody working group on the diagnosis, reporting, and risk assessment for antibody-mediated rejection and desensitization protocols. Transplantation 2004
Jul;78(2):181-185.
Organ Procurement and Transplantation Network (OPTN) Database. US Department of
Health and Human Services, Health Resources and Services Administration; May 11, 2011.
Thomas B. Martins. Development of Internal Controls for the Luminex Instrument as Part of a Multiplex Seven-Analyte Viral Respiratory Antibody Profile
Patel R, Terasaki PI. Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation. N. Engl. J. Med. 1969 Apr;280(14):735-739.
Pierson RN 3rd. Antibody-mediated xenograft injury: mechanisms and protective strategies. Transpl Immunol, juni 2009;21 (2):65-9.
Terasaki PI, Ozawa M. Predicting kidney graft failure by HLA antibodies: a prospective trial. Am. J. Transplant 2004 Mar;4(3):438-443.
Vo AA, Petrozzino J, Yeung K, Sinha A, Kahwaji J, Peng A, m.fl. Efficacy, outcomes, and cost-effectiveness of desensitization using IVIG and rituximab. Transplantation. 27 Mars 2013;95(6):852-8.
von Pawel-Rammingen U, Johansson BP, Bjorck L. IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G. EMBO J 2002 Apr;21(7):1607-1615.
Akesson P, Moritz L, Truedsson M, Christensson B, von Pawel-Rammingen U. IdeS, a highly specific immunoglobulin G (IgG)-cleaving enzyme from Streptococcus pyogenes, is inhibited by specific IgG antibodies generated during infection. Infect. Immun 2006 Jan;74(1):497-503.
Пример 3.
Введение.
Как показано в примерах 1 и 2, IdeS быстро расщепляет все плазменные IgG после внутривенного введения людям. Следующие данные in vitro и ex vivo показывают, что IdeS не только расщепляет растворимый IgG, как было показано ранее, но и отрезает F(ab')2-часть В-клеточного рецепторного комплекса с поверхностных IgG-положительных В-клеток. Усечение BCR под влиянием IdeS имеет сильные ингибирующие эффекты на индукцию IgG, секретируемого CD27-положительными В-клетками памяти, активированными R848 и IL-2, в то время как секреция IgM клетками с IgM-положительными поверхностными BCR не уменьшается при введении IdeS. Это говорит о том, что введение IdeS пациентам с донор-специфическими антителами не только удаляет указанные антитела, но также делает донорспецифические В-клетки памяти (по меньшей мере, на начальном этапе) неспособными реагировать на антигены донора. Таким образом, любая начальная активация В-клеток памяти и образование плазматических клеток, которые могли бы производить больше донор-специфических антител, также нарушается.
Материал и методы.
Скрининг клеточных линий на поверхностный иммуноглобулин.
Различные клеточные линии В-клеточных лимфом человека, т.е U-2940 (ACC634), Nu-DUL-1 (ACC579), Raji (CCL-86) и Daudi (CCL-213), подвергали скринингу на наличие мембраносвязанного IgG или IgM. Вкратце, клетки культивировали при 37°С в 5% СО2 в RPMI1640, дополненной 10% FCS и
- 33 039169
PEST. Клетки обрабатывали в течение 30 мин при 37°С PBS или различными концентрациями IdeS, а затем подвергали кислотному промыванию (0,1М глицин, рН 2,7, 0,5М NaCl) в течение 5 мин на льду. Кислотное промывание удаляет антитела, присутствующие на FcyR или связанные с антигеном, оставляя интактными трансмембранные молекулы (Gilden et al., 1978, Jennings et al., 2011). Клетки окрашивали биотинилированными антителами, специфическими в отношении F(ab')2-части (№ 109-066-097, Jackson, перекрестная реактивность с легкой цепью, присутствующей во всех подклассах иммуноглобулинов) и Fc-части IgG (№ 109-066-098, Jackson, специфические в отношении тяжелой цепи IgG) или IgM (GM80A, ICL). Стрептавидин-АРС (№ 016-130-084, Jackson) использовали для мониторинга клеток в FL4 с использованием проточного цитометра Accuri С6.
Анализы пролиферации и жизнеспособности клеток.
Пролиферацию измеряли путем встраивания BrdU. Клетки обрабатывали PBS или различными концентрациями IdeS, и 5х104 клеток/лунка высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 ч. BrdU добавляли к клеткам и инкубировали в течение 6 ч перед измерением пролиферации в соответствии с рекомендациями производителей (Cell Proliferation ELISA, BrdU colorimetric, Roche № 11 647 229 001). Цитохалазин D (C2618, Sigma) и пуромицин (Invitrogen) использовали в различных концентрациях в качестве антипролиферативных контролей.
Для измерения жизнеспособности клеток использовали чувствительный колориметрический анализ (CCK-8). Клетки обрабатывали PBS или 30 мкг/мл IdeS, и 2x104 клеток/лунка высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 ч. Добавляли ССК-8 (набор для подсчета клеток CCK-8, CCK-8 cell counting kit 8, Dojindo Laboratories, Япония) и измеряли абсорбцию при 450 нм в различные моменты времени. В экспериментах с клетками Nu-DUL-1 их обрабатывали PBS или 30 мкг/мл IdeS, и различное число клеток высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 ч перед добавлением CCK-8. В экспериментах с обогащенными В-клетками периферическую кровь собирали в гепаринизированные пробирки, дополненные IdeS с концентрацией 30 мкг/мл или PBS, и инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 30 мин. 250 мкл смеси RosetteSep® Human В cell Enrichment (№ 07905, StemCell TechNO:logies) добавляли к 5 мл крови, хорошо перемешивали и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Образцы разводили равным объемом PBS, дополненным 2% FCS, а затем разделяли в градиенте плотности (Ficoll-PaquePLUS). Собранные В-клетки подсчитывали и их плотность доводили до 20x104 клеток/мл в RPMI 1640, дополненной 10% FCS и PEST. 2x104 клеток/лунка высевали в трех повторах в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 ч перед добавлением CCK-8.
Эффективность нацеливания IdeS в плазме, оцениваемая путем SDS-PAGE.
Плазму, собранную при разделении в градиенте плотности гепаринизированной крови, обработанной PBS или различными количествами IdeS, использовали для проверки эффективности IdeS на растворимом IgG. Анализы SDS-PAGE проводили в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad Laboratories, Калифорния, США). Вкратце, 1 мкл плазмы разделяли в 4-20% заранее приготовленных гелях Mini-PROTEAN®TGX™ (Bio-Rad) при 200 В в течение 40 мин в невосстанавливающих условиях. Гели окрашивали реагентом GelCode Blue (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями изготовителя и сканировали.
Восстановление отщепленного BCR.
Клетки Nu-DUL-1 обрабатывали PBS или различными количествами IdeS в течение 1 ч при 37°С, а затем тщательно промывали, чтобы удалить весь оставшийся IdeS. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в RPMI 1640, дополненной 10% FCS и PEST. Один планшет сразу же использовали для анализа интактного IgG путем проточной цитометрии, а другой культивировали (37°С, 5% СО2) в течение 24 ч перед анализом. Клетки окрашивали биотинилированным антителом, специфичным в отношении F(ab')2части (№ 109-066-097, Jackson), а затем стрептавидином-АРС (№ 016-130-084, Jackson), и клетки оценивали в FL4 с использованием проточного цитометра Accuri С6.
Периферическую кровь собирали у здоровых добровольцев в гепаринизированные пробирки (BD Vacutainer, № 367876) и обрабатывали 30 мкг/мл IdeS или PBS в течение 1 ч при 37°С до выделения РВМС путем разделения в градиенте плотности (Ficoll-PaquePLUS). Промежуточную фазу РВМС собирали, промывали в PBS и ресуспендировали в культуральной среде (RPMI 1640, дополненной 10% FCS и PEST). РВМС подсчитывали, доводили до плотности 2x106 клеток/мл, затем образец отбирали, фиксировали в PFA, промывали в PBS с добавлением 0,1% BSA и хранили при 4°С до анализа путем проточной цитометрии. Остальные клетки культивировали и образцы отбирали и фиксировали в PFA в указанные моменты времени. Для обнаружения F(ab')2-части IgG использовали биотинилированное IgG против СН1 (№ 710.3202.100, ВАС), для обнаружения Fc-части IgG использовали козлиный противочеловеческий Fcспецифический F(ab')2-фрагмент (№ 109-066-098, Jackson). Клетки также дважды окрашивали РЕконъюгированным анти-CD19 (№ IP-305-T100, ExBio) и стрептавидин-АРС (№ 016-130-084, Jackson). Популяцию лимфоцитов гейтировали с использованием прямого светорассеяния и дважды положительные клетки оценивали в FL2 и FL4 с использованием проточного цитометра Accuri С6.
Внутриклеточная фосфоспецифическая проточная цитометрия (сигналинг BCR).
Клетки Nu-DUL-1 культивировали в течение ночи в бессывороточной среде, чтобы свести к мини
- 34 039169 муму фоновое фосфорилирование до начала экспериментов с сигналингом. На следующий день добавляли PBS или 30 мкг/мл IdeS и клетки культивировали (37°С, 5% СО2) в течение 30 мин. 1х106 клеток удаляли и фиксировали в течение 5 мин в PFA, а затем в течение 10 мин пермеабилизовали в 70% этаноле на льду. Клетки промывали в PBS с добавлением 0,1% BSA и хранили при 4°С до анализа (нулевой образец). После сбора нулевого образца BCR оставшихся клеток сшивали путем добавления 10 мкг/мл козлиного противочеловеческого F(ab')2-специфического F(ab')2 (Jackson № 109-006-097) и образцы клеток собирали в различные моменты времени, фиксировали и пермеабилизовали. Фиксированные клетки окрашивали для анализа путем проточной цитометрии с помощью АРС-конъюгированного фосфоспецифического ERK1/2 (№ 17-9109-42, eBioscience) и РЕ-конъюгированного фосфоспецифического PLC-y2 (№ 558490, BD). Клетки оценивали в FL2 и FL4 с использованием проточного цитометра Accuri С6.
Дифференцировка В-клеток памяти.
Периферическую кровь собирали у здоровых добровольцев в гепаринизированные пробирки (BD Vacutainer, № 367876) и выделяли РВМС путем разделения в градиенте плотности (Ficoll-PaquePLUS). Промежуточную фазу РВМС собирали, промывали в PBS и ресуспендировали в культуральной среде (RPMI 1640, дополненной 10% FCS и PEST). РВМС доводили до плотности 2x106 клеток/мл и высевали либо с IdeS (конечная концентрация 0,3, 3 и 30 мкг/мл), либо с PBS. Клетки стимулировали смесью R848 и RIL-2 в соответствии с рекомендациями производителя (MabTech) и культивировали в течение 72-96 ч. Клетки, предназначенные для кратковременных обработок, оставляли в пробирках, дополненных PBS или IdeS, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С, а затем промывали 3x12 мл PBS и 1x12 мл культуральной средой. Эти клетки высевали и обрабатывали R848/rIL-2, как описано выше.
Фильтровальные планшеты ELISpot предварительно смачивали 70% этанолом, промывали стерильной водой и инкубировали при 4°С в течение ночи с антителом захвата (набор ELISpotPLUS Mabtech № 3850-2HW-Plus для мониторинга IgG-продуцирующих клеток, набор ELISpotPLUS Mabtech № 38452HW-Plus для мониторинга IgM-продуцирующих клеток и набор ELISpotBASIC Mabtech № 3860-2Н для мониторинга IgA-продуцирующих клеток). Фильтровальные планшеты ELISpot промывали и блокировали в течение по меньшей мере 30 мин с культуральной средой перед посевом клеток.
Клетки переносили в 15 мл пробирки, тщательно промывали, подсчитывали, доводили плотность до 0,5x106 клеток/мл и готовили 2-кратные разведения, а затем клетки высевали в подготовленные фильтровальные планшеты ELISpot и культивировали в течение 24 ч. Планшеты ELISpot промывали и инкубировали с биотинилированными антителами обнаружения для анализа общего IgG, IgM и IgA (включены в названные наборы) в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со стрептавидин-HRP, а затем промывали и инкубировали с раствором ТМВ, готовым к использованию, и развивали реакцию до появления отдельных пятен. Планшеты промывали водопроводной водой и сушили в темноте. Фильтры фотографировали и пятна подсчитывали вручную.
В-клеточное обогащение и проточная цитометрия.
Для В-клеточного обогащения периферическую кровь собирали в гепаринизированные пробирки с 30 мкг/мл IdeS или PBS и инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 30 мин. 250 мкл смеси RosetteSep® Human В cell Enrichment (№ 07905, StemCell TechNO:logies) добавляли к 5 мл крови, хорошо перемешивали и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Образцы разводили равным объемом PBS, дополненным 2% FCS, а затем разделяли в градиенте плотности (Ficoll-PaquePLUS). Собранные Вклетки подсчитывали и их плотность доводили до 15x104 клеток/мл в PBS, дополненном 10% FCS, а затем сеяли в V-образные 96-луночные планшеты для окрашивания в ходе проточной цитометрии. Планшеты центрифугировали со скоростью 1500 об/мин в течение 3 мин и супернатант удаляли. Для обнаружения F(ab')2-части IgG использовали 10 мкг/мл биотинилированного IgG против СН1 (№ 710.3202.100, ВАС), для обнаружения Fc-части IgG использовали 0,5 мкг/мл козлиного противочеловеческого Fcспецифического F(ab')2-фрагмента (№ 109-066-098, Jackson). Далее клетки дважды окрашивали РЕконъюгированным анти-CD19 (№ IP-305-T100, ExBio) или РЕ-конъюгированным анти-CD27 (№ 555441, Pharmingen), а затем стрептавидин-АРС (№ 016-130-084, Jackson). Клетки оценивали в FL2 и FL4 с использованием проточного цитометра Accuri С6.
IDES расщепляет IgG-тип BCR в первом клиническом испытании на людях.
Фазу I, двойное слепое и рандомизированное испытание с отдельными увеличивающимися дозами IdeS, проводили в Лунде после утверждения шведскими нормативными и этическими органами (номер ClinicalTrials.gov: NCT01802697). Все субъекты подписывали информированное согласие перед началом каких-либо связанных с испытанием процедур. В качестве поисковой части исследования контролировали целостность IgG-типа BCR на CD19+ клетках в различные промежутки времени после внутривенного введения IdeS в дозе 0,12 или 0,24 мг/кг массы тела. Периферическую кровь собирали в гепаринизированные пробирки и РВМС выделяли в течение 2 ч с момента сбора путем разделения в градиенте плотности (Ficoll-PaquePLUS). Промежуточную фазу РВМС собирали, промывали в PBS и фиксировали в PFA в течение 30 мин на льду. Клетки промывали и хранили в PBS с добавлением 0,5% BSA до тех пор, пока не были собраны образцы во все моменты времени. Для обнаружения F(ab')2-части IgG клетки ок
- 35 039169 рашивали с помощью 10 мкг/мл биотинилированного IgG против СН1 (№ 710.3202.100, ВАС). Для обнаружения Fc-части IgG использовали 0,5 мкг/мл козлиного противочеловеческого Fc-специфического F(ab')2-фрагмента (№ 109-066-098, Jackson). Далее клетки дважды окрашивали РЕ-конъюгированным анти-CD19 (№21270194, ImmuNO:tools) и стрептавидин-АРС (№ 016-130-084, Jackson). Популяцию лимфоцитов гейтировали в образце перед введением дозы для каждого индивидуума, и затем этот гейт использовали для всех образцов в различные моменты времени для этого субъекта. Клетки CD19+ контролировали в FL2, a F(ab')2/Fc-сигнал контролировали в FL4. Клетки CD19+ контролировали в М1 (FL2), и также эти клетки дополнительно контролировали на наличие сигнала при анти-Fc- и анти-Fabокрашивании (FL4). Для каждого образца приведено число клеток в верхнем правом углу (UR), а также средняя интенсивность флуоресценции (MFI).
Кроме того, рассчитывали частоту дважды положительных клеток по следующей формуле:
MFI в URχчисло клеток в UR число клеток в М1.
Эту формулу использовали для того, чтобы иметь возможность оценивать разницу в MFI, когда в UR присутствовало только низкое число клеток.
Результаты.
IdeS расщепляет IgG-тип BCR с такой же эффективностью, как растворимый IgG.
Четыре различных линии В-клеточных лимфом подвергали скринингу на наличие трансмембранного IgG или IgM с использованием подхода проточной цитометрии, включающего этап кислотного промывания, чтобы удалить IgG или IgM, не прикрепленные к мембране через трансмембранный домен (Gilden et al., 1978, Jennings et al., 2011). После выявления наличия IgG- или IgM-типа BCR на клеточных линиях Nu-DUL-1 (IgG-тип BCR) и Daudi (IgM-тип BCR) были выбраны в качестве моделей для дальнейшего анализа. Специфическое к Fab-фрагменту F(ab')2-антитело использовали для обнаружения присутствия Fab-части BCR, так как антитело перекрестно реагирует с легкой цепью, присутствующей как в IgG, так и в IgM. Для того чтобы обнаружить присутствие Fc-части, использовали антитела, направленные против Fc-части IgG. Интактный мембраносвязанный IgG не мог быть обнаружен на поверхности клеток при концентрациях IdeS выше 4 мкг/мл. Клетки Daudi, имеющие IgM-тип BCR, не повреждались даже при высоких концентрациях IdeS (фиг. 19А). Клетки Nu-DUL-1 обрабатывали различными концентрациями IdeS и инкубировали при 37°С в течение 30 мин перед FACS-окрашиванием. Было показано, что IdeS эффективно удаляет F(ab')2-часть IgG, присутствующего в BCR, оставляя отщепленную Fcчасть, прикрепленную к мембране (фиг. 19В).
Затем мы перешли к целевому расщеплению BCR на РВМС, выделенных от здоровых добровольцев. Из-за перекрестной реактивности Fab-специфического антитела с легкими цепями на IgM для окрашивания гетерогенной популяции РВМС использовали СН1-домен-специфический CaptureSelectфрагмент против IgG. Кровь, собранную в пробирки с гепарином, обрабатывали в течение 30 мин (37°С) различными концентрациями IdeS. РВМС разделяли в градиенте плотности после обработки IdeS и собирали плазму и РВМС. Плазму анализировали на SDS-PAGE, чтобы подтвердить эффективность IdeS на растворимом IgG (фиг. 20А). ScIgG формировался уже при 0,9 мкг/мл IdeS, а полное расщепление было достигнуто при 9 мкг/мл.
Поскольку CD19 является отличительным признаком для В-клеточных линий, РВМС дважды окрашивали анти-CD19 и анти-Fab или анти-Fc, чтобы контролировать присутствие интактного IgG-BCR на В-клетках. Проточная цитометрия показала, что IdeS может удалять F(ab')2-часть IgG с CD19+-клеток, оставляя Fc-часть в мембране (фиг. 20В). Поскольку однократно расщепленный мембраносвязанный IgG, присутствующий в BCR, все еще прикреплен к мембране, эффект не полностью виден при проточной цитометрии до тех пор, пока продукт scIgG присутствует и прикреплен к мембране. Полный эффект был достигнут на мембраносвязанном IgG в дозе IdeS 9 мкг/мл. Таким образом, эти результаты впервые показывают, что существует прямая корреляция между эффективностью IdeS на свободном IgG и мембраносвязанном IgG, соответственно присутствующем в В-клеточных рецепторах.
Для того чтобы более четко определить влияние IdeS на подгруппу В-клеток памяти, исследовали влияние на CD19+/CD27+ В-клетки памяти. CD19+ В-клетки составляют лишь несколько процентов от всей популяции РВМС. Поэтому CD19+ В-клетки обогащали путем отрицательной селекции (RosetteSep), которая давала более 90% CD19+-клеток (фиг. 21А). Примерно 10% этой популяции окрашивались дважды положительно на поверхностный IgG и CD27 перед обработкой IdeS (фиг. 21В). После обработки IdeS менее 1% CD19+/CD27+-клеток окрашивались положительно на IgG клеточной поверхности (фиг. 21В). Таким образом, эти данные впервые показывают, что BCR на В-клетках памяти с переключением класса, т.е. на клетках CD19+/CD27+/поверхностный IgG+, эффективно расщепляется под влиянием IdeS.
Расщепленный BCR быстро регенерирует на клеточных линиях и на РВМС и не влияет на жизнеспособность клеток.
Для того чтобы исследовать мембранный круговорот IgG-типа BCR, клетки Nu-DUL-1 обрабатывали различными концентрациями IdeS, промывали, чтобы удалить IdeS, и культивировали. Фракции клеток удаляли через 1 ч и через 24 ч после обработки и анализировали на мембраносвязанный IgG с помощью проточной цитометрии. Через час после обработки IgG не обнаруживался при концентрациях Ides более 4 мкг/мл, а через 24 ч после обработки Fab-специфический сигнал возвращался к исходным уров
- 36 039169 ням, демонстрируя, что мембраносвязанный IgG восстанавливался (фиг. 22А). Клетки Nu-DUL-1 также анализировали на пролиферативную способность путем встраивания BrdU, и не было никакой разницы в пролиферации после расщепления IgG-типа BCR, даже если обработку IdeS продолжали в течение 24 ч (фиг. 22В). Вещества с известной антипролиферативной способностью (пуромицин и цитохалазин D) имели сильное антипролиферативное влияние на клетки. Жизнеспособность клеток Nu-DUL-1 исследовали также путем обработки клеток высокой дозой IdeS (30 мкг/мл) в течение 24 ч, а также жизнеспособность анализировали с использованием анализа CCK-8, и после обработки IdeS не было обнаружено никакого влияния на жизнеспособность клеток (фиг. 22С).
Можно было ожидать того, что IgG-тип BCR будет регенерировать в течение 24 ч на высокопролиферирующих лимфомных клеточных линиях, поскольку мембранный круговорот на пролиферирующих клетках, как правило, является очень высоким. РВМС от здоровых добровольцев подвергали аналогичной обработке для дальнейшего исследования круговорота IgG-типа BCR на первичных клетках. Кровь собирали в пробирки с гепарином и обрабатывали высокой дозой (30 мкг/мл) IdeS. После обработки крови РВМС разделяли на Ficoll. PBMC промывали большими объемами буфера для того, чтобы удалить весь IdeS перед культивированием. Фракцию клеток отбирали в различные моменты времени, фиксировали и окрашивали с помощью анти-CD19 для В-клеточной линии, а также окрашивали с помощью антиFab или анти-Fc для мониторинга IgG-BCR. IgG-тип BCR быстро регенерировал также и на нормальных CD19+-клетках человека, и уже через 16 ч после расщепления число анти-Fab-положительных клеток возвращалось к уровням до обработки, хотя все еще не достигало полного MFI. Это указывает на то, что через 16 ч после обработки РВМС посредством IdeS клетки снова имели инактные IgG-BCR на поверхности, даже если все IgG-BCR еще не были заменены (фиг. 23А). Анти-Fc-сигнал не зависел от обработки, демонстрируя, что обработка IdeS отщепляла F(ab')2 от IgG-типа BCR (фиг. 23В). Поскольку В-клетки составляют лишь несколько процентов от общей численности популяции РВМС, мы также использовали набор для обогащения В-клеток (RosetteSep), который давал более 90% CD19+-клеток. Примерно 20% CD19-обогащенной популяции клеток окрашивалось положительно на IgG с использованием как F(ab')2-, так и Fc-специфических реагентов (фиг. 24). Эксперимент по восстановлению клеточной поверхности повторяли с использованием этих очищенных клеток, и обработка IdeS эффективно удаляла F(ab')2-часть мембраносвязанного IgG, оставляя Fc-часть интактной (фиг. 24А и 24В). Опять же, круговорот был быстрым, и уже через 16 ч после обработки уровень IgG клеточной поверхности восстанавливался (фиг. 24А). Далее жизнеспособность клеток оценивали в течение нескольких дней с помощью анализа CCK-8, чтобы оценить выживаемость первичных человеческих В-клеток с интактным BCR или без него. При временном удалением IgG-типа BCR из CD19-обогащенных клеток путем обработки IdeS (фиг. 25) не наблюдалось никакого существенного влияния на жизнеспособность клеток.
Обработка IdeS ингибирует BCR-сигналинг.
BCR-сигналинг играет важную роль в активации, выживании и дифференцировке В-лимфоцитов. Исходным событием после взаимодействия BCR является активация Lyn и Syk, которая затем распространяется на активацию PLC-y2 и ERK1/2. Описанные эксперименты ясно показали, что IdeS может расщеплять IgG-тип BCR, что может иметь последствия для BCR-сигналинга. Чтобы это проверить, фосфорилирование PLC-y2 и ERK1/2 контролировали как последующий индикатор сигнального каскада BCR. В серии экспериментов, в которых BCR на клетках Nu-DUL-1 был сшит с помощью F(ab')2специфического антитела, было показано, что клетки не могут передавать сигнал через BCR после обработки IdeS (фиг. 26А и 26В). Ни PLC-y2, ни ERK1/2 не фосфорилировались в ответ на попытки лигировать BCR с использованием F(ab')2-специфического антитела после обработки IdeS. Ложно обработанные клетки отвечали нормально. Эти данные свидетельствуют о том, что обработанные IdeS клетки с расщепленным IgG-типом BCR не могут отвечать на антигенную стимуляцию.
IdeS блокирует В-клеточное созревание.
В связи с обнаружением того факта, что IdeS не влияет на жизнеспособность клеточных линий или первичных В-клеток, но делает их неспособными отвечать на антиген, мы решили дополнительно изучить функциональность первичных В-клеток памяти. Для этого РВМС собирали, обрабатывали IdeS и стимулировали рекомбинантным IL2 и R848, чтобы активировать В-клетки памяти и дифференцировать их в Ig-продуцирующие клетки (Jahnmatz et al., 2013). После 72-96 ч клетки интенсивно промывали, чтобы удалить IdeS, и анализировали на частоту Ig-продуцирующих клеток. IdeS также добавляли на третий день IL2/R848-культуры в качестве дополнительного контроля. В этот момент невозможно остановить секрецию IgG IL2/R848-дифференцированными В-клетками. Этот контроль также показывает, что потеря сигнала возникает не из-за преходящего влияния IdeS, мешающего антителам в ELISPOT-анализе (фиг. 27А). В большинстве экспериментов IdeS присутствовал в течение всего периода стимуляции (96 ч), и результаты показали, что обработка IdeS ингибирует дифференцировку В-клеток памяти и число IgG-продуцирующих клеток, при этом не оказывает никакого влияния на созревание IgM- или IgAпродуцирующих клеток (фиг. 27А и 27В). При всех исследованных концентрациях IdeS от 0,3 до 30 мкг/мл имело место значительное влияние на дифференцировку В-клеток (фиг. 27С). Вторая серия экспериментов, в которых IdeS вымывали перед стимуляцией посредством IL2 и R848, также привела к зна- 37 039169 чительному сокращению числа IgG-продуцирующих клеток (фиг. 27D), показывая, что первоначальное удаление антигенсвязывающей части IgG-BCR является важным этапом в ингибировании активации Вклеток памяти в Ig-продуцирующих клетках.
IdeS расщепляет IgG-mun BCR in vivo у людей.
IdeS недавно был испытан в первом исследовании на людях, в котором здоровые люди получали одну возрастающую внутривенную дозу (номер ClinicalTrials.gov: NCT01802697) (представленная рукопись). Самая высокая протестированная доза, которую вводили четырем субъектам, составляла 0,24 мг/кг массы тела. Разведочная часть испытания заключалась в анализе целостности IgG-типа BCR на циркулирующих CD19+-лимфоцитах в разные моменты времени точки после введения IdeS. Периферическую кровь собирали и РВМС очищали перед введением дозы, через 2 ч, 24 ч, 48 ч и 96 ч после введения. Клетки немедленно фиксировали, чтобы предотвратить дальнейший клеточный метаболизм, и хранили до тех пор, пока все временные точки от субъекта не были готовы для анализа. РВМС дважды окрашивали на CD19 и F(ab')2 и Fc-фрагменты и анализировали с помощью проточной цитометрии. Этот способ позволяет измерять частоту и среднюю интенсивность флуоресценции клеток, имеющих F(ab')2 (т.е. интактнный IgG-тип BCR) и Fc на их клеточной поверхности. Тем не менее, этот способ не позволяет различать интактный и однократно расщепленный BCR.
Результаты показали, что число CD19+-клеток, которые окрашивались положительно на F(ab')2, снижалось уже через 2 ч после обработки IdeS (0,24 мг/кг массы тела), в то время как число клеток, окрашенных положительно на Fc, не снижалось (фиг. 28). Это ясно показывает, что IdeS in vivo расщеплял поверхностный IgG на CD19+-клетках. Данные от четырех субъектов, плюс два плацебо, показали, что IdeS эффективно расщеплял IgG-тип BCR у людей, и что частота CD19+-клеток, которые были положительными в отношении поверхностного IgG, постепенно восстанавливалась в течение нескольких дней после введения (фиг. 29).
Обсуждение.
Представленные здесь данные ясно показывают, что IdeS расщепляет IgG-тип BCR и полностью ингибирует BCR-сигналинг в ответ на связывание рецептора. Таким образом, В-клетки с IdeSрасщепленным IgG-типом BCR оказываются неспособными связывать антиген, что приводит к потере основных клеточных событий после связывания рецептора, т.е. интернализации, обработки и представления на молекулах МНС класса II. В-клетки являются очень мощными антигенпредставляющими клетками (Lanzavecchia 1990, Avalos & Plough 2015) и могут с высокой эффективностью представлять антиген на HLA после специфического BCR-опосредованного эндоцитоза, поэтому потеря антигенсвязывающего фрагмента BCR при IdeS-расщеплении может повлиять на представление антигена CD4+ Тклеткам.
Расщепление IgG-типа BCR не оказывает влияния на жизнеспособность клеток ни на клеточных линиях, ни на В-клетках, полученных от здоровых людей (фиг. 22, 23 и 25). Тем не менее, клетки, повидимому, восстанавливаются после обработки несколько медленнее in vivo, чем in vitro (фиг. 29). Из-за очень ограниченного числа клеток, доступных для анализа в испытании фазы 1 на людях, другие Вклеточные маркеры не могли быть исследованы в этом поисковом испытании. Следовательно, не представляется возможным сделать выводы о судьбе какой-либо конкретной субпопуляции В-клеток. Данные согласуются с восстановлением IgG-типа BCR на расщепленных клетках за счет круговорота мембраны, как мы уже видели in vitro, но нельзя исключить, что небольшая задержка в восстановлении, наблюдаемая in vivo, происходит из-за созревания новых В-клеток, а не просто из-за круговорота мембраны.
Результаты, представленные здесь, показывают, что IdeS блокирует развитие IgG-, но не IgA- или IgM-секретирующих клеток, если IdeS используется перед активацией с поликлональной стимуляцией (IL2 и R848). Тем не менее, если IdeS используется позднее, он не имеет никакого блокирующего эффекта. При in vitro стимуляции РВМС в культуре антигены, связанные с BCR, интернализуются и загружаются на молекулы МНС II и представляются Т-клеткам, которые индуцируют пролиферацию и дифференцировку В-клеток (Tangye & Tralington, 2009). При отсутствии антигенной стимуляции, т.е. как в случае, когда IgG-BCR расщепляется под влиянием IdeS, В-клетка не получает второй сигнал и пролиферирует.
Кроме того, это свидетельствует о важной роли комплекса IgG-BCR в ответе на стимуляцию даже в отсутствие антигена, т.е. в поддержании тонизирующего сигнала. Было опубликовано, что мутация одной аминокислоты во внеклеточной области CD79b в BCR приводит к агаммаглобулинемии (Dobbs et al., 2007). Этот факт указывает на то, что взаимодействие между белками в BCR на внеклеточной части имеет важное значение для активации клеток, и мы предполагаем, что взаимодействие между CD79a/b и IgG имеет важное значение для образования надлежащей сигналосомы в ответ на внешние стимулы. Дальнейшее подтверждение этой теории исходит из публикации, касающейся внеклеточного домена CD79b с использованием нелитического антитела (Hardy et al., 2014). Эти авторы обнаружили, что связывание с CD79b приводило к В-клеточной анергии и потере IgG-продуцирующих клеток как in vitro, так и in vivo. Мы полагаем, что разборка BCR путем отщепления F(ab')2-части IgG приводит к невосприимчивости к антигензависимой активации из-за потери надлежащей внутриклеточной сборки белка и образования функциональной сигналосомы.
- 38 039169
IdeS в настоящее время разработан для десенсибилизации высокосенсибилизированных пациентов, находящихся в списке ожидания на трансплантацию почки. У этих пациентов развиваются антитела против большинства доноров и существует мало шансов найти подходящего донора. При удалении донорспецифических антител (DSA) с помощью IdeS перед трансплантацией пациент может получить право на трансплантацию, несмотря на положительный результат перекрестного теста перед началом лечения. Дополнительный эффект введения IdeS заключается в мгновенном образовании свободных F(ab')2фрагментов из DSA с сохраненной связывающей способностью. Эти F(ab')2-фрагменты могут связываться и блокировать эпитопы в трансплантате, и поскольку F(ab')2-фрагменты потеряли свои Fcопосредованные функции, такие как связывание комплемента (CDC), антителозависимая цитотоксичность (ADCC) и антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), то F(abr)2-фрагменты могут иметь возможность блокировать IgM и новообразованные IgG DSA и тем самым обеспечивают дополнительную защиту трансплантата. Представленные здесь результаты показывают, что IdeS также расщепляет IgG-тип BCR на CD27+ В-клетках памяти и делает их неспособными отвечать на антигенную стимуляцию. Таким образом, не только DSA удаляются под влиянием IdeS, но также и DSA-специфические Вклетки памяти изначально не способны отвечать на донорные антигены. Это может потенциально оказывать долгосрочное влияние на исход выживаемости трансплантата, так как исходная активация В-клеток памяти и образование долгоживущих плазматических клеток может повлиять на лечение посредством IdeS.
Ссылки.
Avalos А. М. & Ploegh Н. (2014) Early BCR Events and Antigen Capture, Processing and Loading on MHC Class II on В cells. Front. Immunol. March 10:5.92
Dal Porto JM, Gauld SB, Merrell KT, Mills D, Pugh-Bernard AE, Cambier J. В cell antigen receptor signaling 101. Mol. Immunol. 41(6-7), 599-613 (2004).
Dobbs AK, Yang T, Farmer D, Kager L, Parolini O, Conley ME. (2007) Cutting edge: a hypomorphic mutation in Igbeta (CD79b) in a patient with immunodeficiency and a leaky defect in В cell development. J Immunol. 15; 179(4):2055-9
Hardy I, Anceriz N, Rousseau F, Seefeldt M, Irla M et al. (2014) Anti-CD79 Antibody
Induces В Cell Anergy That Protects against Autoimmunity. J Immunol. 192: 1641-1650
Jahnmatz M, Kesa G, Netterlid E, Buisman AM, Thorstensson R, et al.
(2013) Optimization of a human IgG В-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B- cell responses. J Immunol Methods 391: 50-59
Johansson BP, Shannon O, Bjorck L (2008) IdeS: a bacterial proteolytic enzyme with therapeutic potential. PLoS One 3: e1692
Johnson GL and Lapadat R. (2002). Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science, 298, 1911-1912
Kurosaki T. Regulation of В-cell signal transduction by adaptor proteins. Nat. Rev.
Immunol. 2(5), 354-363 (2002)
Lanzavecchia A. Receptor-mediated antigen uptake and its effect on antigen presentation to class Il-restricted T lymphocytes. Annu Rev Immunol (1990) 8:773-93
Manz R, Hauser A, Hiepe F, Radbruch A. (2005) Maintenance Of Serum Antibody
Levels. Annu. Rev. Immunol. 2005. 23:367-86
Nandakumar KS, Johansson BP, Bjorck L, Holmdahl R (2007) Blocking of experimental arthritis by cleavage of IgG antibodies in vivo. Arthritis Rheum 56: 3253-3260
Rajewsky K. Clonal selection and learning in the antibody system. Nature
1996:381(6585):751-8
Reth M. Antigen receptor tail clue. Nature 338(6214), 383-384 (1989)
- 39 039169
Reth M, Wienands J. Initiation and processing of signals from the В cell antigen receptor. Annu. Rev. Immunol. 15, 453-479 (1997)
Scharenberg AM, Humphries LA, Rawlings DJ. Calcium signalling and cell-fate choice in
В cells. Nat. Rev. Immunol. 7(10), 778-789 (2007)
Stuart G. Tangye and Kim L. Good Human lgM+CD27+ В Cells: Memory В Cells or “Memory” В Cells? The Journal of Immunology, 2007, 179: 13-19
Su YF, Chuang WJ, Wang SM, Chen WY, Chiang-Ni C, Lin YS, Wu J J, Liu CC. (2011) The deficient cleavage of M protein-bound IgG by IdeS: insight into the escape of Streptococcus pyogenes from antibody-mediated immunity. Mol Immunol. 49(1-2):134-42
Tangye & Tralington. (2009) Memory В cells: Effectors of long-lived immune responses.
Eur. J. Immunol. 39: 2065-2075
Tradtrantip L, Asavapanumas N, Verkman AS (2013) Therapeutic cleavage of antiaquaporin-4 autoantibody in neuromyelitis optica by an IgG-selective proteinase. Mol Pharmacol 83: 1268-1275
Vincents B, von Pawel-Rammingen U, Bjorck L and Abrahamson M, (2004). Enzymatic characterization of the streptococcal endopeptidase, IdeS, reveals that it is a cysteine protease with strict specificity for IgG cleavage due to exosite binding. Biochemistry 43: 15540-9 von Pawel-Rammingen U, Johansson В P and Bjorck L, (2002). IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G. EMBO J 21: 1607-15
Wenig K, Chatwell L, von Pawel-Rammingen U, Bjorck L, Huber R and Sondermann P, (2004). Structure of the streptococcal endopeptidase IdeS, a cysteine proteinase with strict specificity for IgG. Proc Natl Acad Sci USA 101: 17371-6
Yang R, Otten MA, Hellmark T, Collin M, Bjorck L, et al. (2010) Successful treatment of experimental glomerulonephritis with IdeS and EndoS, IgG-degrading streptococcal enzymes.
Nephrol Dial Transplant 25: 2479-2486
Пример 4.
Следующее исследование было проведено с целью определения, можно ли нацелить BCR В-клетки, которая была обработана IdeS.
Материалы и методы.
Вкратце, двухступенчатые разведения клеток (Nu-DUL-1, В-клеточная лимфома с IgG-типом BCR; АСС 579 из DSMZ) от 80000/лунка до 1250/лунка в среде R10 (RPMI1640, PEST и 10% FCS) высевали в двух повторах в 96-луночные плоскодонные полистирольные планшеты и использовали в качестве калибратора жизнеспособных клеток. 20000 клеток/лунка высевали в планшет и инкубировали с 30 мкг/мл IdeS или без него при 37°С в СО2-инкубаторе в течение 1 ч. Анти-Fab, анти-Fc или контроль добавляли в тестируемые лунки в конечной концентрации 10 мкг/мл, и планшет инкубировали при 37°С в СО2инкубаторе. Первый планшет удаляли через 3 ч, второй через 24 ч, а третий через 48 ч. После удаления планшета из инкубатора добавляли реагент ССК-8 (из набора для подсчета клеток CCK-8; Dojindo Laboratories, Япония) и продолжали инкубацию в течение 1 ч, а затем с планшета считывали сигнал при длине волны 450 нм в ELISA-планшетном ридере (спектрофотометре). Анализ CCK-8 является чувствительным колориметрическим анализом для определения жизнеспособности клеток в анализах клеточной пролиферации и цитотоксичности. Используемым анти-Fab-агентом был F(ab')2-специфический козлиный F(ab')2-фрагмент (Jackson № 109-006-097, 1,3 мг/мл). Используемым анти-Fе-агентом был Fcспецифическии козлиный F(ab')2-фрагмент (Jackson № 109-006-098, 1,3 мг/мл). Контролем был мышиный γ-глобулин (Jackson № 015-000-002, 11,4 мг/мл). Контроль был выбран так, чтобы он был от того же производителя, что и тестриуемый анти-Fab и анти-Fc, и потому, что мышиный IgG не расщепляется под влиянием IdeS.
- 40 039169
Анти-Fab Анти-FC Контроль IgG
Зч 24 ч 48 ч Зч 24 ч 48 ч Зч 24 ч 48 ч
PBS 25665 18514 7969 21569 8568 3112 21569 23598 24386 Среднее число жизнеспособных клеток
IdeS 25026 29347 25211 23005 9104 979 21569 21583 22469
PBS 1013 288 212 1015 332 446 884 504 1114 Ст. откл.
IdeS 1718 664 355 1940 1780 427 1665 489 374
Результаты и выводы.
Результаты показывают, что сшивание BCR на клетке-мишени, экспрессирующей IgG-тип BCR (в данном случае клеточной линии В-клеточной лимфомы), индуцирует клеточную гибель с использованием антител, направленных против F(ab')2- или Fc-части. Непосредственное применение BCR в качестве мишени, тем не менее, не представляется возможным у людей перед введением IdeS из-за наличия нормальных IgG-уровней (примерно 10 мг/мл) в кровотоке. Тем не менее, предварительное введение IdeS может уменьшить уровни антител, оставшихся в кровотоке, при этом оставляя Fc-фрагмент на клеткахмишенях по-прежнему доступным для терапевтического вмешательства. Нацеливание на Fc-фрагмент после IdeS-расщепления, по меньшей мере, является столь же эффективным на IdeS-обработанных клетках, как на мнимо обработанных клетках. Терапевтическое вмешательство может быть осуществлено с помощью антитела, нацеленного на эпитоп, который создается в BCR как следствие расщепления IdeS, или даже путем нацеливания на общий эпитоп на Fc (как показано здесь). Терапевтическое антитело предпочтительно является таким, которое не расщепляется IdeS и имеет высокую степень Fcэффекторных функций, т.е. CDC, ADCC и ADCP. Антитело также может быть соединено с цитотоксическим агентом, т.е. радиоизотопом или токсином.
Другая возможность обеспечивается значительно более быстрым восстановлением интактных IgG на мембраносвязанном BCR по сравнению с восстановлением IgG в кровотоке. Это дает возможность использовать в качестве мишени F(ab')2-часть, а не только Fc-часть. Восстановление IgG-BCR на Вклетках памяти открывает возможность применения антигенов (связанных с токсинами или радиоизотопами) для специфического нацеливания на В-клетки памяти с определенными нежелательными специфичностями (т.е. против HLA или против инсулина).

Claims (6)

1. Способ увеличения преимуществ терапии для субъекта, который включает: (а) введение субъекту белка, обладающего активностью IgG-цистеинпротеазы, который представляет собой IdeS; и (b) последующее проведение указанной терапии у субъекта, где указанная терапия представляет собой трансплантацию органа;
количество вводимого указанного белка является достаточным для того, чтобы устранить Fcрецепторное связывание, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке крови субъекта; а также этапы (а) и (b) разделены временным интервалом, который является достаточным для устранения Fc-рецепторного связывания, по существу, всеми молекулами IgG, присутствующими в сыворотке крови субъекта, и составляет от 1 ч до не более 6 ч;
где, кроме того, количество вводимого IdeS находится в диапазоне от 0,01 до 1 мг/кг массы тела, и где субъектом является человек.
2. Способ по п.1, в котором указанный белок вводят путем внутривенной инфузии.
3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором временной интервал между этапами (а) и (b) составляет от 1 до 2 ч, от 1 до 3 ч, от 1 до 4 ч, от 1 до 5 ч, от 1 до 6 ч, от 2 до 3 ч, от 2 до 4 ч, от 2 до 5 ч, от 2 до 6 ч, от 3 до 4 ч, от 3 до 5 ч, от 3 до 6 ч, от 4 до 5 ч, от 4 до 6 ч или от 5 до 6 ч.
4. Способ по любому из пп.1-3, где указанная трансплантация органа представляет собой трансплантацию почки, печени, сердца, поджелудочной железы, легкого или тонкого кишечника.
5. Способ по любому из пп.1-4, который также включает этап, проводимый во время или непосредственно перед трансплантацией, который включает индукцию супрессии Т-клеток и/или В-клеток у пациента.
6. Способ по п.5, где указанная индукция супрессии включает введение эффективного количества по меньшей мере одного из муромонаба, базиликсимаба, даклизумаба, антитела против тимоцитарного глобулина (ATG), лимфоцитарного иммуноглобулина, препарата глобулина против тимоцитов (ATGAM) или ритуксимаба.
EA201790192A 2014-07-25 2015-07-10 СПОСОБ СНИЖЕНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ МОЛЕКУЛ СЫВОРОТОЧНОГО IgG У СУБЪЕКТА EA039169B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1413240.1A GB201413240D0 (en) 2014-07-25 2014-07-25 Method
PCT/EP2015/065895 WO2016012285A2 (en) 2014-07-25 2015-07-10 Method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201790192A1 EA201790192A1 (ru) 2017-09-29
EA039169B1 true EA039169B1 (ru) 2021-12-13

Family

ID=51587261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790192A EA039169B1 (ru) 2014-07-25 2015-07-10 СПОСОБ СНИЖЕНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ МОЛЕКУЛ СЫВОРОТОЧНОГО IgG У СУБЪЕКТА

Country Status (19)

Country Link
US (2) US10973889B2 (ru)
EP (1) EP3171891A2 (ru)
JP (1) JP6708641B2 (ru)
KR (2) KR20230119267A (ru)
CN (2) CN114949187A (ru)
AU (1) AU2015294125B2 (ru)
BR (1) BR112017001420A2 (ru)
CA (1) CA2955704A1 (ru)
CL (1) CL2017000191A1 (ru)
CO (1) CO2017000571A2 (ru)
EA (1) EA039169B1 (ru)
GB (1) GB201413240D0 (ru)
HK (1) HK1232122A1 (ru)
IL (1) IL249981B (ru)
MX (1) MX2017001138A (ru)
MY (1) MY196858A (ru)
NZ (1) NZ728265A (ru)
SG (1) SG11201700172WA (ru)
WO (1) WO2016012285A2 (ru)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201502306D0 (en) 2015-02-12 2015-04-01 Hansa Medical Ab Protein
GB201502305D0 (en) 2015-02-12 2015-04-01 Hansa Medical Ab Protein
WO2017210360A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Cardiovax, Llc Methods for diagnosing and treating systemic lupus erythematosus
US10858422B2 (en) 2016-05-31 2020-12-08 Abcentra, Llc Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
US20220259308A1 (en) * 2019-08-01 2022-08-18 Janssen Biotech, Inc. Fcrn antibodies and methods of use thereof
WO2021021989A1 (en) * 2019-08-01 2021-02-04 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cells for improved immunotherapy and uses thereof
AU2021213956A1 (en) 2020-01-28 2022-08-25 Freeline Therapeutics Limited Improved assay for determining neutralising antibody titre to a viral vector
GB202003129D0 (en) * 2020-03-04 2020-04-15 Hansa Biopharma AB Conditioning regimen for transplant of stem cells
GB202007434D0 (en) 2020-05-19 2020-07-01 Hansa Biopharma AB Methods
CN115515631A (zh) * 2020-09-21 2022-12-23 上海宝济药业有限公司 一种药物组合及其应用
US20230374542A1 (en) 2020-10-07 2023-11-23 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy. disorders including limb girdle 21 (lgmd21)
EP4079848A1 (en) 2021-04-22 2022-10-26 Genovis Ab Immunoglobulin cleaving enzyme
WO2023084095A2 (en) 2021-11-15 2023-05-19 Hansa Biopharma AB Methods for enhancing adoptive cell transfer immunotherapies
WO2023175498A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Pfizer Inc. Improved igg-degrading enzymes and methods of use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008071418A2 (en) * 2006-12-13 2008-06-19 Hansa Medical Ab Use of the endoglycosidase endos for treating immunoglobulin g mediated diseases
WO2009033670A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Genovis Ab Method and kits for dissociating fcgamma-receptor-igg complexes and for igg purification and detection
WO2013037824A1 (en) * 2011-09-13 2013-03-21 Genovis Ab Endoglycosidase from streptococcus pyogenes and methods using it
WO2013110946A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Matthew David Max Crispin Combined therapeutic use of antibodies and endoglycosidases

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
JPH0612624B2 (ja) * 1984-06-20 1994-02-16 株式会社日立製作所 半導体集積回路装置
ATE245990T1 (de) * 1996-05-09 2003-08-15 Gen Hospital Corp Gemischter chimerismus und toleranz
ES2380950T3 (es) * 2005-06-09 2012-05-21 Hansa Medical Ab Uso de la proteinasa IdeS ( de S, pyogenes) para tratar enfermedades autoinmunitarias y rechazo de injerto
GB0511769D0 (en) * 2005-06-09 2005-07-20 Hansa Medical Ab Treatment
GB2427360A (en) * 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
TWI626491B (zh) 2012-12-10 2018-06-11 布萊恩荷登視覺協會 用於視力校正之具有一或多個多正焦區域之眼用光學透鏡

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008071418A2 (en) * 2006-12-13 2008-06-19 Hansa Medical Ab Use of the endoglycosidase endos for treating immunoglobulin g mediated diseases
WO2009033670A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Genovis Ab Method and kits for dissociating fcgamma-receptor-igg complexes and for igg purification and detection
WO2013037824A1 (en) * 2011-09-13 2013-03-21 Genovis Ab Endoglycosidase from streptococcus pyogenes and methods using it
WO2013110946A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Matthew David Max Crispin Combined therapeutic use of antibodies and endoglycosidases

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALBERT HEIKE, ET AL: "In vivo enzymatic modulation of IgG glycosylation inhibits autoimmune disease in an IgG subclass-dependent manner.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 105, no. 39, 30 September 2008 (2008-09-30), pages 15005 - 15009, XP002569095, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/PNAS.0808248105 *
Anonymous: "Structural Biochemistry/Proteins/Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA) - Wikibooks, open books for an open world", 29 October 2012 (2012-10-29), XP055248514, Retrieved from the Internet: URL: https://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Proteins/Enzyme-Linked_Immunoabsorbent_Assay_(ELISA) [retrieved on 2016-02-09] the whole document *
Jenny Johansson Söderberg: "The streptococcal IgG degrading enzyme IdeS-studies on host-pathogen interactions", 1 January 2012 (2012-01-01), XP055248265, Retrieved from the Internet: URL: https://www.diva-portal.org/smash/get/diva2:513947/FULLTEXT01.pdf [retrieved on 2016-02-08] figure 4 *
KAVITHA BARUAH; THOMAS A. BOWDEN; BENJAMIN A. KRISHNA; RAYMOND A. DWEK; MAX CRISPIN; CHRISTOPHER N. SCANLAN;: "Selective Deactivation of Serum IgG: A General Strategy for the Enhancement of Monoclonal Antibody Receptor Interactions", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, ACADEMIC PRESS, UNITED KINGDOM, vol. 420, no. 1, 3 April 2012 (2012-04-03), United Kingdom , pages 1 - 7, XP028514772, ISSN: 0022-2836, DOI: 10.1016/j.jmb.2012.04.002 *
KUTTY SELVA NANDAKUMAR, BJÖRN P. JOHANSSON, LARS BJÖRCK, RIKARD HOLMDAHL: "Blocking of experimental arthritis by cleavage of IgG antibodies in vivo", ARTHRITIS & RHEUMATISM, J.B. LIPPINCOTT CO., vol. 56, no. 10, 1 October 2007 (2007-10-01), pages 3253 - 3260, XP055107646, ISSN: 00043591, DOI: 10.1002/art.22930 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2017001138A (es) 2017-06-07
GB201413240D0 (en) 2014-09-10
AU2015294125B2 (en) 2020-10-15
CA2955704A1 (en) 2016-01-28
MY196858A (en) 2023-05-05
US20170209550A1 (en) 2017-07-27
JP2017522384A (ja) 2017-08-10
KR20230119267A (ko) 2023-08-16
CN114949187A (zh) 2022-08-30
JP6708641B2 (ja) 2020-06-10
KR20170039243A (ko) 2017-04-10
EA201790192A1 (ru) 2017-09-29
CO2017000571A2 (es) 2017-06-20
US10973889B2 (en) 2021-04-13
NZ728265A (en) 2024-03-22
AU2015294125A1 (en) 2017-02-02
IL249981B (en) 2022-08-01
IL249981A0 (en) 2017-03-30
WO2016012285A3 (en) 2016-04-14
BR112017001420A2 (pt) 2017-11-28
HK1232122A1 (zh) 2018-01-05
CN106714834A (zh) 2017-05-24
SG11201700172WA (en) 2017-02-27
EP3171891A2 (en) 2017-05-31
KR102565244B1 (ko) 2023-08-10
CL2017000191A1 (es) 2017-08-25
US20210260173A1 (en) 2021-08-26
WO2016012285A2 (en) 2016-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA039169B1 (ru) СПОСОБ СНИЖЕНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ МОЛЕКУЛ СЫВОРОТОЧНОГО IgG У СУБЪЕКТА
US10745274B1 (en) Nucleic acids encoding antibodies specifically binding to MASP-3
Winstedt et al. Complete removal of extracellular IgG antibodies in a randomized dose-escalation phase I study with the bacterial enzyme IdeS–a novel therapeutic opportunity
US20160244511A1 (en) Cross-reactive staphylococcus aureus antibody sequences
Cagigi et al. Vaccine generation of protective Ebola antibodies and identification of conserved B-cell signatures
Mackin et al. Fcγ receptor-dependent antibody effector functions are required for vaccine protection against infection by antigenic variants of SARS-CoV-2
Klaczkowska et al. Heterogeneous Stock Mice are Susceptible to Encephalomyelitis and Antibody‐initiated Arthritis but not to Collagen‐and G6PI‐induced Arthritis
V Suslov Orchestrating HIV neutralization by secondary immune response-mediated induction of RF antibodies
OA19469A (en) Compositions and methods of inhibiting MASP-3 for the treatment of various deseases and disorders.
Islam IgG suppresses antibody responses against surface epitopes of SRBC as well as to proteins in adjuvants, though antibodies specific for the intracellular epitopes of the former are detected