EA034647B1

EA034647B1 - Молекулы антител, связывающие cd22

Info

Publication number: EA034647B1
Application number: EA201890315A
Authority: EA
Inventors: Хелен Маргарет Финни; Стефен Эдвард Рапецки; Керри Луиз Тайсон; Майкл Джон Райт
Original assignee: Юсб Биофарма Спрл
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2020-03-02
Also published as: US20230065921A1; MX2018000470A; HK1252863A1; GB201601077D0; JP2018524007A; EA201890315A1; US10590197B2; EP3322730A1; US20180273620A1; CA2992372A1; AU2016293121A1; US20200157215A1; CL2018000108A1; CN107849140A; BR112018000601A2; CO2018000104A2; WO2017009476A1; IL256846A; US11472879B2; KR20180030656A

Abstract

Описание относится к антителу, которое специфически связывается с CD22, и его вариантам. Заявленное антитело входит в состав композиции для контроля измененных функций B-клеток. Кроме того, заявлена нуклеотидная последовательность, кодирующая указанное антитело, вектор, содержащий указанную нуклеотидную последовательность, а также применение указанных антитела и композиции для терапии аутоиммунных заболеваний и злокачественных новообразований.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет WO 2016/009030 и GB 1601077.9, содержание обеих из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Область изобретения

Настоящее описание относится к молекулам антитела, по меньшей мере, специфическим к антигену CD22, составам, содержащим указанные молекулы антител, и применению любых из них в лечении. Настоящее описание распространяется также на способы получения указанных молекул антител и указанных составов.

Предпосылки изобретения

Биологические механизмы in vivo представляют собой необычайно сложные каскады сигналов, которые сложно распутать и понять. Примером такой передачи сигналов является передача сигналов, необходимая для активации B-клетки. B-клеточный рецептор антигена (BCR) состоит из молекул мембранного иммуноглобулина (mIg) и ассоциированных гетеродимеров (α/β) Igo/IgP (CD79a/CD79b). Субъединицы mIg связывают антиген, что приводит к агрегации рецепторов, в то время как субъединицы α/β передают сигналы во внутреннюю часть клетки. Агрегация BCR быстро активирует киназы Lyn, Blk и Fyn, так же как тирозинкиназы Syk и Btk семейства Src. Это инициирует формирование сигналосомы, состоящей из BCR, вышеупомянутых тирозинкиназ, адаптерных белков, таких как CD19 и BLNK, и ферментов передачи сигнала, таких как PLCy2, PI3K и Vav.

Сигналы, поступающие из сигналосомы, активируют множество каскадов передачи сигналов, вовлекающие киназы, ГТФазы и факторы транскрипции. Это приводит к изменениям метаболизма, экспрессии генов и организации цитоскелета клеток. Сложность передачи сигналов BCR обеспечивает множество различных исходов, включая выживаемость, толерантность (анергию) или апоптоз, пролиферацию и дифференцировку в продуцирующие антитело клетки или B-клетки памяти. Исход ответа определяется состоянием созревания клетки, природой антигена, амплитудой и продолжительностью передачи сигналов BCR и сигналов от других рецепторов, таких как CD40, рецептор IL-21 и BAFF-R.

Множество других трансмембранных белков, некоторые из которых являются рецепторами, модулируют специфические элементы передачи сигналов BCR. Немногие из них включают в себя CD45, CD19, CD22, PIR-B и FcyRIIB1 (CD32). Амплитуда и продолжительность передачи сигналов BCR ограничены посредством петель отрицательной обратной связи, включая петли, вовлеченные в путь Lyn/CD22/SHP-1, путь Cbp/Csk, SHIP, Cbl, Dok-1, Dok-3, FcyRIIB1, PIR-B и интернализацию BCR. In vivo B-клетки часто активируются антигенпредставляющими клетками, которые захватывают антигены и экспонируют их на поверхности клеток. Активация B-клеток посредством таких ассоциированных с мембраной антигенов требует индуцированной BCR реорганизации цитоскелета.

Аутореактивные B-клетки являются ответственными за продукцию патогенных аутоантител, которые могут либо напрямую, либо опосредованно вызывать или обострять аутоиммунные состояния. Истощение положительных по CD20 B-клеток использовали для успешного лечения ряда аутоиммунных состояний, и, таким образом, достоверно установлено, что B-клетки играют важную роль в вызове или поддержании ряда аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, рассеянный склероз и сахарный диабет типа I. Несмотря на то, что истощение B-клеток являлось успешным терапевтическим вариантом, существует также доказательство, что контроль роста и статуса активации B-клеток также может являться эффективным способом модулировать функцию B-клеток. Альтернативные способы, которые не истощают B-клетки и обеспечивают гибкость контроля B-клеток без долгосрочной супрессии иммунитета B-клеток, которая, как показано, ассоциирована с некоторыми побочными эффектами, таким образом, являются желательными. Кроме того, не все ответы или активности B-клеток являются опасными, и доказательства позволяют предполагать, что сохранение популяций регуляторных B-клеток может являться защитным. Такой способ должен является эффективным при заболеваниях, обладающих аномальным функционированием B-клеток, вызванных неприемлемой или избыточной передачей сигналов BcR. Примеры таких заболеваний включают в себя, но без ограничения, воспаление, аутоиммунитет и злокачественные опухоли. Особенный интерес представляют заболевания, которые либо обладают непосредственными требованиями передачи сигналов BcR, либо требуют ингибирования или стимуляции гуморальных иммунных ответов.

Совместное связывание рецептора IIb Fc-γ (CD32b) с B-клеточным рецептором происходит для природной регуляции передачи сигнала, в частности, когда антиген является связанным с антителом в небольших иммунных комплексах. Затем CD32b привлекает фосфатазы SHP-1 и SHIP-1, проявляющие антагонизм активации BcR. Несмотря на то, что этот регуляторный механизм может контролировать функцию B-клеток, нарушение функции CD32b, вызванное вариантом белковой последовательности CD32b, может приводить к аутоиммунному заболеванию, и этот рецептор может подвергаться понижающей регуляции при аутоиммунных заболеваниях, например, как в случае SLE. Альтернативные способы блокирования активности B-клеток, таким образом, являются желательными, поскольку они предлагают альтернативные, неприродные способы регуляции функции BcR. Эти альтернативные механизмы, вероятно, являются особенно важными, когда природные механизмы являются нефункциональными при данном заболевании.

CD22 представляет собой ингибирующий корецептор B-клеточного рецептора (BCR) и играет кри

- 1 034647 тическую роль в установке порогов передачи сигналов для активации B-клеток. Нацеливание на CD22 индуцирует физическую понижающую регуляцию компонентов комплекса BCR на покоящихся клетках, что, вероятно, может приводить к менее отвечающим B-клеткам, так же как ограничение степени передачи сигналов BCR после привлечения BCR. Общим эффектом является ингибирование активации Bклеток, в конечном счете уменьшающие количество последующих аутоиммунных и воспалительных событий, опосредуемых B-клетками. Таким образом, модуляция функции CD22 посредством антител может предоставлять терапевтические преимущества при множестве заболеваний, зависимых от активации B-клеток, включая аутоиммунитет, иммунодефицит и злокачественные новообразования (см., например, CD22: CD22: an inhibitory enigma. Immunology. 2007. Vol. 123: 314-325). Настоящее описание относится к ряду молекул антител, специфических для CD22, которые можно применять отдельно или в комбинации с такими молекулами, как антитело или его связывающий фрагмент, специфические для дополнительного рецептора поверхности B-клеток (такого как CD79), который можно использовать для контроля измененных функций B-клеток, например ассоциированных с конкретными заболеваниями, такими как аутоиммунитет и злокачественная опухоль.

Краткое изложение сущности описания

Таким образом, представлена молекула антитела, содержащая

GX^FSXsX^XsXvXg (SEQ ID NO: 1) _r где X₁ представляет собой F, I или L (например, F), X₂ представляет собой S или D, X₃ представляет собой S, N или G (например, S), X₄ представляет собой S, Y, L или G, X₅ представляет собой Y или отсутствует, X₆ представляет собой W, Y или D (например, W или Y, в частности Y), X₇ представляет собой M или I, и X₈ представляет собой C или S (в частности, S);

CDRH2 формулы (II)

X₉IX₁₀X₁₁X₁₂Xi3Xi4Xi5Xi6TX₁₇YAX₁₈WAKG (SEQ ID NO: 2), где Х₉ представляет собой C или S, X₁₀ представляет собой Y, D, V или N, X₁₁ представляет собой T, P, I, G, S или A, X₁₂ представляет собой G, S или A (в частности, G), X₁₃ представляет собой S, I или T, X₁₄ представляет собой S, N или отсутствует, X₁₅ представляет собой G, D, S, A или T, X₁₆ представляет собой D, T, S, N, V или G, X₁₇ представляет собой Y, D или A, и X₁₈ представляет собой T или S (в частности, S).

CDHR3 формулы (III)

X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33L (SEQ ID NO: 3) , где X₁₉ представляет собой A или отсутствует, X₂₀ отсутствует, представляет собой G или Y, X₂₁ отсутствует, представляет собой P или G, X₂₂ отсутствует, представляет собой Y, S, D или E, X₂₃ представляет собой V, G, Y или W, X₂₄ представляет собой G, Y, S или V, X₂₅ представляет собой Y, S, G или N, X₂₆ представляет собой G, A, S или T, X₂₇ представляет собой Y, G или D, X₂₈ представляет собой D, I, Y, W или H, X₂₉ представляет собой L, G, S, Y или K, X₃₀ представляет собой V, Q, C, S, G, T или D, X₃₁представляет собой Y, A или R, X₃₂ представляет собой L или F, X₃₃ представляет собой N, Y или D (в частности, D);

и вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDRL1, CDRL2 и CDL3 из зайцеобразного, в частности, вариабельный домен легкой цепи, содержащий человеческую каркасную область и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 из зайцеобразного.

В одном варианте осуществления CDRL1 обладает формулой (IV) СХ₃43Хз₅ХзбХз7Хз8Хз9Х4оХ41Х42ЬХ₄з (SEQ ID NO: 4), где X₃₄ представляет собой A или S (в частности, A), X₃₅ представляет собой Q или E (в частности, Q), X₃₆ представляет собой S, N или T (в частности, S), X₃₇ представляет собой I или V, X₃₈ представляет собой S, Y или G (например, S или Y), X₃₉ представляет собой T, S, G или N (например, S или N), X₄₀представляет собой A, G, N, Y, T или R, X₄₁ отсутствует, представляет собой N или K (в частности, отсутствует), X₄₂ отсутствует, представляет собой E или D (в частности, отсутствует), и X₄₃ представляет собой A или S (в частности, A);

CDRL2 обладает формулой (V)

X44X45SX46LX47S (SEQ ID NO: 5) , где X₄₄ представляет собой G, Y, L, A или S, X₄₅ представляет собой A, S или T (в частности, A), X₄₆представляет собой T, R или K (в частности, T) и X₄₇ представляет собой A или S (в частности, A);

CDRL3 обладает формулой (VI)

AGYKSX₄₈X49DX5oX₅iTT (SEQ ID NO: 6) где X₄₈ представляет собой D или E (в частности, D), X₄₉ представляет собой S, A или T, X₅₀ представляет собой D или E (в частности, D) и X₅₁ представляет собой G, A или S; или

CDRL3 обладает формулой (VII)

QX52X53X54X55X56SX57X58X59X60X61X62X63X64 (SEQ ID NO: 7) , где X₅₂ представляет собой S, I или G (например, S или G), X₅₃ представляет собой Y, Н или G (в частности, Y), X₅₄ представляет собой Y, D или F (в частности, Y), X₅₅ представляет собой G, S или Y (например, S или Y), X₅₆ представляет собой T, A или S (в частности, S), X₅₇ представляет собой S, G, V

- 2 034647 или D, X₅₈ представляет собой G, S, L или отсутствует, X₅₉ представляет собой G, R, S или N, X₆₀ представляет собой S, D или V (например, S или D), X₆₁ представляет собой W, Y или отсутствует (например, W или Y), X₆₂ представляет собой A, Т, G или отсутствует, X₆₃ представляет собой N или отсутствует (в частности, отсутствует), X₆₄ представляет собой A или отсутствует (в частности, отсутствует).

В одном варианте осуществления последовательность формулы (I) является такой, как показано в формуле (Ia)

GXiX₂FSX₃X4X5YX₇X8 (SEQ ID NO: 8), где X₁, X₂, X₃, X4, X₅, X₇ и X₈ являются такими, как определено выше для формулы I, в частности представляют собой последовательность формулы (Ib)

GXiX₂FSX3X₄X₅YX7S (SEQ ID NO: 9), где X₁, X₂, X₃, X4, X₅ и X₇ являются такими, как определено выше для формулы I.

В одном варианте осуществления последовательность формулы (II) является такой, как показано в формуле (IIa)

X₉IX₁₀XiiGX₁₃Xi4X₁5X₁₆TX₁₇YAX₁₈WAKG (SEQ ID NO: 10), где X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇ и X₁₈ являются такими, как определено выше для формулы II.

В одном варианте осуществления последовательность формулы (II) является такой, как показано в формуле (IIb)

X₉IXioXiiXi₂Xi3Xi4Xi5Xi6TXi₇YASWAKG (SEQ ID NO: 11), где X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆ и X₁₇ являются такими, как определено выше для формулы II, в частности представляют собой последовательность формулы (IIb), где X₁₂ представляет собой G.

В одном варианте осуществления последовательность формулы (III) является такой, как показано в формуле (IIIa)

X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32DL (SEQ ID NO: 12), где X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂, X₂₃, X₂₄, X₂₅, X₂₆, X₂₇, X₂₈, X₂₉, X₃₀, X₃₁ и X₃₂ являются такими, как определено выше для формулы III.

В одном варианте осуществления последовательность формулы (IV) является такой, как показано в формуле (IVa)

QASX35X36X37X38X39X40X41X42LX43 (SEQ ID NO: 13), где X₃₅, X₃₆, X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀, X₄₁, X₄₂ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV; в частности представляют собой последовательность формулы (IVb)

QASQX₃₆X₃7X3₈X39X4oX4iX42LX43 (SEQ ID NO: 14), где X₃₆, X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀, X₄₁, X₄₂ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV; в частности представляют собой последовательность формулы (IVc)

QASQSX₃₇X₃8X39X4oX41X42LX43 (SEQ ID NO: 15), где X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀, X₄₁, X₄₂ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV; в частности представляют собой последовательность формулы (IVd)

QASQSX₃₇X₃8X39X4oX42LX₄3 (SEQ ID NO: 16), где X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀, X₄₂ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV; в частности представляют собой последовательность формулы (IVe)

QASQSX₃₇X₃₈X₃₉X₄₀LX₄₃ (SEQ ID NO: 17), где X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV; в частности представляют собой последовательность формулы (IVf)

QASQSX₃₇X₃₈X₃₉X₄₀LA (SEQ ID NO: 18) , где X₃₇, X₃₈, X₃₉, и X₄₀ являются такими, как определено выше для формулы IV.

В одном варианте осуществления последовательность формулы (V) является такой, как показано в формуле (Va)

X44ASX46LX47S (SEQ ID NO: 19), где X₄₄, X₄₆ и X₄₇ являются такими, как определено выше для формулы V; в частности представляют собой последовательность формулы (Vb)

X44ASX46LAS (SEQ ID NO: 20), где X₄₄ и X₄₆ являются такими, как определено выше для формулы V; в частности представляют собой последовательность формулы (Vc)

X44ASTLAS (SEQ ID NO: 21), где X₄₄ является такой, как определено выше для формулы V. В одном варианте осуществления последовательность формулы (VI) является такой, как показано в формуле (VIa)

AGYKSX48X49DX50X51TT (SEQ ID NO: 22), где X₄₈, X₄₉, X₅₀ и X₅₁ являются такими, как определено выше для формулы VI; в частности представляют собой последовательность формулы (VIb)

AGYKSDX₄₉DDX₅₁TT (SEQ ID NO: 23) где X₄₉ и X₅₁ являются такими, как определено выше для формулы VI.

- 3 034647

В одном варианте осуществления последовательность формулы (VII) является такой, как показано в формуле (VIIa)

QX52YX54X55X56SX57X58X59X60X61X62X63X64 (SEQ ID NO: 24), где X₅₂, X54, X55, X₅₆, X57, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂, X₆₃ и X₆₄ являются такими, как определено выше для формулы VII; в частности представляют собой последовательность формулы (VIIb)

QX52YYX55X56SX57X58X59X60X61X62X63X64 (SEQ ID NO: 25), где X₅₂, X₅₅, X₅₆, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂, X₆₃ и X₆₄ являются такими, как определено выше для формулы VII; в частности представляют собой последовательность формулы (VIIc)

QX₅₂YYX55SSX57X58X59X6oX61X62X₆3X64 (SEQ ID NO: 26), где X₅₂, X₅₅, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂, X₆₃ и X₆₄ являются такими, как определено выше для формулы VII; в частности представляют собой последовательность формулы (VIId)

QX52YYX55SSX57X58X59X60X61X62X64 (SEQ ID NO: 27), где X₅₂, X₅₅, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂ и X₆₄ являются такими, как определено выше для формулы VII; в частности представляют собой последовательность формулы (VIIe)

QX₅2YYX55SSX₅7X58X59X₆oX61X62 (SEQ ID NO: 28), где X₅₂, X₅₅, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁ и X₆₂ являются такими, как определено выше для формулы VII.

Примеры CDR, попадающих под определение формул (I), (II) и (III), представлены следующим образом:

SEQ

ID

NO:

GFSFSSSYYMC

GFSFSSSYYMS GIDFSSYYYMC GIDFSSYYYMS GFSFSNLYYMC GFSFSNLYYMS GLDFSSYWIC GLDFSSYWIS

(например,	в	качестве	CDRH1)
(например,	в	качестве	CDRH1)
(например,	в	качестве	CDRH1)
(например,	в	качестве	CDRH1)
(например,	в	качестве	CDRH1)
(например,	в	качестве	CDRH1)

(например, в качестве CDRH1) (например, в качестве CDRH1)

SEQ SEQ SEQ SEQ	ID NO: 37 ID NO: 38 ID NO: 39	GFDFSGGYDIS (например, GFSFSSSYWIC (например, GFSFSSSYWIS (например,	в качестве в качестве в качестве (например,	CDRH1) CDRH1) CDRH1)
ID	NO:	40	CIYTGSSGDTYYASWAKG	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	41	SIYTGSSGDTYYASWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	42	CIDPASSGTTYYATWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	43	SIDPASSGTTYYATWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	44	CIDISSSGSTYYASWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	45	SIDISSSGSTYYASWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	46	СIVTGS S DNTYYASWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	47	SIVTGSSDNTYYASWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	48	CIYGGINSVTDYASWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	49	CIYGGINAVTDYASWAKG	(например,	в	качестве
CDRH2) SEQ	ID	NO:	50	CIYGGINTVTDYASWAKG	(например,	в	качестве

CDRH2)

- 4 034647

SEQ ID NO: 51

CDRH2)

SEQ ID NO: 52

CDRH2)

SEQ ID NO: 53

CDRH2)

SEQ ID NO: 54

CDRH2)

SEQ ID NO: 55

CDRH2)

SEQ ID NO: 56

CDRH2)

SEQ ID NO: 57

CDRH2)

SEQ ID NO: 58

CDRH2)

SEQ ID NO: 59

CDRH2)

SIYGGINSVTDYASWAKG

SIYGGINAVTDYASWAKG

SIYGGINTVTDYASWAKG CINSGTGGTAYASWAKG СINAGTGGTAYASWAKG CINTGTGGTAYASWAKG SINSGTGGTAYASWAKG SINAGTGGTAYASWAKG SINTGTGGTAYASWAKG (например, в качестве (например, в качестве (например, в качестве (например, в качестве (например, в качестве (например, в качестве (например, в качестве (например, в качестве (например, в качестве

SEQ ID NO: 60 GPYVGYGYDLQYLYL (например, в качестве CDRH3)

SEQ ID NO: 61 AYGSGGSGYIGCYFDL (например, в качестве CDRH3)

SEQ ID NO: 62 AYGSGGSGYIGSYFDL (например, в качестве CDRH3)

SEQ ID NO: 63 DYYSSDWGVRFNL (например, в качестве CDRH3)

SEQ ID NO: 64 GGGAGYSGAFDL (например, в качестве CDRH3)

SEQ ID NO: 65 DVSNSDHYTRLDL (например, в качестве CDRH3)

SEQ ID NO: 66 DVSNADHYTRLDL (например, в качестве CDRH3)

SEQ ID NO: 67 DVSNTDHYTRLDL (например, в качестве CDRH3)

SEQ ID NO: 68 EWVSGYYKDAFDL (например, в качестве CDRH3)

Примеры CDR, попадающих под определение формул (IV), (V), (VI) и (VII), представлены следующим образом:

SEQ

ID

NO:

QASQSISTALA (например, в качестве CDRL1)

SEQ

ID

NO:

QASQNIGSGLA (например, в качестве варианта 1

CDRL1)

SEQ

ID

NO:

QASQSVYGNNELS (например, в качестве варианта

CDRL1)

SEQ

ID

NO:

QASESISNYLS (например, в качестве варианта 3

CDRL1)

- 5 034647

SEQ ID NO: 73 QSSQSVYNTKDLA (например, в качестве варианта 4 CDRL1)

SEQ ID NO: 74 QASETISSRLA (например, в качестве варианта 5 CDRL1)

SEQ ID NO: 75 GASTLAS (например, в качестве CDRL2)

SEQ	ID	NO:	76	YASTLAS	(например,	в	качестве	варианта	1
CDRL2) SEQ	ID	NO:	77	LASRLAS	(например,	в	качестве	варианта	2
CDRL2) SEQ	ID	NO:	78	ASSKLSS	(например,	в	качестве	варианта	3
CDRL2) SEQ	ID	NO:	79	GTSTLAS	(например,	в	качестве	варианта	4
CDRL2) SEQ	ID	NO:	80	SASTLAS	(например,	в	качестве	варианта	5

CDRL2)

SEQ ID NO:	81 QSYYGTSSGGSWA (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	82 QSHDYSSVRSYGNA (например, в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	83 AGYKSDSDDGTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	84 AGYKSESDDGTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	85 AGYKSDADDGTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	86 AGYKSDTDDGTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	87 AGYKSDSDEGTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	88 AGYKSDSDDATT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	89 AGYKSDSDDSTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	90 AGYKSESDEGTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	91 AGYKSESDDATT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	92 AGYKSESDDSTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	93 AGYKSDADEGTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	94 AGYKSDADDATT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	95 AGYKSDADDSTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	96 AGYKSDTDEGTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	97 AGYKSDTDDATT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	98 AGYKSDTDDSTT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	99 QIYYSASGSRDWT (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	100 QGGFSSSDLNV (например,	в качестве CDRL3)
SEQ ID NO:	101 QGYYYSSGSDYG (например,	в качестве CDRL3)

В одном примере настоящее изобретение относится к антителам против CD22, описанным в настоящем документе, в любом подходящем формате антител. Соответственно, в одном примере настоящее изобретение относится к антителам против CD22 или их фрагментам, содержащим один или несколько из связывающих доменов, описанных в настоящем документе, содержащих CDR, представленные в настоящем документе выше и на фиг. 35, включая CDR кролика, происходящие из следующих антител: антитела 4120, антитела 4126, антитела 4127, антитела 4128, антитела 4130 или антитела 4132. Указанные CDR можно включать в любой подходящий каркас антитела и в любой подходящий формат антитела. Такие антитела включают в себя полноразмерные антитела и их функционально активные фрагменты или производные, которые могут представлять собой, но без ограничения, моноклональные, гуманизированные, полностью человеческие или химерные антитела. Соответственно, такие антитела могут содержать полную молекулу антитела, обладающую полноразмерными тяжелой и легкой цепями или их фрагментами, и могут представлять собой, но без ограничения Fab, модифицированный Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, однодоменные антитела, scFv, двух-, трех- или четырехвалентные антитела, бис-scFv, диатела, триотела, тетратела и эпитопсвязывающие фрагменты любых из вышеуказанных (см., например, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Способы получения и изготовления этих фрагментов антител хорошо известны в данной области (см., например, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Мультивалентные антитела могут обладать множественной специфичностью или они могут являться моноспецифическими (см., например, WO 92/22853 и WO 05/113605). Следует понимать, что этот аспект по изобретению также распространяется на варианты этих антител против CD22, включая гуманизированные варианты и модифицированные варианты, включая те, в которых аминокислоты подвергали мутации в CDR для удаления одного или нескольких участков изомеризации, дезамидирования, гликозилирования или остатка цистеина, как описано в настоящем документе выше.

Таким образом, в одном примере представлена молекула антитела против CD22 по настоящему

- 6 034647 описанию, (например, антитело или его связывающий фрагмент), содержащая тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, обладающие вариабельной областью, где указанная вариабельная область содержит одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 1, 8 или 9, SEQ ID NO: 2, 10 или 11 и SEQ ID NO: 3 или 12, например, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 1, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 2 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 3.

Таким образом, один вариант осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 1, 8 или 9, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 2; или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 1, 8 или 9, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 10; CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 1, 8 или 9, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 11; или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 1, 8 или 9, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 3; или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 1, 8 или 9, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 12; или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 2, 10 или 11, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 3; или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 2, 10 или 11, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 12.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, обладающие вариабельной областью, например содержащие одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 29-68, в частности, где CDR H1 обладает последовательностью, независимо выбранной из SEQ ID NO: 29-39, CDR H2 обладает последовательностью, независимо выбранной из SEQ ID NO: 40-59, и CDR H3 обладает последовательностью, независимо выбранной из SEQ ID NO: 60-68.

В одном примере представлена молекула антитела против CD22 по настоящему описанию (например, антитело или его связывающий фрагмент), содержащие тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, обладающие вариабельной областью, где указанная вариабельная область содержит одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 29, 30, 40, 41 и 60, например, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29 или 30, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40 или 41 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29 или 30, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40 или 41; или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29 или 30, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60; или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40 или 41 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40; или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60; или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60.

В другом варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 30, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 41, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 30, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 41, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60.

В другом варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 41.

В одном примере представлена молекула антитела против CD22 по настоящему описанию (например, антитело или его связывающий фрагмент), содержащая тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, обладающие вариабельной областью, где указанная вариабельная область содержит одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 31, 32, 42, 43, 61 и 62, например, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31 или 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31 или 32, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43; или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31 или 32, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62; или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62. Таким образом, в одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61. В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61. В другом варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61. В другом варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, и CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 43, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62.

- 7 034647

В одном примере представлена молекула антитела против CD22 по настоящему описанию (например, антитело или его связывающий фрагмент), содержащая тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, обладающие вариабельной областью, где указанная вариабельная область содержит одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 33, 34, 44, 45, и 63, например, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63. Таким образом, в одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33, и CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 44, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63. В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63.

В другом варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63. В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45.

В одном примере представлена молекула антитела против CD22 по настоящему описанию (например, антитело или его связывающий фрагмент), содержащая тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, обладающие вариабельной областью, где указанная вариабельная область содержит одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 35, 36, 46, 47 и 64, например, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35 или 36, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 46 или 47, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35 или 36, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 46 или 47, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35 или 36, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 46 или 47, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64. Таким образом, в одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35, и CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 46, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 46, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 47, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 36, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 47, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64. В другом варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 36, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 46, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 36, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 47.

В одном примере представлена молекула антитела против CD22 по настоящему описанию (например, антитело или его связывающий фрагмент), содержащая тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, обладающие вариабельной областью, где указанная вариабельная область содержит одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 37, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 65, 66 и 67, например, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52 или 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, 66 или 67.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52 или 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, 66 или 67.

Таким образом, в одном варианте осуществления

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52, 53, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 49, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 50, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 51, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 52, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 53, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO; 66, или

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52, 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65.

- 8 034647

CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 48, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 49, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 49, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 49, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В другом варианте осуществления

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 50, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 50, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 50, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В другом варианте осуществления

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 51, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 51, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 51, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В другом варианте осуществления

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 52, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 52, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 52, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В другом варианте осуществления

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 49, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 50, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 51, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 52, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 49, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 50, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 51, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 52, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 66.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 49, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 50, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 51, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 52, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 53, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 67.

В одном примере представлена молекула антитела против CD22 по настоящему описанию (например, антитело или его связывающий фрагмент), содержащая тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, обладающие вариабельной областью, где указанная вариабельная область содержит одну, две или три

- 9 034647

CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 38, 39, 54, 55, 56, 57, 58, 59 и 68, например, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38 или 39, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58 или 59, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38 или 39, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59 или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38 или 39, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

В одном варианте осуществления

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 54, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 55, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 56, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 57, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 58, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 59.

В одном варианте осуществления

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 39, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 68.

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 39, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 54, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 39, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 55, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 39, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 56, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 39, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 57, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 39, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 58, или CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 39, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 59.

В одном варианте осуществления

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 54, и CDRH3 представляет собой SEQ ID NO: 68, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 55, и CDRH3 представляет собой SEQ ID NO: 68, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 56, и CDRH3 представляет собой SEQ ID NO: 68, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 57, и CDRH3 представляет собой SEQ ID NO: 68, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 58, и CDRH3 представляет собой SEQ ID NO: 68, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 59, и CDRH3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

В одном варианте осуществления

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 54, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 55, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 56, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 57, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 58, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38, и CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 59, и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

В одном варианте осуществления вариабельную область тяжелой цепи из перечисленных выше применяют в комбинации с вариабельной областью легкой цепи из перечисленных в настоящем документе.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию дополнительно содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 69-101, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, независимо выбранной из SEQ ID NO: 69-74, CDR L2 обладает последовательностью, независимо выбранной из SEQ ID NO: 75-80, и CDR L3 обладает последовательностью, независимо выбранной из SEQ ID NO: 81-101.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 69, 75 и 81, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 69, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 75, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 81.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, и CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81; или CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

- 10 034647

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 70, 76 и 82, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 70, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 76, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 82.

Таким образом в одном варианте осуществления CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, и CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76; или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82; или CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например, содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 71, 77, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 и 98, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 71, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 77, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 и 98.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77; или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98; или CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

В одном варианте осуществления

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 84, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 85, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 86, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 87, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 88, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 89, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 90, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 91, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 92, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 93, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 94, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 95, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 96, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 97, или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 98.

В одном варианте осуществления

CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, или CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 84, или CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 85, или CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 86, или CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 87, или CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 88, или CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 89, или CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 90, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 91, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 92, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 93, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 94, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 95, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 96, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 97, или CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 98.

В одном варианте осуществления

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 84, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 85, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3

- 11 034647 представляет собой SEQ ID NO: 86, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 87, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 88, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 89, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 90, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 91, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 92, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 93, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 94, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 95, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 96, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 97, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 98.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например, содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 72, 78 и 99, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 72, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 78, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 99.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 72, и CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 78; или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 72, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 99; или CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 78, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 99.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например, содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 73, 79 и 100, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 73, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 79, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 100.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 73, и CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 79; или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 73, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 100 или CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 79, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 100.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например, содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 74, 80 и 101, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 74, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 80, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 101.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 74, и CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 80 или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 74, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 101 или CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 80, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 101.

В одном примере молекулы антител по настоящему описанию (например, антитела или связывающий фрагменты) содержат последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 29-101, например, где CDR H1 независимо выбрана из SEQ ID NO: 29-39, CDR Н2 независимо выбрана из SEQ ID NO: 40-59, CDR H3 независимо выбрана из SEQ ID NO: 60-68, CDR L1 независимо выбран из SEQ ID NO: 69-74, CDR L2 независимо выбрана из SEQ ID NO: 75-80, и CDR L3 независимо выбрана из SEQ ID NO: 81-101.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29 или 30, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40 или 41, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29, CDR H2 представля

- 12 034647 ет собой SEQ ID NO: 40 или 41, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 30, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40 или 41, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29 или 30, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29 или 30, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 41, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29, CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 41, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 30, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 30, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 41, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31 или 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43 или, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43 CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ

- 13 034647

ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43 или, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43 CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

83.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2

- 14 034647 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

83.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83.

84.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 84.

84.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 84.

85.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 85.

85.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 85.

86.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID

- 15 034647

NO: 86.

86.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 86.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 86.

87.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 87.

87.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 87.

88.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 88.

88.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 88.

89.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 89.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, CDR H2 представля

- 16 034647 ет собой SEQ ID NO: 44 или 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

89.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 89.

90.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77 и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 90.

90.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 90.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 90.

91.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 91.

91.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 91.

92.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 92.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID nO: 44 или 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 92.

- 17 034647

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 92.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 93.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 93.

93.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 93.

94.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 94.

94.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 94.

95.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 95.

95.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет

- 18 034647 собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 95.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 95.

96.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 96.

96.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 96.

97.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 97.

97.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 97.

98.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 98.

98.

- 19 034647

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 98.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35 или 36, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 46 или 47, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 72, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 78, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 99.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 46 или 47, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 72, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 78, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

99.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например, содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 69, 75 и 81, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 69, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 75, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 81.

В одном примере молекула антитела по настоящему описанию содержит легкую цепь или фрагмент легкой цепи, обладающие вариабельной областью, например, содержащей одну, две или три CDR, независимо выбранные из SEQ ID NO: 70, 76 и 82, в частности, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 70, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 76, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 82.

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, и CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76; или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82; или CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 88, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 89, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 90, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 91, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 92, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 93, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 94, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 95, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 96, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 97, или

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 98.

В одном варианте осуществления

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 84, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 85, или

- 20 034647

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 86, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 87, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 88, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 89, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 90, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 91, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 92, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 93, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 94, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 95, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 96, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 97, или

CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 98.

В одном варианте осуществления

CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 86, или

Таким образом, в одном варианте осуществления CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 73, и CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 79; или CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 73, и CDR L3

- 21 034647 представляет собой SEQ ID NO: 100 или CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 79, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 100.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40 или 41, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

81.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 41, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43 или, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет

- 22 034647 собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR Н2 представляет собой SEQ ID NO: 42, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 43, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 62, CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

- 23 034647

83.

84.

85.

- 24 034647 собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 85.

85.

86.

87.

88.

- 25 034647

88.

89.

90.

91.

В одном варианте осуществления CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45, CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63, CDR L1 представляет собой

- 26 034647

SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO:

91.

92.

93.

94.

- 27 034647

95.

96.

97.

- 28 034647 собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77, и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 97.

98.

99.

Fab-ds-scFv - одиночный линкер - Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab-scFv одиночный линкер - Fv, где scFv содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

Fab'-scFv - одиночный линкер - Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab' - одиночный линкер - Fv, где домен Fv связан с тяжелой или легкой цепью Fab, и scFv связан с другой цепью Fab, и домены Fv соединены посредством дисульфида между вариабельными областями.

Fab'-ds-scFv - одиночный линкер - Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab'scFv одиночный линкер - Fv, где scFv содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

FvFabFv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab с доменами первого Fv, добавленными к N-концу тяжелой и легкой цепи Fab, и доменами второго Fv, добавленными к C-концу тяжелой и легкой цепи.

FvFab'Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab' с доменами первого Fv, добавленными к N-концу тяжелой и легкой цепи Fab', и доменами второго Fv, добавленными к C-концу тяжелой и легкой цепи.

ds-FvFabFv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab с доменами первого Fv, добавленными к N-концу тяжелой и легкой цепи Fab, где первый Fv содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области, и с доменами второго Fv, добавленными к C-концу тяжелой и легкой цепи.

FvFab-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab с доменами первого Fv, добавленными к N-концу тяжелой и легкой цепи Fab, и с доменами второго Fv, добавленными к C-концу тяжелой и легкой цепи, и где второй Fv содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

ds-FvFab'Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab' с доменами первого Fv, добавленными к N-концу тяжелой и легкой цепи Fab', где первый Fv содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области, и с доменами второго Fv, добавленными к C-концу тяжелой и легкой цепи.

FvFab'-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab' с доменами первого Fv, добавленными к N-концу тяжелой и легкой цепи, и с доменами второго Fv, добавленными к C-концу тяжелой и легкой цепи Fab', и где второй Fv содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

ds-FvFabds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab с доменами первого Fv, добавленными к N-концу тяжелой и легкой цепи Fab, где первый Fv содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области, и с доменами второго Fv, добавленными к C-концу тяжелой и легкой цепи, и где

- 29 034647 второй Fv также содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

ds-FvFab'-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к Fab' с доменами первого Fv, добавленными к N-концу тяжелой и легкой цепи Fab', где первый Fv содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области, и с доменами второго Fv, добавленными к C-концу тяжелой и легкой цепи, и где второй Fv также содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

FabFvFv, как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту Fab с двумя парами Fv, добавленными в сериях к C-концу тяжелой и легкой цепи, см., например, WO 2011/086091.

Fab'FvFv, как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту Fab' с двумя парами Fv, добавленными в сериях к C-концу тяжелой и легкой цепи, см., например, WO 2011/086091.

Fab-ds-FvFv, как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту Fab с двумя парами Fv, добавленными в сериях к C-концу тяжелой и легкой цепи, см., например, WO 2011/086091, где первая пара Fv, присоединенная непосредственно к C-концу, содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

Fab'-ds-FvFv, как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту Fab' с двумя парами Fv, добавленными в сериях к C-концу тяжелой и легкой цепи, см., например, WO 2011/086091, где первая пара Fv, присоединенная непосредственно к C-концу, содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

FabFv-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту Fab с двумя парами Fv, добавленными в сериях к C-концу тяжелой и легкой цепи, где вторая пара Fv на С'-конце молекулы содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

Fab'Fv-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту Fab' с двумя парами Fv, добавленными в сериях к С-концу тяжелой и легкой цепи, где вторая пара Fv на С-конце молекулы содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

Fab-ds-Fv-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту Fab с двумя парами Fv, добавленными в сериях к C-концу тяжелой и легкой цепи, где первая и вторая пары Fv содержат дисульфидную связь внутри вариабельной области.

Fab'-ds-Fv-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту Fab' с двумя парами Fv, добавленными в сериях к C-концу тяжелой и легкой цепи, где первый и второй Fv содержат дисульфидную связь внутри вариабельной области.

DiFab, как применяют в настоящем документе, относится к двум молекулам Fab, связанным через C-концы их тяжелых цепей.

DiFab', как применяют в настоящем документе, относится к двум молекулам Fab', связанным посредством одной или нескольких дисульфидных связей в их шарнирной области.

Молекулы DiFab и DiFab', включают в себя их химически конъюгированные формы.

(Fab-scFv)₂, как применяют в настоящем документе, относится к молекуле ди-Fab с двумя scFv, добавленными к ней, например, добавленными к C-концу тяжелой или легкой цепи, например, тяжелой цепи.

(Fab'-scFv)₂, как применяют в настоящем документе, относится к димолекуле Fab' с двумя scFv, добавленными к ней, например, добавленному к C-концу тяжелой или легкой цепи, например, тяжелой цепи.

(Fab)₂-scFv-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к ди-Fab с scFv и ds-Fv, добавленными, например, по одному с C-конца каждой тяжелой цепи.

(Fab')₂-scFvds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к ди-Fab' с scFv и ds-Fv, добавленными, например, по одному с С-конца каждой тяжелой цепи.

(Fab)₂-ds-scFv-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к ди-Fab с ds-scFv и ds-Fv, добавленными, например, с С-конца тяжелой цепи.

(Fab')₂-ds-scFv-ds-Fv, как применяют в настоящем документе, относится к ди-Fab' с ds-scFv и ds-Fv, добавленными, например, с С-конца тяжелой цепи.

Миниантитело, как применяют в настоящем документе, относится к (VL/VH-CH₃)₂. ds-Миниантитело, как применяют в настоящем документе, относится к (VL/VH-CH₃)₂, где одна VL/VH содержит дисульфидную связь внутри вариабельной области.

ди^-Миниантитело, как применяют в настоящем документе, относится к (ds-Fv-CH₃)₂.

Каппа/лямбда-антитело' или 'κ/λ-антитело представляет собой формат нормального IgG с двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями, где две легкие цепи отличаются друг от друга, одна представляет собой легкую цепь λ (VL-CL), и другая представляет собой легкую цепь к (VK-CK). Тяжелая цепь является идентичной, даже в CDR, как описано в WO 2012/023053.

scFv-Fc, как применяют в настоящем документе, относится к scFv, добавленному к N-концу домена CH2, например, посредством шарнирной области фрагмента константной области - (CH2CH3), так что молекула обладает 2 связывающими доменами.

ds-scFv-Fc, как применяют в настоящем документе, относится к ds-scFv, добавленному к N-концу домена CH₂, и scFv, добавленному к N-концу второго домена CH₂, например, посредством шарнирной области фрагмента константной области -(CH₂CH₃)₂, так что молекула обладает 2 связывающими доменами.

- 30 034647 ди-ds-scFv-Fc, как применяют в настоящем документе, относится к scFv, добавленному к N-концу домена CH₂, например, посредством шарнирной области фрагмента константной области (CH₂CH₃)₂, так что молекула обладает 2 связывающими доменами.

Тандем scFv-Fc, как применяют в настоящем документе, относится к двум тандемным scFv, где каждый добавлен в сериях к N-концу домена CH₂, например, посредством шарнирной области фрагмента константной области -(CH₂CH₃), так что молекула обладает 4 связывающими доменами.

sc-Диатело-Fc, как применяют в настоящем документе, представляет собой два sc-диатела, где каждое добавлено к N-концу домена CH₂, например, посредством шарнирной области фрагмента константной области -CH₂CH₃.

scFv-Fc-scFv, как применяют в настоящем документе, относится к четырем scFv, где каждый добавлен к N-концу и C-концу как тяжелой, так и легкой цепи фрагмента -CH₂CH₃.

sc-Диатело-CH₃, как применяют в настоящем документе, относится к двум молекулам sc-диатела, где каждая связана, например, посредством шарнира с доменом CH₃.

IgG-scFv, как применяют в настоящем документе, представляет собой полноразмерное антитело с scFv на C-конце каждой из тяжелых цепей или каждой из легких цепей.

scFv-IgG, как применяют в настоящем документе, представляет собой полноразмерное антитело с scFv на N-конце каждой из тяжелых цепей или каждой из легких цепей.

V-IgG, как применяют в настоящем документе, представляет собой полноразмерное антитело с вариабельным доменом на N-конце каждой из тяжелых цепей или каждой из легких цепей.

IgG-V, как применяют в настоящем документе, представляет собой полноразмерное антитело с вариабельным доменом на C-конце каждой из тяжелых цепей или каждой из легких цепей.

DVD-Ig (известное также как IgG с двойным доменом V) представляет собой полноразмерное антитело с 4 дополнительными вариабельными доменами по одному на N-конце каждой тяжелой и каждой легкой цепи.

Антитело Duobody или с обменом плечей Fab, как применяют в настоящем документе, представляет собой формат биспецифического антитела IgG, где совпадающие и комплементарным образом сконструированные аминокислотные замены в константных доменах (как правило, CH₃) двух различных моноклональных антител приводят при смешивании к формированию гетеродимеров. Пара тяжелая:легкая цепь из первого антитела может в результате конструирования остатка предпочтительно ассоциировать с парой тяжелая:легкая цепь второго антитела. См., например, WO 2008/119353, WO 2011/131746 и WO 2013/060867.

В одном варианте осуществления молекула антитела по настоящему описанию представляет собой биспецифический белковый комплекс, обладающий формулой

A-X:Y-B, где A-X представляет собой первый слитый белок;

Y-B представляет собой второй слитый белок;

X:Y представляет собой гетеродимерное объединение;

: представляет собой взаимодействие связывания между X и Y;

A представляет собой первый белковый компонент биспецифической молекулы, выбранный из Fab или фрагмента Fab';

B представляет собой второй белковый компонент биспецифической молекулы, выбранный из Fab или Fab';

X представляет собой первого партнера по связыванию из связанной пары, независимо выбранного из антигена. или антитела, или его связывающего фрагмента; и

Y представляет собой второго партнера по связыванию из связанной пары, независимо выбранного из антигена, или антитела, или его связывающего фрагмента;

при условии, что когда X представляет собой антиген, Y представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, специфические для антигена, представленного посредством X, и когда Y представляет собой антиген, X представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, специфические для антигена, представленного посредством Y.

В одном аспекте представлена мультиспецифическая молекула антитела, содержащая или состоящая из следующего:

a) полипептидная цепь формулы (I)

Ун-СЩ-Х- (VJp;

b) полипептидная цепь формулы (II)

V_L-C_L-Y-(V₂)_q;

где V_H представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи;

CH₁ представляет собой домен константной области тяжелой цепи, например ее домен 1;

X представляет собой связь или линкер, например аминокислотный линкер;

Y представляет собой связь или линкер, например аминокислотный линкер;

V₁ представляет собой dab, scFv, ds-scFv или ds-Fv;

V_L представляет собой вариабельный домен, например вариабельный домен легкой цепи;

- 31 034647

C|, представляет собой домен из константной области, например домен константной области легкой цепи, такой как Ckappa;

V₂ представляет собой dab, scFv, ds-scFv или ds-Fv;

p представляет собой 0 или 1;

q представляет собой 0 или 1; и когда p представляет собой 1, q представляет собой 0 или 1, и когда q представляет собой 1, p представляет собой 0 или 1, т.е. p и q, оба, не представляют собой 0.

В одном варианте осуществления мультиспецифическая молекула антитела содержит не более одного связывающего домена для CD22 и не более одного связывающего домена для CD79.

В одном варианте осуществления q представляет собой 0, и p представляет собой 1.

В одном варианте осуществления q представляет собой 1, и p представляет собой 1.

В одном варианте осуществления V₁ представляет собой dab, и V₂ представляет собой dab, и вместе они формируют одиночный связывающий домен кооперативной пары вариабельных областей, такой как родственная пара VH/VL, необязательно, связанные дисульфидной связью.

В одном варианте осуществления V_H и V_L являются специфическими для CD79, например CD79a или CD79b.

В одном варианте осуществления V₁ является специфической для CD79, например CD79a или CD79b.

В одном варианте осуществления V₂ является специфической для CD79, например CD79a или CD79b.

В одном варианте осуществления V₁ и V₂ вместе (например, в форме связывающего домена) являются специфическими для CD79, например CD79a или CD79b, и VH и VL являются специфическими для CD22.

В одном варианте осуществления V₁ является специфической для CD22.

В одном варианте осуществления V₂ является специфической для CD22.

В одном варианте осуществления V₁ и V₂ вместе (например, в форме одного связывающего домена) являются специфическими для CD22, и V_H и V_L являются специфическими для CD79.

В одном варианте осуществления V₁ является специфической для CD22, V₂ является специфической для альбумина, и V_H и V_L являются специфическими для CD79.

В одном варианте осуществления V₁ является специфической для альбумина, V₂ является специфической для CD22, и V_H и V_L являются специфическими для CD79.

В одном варианте осуществления V₁ является специфической для CD79, V₂ является специфической для альбумина, и V_H и V_L являются специфическими для CD22.

В одном варианте осуществления V1 является специфической для альбумина, V2 является специфической для CD79, и V_H и V_L являются специфическими для CD22.

В одном варианте осуществления V₁ представляет собой ds-scFv, специфический для CD22, V₂представляет собой ds-scFv, специфический для альбумина, и VH и VL являются специфическими для CD79.

В одном варианте осуществления V₁ представляет собой ds-scFv, специфический для альбумина, V₂представляет собой ds-cFv, специфический для CD22, и V_H и V_L являются специфическими для CD79.

В одном варианте осуществления V₁ представляет собой ds-scFv, специфический для CD79, V₂представляет собой ds-scFv, специфический для альбумина, и V_H и V_L являются специфическими для CD22.

В одном варианте осуществления V1 представляет собой ds-scFv, специфический для альбумина, V2 представляет собой ds-scFv, специфический для CD79, и V_H и V_L являются специфическими для CD22.

Каждая из V₁, V₂, V_H и V_L в конструкциях выше может представлять собой связывающий домен и включать любую из последовательностей, представленных в настоящем документе.

X и Y представляют собой любой пригодный линкер, например, X и Y могут независимо представлять собой SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 271) или SGGGGTGGGGS (SEQ ID NO: 272).

В одном варианте осуществления, когда V₁ и/или V₂ представляют собой dab, ds-Fv или ds-scFv, дисульфидная связь между вариабельными доменами V_H и V_L, V₁ и/или V₂ сформирована между положениями V_H44 и V_L100.

Когда одна или несколько пар вариабельных областей в мультиспецифической молекуле антитела содержит дисульфидную связь между V_H и V_L, она может находиться в любом подходящем положении, например между двумя из остатков, перечисленных ниже (если контекст не указывает на иное, нумерацию Kabat применяют в списке ниже). Во всех случаях, когда приведена ссылка на нумерацию Kabat, соответствующая ссылка представляет собой Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA.

В одном варианте осуществления дисульфидная связь находится в положении, выбранном из группы, содержащей

- 32 034647

V_H37+V_L95C, cm., например, Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

V_h44+V_l100, cm., например; Biochemistry 33 5451-5459

Reiter et al (1994); или Journal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp. 18327-18331 Reiter et al (1994); или Protein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453-1459 Rajagopal et al (1997);

	V_h44+V_l105,	см., например,	J Biochem. 118,	825-831 Luo et
al	(1995);
		V_h4 5+V_l8 7,	см., например,	Protein Science	6, 781-788 Zhu
et	al	(1997);
		V_h55+V_l101,	см., например,	FEBS Letters 377	135-139 Young
et	al	(1995) ;
		V_h100+V_l50	, см., например, Biochemistry	29 1362-1367

Glockshuber et al (1990)

V_H10 0b+V_L4 9;

V_h98+V_l 46, см., например, Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

V_h101+V_l4 6;

V_h105+V_l43, cm., например; Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.

pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993); или Proteins 19, 35-47

Jung et al (1994),

V_h106+V_l57, cm., например, FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995) и положения, соответствующие им в паре вариабельных областей, локализованной в молекуле.

В одном варианте осуществления дисульфидная связь сформирована между положениями V_H44 и V_L100.

Моноспецифический, как применяют в настоящем документе, относится к способности связывать антиген-мишень только один раз.

Таким образом, в одном варианте осуществления мультиспецифические молекулы по настоящему изобретению являются моноспецифическими для каждого антигена.

Таким образом, в одном варианте осуществления связывающие домены мультиспецифических молекул по настоящему описанию являются моноспецифическими. Это обеспечивает преимущества при некоторых терапевтических применениях, поскольку молекулы по описанию неспособны перекрестно связывать антиген посредством связывания антигена-мишени более одного раза. Таким образом, в одном варианте осуществления биспецифические или мультиспецифические молекулы по настоящему описанию неспособны к перекрестному связыванию посредством связывания одной и той же мишени дважды в двух различных положениях, например на одной и той же клетке или на двух различных клетках.

Перекрестное связывание, в частности, по отношению к CD79b на одной и той же клетке или на различных клетках, может подавать сигналы in vivo, например, стимулирующие активность антигенамишени.

В одном примере мультиспецифические молекулы по настоящему изобретению содержат не более одного связывающего домена для CD22 и не более одного связывающего домена для CD79. Каждый связывающий домен является моноспецифическим.

В одном примере, таким образом, мультиспецифическая молекула является моновалентной для CD22 и моновалентной для CD79.

В одном варианте осуществления, каждое антитело или фрагмент антитела, применяемые в мультиспецифических молекулах по настоящему описанию, являются моновалентными.

Таким образом, в одном варианте осуществления связывающие домены мультиспецифических молекул по настоящему описанию являются моновалентными.

Таким образом, в одном варианте осуществления связывающие домены мультиспецифических молекул по настоящему описанию являются моновалентными и моноспецифическими.

В одном варианте осуществления мультиспецифическая молекула по настоящему описанию состоит из двух или более моноспецифических, моновалентных связывающих доменов, таких как Fab, Fab', scFv, V_H, V_L, V_HH, Fv, ds-Fv, комбинированных или связанных любым подходящим способом для конст

- 33 034647 руирования мультиспецифической молекулы, например, как описано в настоящем документе выше.

В другом варианте осуществления, например, где молекулы по описанию содержат по меньшей мере три связывающих домена, тогда два или три связывающих домена (например, антитела, фрагменты или комбинация антитела и фрагмента) могут обладать различными антигенными специфичностями, например связыванием с тремя различными антигенами-мишенями.

Константные области

Домены константной области антитела из антитела по настоящему описанию, если они присутствуют, например, в полноразмерном антителе или мультиспецифической молекуле, можно выбирать по отношению к предполагаемой функции мультиспецифической молекулы антитела и, в частности, эффекторным функциям, которые могу является необходимыми. Например, домены константной области могут представлять собой человеческие домены IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. В частности, можно использовать домены константной области IgG человека, особенно изотипы IgG1 и IgG3, когда молекула антитела предназначена для терапевтических применений и необходимы эффекторные функции антитела. Альтернативно, изотипы IgG2 и IgG4 можно использовать, когда молекула антитела предназначена для терапевтических целей, и эффекторные функции антитела не являются необходимыми.

Следует понимать, что варианты последовательности этих доменов константной области также можно использовать. Например, можно использовать молекулы IgG4, в которых серин в положении 241 заменен на пролин, как описано в Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108. Соответственно, в варианте осуществления, где антитело представляет собой антитело IgG4, антитело может содержать мутацию S241P.

В одном варианте осуществления тяжелая цепь антитела содержит домен CH₁, и легкая цепь антитела содержит домен CL, либо κ, либо λ.

В одном варианте осуществления тяжелая цепь антитела содержит домен CH₁, домен CH₂ и домен CH₃, и легкая цепь антитела содержит домен CL, либо κ, либо λ.

Четыре изотипа IgG человека связывают активирующие рецепторы Fcy (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa), ингибирующий рецептор FcyRIIb и первый компонент комплемента (C1q) с различной аффинностью, обеспечивая очень различные эффекторные функции (Bruhns P. et al., 2009. Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood. 113(16):3716-25), см. также Jeffrey B. Stavenhagen, et al. Cancer Research 2007 Sep. 15; 67(18):8882-90.

Связывание IgG с FcyR или C1q зависит от остатков, локализованных в шарнирной области и домене CH₂. Две области домена СН₂ являются критическими для связывания FcyR и C1q, и обладают уникальными последовательности в IgG2 и IgG4. Показано, что замены на остатки человеческого IgG1 остатков IgG2 в положениях 233-236 и остатков IgG4 в положениях 327, 330 и 331 сильно уменьшают ADCC и CDC (Armour KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29(8):2613-24 и Shields RL. et al., 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 276(9):6591-604). Кроме того, Idusogie et al. показали, что замены на аланин в различных положениях, включая K322, значительно уменьшали активацию комплемента (Idusogie ЕЕ. et al., 2000. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc. J. Immunol. 164(8):4178-84). Подобным образом, показано, что мутации в домене CH₂ мышиного IgG2A уменьшают связывание с FcyRI и C1q (Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J. Immunol. 155(3):116574).

В одном варианте осуществления в применяемую область Fc вносят мутации, в частности мутацию, описанную в настоящем документе. В одном варианте осуществления мутация предназначена для удаления связывания и/или эффекторной функции.

В одном варианте осуществления мутация Fc выбрана из группы, включающей в себя мутацию для удаления связывания области Fc, мутацию для увеличения или удаления эффекторной функции, мутацию для увеличения времени полужизни и их комбинацию.

Некоторые антитела, избирательно связывающие FcRn при pH 6,0, но не при pH 7,4, обладают более высоким временем полужизни во множестве моделей на животных. Показано, что несколько мутаций, локализованных на поверхности раздела между доменами CH₂ и CH₃, такие как T250Q/M428L (Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J. Biol. Chem. 279(8):6213-6) и M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F (Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol. 23(10):1283-8), увеличивают аффинность связывания с FcRn и время полужизни IgG1 in vivo.

Однако не всегда существует прямая взаимосвязь между увеличением связывания FcRn и улучшенным временем полужизни (Datta-Mannan A. et al., 2007. Humanized IgG1 Variants with Differential Binding Properties to the Neonatal Fc Receptor: Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates. Drug Metab. Dispos. 35:86-94).

Для подкласса IgG4 показано уменьшенное связывание рецептора Fc (FcyRIIIa), для антител других

- 34 034647 подклассов IgG, как правило, показано сильное связывание. Уменьшенное связывание рецептора в этих других подтипах IgG можно обеспечивать посредством изменения, например, замены одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, содержащей Pro238, Aps265, Asp270, Asn270 (утрата углевода Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435.

В одном варианте осуществления молекула по настоящему описанию обладает Fc из подкласса IgG, например, IgG1, IgG2 или IgG3, где в Fc вносят мутации в одном, двух или всех из следующих положений S228, L234 и/или D265.

В одном варианте осуществления мутации в области Fc независимо выбраны из S228P, L234A, L235A, L235A, L235E и их комбинаций.

Может являться желательным либо уменьшить, либо увеличить эффекторную функцию области Fc. Необходимы антитела, нацеленные на молекулы поверхности клеток, особенно на молекулы на иммуноцитах, лишенные эффекторных функций. В некоторых вариантах осуществления, например, для лечения аутоиммунитета, усиление связывания Fc на иммуноцитах посредством увеличения связывания негативного рецептора Fc (FcgRIIb или CD32b) может являться желательным, см. Stavenhagen J.B., et al. Advances in Enzyme Regulation 2007 December 3 и Veri M.C., et al. Arthritis Rheum, 2010 Mar 30;62(7):193343. Напротив, для антител, предназначенных для онкологического применения, увеличение эффекторных функций может увеличивать терапевтическую активность.

Многочисленные мутации вносили в домен CH₂ IgG1 человека, и их эффект на ADCC и CDC тестировали in vitro (Idusogie E.E. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J. Immunol. 166 (4):2571-5). Примечательно, опубликовано, что замена аланина в положении 333 увеличивает как ADCC, так и CDC. Lazar et al. описали тройной мутант (S239D/I332E/A330L) с более высокой аффинностью для FcyRIIIa и более низкой аффинностью для FcyRIIb, приводящими к усилению ADCC (Lazar G.A. et al., 2006. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. PNAS 103(11):40054010). Такие же мутации использовали для получения антитела с усиленной ADCC (Ryan M.C. et al., 2007. Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells. Mol. Cancer Ther., 6: 30093018). Richards et al. исследовали немного отличный тройной мутант (S239D/I332E/G236A) с улучшенной аффинностью FcyRIIIa и соотношением FcyRIIa/FcyRIIb, опосредующим увеличенный фагоцитоз клеток-мишеней макрофагами (Richards J.O. et al. 2008. Optimization of antibody binding to Fcgamma RIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol. Cancer Ther. 7(8):2517-27).

Из-за отсутствия у них эффекторных функций, антитела IgG4 представляют собой подходящий подкласс IgG для блокирования рецептора без истощения клеток. Молекулы IgG4 могут обмениваться половинами молекул в динамическом процессе, называемом обменом плечей Fab. Этот феномен может возникать между терапевтическими антителами и эндогенным IgG4. Показано, что мутация S228P предотвращает этот процесс рекомбинации, позволяя конструирование менее непредсказуемых терапевтических антител IgG4 (Labrijn A.F. et al., 2009. Therapeutic IgG4 antibodies engage in Fab-arm exchange with endogenous human IgG4 in vivo. Nat Biotechnol. 27(8):767-71). Эту технологию можно применять для получения биспецифических молекул антител.

Специалисту в данной области понятно также, что антитела могут подвергаться множеству посттрансляционных модификаций. Тип и степень этих модификаций часто зависит от линии клеток-хозяев, используемой для экспрессии антитела, так же как от условий культивирования. Такие модификации могут включать в себя изменения гликозилирования, окисление метионина, формирование дикетопиперазина, изомеризацию аспартата и дезамидирование аспарагина. Частой модификацией является утрата карбоксиконцевого основного остатка (например, лизина или аргинина) из-за действия карбоксипептидаз (как описано в Harris, R. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Соответственно, С-концевой лизин тяжелой цепи антитела может отсутствовать.

Аффинность

Молекулы антител по настоящему описанию содержат по меньшей мере один связывающий домен, который является специфическим для CD22.

Мультиспецифические молекулы по настоящему изобретению содержат связывающий домен, специфический для антигена CD22, и связывающий домен, специфический для антигена CD79a и/или CD79b.

В одном варианте осуществления связывающий домен, применяемый в молекулах по настоящему описанию, является специфическим для CD22.

В одном варианте осуществления связывающий домен, применяемый в молекулах по настоящему описанию, является специфическим для CD79a.

В одном варианте осуществления связывающий домен, применяемый в молекулах по настоящему описанию, является специфическим для CD79b.

В одном варианте осуществления связывающий домен, применяемый в молекулах по настоящему описанию, является специфическим для комплекса CD79, т.е. он узнает эпитоп, присутствующий в комплексе, и является специфическим для него, например, эпитоп, включающий в себя взаимодействие между CD79a и CD79b.

- 35 034647

Связывающий домен для CD79 может связывать CD79a и/или CD79b.

CD79a (также известный как цепь α-белка, ассоциированного с комплексом иммуноглобулина α и B-клеточного рецептора антигена), является известным белком. Экспрессия CD79a ограничена Bлимфоцитами. Человеческая последовательность является доступной в UniProt под номером записи P11912 (SEQ ID NO: 162 и без сигнальной последовательности аминокислот 33-226 из SEQ ID NO:162). Мышиный вариант является доступным в UniProt под номером записи 11911. Настоящее описание относится ко всем формам CD79a из любого вида, в частности, человека, и к любым его природным вариантам. В одном варианте осуществления CD79a относится к человеческой форме белка.

CD79b (также известный как ассоциированная с иммуноглобулином цепь β и кластер дифференцировки 79B) является известным белком. Экспрессия CD79b ограничена B-лимфоцитами. Человеческая последовательность является доступной в UniProt под номером записи P40259 (SEQ ID NO:163 и без сигнальной последовательности аминокислот 29-229 из SEQ ID NO:163). Мышиный вариант находится в UniProt под номером записи P15530. Настоящее описание относится ко всем формам CD79b, из любого вида, в частности, человека, и к любым его природным вариантам. В одном варианте осуществления CD79b относится к человеческой форме белка.

В одном варианте осуществления связывающий домен, специфический для CD79, связывает CD79a.

В одном варианте осуществления связывающий домен, специфический для CD79, связывает CD79b.

В одном варианте осуществления связывающий домен, специфический для CD79, связывает комплекс CD79a и CD79b.

В одном варианте осуществления аффинность связывающего домена для CD79 в молекуле по настоящему описанию составляет приблизительно 100 нМ или сильнее, например приблизительно 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 100 пМ или сильнее, в частности, аффинность связывания 50 пМ или сильнее.

В одном варианте осуществления аффинность связывающего домена для CD79a в молекуле по настоящему описанию составляет приблизительно 100 нМ или сильнее, например приблизительно 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 100 пМ или сильнее, в частности, аффинность связывания 50 пМ или сильнее.

В одном варианте осуществления аффинность связывающего домена для CD79b в молекуле по настоящему описанию составляет приблизительно 100 нМ или сильнее, например приблизительно 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 100 пМ или сильнее, в частности, аффинность связывания 50 пМ или сильнее.

Следует понимать, что аффинность связывающего домена для CD22 может являться одинаковой или отличной от аффинности связывающего домена для CD79.

В одном варианте осуществления мультиспецифические молекулы антител по настоящему описанию или их компоненты антитела/фрагмента подвергают процессингу для обеспечения улучшенной аффинности для антигена или антигенов-мишеней. Такие варианты можно получать посредством ряда протоколов аффинного созревания, включая введение мутаций в CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), перетасовку цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), использование штаммовмутаторов E. coli (Low et al. J. Mol. Biol., 250, 359- 368, 1996), перетасовку ДНК (Patten et al Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), фаговый дисплей (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) и ПЦР с имитацией генетической рекомбинации в процессе полового размножения (Crameri et al. Nature, 391, 288291, 1998). В Vaughan et al. (выше) обсуждают эти способы аффинного созревания.

Антитела и их получение

Связывающие домены для применения по настоящему изобретению можно получать любым пригодным способом, известным в данной области, например CDR можно брать из не относящихся к человеку антител, включая коммерчески доступные антитела, и прививать в человеческие каркасные области, или альтернативно, химерные антитела можно получать из не относящихся к человеку вариабельных областей и человеческих константных областей, и т.д.

Как правило, связывающие домены для применения по настоящему изобретению представляют собой связывающие домены, полученные из антител, связывающих выбранный антиген, таких как антитела, связывающие CD22, или CD79a, и/или CD79b.

Примеры антител против CD22 и CD79 известны в данной области, и их можно применять непосредственно в молекулах по настоящему изобретению или подвергать скринингу по пригодности с использованием способов, описанных в настоящем документе, и затем модифицировать по необходимости, например гуманизировать, с использованием способов, описанных в настоящем документе. Примеры антител против CD22 в клинике включают в себя эпратузумаб и инотузумаб. Другие терапевтические антитела описаны в данной области, например антитела против CD22, описанные в US 2003202975 и WO 14/011520, антитела против CD79b, описанные в WO 14011521 и WO 15021089. Не относящиеся к человеку антитела против CD22 включают в себя моноклональное антитело кролика LS-C2210357 (LSBio) из клона SP104, моноклональное антитело мыши LS-C174778 из клона 4C3, моноклональное антитело мыши LS-C4802, моноклональное антитело мыши LS-B9996 из клона 1B1, моноклональное антитело мыши

- 36 034647

LS-C340404 из клона 2E6, моноклональное антитело мыши LS-C312263, моноклональное антитело мыши LS-C152867, моноклональное антитело мыши LS-C87523, моноклональное антитело мыши LSC134333 из клона FRB4, моноклональное антитело мыши LS-C134336, моноклональное антитело мыши LS-C40961 из клона HIB22, моноклональное антитело мыши LS-C134332, следующие антитела из Santa Cruz Biotechnology sc-271579, sc-377304, sc-7032, sc-18909, sc-7932, sc-7323, sc-7307, sc-7031, sc-20053, sc-189000, sc-136440, sc-136507, sc-53031, sc-73363, sc-53032, моноклональное антитело кролика от Abcam Ab33859 (EP498Y), моноклональное антитело мыши AA 1-687, каталожный номер ABIN1999423, моноклональное антитело мыши от Biolegend workshop number V CD22.14 из клона HIB22.

Коммерчески доступные антитела против CD79a включают в себя моноклональное антитело мыши LS-B4504 (LSBio) из клона HM57, моноклональное антитело мыши LS-B8330, моноклональное антитело мыши LS-C44954, моноклональное антитело кролика LS-B9093, моноклональное антитело мыши LSB8513 из клона JCB117, моноклональное антитело кролика LS-C210607 из клона SP18, моноклональное антитело мыши LS-C175441 из клона 5E2, моноклональное антитело мыши LS-C338670 из клона 3D3, моноклональное антитело мыши LS-C88120 из клона HM47/A9, моноклональное антитело мыши LSC191714, моноклональное антитело мыши LS-C87592, моноклональное антитело мыши LS-C44955, моноклональное антитело мыши LS-C95934, моноклональное антитело мыши LS-C121584, моноклональное антитело мыши LS-C121585, моноклональное антитело мыши LS-C204347, моноклональное антитело мыши LS-C88122, моноклональное антитело мыши от Abcam ab3121 [HM47/A9], моноклональное антитело кролика ab79414 и моноклональное антитело кролика ab133483.

Коммерчески доступные антитела против CD79b включают в себя моноклональное антитело мыши от Abcam ab33295, моноклональное антитело крысы ab23826, моноклональное антитело мыши ab103422, моноклональное антитело кролика ab134103, моноклональное антитело кролика ab134147 и моноклональное антитело кролика ab183343.

Такие коммерчески доступные антитела могут являться полезными инструментами для открытия дополнительных терапевтических антител.

Специалист в данной области может получать антитела для использования в мультиспецифических молекулах по изобретению с использованием любого пригодного способа, известного в данной области.

Антигенные полипептиды, для применения в получении антител, например, для использования для иммунизации хозяина или для использования в пэннинге, например, в фаговом дисплее, можно получать посредством процессов, хорошо известных в данной области, из генетически модифицированных клетокхозяев, содержащих системы экспрессии, или их можно выделять из природных биологических источников. В настоящей заявке, термин полипептиды включает в себя пептиды, полипептиды и белки. Их используют взаимозаменяемо, если не указано иначе. Антигенный полипептид может, в некоторых случаях, являться частью более крупного белка такого как слитый белок например, слитый с аффинной меткой или сходный. В одном варианте осуществления хозяина можно иммунизировать с использованием клетки, такой как фибробласт, трансфицированный соответствующим белком или полипептидом, например, совместно трансфицированный CD79a и CD79b.

Антитела, полученные против антигенного полипептида, можно получать, когда необходима иммунизация животного, посредством введения полипептидов животному, предпочтительно, не относящемуся к человеку животному, с использованием хорошо известных и общепринятых протоколов, см., например, Handbook of Experimental Immunology, D.M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Многих теплокровных животных, таких как кролики, мыши, крысы, овцы, коровы, верблюды или свиньи, можно иммунизировать. Однако мыши, кролики, свиньи и крысы обычно являются наиболее подходящими.

Моноклональные антитела можно получать любым способом, известным в данной области, таким как способ гибридомы (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), способ триомы, способ гибридомы B-клеток человека (Kozbor et al. 1983, Immunology Today, 4:72) и способ EBV-гибридомы (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Антитела можно также получать с использованием способов антитела из отдельного лимфоцита посредством клонирования и экспрессии кДНК вариабельной области иммуноглобулинов из отдельных лимфоцитов, отобранных по продукции специфических антител, например, способами, описанными в Babcook, J. et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; WO 92/02551; WO 2004/051268 и WO 2004/106377.

Антитела для применения по настоящему описанию можно также получать с использованием различных способов фагового дисплея, которые известны в данной области и включают в себя способы, описанные в Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187918), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) и WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; и US 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743; 5969108 и WO 20011/30305.

В одном примере мультиспецифические молекулы по настоящему описанию являются полностью

- 37 034647 человеческими, в частности, один или несколько вариабельных доменов являются полностью человеческими.

Полностью человеческие молекулы представляют собой те, в которых вариабельные области и константные области (когда присутствуют) как тяжелых, так и легких цепей, все имеют человеческое происхождение, или являются, по существу, идентичными последовательностям человеческого происхождения, не обязательного из одного и того же антитела. Примеры полностью человеческих антител могут включать в себя антитела, продуцированные, например, способами фагового дисплея, описанными выше, и антитела, продуцированные мышами, у которых мышиные гены вариабельной и необязательно, константной области иммуноглобулинов заменены на их человеческие эквиваленты, например, как описано в общих чертах в EP 0546073, US 5545806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5661016, US 5770429, EP 0438474 и EP 0463151.

В одном примере связывающие домены мультиспецифических молекул в соответствии с описанием являются гуманизированными.

Гуманизированные (включающие в себя антитела с привитыми CDR), как применяют в настоящем документе, относится к молекулам, обладающим одной или несколькими определяющими комплементарность областями (CDR) из не относящихся к человеку видов, и каркасной областью из человеческой молекулы иммуноглобулина (см., например, US 5585089; WO 91/09967). Следует понимать, что может являться необходимым переносить только определяющие специфичность остатки CDR, а не целую CDR (см., например, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Гуманизированные антитела могут, необязательно, дополнительно содержать один или несколько остатков каркасной области, происходящих из не относящиеся к человеку видов, из которых происходят CDR.

Как применяют в настоящем документе, термин гуманизированная молекула антитела относится к молекуле антитела, где тяжелая и/или легкая цепь содержит одну или несколько CDR (включая, если желательно, одну или несколько модифицированных CDR) из донорного антитела (например, мышиного моноклонального антитела), привитые в каркас вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи акцепторного антитела (например, человеческого антитела). Обзор, см. в Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. В одном варианте осуществления вместо того, чтобы переносить целую CDR, только один или несколько из определяющих специфичность остатков из любой из CDR, описанных в настоящем документе выше, переносят в каркасную область человеческого антитела (см., например, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). В одном варианте осуществления только определяющие специфичность остатки из одной или нескольких из CDR, описанных в настоящем документе выше, переносят в каркас человеческого антитела. В другом варианте осуществления только определяющие специфичность остатки из каждой из CDR, описанных в настоящем документе выше, переносят в каркас человеческого антитела.

Когда CDR или определяющие специфичность остатки прививают, можно использовать любую подходящую акцепторную последовательность каркаса вариабельной области, принимая во внимание класс/тип донорного антитела, из которой происходят CDR, включая каркасные области мыши, примата и человека. Подходящим образом гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением обладает вариабельным доменом, содержащим человеческие акцепторные каркасные области, так же как одну или несколько из CDR, представленных в настоящем документе.

Примеры человеческих каркасных областей, которые можно использовать по настоящему описанию, представляют собой KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и POM (Kabat et al. выше). Например, KOL и NEWM можно использовать для тяжелой цепи, REI можно использовать для легкой цепи, и EU, LAY и РОМ можно использовать как для тяжелой цепи, так и для легкой цепи. Альтернативно, можно использовать человеческие зародышевые последовательности; они являются доступными на http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php.

В гуманизированной молекуле антитела по настоящему описанию акцепторные тяжелая и легкая цепи не обязательно должны происходить из одного и того же антитела, и могут, если желательно, содержать составные цепи, обладающие каркасными областями, происходящими из различных цепей.

Каркасные области не обязательно должны обладать точно такой же последовательностью, как последовательность акцепторного антитела. Например, необычные остатки можно заменять на более часто встречающиеся остатки для этого класса или типа акцепторной цепи. Альтернативно, избранные остатки в акцепторных каркасных областях можно изменять так, чтобы они соответствовали остатку, обнаруженному в таком же положении в донорном антителе (см. Reichmann et al. 1998, Nature, 332, 323-324). Такие изменения необходимо поддерживать на минимуме, необходимом для восстановления аффинности донорного антитела. Протокол для выбора остатков в акцепторных каркасных областях, которые могут нуждаться в изменении, указан в WO 91/09967.

Производные каркасных областей могут обладать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотами, замененными на альтернативную аминокислоту, например, на донорный остаток.

Донорные остатки представляют собой остатки из донорного антитела, т.е. антитела, из которого исходно происходят CDR, в частности, принимают осадок в соответствующей локализации из донорной последовательности. Донорные остатки можно заменять на подходящий остаток, происходящий из кар

- 38 034647 касной области человеческого рецептора (акцепторные остатки).

Остатки в вариабельных доменах антитело пронумерованы общепринятым образом в соответствии с системой, разработанной Kabat et al. Эта система описана в Kabat et al., 1987, в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (hereafter Kabat et al. (выше)). Эту систему нумерации используют в настоящей заявке, за исключением того, где указано иначе.

Обозначение остатков по Kabat не всегда напрямую соответствует линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты по сравнению со строгой нумерацией по Kabat, соответствующее укорочению структурного компонента или вставки в структурный компонент, является ли это каркасной областью или определяющей комплементарность областью (CDR) основной структуры вариабельного домена. Корректную нумерацию остатков по Kabat можно определять для данного антитело посредством выравнивания гомологичных остатков в последовательности антитела со стандартной пронумерованной по Kabat последовательностью.

CDR вариабельного домена тяжелой цепи локализованы в остатках 31-35 (CDR-H1), остатках 50-65 (CDR-H2) и остатках 95-102 (CDR-H3) в соответствии с системой нумерации Kabat. Однако согласно Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), петля, эквивалентная CDR-H1, простирается от остатка 26 до остатка 32. Таким образом, если не указано иначе, CDR-H1, как применяют в настоящем документе, предназначена для обозначения остатков 26-35, как описано посредством комбинации системы нумерации Kabat и топологического определения петель Chothia.

CDR вариабельного домена легкой цепи локализованы в остатках 24-34 (CDR-L1), остатках 50-56 (CDR-L2) и остатках 89-97 (CDR-L3) в соответствии с системой нумерации Kabat.

В одном примере представлен связывающий домен, например, an молекула антитела по настоящему описанию, содержащая вариабельную область тяжелой цепи (например, VH), специфическую для CD79, которая содержит три CDR, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 158, CDR H2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 159, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 160.

В одном варианте осуществления представлен связывающий домен, например, в молекуле антитела по настоящему описанию, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (например, VH), специфическую для CD79, содержащую 3 CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 175 для CDRH1, SEQ ID NO: 176 для CDRH2 и SEQ ID NO: 177 для CDRH3.

В одном варианте осуществления представлен связывающий домен, например, в молекуле антитела по настоящему описанию, содержащий вариабельную область легкой цепи (например, VL), специфическую для CD79, содержащую 3 CDR легкой цепи SEQ ID NO: 161 для CDRL1, SEQ ID NO: 162 для CDRL2 и SEQ ID NO: 163, 164, 165 или 166 для CDRL3.

В одном варианте осуществления представлен связывающий домен, например, молекула антитела по настоящему описанию, содержащая вариабельную область легкой цепи (например, VL), специфическую для CD79, содержащую 3 CDR легкой цепи SEQ ID NO: 178 для CDRL1, SEQ ID NO: 179 для CDRL2 и SEQ ID NO: 180, 181, 182 или 183 для CDRL3.

В одном примере представлен связывающий домен, например, в молекуле антитела по настоящему описанию, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH), специфическую для CD79, содержащую три CDR, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 158, CDR H2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 159, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 160 и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую три CDR, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 161, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 162 и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 163, 164, 165 или 166.

В одном примере представлен связывающий домен, например, в молекуле антитела по настоящему описанию, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), специфическую для CD79, содержащую три CDR, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 175, CDR H2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 176, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 177, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую три CDRs, где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 178, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 179, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 180, 181, 182 или 183.

В одном варианте осуществления представлена молекула антитела, содержащая VH и VL, специфические для CD79b, выбранные из SEQ ID NO: 171 и 173, 171 и 174, 172 и 173, 172 и 174, 188 и 189, и 188 и 190.

Последовательности этих антител против CD79 (антитело 4447 и антитело 4450), включая последовательности VH, VL и CDR, представлены в настоящем документе на фиг. 35. Последовательности антител против CD22 (антител 4120, 4126, 4127, 4128, 4130, 4132), включая последовательности VH, VL и CDR, представлены в настоящем документе на фиг. 35, их можно комбинировать в качестве связывающих доменов в молекулах по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления представлен вариабельный домен или связывающий домен, содержащий пару вариабельных доменов с последовательностью, описанной в настоящем документе, или

- 39 034647 ее вариантом.

В одном примере представлен связывающий домен, специфический для альбумина, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH), обладающую последовательностью, данной в SEQ ID NO: 240, и вариабельную область легкой цепи (VL), обладающую последовательностью, данной в SEQ ID NO: 242.

В одном варианте осуществления связывающий домен или домены являются гуманизированными.

В одном примере одну или несколько CDR, представленных в настоящем документе, можно модифицировать для удаления нежелательных остатков или участков, таких как остатки цистеина или участки изомеризации аспарагиновой кислоты (D), или участки дезамидирования аспарагина (N).

Например, один или несколько остатков цистеина в любой из CDR можно заменять на другую аминокислоту, такую как серин.

В одном примере участок дезамидирования аспарагина можно удалять из одной или нескольких CDR посредством мутагенеза остатка аспарагин (N) и/или соседнего остатка до любой другой пригодной аминокислоты. В одном примере участок дезамидирования аспарагина, такой как NG или NS, можно подвергать мутагенезу, например, до NA или NT.

В одном примере участок изомеризации аспарагиновой кислоты можно удалять из одной или нескольких CDR посредством мутагенеза остатка аспарагиновой кислоты (D) и/или соседнего остатка до любой другой пригодной аминокислоты. В одном примере участок изомеризации аспарагиновой кислоты, такой как DG или DS, можно подвергать мутагенеза, например, до EG, DA или DT.

В одном примере участок N-гликозилирования, такой как NLS, можно удалять посредством мутагенеза остатка аспарагина (N) до любой другой пригодной аминокислоты, например, до SLS или QLS. В одном примере участок N-гликозилирования, такой как NLS, можно удалять посредством мутагенеза остатка серина (S) до любого другого остатка, за исключением треонина (T).

Специалист в данной области способен тестировать варианты CDR или гуманизированных последовательностей в любом пригодном анализе, таком как описанные в настоящем документе, для подтверждения сохранения активности.

Специфическое связывание с антигеном можно тестировать с использованием любого пригодного анализа, включая, например, способы ELISA или поверхностного плазмонного резонанса, такого как BIAcore, где можно измерять связывание с антигеном (CD22 или CD79). В таких анализах можно использовать выделенный природный или рекомбинантный CD22 или CD79 (a и/или b) или пригодный слитый белок/полипептид. В одном примере связывание измеряют с использованием рекомбинантного CD22 (например, последовательности, представленной в SEQ ID NO: 244 или аминокислот 20-847 из SEQ ID NO: 244) или CD79 (например, последовательности, представленной в SEQ ID NO: 245 и SEQ ID NO:246, и аминокислот 33-226 из SEQ ID NO:245 и аминокислот 29-229 из SEQ ID NO: 246), например, посредством поверхностного плазмонного резонанса, такого как BIAcore. Альтернативно, белки можно экспрессировать на клетке, такой как клетка HEK, и измерять аффинность, применяя определение аффинности на основе проточной цитометрии.

Антитела, перекрестно блокирующие связывание молекулы антитела в соответствии с настоящим изобретением с CD22, в частности, молекулы антитела, содержащей последовательность тяжелой цепи, данную в SEQ ID NO: 107, 108, 109 или 110, и последовательность легкой цепи, данную в SEQ ID NO: 106; или молекулы антитела, содержащей последовательность тяжелой цепи, данную в SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 120 или 121, и последовательность легкой цепи, данную в SEQ ID NO: 115; или молекулы антитела, содержащей последовательность тяжелой цепи, данную в SEQ ID NO: 127, 128, 129 или 130, и последовательность легкой цепи, данную в SEQ ID NO: 126; или молекулы антитела, содержащей последовательность тяжелой цепи, данную в SEQ ID NO: 136, 137, 138 или 139, и последовательность легкой цепи, данную в SEQ ID NO: 135; или молекулы антитела, содержащей последовательность тяжелой цепи, данную в SEQ ID NO: 145, 146, 147 или 148, и последовательность легкой цепи, данную в SEQ ID NO: 144; или молекулы антитела, содержащей последовательность тяжелой цепи, данную в SEQ ID NO: 154, 155, 156 или 157, и последовательность легкой цепи, данную в SEQ ID NO: 153, подобным образом можно использовать в связывании CD22 и подобным образом можно использовать в молекулах антител, таких как мультиспецифические молекулы по настоящему изобретению. Соответственно, настоящее изобретение также относится к молекуле антитела, такой как мультиспецифическая молекула, содержащая связывающий домен, специфический для антигена CD22, и связывающий домен, специфический для антигена CD79b, где связывающий домен для CD22 перекрестно блокирует связывание любой из молекул антител, описанных в настоящем документе выше, с CD22 и/или его связывание с CD22 перекрестно блокировано любым из этих антител. В одном варианте осуществления такое антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, описанное в настоящем документе выше. В другом варианте осуществления перекрестно блокирующее антитело связывается с эпитопом, который граничит и/или перекрывается с эпитопом, связываемым антителом, описанным в настоящем документе выше.

В другом варианте осуществления перекрестно блокирующее нейтрализующее антитело связывается с эпитопом, который граничит и/или перекрывается с эпитопом, связываемым антителом, описанным в настоящем документе выше.

- 40 034647

Перекрестно блокирующие антитела можно идентифицировать с использованием любого пригодного способа в данной области, например, с использованием конкурентных анализов ELISA или BIAcore, где связывание перекрестно блокирующего антитела с антигеном (CD22 и/или CD79) предотвращает связывание антитела по настоящему изобретению или наоборот. В таких перекрестно блокирующих анализах можно использовать экспрессированный в клетках, выделенный природный или рекомбинантный CD22 или CD79 (a и/или b) или пригодный слитый белок/полипептид. В одном примере связывание и перекрестное блокирование измеряют с использованием рекомбинантного CD22 или его пригодного фрагмента или природного варианта (например, последовательность, представленная в SEQ ID NO: 244, или последовательность, представленная аминокислотами 20-847 из SEQ ID NO: 244) или CD79, такого как последовательность, представленная в SEQ ID NO:245, или последовательность, представленная аминокислотами 33-226 из SEQ ID NO: 245 (CD79a) и/или последовательность, представленная в SEQ ID NO: 246, или последовательность, представленная аминокислотами 29-229 из SEQ ID NO: 246, например, на 85% или более, например на 90% или более, в частности на 95% или более.

Такие перекрестно блокирующее антитела могут обладать активностью в одном или нескольких функциональных анализах, сравнимой с мультиспецифическими молекулами антител, описанными в настоящем документе.

Настоящее описание распространяется также на новые полипептидные последовательности, описанные в настоящем документе, и последовательности, по меньшей мере на 80% сходные или идентичные им, например с 85% или более, например с 90% или более, в частности с 95, 96, 97, 98 или 99% или более сходством или идентичностью.

Идентичность, как применяют в настоящем документе, указывает на то, что в любом конкретном положении в выровненных последовательностях, аминокислотный остаток является идентичным между последовательностями. Сходство, как применяют в настоящем документе, указывает на то, что в любом конкретном положении в выровненных последовательностях аминокислотный остаток относится к сходному типу между последовательностями. Например, лейцином можно заменять изолейцин или валин. Другие аминокислоты, которые часто можно заменять друг на друга, включают в себя, но без огра ничения, фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, обладающие ароматическими боковыми цепями);

лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, обладающие основными боковыми цепями);

аспартат и глутамат (аминокислоты, обладающие кислыми боковыми цепями); аспарагин и глутамин (аминокислоты, обладающие амидными боковыми цепями) и цистеин и метионин (аминокислоты, обладающие боковыми цепями, содержащими серу).

Степень идентичности и сходства можно легко рассчитать (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith,

D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., и Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991, программное обеспечение BLAST™, доступное из NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

Линкеры

Объяснения линкеров в настоящем документе в одном контексте можно равным образом применять для линкеров в различных контекстах, где применяют линкер, например, в любой мультиспецифической молекуле по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления линкер, применяемый в молекуле по описанию, представляет собой аминокислотный линкер длиной 50 остатков или менее, например, выбранный из последовательности, показанной в последовательностях 251-314.

Таблица 1

Последовательности шарнирных линкеров

SEQ ID NO:	ПОСЛЕ ДОВАТЕ ЛЕНОСТЬ
208	DKTHTCAA
209	DKTHTCPPCPA
210	DKTHTCPPCPATCPPCPA
211	DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
212	DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY

213	DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSWMAEVDGTCY
214	DKTHTCCVECPPCPA
215	DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
216	DKTHTCPSCPA

- 41 034647

Таблица 2

Последовательности гибких линкеров

SEQ ID NO:	ПОСЛЕ ДОВАТЕ ЛЕНОСТЬ
217	SGGGGSE
218	DKTHTS
219	(S)GGGGS
220	(S)GGGGSGGGGS
221	(S)GGGGSGGGGSGGGGS
222	(S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
223	(S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
224	AAAGSG-GASAS
225	AAAGSG-XGGGS-GASAS
226	AAAGSG-XGGGSXGGGS -GASAS
227	AAAGSG- XGGGSXGGGSXGGGS -GASAS
228	AAAGSG- XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
229	AAAGSG-XS-GASAS
230	PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY
231	ATTTGSSPGPT
232	ATTTGS
—	GS
233	EPSGPISTINSPPSKESHKSP
234	GTVAAPSVFIFPPSD
235	GGGGIAPSMVGGGGS
236	GGGGKVEGAGGGGGS
237	GGGGSMKSHDGGGGS
238	GGGGNLITIVGGGGS
239	GGGGWPSLPGGGGS
240	GGEKSIPGGGGS
241	RPLSYRPPFPFGFPSVRP
242	YPRSIYIRRRHPSPSLTT
243	TPSHLSHILPSFGLPTFN
244	RPVSPFTFPRLSNSWLPA
245	SPAAHFPRSIPRPGPIRT
246	APGPSAPSHRSLPSRAFG
247	PRNSIHFLHPLLVAPLGA
248	MPSLSGVLQVRYLSPPDL
249	SPQYPSPLTLTLPPHPSL
250	NPSLNPPSYLHRAPSRIS

251	LPWRTSLLPSLPLRRRP
252	PPLFAKGPVGLLSRSFPP
253	VPPAPWSLRSAHARPPY
254	LRPTPPRVRSYTCCPTP-
255	PNVAHVLPLLTVPWDNLR
256	CNPLLPLCARSPAVRTFP

(S) является необязательным в последовательностях 219-223.

Примеры жестких линкеров включают в себя пептидные последовательности GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO: 273), PPPP (SEQ ID NO: 274) и PPP.

Другие линкеры показаны в табл. 3.

- 42 034647

Таблица 3

SEQ ID NO:	ПОСЛЕ ДОВАТЕ ЛЕНОСТЬ
257	DLCLRDWGCLW
258	DICLPRWGCLW
259	MEDICLPRWGCLWGD
260	QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
261	QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
262	QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
263	EDICLPRWGCLWEDD
264	RLMEDICLPRWGCLWEDD
265	MEDICLPRWGCLWEDD
266	MEDICLPRWGCLWED
267	RLMEDICLARWGCLWEDD
268	EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
269	RAPESFVCYWETICFERSEQ
270	EMCYFPGICWM

Эффекторные молекулы

Если желательно, мультиспецифическую молекулу для применения по настоящему изобретению можно конъюгировать с одной или несколькими эффекторными молекулой(молекулами). Следует понимать, что эффекторная молекула может содержать одиночную эффекторную молекулу или две или более таких молекул, связанные таким образом, чтобы формировать отдельную группу, которую можно присоединять к мультиспецифическим молекулам по настоящему изобретению. Когда является желательным получение антитела или мультиспецифической молекулы по настоящему описанию, связанной с эффекторной молекулой, их можно получать посредством стандартных химических способов или способов рекомбинантной ДНК, в которых фрагмент антитела связан либо напрямую, либо посредством связывающего средства, с эффекторной молекулой. Способы конъюгации таких эффекторных молекул с антителами хорошо известны в данной области (см., Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 и Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Конкретные химические способы включают в себя, например, способы, описанные в WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 и WO 03/031581. Альтернативно, где эффекторная молекула представляет собой белок или полипептид, связь можно осуществлять с использованием способов рекомбинантной ДНК, например, как описано в WO 86/01533 и EP 0392745.

В одном варианте осуществления мультиспецифические молекулы по настоящему описанию могут содержать эффекторную молекулу.

Термин эффекторная молекула, как применяют в настоящем документе, включает в себя, например, антинеопластические средства, лекарственные средства, токсины, биологически активные белки, например ферменты, другое антитело или фрагменты антител, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например ДНК, РНК и их фрагменты, радионуклиды, в частности радиоактивный иодид, радиоактивные изотопы, хелатированные металлы, наночастицы и репортерные группы, такие как флуоресцентные соединения или соединения, которые можно детектировать посредством ЯМР или спектроскопии ESR.

Примеры эффекторных молекул могут включать в себя цитотоксины или цитотоксические средства, включая любое средство, оказывающее неблагоприятное воздействие на клетки (например, уничтожающее). Примеры включают в себя комбрестатины, доластатины, эпотилоны, стауроспорин, майтанзиноиды, спонгистатины, ризоксин, халихондрины, роридины, гемиастерлины, таксол, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, татракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи.

Эффекторные молекулы также включают в себя, но без ограничения, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие средства (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин C и цис-дихлордиамин платины(П) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин, антрамицин (AMC), калихеамицины или дуокармицины) и антимитотические средства (например, винкристин и винбластин).

Другие эффекторные молекулы могут включать в себя хелатированные радиоактивные изотопы, такие как In и Y, Lu , висмут , калифорний , иридий и вольфрам /рений ; или лекарственные

- 43 034647 средства, такие как, но без ограничения, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы I, таксоиды и сурамин.

Другие эффекторные молекулы включают в себя белки, пептиды и ферменты. Представляющие интерес ферменты включают в себя, но без ограничения, протеолитические ферменты, гидролазы, лиазы, изомеразы, трансферазы. Представляющие интерес белки, полипептиды и пептиды включают в себя, но без ограничения, иммуноглобулины, токсины, такие как абрин, рицин A, экзотоксин pseudomonas или дифтерийный токсин, белок, такой как инсулин, фактор некроза опухолей, α-интерферон, β-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста или тканевой активатор плазминогена, тромботическое средство или антиангиогенное средство, например ангиостатин или эндостатин, или модификатор биологического ответа, такой как лимфокин, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), фактор роста нервов (NGF) или другие факторы роста и иммуноглобулины.

Другие эффекторные молекулы могут включать в себя поддающиеся детекции вещества, которые можно использовать, например, в диагностике. Примеры поддающихся детекции веществ включают в себя различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные изотопы, позитронно-активные металлы (для применения в позитронной эмиссионной томографии) и нерадиоактивные ионы парамагнитных металлов. См. в общем патент США № 4741900 относительно ионов металлов, которые можно конъюгировать с антителами для применения в качестве диагностических средств. Пригодные ферменты включают в себя пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; пригодные простетические группы включают в себя стрептавидин, авидин и биотин; пригодные флуоресцентные материалы включают в себя умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид и фикоэритрин; пригодные люминесцентные материалы включают в себя люминол; пригодные биолюминесцентные материалы включают в себя люциферазу, люциферин и экворин; и пригодные радиоактивные изотопы включают в себя ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In и ⁹⁹Tc.

В другом примере эффекторная молекула может увеличивать время полужизни антитела in vivo, и/или уменьшать иммуногенность антитела и/или улучшать доставку антитела через эпителиальный барьер в иммунную систему. Примеры пригодных эффекторных молекул этого типа включают в себя полимеры, альбумин, альбуминсвязывающие белки или альбуминсвязывающие соединения, такие как описанные в WO 05/117984.

Когда эффекторная молекула представляет собой полимер, она может, как правило, представлять собой синтетический или природный полимер, например необязательно замещенный полиалкиленовый, полиалкениленовый или полиоксиалкиленовый полимер с прямой или разветвленной цепью, или разветвленный или неразветвленный полисахарид, например гомо- или гетерополисахарид.

Конкретные необязательные заместители, которые могут присутствовать на вышеупомянутых синтетических полимерах, включают в себя одну или несколько гидрокси-, метил- или метоксигрупп.

Конкретные примеры синтетических полимеров включают в себя необязательно замещенные поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль) поли(виниловый спирт) с прямой или разветвленной цепью или их производные, особенно необязательно замещенный поли(этиленгликоль), такой как метоксиполи(этиленгликоль) или их производные.

Функциональные анализы

Как правило, пригодные связывающие домены для применения по настоящему изобретению можно идентифицировать посредством тестирования одной или нескольких пар связывающих доменов в функциональном анализе. Например, молекулу антитела против CD22, такую как мультиспецифическая молекула, содержащая связывающий домен, специфический для антигена CD22, и связывающий домен, специфический для антигена CD79a и/или CD79b, можно тестировать в одном или нескольких функциональных анализах.

Функциональный анализ, как применяют в настоящем документе, представляет собой анализ, который можно использовать для определения одного или нескольких желательных свойств или видов активности белковых комплексов, комплексов антител или смеси антител, подвергаемых воздействию условий анализа. Пригодные функциональные анализы могут представлять собой анализы связывания, анализы апоптоза, анализы антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), анализы комплементзависимой цитотоксичности (CDC), анализы ингибирования роста или пролиферации клеток (цитостатического эффекта), анализы уничтожения клеток (цитотоксического эффекта), анализы передачи сигналов клетками, анализы продукции цитокинов, анализы продукции антитела и переключения изотопов и дифференцировки клеток.

Эффективность мультиспецифических антител по настоящему описанию можно сравнивать с индивидуальными антителами или смесями (или фрагментами) антител в таких моделях посредством способов, в основном известных специалисту в данной области.

Функциональные анализы можно повторять несколько раз по необходимости для увеличения надежности результатов. Различные статистические тесты, известные специалисту в данной области, можно применять для идентификации статистически значимых результатов и таким образом идентификации

- 44 034647 мультиспецифических молекул с биологическими функциями.

Примеры пригодных функциональных анализов описаны в примерах в настоящем документе и включают в себя измерение способности мультиспецифической молекулы по настоящему изобретению ингибировать активацию B-клеток после стимуляции с использованием антител против IgM, как измерено посредством детекции ингибирования маркеров активации B-клеток, таких как экспрессия фосфорилированного Akt, экспрессия фосфорилированного P38, передача сигналов PLCy, экспрессия CD40, экспрессия CD71 и/или экспрессия CD86.

В одном примере молекула антитела, такого как мультиспецифическое антитело, по настоящему изобретению, обладает IC₅₀ менее 5 нМ для ингибирования экспрессии CD86 в стимулированных антителами против IgM B-клетках.

В одном варианте осуществления анализы in vivo, такие как модели на животных, включая модели опухолей на мышах, модели аутоиммунного заболевания, модели инфицированных вирусом или инфицированных бактериями грызунов или приматов, и т.п., можно применять для тестирования молекул по настоящему описанию.

Слитые белки, как применяют в настоящем документе, содержат белковый компонент, например A или B, слитый с другой молекулой, например партнером по связыванию X или Y (в соответствующих случаях). В одном варианте осуществления слитый белок представляет собой транслированный белок, экспрессированный рекомбинантными способами с генетической конструкции, например экспрессированный у хозяина с конструкции ДНК.

Функцией объединения X:Y является удержание белков A и B поблизости друг от друга, так что можно реализовывать синергическую функцию A и B.

Гетеродимерное объединение, как применяют в настоящем документе, относится к объединению, содержащему два различных партнера по связыванию X и Y, формирующих взаимодействие (например, связывание) между друг другом, обладающее общей аффинностью, достаточной для удержания двух партнеров по связыванию вместе. В одном варианте осуществления X и/или Y являются непригодными для формирования гомодимеров.

Гетеродимерно объединенные и гетеродимерное объединение используют в настоящем документе взаимозаменяемо.

В одном варианте осуществления непригодные для формирования гомодимеров, как применяют в настоящем документе, относится к тому, что формирование гетеродимеров X-Y является более предпочтительным, например, стабильным, например термодинамически стабильным и/или физически стабильным (например, с доказательством отсутствия агрегации), после формирования.

В одном варианте осуществления взаимодействие X-Y является более предпочтительным, чем взаимодействие Х-Х или Y-Y. Это уменьшает формирование гомодимеров Х-Х или Y-Y, когда слитые белки А-Х и B-Y смешивают. Это делает также удаление гомодимеров относительно простым, например, одна стадия очистки, такая как хроматография на колонке, обеспечивает, по существу, чистые слитые белки и/или биспецифические белковые комплексы по настоящему описанию.

В одном варианте осуществления один (или по меньшей мере один) из партнеров по связыванию является неспособным формировать гомодимер, например, в аминокислотную последовательность партнера по связыванию вносят мутации для исключения или минимизации формирования гомодимеров.

В одном варианте осуществления оба партнера по связыванию являются неспособными к формированию гомодимера, например, один из партнеров по связыванию представляет собой пептид, и другой партнер по связыванию представляет собой V_Hh, специфическую для указанного пептида.

В одном варианте осуществления scFv, применяемый в молекулах по настоящему описанию, является неспособным формировать гомодимер.

Неспособность к формированию гомодимеров, как применяют в настоящем документе, относится к низкой или нулевой предрасположенности к формированию гомодимеров. Низкий, как применяют в настоящем документе, относится к 5% или менее, например 4, 3, 2, 1, 0,5% или менее агрегатов.

В одном варианте осуществления: представляет собой взаимодействие связывания, например, на основании сил притяжения, таких как силы Ван-дер-Ваальса, такие как водородные связи и электростатические взаимодействия, например, на основании специфичности антитела для антигена, такого как пептид.

В одном варианте осуществления: не является ковалентной связью.

Формирование комплекса, как применяют в настоящем документе, относится к взаимодействию, включая взаимодействия связывания или химическую реакцию, которое является достаточно специфическим и сильным, когда компоненты слитого белка A-X и B-Y приводят в контакт в подходящих условиях, что комплекс собирается и слитые белки удерживаются вместе.

Удерживаются вместе, как применяют в настоящем документе, относится к удерживанию компонентов (слитых белков) поблизости друг от друга, так что после связывания с комплексом можно проводить манипуляции, как если бы это была одна молекула, и во многих случаях он ведет себя и действует подобно отдельной молекуле. В одном варианте осуществления удержание делает комплекс пригодным для применения в способе, описанном в настоящем документе, т.е. пригодным для применения по мень

- 45 034647 шей мере в одном функциональном скрининге.

В одном варианте осуществления взаимодействие связывания является обратимым.

Специфичность по отношению к X и Y, как применяют в настоящем документе, относится к тому, где партнеры по связыванию X и Y при взаимодействии узнают только друг друга или обладают значительно более высокой аффинностью друг для друга по сравнению с теми, которые не являются партнерами, например, по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз более высокой аффинностью.

В одном варианте осуществления взаимодействие связывания между X и Y обладает низкой константой диссоциации.

Примеры низкой константы диссоциации включают в себя 1-9*10^-2с^-1 или менее, например 1-9*10^-3с^-1, 1-9*10^-4с^-1, 1-9*10^-5с^-1, 1-9*10^-6с^-1 или 1-9*10^-7с^-1. В частности, пригодные константы диссоциации включают в себя 1*10^-4c^-1 или менее, например, 1*10^-5с^-1, 1^х10^-6е^-1 или 1*10^-7е^-1.

В то время как отсутствует намерение связи с теорией, считают, что низкая константа диссоциации (обозначаемая также как скорость диссоциации) позволяет молекулам являться достаточно стабильными, чтобы делать биспецифический белковый комплекс полезным, в частности, в функциональных анализах для скрининга.

В одном варианте осуществления аффинность X и Y друг для друга составляет 5 нМ или сильнее, например 4, 3, 2, 1 нМ или сильнее.

В одном варианте осуществления аффинность X и Y друг для друга составляет 900 пМ или сильнее, например 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 или 50 пМ или сильнее.

В другом варианте осуществления аффинность X и Y друг для друга составляет 10 пМ или сильнее, например 9, 8, 7, 6 или 5 пМ.

Аффинность представляет собой значение, рассчитываемое из скорости связывания и скорости диссоциации для взаимодействия. Термин аффинность, как применяют в настоящем документе, относится к силе суммы всех нековалентных взаимодействий между одиночным участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, пептида). Аффинность молекулы для его партнера по связыванию можно в общем представлять посредством равновесной константы диссоциации (KD). Аффинность можно измерять общепринятыми способами, известными в данной области, включая способы, описанные в настоящем документе, такие как способы поверхностного плазмонного резонанса, в частности BIAcore.

В одном варианте осуществления множество биспецифических белковых комплексов по настоящему описанию тестируют параллельно или, по существу, одновременно.

Одновременно, как применяют в настоящем документе, относится к тому, где образцы/молекулы/комплексы анализируют в одном и том же анализе, например в одном и том же прогоне.

В одном варианте осуществления одновременно относится к сопутствующему анализу, где выход сигнала анализируют посредством аппарата, по существу, в то же самое время. Может потребоваться деконволюция этого сигнала для интерпретации полученных результатов.

Преимущественно тестирование множества биспецифических белковых комплексов позволяет более эффективный скрининг большого количества биспецифических белковых комплексов и идентификацию новых и интересных взаимосвязей. Явно различные вариабельные области против представляющих интерес антигенов-мишеней CD22 и CD79 могут обеспечивать доступ к тонким нюансам биологической функции.

В одном варианте осуществления множество биспецифических белковых комплексов тестируют с использованием мультиплексного формата, как определено выше, и подвергания их одному или нескольким функциональным анализам.

Термин биологическая функция, как применяют в настоящем документе, относится к активности, которая является естественной или целевой для тестируемого биологического объекта, например естественная активность клетки, белка или т.п. В идеале присутствие функции можно тестировать с использованием функционального анализа in vitro, включая анализы с использованием живых клеток млекопитающих. Естественная функция, как применяют в настоящем документе, включает в себя измененную функцию, такую как функции, ассоциированные с злокачественными опухолями.

В одном варианте осуществления мультиспецифическая молекула антитела по настоящему описанию обладает новой или синергической функцией.

Термин синергическая функция, как применяют в настоящем документе, относится к биологической активности, не наблюдаемой, или превышающей наблюдаемую, когда первый и второй белки из биспецифического белкового комплекса по настоящему описанию не применяют вместе, например, активности, наблюдаемой только в биспецифической форме. Таким образом, синергический включает в себя новую биологическую функцию.

Новая биологическая функция, как применяют в настоящем документе, относится к функции, которая не является очевидной или отсутствует, пока два или более синергических объекта [белок A и белок B] не объединят (в качестве биспецифической молекулы или иным образом), или к ранее не идентифицированной функции.

Более высокий, как применяют в настоящем документе, относится к увеличению активности, вклю

- 46 034647 чая увеличение от нуля, т.е. некоторую активность биспецифической молекулы, когда индивидуальные не находящиеся в комплексе компонент или компоненты биспецифической молекулы не обладает/не обладают активностью в соответствующем функциональном анализе, что также обозначают в настоящем документе как новую активность или новую биологическую функцию. Более высокий, как применяют в настоящем документе, включает в себя также превышающий аддитивную функцию биспецифической молекулы в соответствующем функциональном анализе по сравнению с индивидуальными не находящимися в комплексе биспецифическими компонентами или бивалентными связывающими доменами, например, увеличение соответствующей активности на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300% или более.

В одном варианте осуществления новая синергическая функция представляет собой более высокую ингибирующую активность.

В одном варианте осуществления мультиспецифическая молекула антитела по настоящему изобретению обладает более высокой ингибирующей активностью, чем сумма активности бивалентного связывающего домена против CD22 и бивалентного связывающего домена против CD79a, представленных по отдельности или в смеси.

В одном варианте осуществления по меньшей мере один из первого партнера по связыванию, X, и второго партнера по связыванию, Y, из связанной пары независимо выбраны из пептида и белка; например первый партнер по связыванию или второй партнер по связыванию представляет собой пептид.

Пригодные пептиды включают в себя группу, содержащую GCN4, Fos/Jun (человеческий и мышиный Fos обладают номерами в Uniprot P01100 и P01101 соответственно, и человеческий и мышиный jun обладают номерами в Uniprot P05412 и P05627 соответственно), гемагглютинин вируса гриппа человека (HA), полигистидин (His), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и FLAG. Другие пептиды также предусматривают в качестве пригодных для применения по настоящему описанию, в частности, пригодными пептидами являются аффинные метки для очистки белка, поскольку такие пептиды проявляют тенденцию к связыванию с высокой аффинностью с их соответствующими партнерами по связыванию.

Термин пептид, как применяют в настоящем документе, относится к короткому полимеру из аминокислот, связанных пептидными связями, где пептид содержит в диапазоне 2-100 аминокислот, например 5-99, например 6-98, 7-97 или 8-96. В одном варианте осуществления пептид, применяемый по настоящему описанию, представляет собой аминокислотную последовательность из 50 аминокислотных остатков или менее, например 40, 30, 10 или менее. Пептиды, используемые по настоящему описанию, обладают достаточной длиной, чтобы соответствовать назначению, например, если пептид представляет собой линкер, необходимо, чтобы он являлся подходящим образом длинным, чтобы позволять фрагменту, с которым он связан, осуществлять его биологическую функцию; альтернативно, если пептид является партнером по связыванию, он должен являться способным к специфическому связыванию с другой молекулой, такой как антитело.

В одном варианте осуществления другой партнер по связыванию из связанной пары (альтернативно, первый или второй партнер по связыванию) представляет собой белок.

Белок, как применяют в настоящем документе, относится к аминокислотной последовательности из 100 аминокислот или более. В одном варианте осуществления белок, как применяют в настоящем документе, относится к аминокислотной последовательности с вторичной или третичной структурой.

В одном варианте осуществления первый белок, A, и/или второй белок, B, из биспецифического белкового комплекса представляет собой антитело или фрагмент антитела. Такой биспецифический белковый комплекс можно обозначать как биспецифический комплекс антител.

В одном варианте осуществления каждое антитело или фрагмент, применяемые в комплексе биспецифического антитела по описанию, содержит один участок связывания.

Полноразмерное антитело или фрагмент антитела, применяемые в слитых белках (А-Х или B-Y), могут являться моноспецифическими, мультивалентными или биспецифическими.

Преимущественно, применение двух биспецифических антител или фрагментов антител позволяет молекулам по настоящему описанию, таким как биспецифический комплекс антител, описанных в настоящем документе, потенциально являться специфическими для вплоть до 4 различных антигенов (т.е. комплекс может являться тетраспецифическим). Это позволяет исследовать эффекты типа авидности.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как первый слитый белок А-Х, представляют собой моноспецифическое антитело или фрагмент антитела, например Fab, Fab', scFv или т.п., и, в частности, являются специфическими для CD22.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как второй слитый белок B-Y, представляют собой моноспецифическое антитело или фрагмент антитела, например Fab, Fab', scFv или т.п., и, в частности, являются специфическими для CD79a и/или CD79b.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как второй слитый белок B-Y, являются мультивалентными, т.е. обладают двумя или более связывающими доменами.

- 47 034647

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как первый слитый белок A-X, являются моновалентными, и антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как второй слитый белок, B-X, являются моновалентными.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как первый слитый белок A-X, является моновалентным, и антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как второй слитый белок B-Y, является мультивалентным.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как первый слитый белок A-X, являются мультивалентными, и антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как второй слитый белок B-Y, являются моновалентными.

В одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как первый слитый белок A-X, являются мультивалентными, и антитело или фрагмент антитела, применяемые в молекулах по настоящему описанию, или их компоненты, такие как второй слитый белок B-Y, являются мультивалентными.

В одном варианте осуществления первое антитело, второе антитело или как первое, так и второе антитело из молекул по настоящему описанию или их компонентов, например биспецифический комплекс антител, могут находиться в формате IgG, например антитело против CD22 и/или против CD79 можно предоставлять в формате IgG.

В одном варианте осуществления фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из фрагмента антигена (Fab) фрагмента, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) и однодоменного антитела (sdAb), такого как scFv, применяют в первом (A-X) или втором слитом белке (B-Y). Преимущественно небольшой размер scFv может облегчать правильное сворачивание биспецифических комплексов антител.

В одном варианте осуществления первое (A), второе антитело/фрагмент (B) или как первое, так и второе антитело/фрагмент из биспецифического комплекса антител по настоящему описанию может представлять собой Fab.

В одном варианте осуществления первое, второе антитело/фрагмент или как первое, так и второе антитело/фрагмент из биспецифического комплекса антител по настоящему описанию представляет собой/представляют собой V_HH.

Слитый белок, как применяют в контексте биспецифического комплекса по настоящему описанию, относится к белку, например антителу или фрагменту антитела, прикрепленному к партнеру по связыванию.

Для удобства биспецифические белковые комплексы по настоящему описанию обозначают в настоящем документе как A-X:Y-B. Однако эта номенклатура не предназначена для ограничения того, как сконструированы слитые белки A-X и B-Y, поскольку эксперименты авторов настоящего изобретения указывают на то, что партнеры по связыванию X и Y могут являться обращенными, т.е. A-Y и B-X, без неблагоприятного воздействия на способ. Таким образом, A и B, и X, и Y являются нормальными метками, обозначенными, чтобы способствовать объяснению настоящей технологии.

Прикрепленный, как применяют в настоящем документе, относится к соединенному или связанному напрямую или опосредованно посредством линкера, такого как пептидный линкер, примеры которого обсуждают ниже. Соединенный напрямую включает в себя слитый вместе (например, пептидной связью) или конъюгированный химически.

Партнер по связыванию, как применяют в настоящем документе, относится к части одного компонента связанной пары.

В одном варианте осуществления аффинность партнеров по связыванию является высокой, 5 нМ или сильнее, например 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 пМ или сильнее.

Связанная пара, как применяют в настоящем документе, относится к двум партнерам по связыванию, которые специфически связываются друг с другом. Примеры связанной пары включают в себя пептид и антитело или связывающий фрагмент, специфические для него, или фермент и лиганд, или фермент и ингибитор этого фермента.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (X) выбран из группы, содержащей полноразмерное антитело, Fab, Fab', scFv, пептид и sdAb, где примеры sdAb включают в себя V_H или V_L или V_HH.

В одном варианте осуществления второй партнер (Y) выбран из группы, содержащей: полноразмерное антитело, Fab, Fab', scFv, пептид и sdAb, где примеры sdAb включают в себя V_H или V_L или V_HH.

В одном варианте осуществления, где A представляет собой антитело или его фрагмент, первый

- 48 034647 партнер по связыванию (X) присоединен к C-концу тяжелой или легкой цепи первого антитела или фрагмента антитела, например первый партнер по связыванию присоединен к C-концу тяжелой цепи первого антитела или фрагмента антитела.

В другом варианте осуществления, где B представляет собой антитело или его фрагмент, второй партнер по связыванию (Y) присоединен к C-концу тяжелой или легкой цепи второго антитела или фрагмента антитела, например второй партнер по связыванию присоединен к C-концу тяжелой цепи второго антитела или фрагмента антитела.

В одном варианте осуществления X присоединен к C-концу тяжелой цепи антитела или фрагмента (белок A) и Y присоединен к С-концу антитела или фрагмента (белок B).

В одном варианте осуществления X присоединен посредством линкера (например, ASGGGG или ASGGGGSG) к C-концу тяжелой цепи антитела или фрагмента (белок A) и Y присоединен посредством линкера (например, ASGGGG или ASGGGGSG) к C-концу антитела или фрагмента (белок B).

В одном варианте осуществления первый или второй партнер по связыванию (X или Y) представляет собой пептид.

Примеры пригодной связанной пары могут включать в себя GCN4 (SEQ ID NO: 247) или его вариант и 52SR4 (SEQ ID NO: 249) или его вариант, который представляет собой scFv, специфический для GCN4.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (номинально X) представляет собой GCN4 (например, как показано в SEQ ID NO: 247) или его вариант (например, без метки His), и второй партнер по связыванию (номинально Y) представляет собой scFv, специфический для GCN4 (например, как показано в SEQ ID NO: 249), или его вариант.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (номинально X) представляет собой sFv, специфический для GCN4 (например, как показано в SEQ ID NO: 249) или его вариант, и второй партнер по связыванию (номинально Y) представляет собой GCN4 (например, как показано в SEQ ID NO: 247) или его вариант.

Варианты GCN4 включают в себя аминокислотную последовательность по меньшей мере с 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 247. Варианты GCN4 включают в себя также аминокислоты, обладающие по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 248, или нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 145 в строгих условиях.

Пригодный scFv, специфический для GCN4, представляет собой 52SR4 (SEQ ID NO: 146) или его вариант. Варианты 52SR4 включают в себя аминокислотную последовательность по меньшей мере с 80, или 85, или 90, или 95, или 98, или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 250. Варианты 52SR4 включают в себя также аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80, или 85, или 90, или 95, или 98, или 99% идентичностью с последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 146, или нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 248 в строгих условиях.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что одноцепочечное антитело 52SR4 и пептид GCN4 представляют собой связанную пару, пригодную для применения в биспецифических белковых комплексах по настоящему описанию.

Альтернативно, любые пригодные антитело/фрагмент и антиген (например, пептид) можно применять в качестве X и Y.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (X) и второй партнер по связыванию (Y) представляют собой белки.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (X) представляет собой фермент или его активный фрагмент, и второй партнер по связыванию (Y) представляет собой лиганд или наоборот.

В одном варианте осуществления первый партнер по связыванию (X) представляет собой фермент или его активный фрагмент, и второй партнер по связыванию (Y) представляет собой ингибитор этого фермента или наоборот.

Активный фрагмент, как применяют в настоящем документе, относится к аминокислотному фрагменту, который является меньшим, чем полная аминокислотная последовательность молекулы, и сохраняет в основном такую же биологическую активность или соответствующую биологическая активность, например более чем 50% активность, такую как 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.

В другом варианте осуществления первый партнер по связыванию X представляет собой глутатион (GSH), и второй партнер по связыванию Y представляет собой глутатион^-трансферазу (GST) или наоборот.

В другом варианте осуществления X представляет собой Fos, и Y представляет собой Jun или наоборот.

В другом варианте осуществления X представляет собой His, и Y представляет собой антитело про

- 49 034647 тив His или наоборот.

В другом варианте осуществления связанная пара представляет собой связывающий кальмодулин пептид, и Y представляет собой кальмодулин или наоборот.

В другом варианте осуществления X представляет собой связывающий мальтозу белок, и Y представляет собой антитело против связывающего мальтозу белка или его фрагмента, или наоборот.

Другие комбинации фермент-лиганд также предусматривают для применения в партнерах по связыванию. Пригодными являются также аффинные метки, известные в данной области для очистки белка, поскольку они проявляют тенденцию к связыванию с высокой аффинностью с их соответствующими партнерами по связыванию.

Степень идентичности и сходства можно легко рассчитать (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., и Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991, программное обеспечение BLAST™, доступное из NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

В одном варианте осуществления первый или второй партнер по связыванию (X или Y) представляет собой белок или пептид.

В одном варианте осуществления первый и второй слитые белки содержат один или несколько пептидных линкеров. Линкеры можно включать в различных локализациях в слитые белки. Например, линкер можно вводить между партнером по связыванию и присоединенным к нему белком.

В одном варианте осуществления линкер представляет собой пептидный линкер.

Термин пептидный линкер, как применяют в настоящем документе, относится к пептиду с аминокислотными последовательностями. Ряд пригодных пептидных линкеров известен специалисту в данной области.

В одном варианте осуществления пептидный линкер может иметь синтетическое происхождение, т.е. быть получен способами синтетической химии.

В одном варианте осуществления партнеры по связыванию из биспецифических белковых комплексов присоединены к соответствующим им белкам посредством пептидных линкеров.

В одном варианте осуществления слитые белки представляют собой трансляционный слитый белок, т.е. представляет собой слитый белок, экспрессированный в клетках-хозяевах, содержащих генетическую конструкцию, с которой экспрессируют слитый белок.

В одном варианте осуществления слитый белок получают посредством конъюгации A с X или B с Y необязательно посредством пептидного линкера.

В одном варианте осуществления пептидный линкер имеет длину 50 аминокислот или менее, например 20 аминокислот или менее.

Как правило, может являться более эффективным экспрессировать слитый белок рекомбинантным способом, и таким образом, прямая пептидная связь или пептидный линкер, которые можно экспрессировать посредством клетки-хозяина, могут обеспечивать преимущества.

В одном варианте осуществления сформированные комплексы не требуют дополнительных стадий очистки.

В одном варианте осуществления сформированные комплексы требуют одну стадию очистки, например, хроматографии на колонке.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя по меньшей мере одну стадию очистки, например, после экспрессии слитого белка по настоящему описанию.

Функциональный анализ, как применяют в настоящем документе, представляет собой анализ, который можно использовать для определения одного или нескольких желательных свойств или видов активности белковых комплексов, комплексов антител или смеси антител, подвергаемых воздействию условий анализа. Пригодные функциональные анализы могут представлять собой анализы связывания, анализы апоптоза, анализы антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), анализы комплементзависимой цитотоксичности (CDC), анализы ингибирования роста или пролиферации клеток (цитостатического эффекта), анализы уничтожения клеток (цитотоксического эффекта), анализы передачи сигналов клетками, анализы продукции цитокинов, анализы продукции антитела и переключения изотопов и дифференцировки клеток. В одном варианте осуществления анализы in vivo, такие как модели на животных, включая модели опухолей на мышах, модели аутоиммунного заболевания, модели инфицированных вирусом или инфицированных бактериями грызунов или приматов, и т.п., можно применять для тестирования молекул по настоящему описанию.

В контексте биспецифических комплексов антител эффективность биспецифических комплексов антител по настоящему описанию можно сравнивать с индивидуальными антителами или смесями антител (или фрагментов) в таких моделях посредством способов, в общем известных специалисту в данной

- 50 034647 области.

Функциональные анализы можно повторять несколько раз по необходимости в присутствии или в отсутствие различных образцов конкретного биспецифического комплекса антител для увеличения надежности результатов. Различные статистические тесты, известные специалисту в данной области, можно применять для идентификации статистически значимых результатов и, таким образом, идентификации биспецифических комплексов антител с биологическими функциями, в частности для идентификации оптимальных пар вариабельных областей для применения в мультиспецифической молекуле по настоящему изобретению.

Композиции и медицинские применения

В одном аспекте представлена молекула по настоящему описанию или компонент, такой как слитый белок, гетеродимерно объединенный биспецифический белковый комплекс, композиция, содержащая молекулу по изобретению, включая слитый белок или указанный биспецифический белковый комплекс, мультиплексный объект, массив, библиотека, как определено в настоящем документе.

В одном варианте осуществления молекулы по настоящему описанию, например антитело, описанное в настоящем документе, мультиспецифическая молекула и биспецифический белковый комплекс, являются пригодными для терапевтических применений и могут обеспечивать новые лекарственные средства для лечения заболеваний. Таким образом, в следующем аспекте представлена молекула антитела по настоящему описанию, например биспецифический белковый комплекс, как описано выше, для применения в терапии. Молекулы по настоящему описанию, включая биспецифические белковые комплексы, описанные в настоящем документе, являются пригодными для лечения ряда заболеваний, таких как злокачественная опухоль.

Молекулы по настоящему описанию, включая мультиспецифические молекулы и биспецифические белковые комплексы, описанные в настоящем документе, являются также особенно подходящими для ингибирования функции B-клеток для контроля иммунных и аутоиммунных реакций при различных аутоиммунных заболеваниях.

Таким образом, настоящее описание распространяется на способ лечения заболевания у пациента, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества молекулы по настоящему описанию, например мультиспецифической молекулы или биспецифического белкового комплекса по настоящему описанию.

В одном аспекте представлена фармацевтическая композиция, содержащая одну или несколько молекул по настоящему описанию, например мультиспецифическую молекулу по настоящему описанию.

Разнообразные различные компоненты можно включать в композицию, включая фармацевтически приемлемые носители, наполнители и/или разбавители. Композиция может, необязательно, содержать дополнительные молекулы, способные изменять характеристики популяции мультиспецифических молекул по изобретению, таким образом, например, уменьшая, стабилизируя, модулируя и/или активируя функцию антител. Композиция может находиться в твердой или жидкой форме и может, среди прочего, находиться в форме порошка, таблетки, раствора или аэрозоля.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или диагностической композиции, содержащей молекулу антитела или мультиспецифической молекулы по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими из фармацевтически приемлемого наполнителя, разбавителя или носителя.

Соответственно, представлено применение мультиспецифической молекулы по изобретению для применения в лечении и для изготовления лекарственного средства для лечения патологического состояния или нарушения.

Патологические состояния

Патологическое состояние или нарушение, можно, например, выбирать из группы, состоящей из инфекции (вирусный, бактериальной, грибковой и паразитической), эндотоксинового шока, ассоциированного с инфекцией, артрита, такого как ревматоидный артрит, астмы, такой как тяжелая астма, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, заболевания Пейрони, целиакии, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, послеоперационных спаек, инсульта, диабета типа I, болезни Лайма, менингоэнцефалита, аутоииммунного увеита, иммуноопосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, таких как рассеянный склероз, волчанки (например, системной красной волчанки) и синдрома Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, болезни Грэйва, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, болезни Меньера, пемфигуса, первичного биллиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, гранулематоза Вегенера, других аутоиммунных нарушений, панкреатита, травмы (хирургической операции), реакции трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, заболевания сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, так же как атеросклероз, внутрисосудистого свертывания крови, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита, гипохлоргидрии и злокачественной опухоли, включая рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, рак яичника, печеночноклеточный рак, рак тол

- 51 034647 стого кишечника, рак поджелудочной железы, рак пищевода, рак головы и шеи, почки, и злокачественной опухоли, в частности почечноклеточного рака, рака предстательной железы, рака печени, меланомы, саркомы, миеломы, нейробластомы, хориокарциномы плаценты, рака шейки матки и рака щитовидной железы, и их метастазирующих форм.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой злокачественную опухоль, например лейкоз, включая лимфоцитарный лейкоз, такой как острый лимфобластный лейкоз или хронический лимфоцитарный лейкоз; или миелогенный лейкоз, такой как острый миелогенный лейкоз или хронический миелогенный лейкоз.

В одном варианте осуществления аутоиммунное заболевание включает в себя острый диссеминированный энцефаломиелит (adem), острый некротизирующий геморрагический лейкоэнцефалит, болезнь Аддисона, недостаточность надпочечников, гипокортизолизм, очаговую алопецию, амилоидоз, анкилозирующий спондилит, спондилоартрит, болезнь Штрюмпелля-Мари, анти-GBM/анти-TBM-нефрит, антифосфолипидный синдром (aps), аутоимунный ангиоотек, аутоимунную апластическую анемию, аутоимунную вегетативную дистонию, аутоиммунный гепатит, аутоимунную гиперлипидемию, аутоимунный иммунодефицит, аутоимунное заболевание внутреннего уха (AIED), аутоимунный лимфопролиферативный синдром (ALPS), синдром Канале-Смита, аутоимунный миокардит, аутоимунный оофорит, аутоимунный панкреатит (AIP), аутоимунные полигландулярные синдромы (типов I, II и III), аутоимунную ретинопатию (AR), аутоимунную тромбоцитопеническую пурпуру (ATP), аутоимунное заболевание щитовидной железы, аутоимунную крапивницу, аксональные/нейрональные невропатии, болезнь Бало, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, болезнь Кастлемена, целиакию, болезнь Чагаса, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию (CIDP), хронический рецидивирующий множественный остеомиелит (CRMO), синдром Черджа-Стросс, рубцовый пемфигоид/доброкачественный пемфигоид слизистых оболочек (CP), болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, колиты, энтерит, илеит, синдром Когана, болезнь холодовой агглютинации, врожденную блокаду сердца, миокардит Коксаки, заболевание crest, криоглобулинемию, демиелинизирующие невропатии, герпетиформный дерматит, болезнь Дюринга, дерматомиозит, диабет, типа I, дискоидную красную волчанку (DLE), синдром Дресслера, эндометриоз, буллезный эпидермолиз (EB) и буллезный эпидермолиз acquisita (EBA), эозинофильный гастроэнтерит, эзофагит, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана, узловатую эритему, экспериментальный аллергический энцефаломиелит, синдром Эванса, фиброзирующий альвеолит, гигантоклеточный артериит (височный артериит), гигантоклеточный миокардит, гломерулонефрит (не пролифератинвный: фокальный сегментарный гломерулосклероз и мембранозный гломерулонефрит, пролиферативный: IgA-нефропатия), синдром Гудпасчера, гранулематоз с полиангиитом (GPA) (ранее называемый гранулематозом Вегенера), болезнь Грэйвса, синдром ГийенаБарре, синдром Миллера-Фишера, острую моторную аксональную невропатию, острую панавтономную невропатию, стволовой энцефалит Бикерстаффа, энцефалит Хашимото, тиреоидит Хашимото, гемолитическую анемию, пурпуру Геноха-Шенлейна, гестационный герпес, гипогаммаглобулинемию, идиопатический пульмонарный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), IgA-нефропатию (IGAN), синдром Бергера, совместный фарингит и гломерулонефрит, IgA-пемфигус, связанное с IgG4 склерозирующее заболевание, иммуно-регулируемое бесплодие, миозит с тельцами включения, инсулинзависимый сахарный диабет, интерстициальный цистит, синдром Исаака, нейромиотонию, ювенильный артрит, ювенильный миозит, болезнь Кавасаки, синдром Ламберта-Итона, лейкоцитокластический васкулит, плоский лишай, склерозирующий лишай, деревянистый конъюнктивит, зависимый от IgA линейный дерматоз (LAD), пемфигоид, волчанку (SLE), болезнь Лайма, болезнь Меньер, микроскопический полиангиит (MPA), смешанное заболевание соединительной ткани (MCTD), моноклональную гаммапатию, язву Мурена, болезнь Мухи-Габерманна, рассеянный склероз, миастению, миозит, нарколепсию, оптиконевромиелит Девика (Девика), нейромиотония, синдром Исаака (приобретенный, паранеопластический, наследственный), нейтропению, глазной рубцовый пемфигоид, оптический неврит, оофорит, опсо-миоклональный синдром, орхит, палиндромный ревматизм, pandas (детские аутоиммунные нервнопсихические расстройства, ассоциированные со стрептококковыми инфекциями), паранеопластический аутоимунный синдром множественного поражения органов (PAMS), паранеопластическую мозжечковую дегенерацию, паранеопластический пемфигус (PNP), пароксизмальную ночную гемоглобинурию (PNH), синдром Парри-Ромберга, синдром Персонейджа-Тернера, промежуточный увеит (периферический увеит), гестационный пемфигоид (PG), обыкновенную пузырчатку (PV), листовидную пузырчатку (PF), периферическую невропатию, перивенозный энцефаломиелит, пернициозную анемию, синдром Poems, узелковый полиартериит (PAN), ревматическую полимиалгию, полимиозит, постинфарктный синдром, постперикардиотомический синдром, прогестероновый дерматит, первичный биллиарный цирроз, синдром Гано, первичный склерозирующий холангит (PSC), склерозирующий холангит, псориаз, псориатический артрит, гангренозную пиодермию, истинную эритроцитарную аплазию, энцефалит Расмуссена, хронический очаговый энцефалит (CFE), феномен Рейно, реактивный артрит, синдром Рейтера, ассоциированную с рековерином ретинопатию (RAR), симпатическую рефлекторную дистрофию, синдром Рейтера, рецидивирующий полихондрит, синдром беспокойных ног, ретроперитонеальный фиброз, ревматическую атаку, ревматоидный артрит, саркоидоз, синдром Шмидта, склерит, склеродермия, системную

- 52 034647 склеродермию, синдром Шегрена, аутоиммунитет к сперме и яичкам, синдром скованного индивидуума/человека, подострый бактериальный эндокардит (SBE), синдром Сусака, симпатическую офтальмию, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, облитерирующий тромбангиит, болезнь Бюргера, тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), синдром Толоса-Ханта, поперечный миелит, язвенный колит, недифференцированное заболевание соединительной ткани (UCTD), увеит, ревматическую полимиалгию, артериит Такаясу, височный артериит, болезнь Бюргера, кожный васкулит, болезнь Кавасаки, узелковый полиартериит, синдром Бехчета, синдром Черджа-Стросс, кожный васкулит, пурпуру Геноха-Шенлейн, микроскопический полиангиит, гранулематоз Вегенера, васкулит гольфиста, везикулобуллезный дерматоз, витилигогранулематоз Вегенера (в настоящее время называемый гранулематозом с полиангиитом (GPA).

В одном варианте осуществления аутоиммунное заболевание выбрано из группы, содержащей или состоящий из следующего: васкулит ANCA, IgA-нефропатия (Бергера), обыкновенная пузырчатка/буллезный пемфигоид, ITP, первичный биллиарный цирроз, аутоимунный тиреоидит (болезнь Грэйва), болезнь Хашимото, волчаночный нефрит, мембранозный гломерулонефрит (или мембранозная нефропатия), APS, миастения, оптиконевромиелит, первичный синдром Шегрена, аутоиммунная нейтропения, аутоимунный панкреатит, дерматомиозит, аутоимунный увеит, аутоимунная ретинопатия, болезнь Бехчета, IPF, системная склеродермия, фиброз печени, аутоиммунный гепатит, первичный склерозирующий холангит, витилиго, синдром Гудпасчера, легочно-альвеолярный протеиноз, хроническая аутоимунная крапивница, псориаз, ревматоидный артрит, псориатический артрит, аксиальный спондилоартрит, трансплантация (включая GvHD), астма, COPD, гигантоклеточный артериит, невосприимчивые аутоимунные цитопении, синдром Эванса (аутоимунная гемолитическая анемия), диабет type I, саркоидоз, полимиозит, язвенный колит, болезнь Крона, целиакия, макроглобулинемия Вальденстрема, фокальный сегментарный гломерулосклероз, хроническая болезнь Лайма (боррелиоз Лайма), плоский лишай, синдром скованного индивидуума, дилатационная кардиомиопатия, аутоимунный (лимфоцитарный) оофорит, приобретенный буллезный эпидермолиз, аутоиммунный атрофический гастрит, перниционзая анемия, атопический дерматит, атеросклероз, рассеянный склероз, энцефалит Расмуссена, синдром Гийена-Барре, приобретенная нейромиотония, инсульт.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой злокачественную опухоль, например лейкоз, например, лимфоцитарный лейкоз, такой как острый лимфобластный лейкоз или хронический лимфоцитарный лейкоз; или миелогенный лейкоз, такой как острый миелогенный лейкоз или хронический миелогенный лейкоз; или лимфома, такая как диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома или лимфома Ходжкина или неходжкинская лимфома.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или диагностической композиции, содержащий молекулу по настоящему описанию, такую как мультиспецифическая молекула, описанная в настоящем документе в комбинации с одним или несколькими из фармацевтически приемлемого наполнителя, разбавителя или носителя. Соответственно, представлено применение молекулы по настоящему описанию, такой как мультиспецифическая молекула, как описано в настоящем документе, для применения в лечении и в изготовлении лекарственного средства.

Композицию, как правило, поставляют в качестве части стерильной фармацевтической композиции, которая в норме включает фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может, кроме того, содержать фармацевтически приемлемый адъювант.

Настоящее изобретение также относится к способу получения фармацевтической или диагностической композиции, включающему в себя добавление и смешивание мультиспецифической молекулы по настоящему изобретению вместе с одним или несколькими из фармацевтически приемлемого наполнителя, разбавителя или носителя.

Термин фармацевтически приемлемый наполнитель, как применяют в настоящем документе, относится к фармацевтически приемлемому для составления носителю, раствору или добавке для улучшения желательных характеристик композиций по настоящему описанию. Наполнители хорошо известны в данной области и включают в себя буферы (например, цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), ЭДТА, хлорид натрия, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии можно инкапсулировать в липосомы или биоразлагаемые микросферы. Состав, как правило, можно предоставлять, по существу, в стерильной форме, с применением способов изготовления в стерильных условиях.

Это может включать в себя получение и стерилизацию посредством фильтрации забуференного раствора растворителя, применяемого для составления, асептической суспензии антитела в стерильном забуференном растворе растворителя, и распределения состава в стерильную тару способами, известными специалисту в данной области.

Фармацевтически приемлемый носитель сам по себе не должен индуцировать продукцию антител, опасных для индивидуума, которому вводят композицию, и не должен являться токсичным. Пригодные носители могут представлять собой большие, медленно подвергаемые метаболизму макромолекулы, такие как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кисло

- 53 034647 ты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные частицы вирусов.

Можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Такие носители позволяют составление фармацевтических композиций в форме таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий для проглатывания пациентом.

Молекулы по описанию, такие как мультиспецифическая молекула, описанная в настоящем документе, можно доставлять диспергированными в растворителе, например, в форме раствора или суспензии. Их можно суспендировать в пригодном физиологическом растворе, например физиологическом солевом растворе, фармакологически приемлемом растворителе или забуференном растворе. Забуференные растворы, известные в данной области, могут содержать 0,05-0,15 мг диэдетата натрия, 8,0-9,0 мг NaCl, 0,15-0,25 мг полисорбата, 0,25-0,30 мг безводной лимонной кислоты и 0,45-0,55 мг цитрата натрия на 1 мл воды, так, чтобы достигать рН приблизительно 4,0-5,0. Как упомянуто выше, суспензию можно получать, например, из лиофилизированного антитела.

Всестороннее обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

Термин терапевтически эффективное количество, как применяют в настоящем документе, относится к количеству лекарственного средства, необходимого для лечения, облегчения или предотвращения намеченного заболевания или состояния, или для проявления поддающегося детекции терапевтического или профилактического эффекта. Для любого антитела, терапевтически эффективное количество можно первоначально оценивать либо в анализах культур клеток, либо в моделях на животных, обычно у грызунов, кроликов, собак, свиней или приматов. Модель на животных можно также использовать для определения подходящего диапазона концентраций и способа введения. Такую информацию можно затем использовать для определения доз, которые можно использовать, и способов введения человеку.

Точное терапевтически эффективное количество для субъекта-человека зависит от тяжести состояния заболевания, общего состояния здоровья субъекта, возраста, массы и пола субъекта, диеты, времени и частоты введения, комбинацию(комбинации) лекарственных средств, реакцию чувствительности и устойчивости/ответа на терапию. Это количество можно определять посредством общепринятых экспериментов, и оно находится в компетенции лечащего врача. Как правило, терапевтически эффективное количество может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, например от 0,1 до 20 мг/кг. Альтернативно, доза может составлять от 1 до 500 мг в сутки, например 10-100, 200, 300 или 400 мг в сутки. Фармацевтические композиции можно удобно представлять в форме единичных доз, содержащих предопределенное количество действующего вещества по изобретению.

Композиции можно вводить пациенту по отдельности, или их можно вводить в комбинации (например, одновременно, последовательно или отдельно) с другими средствами, лекарственными средствами или гормонами.

Доза, в которой вводят мультиспецифическую молекулу по настоящему описанию, зависит от характера состояния, подлежащего лечению, степени присутствующего воспаления и от того, используют ли молекулу антитела профилактически или для лечения существующего состояния.

Частота дозирования зависит от времени полужизни мультиспецифической молекулы и длительности ее эффекта. Если мультиспецифическая молекула обладает коротким временем полужизни (например, 2-10 ч), может являться необходимым введение одной или нескольких доз в сутки. Альтернативно, если мультиспецифическая молекула обладает длительным временем полужизни (например, 2-15 суток), может являться необходимым введение только дозы один раз в сутки, один раз в неделю или даже один раз в каждые 1 или 2 месяца.

По настоящему описанию pH конечного состава не является сходным с значением изоэлектрической точки мультиспецифической молекулы, если pH состава составляет 7, тогда pI от 8-9 или выше может являться пригодным. В то время как отсутствует намерение связи с теорией, считают, что это может в конечном счете обеспечивать конечный состав с улучшенной стабильностью, например, антитело или фрагмент остается в растворе.

Фармацевтические композиции по этому изобретению можно вводить посредством любого количества способов, включая, но без ограничения, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, интратекальный, интравентрикулярный, трансдермальный, чрескожный (например, см. WO 98/20734), подкожный, внутрибрюшинный, интраназальный, кишечный, местный, подъязычный, интравагинальный или ректальный способы. Безыгольные шприцы также можно использовать для введения фармацевтических композиций по изобретению.

Прямую доставку композиций можно, как правило, осуществлять посредством инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно, или доставлять в межклеточное пространство ткани. Композиции можно также вводить в конкретную представляющую интерес ткань. Дозирование для лечения может представлять собой расписание для однократной дозы или расписание для множест

- 54 034647 венных доз.

Когда продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может принимать форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном носителе, и он может содержать средства для получения составов, такие как суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, мультиспецифическая молекула может находиться в сухой форме, для разведения перед использованием в подходящей стерильной жидкости. Если композиция предназначена для введения способом с использованием желудочно-кишечного тракта, может являться необходимым, чтобы композиция содержала средство, которое защищает антитело от деградации, но которое высвобождает биспецифический белковый комплекс после его абсорбции из желудочно-кишечного тракта.

Пригодный для распыления состав по настоящему описанию можно предоставлять, например, в форме однократных единичных доз (например, в герметично закрытых пластиковых контейнерах или флаконах), упакованных в оболочки из фольги. Каждый флакон содержит единичную дозу в объеме, например, 2 мл буферного растворителя/раствора.

Термин вариант, как применяют в настоящем документе, относится к пептиду или белку, содержащему по меньшей мере одно изменение аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности по сравнению с аминокислотной или нуклеотидной последовательностью соответствующего пептида или белка дикого типа. Вариант может обладать по меньшей мере 80, или 85, или 90, или 95, или 98, или 99% идентичностью последовательности с соответствующим пептидом или белком дикого типа. Однако для варианта является возможным обладать менее чем 80% идентичностью последовательности, при условии, что вариант обладает, по существу, сходной функцией с соответствующим ему пептидом или белком дикого типа.

В одном варианте осуществления конструкция по настоящему описанию является, по меньшей мере, триспецифической. В этой ситуации дополнительная специфичность может быть нацелена на любой представляющий интерес антиген, например антигены для продления времени полужизни, такие как альбумин или неонатальный рецептор Fc (FcRn); антигены для эффекторной функции, такие как активирующие или ингибирующие рецепторы Fc или костимулирующие молекулы; антигены для нацеливания на ткань или клетку или антигены, чтобы способствовать переносу через гематоэнцефалический барьер (BBB), такие как рецептор трансферрина или LRP1.

Описание распространяется также на композиции, такие как фармацевтические композиции, содержащие указанные новые форматы с конкретной антигенной специфичностью.

В следующем аспекте описание относится к применению форматов и композиций в лечении.

Настоящее изобретение также относится к способу получения фармацевтической или диагностической композиции, включающему в себя добавление и смешивание молекулы антитела или мультиспецифической молекулы по настоящему изобретению вместе с одним или несколькими из фармацевтически приемлемого наполнителя, разбавителя или носителя.

Молекула антитела или мультиспецифическая молекула может являться единственным активным ингредиентом в фармацевтической или диагностической композиции или может сопровождаться другими активными ингредиентами, включая другие ингредиенты - антитела или не относящиеся к антителам ингредиенты, такие как стероиды или другие молекулы лекарственного средства.

Фармацевтические композиции подходящим образом содержат терапевтически эффективное количество антитела по изобретению. Термин терапевтически эффективное количество, как применяют в настоящем документе, относится к количеству лекарственного средства, необходимого для лечения, облегчения или предотвращения намеченного заболевания или состояния, или для проявления поддающегося детекции терапевтического или профилактического эффекта. Для любого антитела терапевтически эффективное количество можно первоначально оценивать либо в анализах культур клеток, либо в моделях на животных, обычно у грызунов, кроликов, собак, свиней или приматов. Модель на животных можно также использовать для определения подходящего диапазона концентраций и способа введения. Такую информацию можно затем использовать для определения доз, которые можно использовать, и способов введения человеку.

Точное терапевтически эффективное количество для субъекта-человека зависит от тяжести состояния заболевания, общего состояния здоровья субъекта, возраста, массы и пола субъекта, диеты, времени и частоты введения, комбинацию (комбинации) лекарственных средств, реакцию чувствительности и устойчивости/ответа на терапию. Это количество можно определять посредством общепринятых экспериментов и оно находится в компетенции лечащего врача. Как правило, терапевтически эффективное количество может составлять от 0,01 до 500 мг/кг, например от 0,1 до 200 мг/кг, например, 100 мг/кг.

Фармацевтические композиции можно удобно представлять в форме единичных доз, содержащих предопределенное количество действующего вещества по изобретению на дозу.

Средства, как применяют в настоящем документе, относятся к веществу, которое при введении оказывает физиологическое действие.

- 55 034647

Лекарственное средство, как применяют в настоящем документе, относится к химическому веществу, которое в терапевтической дозе оказывает соответствующее физиологическое действие.

В одном варианте осуществления антитела или фрагменты по настоящему описанию применяют вместе с терапией иммунодепрессантом, таким как стероид, в частности преднизон.

В одном варианте осуществления антитела или фрагменты по настоящему описанию применяют вместе с терапией ритуксимабом или другой нацеленной на B-клетки терапией.

В одном варианте осуществления антитела или фрагменты по настоящему описанию применяют вместе с терапией любым средством, модулирующим B-клетки или T-клетки, или иммуномодулятором. Примеры включают в себя метотрексат, микрофениолят и азатиоприн.

Доза, в которой вводят молекулу антитела по настоящему изобретению, зависит от характера состояния, подлежащего лечению, степени присутствующего воспаления и от того, используют ли молекулу антитела профилактически или для лечения существующего состояния.

Частота дозирования зависит от времени полужизни молекулы антитела и длительности ее эффекта. Если молекула антитела обладает коротким временем полужизни (например, 2-10 ч), может являться необходимым введение одной или нескольких доз в сутки. Альтернативно, если молекула антитела обладает длительным временем полужизни (например, 2-15 суток),и/или длительным профилем фармакодинамики (PD), может являться необходимым введение только дозы один раз в сутки, один раз в неделю или даже один раз в каждые 1 или 2 месяца.

В одном варианте осуществления дозу доставляют раз в две недели, т.е. дважды в месяц.

В одном варианте осуществления дозы разделяют промежутками, чтобы позволить ответам против лекарственного средства (в этом случае, против антител) исчезать до введения дальнейшей дозы.

Время полужизни, как применяют в настоящем документе, предназначено для обозначения продолжительности присутствия молекулы в кровотоке, например в сыворотке/плазме.

Фармакодинамика, как применяют в настоящем документе, относится к профилю и, в частности, продолжительности биологического действия молекулы в соответствии с настоящим описанием.

Фармацевтически приемлемый носитель сам по себе не должен индуцировать продукцию антител, опасных для индивидуума, которому вводят композицию, и не должен являться токсичным. Пригодные носители могут представлять собой большие, медленно подвергаемые метаболизму макромолекулы, такие как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные частицы вирусов.

Можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие средства или забуферивающие pH вещества, могут присутствовать в таких композициях. Такие носители позволяют составление фармацевтических композиций в форме таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий для проглатывания пациентом.

Пригодные для введения формы включают в себя формы, пригодные для парентерального введения, например, посредством инъекции или инфузии, например посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Когда продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может принимать форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном носителе, и он может содержать средства для получения составов, такие как суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства.

Альтернативно, молекула антитела может находиться в сухой форме, для разведения перед использованием в подходящей стерильной жидкости.

После получения состава композиции по изобретению можно вводить напрямую субъекту. Субъекты, подлежащие лечению, могут являться животными. Однако в одном или нескольких вариантах осуществления композиции являются адаптированными для введения субъектам-людям.

Подходящим образом, в составах по настоящему описанию pH конечного состава не является сходным с значением изоэлектрической точки антитела или фрагмента, например, если pI белка лежит в диапазоне 8-9 или выше, тогда pH состава 7 может являться пригодным. В то время как отсутствует намерение связи с теорией, считают, что это может в конечном счете обеспечивать конечный состав с улучшенной стабильностью, например, антитело или фрагмент остается в растворе.

В одном примере фармацевтический состав при pH в диапазоне 4,0-7,0 содержит 1-200 мг/мл молекулы антитела по настоящему описанию, 1-100 мМ буфера, 0,001-1% поверхностно-активного вещества a) 10-500 мМ стабилизатора, b) 10-500 мМ стабилизатора и 5-500 мМ средства для придания тоничности или c) 5-500 мМ средства для придания тоничности.

Фармацевтические композиции по этому изобретению можно вводить посредством любого количества способов, включая, но без ограничения, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, интратекальный, интравентрикулярный, трансдермальный, чрескожный

- 56 034647 (например, см. WO 98/20734), подкожный, внутрибрюшинный, интраназальный, кишечный, местный, подъязычный, интравагинальный или ректальный способы. Безыгольные шприцы также можно использовать для введения фармацевтических композиций по изобретению. Как правило, терапевтические композиции можно получать в форме пригодных для инъекции средств, в форме жидких растворов или суспензий. Можно получать также твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией.

Прямую доставку композиций можно, как правило, осуществлять посредством инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно или доставлять в межклеточное пространство ткани. Композиции можно также вводить в очаг. Дозирование для лечения может представлять собой расписание для однократной дозы или расписание для множественных доз.

Следует понимать, что активным ингредиентом в композиции является молекула антитела. Таким образом, она может являться чувствительной к деградации в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композиция предназначена для введения способом с использованием желудочно-кишечного тракта, может являться необходимым, чтобы композиция содержала средство, которое защищает антитело от деградации, но которое высвобождает антитело после его абсорбции из желудочно-кишечного тракта.

В одном варианте осуществления состав представлен в форме состава для местного введения, включая ингаляцию.

Подходящие пригодные для ингаляции препараты включают в себя пригодные для ингаляции порошки, отмеренные аэрозоли, содержащие газы-пропелленты или пригодные для ингаляции растворы, не содержащие газы-пропелленты. Пригодные для ингаляции порошки в соответствии с описанием, содержащие активное вещество, могут состоять единственно из вышеупомянутых активных веществ, или из смеси вышеупомянутых активных веществ с физиологически приемлемым наполнителем.

Эти пригодные для ингаляции могут включать в себя моносахариды (например, глюкозу или арабинозу), дисахариды (например, лактозу, сахарозу, мальтозу), олиго- и полисахариды (например, декстраны), полиспирты (например, сорбит, маннит, ксилит), соли (например, хлорид натрия, карбонат кальция) или их смеси друг с другом. Подходящим образом используют моно- или дисахариды, используют лактозу или глюкозу, в частности, но не исключительно, в форме их гидратов.

Частицы для накопления в легком требуют размера частиц менее 10 мкм, например 1-9 мкм, например от 1 до 5 мкм. Размер частиц активного ингредиента (например, антитело или фрагмент) имеет первостепенную важность.

Газы-пропелленты, которые можно использовать для получения пригодных для ингаляции аэрозолей, известны в данной области. Пригодные газы-пропелленты выбирают среди углеводородов, таких как н-пропан, н-бутан или изобутан, и галоуглеводородов, таких как хлорированные и/или фторированные производные метана, этана, пропана, бутана, циклопропана или циклобутана. Вышеупомянутые газы-пропелленты можно использовать по отдельности или в их смесях.

Особенно пригодные газы-пропелленты представляют собой галогенированные производные алкана, выбранные из TG11, TG12, TG134а и TG227. Из вышеупомянутых галогенированных углеводородов TG134a (1,1,1,2-тетрафторэтан) и TG227 (1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан) и их смеси являются особенно пригодными.

Содержащие газ-пропеллент пригодные для ингаляции аэрозоли могут также содержать другие ингредиенты, такие как сорастворители, стабилизаторы, действующие на поверхности вещества (поверхностно-активные вещества), антиоксиданты, смазывающие средства и средства для доведения pH. Все эти ингредиенты известны в данной области.

Содержащие газ-пропеллент пригодные для ингаляции аэрозоли по изобретению могут содержать вплоть до 5 мас.% активного вещества. Аэрозоли по изобретению содержат, например, 0,002-5, 0,01-3, 0,015-2, 0,1-2, 0,5-2 или 0,5-1 мас.% активного ингредиента.

Альтернативно, местное введение в легкое может также представлять собой введение состава в жидком растворе или суспензии, например, применение устройства, такого как распылитель, например распылитель, соединенный с компрессором (например, распылитель Pari LC-Jet Plus(R), соединенный с компрессором Pari Master(R), изготовленный в Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

Антитело или мультиспецифическую молекулу по изобретению можно доставлять, диспергированными в растворителе, например, в форме раствора или суспензии. Их можно суспендировать в подходящем физиологическом растворе, например солевом растворе или другом фармакологически приемлемом растворителе или забуференном растворе. Забуференные растворы, известные в данной области, могут содержать 0,05-0,15 мг диэдетата натрия, 8,0-9,0 мг NaCl, 0,15-0,25 мг полисорбата, 0,25-0,30 мг безводной лимонной кислоты и 0,45-0,55 мг цитрата натрия на 1 мл воды, так чтобы достигать pH приблизительно 4,0-5,0. Для суспензии можно применять, например, лиофилизированное антитело.

Терапевтические составы суспензий или растворов могут также содержать один или несколько наполнителей. Наполнители хорошо известны в данной области и включают в себя буферы (например,

- 57 034647 цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), ЭДТА, хлорид натрия, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии можно инкапсулировать в липосомы или биоразлагаемые микросферы. Состав, как правило, можно предоставлять, по существу, в стерильной форме, с применением способов изготовления в стерильных условиях.

Это может включать в себя получение и стерилизацию посредством фильтрации забуференного растворителя/раствора, применяемого для составления, асептической суспензии антитела в стерильном забуференном растворе растворителя, и распределения состава в стерильную тару способами, известными специалисту в данной области.

Пригодный для распыления состав по настоящему описанию можно предоставлять, например, в форме однократных единичных доз (например, в герметично закрытых пластиковых контейнерах или флаконах), упакованных в оболочки из фольги. Каждый флакон содержит единичную дозу в объеме, например, 2 мл, буферного растворителя/раствора.

Антитела, описанные в настоящем документе, могут являться пригодными для доставки посредством распыления.

Предусматривают также, что антитело по настоящему изобретению можно вводить с использованием генотерапии. Для достижения этого последовательности ДНК, кодирующие тяжелые и легкие цепи молекулы антитела, под контролем соответствующих компонентов ДНК вводят пациенту, так что цепи антитела экспрессируются с последовательностей ДНК и собираются in situ.

В одном варианте осуществления молекулу по настоящему описанию, такую как молекула антитела, описанная в настоящем документе, можно использовать для функционального изменения активности представляющих интерес антигена или антигенов. Например, молекула антитела по описанию может осуществлять нейтрализацию, антагонизм или агонизм активности указанного антигена или антигенов, напрямую или опосредованно.

В одном варианте осуществления молекулы по настоящему описанию, включая слитые белки, биспецифические белковые комплексы или содержащие их композиции представлены для применения в качестве лабораторного реагента.

Настоящее описание распространяется также на набор, содержащий молекулу по настоящему описанию или ее компонент. В одном варианте осуществления набор содержит:

a) один или несколько слитых белков (A-X), содержащих первое антитело или фрагмент антитела (A) , специфические для CD22, или CD79a, и/или CD79b, присоединенные к первому партнеру по связыванию из связанной пары (X); и

b) один или несколько слитых белков (B-Y), содержащих второе антитело или фрагмент антитела (B) , специфические для CD22, или CD79a, и/или CD79b, присоединенные к второму партнеру по связыванию из связанной пары (Y), где последний является специфическим для первого партнера по связыванию;

например, где первый партнер по связыванию (X) представляет собой пептид или полипептид, и второй партнер по связыванию (Y) представляет собой антитело или фрагмент антитела, специфические для него;

где второй партнер по связыванию Y является специфическим для первого партнера по связыванию X, и второй партнер по связыванию представляет собой, например, антитело или фрагмент антитела, специфические для него; и специфическое взаимодействие (например, взаимодействие связывания) двух партнеров по связыванию образует гетеродимерное объединение, которое физически объединяет два слитых белка из a) и b) с формированием биспецифического белкового комплекса; и где по меньшей мере один из A или B является специфическим для CD22, и другой является специфическим для CD79a и/или CD79b, и слитый белок(белки) находится/находятся в комплексной или не в комплексной форме.

Преимущественно набор может содержать биспецифические белковые комплексы по настоящему описанию или может содержать слитые белки, которые находятся в комплексной или не в комплексной форме. В первом случае, биспецифические белковые комплексы являются готовыми к применению из упаковки, что обеспечивает удобство и простоту применения, в то время как в последнем случае, биспецифические белковые комплексы можно собирать в соответствии с требованиями пользователя с использованием комбинации с другими слитыми белками.

В другом варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции для применения.

В другом варианте осуществления набор дополнительно содержит один или несколько реагентов для проведения одного или нескольких функциональных анализов.

В одном варианте осуществления молекулы по настоящему описанию, включая слитые белки, биспецифические белковые комплексы или содержащие их композиции, представлены для применения в качестве лабораторного реагента.

Дополнительные аспекты

В следующем аспекте представлена нуклеотидная последовательность, например последовательность ДНК, кодирующая конструкцию, как описано в настоящем документе, включая мультиспецифиче

- 58 034647 скую молекулу или слитый белок, как определено выше.

В одном варианте осуществления представлена нуклеотидная последовательность, например, последовательность ДНК, кодирующая конструкцию, как описано в настоящем документе, включая мультиспецифическую молекулу или биспецифический белковый комплекс, или антитело по настоящему описанию.

Описание в настоящем документе распространяется также на вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, как определено выше.

Термин вектор, как применяют в настоящем документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к транспорту другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Примером вектора является плазмида, которая представляет собой кольцевую двухцепочечную петлю ДНК, в которую можно лигировать дополнительные фрагменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные фрагменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Конкретные векторы являются способными к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, обладающие бактериальной точкой начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) можно интегрировать в геном клетки-хозяина, где они затем реплицируются вместе с геномом хозяина. По настоящему описанию термины плазмида и вектор можно использовать взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее общеупотребительной формой вектора.

Общие способы, которыми можно конструировать векторы, способы трансфекции и способы культивирования хорошо известны специалистам в данной области. В этом отношении приведена ссылка на Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York, и руководство Maniatis, опубликованное Cold Spring Harbor Publishing.

Термин селективный маркер, как применяют в настоящем документе, относится к белку, экспрессия которого позволяет идентифицировать клетки, трансформированные или трансфицированные вектором, содержащим маркерный ген. Широкий диапазон селективных маркеров известен в данной области.

Например, как правило, ген селективного маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую введен вектор. Селективный маркер может также представлять собой пригодный для визуальной идентификации маркер, например, такой как флуоресцентный маркер. Примеры флуоресцентных маркеров включают в себя родамин, FITC, TRITC, виды Alexa Fluor и различные их конъюгаты.

Представлена также клетка-хозяин, содержащая один или несколько клонирующих или экспрессирующих векторов, содержащих одну или несколько последовательностей ДНК, кодирующих антитело по настоящему описанию. Любую пригодную систему клетка-хозяин/вектор можно использовать для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела по настоящему описанию. Системы бактерий, например, E. coli, и другие системы микроорганизмов можно использовать, или системы экспрессии клеток-хозяев эукариот, например, млекопитающих, также можно использовать. Пригодные клетки-хозяева млекопитающих включают в себя клетки CHO, миеломы или гибридомы.

Настоящее описание относится также к способу получения молекулы по настоящему описанию или ее компонента, включающему в себя культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор по настоящему описанию в условиях, пригодных для управления экспрессией белка с ДНК, кодирующей молекулу по настоящему описанию, и выделения молекулы.

Молекулы по настоящему описанию, включая биспецифические белковые комплексы, описанные в настоящем документе, можно использовать в наборах для диагностики/детекции. Наборы могут, например, содержать биспецифические комплексы антител, которые являются специфическими для двух антигенов, оба из которых присутствуют на одном и том же типе клеток, и где положительный диагноз можно сделать только, если оба антигена успешно детектированы. Посредством использования молекулы по настоящему описанию, такой как биспецифические комплексы антител, описанные в настоящем документе, вместо двух отдельных антител или фрагментов антител в некомплексной форме, специфичность детекции можно сильно увеличивать.

В одном варианте осуществления молекулы по настоящему описанию, такие как биспецифические комплексы антител, фиксируют на твердой поверхности. Твердая поверхность может представлять собой, например, чип или планшет для ELISA.

Кроме того, представлено применение молекулы по настоящему описанию, например биспецифического белкового комплекса, описанного в настоящем документе, для детекции в образце присутствия первого и второго пептида, посредством чего указанные молекулы используют в качестве средств для детекции.

Молекулы по настоящему описанию, такие как биспецифические комплексы антител, описанные в настоящем документе, можно, например, конъюгировать с флуоресцентным маркером, облегчающим детекцию связанных комплексов антитело-антиген. Такие биспецифические комплексы антител можно использовать для иммунофлуоресцентной микроскопии. Альтернативно, биспецифические комплексы антител можно также использовать для Вестерн-блоттинга или ELISA.

В одном варианте осуществления представлен способ очистки молекулы по настоящему описанию

- 59 034647 или ее компонента.

В одном варианте осуществления представлен способ очистки молекулы по настоящему описанию или ее компонента, включающий в себя стадии проведения анионообменной хроматографии в несвязывающем режиме, так что примеси остаются на колонке, и антитело остается в несвязанной фракции. Эту стадию можно, например, проводить при pH приблизительно 6-8.

Способ может дополнительно включать в себя стадию начального связывания с использованием катионообменной хроматографии, проводимой, например, при pH приблизительно 4-5.

Способ может дополнительно включать в себя дополнительную стадию(стадии) хроматографии для обеспечения выведения соответствующим образом примесей, связанных с продуктом и способом, из потока продукции.

Способ очистки может также включать в себя одну или несколько стадий ультрафильтрации, таких как стадия концентрирования и диафильтрации.

Очищенная форма, как используют выше, предназначена для обозначения по меньшей мере 90% чистоты, такой как чистота 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% мас./мас. или более.

В контексте этого описания содержащий следует интерпретировать как включающий.

Аспекты описания, содержащие конкретные элементы, предназначены также, чтобы распространяться на альтернативные варианты осуществления, состоящие или в основном состоящие из соответствующих элементов.

Явно перечисленные варианты осуществления можно использовать в настоящем документе как основу для отказа от пункта формулы изобретения.

Содержание всех ссылок, на которые ссылаются в настоящем документе, конкретно приведено в качестве ссылки.

Подзаголовки в настоящем документе применены, чтобы способствовать структурированию описания, и не предназначены для выведения значения технических терминов в настоящем документе.

Последовательности по описанию представлены на фиг. 35.

Абзацы.

1. Молекула антитела, содержащая связывающий домен, специфический для CD22, где связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), содержащий

CDRH1 формулы (I)

GX1X2FSX3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 1), где X₁ представляет собой F, I или L (например, F), X₂ представляет собой S или D, X₃ представляет собой S, N или G (например, S), X₄ представляет собой S, Y, L или G, X₅ представляет собой Y или отсутствует, X₆ представляет собой W, Y или D (например, W или Y, в частности Y), X₇ представляет собой M или I и X₈ представляет собой C или S (в частности, S);

CDRH2 формулы (II)

X9IX10X11X12X13X14X15X16TX17YAX18WAKG (SEQ ID NO: 2), где X₉ представляет собой C или S, X₁₀ представляет собой Y, D, V или N, X₁₁ представляет собой T, P, I, G, S или A, X₁₂ представляет собой G, S или A (в частности, G), X₁₃ представляет собой S, I или Т, X₁₄ представляет собой S, N или отсутствует, X₁₅ представляет собой G, D, S, A или T, X₁₆ представляет собой D, T, S, N, V или G, X₁₇ представляет собой Y, D или A и X₁₈ представляет собой T или S (в частности, S);

CDHR3 формулы (III)

где Х₁₉ представляет собой A или отсутствует, X₂₀ представляет собой G, Y или отсутствует, X₂₁представляет собой Р, G или отсутствует, X₂₂ представляет собой Y, S, D, E или отсутствует, X₂₃ представляет собой V, G или W, X₂₄ представляет собой G, S, Y или V, X₂₅ представляет собой Y, S, G или N, X₂₆ представляет собой G, A, S или T, X₂₇ представляет собой Y, A, G или D, X₂₈ представляет собой W, D, I, Y или H, X₂₉ представляет собой L, G, S, Y или K, X₃₀ представляет собой V, Q, C, S, G, T или D, X₃₁представляет собой Y, A или R, X₃₂ представляет собой L или F, X₃₃ представляет собой N, Y или D (в частности, D), и вариабельный домен легкой цепи (VL).

2. Молекула антитела, содержащая связывающий домен, специфический для CD22, где связывающий домен содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий

- 60 034647

CDRL1 формулы (IV)

0X348X35X36X37X38X39X40X41X42:^X43 (SEQ ID NO: 4), где X₃₄ представляет собой A или S (в частности, A), X₃₅ представляет собой Q или E (в частности, Q), X₃₆ представляет собой S, N или T (в частности, S), X₃₇ представляет собой I или V, X₃₈ представляет собой S, Y или G (например, S или Y), X₃₉ представляет собой T, S, G или N (например, S или N), X₄₀представляет собой A, G, N, Y, T или R, X₄₁ отсутствует, представляет собой N или K (в частности, отсутствует), X₄₂ отсутствует, представляет собой E или D (в частности, отсутствует) и X₄₃ представляет собой A или S (в частности, A);

CDRL2 формулы (V)

CDRL3 обладает формулой (VI)

AGYKSX₄₈X4₉DX5₀X₅₁TT (SEQ ID NO: 6), где X₄₈ представляет собой D или E (в частности, D), E₄₉ представляет собой S, A или T, X₅₀ представляет собой D или E (в частности, D) и X₅₁ представляет собой G, A или S; или

CDRL3 формулы (VII)

0X52X53X54X55X568X57X58X59X60X61X62X63X64 (SEQ ID NO: 7) , где X₅₂ представляет собой S, I или G (например, S или G), X₅₃ представляет собой Y, H или G (в частности, Y), X₅₄ представляет собой Y, D или F (в частности, Y), X₅₅ представляет собой G, S или Y (например, S или Y), X₅₆ представляет собой T, A или S (в частности, S), X₅₇ представляет собой S, G, V или D, X₅₈ представляет собой G, S, L или отсутствует, X₅₉ представляет собой G, R, S или N, X₆₀ представляет собой S, D или V (например, S или D), X₆₁ представляет собой W, Y или отсутствует (например, W или Y), X₆₂ представляет собой A, T, G или отсутствует, X₆₃ представляет собой N или отсутствует (в частности, отсутствует), X₆₄ представляет собой A или отсутствует (в частности, отсутствует), и вариабельный домен тяжелой цепи (V_H).

3. Молекула антитела, содержащая связывающий домен, специфический для CD22, где связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), содержащий

CDRH1 формулы (I)

GX1X2FSX3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 1) , где X₁ представляет собой F, I или L (например, F), X₂ представляет собой S или D, X₃ представляет собой S, N или G (например, S), X₄ представляет собой S, Y, L или G, X₅ представляет собой Y или отсутствует, X₆ представляет собой W, Y или D (например, W или Y, в частности Y), X₇ представляет собой M или I и X₈ представляет собой C или S (в частности, S);

CDRH2 формулы (II)

X₉IX₁₀XiiXi2Xi3Xi4Xi5Xi6TXi₇YAXi₈WAKG (SEQ ID NO: 2), где Х₉ представляет собой С или S, Х₁₀ представляет собой Y, D, V или N, Х₁₁ представляет собой Т, Р, I, G, S или А, Х₁₂ представляет собой G, S или А (в частности, G), Х₁₃ представляет собой S, I или Т, Х₁₄ представляет собой S, N или отсутствует, Х₁₅ представляет собой G, D, S, А или Т, Х₁₆ представляет собой D, Т, S, N, V или G, Х₁₇ представляет собой Y, D или А и Х₁₈ представляет собой Т или S (в частности, S);

CDHR3 формулы (III)

X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33L (SEQ ID NO: 3), где Х₁₉ представляет собой A или отсутствует, X₂₀ отсутствует, представляет собой G или Y, X₂₁ отсутствует, представляет собой P или G, X₂₂ отсутствует, представляет собой Y, S, D или E, X₂₃ представляет собой V, G, Y или W, X₂₄ представляет собой G, Y, S или V, X₂₅ представляет собой Y, S, G или N, X₂₆ представляет собой G, A, S или T, X₂₇ представляет собой Y, G или D, X₂₈ представляет собой D, I, Y, W или H, X₂₉ представляет собой L, G, S, Y или K, X₃₀ представляет собой V, Q, C, S, G, T или D, X₃₁представляет собой Y, A или R, X₃₂ представляет собой L или F, X₃₃ представляет собой N, Y или D (в частности, D, и вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий

CDRL1 формулы (IV)

QX34SX35X36X37X38X39X40X41X42LX43 (SEQ ID NO: 4), где X₃₄ представляет собой A или S (в частности, A), X₃₅ представляет собой Q или E (в частности, Q), X36 представляет собой S, N или T (в частности, S), X37 представляет собой I или V, X38 представляет собой S, Y или G (например, S или Y), X₃₉ представляет собой T, S, G или N (например, S или N), X₄₀представляет собой A, G, N, Y, T или R, X₄₁ отсутствует, представляет собой N или K (в частности, отсутствует), X₄₂ отсутствует, представляет собой E или D (в частности, отсутствует) и X₄₃ представляет собой A или S (в частности, A);

CDRL2 формулы (V)

- 61 034647

X44X45SX46LX47S (SEQ ID NO: 5), где X₄₄ представляет собой G, Y, L, A или S, X₄₅ представляет собой A, S или T (в частности, A), X₄₆представляет собой T, R или K (в частности, T) и X₄₇ представляет собой A или S (в частности, A);

CDRL3 обладает формулой (VI)

AGYKSX₄₈X49DX₅oX5iTT (SEQ ID NO: 6) , где X₄₈ представляет собой D или E (в частности, D), X₄₉ представляет собой S, A или T, X₅₀ представляет собой D или E (в частности, D) и X₅₁ представляет собой G, A или S; или

CDRL3 формулы (VII)

0X52X53X54X55X568X57X58X59X60*61X62X63X64 (SEQ ID NO: 7) , где X₁₉ представляет собой A или отсутствует, X₂₀ представляет собой G, Y или отсутствует, X₂₁представляет собой P, D, G или отсутствует, X₂₂ представляет собой Y, S, D, E или отсутствует, X₂₃ представляет собой V, G или W, X₂₄ представляет собой G, S, Y или V, X₂₅ представляет собой Y, S, G или N, X₂₆ представляет собой G, A, S или T, X₂₇ представляет собой Y, A, G или D, X₂₈ представляет собой W, D, I, Y или H, X₂₉ представляет собой L, G, S, Y или K, X₃₀ представляет собой V, Q, C, S, G, T или D, X₃₁представляет собой Y, A или R, X₃₂ представляет собой L или F, X₃₃ представляет собой N, Y или D (в частности, D), и вариабельный домен легкой цепи (V_L).

4. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3, где CDRH1 обладает формулой (Ia)

GX1X2FSX3X4X5YX7X8 (SEQ ID NO: 8) , где X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₇ и X₈ определены выше для формулы (I).

5. Молекула антитела по абзацу 4, где CDRH1 обладает формулой (Ib)

GXiX₂FSX3X4X5YX7S (SEQ ID NO: 9), где X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ и X₇ являются такими, как определено выше для формулы (I).

6. Молекула антитела по любому из абзацев 1-5, где CDRH2 обладает формулой (IIa)

X₉IX₁₀XiiGXi3Xi4Xi5Xi6TXi7YAXi8WAKG (SEQ ID NO: 10) где X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇ и X₁₈ являются такими, как определено выше для формулы II.

7. Молекула антитела по абзацу 6, где CDRH2 обладает формулой (IIb)

X₉IX₁₀XiiXi2Xi3Xi4Xi5Xi6TXi₇YASWAKG (SEQ ID NO: 11) где X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆ и X₁₇ являются такими, как определено выше для формулы II, в частности последовательность формулы (IIb), где X₁₂ представляет собой G.

8. Молекула антитела по любому из абзацев 1-7, где CDRH3 обладает формулой (IIIa)

X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32DL (SEQ ID NO: 12) где X19, X20, X21, X22, X23, X24, X25, X26, X27, X28, X29, X30, X31 и X32 являются такими, как определено выше для формулы III.

9. Молекула антитела по любому из абзацев 1-8, где CDRL1 обладает формулой (IVa)

QASX35X36X37X38X39X40X41X42LX43 (SEQ ID NO: 13), где X₃₅, X₃₆, X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀, X₄₁, X₄₂ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV.

10. Молекула антитела по абзацу 9, где CDRL1 обладает формулой (IVb)

QASQX₃₆X37X38X39X4oX4iX42LX₄3 (SEQ ID NO: 14), где X₃₆, X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀, X₄₁, X₄₂ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV.

11. Молекула антитела по абзацу 9 или 10, где CDRL1 обладает формулой (IVc)

QASQSX37X38X39X4oX41X₄2LX₄₃ (SEQ ID NO: 15), где X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀, X₄₁, X₄₂ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV.

12. Молекула антитела по любому из абзацев 9-11, где CDRL1 обладает формулой (IIId)

QASQSX37X38X39X40X42LX43 (SEQ ID NO: 16) где X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀, X₄₂ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV.

13. Молекула антитела по любому из абзацев 9-11, где CDRL1 обладает формулой (IVe)

QASQSX37X38X39X40LX43 (SEQ ID NO: 17), где X₃₇, X₃₈, X₃₉, X₄₀ и X₄₃ являются такими, как определено выше для формулы IV.

14. Молекула антитела по любому из абзацев 9-13, где CDRL1 обладает формулой (IVf)

QASQSX3₇X3sX3₉X₄oLA (SEQ ID NO: 18), где X₃₇, X₃₈, X₃₉ и X₄₀ являются такими, как определено выше для формулы IV.

15. Молекула антитела по любому из абзацев 1-14, где CDRL2 обладает формулой (Va)

X₄₄ASX₄₆LX₄₇S (SEQ ID NO: 19) , где X₄₄, X₄₆ и X₄₇ являются такими, как определено выше для формулы V.

16. Молекула антитела по абзацу 15, где CDRL2 обладает формулой (Vb)

X₄₄ASX₄₆LAS (SEQ ID NO: 20), где X₄₄ и X₄₆ являются такими, как определено выше для формулы V.

17. Молекула антитела по п.16, где CDRL2 обладает формулой (Vc)

- 62 034647

X₄₄ASTLAS (SEQ ID NO: 21), где X₄₄ является таким, как определено выше для формулы V.

18. Молекула антитела по любому из абзацев 1-17, где CDRL3 обладает формулой (VIa)

AGYKSX₄₈X₄₉DX₅₀X5iTT (SEQ ID NO: 22), где X₄₉, X₅₀ и X₅₁ являются такими, как определено выше для формулы V.

19. Молекула антитела по абзацу 18, где CDRL3 обладает формулой (VIb)

AGYKSDX₄₉DDX₅iTT (SEQ ID NO: 23), где X₄₉ и X₅₁ являются такими, как определено выше для формулы VI.

20. Молекула антитела по любому из абзацев 1-17, где CDRL3 обладает формулой (VIIa)

QX5₂YX₅₄X55X₅₆SX57X58X59X6oX₆iX62X63X64 (SEQ ID NO: 24), где X₅₂, X₅₄, X₅₅, X₅₆, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂, X₆₃ и X₆₄ являются такими, как определено выше для формулы VII.

21. Молекула антитела по абзацу 20, где CDRL3 обладает формулой (VIIb)

ОХ₅₂УУХ₅₅Х₅₆ЗХ₅₇Х58Х59ХбоХб1Хб2ХбзХб4 (SEQ ID NO: 25), где X₅₂, X₅₅, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂, X₆₃ и X₆₄ являются такими, как определено выше для формулы VII.

22. Молекула антитела по абзацу 21, где CDRL3 обладает формулой (VIIc)

QX₅₂YYX₅₅SSX₅₇X₅8X59X6oX61X62X63X64 (SEQ ID NO: 26), где X₅₂, X₅₅, X₅₆, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂, X₆₃ и X₆₄ являются такими, как определено выше для формулы VII.

23. Молекула антитела по абзацу 21 или 22, где CDRL3 обладает формулой (VIId)

QX₅₂YYX₅₅SSX₅₇X₅₈X₅₉X₆oX61X62X64 (SEQ ID NO: 27), где X₅₂, X₅₅, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂ и X₆₄ являются такими, как определено выше для формулы VII.

24. Молекула антитела по абзацу 21 или 22, где CDRL3 обладает формулой (VIIe)

QX₅2YYX55SSX₅₇X58X59X6oX61X62 (SEQ ID NO: 28), где X₅₂, X₅₅, X₅₇, X₅₈, X₅₉, X₆₀, X₆₁, X₆₂ являются такими, как определено выше для формулы VII.

25. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3, где CDRH1 независимо выбран из SEQ ID NO: 29-39, CDRH2 независимо выбран из SEQ ID NO: 40-59 и CDRH3 независимо выбран из SEQ ID NO: 6068.

26. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 29 или 30, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 40 или 41 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 60.

27. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 31 или 32, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 42 или 43 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 61 или 62.

28. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 или 25, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 44 или 45 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 63.

29. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 или 25, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 35 или 36, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 46 или 47 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 64.

30. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 или 25, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52 или 53 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 65, 66 или 67.

31. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 или 25, где CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 38 или 39, CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58 или 59 и CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 68.

32. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-31, где CDRL1 независимо выбрана из SEQ ID NO: 69-74, CDRL2 независимо выбрана из SEQ ID NO: 75-80 и CDRL3 независимо выбрана из SEQ ID NO: 81-101.

33. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-32, где CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 69, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 75 и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 81.

34. Молекула антитела по абзацу 32, где CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 70, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 76 и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 82.

35. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-32, где CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 71, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 77 и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

36. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-32, где CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 72, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 78 и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 99.

37. Молекула антитела по п.32, где CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 73, CDR L2 представ

- 63 034647 ляет собой SEQ ID NO: 79 и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 100.

38. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-32, где CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 74, CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 80 и CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 101.

39. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-38, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 29 или 30, CDR H2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 40 или 41, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 60; и где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 69, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 75, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 81.

40. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-38, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 31 или 32, CDR H2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 42 или 43, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 61 или 62; и где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 70, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 76, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 82.

41. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-38, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 33 или 34, CDR H2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 44 или 45, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 63; и где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 71, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 77, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98.

42. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-38, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 35 или 36, CDR H2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 46 или 47, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 64; и где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 72, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 78, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 99.

43. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-38, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 37, CDR Н2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52 или 53, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 65, 66 или 67; и где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 73, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 79, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 100.

44. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 25-38, где CDR H1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 38 или 39, CDR H2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58 или 59, и CDR H3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 68; и где CDR L1 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 74, CDR L2 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 80, и CDR L3 обладает последовательностью, данной в SEQ ID NO: 101.

45. Молекула антитела по любому из абзацев 1-44, где V_H и V_L являются гуманизированными.

46. Молекула антитела по абзацу 45, где вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) содержит человеческую каркасную область, где остаток по меньшей мере в одном из положений 11, 23, 24, 37, 47, 48, 49, 67, 71, 73, 76, 78 и 94 представляет собой донорный остаток, и вариабельный домен легкой цепи (V_L) содержит человеческую каркасную область, где остаток по меньшей мере в одном из положений 1, 2, 3, 36, 63, 65, 66, 70 и 71 представляет собой донорный остаток.

47. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3, или 45, или 46, содержащая V_H, независимо выбранную из SEQ ID NO: 107, 108, 109, 110, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 127, 128, 129, 130, 136, 137, 138, 139, 145, 146, 147, 148, 154, 155, 156 и 157.

48. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 47, содержащая вариабельный домен VL, содержащий последовательность, независимо выбранную из SEQ ID NO: 106, 115, 126, 135, 144 и 153.

49. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 47 или 48, содержащая VH, независимо выбранную из SEQ ID NO: 107, 108, 109 и 110, и V_L с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 106.

50. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 47 или 48, содержащая VH, независимо выбранную из SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 120 и 121, и V_L с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 115.

51. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 47 или 48, которая содержит V_H, независимо выбранную из SEQ ID NO: 127, 128, 129 и 130, и V_L с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 126.

52. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 47 или 48, которая содержит VH, независимо выбранную из SEQ ID NO: 13 6, 137, 138 и 139, и V_L с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 135.

53. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 47 или 48, которая содержит V_H, независимо выбранную из SEQ ID NO: 145, 146, 147 и 148, и V_L с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 144.

54. Молекула антитела по любому из абзацев 1-3 и 47 или 48, которая содержит VH, независимо выбранную из SEQ ID NO: 154, 155, 156 и 157, и V_L с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 153.

55. Молекула антитела по любому из абзацев 1-54, где каждый связывающий домен содержит два вариабельных домена антитела.

56. Молекула антитела по абзацу 55, где два вариабельных домена антитела представляют собой

- 64 034647 пару Vh/Vl.

57. Молекула антитела по любому из абзацев 1-45, где вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью или сходством с вариабельным доменом легкой цепи из SEQ ID NO: 106, 115, 126, 135, 144 и 153, и где вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью или сходством с вариабельным доменом тяжелой цепи из SEQ ID NO: 107, 108, 109, 110, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 127, 128, 129, 130, 136, 137, 138, 139, 145, 146, 147, 148, 154, 155, 156 и 157.

58. Молекула антитела по любому из абзацев 1-57, где антитело представляет собой полноразмерное антитело.

59. Молекула антитела по любому из абзацев 1-57, где антитело представляет собой scFv, Fv, Fab или фрагмент Fab'.

60. Молекула антитела по любому из абзацев 1-57 где молекула представляет собой мультиспецифический белок, например биспецифический или триспецифический.

61. Молекула антитела по абзацу 60, где мультиспецифическая молекула содержит один связывающий домен, который является специфическим для CD22, и один связывающий домен, который является специфическим для CD79a и/или CD79b.

62. Молекула антитела по любому из абзацев 1-61, где формат молекулы выбран из диатела, scдиатела, триотела, тандемного scFv, FabFv, Fab'Fv, Fab-ds-Fv, Fab-scFv, Fab-ds-scFv, Fab-(ds-scFv)₂, диFab, ди-Fab', триотела, тандемного scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, sc-диатела-Fc, sc-диатела-CHз, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, Duobody и DVD-Ig.

63. Молекула антитела по любому из абзацев 1-62, содержащая связывающий домен, специфический для сывороточного альбумина, такого как человеческий сывороточный альбумин.

64. Молекула антитела по любому из абзацев 1-63, в которой связывающий домен или домены являются гуманизированными.

65. Молекула антитела по любому из абзацев 1-64, в которой одна аминокислота в одной или нескольких CDR заменена на другую аминокислоту.

66. Композиция, содержащая одну или несколько молекул антител, как определено в любом из абзацев 1-65.

67. Нуклеотидная последовательность, кодирующая молекулу антитела, как определено в любом из абзацев 1-65.

68. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, определенную в абзаце 67.

69. Молекула антитела по любому из абзацев 1-65 или композиция по п.66 для применения в терапии.

70. Применение молекулы антитела по любому из абзацев 1-65 или композиции по абзацу 66 для изготовления лекарственного средства для применения в терапии, в частности для лечения состояния или нарушения, описанного в настоящем документе.

71. Способ лечения пациента, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества молекулы антитела по любому из абзацев 1-65 или композиции по абзацу 66.

Список литературы.

1. Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Hanes J., Jermutus L., Weber-Bornhauser S., Bosshard H.R., Pluckthun A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14130-14135.

2. Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment (scFv) with Low Picomolar Affinity. Zhand C., Spinelli S., Luginbuhl B., Amstutz P., Cambillau C., Pluckthun A. (2004) J. Biol. Chem. 279, 18870-18877.

3. Antigen recognition by conformational selection. Berger C., Weber-Bornhauser S., Eggenberger Y., Hanes J., Pluckthun A., Bosshard H.R. (1999) F.E.B.S. Letters 450, 149-153.

Примеры

Термин Fab-Kd-Fab, как применяют в примерах, описывает биспецифический белковый комплекс, обладающий формулой A-X:Y-B, где

A-X представляет собой первый слитый белок;

Y -B представляет собой второй слитый белок;

A содержит фрагмент Fab, специфический для антигена, такого как CD22 или CD79;

В содержит фрагмент Fab, специфический для антигена, такого как CD22 или CD79;

X является первым партнером по связыванию из связанной пары, таким как scFv;

Y является вторым партнером по связыванию из связанной пары, таким как пептид; и : представляет собой взаимодействие (например, взаимодействие связывания) между X и Y.

Пример 1. Получение Fab'-A (Fab-scFv [A-X]) и Fab'-B (Fab-пептид [B-Y]) для функциональных анализов.

Способ клонирования.

ДНК вариабельной области антитела получали посредством ПЦР или синтеза гена, фланкируемого

- 65 034647 последовательностью ДНК участков для ферментов рестрикции. Эти участки представляли собой HindIII и XhoI для вариабельных областей тяжелых цепей и HindIII и BsiWI для вариабельных областей легких цепей. Это делает вариабельную область тяжелой цепи поддающейся лигированию в два вектора для тяжелой цепи (pNAFH с FabB-Y и pNAFH с FabA-X-ds [стабилизированный дисульфидными связями]), поскольку они обладают комплементарными участками рестрикции. Это обеспечивает лигирование вариабельной области выше (или 5') мышиных константных областей и пептида Y (GCN4) или scFv X (52SR4) с созданием полноразмерной рамки считывания. Легкие цепи клонировали в стандартные собственные векторы с мышиной константной областью к (pMmCK или pMmCK S171C), снова с использованием таких же комплементарных участков рестрикции. Вектор pMmCK S171C используют, если вариабельная область выделена из кролика. События клонирования подтверждали посредством секвенирования с использованием праймеров, фланкирующих полноразмерную открытую рамку считывания.

Культивирование CHQ-S.

Суспензионные клетки CHOS предварительно адаптировали к среде CDCHO (Invitrogen), дополненной 2 мМ (100*) glutamax. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста с встряхиванием при 140 об/мин в инкубаторе с встряхивателем (Kuner A.G., Birsfelden, Switzerland) и культивировали при 37°С с добавлением 8% CO₂.

Туансфекция с помощью электропорации.

Перед трансфекцией количество и жизнеспособность клеток определяли с использованием счетчика клеток CEDEX (Innovatis A.G. Bielefeld, Germany) и необходимое количество клеток (2*10⁸ клеток/мл) переносили в конические пробирки для центрифугирования и центрифугировали при 1400 об/мин в течение 10 мин. Осажденные клетки ресуспендировали в стерильном уравновешенном солевом растворе Earls и центрифугировали при 1400 об/мин в течение дополнительных 10 мин. Супернатант отбрасывали и осадки ресуспендировали до желательной плотности клеток.

Смешивали с ДНК вектора в конечной концентрации 400 мкг для 2*10⁸ клеток/мл и 800 мкл переносили пипеткой в кюветы (Biorad) и подвергали электропорации с использованием собственной системы для электропорации.

Трансфицированные клетки переносили непосредственно в 1X3 л колбы Эрленмейера, содержащие среду ProCHO 5, обогащенную 2 мМ glutamax и раствором антибиотического-антимитотического средства (100X) (1 к 500), клетки культивировали в инкубаторе с встряхивателем Kuhner при 37°С, 5% CO₂ и встряхивании при 140 об/мин. Питательную добавку 2 г/л ASF (AJINOMOTO) добавляли через 24 ч после трансфекции, температуру снижали до 37°С для дальнейших 13 суток культивирования. На сутки четыре 3 мМ бутират натрия (n-BUTRIC ACID Sodium Salt, Sigma B-5887) добавляли в культуру.

На сутки 14 культуры переносили в пробирки и супернатант отделяли от клеток после центрифугирования в течение 30 мин при 4000 об/мин. Оставленные супернатанты далее фильтровали через фильтры 0,22 мкм SARTO BRAN P Millipore, затем 0,22 мкм Gamma gold. Конечные уровни экспрессии определяли посредством HPLC с белком G.

Крупномасштабная (1,0 л) очистка.

Fab-A и Fab-B очищали посредством аффинного связывания с использованием системы АКТА Xpress и предварительно набитых никелевых колонок HisTrap Excel (GE Healthcare). Культуральные супернатанты стерилизовали фильтрованием через 0,22 мкм, и pH доводили до нейтрального, по необходимости, с использованием слабых кислоты или основания перед загрузкой в колонки. Вторую стадию промывки с содержанием 15-25 мМ имидазола использовали для вытеснения всех слабо связанных белков клетки-хозяина/неспецифически связывающих His веществ с никелевой смолы. Элюцию проводили с использованием 10 мМ фосфата натрия, pH 7,4+1 М NaCl+250 мМ имидазол, собирали фракции по 2 мл. Один объем колонки в системе элюции останавливали на 10 мин для сжатия пика элюции и, следовательно, уменьшения общего объема для элюции. Наиболее чистые фракции объединяли и буфер заменяли на PBS (Sigma), pH 7,4 и фильтровали через 0,22 мкм. Конечные пулы анализировали посредством сканирования A280, SE-HPLC (способ G3000), SDS-PAGE (восстанавливающего и не восстанавливающего) и анализировали эндотоксины с использованием системы PTS Endosafe.

Пример 2. Применение Fab'-A (Fab-scFv [A-X]) и Fab'-B (Fab-пептид [B-Y]) в формате гетеродимерно объединенного биспецифического белкового комплекса, чтобы показать, что биспецифические, но не бивалентные, комбинации CD79/CD22 ингибируют передачу сигналов Akt.

PBMC человека, полученные из конических устройств для афереза тромбоцитов, закладывали на хранение в форме замороженных аликвот. Перед проведением анализа клетки размораживали, промывали в DMEM (Life Technologies) и позволяли акклиматизацию в окружении 37°С/5% CO₂. Во время этого периода панели биспецифических или бивалентных антител получали посредством разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fab'-A (Fab-scFv) и Fab'-B (Fab-пептид) с антигенной специфичностью для белков поверхности клеток CD22 и CD79b в DMEM, содержащей 10% телячью сыворотку и 2 мМ глутамин. Эта панель показана в табл. 4.

- 66 034647

Таблица 4

Возможная панель биспецифических и бивалентных комбинаций антител со специфичностью для CD22 и CD79b

(А-Х) Fab А	(B-Y) Fab В
CD22-Y	CD79b-Y
CD22-X	CD22-X:Y-CD22	CD22-X:Y-CD79b
CD79b-X	CD79b-X:Y-CD22	CD79b-X:Y-CD79b

где X представляет собой scFv (52SR4), и Y представляет собой пептид (GCN4).

Fab'A-X и Fab'B-Y инкубировали вместе в течение 90 мин (в окружении 37°С/5% CO₂) перед смешиванием с 2,5*105 PBMC в 96-луночных планшетах с V-образным дном. Затем PBMC плюс биспецифические или бивалентные комбинации инкубировали вместе в течение следующих 90 мин. После этого периода времени B-клетки активировали посредством добавления 200 нМ F(ab')₂ козы против IgM человека (Southern Biotechnology) на 8 мин при 37°С. Затем реакцию передачи сигналов останавливали посредством добавления равного объема буфера Cytofix (BD Biosciences). Затем планшеты оставляли при комнатной температуре на 15 мин перед центрифугированием при 500 g в течение 5 мин. Избыток супернатанта отбрасывали от осадка клеток, который ресуспендировали в проточном буфере (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃) и промывали еще один раз. Затем клетки ресуспендировали в ледяном буфере Perm III (BD Biosciences) в течение 30 мин перед промывкой дважды в проточном буфере.

Затем клетки окрашивали с использованием флуоресцентно меченного антитела против CD20 (BD Biosciences) и флуоресцентно меченного антитела против фосфо-Akt, узнающего модифицированный остаток серина в положении 473 на белке. Затем проводили ресуспендирование в планшетах и инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. После этого периода времени планшеты промывали еще два раза и проводили ресуспендирование в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию в клетках CD20 и Akt измеряли с использованием проточного цитометра Intellicyt HTFC™.

С использованием пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt), Bклетки идентифицировали отдельно от других популяций клеток, и среднее геометрическое уровней Akt рассчитывали для каждой лунки. Затем все данные выражали как процент ингибирования от максимального ответа (только антитела против IgM) минус фон (только клетки). Относительный эффект комбинаций CD22 и CD79b показан в табл. 5 (|=ингибирование, /стимуляция и θ общее отсутствие эффекта).

Таблица 5 Таблица относительной силы ингибирования фосфорилированного Akt для биспецифических и бивалентных комбинаций антител со специфичностью для CD22 и CD79b

(A-X) Fab A	(B-Y) Fab В
CD22-Y	CD79b-Y
CD22-X	T T	1 1 1
CD79b-X	1 1 1	<->

Эти данные показаны также в форме столбчатой диаграммы (фиг. 1). Данные представляют средние значения, и планки погрешностей представляют собой 95% доверительные интервалы. Данные показывают, что комбинации CD22 с CD79b могут ингибировать экспрессию фосфо-Akt в B-клетках, стимулированных с использованием антител против IgM. В отличие от этого для комбинации CD22 с CD22 показаны увеличенные уровни экспрессии фосфо-Akt.

Пример 3. Применение Fab'-A (Fab-scFv [A-X]) и Fab'-B (Fab-пептид [B-Y]) в формате гетеродимерно объединенного биспецифического белкового комплекса, чтобы показать, что биспецифические, но не бивалентные, комбинации CD79/CD22 ингибируют передачу сигналов PLCy2.

PBMC человека, полученные из конических устройств для афереза тромбоцитов, закладывали на хранение в форме замороженных аликвот. Перед проведением анализа клетки размораживали, промывали в DMEM (Life Technologies) и позволяли акклиматизацию в окружении 37°С/5% CO₂. Во время этого периода матрицы биспецифических или бивалентных антител получали посредством разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fab'-(Fab-scFv [A-X]) и Fab'-B (Fab-пептид [B-Y]) с антигенной специфичностью для белков поверхности клеток CD22 и CD79b в DMEM, содержащей 10% телячью сыворотку и 2 мМ глутамин. Эта матрица показана в табл. 4.

- 67 034647

Fab'A-X и Fab'B-Y инкубировали вместе в течение 90 мин (в окружении 37°С/5% CO₂) перед смешиванием с 2,5*10⁵ PBMC в 96-луночных планшетах с V-образным дном. Затем PBMC плюс биспецифические или бивалентные комбинации инкубировали вместе в течение следующих 90 мин. После этого периода времени B-клетки активировали посредством добавления 200 нМ F(ab')₂ козы против IgM человека (Southern Biotechnology) в течение 8 мин при 37°С. Затем реакцию передачи сигналов останавливали посредством добавления равного объема буфера Cytofix (BD Biosciences). Затем планшеты оставляли при комнатной температуре на 15 мин перед центрифугированием при 500 g в течение 5 мин. Избыток супернатанта отбрасывали от осадка клеток, который ресуспендировали в проточном буфере и промывали еще один раз. Затем клетки ресуспендировали в ледяном буфере Perm III (BD Biosciences) в течение 30 мин перед промывкой дважды в проточном буфере.

Затем клетки окрашивали с использованием флуоресцентно меченного антитела против CD20 (BD Biosciences) и флуоресцентно меченного антитела против фосфо-PLCγ2, узнающего модифицированный остаток тирозина в положении 759 на белке. Затем проводили ресуспендирование в планшетах и инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. После этого периода времени планшеты промывали еще два раза и проводили ресуспендирование в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию в клетках CD20 и PLCy2 измеряли с использованием проточного цитометра Intellicyt HTFC™.

С использованием пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) Bклетки идентифицировали отдельно от других популяций клеток, и среднее геометрическое уровней PLCy2 рассчитывали для каждой лунки. Затем все данные выражали как процент ингибирования от максимального ответа (только антитела против IgM) минус фон (только клетки). Относительный эффект комбинаций CD22 и CD79b показан в табл. 6 (|=ингибирование, (стимуляция и θ общее отсутствие эффекта).

Таблица 6 Таблица относительной силы ингибирования фосфорилированного PLCg2 для биспецифических и бивалентных комбинаций антител со специфичностью для CD22 и CD79b

(А-Х) Fab А	(B-Y) Fab В
CD22-Y	CD79b-Y
CD22-X	Т	1 1 1
CD79b-X	1 1 1	θ

где X представляет собой scFv и Y представляет собой пептид.

Эти данные можно выражать также в форме столбчатой диаграммы (фиг. 2), данные представляют средние значения, и планки погрешностей представляют собой 95% доверительные интервалы. Данные показывают, что комбинации CD22 с CD79b и CD79b с CD79b все могут ингибировать экспрессию фосфо-PLCγ2 в B-клетках, стимулированных с использованием антител против IgM. В отличие от этого для комбинации CD22 с CD22 показаны увеличенные уровни экспрессии фосфо-PLCγ2.

Пример 4. Применение Fab'-A (Fab-scFv [A-X]) и Fab'-B (Fab-пептид [B-Y]) в формате гетеродимерно объединенного биспецифического белкового комплекса, чтобы показать, что биспецифические комбинации CD79/CD22 ингибируют экспрессию CD86.

PBMC человека, полученные из конических устройств для афереза тромбоцитов, закладывали на хранение в форме замороженных аликвот. Перед проведением анализа клетки размораживали, промывали в DMEM (Life Technologies) и позволяли акклиматизацию в окружении 37°С/5% CO₂. Во время этого периода матрицы биспецифических или бивалентных антител получали посредством разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fab'-X (Fab-scFv) и Fab'-Y (Fab-пептид) с антигенной специфичностью для белков поверхности клеток CD22 и CD79b в DMEM, содержащей 10% телячью сыворотку и 2 мМ глутамин. Эта матрица показана в табл. 4.

Fab'A-X и Fab'B-Y инкубировали вместе в течение 90 мин (в окружении 37°С/5% CO₂) перед смешиванием с 2,5*10⁵ PBMC в 96-луночных планшетах с V-образным дном. Затем PBMC плюс биспецифические или бивалентные комбинации инкубировали вместе в течение следующих 90 мин. После этого периода времени B-клетки активировали посредством добавления 200 нМ F(ab')₂ козы против IgM человека (Southern Biotechnology) в течение 24 ч при 37°С. После этого периода времени планшеты помещали на лед и промывали один раз ледяным проточным буфером (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃). Затем клетки окрашивали с использованием флуоресцентно меченного антитела против CD19 (BD Biosciences) и флуоресцентно меченного антитела против CD86 и инкубировали на льду в течение 1 ч в темноте. После этого периода времени планшеты промывали еще два раза и проводили ресуспендирование в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию в клетках CD19 и CD86 измеряли с использованием проточного цитометра Intellicyt HTFC™. С использованием пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) B-клетки идентифицировали отдельно от других популяций клеток, среднее геометрическое

- 68 034647 уровней CD86 рассчитывали для каждой лунки. Затем все данные выражали как процент ингибирования от максимального ответа (только антитела против IgM) минус фон (только клетки). Относительный эффект комбинаций CD22 и CD79b показан в табл. 7 (^=ингибирование, ) стимуляция и θ общее отсутствие эффекта).

Таблица 7

Таблица относительной силы ингибирования экспрессии CD86 в B-клетках для биспецифических и бивалентных комбинаций антител со специфичностью для CD22 и CD79b

где X представляет собой scFv (52SR4) и Y представляет собой пептид (GCN4).

Эти данные показаны также в форме столбчатой диаграммы (фиг. 3), данные представляют средние значения и планки погрешностей представляют собой 95% доверительные интервалы. Данные показывают, что комбинации CD22 с CD79b и CD79b с CD79b все могут ингибировать экспрессию CD86 на Bклетках, стимулированных с использованием антител против IgM. В отличие от этого для комбинации CD22 с CD22 показаны увеличенные уровни экспрессии CD86.

Пример 5. Ингибирующий эффект CD22 и CD79b можно воспроизвести, только когда антитела аранжированы в биспецифической ориентации PBMC человека, полученные из конических устройств для афереза тромбоцитов, закладывали на хранение в форме замороженных аликвот.

Перед проведением анализа клетки размораживали, промывали в DMEM (Life Technologies) и позволяли акклиматизацию в окружении 37°С/5% CO₂. Во время этого периода биспецифические, бивалентные комбинации или смеси антител получали посредством разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fab'-X (Fab-scFv) и/или Fab'-Y (Fab-пептид) с антигенной специфичностью для белков поверхности клеток CD22 и CD79b в DMEM, содержащей 10% телячью сыворотку и 2 мМ глутамин. Эти комбинации показаны в табл. 8. Для эксперимента с кривой титрования эти комбинации затем разводили за 8 ступеней разведения 1 к 2,5 для получения титрования дозы для этой комбинации.

Таблица 8 Матрица биспецифических, бивалентных или смесей антител со специфичностью для CD22 и CD79b

(А-Х) Fab А	(B-Y) Fab В
CD22-Y	CD79b-Y	CD79b-X
CD22-X	CD22-X:Y-CD22	CD22-X:Y-CD79Ь	CD22-X X-CD79

CD79b-X	CD79b-X:Y-CD22	CD79b-X:Y-CD79b	-
CD22-Y	-	CD22-Y Y-CD79b	-

Fab'A-X и/или Fab'B-Y инкубировали вместе в течение 90 мин (в окружении 37°С/5% CO₂) перед смешиванием с 2,5*105 PBMC в 96-луночных планшетах с V-образным дном. Затем PBMC плюс комбинации Fab'A-X и/или Fab'B-Y инкубировали вместе в течение следующих 90 мин. После этого периода времени B-клетки активировали посредством добавления 200 нМ F(ab')₂ козы против IgM человека (Southern Biotechnology) в течение 8 мин при 37°С. Затем реакцию передачи сигналов останавливали посредством добавления равного объема буфера Cytofix (BD Biosciences). Затем планшеты оставляли при комнатной температуре на 15 мин перед центрифугированием при 500 g в течение 5 мин. Избыток супернатанта отбрасывали от осадка клеток, который ресуспендировали в проточном буфере (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃) и промывали еще один раз. Затем клетки ресуспедировали в ледяном буфере Perm III (BD Biosciences) в течение 30 мин перед промывкой дважды в проточном буфере.

Затем клетки окрашивали с использованием флуоресцентно меченных антитела против CD20 (BD Biosciences), антитела против фосфо-Akt, узнающего модифицированный остаток серина в положении 473, и антитела против фосфо-PLCγ2, узнающего модифицированный остаток тирозина в положении 759. Затем проводили ресуспендирование в планшетах и инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. После этого периода времени планшеты промывали еще два раза и проводили ресуспендирование в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию в клетках CD20, Akt и PLCy2 измеряли с исполь

- 69 034647 зованием проточного цитометра Intellicyt HTFC™. С использованием пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt), B-клетки идентифицировали отдельно от других популяций клеток, среднее геометрическое уровней Akt и PLCy2 рассчитывали для каждой лунки. Затем все данные выражали как процент ингибирования от максимального ответа (только антитела против IgM) минус фон (только клетки). На фиг. 4 и 5 показано, что только биспецифическая комбинация антител против CD22 и CD79b, но не смеси антител против CD22 и CD79b, ингибировали экспрессию фосфорилированных Akt и PLCy2 (данные представляют средние значения, и планки погрешностей представляют собой 95% доверительные интервалы).

Для подтверждения ингибирования, наблюдаемого для биспецифической комбинации CD22 и CD79b, эту комбинацию вместе со смесью антител против CD22 и CD79b титровали и ингибирование общего внутриклеточного уровня ΙκΒ (считываемый показатель передачи сигналов) и CD86 (маркер активации через 24 ч) измеряли в B-клетках.

Как можно видеть на фиг. 6, комбинация CD22-X/CD79b-Y, но не комбинация CD22-X/CD79b-X, являлась способной ингибировать активацию сигнала NF-κΒ после стимуляции посредством антител против IgM, как измеряли по общему уровню белка ΙκΒ. IC₅₀, как экстраполировано с использованием подбора 4-параметрической логистической кривой с использованием Graphpad Prism 6, составляла 7,5 нМ (данные представляют средние значения, и планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения). Кроме того, титрование комбинации CD22-X/CD79b-Y, но не комбинации CD22-X/CD79bX, являлось способным ингибировать индуцированную антителами против IgM экспрессию CD86 на Bклетках через 24 ч (см. фиг. 7).

PBMC человека, полученные из конических устройств для афереза тромбоцитов, закладывали на хранение в форме замороженных аликвот. Перед проведением анализа, клетки размораживали, промывали в DMEM (Life Technologies) и позволяли акклиматизацию в окружении 37°C/5% CO₂. Во время этого периода биспецифические комбинации were получали посредством разведения эквимолярных (500 нМ) количеств Fab'-X (Fab-scFv) и Fab'-Y (Fab-пептид) с антигенной специфичностью для белков поверхности клеток CD22 и CD79b в DMEM, содержащей 10% телячью сыворотку и 2 мМ глутамин. Затем эти комбинации разводили за 8 ступеней разведения 1 к 2,5 для получения титрования дозы для этой комбинации. Fab'-X и Fab'-Y инкубировали вместе в течение 90 мин (в окружении 37°C/5% СО₂) перед добавлением 2,5^105 PBMC в 96-луночные планшеты с V-образным дном. Затем PBMC добавляли к комбинациям Fab'-X и Fab'-Y и инкубировали вместе в течение следующих 90 мин. После этого периода времени B-клетки активировали посредством добавления 200 нМ F(ab')₂ козы против IgM человека (Southern Biotechnology) на 24 ч при 37°C. Для обеспечения детекции маркеров активации на поверхности клеток планшеты помещали на лед и промывали один раз в ледяном проточном буфере (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃). Затем клетки окрашивали с использованием флуоресцентно меченного антитела против CD19 антитело (BD Biosciences) и флуоресцентно меченного антитела против CD86 и инкубировали на льду в течение 1 ч в темноте. После этого периода времени планшеты промывали еще два раза и проводили ресуспендирование в 25 мкл проточного буфера. Экспрессию в клетках CD19 и CD86 измеряли с использованием проточного цитометра Intellicyt HTFC™. С использованием пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt) B-клетки идентифицировали отдельно от других популяций клеток, и среднее геометрическое уровней CD86 рассчитывали для каждой лунки. Затем все данные выражали как процент ингибирования от максимального ответа (только антитела против IgM) минус фон (только клетки). Как можно видеть на фиг. 7, титрование комбинации CD22-X/CD79b-Y являлось способным ингибировать индуцированную антителами против IgM экспрессию CD86 на B-клетках через 24 ч. IC₅₀, как экстраполировано с использованием подбора 4-параметрической логистической кривой с использованием Graphpad Prism 6, составляла 10,3 нМ (данные представляют средние значения и планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения).

Пример 6. Ингибирующий эффект биспецифического белка CD22 и CD79b можно воспроизвести с различными V-областями антитела.

Иммунизация: ДНК, кодирующую выбранные антигены, получали посредством синтеза генов или из коммерческих источников и клонировали в экспрессирующий вектор с сильным конститутивным промотором. Затем плазмидную ДНК переносили в клетки фибробласты кролика Rab-9 (ATCC® CRL1414™) с использованием собственной системы для электропорации. Через 24 ч в клетках проверяли экспрессию антигена посредством проточной цитометрии и замораживали в аликвотах в жидком азоте до использования. При иммунизации применяли вплоть до 6 антигенов на кролика либо посредством совместной экспрессии на одной и той же клетке, либо посредством получения смесей клеток после однократной или множественной трансфекции. Кроликов иммунизировали 3 дозами клеток.

Открытие антител: культуры B-клеток получали с использованием способа, сходного со способом, описанным в Zubler et al. (1985). Кратко, происходящие из селезенки или PBMC B-клетки от иммунизированных кроликов культивировали при плотности приблизительно 2000-5000 клеток на лунку в 96луночных культуральных планшетах с штрих-кодами с 200 мкл/лунку среды RPMI 1640 (Gibco BRL), дополненной 10% FCS (PAA laboratories ltd), 2% HEPES (Sigma Aldrich), 1% L-глутамином (Gibco BRL), 1% раствором пенициллина/стрептомицина (Gibco BRL), 0,1% β-меркаптоэтанолом (Gibco BRL), 3%

- 70 034647 культуральным супернатантом активированных спленоцитов и облученными γ-излучением мутантными клетками тимомы мыши EL4 (5 χ 10⁴/лунку) в течение семи суток при 37°С в атмосфере 5% CO₂.

Присутствие антигенспецифических антител в культуральных супернатантах B-клеток определяли с использованием гомогенного анализа связывания на основе флуоресценции с использованием клеток HEK293, совместно трансфицированных с использованием антигенов, которыми иммунизировали кроликов. Скрининг включал в себя перенос 10 мкл супернатанта из 96-луночных культуральных планшетов с штрих-кодами в 384-луночные планшеты для анализа с черными стенками с штрих-кодами, содержащие клетки HEK293, трансфицированные антигеном-мишенью (приблизительно 3000 клеток/лунку) с использованием жидкостного манипулятора Matrix Platemate. Связывание выявляли с использованием конъюгата с Cy-5 антител козы против IgG кролика, специфических для Fey (Jackson). Планшеты считывали в системе детекции клеток Applied Biosystems 8200.

После первичного скрининга положительные супернатанты объединяли в 96-луночные исходные планшеты с штрих-кодами с использованием робота для отбора наилучших кандидатов Aviso Onyx и Bклеток в планшетах для культивирования, замороженных при -80°С. Затем проводили скрининг исходных планшетов с использованием гомогенного анализа связывания на основе флуоресценции на клетках HEK293, трансфицированных с использованием антигенов по отдельности, и бусин Superavidin™ (Bangs Laboratories), покрытых рекомбинантным белком, в качестве источника антигена. Это выполняли для определения антигенной специфичности для каждой лунки.

Чтобы позволить выделение генов вариабельной области антитела из выборки представляющих интерес лунок, проводили стадию деконволюции для обеспечения идентификации антигенспецифических B-клеток в данной лунке, содержащей гетерогенную популяцию B-клеток. Этого достигали с использованием способа флуоресцентных фокусов (Clargo et al., 2014. Mabs 2014 Jan 1:6(1)143-159; EP 1570267 B1). Кратко, секретирующие иммуноглобулины B-клетки из положительной лунки смешивали либо с клетками HEK293, трансфицированными с использованием антигена-мишени, либо со стрептавидиновыми бусинами (New England Biolabs), покрытыми биотинилированным антигеном-мишенью, и с конечным разведением 1:1200 конъюгата с FITC антитела козы против антител кролика, специфического для фрагмента Fey (Jackson). После статической инкубации при 37°С в течение 1 ч антигенспецифические B-клетки можно идентифицировать благодаря присутствию флуоресцентного ореола, окружающего эти B-клетки. Ряд этих индивидуальных клонов B-клеток, идентифицированных с использованием микроскопа Olympus, затем отбирали с использованием микроманипулятора Eppendorf и закладывали на хранения в пробирках для ПЦР. Способ флуоресцентных фокусов использовали также для идентификации антигенспецифических B-клеток из гетерогенной популяции B-клеток непосредственно из костного мозга иммунизированных кроликов.

Гены вариабельных областей антител выделяли из отдельных клеток посредством ПЦР после обратной транскрипции (RT) с использованием праймеров, специфических для вариабельной области тяжелой и легкой цепи. Проводили два цикла ПЦР, где в гнездовой вторичной ПЦР включали участки рестрикции на 3'- и 5'-концах, позволяющие клонирование вариабельной области в векторы для экспрессии у млекопитающих Fab-X и Fab-Y (V_H) мыши или к (V_L) мыши. Конструкциями тяжелой и легкой цепи для векторов, экспрессирующих Fab-X и Fab-Y, совместно трансфицировали клетки HEK-293 с использованием Fectin 293 (Life Technologies) или клетки Expi293 с использованием Expifectamine (Life Technologies), и рекомбинантное антитело экспрессировали в 6-луночных культуральных планшетах в объеме 5 мл. После 5-7 суток экспрессии, супернатанты собирали. Супернатанты тестировали в гомогенном анализе связывания на основе флуоресценции на клетках HEK293, трансфицированных с использованием антигена, и бусинах Superavidin™ (Bangs Laboratories), покрытых рекомбинантным белком, или трансфицированных с использованием антигена клеток НЕК. Это выполняли для подтверждения специфичности клонированных антител.

Мелкомасштабное получение Fab A-X и Fab B-Y (мелкомасштабная (50 мл) трансфекция Expi293).

Клетки Expi293 субкультивировали общепринятым способом в среде для экспрессии для Expi293™ до конечной концентрации 0,5^χ10⁶ жизнеспособных клеток/мл и инкубировали в инкубаторе с ротационнным встряхиванием (Multitron, Infors HT) при 120 об/мин, 8% CO₂ и 37°С.

На сутки трансфекции жизнеспособность и концентрацию клеток измеряли с использованием автоматизированного счетчика клеток (Vi-CELL, Beckman Coulter). Для достижения конечной концентрации 2,5^χ10⁶ жизнеспособных клеток/мл, соответствующий объем суспензии клеток добавляли в стерильную 250 мл встряхиваемую колбу Эрленмейера и доводили до объема 42,5 мл посредством добавления свежей, предварительно нагретой среде для экспрессии для Expi293™ для каждой трансфекции в 50 мл.

Для получения комплексов липид-ДНК для каждой трансфекции всего 50 мкг плазмидной ДНК для тяжелой цепи и легкой цепи разводили в среде Opti-MEM® I (LifeTechnologies) до общего объема 2,5 мл, и 135 мкл реагента ExpiFectamine™ 293 (LifeTechnologies) разводили в среде Opti-MEM® I до общего объема 2,5 мл. Все разведения осторожно перемешивали и инкубировали в течение не более 5 мин при комнатной температуре перед добавлением каждого раствора ДНК добавляли к соответствующим образом разведенному реагенту ExpiFectamine™ 293 для получения общего объема 5 мл. Смеси ДНК - реа

- 71 034647 гент ExpiFectamine™ 293 осторожно перемешивали и инкубировали в течение 20-30 мин при комнатной температуре, чтобы позволить формирование комплексов ДНК - реагент ExpiFectamine™ 293.

После завершения инкубации комплекса ДНК - реагент ExpiFectamine™ 293, 5 мл комплекса ДНК реагент ExpiFectamine™ 293 добавляли в каждую встряхиваемую колбу. Встряхиваемые колбы инкубировали в инкубаторе с ротационнным встряхиванием (Multitron, Infors НТ) при 120 об/мин, 8% CO₂ и 37°С.

Приблизительно через 16-18 ч после трансфекции, 250 мкл усилителя трансфекции 1 ExpiFectamine™ 293 (LifeTechnologies) и 2,5 мл усилителя трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293 (LifeTechnologies) добавляли в каждую встряхиваемую колбу.

Культуры клеток собирали через 7 суток после трансфекции. Клетки переносили в 50 мл пробирки для центрифугирования (Falcon) и осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 4000 об/мин с последующей стерилизацией фильтрацией через 0,22 мкм Stericup (Merck Millipore). Осветленные и стерилизованные фильтрацией супернатанты сохраняли при 4°С. Конечные уровни экспрессии определяли посредством HPLC с белком G.

Мелкомасштабная (50 мл) очистка: как Fab-X, так и Fab-Y очищали по отдельности посредством аффинного связывания с использованием системы для мелкомасштабной очистки на основе вакуума. Кратко, 50 мл культуральных супернатантов стерилизовали фильтрацией через 0,22 мкм перед добавлением 500 мкл бусин Ni-сефарозы (GE Healthcare). Затем смесь супернатанта с бусинами переворачивали в течение приблизительно 1 ч до удаления супернатанта посредством подключения вакуума. Затем бусины промывали с использованием раствора для промывки 1 (50 мМ фосфат натрия, 1М NaCl, pH 6,2) и раствора для промывки 2 (0,5М NaCl). Элюцию проводили с использованием 50 мМ ацетата натрия, pH 4,0, +1М NaCl. Буфер в элюированных фракциях заменяли на PBS (Sigma), pH 7,4 и фильтровали через 0,22 мкм. Конечные пулы анализировали посредством сканирования A280, SE-UPLC (способ BEH200), SDS-PAGE (восстанавливающего и не восстанавливающего) и анализировали эндотоксины с использованием системы PTS Endosafe.

PBMC человека, полученные из конических устройств для афереза тромбоцитов, закладывали на хранение в форме замороженных аликвот. Перед проведением анализа, клетки размораживали, промывали в RPMI 1640 (Life Technologies) и позволяли акклиматизацию в окружении 37°С /5% CO₂. Во время этого периода, комбинации биспецифических, бивалентных или смесей антител получали посредством разведения эквимолярных (200 нМ) количеств Fab'-X (Fab-scFv) и/или Fab'-Y (Fab-пептид) с антигенной специфичностью для белков поверхности клеток CD22 и CD79b в RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ глутамин. Эти комбинации 3 различных CD79b Fab-Y и 3 различных CD22 Fab-X показаны в табл. 9.

Таблица 9 Матрица биспецифических белков со специфичностью для CD22 и CD79b

(А-Х)	(B-Y)
Fab А	Fab В
	CD79-Y	CD79-Y	CD79b-y

	VR4447	VR4450	VR4246
CD22-X VR0982	CD22- X: Y- CD7 9b	CD22- X:Y- CD7 9b	CD22- X:Y- CD7 9b
CD22-X VR4126	CD22- X: Y- CD7 9b	CD22- X: Y- CD7 9b	CD22- X: Y- CD7 9b
CD22-X VR4130	CD22- X: Y- CD7 9b	CD22- X:Y- CD7 9b	CD22- X:Y- CD7 9b

Fab'A-X и Fab'B-Y инкубировали вместе в течение 60 мин (в окружении 37°С/5% CO₂) перед смешиванием с 2,5*105 PBMC в 96-луночных планшетах с V-образным дном. Затем PBMC плюс комбинации Fab'A-X и/или Fab'B-Y инкубировали вместе в течение следующих 90 мин. После этого периода времени В-клетки активировали посредством добавления 12,5 мкг/мл F(ab')2 козы против IgM человека (Southern Biotechnology) на 10 мин при 37°С. Затем реакцию передачи сигналов останавливали посредст

- 72 034647 вом добавления равного объема буфера Cytofix (BD Biosciences). Затем планшеты оставляли при комнатной температуре на 15 мин перед центрифугированием при 500 g в течение 5 мин. Избыток супернатанта отбрасывали от осадка клеток, который ресуспендировали в проточном буфере (PBS+1% BSA+0,1% NaN₃+2 мМ ЭДТА) и промывали еще один раз. Затем клетки ресуспендировали в ледяном буфере Perm III (BD Biosciences) в течение 30 мин перед промывкой дважды в проточном буфере.

Затем клетки окрашивали с использованием флуоресцентно меченных антитела против CD20 (BD Biosciences) и антитела против фосфо-PLCγ2, узнающего модифицированный остаток тирозина в положении 759. Затем проводили ресуспендирование в планшетах и инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. После этого периода времени планшеты промывали еще два раза и проводили ресуспендирование в 40 мкл проточного буфера. Экспрессию в клетках CD20 и PLCy2 измеряли с использованием проточного цитометра Intellicyt HTFC™.

С использованием пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt), Bклетки идентифицировали отдельно от других популяций клеток, и среднее геометрическое уровней PLCy2 рассчитывали для каждой лунки. Затем все данные выражали как процент ингибирования от максимального ответа (только антитела против IgM) минус фон (только клетки).

Как можно видеть на фиг. 8, данные показывают, что комбинация против CD22 с CD79b с использованием всех различных V-областей антитела, может ингибировать экспрессию фосфо-PLCy2 в Bклетках, стимулированных с использованием антител против IgM.

Пример 7. Матрица скрининга больших панелей гетеродимерно объединенных белковых комплексов для идентификации новых мишеней биспецифических антител.

Введение. После успешного подтверждения биспецифического формата и способа скрининга в более ранних примерах скрининг расширяли до большего количества пар антигенов. Получали панель пар вариабельных (V) областей антитела против 23 различных антигенов, экспрессированных на B-клетках. С использованием Fab-Kd-Fab [т.е. A-X:Y-B, где A и B представляют собой фрагменты Fab], сформирован формат матрицы гетеродимерно объединенных белковых комплексов, представляющих множество комбинаций V-областей для каждой из 315 различных комбинаций пар антигенов. Проводили скрининг этих комбинаций по их способности модулировать передачу сигналов BCR (B-клеточного рецептора) в высокопроизводительном анализе проточной цитометрии для отбора новых пар мишеней для воздействия с использованием биспецифического антитела.

Антитела выделяли, как описано в примере 6.

Анализы скрининга.

РВМС доноров быстро размораживали с использованием водяной бани, установленной на 37°С, и осторожно переносили в 50 мл пробирку Falcon. Затем их разводили в добавляемых по каплям 5 мл среды для анализа для минимизации осмотического шока. Затем клетки осторожно разводили до 20 мл перед добавлением конечной среды для разбавления для доведения объема до 50 мл. Затем клетки центрифугировали при 500 g в течение 5 мин перед удалением супернатанта и ресуспендированием клеток в 1 мл среды. Затем клетки подсчитывали и разводили до 1,66*10⁶ клеток/мл перед распределением по 30 мкл на лунку в TC планшет с V-образным дном, получая конечную концентрацию для анализа 5,0*10⁴клеток/лунку. Затем планшеты с клетками сохраняли закрытыми в инкубаторе при 37°С, 5% CO₂, пока они не требовались, оставляя их в покое минимум на 1 ч.

Реагенты Fab-X и Fab-Y смешивали в эквимолярном соотношении в 5* конечной концентрации для анализа и инкубировали в течение 90 мин при 37°С, 5% CO₂. Образцы подготавливали в 96-луночном полипропиленовом планшете с U-образным дном и накрывали во время инкубации.

мкл 5* смеси Fab-KD-Fab добавляли в соответствующие тестируемые лунки, содержащие клетки, и перемешивали посредством встряхивания при 1000 об/мин в течение 30 с перед инкубацией в течение 90 мин при 37°С, 5% CO2.

Затем клетки стимулировали с использованием 10 мкл антител против IgM человека. Конечная концентрация стимуляторов в анализе менялась в зависимости от считываемых показателей панели для анализа, тремя коктейлями антител A, B и C (подробно описанными ниже) проводили концентрацию при конечной концентрации для анализа либо 50 мкг/мл (коктейль A и C) или 25 мкг/мл (коктейль B). Затем содержимое планшетов для анализа осторожно перемешивали при 1000 об/мин в течение 30 с перед инкубацией при 37°С, 5% CO₂ в течение 5 мин (коктейль антител A и C) или 2 мин (коктейль антител B). Анализ останавливали посредством добавления 150 мкл ледяного BD CytoFix во все лунки и инкубировали в течение 15 мин при RT. Затем фиксированные клетки центрифугировали при 500 g в течение 5 мин для осаждения клеток и обеспечивали удаления супернатанта с использованием промывателя для планшетов BioTek ELx405. Осадок ресуспендировали посредством встряхивания планшета при 2400 об/мин в течение 30 с. Затем клетки пермеабилизовывали при 4°С посредством добавления 100 мкл ледяного буфера для пермеабилизации клеток III BD в течение 30 мин. Затем клетки промывали в 100 мкл буфера для FACS и центрифугировали при 500 g в течение 5 мин. Супернатант снова удаляли посредством ELx405 перед его использованием для быстрого распределения 200 мкл буфера для FACS для отмывки всех остатков буфера для пермеабилизации. Клетки снова центрифугировали при 500 g и супернатант удаляли переворачиванием. Во время предшествующей стадии осаждения центрифугированием

- 73 034647 коктейль антител подготавливали в буфере для FACS и сохраняли закрытым от света. Затем клетки ресуспендировали встряхиванием (2400 об/мин, 30 с) перед добавлением 20 мкл коктейля антител во все лунки и встряхиванием планшета в течение 30 с при 1000 об /мин. Затем клетки инкубировали в течение 60 мин при RT в темноте.

Затем клетки промывали дважды в 200 мкл буфера для FACS с использованием центрифугирования при 500 g и супернатант удаляли после каждой стадии. Наконец, клетки ресуспендировали посредством встряхивания в течение 30 с при 2400 об/мин перед добавлением конечных 20 мкл буфера для FACS. Затем планшет(ы) считывали в устройстве Intellicyt HTFC/iQue.

Буфер для FACS=PBS +1% BSA+0,05% NaN₃+2 мМ ЭДТА.

Коктейль антител A=1:2 CD20 PerCp-Cy5.5 (BD Biosciences)+1:5 PLCy2 AF88+l:10 Akt AF647+1:50 ERK1/2 PE (разведенный в буфере для FACS).

Коктейль антител B=1:2 CD20 PerCp-Cy5.5 (BD Biosciences)+1:5 Syk PE+1:5 BLNK AF647 (разведенный в буфере для FACS).

Коктейль антител C=1:5 CD20 PerCp-Cy5.5 (Biolegend)+1:5 PLCy2 AF488+l:10 Akt AF647+1:5 Syk PE (разведенный в буфере для FACS).

Реагент	Поставщик	Каталожный номер
Антитело против 1дМ человека	Southern Biotech	2022-14
CytoFix	BD Biosciences	554655
Буфер Perm III	BD Biosciences	558050
Антитело против Akt (pS473) AF647	BD Biosciences	561670
Антитело против SYK (pY348) РЕ	BD Biosciences	558529
Антитело против PLCy2 (pY759) AF4 8 8	BD Biosciences	558507
Антитело против BLNK(pY84) AF647	BD Biosciences	558443
Антитело против ERK1/2 (pT202/pY204) РЕ	BD Biosciences	561991
Антитело против CD20 человека РегСр-Су5.5	BD Biosciences	558021
Антитело против CD20 человека AF4 8 8	BD Biosciences	558056
Антитело против CD20 человека РегСр-Су5.5	Biolegend	340508
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Fisher Scientific	10562765
RPMI 1640	Life Technologies	31870
Фетальная телячья сыворотка (FCS)	Life Technologies	16140
Glutamax	Life Technologies	35050
Пенициллин/Стрептомицин (P/S)	Life Technologies	15070
ЭДТА	Sigma	03690
Азид натрия (NaN3)	Sigma	S2002
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma	A1470

- 74 034647

Проводили скрининг комбинаций Fab-X+Fab-Y с использованием либо коктейля антител A и B, либо только C. Все скрининги were проводили на клетках из конических устройств от 2 различных доноров крови. Данные собирали и оценивали с использованием Коммерчески доступных инструментов программного обеспечения. Всего поводили скрининг комбинаций 2500 Fab-X+Fab-Y против 315 различных комбинаций антигенов.

Результаты.

Рассчитывали процент ингибирования индукции фосфорилирования белков каскада передачи сигналов BCR посредством каждой комбинации Fab-Kd-Fab [т.е. A-X:Y-B, где A и B представляют собой фрагменты Fab], в этом примере в поиске новых комбинаций антигенов, ингибирующих функцию Bклеток, где критерий положительной комбинации устанавливали как по меньшей мере 30% ингибирование по меньшей мере двух считываемых показателей фосфо-молекул посредством по меньшей мере одной комбинации V-областей. В соответствии с этим порогом 11 новых комбинаций пар антигенов из 315 исследованных соответствовали требуемым критериям. Это представляет собой 3,5% долю наилучших результатов, что показывает важность скрининга больших количеств комбинаций для нахождения комбинаций с желательной активностью и того, какова доля активности комбинации CC79b и CD22.

На фиг. 10-12 показаны данные для перекрестной специфичности для матрицы антигенов. Значения представляют собой процент ингибирования (с отрицательным значением для активации) фосфорилирования Syk, PLCy2 и АКТ, соответственно, и представляют собой среднее для множества оцененных комбинаций V-областей.

Тестировали 315 различных комбинаций антигенов, и как можно видеть, эффект на передачу сигналов BCR различных комбинаций антител значительно менялся от сильного ингибирования, например, для антигена 2 (CD79b) на Fab-X в комбинации с антигеном 3 (CD22) на Fab-Y (69,66% ингибирования фосфо-Syk), и антигена 2 (CD79b) на Fab-Y в комбинации с антигеном 3 (CD22) на Fab-X (52,32% ингибирования фосфо-Syk), показанного на фиг. 11), до активации, например, для антигена 6 на X и антигена 11 на Y (минус 118,10% для фосфо-Syk, фиг. 11).

Каждая точка данных, представляющая собой средние значения в %, представленные на фиг. 10-12, показана для антигена 2 (CD79b) на Fab-X и антигена 3 (CD22) на Fab-Y на фиг. 13. В этом случае, оценивали 23 различных комбинаций V-областей различных антител. Та же самая комбинация антигенов, но в альтернативной ориентации, т.е. антиген 2 (CD79b) на Fab-Y и антиген 3 (CD22) на Fab-X, показана на фиг. 14. В этом случае оценивали 9 различных комбинаций V-областей различных антител. Для всех Vобластей показано ингибирование, но преимущественным образом этот способ можно также использовать для отбора оптимальных комбинаций V-областей.

Пример 8. Сравнение активности совместного нацеливания на антиген CD79b плюс антиген CD22 в формате скрининга Fab-Kd-Fab для формата биспецифического BYbe с молекулярной связью.

Введение. Чтобы проверить, что активность по отношению к паре мишеней CD79b/CD22, идентифицированную в комплексном скрининге гетеродимерно объединенных Fab-Kd-Fab, можно перевести в сходную желательную активность в альтернативном терапевтическом формате с молекулярной связью, специфичность для антигена CD79b (VR4447) и специфичность для антигена CD22 (VR4130) получали в формате BYbe. Этот формат BYbe состоит из V-областей против антигена CD22 (VR4130) в форме стабилизированного дисульфидной связью (ds-) одноцепочечного (оц)-Рг, слитых с тяжелой цепью Fab против антигена CD79b (VR4447) посредством линкера SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17).

Способы.

Очистку BYbe для функционального скрининга проводили следующим образом.

Для функционального скрининга форматы BYbe (Fab-ds-scFv [scFv с C-конца тяжелой цепи Fab]) очищали следующим образом. Осветленные культуральные супернатанты после стандартной экспрессии в expiHEK или CHO стерилизовали фильтрацией через 0,22 мкм. Фильтрованные супернатанты наносили при 2 мл/мин на 50 мл колонки GammabindPlus с сефарозой XK26 (GE Healthcare), уравновешенные в PBS, pH 7,4 (Sigma Aldrich Chemicals). После нанесения колонки промывали с использованием PBS pH 7,4 и затем проводили элюцию с использованием 0,1М глицина/HCl. pH 2,7. За элюцией следили по оптической плотности при 280 нм, собирали пик элюции и затем нейтрализовали с использованием 1/25 объема 2М Tris/HCl, pH 8,5. Нейтрализованные образцы концентрировали с использованием концентраторов Amicon Ultra-15 с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10 кДа (BYbe) и центрифугирования при 4000*g в роторе с качающимися стаканами. Концентрированные образцы наносили на колонку либо XK16/60, либо XK26/60 Superdex200 (GE Healthcare), уравновешенную в PBS, pH7,4. Проводили хроматографию на колонках с использованием изократического градиента PBS, pH7,4, либо при 1 мл/мин, либо при 2,6 мл/мин соответственно. Фракции собирали и анализировали эксклюзионной хроматографией в геле TSK G3000SWXL; 5 мкм, колонка 7,8*300 мм, хроматография с использованием изократического градиента 0,2М фосфата, pH 7,0 при 1 мл/мин, с детекцией при оптической плотности 280 нм. Избранные мономерные фракции объединяли и концентрировали до >1 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-15 с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10 кДа, и центрифугирования при 4000xg в роторе с качающимися стаканами. Конечные образцы анализировали; по концентрации посредством сканирующего при A280 спектрофотометра УФ-видимой части спектра (Cary 50Bio); по %

- 75 034647 мономера посредством эксклюзионной хроматографии на геле TSK G3000SWXL; колонка 5 мкм, 7,8*300 мм, хроматография с использованием изократического градиента 0,2М фосфата, pH 7,0 при 1 мл/мин, с детекцией при оптической плотности 280 нм; посредством восстанавливающего и не восстанавливающего SDS-PAGE, проводимого в 4-20% Tris-глициновых 1,5 мм гелях (Novex) при 50 мА (на гель) в течение 53 мин; и по эндотоксину посредством портативной тест-системы EndoSafe® от Charles River с тестовыми картриджами с лизатом амебоцитов мечехвоста (LAL).

Функциональные анализы.

Анализ маркеров активации. Специфический для антигена CD79b- Fab'-Y и специфический для антигена CD22 Fab'-X инкубировали вместе в течение 60 мин (в окружении 37°С и 5% CO₂) в эквимолярной концентрации. Комбинации титровали от исходной молярности 100 нМ, в серийных разведениях 1:4.

Специфический для антигенов CD79b и CD22 BYbe также титровали от исходной молярности 100 нМ в серийных разведениях 1:4. В 96-луночных планшетах с V-образным дном, 1,5*105 PBMC добавляли в лунки, в которые добавляли титрованные комбинации Fab'-X и Fab'-Y или титрованный BYbe. Комбинации Fab'-X и Fab'-Y или BYbe инкубировали с клетками в течение дополнительных 90 мин. После этого периода времени B-клетки активировали посредством добавления 25 мкг/мл F(ab')₂ козы против IgM человека (Southern Biotechnology) в течение 24 ч при 37°С плюс 5% CO₂.

В лунки добавляли 100 мкл ледяного буфера для FACS (PBS+1% BSA+0,1% NaN₃+2 мМ ЭДДА), планшеты герметично закрывали и накрывали влажным льдом в течение приблизительно 15 мин, перед центрифугированием при 500*g в течение 5 мин при 4°С. Избыток супернатанта отбрасывали от осадок клеток и планшеты встряхивали при 2000 об/мин в течение 30 с.

Затем клетки окрашивали с использованием коктейля флуоресцентно меченных антител против CD19, против CD20 и против CD71, против CD40 и против CD86 (BD Biosciences). Планшеты кратко встряхивали и инкубировали в течение 1 ч на влажном льду в темноте. После этого периода времени планшеты промывали дважды и ресуспендировали в 20 мкл буфера для FACS. Экспрессию CD19, CD20 и CD71, CD40 и CD86 измеряли с использованием проточного цитометра Intellicyt iQUE® Screener.

С использованием пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt), Bклетки идентифицировали отдельно от других популяций клеток и среднее геометрическое уровней CD71, CD40 и CD86 рассчитывали для каждой лунки. Затем все данные выражали как процент ингибирования от максимального ответа (только антитела против IgM) минус фон (только клетки).

Анализ PhosFlow. Специфический для антигена CD79b Fab'-Y и специфический для антигена CD22 Fab'-X инкубировали вместе в течение 60 мин (в окружении 37°С и 5% CO₂) в эквимолярной концентрации. Комбинации титровали от исходной молярности 100 нМ, в серийных разведениях 1:4. Специфический для антигена CD79b и антигена CD22 BYbe также титровали от исходной молярности 100 нМ, в серийных разведениях 1:4. В 96-луночных планшетах с V-образным дном, 5,0*10⁴ PBMC добавляли в лунки, в которые добавляли титрованные комбинации Fab'-X и Fab'-Y или титрованный BYbe. Комбинации Fab'-X и Fab'-Y или BYbe инкубировали с клетками в течение дополнительных 90 мин. После этого периода времени В-клетки активировали посредством добавления 25 мкг/мл F(ab')2 козы против IgM человека (Southern Biotechnology) в течение 15 мин при 37°С плюс 5% CO₂. Затем реакцию передачи сигнала останавливали посредством добавления равного объема буфера Cytofix (BD Biosciences). Затем планшеты оставляли при комнатной температуре на 15 мин перед центрифугированием при 500*g в течение 5 мин. Избыток супернатанта отбрасывали от осадка клеток, который ресуспендировали в буфере для FACS (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃+2 мМ ЭДДА) и промывали еще раз. Затем клетки ресуспендировали в ледяном буфере Perm III (BD Biosciences) в течение 30 мин перед промывкой дважды в проточном буфере.

Затем клетки окрашивали с использованием флуоресцентно меченного антитела против CD20 (BD Biosciences) и антител против фосфорилированного PLCy2, против фосфорилированного Akt и против фосфорилированного p38 (BD Biosciences). Затем проводили ресуспендирование в планшетах и инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. После этого периода времени планшеты промывали еще два раза и ресуспендировали в 20 мкл буфера для FACS. Экспрессию в клетках CD20 и фосфо-PLCγ2, фосфо-Akt и фосфо-р38 измеряли с использованием проточного цитометра Intellicyt iQUE®.

С использованием пакета программного обеспечения для анализа данных Forecyt™ (Intellicyt), Bклетки идентифицировали отдельно от других популяций клеток, и среднее геометрическое уровней PLCy2, Akt и p38 рассчитывали для каждой лунки. Затем все данные выражали как процент ингибирования от максимального ответа (только антитела против IgM) минус фон (только клетки).

Результаты.

Анализ PhosFlow. Данные на фиг. 15 показывают, что нацеливание на антиген CD79b и антиген CD22 в формате Fab-Kd-Fab или BYbe может ингибировать фосфорилированный PLCy2 в B-клетках, стимулированных с использованием антител против IgM. Данные на фиг. 16 показывают, что нацеливание на антиген CD79b и антиген CD22 в формате Fab-Kd-Fab или BYbe может ингибировать фосфорилированный P38 в Bклетках, стимулированных с использованием антител против IgM. Данные на фиг. 17 показывают, что нацеливание на антиген CD79b и антиген CD22 в формате Fab-Kd-Fab или BYbe может ингибировать фосфорилированный Akt в B-клетках, стимулированных с использованием антител против IgM.

- 76 034647

Анализ маркеров активации. Как можно видеть на фиг. 18, данные показывают, что нацеливание на антиген CD79b и антиген CD22 в формате Fab-Kd-Fab или BYbe может ингибировать экспрессию CD71 на B-клетках, стимулированных с использованием антител против IgM. Данные на фиг. 19 показывают, что нацеливание на антиген CD79b и антиген CD22 в формате Fab-Kd-Fab или BYbe может ингибировать экспрессию CD40 на B-клетках, стимулированных с использованием антител против IgM. Данные на фиг. 20 показывают, что нацеливание на антиген CD79b и антиген CD22 в формате Fab-Kd-Fab или BYbe может ингибировать экспрессию CD86 на B-клетках, стимулированных с использованием антител против IgM.

Пример 9. Сравнение активности совместного нацеливания на антиген CD79b плюс антиген CD22 в формате биспецифического Bybe с молекулярной связью с дополнительным добавлением связывающего домена против альбумина для продления времени полужизни in vivo.

Введение. Чтобы проверить, что активность по отношению к паре мишеней CD79b/CD22, идентифицированную в комплексном скрининге гетеродимерно объединенных Fab-Kd-Fab, можно перевести в сходную желательную активность в потенциальном терапевтическом формате с молекулярной связью с нацеливанием против альбумина, направленного на продление времени полужизни in vivo, фрагмент антитела против альбумина сливали с легкой цепью антигена CD22 Fab в формате BYbe, описанном в примере 8, посредством линкера, обладающего последовательностью SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17). Специфичность для антигена CD79b (VR4447) и специфичность для антигена CD22 (VR4130 и VR4126) получали в формате Bybe с добавлением и без добавления фрагмента против альбумина (VR0645).

Описание конструкций, использованных в этом эксперименте.

Наименование конструкции	Специфичность Fab	Тяжелая цепь scFv	Легкая цепь scFv
VR4447/VR4126 BYbe	Антиген CD79Ь	Антиген CD22	Нет
VR4447/VR4126/VR645) BYbe/альбумин	Антиген CD79Ь	Антиген CD22	Альбумин
VR4447/VR4130 BYbe	Антиген CD79Ь	Антиген CD22	Нет
VR4447/VR4130/VR645) BYbe/альбумин	Антиген CD79b	Антиген CD22	Альбумин

Способы

Очистка BYbe с дополнительной специфичностью/без дополнительной специфичности против альбумина.

Форматы BYbe (Fab-ds-scFv [scFv с C-конца тяжелой цепи Fab]) и BYbe со специфичностью против альбумина (Fab-2xds-scFv [scFv с C-конца тяжелой цепи и легкой цепи Fab]) очищали следующим образом.

Осветленные культуральные супернатанты после стандартной экспрессии в expiHEK или CHO стерилизовали фильтрацией через 0,22 мкм. Фильтрованные супернатанты наносили при 2 мл/мин на 50 мл колонки GammabindPlus с сефарозой XK26 (GE Healthcare), уравновешенные в PBS, pH7,4 (Sigma Aldrich Chemicals). После нанесения колонки промывали с использованием PBS, pH7,4 и затем проводили элюцию с использованием 0,1М глицина/HCl, pH 2,7. За элюцией следили по оптической плотности при 280 нм, собирали пик элюции и затем нейтрализовали с использованием 1/25 объема 2М Tris/HCl, pH 8,5.

Нейтрализованные образцы концентрировали с использованием концентраторов Amicon Ultra-15 с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10 кДа или 30 кДа и центрифугирования при 4000*g в роторе с качающимися стаканами. Концентрированные образцы наносили на колонку либо XK16/60, либо XK26/60 Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенную в PBS, pH 7,4. Проводили хроматографию на колонках с использованием изократического градиента PBS, pH 7,4 либо при 1 мл/мин, либо при 2,6 мл/мин соответственно. Фракции собирали и анализировали эксклюзионной хроматографией в геле TSK G3000SWXL; 5 мкм, колонка 7,8*300 мм, хроматография с использованием изократического градиента 0,2 М фосфата, pH 7,0 при 1 мл/мин, с детекцией при оптической плотности 280 нм. Избранные мономерные фракции объединяли и концентрировали до >1 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-15 с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10 кДа или 30 кДа, и центрифугирования при 4000*g в роторе с качающимися стаканами. Конечные образцы анализировали; по концентрации посредством сканирующего при A280 спектрофотометра УФ-видимой части спектра (Cary 50Bio); по % мономера посредством эксклюзионной хроматографии на геле TSK G3000SWXL; колонка 5 мкм, 7,8*300 мм, хроматография с использованием изократического градиента 0,2М фосфата, pH 7,0 при 1 мл/мин, с детекцией при оптической плотности 280 нм; посредством восстанавливающего и не восстанавливающего SDS-PAGE в 4-20% Tris-глициновых 1,5 мм гелях (Novex) при 50 мА (на гель) в течение 53 мин; и по эндотоксину посредством портативной тест-системы EndoSafe® Portable от Charles River с тестовыми картриджами с лизатом амебоцитов мечехвоста (LAL).

100 нМ очищенный белок для каждой конструкции предварительно инкубировали с PBMC человека, полученными от пяти отдельных доноров в течение 60 мин при 37°C/5% CO₂ в среде RMPI 1640 плюс

- 77 034647

10% фетальная бычья сыворотка и 2 мМ Glutamax (среда R10). Через 60 мин клетки стимулировали с использованием 25 мкг/мл антител козы против IgM, разработанных для стимуляции только B-клеток. Через 24 ч планшеты помещали на лед для остановки любой дальнейшей активации клеток перед промывкой один раз ледяным буфером для проточной цитометрии (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃). Весь супернатант удаляли и осадки клеток ресуспендировали. Клетки помещали на лед и добавляли коктейль антител против CD19, CD20, CD27, CD71 и CD86. Клетки инкубировали в течение 60 мин перед промывкой дважды в буфере для проточной цитометрии. Данные по связыванию антител против CD27, CD71 и CD86 с положительными по CD19/CD20 B-клетками получали с использованием высокопроизводительного проточного цитометра iQUE. Программное обеспечение Forecyt использовали для получения гистограмм и выведения среднего геометрического из считываний интенсивности связывания антител против CD27, CD71 и CD86 с B-клетками. Эти данные импортировали в Excel и значения процента ингибирования получали для каждой комбинации. Затем данные импортировали в Graphpad Prism и получали графики вида ящик с усами, где среднее указано посредством

На фиг. 21 показано ингибирование экспрессии CD27 на B-клетках, индуцированное посредством VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумина. Среди пяти тестированных доноров, для некоторых показаны постоянно сходные уровни ингибирования индуцированного антителами против IgM CD27.

На фиг. 22 показано ингибирование экспрессии CD71 на B-клетках, индуцированное VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумином. Среди пяти доноров для некоторых показаны постоянно сходные уровни ингибирования индуцированного антителами против IgM CD71.

На фиг. 23 показано ингибирование экспрессии CD86 на B-клетках, индуцированное VR4447/VR4126 BYbe и VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумином. Среди пяти доноров для некоторых показаны постоянно сходные уровни ингибирования индуцированного антителами против IgM CD86.

На фиг. 24 показано ингибирование экспрессии CD27 на B-клетках, индуцированное VR4447/VR4130 BYbe и VR4447/VR4130/VR645 BYbe/альбумином. Среди пяти тестированных доноров для некоторых показаны постоянно сходные уровни ингибирования индуцированного антителами против IgM CD27.

На фиг. 25 показано ингибирование экспрессии CD71 на B-клетках, индуцированное VR4447/VR4130 BYbe и VR4447/VR4130/VR645 BYbe/альбумином. Среди пяти доноров, для некоторых показаны постоянно сходные уровни ингибирования индуцированного антителами против IgM CD71.

На фиг. 26 показано ингибирование экспрессии CD86 на B-клетках, индуцированное VR4447/VR4130 BYbe и VR4447/VR4130/VR645 BYbe/альбумином. Среди пяти доноров для некоторых показаны постоянно сходные уровни ингибирования индуцированного антителами против IgM CD86.

Пример 10. Эффект совместного нацеливания антигена CD79b плюс антиген CD22 на функцию Bклеток памяти с использованием биспецифических Bybe с молекулярной связью с дополнительным добавлением или без дополнительного добавления фрагмента против альбумина.

Введение.

Для оценки того, оказывает ли нацеливание на CD79b/CD22 функциональный эффект на B-клетки в долгосрочной культуре, измеряли продукцию IgG из B-клеток, культивированных после выделения или в смешанной культуре PBMC. Измерение специфических антител против воскресшего антигена токсоида столбняка обеспечивает считываемый показатель функции B-клеток памяти.

Специфичность против антигена CD79b (VR4447) и специфичность против антигена CD22 (VR4126, VR4127 и VR4130) получали в формате BYbe с добавлением или без добавления фрагмента против альбумина (VR0645). Фрагмент антитела против альбумина сливали с легкой цепью Fab против антигена CD22 в формате BYbe, как описано в примере 8, посредством линкера, обладющего последовательностью SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:17).

Наименование конструкции	Специфично сть Fab	Тяжелая цепь scFv	Легкая цепь scFv
VR4447/VR4126 BYbe	Антиген CD7 9b	Антиген CD22	Нет
VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумин	Антиген CD79b	Антиген CD22	Альбумин
VR4447/VR4127 BYbe	Антиген CD79b	Антиген CD22	Нет
VR4447/VR4130 BYbe	Антиген CD79b	Антиген CD22	Нет
VR4447/VR4130/VR645 BYbe/альбумин	Антиген CD79b	Антиген CD22	Альбумин

- 78 034647

Способы

Форматы BYbe (Fab-ds-scFv [scFv с C-конца тяжелой цепи]) и BYbe with anti-альбумин (Fab-2xdsscFv [scFv с C-конца тяжелой цепи и легкой цепи Fab]) очищали, как описано в примере 9.

Активация B-клеток и измерение специфических для токсоида столбняка IqG.

PBMC человека или очищенные B-клетки, полученные от вплоть до 3 отдельных доноров, стимулировали с использованием 500 нг/мл CD40L, 1 мкг/мл CpG и 50 нг/мл IL-21 в среде 1640 плюс 10% фетальная бычья сыворотка и 2 мМ Glutamax (среда R10) в течение 6 суток. Конструкции очищенного белка добавляли в конечной концентрации 100 нМ на сутки 0 и оставляли в культуральной среде на время продолжительности анализа. Через 6 суток супернатанты собирали и количество IgG, специфических для токсоида столбняка, детектировали посредством ELISA. Кратко, планшеты для ELISA с половинным объемом лунок Maxisorp (Nunc) покрывали с использованием 10 мкг/мл токсоида столбняка в PBS в течение ночи при 4°С. Затем планшеты блокировали в 5% молоке в PBS, содержащем 0,05% Tween 20, в течение 2 ч. Супернатанты разводили и затем добавляли на 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали с использованием PBS-0,05% Tween 20, и связанное с токсином столбняка антитело детектировали с использованием антитела козы против IgG(H+L) человека с пероксидазой, разведенного до 1 мкг/мл в 5% молоке-PBS-0,05% Tween 20. Планшеты проявляли с использованием раствора субстрата TMB (KPL) и оптическую плотность измеряли при 450 нМ с использованием считывателя для микропланшетов Synergy 2 (Biotek). Данные экспортировали в Excel и рассчитывали процент ингибирования относительно клеток, культивированных без тестируемых антител. Затем данные импортировали в Graphpad Prism® и наносили на график в форме столбчатых диаграмм.

На фиг. 27 показано ингибирование продукции IgG против токсоида столбняка из PBMC, культивированных с VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe и VR4447/VR4130 BYbe. Данные представляют собой пулированные данные для 3 доноров.

На фиг. 28 показано ингибирование продукции IgG против токсоида столбняка из очищенных Bклеток, культивированных с VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe и VR4447/VR4130 BYbe. Данные представляют собой пулированные данные для 2 доноров.

На фиг. 29 показано ингибирование продукции IgG против токсоида столбняка либо из PBMC, либо из очищенных B-клеток, культивированных с VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe, VR4447/VR4130 BYbe, VR4447/VR4126/VR645 BYbe/альбумином и VR4447/VR4130/VR645 BYbe/альбумином. Показаны данные для одного донора.

Пример 11. Нарушение регуляции передачи сигналов BCR в B-клетках от пациента с SLE и эффект совместного нацеливания на антиген CD79b плюс антиген CD22 на функцию B-клеток при SLE.

Введение.

Чтобы оценить, можно ли использовать комбинацию CD79b/CD22 для лечения людей с аутоиммунными заболеваниями, авторы настоящего изобретения использовали B-клетки от пациентов с системной красной волчанкой (SLE) в качестве модельной системы. Тестировали влияние комбинации CD79b/CD22 (VR4447/VR4130) на статус активации передающих сигналы белков, как известно, вовлеченных в функцию B-клеток, но с нарушенной регуляцией у пациентов с SLE по сравнению со здоровыми волонтерами. В этом эксперименте В-клетки от пациентов с 12 SLE и 12 здоровых волонтеров сравнивали по эффекту, который совместное нацеливание на CD79b и CD22 оказывало на их статус активации.

Способы

Анализ PhosFlow.

Все анализы проводили с использованием 2*10⁵ PBMC на лунку.

В обработанных образцах специфические для антигена CD79b и антигена CD22 BYbe тестировали в концентрации 100 нМ. PBMC как от здоровых добровольцев, так и от пациентов с SLE предварительно инкубировали с BYbe в течение 90 мин при 37°С. В необработанных образцах BYbe просто исключали в ходе этого периода инкубации. После этого периода времени клетки активировали с использованием 25 мкг/мл F(ab')₂ козы против IgM человека (Southern Biotechnology) в течение 10 мин при 37°С плюс 5% CO₂ и реакцию останавливали посредством добавления фиксатора (Cytofix - BD Biosciences). В нестимулированных образцах, антитело против IgM человека просто исключали в ходе этого периода инкубации. Через 15 мин при комнатной температуре клетки осаждали (500*g в течение 5 мин) и затем ресуспендировали в ледяном буфере perm III (BD Biosciences) перед промывкой дважды в проточном буфере (PBS+1% BSA+0,01% NaN₃+2 мМ ЭДТА). Затем клетки окрашивали с использованием антител против CD20, против фосфорилированного (p) NF-кВ, против pSyk, против pAtk и против pErk 1 и 2, и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч. Наконец, планшеты промывали дважды в проточном буфере перед измерением в проточном цитометре iQUE (Intellicyt). Затем рассчитывали среднее геометрическое (среднюю интенсивность флуоресценции, MFI) экспрессии pNF-кВ, pSyk, pAkt и pErk 1 и 2 на B-клетках и выражали в графической форме.

- 79 034647

Результаты.

На фиг. 30 показано, что фоновое фосфорилирование NF-κΒ, Syk, Akt и Erk 1 и 2 (без стимуляции и без обработки) повышено в В-клетках пациентов с SLE по сравнению с фосфорилированием у здоровых добровольцев.

На фиг. 31-34 показано, что CD79/CD22 BYbe может равным образом ингибировать pNF-κΗ, pSyk, pAkt и pErk 1 и 2 у здоровых добровольцев и пациентов с SLE.

Заключения.

Эти данные показывают, что B-клетки от пациентов с SLE являются активированными перед какойлибо стимуляцией in vitro по сравнению с здоровыми добровольцами. После стимуляции клеток посредством B-клеточного рецептора, как для здоровых добровольцев, так и для пациентов с SLE, показаны увеличенные уровни активации по сравнению с фоновым сигналом. Как у здоровых добровольцев, так и у пациентов с SLE, этот сигнал, по существу, блокирован посредством комбинации CD79b/CD22. Эти данные показывают, что комбинация CD79b/CD22 может ингибировать B-клетки от здоровых добровольцев, так же как от людей с основным аутоиммунным заболеванием, указывая на то, что этот путь имеет фундаментальную важность для активации B-клеток.

Пример 12. Способ гуманизации.

Гуманизированные варианты антител кролика, полученных в предшествующих примерах и представленных на фиг. 35, разрабатывали посредством прививки CDR из V-областей антитела кролика в каркасные области V-областей человеческого зародышевого антитела. Для улучшения вероятности восстановления активности антитела, ряд каркасных остатков из V-областей кролика также сохраняли в разработанных гуманизированных последовательностях. Эти остатки выбирали с использованием протокола, описанного в Adair et al. (1991) (Humanised antibodies. WO 91/09967). CDR, привитые из донорной в акцепторную последовательность, являются такими, как определено по Kabat (Kabat et al., 1987), за исключением CDRH1, где используют комбинированное определение Chothia/Kabat (см. Adair et al., 1991 Humanised antibodies. WO 91/09967). Обычно гены VH антител кролика короче, чем выбранные акцепторные гены VH человека. При выравнивании с человеческими акцепторными последовательностями в каркасной области 1 из областей VH антител кролика, как правило, отсутствует N-концевой остаток, который сохраняют в гуманизированном антителе. В каркасной области 3 из областей VH антител кролика также, как правило, отсутствуют один или два остатка (75 или 75 и 76) в петле между цепями D и E бетаскладки: в гуманизированных антителах пропуск заполняют соответствующими остатками из выбранной человеческой акцепторной последовательности.

Гуманизированные последовательности представлены на фиг. 35, и донорные остатки указаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Представлены также варианты последовательностей CDR.

Антитело против CD79 Ab 4447.

Человеческие V-область IGRV1D-13 плюс J-область JR4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR легкой цепи антитела 4447. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VK 4447 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 2, 3, 36, 46, 49 и 70 (нумерация по Kabat): глутамин (Q2), валин (V3), лейцин (L36), глутамин (Q46), гистидин (H49) и глутамин (Q70) соответственно.

Человеческие V-область IGHV3-48 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4447. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4447 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 24, 48, 49, 71, 73, и 78 (нумерация по Kabat): валин (V24), изолейцин (I48), глицин (G49), лизин (R71), серин (S73) и валин (V78) соответственно.

Человеческие V-область IGHV4-59 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве альтернативного акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4447. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4447 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 37, 67, 71, 73 и 78 (нумерация по Kabat): валин (V37), фенилаланин (F67), лизин (R71), серин (S73) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта: широко опубликовано превращение глутамина в пироглутамат на N-конце антител и фрагментов антител. В некоторых случаях CDRL3 можно подвергать мутагенезу для удаления пары остатков цистеина (вариант CDRL3).

Антитело против CD79 Ab 4450.

Человеческие V-область IGRV1-6 плюс J-область JR4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR легкой цепи антитела 4450. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VR 4450 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 3 и 70 (нумерация по Kabat): аспарагиновая кислота (D3) и глутамин (Q70) соответственно. В некоторых случаях CDRL3 можно подвергать мутагенезу для модификации потенциального участка изомеризации аспартата (варианты 1-3 CDRL3).

Человеческие V-область IGHV3-66 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4450. В дополнение к CDR один или несколько из сле

- 80 034647 дующих каркасных остатков из гена VH 4450 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 24, 48, 49, 73 и 78 (нумерация по Kabat): валин (V24), изолейцин (I48), глицин (G49), серин (S73) и валин (V78) соответственно.

Человеческие V-область IGHV4-59 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве альтернативного акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4450. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена V_H 4450 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 37, 67, 71, 73 и 78 (нумерация по Kabat): валин (V37), фенилаланин (F67), аргинин (R71), серии (S73) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта.

Антитело против CD22 Ab 4120.

Человеческие V-область IGRV1D-13 плюс J-область JR4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR легкой цепи антитела 4120. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VR 4120 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 2 и 3 (нумерация по Kabat): фенилаланин (F2) и глутаминовая кислота (E3) соответственно.

Человеческие V-область IGHV3-33 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4120. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4120 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 11, 48, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): лейцин (L11), изолейцин (I48), лизин (R71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта. В некоторых случаях CDRH1 и CDRH2 можно подвергать мутагенезу для удаления остатков цистеина (вариант CDRH1 и вариант CDRH2 соответственно).

Человеческие V-область IGHV4-38-2 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве альтернативного акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4120. В дополнение к CDR, один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4120 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 24, 37, 49, 67, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): аланин (A24), валин (V37), аланин (A49), фенилаланин (F67), лизин (K71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта. В некоторых случаях CDRH1 и CDRH2 можно подвергать мутагенезу для удаления остатков цистеина (вариант CDRH1 и вариант CDRH2 соответственно).

Антитело против CD22 Ab 4126.

Человеческие V-область IGKV1-5 плюс J-область JK4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR легкой цепи антитела 4126. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена 4126 VK (донорных остатков) можно оставлять в положениях 3 и 70 (нумерация по Kabat): валин (V3) и глутамин (Q70) соответственно.

Человеческие V-область IGHV3-7 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4126. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4126 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): лизин (R71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. В некоторых случаях CDRH1, CDRH2 и CDRH3 можно подвергать мутагенезу для удаления остатков цистеина (вариант CDRH1, вариант CDRH2 и CDRH3 соответственно).

Человеческие V-область IGHV4-4 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве альтернативного акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4126. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4126 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 24, 48, 49, 67, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): аланин (A24), валин (V48), аланин (A49), фенилаланин (F67), лизин (K71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта. В некоторых случаях CDRH1, CDRH2 и CDRH3 можно подвергать мутагенезу для удаления остатков цистеина (вариант CDRH1, вариант CDRH2 и CDRH3 соответственно).

Антитело против CD22 Ab 4127.

Человеческие V-область IGKV1-5 плюс J-область JK4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR легкой цепи антитела 4127. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VK 4127 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 1, 3 и 70 (нумерация по Kabat): аланин (A1), валин (V3) и глутамин (Q70) соответственно. В некоторых случаях CDRL3 можно подвергать мутагенезу для модификации потенциальных участков изомеризации аспарагиновой кислоты (варианты 1-15 CDRL3).

Человеческие V-область IGHV3-9 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4127. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4127 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 47, 48,

- 81 034647

49, 71, 73, 76, 78 и 94 (нумерация по Kabat): лейцин (L47), изолейцин (I48), глицин (G49), лизин (R71), серин (S73), треонин (T76), валин (V78) и аргинин (R94) соответственно. В некоторых случаях CDRH1 и CDRH2 можно подвергать мутагенезу для удаления остатков цистеина (вариант CDRH1 и вариант CDRH2 соответственно).

Человеческие V-область IGHV4-38-2 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве альтернативного акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4127. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена 4127 VH (донорных остатков) можно оставлять в положениях 24, 37, 47, 67, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): аланин (A24), валин (V37), лейцин (L47), фенилаланин (F67), лизин (K71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта. В некоторых случаях CDRH1 и CDRH2 можно подвергать мутагенезу для удаления остатков цистеина (CDRH1 вариант и CDRH2 вариант соответственно).

Антитело против CD22 Ab 4128.

Человеческие V-область IGKV1-5 плюс J-область JK4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR легкой цепи антитела 4128. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VK 4128 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 3, 36, 63, 65, 66 и 71 (нумерация по Kabat): валин (V3), фенилаланин (F36), лизин (K63), аспарагиновая кислота (D65), аргинин (R66) и тирозин (Y71) соответственно.

Человеческие V-область IGHV3-33 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4128. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4128 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 11, 23, 24, 48, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): лейцин (L11), лизин (K23), глицин (G24), изолейцин (I48), лизин (K71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта. В некоторых случаях CDRH1 и CDRH2 можно подвергать мутагенезу для удаления остатков цистеина (вариант CDRH1 и вариант CDRH2 соответственно).

Человеческие V-область IGHV4-59 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве альтернативного акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4128. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4128 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 23, 24, 37, 49, 67, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): лизин (K23), глицин (G24), валин (V37), аланин (A49), фенилаланин (F67), лизин (K71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта. В некоторых случаях CDRH1 и CDRH2 можно подвергать мутагенезу для удаления остатков цистеина (вариант CDRH1 и вариант CDRH2 соответственно).

Антитело против CD22 Ab 4130.

Человеческие V-область IGKV1-9 плюс J-область JK4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR легкой цепи антитела 4130. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VK 4130 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 1, 2 и 3 (нумерация по Kabat): аланин (A1), аланин (A2) и валин (V3) соответственно.

Человеческие V-область IGHV3-66 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4130. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4130 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 48, 49, 67, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): изолейцин (I48), глицин (G49), валин (V67), лизин (R71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. В некоторых случаях CDRH2 можно подвергать мутагенезу для удаления остатка цистеина и/или модификации потенциального участка дезамидирования аспарагина (варианты 1-5 CDRH2). CDRH3 можно также подвергать мутагенезу для модификации потенциального участка дезамидирования аспарагина (варианты 1-2 CDRH3).

Человеческие V-область IGHV4-4 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве альтернативного акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4130. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4130 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 24, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): аланин (A24), лизин (R71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта. В некоторых случаях CDRH2 можно подвергать мутагенезу для удаления остатка цистеина и/или модификации потенциального участка дезамидирования аспарагина (варианты 1-5 CDRH2). CDRH3 можно также подвергать мутагенезу для модификации потенциального участка дезамидирования аспарагина (варианты 1-2 CDRH3).

Антитело против CD22 Ab 4132.

Человеческие V-область IGKV1-5 плюс J-область JK4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR легкой цепи антитела 4132. В дополнение к CDR один или несколько из сле- 82 034647 дующих каркасных остатков из гена VK 4132 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 3 и 71 (нумерация по Kabat): валин (V3) и тирозин (Y71) соответственно.

Человеческие V-область IGHV3-21 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4132. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4132 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 48, 49, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): серин (S48), глицин (G49), аспарагин (N71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. В некоторых случаях CDRH1 можно подвергать мутагенезу для удаления остатка цистеина (CDRH1 вариант). CDRH2 можно также подвергать мутагенезу для удаления остатка цистеина и/или модификации потенциального участка дезамидирования аспарагина (варианты 15 CDRH2).

Человеческие V-область IGHV4-4 плюс J-область JH4 (IMGT, http://www.imgt.org/) выбраны в качестве альтернативного акцептора для CDR тяжелой цепи антитела 4132. В дополнение к CDR один или несколько из следующих каркасных остатков из гена VH 4132 (донорных остатков) можно оставлять в положениях 24, 48, 67, 71, 73, 76 и 78 (нумерация по Kabat): аланин (A24), серин (S48), фенилаланин (F67), аспарагин (N71), серин (S73), треонин (T76) и валин (V78) соответственно. Остаток глутамина в положении 1 человеческой каркасной области заменен на глутаминовую кислоту (E1) для обеспечения экспрессии и очистки гомогенного продукта. В некоторых случаях CDRH1 можно подвергать мутагенезу для удаления остатка цистеина (вариант CDRH1). CDRH2 можно также подвергать мутагенезу для удаления остатка цистеина и/или модификации потенциального участка дезамидирования аспарагина (варианты 1-5 CDRH2).

Claims

1. Антитело, которое специфически связывается с CD22 и содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_L), где вариабельная область тяжелой цепи (V_H) содержит CDRH1, CDRH2 и CDRH3, где CDRH1 представляет собой SEQ ID NO: 37, CDRH2 представляет собой SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52 или 53 и CDRH3 представляет собой SEQ ID NO: 65, 66 или 67, и где вариабельная область легкой цепи (V_L) содержит CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRL1 представляет собой SEQ ID NO: 73, CDRL2 представляет собой SEQ ID NO: 79 и CDRL3 представляет собой SEQ ID NO: 100.

2. Антитело по п.1, где (V_H) и (V_L) являются гуманизированными.

3. Антитело по п.2, где вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) содержит каркасную область человека, где остаток по меньшей мере в одном из положений 11, 23, 24, 37, 47, 48, 49, 67, 71, 73, 76, 78 и 94 представляет собой донорный остаток, и вариабельный домен легкой цепи (VL) содержит каркасную область человека, где остаток по меньшей мере в одном из положений 1, 2, 3, 36, 63, 65, 66, 70 и 71 представляет собой донорный остаток.

4. Антитело по любому из пп.2 или 3, содержащее (V_H), выбранную из SEQ ID NO: 145, 146, 147 или 148.

5. Антитело по любому из пп.2-4, содержащее вариабельный домен (V_L), содержащий SEQ ID NO: 144.

6. Композиция для контроля измененных функций B-клеток, содержащая антитело по любому из пп.1-5.

7. Нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело по любому из пп.1-5.

8. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность по п.7.

9. Применение антитела по любому из пп.1-5 для терапии аутоиммунных заболеваний и злокачественных новообразований.

10. Применение композиции по п.6 для терапии аутоиммунных заболеваний и злокачественных новообразований.