EA031659B1 - Ингибиторы erk - Google Patents

Abstract

В изобретении предложены тиено[2,3-с]пиррол-4-оновые соединения, ингибирующие активность внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK), которые могут быть эффективными при лечении рака.

Description

Изобретение относится к тиено[2,3-с]пиррол-4-оновым соединениям или к их фармацевтически приемлемым солям и к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, которые ингибируют активность внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK) и могут быть эффективными для лечения рака.

Путь ERK/MARK является важным для пролиферации клеток, и его активацию часто наблюдают при разнообразных опухолях. При нескольких раковых заболеваниях, включая колоректальный рак, меланому, немелкоклеточный рак легкого, а также опухоли молочной железы и поджелудочной железы, происходит мутация в генах RAS, которые предшествуют ERK1/2 в сигнальном пути. Высокая активность RAS при многих опухолях человека сопровождается повышенной активностью ERK. В исследованиях также было показано, что ERK является ключевым компонентом сигнальной системы RAS. Указанные наблюдения подтверждают привлекательность сигнального пути ERK1/2 при развитии способов противораковой терапии для широкого спектра опухолей человека.

Ингибиторы ERK известны в данной области техники; см., например, WO 2013130976. Кроме того, в данной области техники известны и другие аминопиримидиновые соединения; см., например, WO 2010/022121. Сохраняется необходимость в предложении альтернативных ингибиторов ERK, в частности, для лечения рака. Соответственно, в настоящем изобретении предложены ингибиторы ERK1/2, которые могут быть эффективными для лечения рака.

В изобретении предложено соединение следующей формулы:

где R¹ представляет собой

R² и R³ независимо представляют собой метил, или R² и R³ могут быть объединены с образованием циклопропила;

R⁴ представляет собой водород, метил, хлор, фтор или трифторметил; и

R⁵ представляет собой

или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении также предложено соединение следующей формулы:

- 1 031659 где R¹ представляет собой

R² и R³ независимо представляют собой метил, или R² и R³ циклопропила;

R⁴ представляет собой водород, метил, хлор, фтор или трифторметил; и R⁵ представляет собой могут быть объединены с образованием

или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении также предложен вариант реализации соединения формулы I, где R² и R³ представляют собой метил.

В настоящем изобретении также предложен другой вариант реализации соединения формулы I, где R⁴ представляет собой водород.

В настоящем изобретении также предложен другой вариант реализации соединения формулы I, где R¹ представляет собой

В настоящем изобретении также предложен дополнительный вариант реализации соединения формулы I, где R⁵ представляет собой

Предпочтительно в настоящем изобретении предложено соединение, представляющее собой 6,6диметил-2-{2-[(1-метил-1И-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он, или его фармацевтически приемлемая соль.

В качестве конкретного варианта реализации в настоящем изобретении предложено соединение, представляющее собой 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1И-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он.

В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 6,6-диметил-2{2-[(1-метил-1И-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1И-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

В изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1И-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она или его фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту,

- 2 031659 нуждающемуся в этом, эффективного количества 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она.

В изобретении предложен 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. В настоящем изобретении предложен 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Шпиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4он или его фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения рака. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения рака, содержащая 6,6диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он или его фармацевтически приемлемую соль.

В изобретении также предложен 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он для применения в терапии. В настоящем изобретении предложен 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он для применения для лечения рака. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения рака, содержащая 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]-пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он.

В настоящем изобретении предложено применение 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака. В изобретении также предложено применение 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она для получения лекарственного средства для лечения рака.

В изобретении предложен 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он в кристаллической форме. В настоящем изобретении также предложен 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он в кристаллической форме, характеризующейся дифрактограммой рентгеновской порошковой дифракции, имеющей характеристические пики при 19,3° 2Θ ± 0,2° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 15,5, 17,1, 18,0, 20,2, 21,5 и 22,1°.

Кроме того, в настоящем изобретении предложены предпочтительные варианты реализации способов и применения, таких как описано в настоящей заявке, где рак выбран из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака поджелудочной железы и немелкоклеточного рака легкого. Предпочтительными раковыми заболеваниями являются колоректальный рак, рак поджелудочной железы и немелкоклеточный рак легкого.

В изобретении также предложен 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он или его фармацевтически приемлемая соль для применения для одновременного, раздельного или последовательного введения в комбинации с одним или более химиотерапевтическими агентами для лечения рака. Предпочтительными химиотерапевтическими агентами для указанной комбинации являются универсальное соединениеингибитор RAF, более конкретно 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фенил)мочевина), соединение-ингибитор CDK4/6, более конкретно палбоциклиб, рибоциклиб или [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил2-метил-3Н-бензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль, или антитело к VEGFR2, более конкретно рамуцирумаб. Дополнительными предпочтительными химиотерапевтическими агентами для указанной комбинации являются соединение-ингибитор рецепторной киназы ТФР-бета, более конкретно галунисертиб (см. WO 2004/048382), ингибитор киназы ALK-5, более конкретно EW-7197, соединение-ингибитор MEK, более конкретно кобиметиниб или траметиниб, или соединение-ингибитор Notch, более конкретно 4,4,4-трифтор-М-[(18)-2-[[(78)-5-(2-гидроксиэтил)-6-оксо7Н-пиридо[2,3-б][3]бензазепин-7-ил]амино]-1-метил-2-оксоэтил]бутанамид (см. WO 2013/016081). Дополнительными предпочтительными химиотерапевтическими агентами для указанной комбинации являются ингибитор PD-L1 (лиганд 1 запрограммированной гибели клеток) или ингибитор PD-1 (белок 1 запрограммированной гибели).

В настоящее изобретение предпочтительно включены соединения формулы I, имеющие следующие заместители:

a) R¹ представляет собой

b) R² представляет собой метил;

c) R³ представляет собой метил;

- 3 031659

d) R⁴ представляет собой водород; или

e) R⁵ представляет собой

Более предпочтительно в настоящее изобретение включены соединения формулы I, имеющие следующие комбинации заместителей:

a) R² и R³ представляют собой метил;

b) R² представляет собой метил, R³ представляет собой метил, и R⁴ представляет собой водород;

c) R¹ представляет собой

и R⁵ представляет собой

d) R² представляет собой метил, R³ представляет собой представляет собой метил, R⁴ представляет собой водород, и R¹

е) R² представляет собой метил, R³ представляет собой представляет собой метил, R⁴ представляет собой водород, и R⁵

или

f) R² представляет собой метил, R³ представляет собой метил, R⁴ представляет собой водород, и R¹ представляет собой

и R⁵ представляет собой

Следует понимать, что при использовании выше и далее в настоящем описании последующие тер мины, если не указано иное, имеют следующие значения.

Фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество представляет собой среду, общепринятую в данной области техники, для доставки биологически активных агентов млекопитающим, например человеку.

Фармацевтически приемлемые соли или фармацевтически приемлемая соль относится к относительно нетоксичной неорганической и органической соли или солям соединения согласно настоящему изобретению.

Эффективное количество обозначает количество соединения или его фармацевтической соли согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей соединение или его фармацевтически приемлемую соль, согласно настоящему изобретению, которое вызывает биологический или медицинский ответ или желаемое терапевтическое действие в ткани, организме, у животного, млекопитающего или человека, предполагаемый исследователем, ветеринаром, врачом или другим кли ническим специалистом.

Подразумевается, что термины способ лечения, лечить, лечение и т.д., включают замедление или обращение вспять прогрессирования нарушения. Указанные термины также включают облегчение, ослабление, подавление, устранение или снижение одного или более симптомов нарушения или состояния, даже если нарушение или состояние фактически не устраняется, и если прогрессирование нарушения или состояния как такового не замедляется или не обращается вспять.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что соединения согласно настоящему изо

- 4 031659 бретению могут образовывать соли. Соединения согласно настоящему изобретению содержат основные гетероциклы и соответственно они могут взаимодействовать с любыми неорганическими и органическими кислотами с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты. Указанные фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты и общая методика их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, P. Stahl et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008); S.M. Berge et al., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977.

Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно включают в состав фармацевтических композиций, которые вводят при помощи различных способов. Указанные композиции предпочтительно предназначены для перорального введения. Указанные фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro et al., 21-е изд., Mack Publishing Co., 2005).

Соединения согласно настоящему изобретению в общем случае являются эффективными в широком диапазоне дозировок. Например, ежедневные дозировки, как правило, включены в диапазон от примерно 1 до 2000 мг. Предпочтительно указанные ежедневные дозы включены в диапазон от 50 до 1000 мг. Более предпочтительно указанные ежедневные дозы включены в диапазон от 125 до 400 мг. В некоторых случаях дозировки ниже нижнего предела вышеуказанных диапазонов могут быть более чем достаточными, при этом в других случаях можно применять более высокие дозы, таким образом, подразумевается, что приведенные выше диапазоны дозировок не ограничивают каким-либо образом объем изобретения. Следует понимать, что фактическое вводимое количество соединения определяется лечащим врачом с учетом важных факторов, включая состояние, подвергающееся лечению, выбранный способ введения, фактическое вводимое соединение или соединения, возраст, массу тела и ответ конкретного пациента и тяжесть симптомов пациента.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что определенные соединения согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере один хиральный центр. В настоящее изобретение включены все отдельные энантиомеры или диастереомеры, а также смеси энантиомеров и диастереомеров указанных соединений, включая рацематы. Соединения согласно настоящему изобретению, содержащие по меньшей мере один хиральный центр, предпочтительно существуют в виде отдельных энантиомеров или диастереомеров. Отдельные энантиомеры или диастереомеры можно получать с использованием хиральных реагентов или при помощи стереоселективных или стереоспецифических способов синтеза. В качестве альтернативы отдельные энантиомеры или диастереомеры можно выделять из смесей при помощи стандартных способов хиральной хроматографии или кристаллизации.

Обозначение изомер 1 в названии соединения указывает на то, что соответствующее промежуточное соединение или соединение согласно настоящему изобретению является первым из двух элюируемых энантиомеров при разделении смеси двух энантиомеров путем хиральной хроматографии. Обозначение изомер 2 в названии соединения указывает на то, что соответствующее промежуточное соединение или соединение согласно настоящему изобретению является вторым из двух элюируемых энантиомеров при разделении смеси двух энантиомеров путем хиральной хроматографии.

Соединения согласно настоящему изобретению можно получать согласно способам синтеза, хорошо известным и изученным в данной области техники. Подходящие условия для проведения стадий указанных взаимодействий хорошо известны в данной области техники, и соответствующие замены растворителей и реагентов входят в рамки компетенции специалистов в данной области техники. Кроме того, специалисты в данной области техники должны понимать, что во время синтеза при необходимости или по желанию промежуточные соединения можно выделять и/или очищать при помощи различных хорошо известных способов, и часто можно использовать различные промежуточные соединения непосредственно на последующих стадиях синтеза после незначительной очистки, или вообще не проводя очистку. Кроме того, специалистам будет понятно, что в некоторых случаях порядок, в котором вводят фрагменты, не важен. Конкретный порядок стадий, требуемых для получения соединений согласно настоящему изобретению, зависит от конкретного синтезируемого соединения, исходного соединения и относительной реакционной способности замещаемых фрагментов, что хорошо известно квалифицированным химикам. Все заместители, если не указано иное, такие как определено выше, и все реагенты хорошо известны и изучены в данной области техники.

При использовании в настоящем описании следующие термины имеют указанные значения: ACN относится к ацетонитрилу; ДХМ относится к дихлорметану; ДМФ представляет собой N,Nдиметилформамид; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; DTT относится к дитиотреитолу; ЭДТА относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; ЭГТА относится к этиленгликольтетрауксусной кислоте; ELISA относится к фермент-связанному иммуносорбентному исследованию; EtOAc относится к этилацетату; EtOH относится к этанолу; ЭБС относится к эмбриональной бычьей сыворотке; HBSS относится к сбалансированному солевому раствору Хэнкса; IC₅₀ относится к концентрации полумаксимального ингибирования; IVTI относится к ингибированию мишени in vivo; MC относится к масс-спектроскопии; МеОН относится к метанолу; ЯМР относится к ядерному магнитному резонансу; PBST относится к фосфатному буферному солевому раствору, содержащему Tween-20; ТГФ

- 5 031659 относится к тетрагидрофурану; UVW относится к длине волны в ультрафиолетовом диапазоне, и XRD относится к рентгеновской дифракции.

Если не указано обратное, названия и нумерация соединений, проиллюстрированных в настоящем описании, получены с использованием ACDLABS или Accelrys Draw 4.1.

Соединения согласно настоящему изобретению можно синтезировать, как проиллюстрировано на следующих схемах, где R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ такие, как определено выше.

Схема 1. Синтез соединений формулы I

О

Формула I

На схеме 1 проиллюстрирован общий способ синтеза соединений формулы I. Проводят взаимодействие соединения 1 с подходящим замещенным соединением 2 в хорошо известных условиях реакции ароматического замещения или сочетания с получением соединения формулы I. Более конкретно, проводят взаимодействие соединения 1 с соединением 2 при повышенной температуре в присутствии подходящего основания, такого как гидрид натрия, хлорид изопропилмагния, карбонат цезия, карбонат или трет-бутоксид калия. Необязательно, добавление подходящего агента-лиганда, такого как 4,5бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен или 2-(ди-трет-бутилфосфино)-2',4',6'-триизопропил-3,6диметокси-1,1'-бифенил, и подходящего катализатора, такого как ацетат палладия(П), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) или хлор[2-(ди-трет-бутилфосфино)-2',4',6'-триизопропил-1,1 '-бифенил] [2(2-аминоэтил)фенил)]палладий(П), в соответствующем растворителе, таком как 1,4-диоксан или третбутиловый спирт, также может обеспечивать соединение формулы I.

Схема 2. Синтез соединений формулы I, где R⁵ представляет собой 3-метокси-1Н-пиразол-4-ил или 3 -циклопропил-1 Н-пиразол-4-ил

На схеме 2 проиллюстрирован способ синтеза соединений формулы I, где R⁵ представляет собой 3метокси-1И-пиразол-4-ил или 3-циклопропил-1И-пиразол-4-ил. Проводят взаимодействие соединения 1 с соединением 3, представляющим собой подходящий замещенный пиразоламин, содержащий подходящие азот-защитные группы, такие как трет-бутилоксикарбонил, в хорошо известных условиях реакции сочетания, таких как описано выше, с получением соединения 4. Проводят дополнительное взаимодействие соединения 4 с подходящим агентом для удаления азот-защитных групп, таким как хлороводород или трифторуксусная кислота, в подходящем растворителе, таком как 1,4-диоксан или МеОН, с получением соединения формулы I, где R⁵ представляет собой 3-метокси-1И-пиразол-4-ил или 3-циклопропил1 И-пиразол-4-ил.

- 6 031659

Схема 3. Альтернативный способ синтеза соединений формулы I о о

о

На схеме 3 проиллюстрирован альтернативный способ синтеза соединений формулы I. Проводят взаимодействие соединения 5 с (2-бромэтокси)-трет-бутилдиметилсиланом в присутствии подходящего основания, такого как гидрид натрия, в подходящем растворителе, таком как ДМФ, с получением соединения 6. Затем проводят взаимодействие соединения 6 с подходящим замещенным соединением 2 (R⁵NH₂) в хорошо известных условиях реакции сочетания, таких как описано выше, с получением соединения 7. Проводят взаимодействие соединения 7 с подходящим агентом для удаления защитных групп, таким как уксусная кислота, в подходящем растворителе, таком как смесь ТГФ и воды, с получением соединения 8. Проводят дополнительное взаимодействие соединения 8 с метансульфонилхлоридом в подходящем растворителе, таком как ДМФ, в присутствии подходящего основания, такого как триэтиламин, с получением соединения 9. Проводят взаимодействие соединения 9 с подходящим амином в подходящем растворителе, таком как ACN, с получением соединения формулы I.

Схема 4. Синтез соединения 1

На схеме 4 проиллюстрирован способ синтеза соединения 1. Проводят взаимодействие соединения 10 с подходящим бромирующим агентом, таким как N-бромсукцинимид, в подходящем растворителе, таком как ACN, с получением соединения 11. Проводят взаимодействие соединения 11 с подходящим основанием, таким как гидрид натрия или гидроксид натрия, и подходящим агентом N-алкилирования, таким как 4-(2-хлорэтил)морфолин, с получением соединения 12. Проводят взаимодействие соединения 12 с бис(пинаколато)дибором, подходящим основанием, таким как ацетат калия, и подходящим катализатором, таким как хлорид (1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен)палладия(П), в подходящем растворителе, таком как 1,4-диокеан, при повышенной температуре с получением соединения 13. Проводят взаимодействие соединения 13 с подходящим замещенным пиримидиновым соединением, таким как 2,4дихлор-5-метилпиримидин, подходящим основанием, таким как карбонат калия, подходящим катализатором, таким как тетракис(трифенилфосфин)палладий, в подходящем растворителе, таком как смесь 1,4диоксана и воды, при повышенной температуре с получением соединения 1.

- 7 031659

Схема 5. Альтернативный способ синтеза соединения 1 о о

О

На схеме 5 проиллюстрирован альтернативный способ синтеза соединения 1. Проводят взаимодействие соединения 11 с подходящим азот-защитным агентом, таким как ди-трет-бутилдикарбонат, в подходящем растворителе, таком как ACN, в присутствии подходящего основания, такого как N,Nдиизопропилэтиламин, с получением соединения 14. Проводят взаимодействие соединения 14 с бис(пинаколато)дибором в хорошо известных условиях реакции сочетания, таких как описано выше, с получением соединения 15. Проводят взаимодействие соединения 15 с подходящим замещенным пиримидиновым соединением в хорошо известных условиях реакции сочетания, таких как описано выше, с получением соединения 16. Проводят удаление защитных групп в соединении 16 с использованием подходящего агента для удаления защитных групп, такого как трифторуксусная кислота или хлороводород, в подходящем растворителе, таком как ДХМ или 1,4-диоксан, с получением соединения 17. Проводят взаимодействие соединения 17 с подходящим алкилирующим агентом, таким как 4-(2-бромэтил)морфолин, в подходящем растворителе, таком как N-метилпирролидон, в присутствии подходящего основания, такого как гидрид натрия, с получением соединения 1.

Пример получения 1. 6,6-Диметилтиено[2,3-с]фуран-4-он

О

Охлаждали раствор 3-тиофенкарбоновой кислоты (250 г, 1,95 моль) в ТГФ (9750 мл) до -70°С в 20 л

3-горлой колбе. В полученный раствор медленно добавляли н-бутиллитий (2,5М в гексане, 1872 мл, 4,68 моль), поддерживая температуру ниже -55°С. Перемешивали реакционную смесь в течение одного часа при -70°С. Медленно добавляли ацетон (187 мл, 2,55 моль) при -70°С. Оставляли реакционную смесь нагреваться до 0°С и перемешивали в течение трех часов при 0°С. В полученный раствор добавляли 4М HCl (1500 мл) при 0°С и оставляли реакционную смесь нагреваться до комнатной температуры. Перемешивали полученную смесь в течение ночи. Фильтровали реакционную смесь через подложку с диатомитовой землей и промывали подложку толуолом (3х 500 мл). Концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Растворяли полученный неочищенный остаток в толуоле (3750 мл) и воде (250 мл) и добавляли п-толуолсульфокислоту (100,1 г, 0,526 моль) при комнатной температуре. Кипятили реакционную смесь с обратным холодильником в течение 16 ч при 100°С. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении при 50°С. Растворяли полученный остаток в воде и экстрагировали EtOAc (2х10 л). Промывали органический слой насыщенным водным бикарбонатом натрия и водой. Сушили органический слой над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении при 50°С с получением 200 г титульного соединения (61%) в виде коричневой вязкой жидкости. МС (m/z): 169 (М+1).

Пример получения 2. 6,6-Диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он

NH

В 5 л автоклав помещали раствор 6,6-диметилтиено[2,3-с]фуран-4-она (150 г, 0,891 моль) в гидро ксиде аммония (1000 мл). В замкнутой среде осторожно нагревали реакционную смесь до 200°С и перемешивали в течение четырех часов при 200°С. Через четыре часа охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и стравливали газообразный аммиак. Экстрагировали реакционную смесь ДХМ (3х

фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении при 50°С с получением 100 г титульного соединения (67%). МС (m/z): 168 (М+1).

Пример получения 3. Метил-2-бромтиофен-3-карбоксилат

- 8 031659

Обрабатывали раствор 2-бром-3-тиофенкарбоновой кислоты (10,1 г, 49 ммоль) в МеОН (100 мл) серной кислотой (2,5 мл, 45 ммоль). Нагревали реакционную смесь до температуры обратной конденсации в течение ночи. Концентрировали смесь при пониженном давлении для удаления органического растворителя и выливали полученную смесь в ледяную воду. Экстрагировали холодный раствор EtOAc. Промывали объединенные органические экстракты водой, затем насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении с получением 10,77 г титульного соединения (100%). ¹H ЯМР (400,15 МГц, ДМСО-а₆) δ 7,65 (d, J=6 Гц, 1H), 7,34 (d, J=6 Гц, 1H), 3,78 (s, 3H).

Пример получения 4. Метил-2-цианотиофен-3-карбоксилат

Нагревали смесь метил-2-бромтиофен-3-карбоксилата (28 г, 128 ммоль) и цианида меди (15 г, 167 ммоль) в N-метилпирролидоне (130 мл) до 120°С в течение ночи. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и разбавляли EtOAc. Промывали органический раствор насыщенным NaCl, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя 25% EtOAc в гексане, с получением 15,2 г титульного соединения (71%). 'Н ЯМР (400,15 МГц, ДМСО^₆) δ 8,10 (d, J=5 Гц, 1H), 7,58 (d, J=5 Гц, 1H), 3,86 (s, 3H).

Пример получения 5. Спиро[5Н-тиено[2,3-с]пиррол-6,1'-циклопропан]-4-он

Обрабатывали выдерживаемый при -70°С раствор метил-2-цианотиофен-3-карбоксилата (13,7 г, 79 ммоль) и тетра(изопропоксида) титана (24,8 г, 87,4 ммоль) в диэтиловом эфире (330 мл) раствором бромида этилмагния (3M в диэтиловом эфире, 58 мл, 175 ммоль). Перемешивали реакционную смесь в течение 60 мин. Удаляли охлаждающую баню и оставляли смесь медленно нагреваться до комнатной температуры на один час. Добавляли эфират трифторида бора (22,6 мл, 159 ммоль) и перемешивали смесь в течение еще одного часа. Реакцию гасили 1н. хлороводородной кислотой (240 мл) и перемешивали в течение ночи. Отделяли органический слой и повторно экстрагировали водный слой дополнительным количеством диэтилового эфира. Объединяли органические экстракты и промывали насыщенным водным бикарбонатом натрия и насыщенным NaCl. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем ВЭЖХ на колонке С18 (колонка: 275 г; подвижная фаза: А) 0,10% муравьиной кислоты в воде, В) 0,10% муравьиной кислоты в ACN; градиент: 5-35% В; расход: 80 мл/мин) с получением 1,02 г титульного соединения (35%). '11 ЯМР (400,15 МГц, ДМСО-d^ δ 8,43 (шир^, 1H), 7,53 (d, J=5 Гц, 1H), 7,12 (d, J=5 Гц, 1H), 1,51 (m, 2Н), 1,38 (m, 2Н).

Пример получения 6. 2-Бром-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он

В 20 л колбу, содержащую 6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он (835 г, 4,99 моль), добавляли ACN (10000 мл) и охлаждали раствор до 10°С. В реакционную смесь добавляли N-бромсукцинимид (444,4 г, 2,49 моль) четырьмя равными порциями и перемешивали в течение шести часов при 25°С. Кон центрировали реакционную смесь при пониженном давлении и суспендировали полученное соединение в воде и экстрагировали EtOAc (3х 4,1 л). Промывали объединенные органические экстракты водой (3х 4,1 л) и насыщенным NaCl (4,1 л), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Органический раствор хранили для объединения с дополнительными порциями.

При помощи того же способа, что описан выше, получали две дополнительные порции с использованием 650 г и 835 г 6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она соответственно. Объединяли органические растворы, полученные во всех трех опытах, и концентрировали при пониженном давлении при 50°С с получением 2-бром-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она в виде коричневого клейкого вещества. Суспендировали полученный продукт в смеси диэтиловый эфир/гексан (2:1 об./об.) и фильтровали с получением 1542 г титульного соединения (45%). МС (m/z): 246/248 (М+1/М+3).

- 9 031659

Следующее соединение получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере получения 6

Пр.пол.	Название соединения	Структура	МС (m/z):
7	2-бромспиро [5Н-тиено[2,3 -с] пиррол - 6,1 '-цикл опропан] -4-он	О	244/246 (М+1/М+3)

Пример получения 8. Гидробромид 4-(2-бромэтил)морфолина

Н-Вг

Раствор дибромида трифенилфосфина (124 г, 293 ммоль) в ДХМ (2,44 л) обрабатывали, добавляя по каплям раствор 4-морфолинэтанола (32 г, 244 ммоль) в ДХМ (60 мл) в течение одного часа, поддерживая температуру реакционной смеси ниже 25°С. Перемешивали смесь в течение ночи при комнатной температуре. Проводили дополнительное взаимодействие, как описано выше, с использованием 4морфолинэтанола (10 г, 76 ммоль), изменив соответствующим образом количества других реагентов. Объединяли реакционные смеси и собирали твердые вещества путем вакуумного фильтрования с получением 76,7 г титульного соединения (84%). ¹Н ЯМР (399,8 МГц, ДМСО-й₆) δ 4,05 (m, 2Н), 3,84 (m, 2Н), 3,78 (t, J=7 Гц, 1H), 3,67 (t, J=7 Гц, 2Н), 3,56 (m, 2Н), 3,26 (m, 2Н).

Пример получения 9. трет-Бутил-2-бром-6,6-диметил-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-5-карбоксилат

Способ синтеза 1.

Обрабатывали раствор 2-бром-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она (25 г, 102 ммоль), 4диметиламинопиридина (1,25 г, 10 ммоль) и Х,Х-диизопропилэтиламина (24 мл, 138 ммоль) в ACN (481 мл) ди-трет-бутилдикарбонатом (35 г, 162 ммоль). Перемешивали смесь в течение ночи при комнатной температуре. Концентрировали смесь при пониженном давлении. Разбавляли смесь гексаном, фильтровали смесь через подложку с силикагелем и элюировали подложку гексаном, затем 20% ДХМ в гексане. Концентрировали фильтрат досуха с получением 36,5 г титульного соединения (93%) в виде оранжевого маслянистого вещества. ¹H ЯМР (399,8 МГц, CDCl₃) δ 7,19 (s, 1H), 1,74 (s, 6H), 1,58 (s, 9H).

Способ синтеза 2.

Раствор 2-бром-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она (200 г, 813 ммоль), ХА'-димети.ширидип-

4-амина (9,93 г, 81 ммоль) и ди-трет-бутилдикарбоната (266 г, 1219 ммоль) в ACN (2 л) обрабатывали, добавляя по каплям Х'А'-диизопропидэтидамин (213 мл, 1219 ммоль). Перемешивали смесь при комнатной температуре в течение четырех часов. Нагревали реакционную смесь до 30°С в течение двух часов. Охлаждали смесь до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Концентрировали смесь при пониженном давлении. Разбавляли смесь EtOAc и дважды промывали полученный органический раствор водой (300 мл), затем насыщенным NaCl (300 мл). Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток на подложке с силикагелем, элюируя с градиентом 0-20% смесями EtOAc в гексане, с получением 253 г титульного соединения (90%). МС (m/z): 290/292 (М-изобутен+1/М-изобутен+3). ¹H ЯМР (399,8 МГц, CDCI3) δ 7,19 (s, 1H), 1,74 (s, 6H), 1,58 (s, 9H).

Пример получения 10. трет-Бутил-6,6-диметил-4-оксо-2-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-

Дегазировали смесь трет-бутид-2-бром-6,6-диметил-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-5-карбоксидата (114 г, 329 ммоль), бис(пинаколато)дибора (125 г, 494 ммоль) и ацетата калия (97 г, 988 ммоль) в 1,4-диоксане (1,6 л) азотом в течение 10 мин. Добавляли хлорид (1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен)падладия (II) (5,38 г, 6,6 ммоль) и грели смесь при 90°С в течение четырех часов. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и фильтровали через подложку CELITE®. Концентрировали фильтрат и затем обрабатывали остаток 10% EtOAc в гексане. Собирали осадок путем вакуумного фильтрования с получением 65,8 г титульного соединения (40%). МС (m/z): 338 (М-изобутен+1).

Пример получения 11. трет-Бутид-2-(2-хдорпиримидин-4-ил)-6,6-диметид-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-5-карбоксилат

- 10 031659

Способ синтеза 1.

Дегазировали смесь трет-бутил-2-бром-6,6-диметил-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-5-карбоксилата (36 г, 104 ммоль), бис(пинаколато)дибора (59,8 г, 235 ммоль) и ацетата калия (33,2 г, 338 ммоль) в 1,4-диоксане (520 мл) азотом в течение 10 мин. Добавляли хлорид (1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен)палладия (II) (4,45 г, 5,5 ммоль) и нагревали смесь до 90°С. Грели смесь при 90°С в течение двух часов. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и перемешивали в течение трех часов. Добавляли 2,4дихлорпиримидин (22 г, 145 ммоль), затем раствор карбоната калия (20,4 г, 147 ммоль) в воде (83 мл). Дегазировали полученную смесь азотом в течение 10 мин. Добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (1,59 г, 1,38 ммоль) и нагревали смесь до 90°С в течение двух часов. Охлаждали смесь до комнатной температуры и фильтровали через подложку CELITE®. Промывали фильтрат тремя порциями воды и одной порцией насыщенного NaCl. Концентрировали органический слой при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-25% смесями EtOAc в ДХМ, с получением 11 г титульного соединения (59%). МС (m/z): 324 (М-изобутен+1).

Способ синтеза 2.

Дегазировали смесь трет-бутил-6,6-диметил-4-оксо-2-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2ил)тиено[2,3-с]пиррол-5-карбоксилата (11,7 г, 30 ммоль), 2,4-дихлорпиримидина (13 г, 89 ммоль), карбоната калия (20,4 г, 147 ммоль) и воды (50 мл) в 1,4-диоксане (100 мл) азотом в течение 10 мин. Добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (2,58 г, 2,2 ммоль) и нагревали смесь до 87°С в течение 1,5 ч. Охлаждали смесь до комнатной температуры. Разбавляли смесь EtOAc (1 л) и промывали полученный раствор водой и насыщенным NaCl. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Обрабатывали остаток 30% EtOAc в гексане (200 мл) и собирали полученный осадок путем вакуумного фильтрования с получением 7,6 г титульного соединения (67%). МС (m/z): 324 (М-изобутен+1).

Пример получения 12.

2-(2-Хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он

Перемешивали смесь трет-бутил-2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-

5-карбоксилата (6,36 г, 16,7 ммоль) и трифторуксусной кислоты (25 мл) в ДХМ (25 мл) при комнатной температуре в течение двух часов. Концентрировали смесь при пониженном давлении и разбавляли остаток ДХМ. Разделяли смесь насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и собирали твердые вещества из двухфазной эмульсии. Промывали твердые вещества диэтиловым эфиром и сушили в вакууме при 50°С в течение ночи с получением 4,65 г титульного соединения (99%). МС (m/z): 280 (М+1).

Пример получения 13. Гидрохлорид 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она

Нагревали раствор трет-бутил-2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-5карбоксилата (66,7 г, 176 ммоль) и хлороводорода (4М в 1,4-диоксане, 263 мл, 1054 ммоль) в 1,4диоксане (585 мл) при 30°С в течение пяти часов. Удаляли нагревательный элемент и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. В реакционную смесь медленно добавляли гексан (800 мл). Перемешивали полученную взвесь в течение 10 мин и собирали твердые вещества путем вакуумного фильтрования. Сушили твердое вещество в вакууме с получением 56 г титульного соединения (100%). МС (m/z): 280 (М+1).

Пример получения 14. 2-Бром-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)тиено[2,3-с]пиррол-4-он

О

В воду (250 мл) добавляли гидроксид натрия (160 г, 4 моль) и перемешивали смесь до получения прозрачного раствора. Добавляли 1,4-диоксан (2 л), затем 2-бром-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4он (215 г, 874 ммоль), йодид тетрабутиламмония (300 г, 812 ммоль) и гидрохлорид 4-(2-хлор

- 11 031659 этил)морфолина (300 г, 1564 ммоль). Грели смесь при 80°С в течение одного часа. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры. Разбавляли реакционную смесь водой (2 л) и экстрагировали смесь EtOAc (3х 2 л). Сушили объединенные органические экстракты над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Добавляли ДХМ (2 л) и гексан (2 л) и промывали полученный органический раствор насыщенным NaCl (2х 1 л). Концентрировали органический раствор при пониженном давлении до минимального объема. Отфильтровывали твердые вещества с получением 180 г титульного соединения (57%). МС (m/z): 359/361 (М+1/М+3).

Пример получения 15. 2-Бром-5-[2-[трет-бутил(диметил)силил]оксиэтил]-6,6-диметилтиено[2,3с]пиррол-4-он

Суспензию гидрида натрия (60 мас.% в минеральном масле, 3,9 г, 97,5 ммоль) в ДМФ (203 мл) обрабатывали при 0°С 2-бром-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-оном (20 г, 81,3 ммоль), затем (2бромэтокси)-трет-бутилдиметилсиланом (23,3 г, 97,5 ммоль). Перемешивали реакционную смесь при 0°С в течение одного часа. Удаляли ледяную баню и перемешивали реакционную смесь в течение ночи. Реакцию гасили насыщенным водным хлоридом аммония и экстрагировали смесь EtOAc. Промывали органический раствор насыщенным NaCl. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя 20% EtOAc в гексане, с получением 26 г титульного соединения (79%). МС (m/z): 404/406 (М+1/М+3).

Следующее соединение получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере получения 15

Пр. пол.	Название соединения	Структура	МС (m/z):
16	2'-бром-5'-(2морфолиноэтил)спиро[циклопропан-1,6'тиено[2,3-с]пиррол]-4'-он	О SA	357/359 (M+l/M+3)

Пример получения 17. 2-(2-Хлор-5-метилпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)тиено[2,3-с]пиррол-4-он

Дегазировали смесь 2-бром-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)тиено[2,3-с]пиррол-4-она (5,76 г, 16 ммоль), бис(пинаколато)дибора (4,88 г, 19,2 ммоль) и ацетата калия (4,86 г, 48 ммоль) в 1,4-диоксане (80 мл) азотом в течение 20 мин. Добавляли хлорид (1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен)палладия (II) (668 мг, 0,80 ммоль) и грели смесь при 90°С в течение ночи. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры, концентрировали фильтрат и затем обрабатывали остаток EtOAc. Собирали осадок путем вакуумного фильтрования. К твердому веществу (3,7 г) добавляли 2,4-дихлор-5-метилпиримидин (1,5 г, 9,1 ммоль), 1,4-диоксан (50 мл), карбонат калия (3,8 г, 27 ммоль) и воду (33 мл). Дегазировали полученную смесь азотом в течение 20 мин. Добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (790 мг, 0,68 ммоль) и нагревали смесь до 90°С в течение двух часов. Охлаждали смесь до комнатной температуры и разбавляли EtOAc. Промывали органический раствор насыщенным NaCl. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-10% смесями МеОН в EtOAc, с получением 1,82 г титульного соединения (19%). МС (m/z): 407 (М+1).

Следующие соединения получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере получения 17

Пр. пол.

Название соединения

Структура

МС (m/z):

- 12 031659

18	2-(2,5-дихлорпиримидин-4-ил)6,6-диметил-5-(2морф ол иноэтил )тиено [2,3с] пиррол-4-он	CI О /___ч /=^ _χ° Cl /	427 (M+1)
19	2-(2-хлор-5-фторпиримидин-4ил)-6,6-диметил-5-(2морф ол иноэтил )тиено [2,3с] пиррол-4-он	F 0 / \	411 (M+1)
20	2-[2-хлор-5-(трифторметил)пиримидин-4-ил] -6,6-диметил-5 (2-морфолиноэтил)тиено[2,3с] пиррол-4-он	F F / F 7/ /° Cl '	461 (M+1)
21	5-|2-|/и/?е/и-бутил(диметил)силил] оксиэтил] -2-(2хлорпиримидин-4-ил)-6,6диметилтиено[2,3-с]пиррол-4-он	0 A Cl	438 (M+1)
22	2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6диметил-5-[2-(5-окса-8азаспиро [2.6] нонан-8ил)этил]тиено[2,3-с]пиррол-4-он	- у Λ l·/ —ATf4 N—У \ z° Cl /	433 (M+1)
23	2'-(2-хлорпиримидин-4-ил)-5'-(2морфолиноэтил)спиро[цикл опропан-1,6'-тиено [2,3с]пиррол]-4'-он	0 /—ч Cl	391 (M+1)

Пример получения 24. 2-(2-Хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)тиено[2,3с]пиррол-4-он о

Способ синтеза 1.

Дегазировали смесь 2-бром-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)тиено[2,3-с]пиррол-4-она (200 г, 557 ммоль), бис(пинаколато)дибора (200 г, 788 ммоль) и ацетата калия (200 г, 2038 ммоль) в 1,4-диоксане (1 л) азотом в течение 15 мин. Добавляли хлорид (1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен)палладия (II) (20 г, 27 ммоль) и нагревали смесь до 90°С. Грели смесь при 90°С в течение одного часа. Охлаждали реакционную смесь до 50°С и добавляли карбонат калия (250 г, 1809 ммоль), 2,4-дихлорпиримидин (230 г, 1543 ммоль) и воду (300 мл). Грели смесь при 90°С в течение одного часа. Охлаждали смесь до 35°С и добавляли воду (700 мл). Экстрагировали реакционную смесь ДХМ (2 л). Водный раствор снова экстрагировали ДХМ (500 мл). Сушили объединенные органические растворы над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Разбавляли остаток 10% EtOAc в гексане (2 л) и перемешивали в течение одного часа. Декантировали надосадочную жидкость и промывали твердые вещества гексаном (500 мл). Растворяли твердые вещества в ДХМ (300 мл) и медленно добавляли гексаны (2 л). Собирали полученные твердые вещества путем вакуумного фильтрования и сушили с получением 150 г титульного соединения (65%). МС (m/z): 393 (М+1).

Способ синтеза 2.

Охлаждали смесь гидрохлорида 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4она (10 г, 32 ммоль) и йодида тетрабутиламмония (1,17 г, 3,16 ммоль) в N-метилпирролидоне (211 мл) до 0°С на бане с ледяной водой. По частям добавляли гидрид натрия (60 мас.% в минеральном масле, 5,06 г, 126,5 ммоль). Перемешивали смесь при 0°С в течение 10 мин и затем добавляли гидробромид 4-(2бромэтил)морфолина (13,9 г, 50,6 ммоль). Удаляли ледяную баню и перемешивали смесь в течение четырех часов. Реакцию гасили насыщенным водным хлоридом аммония и разбавляли смесь водой (1 л). Экстрагировали смесь изопропилацетатом (4х 700 мл). Сушили объединенные органические экстракты над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении.

- 13 031659

Добавляли 20% EtOAc в гексане и перемешивали смесь в течение одного часа. Собирали твердое вещество путем вакуумного фильтрования и сушили с получением 8,6 г титульного соединения (69%). МС (m/z): 393 (М+1).

Способ синтеза 3.

Раствор 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она (500 мг, 1,4 ммоль) в ДМФ (14 мл) обрабатывали гидридом натрия (60 мас.% в минеральном масле, 129 мг, 3,2 ммоль). Перемешивали смесь в течение 10 мин и затем добавляли гидрохлорид 4-(2-бромэтил)морфолина (412 мг, 1,8 ммоль). Перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Охлаждали смесь до 0°С и добавляли гидрохлорид 4-(2-бромэтил)морфолина (165 мг, 0,7 ммоль), затем гидрид натрия (60 мас.% в минеральном масле, 14 мг, 0,4 ммоль). Удаляли ледяную баню и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли гидрид натрия (60 мас.% в минеральном масле, 14 мг, 0,4 ммоль) и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение пяти часов. Разбавляли смесь водой и экстрагировали EtOAc. Промывали органические экстракты 5% водным хлоридом лития. Концентрировали органический раствор при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-10% смесями МеОН в ДХМ, с получением 524 мг титульного соединения (93%). МС (m/z): 393 (М+1).

Пример получения 25. 5-[2-[трет-Бутил(диметил)силил]оксиэтил]-6,6-диметил-2-[2-[(2-метилпиразол-3-ил)амино]пиримидин-4-ил]тиено[2,3-с]пиррол-4-он

Дегазировали смесь 5-[2-[трет-бутил(диметил)силил]оксиэтил]-2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6диметилтиено[2,3-с]пиррол-4-она (6 г, 13,7 ммоль), 2-метилпиразол-3-амина (1,60 г, 16,4 ммоль), карбоната цезия (8,92 г, 27,4 ммоль), 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (790 мг, 1,37 ммоль) и 1,4-диоксана (150 мл) азотом в течение 10 мин. Добавляли ацетат палладия (II) (610 мг, 2,74 ммоль) и грели смесь при 90°С в течение 2,5 ч. Охлаждали смесь до комнатной температуры и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. Разбавляли реакционную смесь 10% МеОН в ДХМ и перемешивали смесь в течение 15 мин. Фильтровали смесь через CELITE® и промывали твердые вещества 10% МеОН в ДХМ. Концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 60-100% смесями EtOAc в ДХМ, с получением 5,73 г титульного соединения (84%). МС (m/z): 499 (М+1).

Пример получения 26. 2-Бром-5-(2-гидроксиэтил)-6,6-диметилтиено[2,3-с]пиррол-4-он

2-Бром-5-[2-[трет-бутил(диметил)силил]оксиэтил]-6,6-диметилтиено[2,3-с]пиррол-4-он (26 г, 64 ммоль) в ТГФ (40 мл) обрабатывали уксусной кислотой (120 мл) и водой (40 мл). Перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. Концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Разбавляли остаток EtOAc и промывали полученный раствор насыщенным водным бикарбонатом натрия, затем насыщенным NaCl. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат с получением 18,97 г титульного соединения (100%). МС (m/z): 290/292 (М+1/М+3).

Следующее соединение получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере получения 26

Пр. пол.	Название соединения	Структура	Комм.	МС. (m/z):
27	5-(2-гидроксиэтил)-6,6диметил-2-[2-[(2метилпиразол-3ил)амино] пиримидин-4ил ] тиено [2,3 -с] пиррол-4-он	О /—N HN Ш Μ	Исп. 4н. HCl в диоксане	385 (М+1)

Пример получения 28. 2-(2-Бром-6,6-диметил-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-5-ил)этил-метансульфонат

- 14 031659

Охлаждали раствор 2-бром-5-(2-гидроксиэтил)-6,6-диметилтиено[2,3-с]пиррол-4-она (18,97 г, 65,4 ммоль) в ДХМ (300 мл) до 0°С. Обрабатывали смесь триэтиламином (13,7 мл, 98,1 ммоль) и метансульфонилхлоридом (8,24 г, 71,9 ммоль). Перемешивали смесь при 0°С в течение двух часов. Промывали раствор водой и насыщенным NaCl. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя EtOAc, с получением 23,8 г титульного соединения (99%). МС (m/z): 368/370 (М+1/М+3).

Следующее соединение получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере получения 28

Пр. пол.	Название соединения	Структура	МС (m/z):
29	2- [6,6-диметил-2- [2- [(2метилпиразол-3-ил)амино]пиримидин-4-ил]-4-оксотиено[2,3с]пиррол-5-ил]этил-метансульфонат	N/=% О О . v А-ХгА 'sz нКм и о —N J	463 (М+1)

Пример получения 30. 3-Этил-4-нитро-1Н-пиразол

Растворяли 3-этил-Ш-пиразол (1 г, 10,4 ммоль) в серной кислоте (5 мл) и охлаждали смесь до -5°С. Затем в смесь по частям добавляли нитрат калия (1,16 г, 11,4 ммоль). Перемешивали смесь в течение ночи, оставляя медленно нагреваться до комнатной температуры. Охлаждали смесь до 0°С и медленно гасили реакцию гидроксидом аммония до достижения рН примерно 10. Собирали полученное твердое вещество путем вакуумного фильтрования и промывали небольшим количеством воды. Охлаждали фильтрат до 0°С и затем собирали твердое вещество из фильтрата путем вакуумного фильтрования и промывали небольшим количеством воды. Объединяли твердые вещества и растворяли в ДХМ. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Выпаривали один раз совместно с диэтиловым эфиром с получением 1,34 г титульного соединения (91%). МС (m/z): 140 (М-1).

Пример получения 31. трет-Бутил-3-метокси-4-нитропиразол-1-карбоксилат

Суспензию 5-метокси-4-нитро-Ш-пиразола (3 г, 21 ммоль), ди-трет-бутилдикарбоната (6,9 г, 31,6 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (1,28 г, 10,5 ммоль) в ДХМ (300 мл) обрабатывали триэтиламином (5,85 мл, 42 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. Концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 1-10% смесями EtOAc в гексане, с получением 3,48 г титульного соединения (68%). ¹H ЯМР (399,8 МГц, ДМСО-ф) δ 9,10 (s, 1H), 3,98 (s, 3H), 1,56 (s, 9H).

Пример получения 32. 3-Этил-Ш-пиразол-4-амин

Суспензию палладия (5 мас.% на углеродной подложке, 450 мг, 0,21 ммоль) в EtOH (21 мл) обрабатывали 3-этил-4-нитро-1H-пиразолом (300 мг, 2,13 ммоль). Перемешивали полученную смесь в атмосфере водорода в течение 6,5 ч. Фильтровали реакционную смесь через CELITE® и дополнительно промывали твердые вещества EtOH. Концентрировали фильтрат при пониженном давлении с получением 240 мг титульного соединения (99%). ¹H ЯМР (400,1 МГц, CD₃CN) δ 7,02 (s, 1H), 2,54 (q, J=7 Гц, 3H), 1,17 (t, J=7 Гц, 9Н).

Следующее соединение получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере получения 32

- 15 031659

Пр. пол.	Название соединения	Структура	МС (m/z):
33	/и/х?/??-бутил-4-амино-3- метоксипиразол-1 -карбоксилат	Η,Ν О O>N \	214 (М+1)

Пример получения 34. трет-Еутил-П-(2-циклопропилпиразол-3-ил)карбамат

Охлаждали раствор 2-циклопропилпиразол-3-карбоновой кислоты (4 г, 26 ммоль) в ТГФ (35 мл) до 0°С и добавляли триэтиламин (5,5 мл, 39 ммоль), а затем азид дифенилфосфоновой кислоты (8,5 мл, 39 ммоль). Перемешивали смесь в течение четырех часов, при этом медленно нагревали реакционную смесь до комнатной температуры. Добавляли трет-бутиловый спирт (4,99 мл) и грели смесь при 70°С в течение 18 ч. Концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-20% смесями МеОН в ДХМ, с получением 5,39 г титульного соединения (92%). МС (m/z): 224 (М+1).

Пример получения 35. 2-Циклопропилпиразол-3-амин

Раствор трет-бутил-Х-(2-циклопропилпиразол-3-ил)карбамата (5,39 г, 24 ммоль) в ДХМ (12 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (16 мл, 213 ммоль). Перемешивали раствор при комнатной температуре в течение одного часа. Концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Растворяли остаток в ДХМ и обрабатывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия до достижения устойчивого рН водной фазы >7. Разделяли фазы и сушили органическую фазу над безводным сульфатом натрия. Фильтровали смесь и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Концентрировали водную фазу при пониженном давлении. Объединяли остатки органической и водной фаз и очищали путем обращенно-фазовой колоночной хроматографии (колонка: 130 г С18; подвижная фаза: А) вода, В) ACN; градиент: 0-20% В). Концентрировали фракции и растворяли остаток в 25% МеОН в ДХМ. Фильтровали смесь и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Растворяли остаток в

EtOAc и добавляли воду. Разделяли слои и повторно экстрагировали водный слой EtOAc (8х 100 мл). Концентрировали объединенный органический экстракт при пониженном давлении с получением 2,27 г титульного соединения (76%). ¹Н ЯМР (400,1 МГц, CD3CN) δ 7,02 (d, J=2 Гц, 1H), 5,33 (d, J=2 Гц, 1H), 4,28 (шир.э, 2H), 3,10 (m, 1H), 0,96 (m, 4H).

Пример получения 36. 2-(Дибензиламино)этанол

Смесь 2-(бензиламино)этанола (0,95 мл, 6,6 ммоль) в ACN (35 мл) обрабатывали карбонатом калия (1,83 г, 13,2 ммоль), затем бензилбромидом (1,18 мл, 9,89 ммоль). Грели реакционную смесь при 80°С в течение 1,5 ч. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и фильтровали смесь. Концентрировали фильтрат при пониженном давлении и очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-30% смесями EtOAc в гексане, с получением 1,7 г титульного соединения (100%). МС (m/z): 242 (М+1).

Пример получения 37. 2-[2-(Дибензиламино)этокси]-2,2-дифторуксусная кислота

Раствор 2-(дибензиламино)этанола (1,5 г, 6,2 ммоль) и натриевой соли хлор-2,2-дифторуксусной кислоты (950 мг, 6,19 ммоль) в ТГФ (12 мл) при 0°С обрабатывали гидридом натрия (60 мас.% в минеральном масле, 500 мг, 12,5 ммоль). Нагревали реакционную смесь до температуры обратной конденсации в течение ночи. В реакционную смесь добавляли дополнительное количество гидрида натрия (60 мас.% в минеральном масле, 120 мг, 3 ммоль) и продолжали нагревать в течение еще одного часа. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и разбавляли водой. Экстрагировали смесь диэти

- 16 031659 ловым эфиром. Разделяли слои и доводили рН водного слоя до 6 при помощи 6н. хлороводородной кислоты. Экстрагировали водный раствор EtOAc. Объединяли все органические растворы и сушили над безводным сульфатом натрия. Фильтровали смесь и концентрировали фильтрат при пониженном давлении с получением 1,03 г титульного соединения (49%). МС (m/z): 336 (М+1).

Пример получения 38. Метил-2-[2-(дибензиламино)этокси]-2,2-дифторацетат о

Раствор 2-[2-(дибензиламино)этокси]-2,2-дифторуксусной кислоты (100 мг, 0,298 ммоль) в толуоле (9 мл) и МеОН (2 мл) обрабатывали, добавляя по каплям (триметилсилил)диазометан (2М в гексане, 0,16 мл, 0,32 ммоль). Перемешивали смесь в течение 15 мин при комнатной температуре. Реакцию гасили уксусной кислотой (0,1 мл) и концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении с получением 102 мг титульного соединения (98%). МС (m/z): 350 (М+1).

Пример получения 39. 4-Бензил-2,2-дифторморфолин-3-он

Суспензию палладия (10% на углеродной подложке, 50 мг, 0,141 ммоль) в EtOH (15 мл) обрабатывали метил-2-[2-(дибензиламино)этокси]-2,2-дифторацетатом (485 мг, 1,39 ммоль) в EtOH (15 мл). Перемешивали реакционную смесь в атмосфере водорода (баллон) при комнатной температуре в течение ночи. Фильтровали реакционную смесь через CELITE® и концентрировали фильтрат при пониженном давлении с получением 294 мг титульного соединения (93%). МС (m/z): 228 (М+1).

Пример получения 40. 4-Бензил-2,2-дифторморфолин

F

Раствор 4-бензил-2,2-дифторморфолин-3-она (290 мг, 1,28 ммоль) в ТГФ (13 мл) обрабатывали комплексом диметилсульфида бора (2М в ТГФ, 3,06 мл, 6,12 ммоль). Грели реакционную смесь при 55°С в течение 3,5 ч и затем удаляли нагревание и продолжали перемешивать в течение ночи. Нагревали реакционную смесь до 55°С в течение еще двух часов. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и гасили реакцию, добавляя по каплям хлороводородную кислоту (6н., 3,06 мл, 18,4 ммоль). Грели реакционную смесь при 100°С в течение одного часа. Охлаждали смесь до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Разбавляли смесь водой и доводили рН до 12 при помощи 2н. гидроксида натрия. Экстрагировали смесь EtOAc. Сушили органические экстракты над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении с получением 120 мг титульного соединения (44%). МС (m/z): 214 (М+1).

Пример получения 41. 2-Бром-6,6-диметил-5-[2-(5-окса-8-азаспиро[2.6]нонан-8-ил)этил]тиено[2,3с]пиррол-4-он

Грели смесь 2-(2-бром-6,6-диметил-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-5-ил)этилметансульфоната (2,76 г, 6,9 ммоль) и 5-окса-8-азаспиро[2.6]нонана (2,18 г, 16,3 ммоль) в ДМФ (33 мл) при 80°С в течение ночи. Охлаждали смесь до комнатной температуры и разбавляли EtOAc. Промывали органический раствор насыщенным NaCl (3х 30 мл). Сушили органический раствор над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем обращенно-фазовой колоночной хроматографии (колонка: 100 г Gold С18; подвижная фаза: А) 0,1% муравьиной кислоты в воде, В) 0,1% муравьиной кислоты в ACN; градиент: 5% В в течение 5 мин, 5-50% В в течение 20 мин; расход: 53 мл/мин) с получением 3,6 г титульного соединения (85%). МС (m/z): 399/401 (М+1/М+3).

Пример получения 42. трет-Бутил-4-[[4-[6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-2-ил]-5-метилпиримидин-2-ил]амино]-3-метоксипиразол-1-карбоксилат

- 17 031659

Дегазировали смесь 2-(2-хлор-5-метилпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)тиено[2,3-с]пиррол-4-она (250 мг, 0,61 ммоль), трет-бутил-4-амино-3-метоксипиразол-1-карбоксилата (157 мг, 0,74 ммоль), карбоната цезия (300 мг, 0,92 ммоль), 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (71 мг, 0,12 ммоль) и 1,4-диоксана (6,4 мл) азотом в течение 15 мин. Добавляли ацетат палладия (II) (14 мг, 0,0614 ммоль) и грели смесь при 110°С в течение ночи. Охлаждали смесь до комнатной температуры и разбавляли EtOAc. Промывали органический раствор насыщенным NaCl. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем ВЭЖХ на колонке С18 (колонка: 150 г; подвижная фаза: А) 0,10% муравьиной кислоты в воде, В) 0,10% муравьиной кислоты в ACN; градиент: 10-50% В; расход: 60 мл/мин) с получением 101 мг титульного соединения (28%). МС (m/z): 584 (М+1).

Следующие соединения получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере получения 42

Пр. пол.	Название соединения	Структура	Комм.	МС (m/z):
43	7/?с7И-бутил-4-||4-|6.6диметил-5-(2морфолиноэтил)-4оксотиено [2,3-с] пиррол-2ил] пиримидин-2-ил] амино] -3 метоксипиразол-1 карбоксилат	0 /—\ N 1 О'-'х· N. -О ° N т.	Кат.: трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0)	570 (М+1)
44	7/?с7И-бутил-4-||4-|6.6диметил-5-(2морфолиноэтил)-4оксотиено [2,3-с] пиррол-2-ил] 5 -фторпиримидин-2 ил] амино] -3 - метоксипиразол 1-карбоксилат	F 0 /—\ /=/ __/° An S'70. HN / ζ οΛα° τ		588 (М+1)
45	7/?е/и-бутил-5 -цикл опропил-4[[4-[6,6-диметил-5-(2морфолиноэтил)-4оксотиено [2,3-с] пиррол-2ил] пиримидин-2ил] амино] пиразол-1 карбоксилат	0 /—\ Λ ο+ο X		580 (М+1)

Пример 1. 6,6-Диметил-2-{2-[(1-метил-1П-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4ил)этил] -5,6-дигидро-4Н-тиено [2,3-с] пиррол-4-он

Способ синтеза 1.

В суспензию гидрида натрия (60 мас.% в минеральном масле, 30 г, 750 ммоль) в N-метилпирролидоне (500 мл) медленно добавляли 2-метилпиразол-3-амин (75 г, 772 ммоль). Перемешивали полученную смесь в течение 90 мин. Добавляли раствор 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2морфолиноэтил)тиено[2,3-с]пиррол-4-она (145 г, 369 ммоль) в N-метилпирролидоне (200 мл). Охлаждали нагретую реакционную смесь до комнатной температуры и выливали реакционную смесь в воду (3 л). Доводили рН до ~3 при помощи концентрированной хлороводородной кислоты (200 мл). Экстрагировали смесь ДХМ (4x2 л). Нейтрализовали водный слой при помощи 5М гидроксида натрия. Экстрагировали водный раствор ДХМ (2x2 л). Объединяли полученные органические экстракты и промывали водой (2 л). Сушили органические слои над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток на небольшой колонке с силикагелем (2 кг), элюируя последовательно ДХМ (2 л), 2,5% EtOH в ДХМ (2 л), 5% EtOH в ДХМ (2 л), 7,5% EtOH в ДХМ (2 л) и,

- 18 031659 наконец, 10% EtOH в ДХМ (10 л). Концентрировали соответствующие фракции при пониженном давлении. Добавляли EtOAc (1 л) и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли EtOAc (1 л) и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли EtOAc (500 мл) и гексан (500 мл). Собирали твердое вещество путем вакуумного фильтрования и промывали твердое вещество гексаном (500 мл). Сушили твердое вещество в вакууме при 50°С с получением 65,7 г титульного соединения (39%). МС (m/z): 454 (М+1).

Способ синтеза 2.

Дегазировали смесь 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)-тиено[2,3-с]пиррол-4-она (20,8 г, 52,9 ммоль), 2-метилпиразол-3-амина (5,7 г, 58,2 ммоль), карбоната цезия (37,9 г, 116,5 ммоль), 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (2,6 г, 4,5 ммоль) и 1,4-диоксана (529 мл) азотом в течение 10 мин. Добавляли трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0) (2,4 г, 2,6 ммоль) и нагревали смесь до 85°С в течение четырех часов. Охлаждали смесь до комнатной температуры и фильтровали смесь через бумажный фильтр. Концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Повторно проводили взаимодействие с использованием 8 г 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)тиено[2,3-с]пиррол-4-она и объединяли два остатка. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле (330 г), элюируя с градиентом 5-25% смесями МеОН в (10% EtOAc в ДХМ). Объединяли фракции и концентрировали при пониженном давлении. Повторно очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле (330 г), элюируя с градиентом 5-25% смесями МеОН в 10% EtOAc в DCM. Объединяли фракции и концентрировали при пониженном давлении. Растворяли остаток в ДХМ (400 мл) и затем добавляли ацетон (1 л). Медленно концентрировали смесь при пониженном давлении примерно до 700 мл. Собирали твердое вещество путем вакуумного фильтрования с получением 14,8 г титульного соединения (48%). МС (m/z): 454 (М+1).

Способ синтеза 3.

Дегазировали смесь 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)-тиено[2,3с]пиррол-4-она (250 мг, 0,64 ммоль), 2-метилпиразол-3-амина (124 мг, 1,3 ммоль), карбоната цезия (622 мг, 1,9 ммоль), 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (55 мг, 0,095 ммоль) и 1,4-диоксана (6,4 мл) азотом в течение 15 мин. Добавляли ацетат палладия (II) (14,3 мг, 0,0636 ммоль) и грели смесь при 90°С в течение ночи. Охлаждали смесь до комнатной температуры и фильтровали смесь через бумажный фильтр. Промывали твердые вещества 10% МеОН в ДХМ. Концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Повторно проводили взаимодействие и объединяли два остатка. Очищали остаток путем ВЭЖХ на колонке С18 (30 х 75 мм, 5 мкм, Xbridge ODB), элюируя с расходом 85 мл/мин и градиентом 928% смесями ACN в 10 мМ карбонате аммония (рН 10) в воде. Объединяли фракции и концентрировали при пониженном давлении для удаления ACN. Лиофилизировали водный раствор с получением 100 мг титульного соединения (18%). МС (m/z): 454 (М+1).

Следующие соединения получали, по существу, при помощи способа синтеза 3, описанного в примере 1

Пр.		Химическое название	Структура	Физ. данные MC (m/z):
2		6,6-диметил-2-{5-метил-2-[(1-метил1Н-пиразол-5 -ил)амино] пиримидин4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он	/ 0 /—ч /=\ /'У! 0 n /—N HN /	468 (M+l)
3		4- [(4- {6,6-диметил-5-[2-(морфолин-4ил)этил]-4-оксо-5,6-дигидро-4Нтиено [2,3 -с] пиррол-2-ил} пиримидин2-ил)амино] -1 -метил-1 Н-пиразол-3 -	O /__4 /=\ о n /)— iT f HN /	479 (M+l)

- 19 031659

		карбонитрил
4		6,6-диметил-2- {2- [(1 -метил-1Нпиразол-5 -ил)амино] пиримидин-4ил}-5-[2-(5-окса-8-азаспиро[2.6]нон8-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3с] пиррол-4-он	Р Д ^_N HN ' rr	494 (M+l)
5		2'-{2-[(1-метил-1Н-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил}-5'-[2(морфолин-4-ил)этил] спиро[циклопропан-1,6'-тиено [2,3 с] пиррол] -4'(5 'Н)-он	0 __ У-n HN N^	452 (M+l)
6		6,6-диметил-2- {2- [(1 -метил-1Нпиразол-5-ил)амино]-5(трифтор метил )пиримидин-4-ил}-5[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он	F F-4—F о z__ /=\ г~п ° N />—f T N—' /—N StC HN	522 (M+l)
7		2- {2-[(3-метокси-1 -метил-1Нпиразол-4-ил)амино]-5метилпиримидин-4-ил}-6,6-диметил5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он	/ ° !---\ Z=\ Г~^ 0 N. Я 1 y-N HN / у N	498 (M+l)
8		2-{2-[(2,3-диметилпиридин-4ил)амино]пиримидин-4-ил} -6,6диметил-5 - [2-(морфолин-4-ил)этил] 5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол4-он	0 __ \ /НТм vj y-N HN A	479 (M+l)
9		6,6-диметил-2- {2- [(1 -метил-1Нпиразол-4-ил)амино] пиримидин-4ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он	0 /—\ /=\ Z-^хЛ 0 \\ T y-N HN I ъ 4 ,N. N \	454 (M+l)
10		2- {2-[(4-фтор-2-метилфенил)-амино] - 5 -метилпиримидин-4-ил} -6,6диметил-5 - [2-(морфолин-4-ил)этил] 5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол4-он	/ 0 /—\ /=\ /хД 0 \ T ,N^ y-N s'^70 HN / F	496 (M+l)

- 20 031659

11		6,6-диметил-2-[5-метил-2- (пиримидин-4-иламино)пиримидин- 4-ил]-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он	/=/ /—/ А А 00 An s-Αφ HN ' YA x—N	466 (M+l)
12		2-{2-[(2,3-диметилпиридин-4ил)амино] -5 -метилпиримидин-4-ил } 6,6-диметил-5-[2-(морфолин-4ил )этил] -5,6-диги дро-4Н-тиено [2,3с] пиррол-4-он	/ 0 /—\ ___( JI у—ы о AlA An sAq HN ‘ Y	493 (M+l)
13		4- [(4- {6,6-диметил-5-[2-(морфолин-4ил)этил]-4-оксо-5,6-дигидро-4Нтиено [2,3 -с] пиррол-2-ил} пиримидин2-ил)амино]-пиридин-3-карбонитрил	0 /—\ /=\ 0 aAX A An s+K HN /	476 (M+l)
14		2-{5-хлор-2-[(1-метил-1Н-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил} -6,6диметил-5 - [2-(морфолин-4-ил)этил] 5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3 -с] пиррол4-он	ci о /—у , / JI /—ti о An sA/ HN ' NX	488 (M+l)
15		2-{5-фтор-2-[(1-метил-1Н-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил} -6,6диметил-5 - [2-(морфолин-4-ил)этил] 5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3 -с] пиррол4-он	F 0 z--- νΓαΧΧ;ν^~ HN /	472 (M+l)
16		4- [(4- {6,6-диметил-5 -[2-(морфолин-4ил)этил]-4-оксо-5,6-дигидро-4Нтиено[2,3-с]пиррол-2-ил}-5фторпиримидин-2-ил)амино] -1 метил- 1Н-пиразол-3 -карбонитрил	F 0 /---4 чСаАПан anA 0N S'XY HN / Jh n^Vx	497 (M+l)
17*		2-{2-[(1,3-диметил-1Н-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил} -6,6диметил-5 - [2-(морфолин-4-ил)этил] 5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3 -с] пиррол4-он	° /—\ z=\ __/° An s-AZ HN / ’nA	468 (M+l)
18		2-{2-[(2,4-дифторфенил)-амино]-5метилпиримидин-4-ил}-6,6-диметил5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он	0 {KJAv /—N S HN F	500 (M+l)
19		2-{2-[(2,4-дифторфенил)амино]пиримидин-4-ил}-6,6-диметил-5-[2(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он	0 /=ч Ф «AlAv An s HN F	486 (M+l)

*: В качестве лиганда применяли метансульфонат [(4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен)2-(2'-амино-1,1 '-бифенил)]палладия(П).

Пример 20. 4-[(4-{6,6-Диметил-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-4-оксо-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-2-ил}пиримидин-2-ил)амино]-1H-пиразол-5-карбонитрил

Грели раствор 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)-тиено[2,3-с]пиррол-4она (350 мг, 0,89 ммоль), 4-амино-1H-пиразол-5-карбонитрила (116 мг, 1,07 ммоль), карбоната калия (320 мг, 2,32 ммоль), 2-(ди-трет-бутилфосфино)-2',4',6'-триизопропил-3,6-диметокси-1,1'-бифенила (87 мг, 0,18 ммоль), трет-бутилового спирта (2,3 мл) и уксусной кислоты (одна капля) при 90°С в течение двух

- 21 031659 часов. Охлаждали смесь до комнатной температуры. Разбавляли смесь 10% МеОН в ДХМ и фильтровали раствор через колонку с CELITE®, в верхнюю часть которой помещали небольшое количество силикагеля. Промывали колонку 10% МеОН в ДХМ и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем обращенно-фазовой колоночной хроматографии (колонка: С18, 275 г Gold; подвижная фаза: А) 10 мМ бикарбонат аммония в воде с 5% МеОН, В) ACN; градиент: 10% В в течение 5 мин, градиент до 40% В в течение 25 мин; расход: 125 мл/мин) с получением 240 мг титульного соединения (58%). МС (m/z): 465 (М+1).

Следующее соединение получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере 20

Пр.		Химическое название	Структура	Физич. данные
				МС (m/z):
21		6,6-диметил-5-[2(морфолин-4-ил)этил] -2[2-(1Н-1,2,3-триазол-5иламино)-пиримидин-4ил]-5,6-дигидро-4Нтиено[2,3-с]пиррол-4-он	s 0	441 (М+1)

Пример 22. 6,6-Диметил-2-{2-[(5-метил-1H-пиразол-4-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он

Смесь 2-(2-хлорпиримидин-4-ил)-6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)тиено[2,3-с]пиррол-4-она (230 мг, 0,59 ммоль), 3-метил-1И-пиразол-4-амина (142 мг, 0,73 ммоль), хлор[2-(ди-трет-бутилфосфино)2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил][2-(2-аминоэтил)-фенил)]палладия (II) (8 мг, 0,012 ммоль), 2-ди-третбутилфосфино-2',4',6'-триизопропилбифенила (5 мг, 0,012 ммоль) и трет-бутоксида натрия (118 мг, 1,2 ммоль) трижды продували азотом. Добавляли трет-бутиловый спирт (2 мл), закрывали реакционную смесь и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Реакционную смесь обрабатывали EtOAc и перемешивали смесь в течение ночи. Концентрировали при пониженном давлении. Растворяли остаток в EtOAc и промывали органический раствор насыщенным водным хлоридом аммония. Водный слой дважды повторно экстрагировали EtOAc. Сушили объединенные органические экстракты над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-10% смесями МеОН в ДХМ, с получением 164 мг титульного соединения (62%). МС (m/z): 454 (М+1).

Следующие соединения получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере 22

Пр.		Химическое название	Структура	Физ. данные MC (m/z):
23		2-{2-[(1-циклопропил-1Н-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил} -6,6диметил-5 -[2-(морфолин-4-ил)этил] 5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол4-он	0 /—к /=\ /—чФ 0 N У- N S7\ HN !	480 (М+1)
24		2-{2-[(5-этил-1Н-пиразол-4ил)амино]пиримидин-4-ил} -6,6диметил-5 -[2-(морфолин-4-ил)этил] 5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол4-он	0 /—\ /=\ r~N 0 y-м s7^ HN I )=\ О	468 (М+1)

Пример 25. 6,6-Диметил-2-{2-[(1-метил-1H-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(тиоморфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он

- 22 031659

Грели смесь 2-[6,6-диметил-2-[2-[(2-метилпиразол-3-ил)амино]пиримидин-4-ил]-4-оксотиено[2,3с]пиррол-5-ил]этил-метансульфоната (260 мг, 0,56 ммоль), тиоморфолина (116 мг, 1,12 ммоль) и триэтиламина (0,18 мл, 0,38 ммоль) в ACN (2 мл) при 60°С в течение ночи. Охлаждали смесь до комнатной температуры и фильтровали раствор через CELITE®. Промывали твердые вещества 10% МеОН в ДХМ и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем обращенно-фазовой колоночной хроматографии (колонка: С18, 275 г Gold; подвижная фаза: А) 10 мМ аммиак в 5% МеОН в воде, В) ACN; градиент: 10% В в течение 5 мин, 10-65% В в течение 25 мин; расход: 200 мл/мин) с получением 170 мг титульного соединения (64%). МС (m/z): 470 (М+1).

Следующие соединения получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере 25

Пр.		Химическое название	Структура	Физ. данные МС (m/z):
		6,6-диметил-2- {2-[(1 -метил-			0	F
		1 Н-пиразол-5-ил)амино] -	/=\	s—		^-N 0
26		пирими ДИН-4-ИЛ } -5 - [2-	N V- А HN	N —	^F	526
	(2,2,6,6-тетрафторморфолин-				(M+l)
		4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-	А
		тиено[2,3-с]пиррол-4-он	-—N J Г'Г
		6,6-диметил-2- {2-[(1 -метил-			0	A
		1 Н-пиразол-5-ил)амино] -	N У-		N —	__ 0
27		пиримидин-4-ил } -5-[2-(1,4-	А				468
	оксазепан-4-ил )этил]-5,6-	HN				(M+l)
		дигидро-4Н-тиено[2,3-
		с] пиррол-4-он	^-N J N
		6,6-диметил-2- {2-[(1 -метил-			0	A1
		1 Н-пиразол-5-ил)амино] -	А		/
28		пиримидин-4-ил} -5-[2-(8-	)—n				480
	окса-3 -азабицикло [3.2.1 ] окт-3 -	HN				(M+l)
		ил)этил] -5,6-дигидро-4Н-	_N А
		тиено[2,3-с]пиррол-4-он
		5-[2-(3,3-дифторпирролидин- 1 -ил)этил] -6,6-диметил-2- {2-	N У-		0 N^
29		[(1-метил-1Н-пиразол-5-	А			F	474
	ил)амино] пиримидин-4-ил} - 5,6-д игидро-4Н-тиено [2,3-	HN А 3 N^				(M+l)
		с] пиррол-4-он
		6,6-диметил-2- {2-[(1 -метил-			0	.—|\/
		1 Н-пиразол-5-ил)амино] -	N У- A	00	N —
30		пиримидин-4-ил}-5-[2-(2-			466
	окса-5-азабицикло [4.1.0] гепт-	HN				(M+l)
		5-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-	Л J N
		тиено[2,3-с]пиррол-4-он
		6,6-диметил-5-{2-[(ЗК)-3- метилморфолин-4-ил]этил} -2-			0	хиральный
31		{2-[(1-метил-1Н-пиразол-5- ил)амино] пиримидин-4-ил} -	N / A HN	s-	1 N—	/—N_®	468 (M+l)
		5,6-д игидро-4Н-тиено [2,3-
		с] пиррол-4-он	A hr

Пример 32. 5-[2-(2,2-Дифторморфолин-4-ил)этил]-6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-Ш-пиразол-5- 23 031659 ил)амино]пиримидин-4-ил}-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он

Суспензию гидроксида палладия (20% на углеродной подложке, 63 мг, 0,09 ммоль) в EtOAc (5 мл) обрабатывали 4-бензил-2,2-дифторморфолином (95 мг, 0,45 ммоль) в EtOAc (5 мл). Перемешивали реакционную смесь в атмосфере водорода (баллон) при комнатной температуре в течение пяти часов. Фильт ровали реакционную смесь через CELITE® и выделяли фильтрат. К фильтрату добавляли триэтиламин (0,11 мл, 0,79 ммоль) и 2-[6,6-диметил-2-[2-[(2-метилпиразол-3-ил)амино]пиримидин-4-ил]-4оксотиено[2,3-с]пиррол-5-ил]этил-метансульфонат (306 мг, 0,66 ммоль). Грели смесь при 80°С в течение одного часа. Добавляли ACN (15 мл) и грели смесь при 80°С в течение двух дней. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 0-10% смесями МеОН в EtOAc. Концентрировали фракции при пониженном давлении. Повторно очищали остаток путем колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 50-100% смесями EtOAc в гексане, затем второй раз с градиентом 0-10% смесями МеОН в EtOAc, с получением 47 мг титульного соединения (30%). МС (m/z): 490 (М+1).

Пример 33. 5-[2-(6,6-Дифтор-1,4-оксазепан-4-ил)этил]-6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1H-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил}-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он

Гидрохлорид 6,6-дифтор-1,4-оксазепана (200 мг, 0,15 ммоль) обрабатывали карбонатной смолой (3 мольных эквивалента) в ДХМ (5 мл). Перемешивали суспензию смолы в течение одного часа. Удаляли твердые вещества путем фильтрования и обрабатывали фильтрат п-толуолсульфокислотой (250 мг, 1,45 ммоль). Перемешивали полученную смесь в течение двух часов и затем концентрировали смесь при пониженном давлении. Добавляли ACN (2 мл) и 2-[6,6-диметил-2-[2-[(2-метилпиразол-3-ил)амино]пиримидин-4-ил]-4-оксотиено[2,3-с]пиррол-5-ил]этил-метансульфонат (200 мг, 0,43 ммоль). Обрабатывали полученный раствор триэтиламином (0,15 мл, 1,08 ммоль). Закрывали реакционный сосуд и грели смесь при 80°С в течение трех часов. Охлаждали до комнатной температуры и концентрировали реакционную смесь. Очищали остаток путем обращенно-фазовой колоночной хроматографии (колонка: 50 г С-18; подвижная фаза: А) 0,1% ТФУ в воде, В) 0,1% ТФУ в ACN; градиент 10-80% В). Концентрировали фракции, содержащие продукт. Растворяли остаток в ДХМ и промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Сушили органический раствор над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Очищали остаток путем обращенно-фазовой колоночной хроматографии (колонка: 15 г Gold С-18; подвижная фаза: А) 10 мМ карбонат аммония в воде с 10% МеОН, В) ACN; градиент 10-80% В) с получением 16 мг титульного соединения (7%). МС (m/z): 504 (М+1).

Пример 34. 5-{2-[Циклопропил(метил)амино]этил}-6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1H-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил}-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он

Грели раствор 2-[6,6-диметил-2-[2-[(2-метилпиразол-3-ил)амино]пиримидин-4-ил]-4-оксотиено[2,3с]пиррол-5-ил]этил-метансульфоната (70 мг, 0,16 ммоль) и N-метилциклопропанамина (77 мг, 1,08 ммоль) в ДМФ (1,7 мл) при 90°С в течение ночи. Охлаждали смесь до комнатной температуры. Очищали раствор путем обращенно-фазовой колоночной хроматографии (колонка: 100 г Gold C-18; подвижная фаза: А) 0,1% муравьиной кислоты в воде, В) 0,1% муравьиной кислоты в ACN; градиент: 5% В в течение 5 мин, градиент до 65% В в течение 25 мин; расход: 60 мл/мин) с получением 70 мг титульного со- 24 031659 единения (37%). МС (m/z): 438 (М+1).

Следующее соединение получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере 34

Пр.		Химическое название	Структура	Физ. данные МС (m/z):
35		6,6-диметил-2- {2-[( 1 -метил-1Нпиразол-5-ил)амино1-пиримидин4-ил}-5-[2-(7-окса-4азаспиро [2.5] окт-4-ил)этил] -5,6дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4он		480 (М+1)

Пример 36. Гидрохлорид 2-{2-[(3-метокси-1H-пиразол-4-ил)амино]-5-метилпиримидин-4-ил}-6,6диметил-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она

Перемешивали раствор трет-бутил-4-[[4-[6,6-диметил-5-(2-морфолиноэтил)-4-оксотиено[2,3с]пиррол-2-ил]-5-метилпиримидин-2-ил]амино]-3-метоксипиразол-1-карбоксилата (101 мг, 0,173 ммоль) и хлороводорода (4,0М в 1,4-диоксане, 2 мл, 8 ммоль) в МеОН (20 мл) при комнатной температуре в течение 12 ч. Концентрировали смесь досуха с получением 80 мг титульного соединения (89%). МС (m/z): 484 (М+1).

Следующие соединения получали, по существу, при помощи способа, описанного в примере 36

Пр.		Химическое название	Структура	Физ. данные МС (m/z):
37*		2-{2-[(3-метокси-1Нпиразол-4-ил)амино]пиримидин-4-ил} -6,6диметил-5-[2-(морфолин-4ил)этил] -5,6-дигидро-4Нтиено[2,3 -с] пиррол-4-он	0 /—к ___ /^N 0 + %//+7 HN ' / N	470 (M+1)
38		гидрохлорид 2-{2-[(5циклопропил-1Н-пиразол4-ил)амино]пиримидин-4ил}-6,6-диметил-5-[2(морфолин-4-ил)этил] -5,6дигидро-4Н-тиено[2,3с]пиррол-4-она	0 /—\ y=x _V^N\__/° ^-N S^-Z HN / У H-Cl ϊΑΝΗ	480 (M+1)
39		гидрохлорид 2-{5-фтор-2[(3-метокси-1Н-пиразол-4ил )амино] пири мид ин-4ил}-6,6-диметил-5-[2(морфолин-4-ил)этил] -5,6дигидро-4Н-тиено[2,3с]пиррол-4-она	F ,° \n' s^-Z HN ! /=\ H-CI O-Zs NH / N	488 (M+1)

*: После взаимодействия получали свободное основание

Пример 40. Изомер 2 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1H-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-{2-[2окса-5-азабицикло[4.1.0]гепт-5-ил]этил}-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-она

6,6-Диметил-2-{2-[(1-метил-1H-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(2-окса-5-азабицикло

- 25 031659 [4.1.0]гепт-5-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он (пример 30) очищали путем хиральной колоночной хроматографии (колонка: Lux Cellulose-4 21,2x250 мм; подвижная фаза: 40% изопропиловый спирт (0,2% изопропиламина/CO2); время элюирования: 11 мин) с получением 24 мг титульного соединения (34%). МС (m/z): 466 (М+1).

Рентгеновская порошковая дифракция.

Дифрактограммы XRD кристаллических твердых веществ получали на рентгеновском порошковом дифрактометре Bruker D4 Endeavor, оборудованном источником CuKa (λ = 1,54060 А) и детектором Vantec, эксплуатируемом при 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали в диапазоне от 4 до 40° 2Θ с шагом 0,009° 2Θ и скоростью сканирования 0,5 с/шаг, дивергенция составляла 0,6 мм, фиксирующая антирассеивающая щель 5,28, и щель детектора 9,5 мм. Сухой порошок помещали в кварцевый держатель образца, гладкую поверхность получали при помощи предметного стекла. Дифрактограммы кристаллической формы собирали при температуре и относительной влажности окружающей среды. В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительная интенсивность пиков дифракции может быть различной в зависимости от предпочтительной ориентации, определяемой такими факторами, как морфология и структура кристалла. При наличии эффектов предпочтительной ориентации интенсивность пиков изменяется, но характеристические положения пиков в полиморфе остаются неизменными. Кроме того, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы положения угловых пиков могут незначительно изменяться. Например, сдвиг положений пиков может быть вызван колебаниями температуры или влажности, при которых проводят анализ образца, смещением образца или наличием или отсутствием внутреннего стандарта. В настоящем случае погрешность положения пиков ± 0,2° 2Θ учитывает указанные возможные отклонения, не препятствуя однозначному определению указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы можно проводить на основании любой уникальной комбинации отличительных пиков (в ° 2Θ), как правило, наиболее выраженных пиков. Дифрактограммы кристаллической формы, собранные при температуре и относительной влажности окружающей среды, нормировали по пикам стандарта NIST 675 при 8,853 и 26,774 градуса 2-тета.

Рентгеновская порошковая дифракция кристаллической формы 1 согласно примеру 1.

6,6-Диметил-2-{2-[(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-

5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он (кристаллическая форма 1).

В раствор ACN (1 мл) и воды (1 мл) добавляли 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он (103 мг) и грели смесь при 70°С в течение 10 мин. Фильтровали и оставляли раствор охлаждаться до комнатной температуры на ночь. В раствор медленно добавляли воду (2 мл) в течение пяти часов. Собирали твердые вещества путем вакуумного фильтрования и промывали водой. Сушили твердые вещества на воздухе с получением 94 мг титульного соединения (92%).

Полученный образец кристаллической формы 1 согласно примеру 1 был охарактеризован при помощи дифрактограммы XRD, полученной с использованием облучением CuKa, как имеющий пики дифракции (в градусах 2-тета), такие как описано ниже в табл. 1, и, в частности, имеющий пики при 19,3° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 15,5, 17,1, 18,0, 20,2, 21,5 и 22,1°; где погрешность углов дифракции составляет 0,2°.

Таблица 1. Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллической формы 1 согласно примеру 1

Пик	Угол (°2-тета) +/- 0,2°	Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика)
1	7,1	7
2	8,8	11
3	12,6	7

- 26 031659

4	14,3	6
5	15,5	29
6	16,6	15
7	17,1	25
8	17,6	8
9	18,0	63
10	18,7	13
11	19,3	100
12	20,2	24
13	20,7	14
14	21,5	27
15	22,1	26
16	22,8	9
17	23,8	13
18	24,5	10
19	26,4	15
20	27,2	13
21	28,0	9
22	29,3	8

При помощи нескольких групп данных было показано, что процессы, задействованные при инициировании, росте и прогрессировании опухоли, опосредованы путем активации одного или более сигнальных путей в раковых клетках. Путь митоген-активируемой протеинкиназы (MARK) является ключевым регулятором пролиферации и выживания клеток. ERK является последующим элементом указанного пути и играет центральную роль при передаче внеклеточных сигналов от активированных рецепторных тирозинкиназ (RTK), таких как EGFR, FGFR, PDGFR, VEGFR и т.д. Указанный путь представляет собой трехзвенный киназный каскад, состоящий из киназ RAF, MEK и ERK (внеклеточная сигналрегулируемая киназа), и активация указанного пути происходит при активации RAS, небольшой ГТФазы. Активация RAS приводит к рекрутингу RAF, серин/треонинкиназы и ее активации. Затем активированный RAF фосфорилирует и активирует MEK1/2, который в свою очередь фосфорилирует и активирует ERK1/2. В активированной форме ERK1/2 фосфорилирует несколько нижележащих мишеней в цитоплазме и ядре, задействованных в пролиферации, росте, выживаемости клеток и ЕМТ (эпителиальномезенхимальный переход).

Путь RAS/MAPK является одним из наиболее важных путей для пролиферации клеток, как полагают, активация указанного пути происходит при ~30% всех раковых заболеваний человека. Конститутивная активация пути MAPK может происходить в результате активирующих мутаций RAS, BRAF, MEK1, утраты супрессора опухоли NF1 или предшествующей активации, опосредованной мутациями, амплификацией или опосредованной лигандом активацией RTK. Было показано, что при нескольких раковых заболеваниях, включая колоректальный рак, меланому, рак легкого и поджелудочной железы, происходит соматическая мутация всех трех генов семейства RAS (KRAS, NRAS и HRAS), чаще всего вызванная точечной мутацией в кодонах 12, 13 и 61. Указанные мутации вызывают конститутивную активацию RAS, которая сопровождается повышением активности ERK1/2 и сигнальной системы роста. Мутации в кодонах 12, 13 и 61 KRAS придают устойчивость к соединениям и моноклональным антителам, ингибирующим EGFR. Мутации KRAS выявлены при 30% раковых заболеваний легких, 90% раковых заболеваний поджелудочной железы, 10% раковых заболеваний желудка и 50% колоректальных раковых заболеваний. Мутации NRAS обнаружены примерно в 10-25% случаев меланомы. Кроме того, мутации RAS (HRAS, KRAS и NRAS) выявлены при ~55-60% случаев раковых заболеваний щитовидной железы. Соматические точечные мутации BRAF происходят примерно в 8% опухолей человека, чаще при меланоме (60%), колоректальном раке (10%) и раковых заболеваниях щитовидной железы (50%). При меланоме, как полагают, все мутации BRAF происходят внутри киназного домена, и одиночное замещение (Т-> A, V600E) происходит в 80% случаев мутации. Было показано, что мутации BRAF за редким исключением взаимно исключают мутации RAS, это позволяет предположить, что указанные генетические изменения активируют общие нижележащие эффекторы.

Биологические исследования.

В последующих исследованиях продемонстрировано, что предложенные соединения согласно настоящему изобретению представляют собой ингибиторы киназной активности ERK1 и ERK2. Результаты следующих исследований также подтверждают, что предложенные соединения согласно настоящему изобретению ингибируют сигнальную систему ERK в раковых клетках. Кроме того, было показано, что соединение согласно примеру 1 направленно ингибирует путь ERK в определенных моделях ксенотрансплантатов раковых опухолей. Кроме того, соединение согласно примеру 1 подавляет рост опухоли в определенных моделях ксенотрансплантатов раковых опухолей.

Исследование киназы ERK1.

- 27 031659

Задачей настоящего исследования являлось определение способности соединений ингибировать киназную активность ERK1. Исследование ERK1 киназы проводили in vitro при помощи TR-FRET. Реакции (в 12,5 мкл) запускали путем добавления 5 мкл фермента ERK1 (Invitrogen, #PR5254B, конечная концентрация 100 нг/мл) и субстрата GFP-ATF2 (Invitrogen, # PV4445, конечная концентрация 0,2 мкМ), 5 мкл раствора АТФ (Invitrogen, # PV3227, конечная концентрация 10 мкМ), полученного в киназном буфере (50 мМ Hepes, рН 7,4, 5 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ЭГТА, 0,01% Triton Х-100, 1 мМ DTT) и 2,5 мкл исследуемых соединений в растворе ДМСО (конечная концентрация 4%, об./об.) в 384-луночном PROXIPLATE™ (Perkin Elmer, #GRN6260). Инкубировали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 60 мин. Реакцию останавливали путем добавления 12,5 мкл останавливающего буфера (10 мМ ЭДТА, 2 нМ антитела Tb-anti-pATF2 (pThr71), Invitrogen, #PV4448) в буфере для разбавления TR-FRET (Invitrogen, # PV3574). Инкубировали планшеты при комнатной температуре в течение еще 60 мин и анализировали на планшет-ридере ENVISION® (PerkinElmer) при длине волны возбуждения 340 нм. Вычисляли отношение TR-FRET путем деления сигнала испускания акцептора GFP (при 520 нм) на сигнал испускания донора Tb (при 495 нм). Вычисляли ингибирование в процентах с использованием значений отношения TR-FRET, полученных в лунках, в которые вводили соединение, и Мах (контроль ДМСО) и Min (без добавления фермента) значений, полученных в контрольных лунках того же планшета {ингибирование, % = 100 - [(исследуемое соединение - медианное Min)/ (медианное Мах - медианное Min) х 100]}.

Все соединения исследовали в 10 концентрациях (от 20 мкМ до 0,001 мкМ), полученных по схеме разбавления 1:3. Значения Abs_IC₅₀ получали путем подстановки значения ингибирования в процентах и данных, полученных для десяти точек концентрации, в 4-параметровое нелинейное логистическое уравнение (уравнение 205) с использованием ACTIVITYBASE® 7.3 (ID Business Solutions Limited).

Предложенные соединения согласно настоящему изобретению тестировали в настоящем исследовании, по существу, согласно приведенному выше описанию. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что все предложенные соединения ингибируют киназную активность ERK1, где значения IC₅₀ составляют менее 0,15 мкМ. Например, соединение согласно примеру 1 имеет значение IC₅₀ 4,86 нМ (±0,20, n=7).

Исследование киназы ERK2.

Задачей настоящего исследования являлось определение способности соединений ингибировать киназную активность ERK2. Исследование ERK2 киназы проводили in vitro при помощи TR-FRET. Реакции (в 12,5 мкл) запускали путем добавления 5 мкл фермента ERK2 (Invitrogen, #PV3595B, конечная концентрация 50 нг/мл) и субстрата GFP-ATF2 (Invitrogen, # PV4445, конечная концентрация 0,2 мкМ), 5 мкл раствора АТФ (Invitrogen, # PV3227, конечная концентрация 10 мкМ), полученного в киназном буфере (50 мМ Hepes, рН 7,4, 5 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ЭГТА, 0,01% Triton Х-100, 1 мМ DTT) и 2,5 мкл исследуемых соединений в растворе ДМСО (конечная концентрация 4%, об./об.) в 384-луночном PROXIPLATE™ (Perkin Elmer, #GRN6260). Инкубировали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 60 мин. Реакцию останавливали путем добавления 12,5 мкл останавливающего буфера (10 мМ ЭДТА, 2 нМ антитела Tb-anti-pATF2 (pThr71), Invitrogen, #PV4448) в буфере для разбавления TR-FRET (Invitrogen, # PV3574). Инкубировали планшеты при комнатной температуре в течение еще 60 мин и анализировали на планшет-ридере ENVISION® (PerkinElmer) при длине волны возбуждения 340 нм. Вычисляли отношение TR-FRET путем деления сигнала испускания акцептора GFP (при 520 нм) на сигнал испускания донора Tb (при 495 нм). Вычисляли ингибирование в процентах с использованием значений отношения TR-FRET, полученных в лунках, в которые вводили соединение, и Мах (контроль ДМСО) и Min (без добавления фермента) значений, полученных в контрольных лунках того же планшета {ингибирование, % = 100 - [(исследуемое соединение - медианное Min) / (медианное Мах - медианное Min) х 100]}.

Все соединения исследовали в 10 концентрациях (от 20 мкМ до 0,001 мкМ), полученных по схеме разбавления 1:3. Значения Abs_IC₅₀ получали путем подстановки значения ингибирования в процентах и данных, полученных для десяти точек концентрации, в 4-параметровое нелинейное логистическое уравнение (уравнение 205) с использованием ACTIVITYBASE® 7.3 (ID Business Solutions Limited).

Предложенные соединения согласно настоящему изобретению тестировали в настоящем исследовании, по существу, согласно приведенному выше описанию. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что все предложенные соединения ингибируют киназную активность ERK2, где значения IC₅₀ составляют менее 0,15 мкМ. Например, соединение согласно примеру 1 имеет значение IC₅₀ 5,24 нМ (±0,24, n=7).

Клеточное исследование механизма действия ERK1/2 (исследование pRSK1 Alphascreen).

Задачей настоящего исследования являлось определение способности соединений ингибировать сигнальную систему ERK в раковых клетках in vitro. Исследование pRSK1 Alphascreen проводили с использованием клеточной линии колоректального рака НСТ116 (АТСС, # CCL-247). Традиционным образом выращивали клетки НСТ116 в питательной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) (Hyclone, #SH30022), содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) (Gibco, #16000-044), в колбах Т

- 28 031659

150 и инкубировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°С. Собирали клетки после достижения конфлюентности и замораживали в среде для замораживания в количестве 1х 10е⁷ клеток/мл в качестве замороженных клеток, готовых к исследованию и хранили в жидком азоте. Для проведения исследования 40000 клеток HCT116/лунку помещали в 96-луночный планшет для тканевых культур и инкубировали при 37°С в инкубаторе с 5% CO₂ в течение ночи. Исследовали соединения в 10 концентрациях, начиная с максимальной концентрации 20 мкМ, использовали схему разбавления 1:3 (от 20 до 0,001 мкМ), где конечная концентрация ДМСО составляла 0,5% (об./об.). Добавляли соединения в 20 мкл бессывороточной питательной среды и инкубировали при 37°С в течение двух часов. Удаляли питательную среду и в каждую лунку добавляли 50 мкл 1х лизисного буфера [Cell Signaling Technology, #9803], содержащего 1х коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз Halt [Thermo, #78441], и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин на шейкере. Переносили 4 мкл клеточного лизата из каждой лунки в соответствующие лунки 384-луночного планшета для исследования [Perkin Elmer, #6006280] и добавляли 5 мкл реакционной смеси [2000 частей 1х буфера для исследования (Perkin Elmer, #A1000), 1 часть антитела биотин-RSK1 (Santa Cruz, #sc-231-B-G), 4 части антитела pRSK1 (Abcam, #ab32413), 35 частей акцепторных зерен (Perkin Elmer, #6760617R)]. Закрывали планшет пленкой на основе фольги (Beckman Coulter, # 538619) и инкубировали при комнатной температуре в течение двух часов. В каждую лунку добавляли 2 мкл донорных зерен [20 частей 1х буфера для исследования, 1 часть донорных зерен] и закрывали планшет прозрачной пленкой (Applied Biosystems, #4311971) и инкубировали при комнатной температуре без доступа света в течение двух часов. Измеряли интенсивность флуоресценции в каждой лунке путем анализа планшетов на планшет-ридере ENVISION® (PerkinElmer). Значения Rel IC₅₀ получали путем подстановки данных ингибирования pRSK1 в процентах [% ингибирование = 100 - [(исследуемое соединение - медианное Min)/ (медианное Мах - медианное Min) х 100] и данных, полученных для десяти точек концентрации, в 4-параметровое нелинейное логистическое уравнение (уравнение Abase 205) с использованием ACTIVITYBASE® 7.3 (ID Business Solutions Limited).

Предложенные соединения согласно настоящему изобретению тестировали в настоящем исследовании, по существу, согласно приведенному выше описанию. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что все предложенные соединения ингибируют фосфорилирование субстрата ERK (RSK) в опухолевых клетках, где значения IC₅₀ составляют менее 3 мкМ. Например, соединение согласно примеру 1 имеет значение IC₅₀ 0,429 мкМ (± 0,173, n=8).

Исследование направленного ингибирования In Vivo (IVTI) (исследование pRSK1 ELISA).

Задачей настоящего исследования являлось определение способности исследуемого соединения ингибировать фосфорилирование субстрата ERK1/2 в животной модели. Самкам бестимусных мышей (2225 г), которых получали в Harlan Laboratories, подкожно в правый бок имплантировали 5х10е⁶ клеток колоректального рака НСТ116 (АТСС, # CCL-247) в 200 мкл 1:1 смеси сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) + раствора Matrigel. Измеряли рост опухоли и массу тела два раза в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда размер опухоли достигал 300-500 мм³, животных случайным образом распределяли по группам из пяти животных. Животным перорально вводили соединение в соответствующей дозе в специфическом носителе соединения или только носитель (носитель: 1% ГЭЦ/0,25% Tween 80/0,05% Antifoam) и собирали образцы опухолей и крови с целевыми интервалами после введения дозы. Умерщвляли животных с использованием изофлурановой анестезии путем цервикальной дислокации. Мгновенно замораживали опухоли и хранили при -80°С до обработки перед измерением уровня pRSK1 в исследовании ELISA. Собирали образцы крови в пробирки с покрытием ЭДТА и осаждали плазму путем центрифугирования и замораживали при -80°С в 96-луночном планшете. Определяли воздействие соединения при помощи стандартных способов.

Распыляли образцы опухолей в жидком азоте и проводили лизис в 1х лизисном буфере (MSD, #R60TX-3), содержащем 1х коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз Halt (Thermo Scientific, #0861281), 1 мМ фенилметансульфонилфторид (PMSF) (Sigma, # 93482-50ML-F) и 1 мкМ метаванадат натрия (Sigma, #590088), с использованием зерен Matrix D (MP Biomedical, #6913-500) в устройстве для разрушения клеток FastPrep-24™ Cell Disrupter (MP Biomedical) в холодной камере (4°С). Лизаты опухолей переносили в свежие пробирки после перемешивания при 14000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Определяли концентрацию белка в лизатах опухолей или клеток с использованием набора для исследования белка Pierce BCA Protein Assay Kit (кат.№ 23225, Thermo Scientific). Указанный набор содержал три основных компонента - (1) реагент А ВСА, содержащий карбонат натрия, бикарбонат натрия, бицинхониновую кислоту и тартрат натрия в 0,1М гидроксиде натрия, (2) реагент В ВСА, содержащий 4% сульфата меди (II), и (3) стандартные ампулы с альбумином, содержащие 2 мг/мл в 0,9% солевом растворе и 0,05% азид натрия. В 96-луночном планшете у лунки в двух повторностях добавляли стандартный белок альбумин бычьей сыворотки в концентрации в диапазоне 20-2000 мкг/мл в 25 мкл для получения стандартной кривой. В исследуемые лунки в двух повторностях добавляли лизаты клеток или опухолей, разбавленные в 25 мкл 1х ФБР. Рабочий реагент ВСА готовили путем добавления 2% реагента В в реагент А (2 мл В + 98

- 29 031659 мл А), тщательно перемешивали и добавляли 200 мкл к каждому образцу или стандарту. Тщательно перемешивали, закрывали планшет и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Охлаждали планшет до комнатной температуры и измеряли поглощение примерно при 562 нм на планшет-ридере (планшетридер Envision производства Perkin Elmer). Вычитали значение среднего поглощения при 562 нм для пустых стандартных образцов из значений поглощения при 562 нм для всех других отдельных стандартных и неизвестных (лизат клеток или опухоли) образцов. Получали стандартную кривую путем построения графика зависимости скорректированных на пустой образец значений поглощения при 562 нм для каждого стандартного образца с альбумином бычьей сыворотки от концентрации альбумина в мкг/мл. Стандартную кривую использовали для определения концентрации белка в каждом из неизвестных образцов при помощи логарифмической подстановки в Microsoft Excel. Замораживали оставшиеся лизаты опухолей при -80°С. Лизаты опухолей после однократного цикла замораживания-размораживания использовали для измерения экспрессии pRSK1 при помощи сэндвич-ELISA.

На 96-луночные планшеты (Thermo, #15042) в течение ночи при 4°С наносили покрытие 40 нг козьего антитела RSK1 (Santa Cruz, # sc-231-G) и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа и затем при 4°С в течение ночи. Планшеты трижды промывали 300 мкл PBST (1х фосфатный буферный солевой раствор (ФБР), содержащий 0,05% Tween-20), блокировали 100 мкл блокирующего буфера на лунку (Thermo Scientific, #37532) и инкубировали при комнатной температуре в течение двух часов. Планшеты трижды промывали 300 мкл PBST и в каждую лунку переносили по 20 мкг лизата опухоли и инкубировали при 4°С в течение ночи. Планшеты трижды промывали 300 мкл PBST и инкубировали совместно с 100 мкл кроличьего антитела pRSK1 (T359/S363) (разбавленного 1:1000 в блокирующем буфере) при комнатной температуре в течение четырех часов. Планшеты трижды промывали 300 мкл PBST и инкубировали совместно с 100 мкл антикроличьего вторичного антитела, конъюгированного с HRP (GE Healthcare UK, #NA934V; разбавленного 1:10000 в блокирующем буфере). Инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты трижды промывали 300 мкл PBST, добавляли 100 мкл субстрата с максимальной чувствительностью SUPERSIGNAL® ELISA Femto (Thermo, #37075) и инкубировали на шейкере в течение одной минуты. Определяли сигнал люминесценции на планшетридере ENVISION®. Определяли уровень pRSK1 в каждом лизате опухоли, принимая результаты, полученные в лизатах опухолей, которые обрабатывали только носителем, за 100%. Каждый образец анализировали в двух повторностях и для вычисления использовали среднее значение. Значение TED₅₀ вычисляли при помощи Excel и XL Fit.

Соединение согласно настоящему изобретению тестировали в настоящем исследовании, по существу, согласно приведенному выше описанию. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что соединение согласно примеру 1 ингибирует фосфорилирование RSK1 в модели ксенотрансплантата опухоли. Например, соединение согласно примеру 1 имеет значение TED₅₀ 16 мг/кг.

Модели ксенотрансплантата опухоли.

Задачей настоящего исследования являлось определение снижения объема опухоли в ответ на введение исследуемого соединения. Выращивали культуру клеток колоректального рака человека НСТ116 (АТСС, # CCL-247), собирали и подкожно вводили 5х10е⁶ клеток в 200 мкл 1:1 HBSS+раствор Matrigel в правый бок самкам бестимусных мышей (22-25 г, Harlan Laboratories). Выращивали культуру клеток рака поджелудочной железы человека MIA РАСА-2 (АТСС, # CRL-1420) или клеток немелкоклеточного рака легкого человека CALU-6 (АТСС, # НТВ-56) или клеток колоректального рака человека COLO-205 (АТСС, # CCL-222), собирали и подкожно вводили 5х10е⁶ клеток в 200 мкл 1:1 HBSS+раствор Matrigel в правый бок самкам бестимусных мышей (22-25 г, Harlan Laboratories). Измеряли рост опухоли и массу тела два раза в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда размер опухоли достигал 200400 мм³, случайным образом распределяли животных по группам, включающим от восьми до десяти животных. Готовили препарат исследуемого соединения в соответствующий носитель (носитель: 1% ГЭЦ/0,25% Tween 80/0,05% Antifoam) и вводили при помощи перорального зонда в течение 14-21 дней. Определяли ответ опухоли путем измерения объема опухоли, который проводили два раза в неделю в течение курса лечения. Массу тела рассматривали как общую меру токсичности.

Соединение согласно настоящему изобретению тестировали в настоящем исследовании, которое проводили согласно приведенному выше описанию. Было показано, что соединение согласно примеру 1 имеет значения дельта Т/С%, такие как приведено ниже в табл. 2. Полученные результаты указывают на то, что соединение согласно примеру 1 имеет значительную противоопухолевую активность в нескольких моделях ксенотрансплантата раковых клеток человека, включая НСТ116, MIA PACA-2, CALU-6 и COLO-205.

- 30 031659

Таблица 2. Эффективность соединения согласно примеру 1 в моделях ксенотрансплантатов

Модель опухоли	Доза (мг/кг)	Схема	Р	Дельта Т/С % или Регр.%	TGI%
НСТ116	25	QD		-8	108
НСТ116	50	QD	<0,001*	11	89
НСТ116	100	QD	<0,001*	-25	125
MIA РАСА-2	12,5	QD	0,003*	32	68
MIA РАСА-2	25	QD	<0,001*	2	98
MIA РАСА-2	50	QD	<0,001*	-22	122
MIA РАСА-2	100	QD	<0,001*	-66	166
CALU-6	12,5	QD	0,010*	22	78
CALU-6	25	QD	0,005*	14	86
CALU-6	50	QD	<0,001*	-31	131
CALU-6	100	QD	<0,001*	-77	177
COLO-205	12,5	QD	<0,001*	-19	119
COLO-205	25	QD	<0,001*	-32	132
COLO-205	100	QD	<0,001*	-76	176

Анализ объема опухоли проводили на основании ковариантной структуры Log 10 и SpatialPower.

*: значительное различие (р<0,05);

НО: не определяли;

Значение дельта Т/С% вычисляли, если конечный объем опухоли в группе, которой проводили лечение, соответствовал объему опухоли на исходном уровне или превышал его. Использовали формулу 100-(Т-Т₀)/(С-С₀), где Т и С представляют собой средние конечные значения объема опухоли, в группе, которой проводили лечение, и контрольной группе соответственно. Т₀ и С₀ представляют собой средние значения объема опухоли в указанных группах на исходном уровне.

% Регрессии вычисляли, если конечный объем опухоли был ниже исходного уровня. Использовали формулу 100-(Т-Т₀)/Т₀, где Т₀ представляет собой средний объем опухоли в группе, которой проводили лечение, на исходном уровне.

В моделях НСТ116, MIA PACA-2 и CALU-6 общее среднее для всех групп на исходном уровне (перед рандомизацией) в день 10, день 20 и день 15, соответственно, использовали для вычисления изменения Т/С в %.

Комбинированные исследования In Vivo.

Вследствие гетерогенности опухолей применение комбинированной терапии стало незаменимым вариантом при лечении определенных типов рака для обеспечения эффективной терапии или преодоления приобретаемой устойчивости. Было сделано предположение о том, что комбинация направленных способов терапии может более эффективно замедлять или даже устранять раковые заболевания. Согласно указанному контексту проводили исследование соединения согласно примеру 1 в отношении подавления роста опухоли в комбинации с универсальным соединением-ингибитором RAF (см. WO 2013/134243, 1-(3,3-диметилбутил)-3-(2-фтор-4-метил-5-(7-метил-2-(метиламино)-пиридо[2,3-б]пиримидин-6-ил)фени)мочевина, далее универсальное соединение-ингибитор RAF), соединениемингибитором CDK4/6 (см. WO 2010/075074, [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль), далее соединение-ингибитор CDK4/6) или DC101 (см., например, Witte L. et al. Cancer Metastasis Rev., 17, 155-161, 1998, крысиное моноклональное антитело к мышиному VEGFR2, которое можно применять в экспериментах на мышах в качестве заменителя антитела к VEGFR2, предпочтительно рамуцирумаб (см. WO 2003/075840, также известный как Cyramza®, IMC-1121b, регистрационный номер CAS 947687-13-0)). Более конкретно соединение согласно примеру 1 исследовали в комбинации с универсальным соединением-ингибитором RAF или соединением-ингибитором CDK4/6 в модели ксенотрансплантата клеток колоректального рака НСТ116 с мутацией KRAS. Кроме того, соединение согласно примеру 1 исследовали в комбинации с соединением-ингибитором CDK4/6 или DC101 в моделях ксенотрансплантатов клеток немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) NCI-H441, А549 и NCI-H2122 с мутацией KRAS.

Исследование эффективности комбинации в отношении НСТ116 проводили на бестимусных мышах. Выращивали культуру клеток колоректального рака человека НСТ116 (АТСС, # CCL-247), собирали и подкожно вводили 5x10e⁶ клеток в 200 мкл 1:1 HBSS+раствор Matrigel в правый бок самкам бестимусных крыс NIH (120-145 г, Taconic Farms). Измеряли рост опухоли и массу тела два раза в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда средний размер опухоли достигал 200-300 мм³, случайным образом распределяли животных по группам, включающим от пяти до семи животных. Готовили препарат исследуемого соединения в соответствующем носителе (см. ниже) и вводили при помощи перорального зонда в течение 21-28 дней. Ответ опухоли определяли путем измерения объема опухоли, которое проводили два раза в неделю в течение курса лечения. В настоящем исследовании в качестве

- 31 031659 носителя применяли 1% ГЭЦ (гидроксиэтилцеллюлоза)/0,25% Tween® 80/0,05% Antifoam. Соединение согласно примеру 1 и универсальное соединение-ингибитор RAF вводили в 1% ГЭЦ/0,25% Tween® 80/0,05% Antifoam. Соединение-ингибитор CDK4/6 вводили в 1% ГЭЦ в 25 мМ буфере на основе фосфата натрия, рН 2. Введение соединения согласно примеру 1 в дозе 10 мг/кг и 20 мг/кг QD в качестве единственного агента обеспечивало активность подавления роста опухоли, составляющую 52 и 64% соответственно (табл. 3). В противоположность этому введение универсального соединения-ингибитора RAF в дозе 10 мг/кг и 20 мг/кг BID в качестве единственного агента обеспечивало активность 29 и 68% соответственно. Результаты для всех способов лечения статистически отличались (р<0,05) от контрольного опыта с использованием носителя за исключением введения универсального соединения-ингибитора RAF в дозе 10 мг/кг BID. Введение соединения согласно примеру 1 в дозе 10 мг/кг, QD, в комбинации с универсальным соединением-ингибитором RAF в дозе 10 мг/кг, BID, обеспечивало 94% подавление роста опухоли (р<0,001), и результат применения комбинации является синергическим, что определено при помощи независимого анализа по Елиссу (табл. 3). Можно предположить, что указанная комбинация хорошо переносится, так как значительное снижение массы тела отсутствовало. Введение соединения согласно примеру 1 в дозе 10 мг/кг, QD, в комбинации с универсальным соединением-ингибитором RAF в дозе 20 мг/кг, BID, также обеспечивало значительное (р<0,05) подавление роста опухоли (95%), и результат применения комбинации является аддитивным, что определено при помощи независимого анализа по Елиссу (табл. 3). Можно предположить, что указанная комбинация хорошо переносится, так как значительное снижение массы тела отсутствовало. В этом же исследовании введение соединения согласно примеру 1 в дозе 10 мг/кг, QD, совместно с соединением-ингибитором CDK4/6 в дозе 20 мг/кг QD обеспечивало 98% подавление роста опухоли, тогда как значения эффективности в отношении подавления роста опухоли для соединения согласно примеру 1 и соединения-ингибитора CDK4/6 в качестве отдельных агентов составляли 52 и 76% соответственно. Комбинация двух указанных агентов обеспечивает статистически значимый аддитивный результат, что определено при помощи независимого анализа по Елиссу (табл. 3). Можно предположить, что указанная комбинация хорошо переносится, так как значительное снижение массы тела отсутствовало. Указанные результаты позволяют предположить, что комбинация соединения согласно примеру 1 совместно с универсальным соединением-ингибитором RAF или соединением-ингибитором CDK4/6 может обеспечивать повышенное благоприятное действие у пациентов, имеющих колоректальный рак с мутацией KRAS.

Таблица 3. Исследование комбинации соединения согласно примеру 1 совместно с универсальным соединением-ингибитором RAF или соединением-ингибитором CDK4/6 в модели ксенотрансплантата клеток колоректального рака НСТ116 с мутацией KRAS

Группа лечения	Соединение	Доза (мг/кг)	Схема	Дельта T/C %	TGI%	P	Результат комбинации
1	Носитель	НО.	BID	HO.	HO.	HO.	но.
2	Пример 1	10	QD	48	52	0,038*	но.
3	Пример 1	20	QD	36	64	0,005*	но.
4	У нив. ингибитор RAF	10	BID	71	29	0,303	но.
5	У нив. ингибитор RAF	20	BID	32	68	0,001*	но.
6	Ингибитор CDK4/6	20	QD	24	76	<0,001*	но.
7	Пример 1 + унив. ингибитор RAF	10, 10	QD, BID	6	94	<0,001*	Синерг.
8	Пример 1 + унив. ингибитор RAF	ю, 20	QD, BID	5	95	<0,001*	Аддитив.
9	Пример 1 + ингибитор CDK4/6	ю, 20	QD, QD	2	98	<0,001*	Аддитив.

Анализ объема опухоли проводили на основании ковариантной структуры Log 10 и SpatialPower.

*: значительное различие (р<0,05);

**статистический эффект применения комбинации двух агентов был определен при помощи независимого анализа по Елиссу: сначала проводили подстановку в модели повторяющихся измерений для построения зависимости логарифмированного значения объема опухоли от группы, времени и группы

- 32 031659 времени. Затем для исследования эффекта взаимодействия в каждый момент времени использовали параметры контрастной оценки. Ожидаемый аддитивный ответ (EAR) комбинации вычисляли по шкале объема опухоли как EAR объем = V1-V2/V0, где V0, V1 и V2 представляют собой оценочные средние значения объема опухоли для контроля с использованием носителя, отдельно для способа лечения 1 и отдельно для способа лечения 2 соответственно. Если различия в тесте определения взаимодействия являются значимыми (р < 0,05), то для исследуемых доз и режимов введения эффект комбинации называют синергическим, если наблюдаемый объем при применении комбинации ниже объема EAR, антагонистическим, если наблюдаемый объем при применении комбинации выше объема EAR, и в остальных случаях аддитивным.

Н.О.: не определяли.

Значение дельта Т/С% вычисляли, если конечный объем опухоли в группе, которой проводили лечение, соответствовал объему опухоли на исходном уровне или превышал его. Использовали формулу 100-(Т-Т₀)/(С-С_о), где Т и С представляют собой средние конечные значения объема опухоли, в группе, в которой проводили лечение, и контрольной группе соответственно. Т₀ и С₀ представляют собой средние значения объема опухоли в указанных группах на исходном уровне.

Во всех исследованиях дозирование проводили в течение 28 дней.

Общее среднее для всех групп на исходном уровне (перед рандомизацией) в день 11 использовали для вычисления изменения Т/С в %.

Также проводили исследование эффективности комбинации в отношении трех моделей ксенотрансплантата НМРЛ с мутацией KRAS, включая А549 (KRAS_G12S) у мышей SCID, а также NCIH441 (KRAS_G12V) и NCI-H2122 (ICRAS_G12C) у бестимусных мышей. Выращивали культуры клеток немелкоклеточного рака легкого N0^441 (АТСС, # CRL-5807) и NCI-H2122 (АТСС, #CRL-5985), собирали и подкожно вводили 5x10e⁶ клеток в 200 мкл 1:1 HBSS+ раствор Matrigel в правый бок самкам бестимусных мышей (20-22 г, Harlan Laboratories). Выращивали культуры клеток немелкоклеточного рака легкого человека А549 (АТСС, # СС1-185), собирали и подкожно вводили 5x10e⁶ клеток в 200 мкл 1:1 HBSS+ раствор Matrigel в правый бок самкам мышей СВ-17 SCID (18-20 г, Taconic Farms). Для всех клеточных линий измеряли рост опухоли и массу тела два раза в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда средний размер опухоли достигал 200-300 мм³, случайным образом распределяли животных по группам, включающим от пяти до семи животных. Готовили препарат исследуемого соединения в соответствующем носителе (см. ниже) и вводили при помощи перорального зонда (соединение согласно примеру 1 и соединение-ингибитор CDK4/6) или интраперитонеально (DC101) в течение 21-28 дней. Ответ опухоли определяли путем измерения объема опухоли, которое проводили два раза в неделю в течение курса лечения. В качестве носителя в указанном исследовании использовали 1% ГЭЦ/0,25% Tween® 80/0,05% Antifoam. Соединение согласно примеру 1 вводили в 1% ГЭЦ/0,25% Tween® 80/0,05% Antifoam, и соединение-ингибитор CDK4/6 вводили в 1% ГЭЦ в 25 мМ буфере на основе фосфата натрия, рН 2. Введение соединения согласно примеру 1 в качестве единственного агента в дозе 50 мг/кг обеспечивало 41% и 91% подавление роста опухоли в отношении опухолей NCI-H2122 и А549 соответственно; и обеспечивало 101% подавление роста опухоли (т.е. 1% регрессию опухоли) в опухолях NCIH441. Введение соединения-ингибитора CDK4/6 в качестве единственного агента в дозе 50 мг/кг обеспечивало 53%, 51% и 81% подавление роста опухоли в моделях NCI-H2122, А549 и NCI-H441 соответственно. Кроме того, комбинация соединения согласно примеру 1 (50 мг/кг) с соединением-ингибитором CDK4/6 (50 мг/кг) обеспечивала 151 % (т.е. 51% регрессию) и 147% (т.е. 47% регрессию) подавление роста опухоли в опухолях А549 и NCI-H441 соответственно; и 82% подавление роста опухоли в опухолях NCI-H2122. Результаты комбинации во всех трех моделях опухолей определяли как аддитивные при помощи независимого анализа по Блиссу (табл. 4). В общем случае, можно предположить, что все способы лечения в указанных исследованиях хорошо переносились, на что указывает отсутствие значительного снижения массы тела. В той же модели ксенотрансплантата NCI-H441 DC101 в фосфатном буфере также вводили интраперитонеально два раза в неделю (BIW) в качестве единственного агента или в комбинации с соединением согласно примеру 1, 50 мг/кг, QD в течение 28 дней. Введение DC101 в дозе 20 мг/кг, BIW, в качестве единственного агента обеспечивало 102% подавление роста опухоли (т.е. 2% регрессию). Комбинация соединения согласно примеру 1 в дозе 50 мг/кг, QD, совместно с DC101 в дозе 20 мг/кг, BIW, обеспечивала 146% подавление роста опухоли (т.е. 46% регрессию). Результат указанной комбинации определен как аддитивный согласно независимому анализу по Блиссу (табл. 4). Можно предположить, что указанная комбинация хорошо переносилась, так как значительная потеря массы тела отсутствовала. Полученные результаты позволяют предположить, что комбинация соединения согласно примеру 1 с соединением-ингибитором CDK4/6 или антителом к VEGFR2 может обеспечивать повышенное благоприятное действие у пациентов с немелкоклеточным раком легкого с мутацией KRAS.

- 33 031659

Таблица 4. Исследование комбинации соединения согласно примеру 1 с соединением-ингибитором CDK4/6 или DC101 в моделях ксенотрансплантатов немелкоклеточного рака легкого с мутацией KRAS

Пример 1

Аддитивный

Аддитивный

Аддитивный

Аддитивный

Эффект комбинации

Носитель

Ингибитор

CDK4/6

DC101

Пример 1 +

DC101

Пример 1 + ингибитор

CDK4/6

Носитель ингибитор [ DK.4/6

Пример 1

Пример 1 + ингибитор

CDK4/6

Носитель ингибитор

CDK4/6

Пример 1

Пример 1 + ингибитор

С DK4/6 'Анализ объема опухоли проводили после трансформации значений в Log 10 и при помощи ANOVA с повторяющимися измерениями со специальной степенной ковариантной структурой;

*: значимые различия (р <0,05);

**статистический эффект комбинации двух агентов определяли при помощи независимого способа по Блиссу: сначала проводили подстановку в модели повторяющихся измерений для построения зависимости логарифмированного значения объема опухоли от группы, времени и группы-времени. Затем для исследования эффекта взаимодействия в каждый момент времени использовали параметры контрастной оценки. Ожидаемый аддитивный ответ (EAR) комбинации вычисляли по шкале объема опухоли как EAR объем = V1-V2/V0, где V0, V1 и V2 представляют собой оценочные средние значения объема опухоли для контроля с использованием носителя, отдельно для способа лечения 1 и отдельно для способа лечения 2 соответственно. Если различия в тесте определения взаимодействия являются значимыми (р < 0,05), то для исследуемых доз и режимов введения эффект комбинации называют синергическим, если наблюдаемый объем при применении комбинации ниже объема EAR, антагонистическим, если наблюдаемый объем при применении комбинации выше объема EAR, и в остальных случаях аддитивным.

Н.О.: не определяли;

Значение дельта Т/С% вычисляли, если конечный объем опухоли в группе, которой проводили лечение, соответствовал объему опухоли на исходном уровне или превышал его. Использовали формулу 100-(Т-Т₀)/(С-С₀), где Т и С представляют собой средние конечные значения объема опухоли в группе, которой проводили лечение, и контрольной группе соответственно. Т₀ и С₀ представляют собой средние значения объема опухоли в указанных группах на исходном уровне.

Значения на исходном уровне (перед рандомизацией) в день 11 (НСТ116), день 25 (NCI-H441), день 22 (А549), день 18 (NCI-H2122) использовали для вычисления изменения Т/С в %.

Дозирование проводили в течение 28 дней во всех исследованиях.

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы где R¹ представляет собой

   - 34 031659

   R² и R³ представляют собой метил или R² и R³ могут быть объединены с образованием циклопропила;

   _R4 _R5 представляет собой водород, метил, хлор, фтор или трифторметил; представляет собой или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, отличающееся тем, что R² и R³ независимо представляют собой метил.

   его
3. 3. Соединение по п.2 ставляет собой водород.
4. 4. Соединение по п.3 ставляет собой или или его фармацевтически приемлемая соль, отличающееся тем, что фармацевтически приемлемая соль, отличающееся тем, что

   R⁴

   R¹ предпред
5. 5. Соединение по п.3 ставляет собой или его фармацевтически приемлемая соль, отличающееся тем, что

   R⁵ пред-
6. 6. Соединение по п.4, представляющее собой 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1И-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он или его фармацевтически приемлемую соль.
7. 7. Соединение по п.6, представляющее собой 6,6-диметил-2-{2-[(1-метил-1И-пиразол-5ил)амино]пиримидин-4-ил}-5-[2-(морфолин-4-ил)этил]-5,6-дигидро-4Н-тиено[2,3-с]пиррол-4-он.
8. 8. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
9. 9. Применение соединения по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли для ингибирования активности внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK).
10. 10. Применение соединения по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака.
11. 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что указанное раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака поджелудочной железы и немелкоклеточного рака легкого.
12. 12. Применение по п.11, отличающееся тем, что указанное раковое заболевание представляет собой колоректальный рак.
13. 13. Применение по п.11, отличающееся тем, что указанное раковое заболевание представляет собой

    - 35 031659 рак поджелудочной железы.
14. 14. Применение по п.11, отличающееся тем, что указанное раковое заболевание представляет собой немелкоклеточный рак легкого.
15. 15. Применение комбинации, содержащей соединение по п.7 или его фармацевтически приемлемую соль и рамуцирумаб одновременно, раздельно или последовательно, для лечения немелкоклеточного рака легкого.
16. 16. Применение соединения по п.7 или его фармацевтически приемлемой соли одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с рамуцирумабом для лечения немелкоклеточного рака легкого.
17. 17. Применение рамуцирумаба одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с соединением по п.7 или его фармацевтически приемлемой солью для лечения немелкоклеточного рака легкого.
18. 18. Применение по любому из пп.15-17, отличающееся тем, что указанный немелкоклеточный рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого с мутацией KRAS.
19. 19. Применение комбинации, содержащей соединение по п.7 или его фармацевтически приемлемую соль и [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Hбензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемую соль одновременно, раздельно или последовательно, для лечения немелкоклеточного рака легкого.
20. 20. Применение соединения по п.7 или его фармацевтически приемлемой соли одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7фтор-3-изопропил-2-метил-3H-бензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амином или его фармацевтически приемлемой солью для лечения немелкоклеточного рака легкого.
21. 21. Применение [5-(4-этилпиперазин-1 -илметил)пиридин-2-ил]-[5 -фтор-4-(7-фтор-3 -изопропил-2метил-3H-бензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина или его фармацевтически приемлемой соли одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с соединением по п.7 или его фармацевтически приемлемой солью для лечения немелкоклеточного рака легкого.
22. 22. Применение по любому из пп.19-21, отличающееся тем, что указанный немелкоклеточный рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого с мутацией KRAS.
23. 23. Применение комбинации, содержащей соединение по п.7 или его фармацевтически приемлемую соль и [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Hбензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемую соль одновременно, раздельно или последовательно, для лечения колоректального рака.
24. 24. Применение соединения по п.7 или его фармацевтически приемлемой соли одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7фтор-3-изопропил-2-метил-3H-бензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амином или его фармацевтически приемлемой солью для лечения колоректального рака.
25. 25. Применение [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2метил-3H-бензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина или его фармацевтически приемлемой соли одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с соединением по п.7 или его фармацевтически приемлемой солью для лечения колоректального рака.
26. 26. Применение по любому из пп.23-25, отличающееся тем, что указанный колоректальный рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого с мутацией KRAS.