EA030795B1

EA030795B1 - Молекулы для селективной доставки пары визуализирующих агентов в раковую ткань

Info

Publication number: EA030795B1
Application number: EA201490385A
Authority: EA
Inventors: Цзюньцзе Лю; Хесус Гонзалез
Original assignee: Авелас Биосайнсиз, Инк.
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2018-09-28
Also published as: EP3473273A1; JP2014521661A; US9371367B1; KR102004558B1; US9278144B2; DK2736533T3; AU2012290318A1; EP2736533A4; US9504763B2; US20180057536A1; MX2014001138A; CN103874512A; US9840537B2; AU2012290318B2; EA201490385A1; US20190119327A1; CN103874512B; HK1197184A1; CA2841249C; CA2841249A1

Abstract

В изобретении описана молекула для селективной доставки пары агентов для визуализации раковой ткани, имеющая структуру [D-c]-A-[c-M]-X-B-[c-D], где X представляет собой пептидный линкер, который способен к расщеплению при помощи протеазы; A представляет собой пептид с последовательностью, содержащей 5 последовательных остатков глутамата; B представляет собой пептид с последовательностью, содержащей 8 последовательных остатков аргинина; c, cи c, каждый независимо, представляет собой остаток аминокислоты; M представляет собой полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ); и Dи Dпредставляют собой пару акцепторной и донорной флуоресцентных частиц, между которыми возможен флуоресцентный резонансный перенос энергии по механизму Фёрстера; и где [c-М] присоединён в любом положении к X, [D-c] присоединён к любой аминокислоте в A, и [c-D] присоединён к любой аминокислоте в B, и M представляет собой полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий среднюю молекулярную массу 500, 1000, 2000, 5000 или 10000 Да, а также ее применение для доставки пары визуализирующих агентов в раковую ткань.

Description

Данное изобретение относится к молекуле селективной доставки пары агентов для визуализации раковой ткани, имеющей формулу I, имеющую структуру |Т)а-са]-А-[см-М]-Х-В-[св-Ов] формула I, где X представляет собой пептидный линкер, который способен к расщеплению при помощи протеазы;

А представляет собой пептид с последовательностью, содержащей 5 последовательных остатков глутамата;

В представляет собой пептид с последовательностью, содержащей 8 последовательных остатков аргинина;

сА, сВ и сМ, каждый независимо, представляет собой остаток аминокислоты;

М представляет собой полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ);

1)_А и 1)_В представляют собой пару акцепторной и донорной флуоресцентных частиц, между которыми возможен флуоресцентный резонансный перенос энергии по механизму Фёрстера; и где [с_М-М] присоединён в любом положении к X, [Э_А-с_А] присоединён к любой аминокислоте в А, и |с_В-1)_В] присоединён к любой аминокислоте в В, М представляет собой полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий среднюю молекулярную массу 500, 1000, 2000, 5000 или 10000 Да.

В одном из вариантов изобретения с_А, с_В и с_М, каждый независимо, выбран из Ό-цистеина, Όглутамата, лизина и пара-4-ацетил-Ь-фенилаланина. с_В представляет собой остаток Ό-цистеина.

В одном из вариантов изобретения с_А представляет собой остаток Ό-глутамата или лизина.

В одном из вариантов изобретения с_М обозначает остаток пара-4-ацетил-Ь-фенилаланина.

В одном из вариантов изобретения X способен к расщеплению при помощи матриксной металлопротеиназы.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность, которая способна к расщеплению при помощи ММР2, ММР7, ММР9 или ММР14. X содержит аминокислотную последовательность, выбранную из

РШЬАО, РГО-С(ше)АО, ΚΡΙΑΓΑΚδ, Ε8ΡΑΥΥΤΑ, ОРК8РЦ РРК8РЦ РТЦ]Л<к и РТЦи<(Ас).

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность Р1,01 .АС.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность РЬС-С(те)АС.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность КР1.А1.АГ8.

В одном из вариантов изобретения Э_А и Э_В означают Су5 и Су7.

- 1 030795

В одном из вариантов изобретения Ό_Α и Ό_Β означают Су5 и 1КОуе750.

В одном из вариантов изобретения Ό_Α и Ό_Β означают Су5 и 1КОуе800.

В одном из вариантов изобретения Ό_Α и Ό_Β означают Су5 и 1СО.

В одном из вариантов изобретения молекула формулы (I) представляет собой

δϋΜ-25.

В одном из вариантов изобретения ткань представляет собой раковую ткань молочной железы, ткань колоректального рака, ткань сквамозноклеточной карциномы, раковую ткань простаты, ткань меланомы или раковую ткань щитовидной железы.

В одном из вариантов изобретения ткань представляет собой раковую ткань молочной железы.

В одном из вариантов изобретения ткань представляет собой ткань колоректального рака.

В одном из вариантов изобретения образец ткани для визуализации рака, содержит (а) ткань и (Ь) молекулу формулы (I).

В одном из вариантов изобретения образец ткани представляет собой образец, помещённый на слайд, или срез для определения патологии.

В одном из вариантов изобретения ткань является раковой тканью.

В одном из вариантов изобретения раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы, раковую ткань колоректального рака, ткань сквамозноклеточной карциномы, раковую ткань простаты, ткань меланомы или раковую ткань щитовидной железы.

В одном из вариантов изобретения раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы.

В одном из вариантов изобретения раковая ткань представляет собой раковую ткань колоректального рака.

В одном из вариантов изобретения молекулу формулы (I) применяют для доставки пары визуализирующих агентов в раковую ткань, включая приведение раковой ткани в контакт с указанной молекулой.

В одном из вариантов раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы.

В одном из вариантов раковая ткань представляет собой раковую ткань колоректального рака.

В одном из вариантов изобретения молекулу формулы (I) применяют для визуализации раковой ткани у субъекта, нуждающегося в этом, при этом применение включает:

ί) введение субъекту указанной молекулы и ίί) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

В одном из вариантов раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы, раковую ткань колоректального рака, ткань сквамозноклеточной карциномы, раковую ткань простаты, ткань меланомы или раковую ткань щитовидной железы.

В одном из вариантов хирургическое поле, окружающее раковую ткань, уменьшается.

В одном из вариантов изобретения молекула формулы представляет собой молекулу формулы (I) 8ΌΜ-25

8ΌΜ-25.

Перечень фигур

На фиг. 1 показаны результаты действия молекулы для селективной доставки (8ΌΜ), показаны флуоресцентные изображения 3 различных мышей, получивших инъекцию 8ΌΜ-6. Изображения получали через 2 ч после инъекции. Опухолевая ткань и контрлатеральная ткань, использовавшиеся для оп- 2 030795 ределения контраста, показаны на правом изображении. Средняя величина контраста для трёх мышей была равна 1.1.

На фиг. 2 показаны логометрические изменения интенсивности флуоресценции молекул для селективной доставки. На этой фигуре показаны результаты отщепления 8ΌΜ-9 при помощи 1 нМ фермента ΜΜΡ-2. Увеличение интенсивногсти флуоресценции донора (левая панель) и уменьшение интенсивности флуоресценции акцептора (правая панель) свидетельствует об уменьшении РКЕТ (резонансного переноса энергии флуоресценции) после отщепления пептида.

На фиг. 3 показано усиление интенсивности флуоресценции молекул для селективной доставки после отщепления при помощи протеазы. Отщепление 8ΌΜ-10 осуществляли с помощью 1 нМ фермента ΜΜΡ-9 в физиологическом растворе, содержащем буферное вещество. Флуоресценция метки Су5 увеличивается более чем в 100 раз после отщепления пептида, так как гасители флуоресценции больше не присоединены внутримолекулярно к Су5 и не могут более гасить флуоресценцию Су5.

На фиг. 4 показано усиление интенсивности флуоресценции молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-10 после отщепления гомогенатов опухоли. Молекула для селективной доставки 10 (8ΌΜ-10) отщеплялась гомогенатами опухоли НТ-1080. 1 нМ ΜΜΡ-9 или 10 мкл гомогенатов опухолевой ткани (ТН2 и ТН3) смешивали с 1 мкМ соединения 13 в 100 мкл буферного раствора в течение 24 ч при температуре 37°С. ΟΜ6001 представляет собой общий ингибитор ΜΜΡδ с широким спектром действия.

Контрольная полоса содержит 8ΌΜ-6, которая в интактной, не отщеплённой форме характеризуется сильной флуоресценцией, которая проявляется на поверхности геля. Не отщепленная молекула 8ΌΜ10 получилась из-за эффективного гашения (вторая колонка слева). После отщепления, осуществляемого при помощи ΜΜΡ-9, гашение флуоресценции фрагмента, содержащего флуорофор, прекращается (появляется сильная флуоресценция) и флуоресценция проявляется в нижней части геля. Как показано на примере геля, гомогенаты опухолей отщепляют также 8ΌΜ-10 с получением продукта с сильной флуоресценцией. Эта реакция блокируется ингибитором ΜΜΡ, свидетельствуя о том, что отщепление обусловлено ΜΜΡδ, ассоциируемыми с опухолью.

На фиг. 5 показано биораспределение трёх флуоресцентных соединений через 6 ч после введения (IV) в хвостовую вену 2.9 нмоль каждого соединения. 8ΌΜ-6 характеризуется в 5 раз более высоким распределением в опухоли по сравнению с 8ΌΜ-1 и 8ΌΜ-2. Молекулы для селективной доставки 1 и 2 содержат одинаковое количество остатков глутамата и аргинина, что приводит к образованию нейтрального ядра-сетки, в то время как 8ΌΜ-6 содержит заряд 3+ благодаря наличию более положительно заряженных аргининов.

На фиг. 6 показана визуализация отношения эмиссии РКЕТ для определения наличия рака в лимфоузлах мыши. Это отношение эмиссии получали, используя уравнение 2, где Ехр1=0.7 с, Ехр2=4.1 с и к=20. Правая панель показывает изображение в формате, который свидетельствует о сильном контрасте между метастатическим узлом (очень большой лимфоузел, обозначенный нижней левой тёмной стрелкой) и неметастатическими лимфоузлами (другие стрелки). Более высокое отношение показано в виде более светлых элементов (метастатические) по сравнению с более тёмными элементами неметастатических лимфоузлов.

На фиг. 7 показаны результаты ех νίνο определения активности тканей мыши. 8ΌΜ-23 инкубировали вместе с активированными гомогенатами опухолевой ткани и нормальными гомогенатами ткани мышц бедра. Ферментативная активность тканей привела к отщеплению 8ΌΜ-23 и к большому увеличению РКЕТ (меченая первичная опухоль). Это увеличение было результатом отщепления 8ΌΜ. Нормальная мышечная ткань не отщепляла 8ΌΜ-23.

На фиг. 8 показаны результаты ех νίνο определения активности тканей человека с помощью коэффициента эмиссии РКЕТ. 8ΌΜ-25 инкубировали вместе с образцами гомогенатов нормальной ткани груди человека и раковой тканью груди человека (\УО2808. ^02821, \УЭ2815. ^02817, \УЭ2824). Было установлено, что ферментативная активность и отщепление 8ΌΜ-25 значительно больше в раковой ткани груди человека, чем в нормальной ткани груди человека (данные с ошибками).

На фиг. 9 показаны величины коэффициента эмиссии РКЕТ, полученные при проведении ех νίνο анализа человеческой ткани. 8ΌΜ-25 и 8ΌΜ-32 инкубировали вместе с образцом нормальной здоровой ткани груди человека (^02823) и раковой ткани груди человека (^02808, ^02815). Было установлено, что ферментативная активность и отщепление 8ΌΜ значительно больше в раковой ткани груди человека, чем в нормальной ткани груди человека.

На фиг. 10 приведены величины коэффициента эмиссии РКЕТ на примере положительных и отрицательных лимфоузлов в модели метастатического лимфоузла мыши, который был обработан 8ΌΜ-24. Узлы считались или положительными, или отрицательными на основе анализа окрашивания Н&Е патологом.

На фиг. 11 приведена кривая КОС, полученная путём изменения пороговой величины, использованной для определения или положительного, или отрицательного прогноза образования метастазов по отношению коэффициента эмиссии с использованием 8ΌΜ-24 в модели метастатического лимфоузла. Эти данные показывают высокую чувствительность и специфичность при диагностике злокачественных и здоровых лимфоузлов.

- 3 030795

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Молекулы для селективной доставки позволяют осуществить нацеленную доставку терапевтических агентов и/или визуализирующих агентов в конкретные клетки и/или в конкретные ткани. Согласно некоторым вариантам молекулы для селективной доставки включают (а) последовательность молекулярного переноса или удержания (часть В), (б) по меньшей мере один фрагмент доставки (часть Ό), связанную с частью А, В или X, (в) линкер X и (г) макромолекулярный носитель и (д) последовательность кислой аминокислоты (часть А), которая эффективна при ингибировании или предотвращении поглощения клетками или удержании тканей.

Согласно некоторым вариантам отщепление линкера X, которое приводит к отделению части А от части В, эффективно при поглощении или удержании части В и присоединённого сагдо клетками и тканью.

Однако молекулы для селективной доставки могут подвергаться быстрому фармакокинетическому клиренсу с коротким периодом полужизни в плазме, широким распределением и медленным вымыванием из многих нецелевых тканей с неспецифическим поглощением. Таким образом, существует необходимость в молекуле для селективной доставки с повышенной ίη νίνο циркуляцией, накоплением в целевой ткани относительно нецелевых тканей, модулированной селективностью. В случае визуализирующих агентов существует необходимость в повышении контраста в целевой ткани по сравнению с фоновой тканью.

Некоторые определения.

В данной заявке применяемые термины имеют следующие значения, если не указано иное.

Применяемый термин целевая (прицельная) молекула относится к любому агенту (например, пептиду, белку, полимеру нуклеиновой кислоты, аптамеру или малой молекуле), который связывается (например, присоединяется) к мишени, представляющей интерес. Мишенью, представляющей интерес, может быть ткань, клетка, клеточная структура (например, органелла), белок, пептид, полисахарид или полимер нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам целевая молекула представляет собой любой агент, который ассоциируется (например, связывается с одной или более раковыми клетками субъекта).

Используемые в данной заявке термины полипептид, пептид и белок применяются как взаимозаменяемые и относятся к остаткам полимера аминокислоты. Эти термины относятся к полимерам аминокислот природного происхождения, а также к полимерам аминокислот, в которых один или более остатков аминокислот представляют собой остатки аминокислоты неприродного происхождения (например, аналог аминокислоты). Эти термины охватывают цепи аминокислот любой длины, включая белки полной длины (а именно, антигены), в которых остатки аминокислот связаны ковалентными пептидными связями. Применяемый в данной заявке термин пептид относится к аминокислотным остаткам полимера, длина которых включает от 2 до примерно 50 остатков. Согласно некоторым вариантам пептид содержит от примерно 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 или 11 остатков до примерно 50, 45, 40, 45, 30, 25, 20 или 15 остатков. Когда в данной заявке приведена аминокислотная последовательность, она подразумевает как Ь-, Ό- или бета-аминокислотные версии последовательности, так и ретро-, инверсионные и ретроинверсионные изоформы. Пептиды включают также полимерные аминокислоты, в которых один или более аминокислотных остатков являются искусственным химическим аналогом соответствующей аминокислоты природного происхождения, а также полимерные аминокислоты природного происхождения. Кроме того, этот термин относится к аминокислотам, соединённым пептидными связями или другими модифицированными связями (например, когда пептидная связь замещена а-эфирной, β-эфирной, тиоамидной, фосфонамидной, карбаматной, гидроксилатной группами и т.п. (см., например, 8ра1о1а, (1983) Скет. Вюскет. Лтто Аабк апб РгоЮиъ 7: 267-357), где амид замещён насыщенным амином (см., например, 8кг1е5 е1 а1., патент США № 4496542, который включён в данную заявку путём отсылки, и публикацию КакепЬгопп е1 а1. (1990) рр. 969-970 ίη Ргос. 11'¹' Лтепсап Рерббе §утро8шт, Е8СОМ §с1епсе РиЬкккегк, Тке №1кег1апб8, и т.п.).

Термин аминокислота относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые действуют как природные аминокислоты. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также такие аминокислоты, которые позже были модифицированы, например гидроксипролин, γкарбоксиглутамат и О-фосфосерин. Термин аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют ту же основную химическую структуру, что и природные аминокислоты, то есть когда а-углерод соединён с водородом, с карбоксильной группой, аминогруппой и группой К, например гомосерин, норлейцин, сульфоксид метионина. Такие аналоги содержат модифицированные группы К (например, норлейцин) или модифицированные основные цепи пептида, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и природные аминокислоты. Миметики аминокислот представляют собой химические соединения, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые действуют способом, похожим на действие природных аминокислот. Аминокислоты могут быть Ό-аминокислотами или Ь-аминокислотами.

- 4 030795

В данной заявке аминокислоты могут быть обозначены общеизвестными трёхбуквенными символами или однобуквенными кодами, которые рекомендованы комиссией ШРЛС-ШВ ВюсНетюа1 Иотепс1а(игс Сотпиккюп. Нуклеотиды также могут обозначаться однобуквенными кодами.

Специалисту в данной области хорошо известно, что индивидуальные замещения, делеции или добавления в аминокислотную последовательность пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшое количество аминокислот в кодированной последовательности представляют собой консервативно модифицированный вариант, где изменение приводит к замещению аминокислоты химически подобными аминокислотами.

Таблицы, показывающее консервативное замещение, хорошо известны в уровне техники. Такие консервативно модифицированные варианты дополняются полиморфными вариантами и не исключают межвидовых гомологов и аллелей по изобретению.

Используемый в данной заявке термин метка относится к молекуле, которая облегчает визуализацию и/или обнаружение целевой молекулы, описанной в данной заявке. Согласно некоторым вариантам метка представляет собой флуоресцентное вещество.

Выражение специфически связывает, когда оно относится к взаимодействию между нацеленной молекулой, описанной в данной заявке, и мишенью (например, очищенным белком, раковыми клетками или раковой тканью, опухолью или метастатическим повреждением, метастазами или лимфоузлом или метастатическим лимфоузлом), относится к образованию связи с высокой аффинностью между нацеленной молекулой и мишенью. Кроме того, этот термин означает, что нацеленная молекула обладает низкой аффинностью к молекулам, не являющимся мишенями.

Термины селективное связывание селективность и т.п. относится к предпочтению агента к взаимодействию с одной молекулой по сравнению с другой молекулой. Предпочтительно, когда взаимодействия между нацеленной молекулой, описанной в данной заявке, и мишенью являются как специфическими, так и селективными. Следует заметить, что согласно некоторым вариантам такой агент получен для того, чтобы специфически связывать две отличающиеся, но всё же похожие мишени без связывания с другими нежелательными мишенями.

Термины индивидуум, пациент или субъект применяются как взаимозаменяемые. В данной заявке они означают любое млекопитающее (то есть виды любой группы, члены семейств и рода в таксонометрической классификации животные: хордовые: позвоночные: млекопитающие). Согласно некоторым вариантам млекопитающее является человеком. Ни один из этих терминов не ограничен и не требует ограничения ситуацией, характеризующейся наблюдением (5ирегу15юп) (например, постоянным или периодическим) работника здравоохранения (например, врача, дипломированной медицинской сестры, младшей медицинской сестры, фельдшера, санитара или работника хосписа.

Термины вводить, введение и т.п., применяемые в данной заявке, относятся к способам, которые могут быть использованы для обеспечения доставки агентов или композиций в желаемое место биологического действия. Эти способы включают, но без ограничения, парентеральную инъекцию (например, внутривенную, подкожную, интраперитонеальную, внутримышечную, внутрисосудистую, интратекальную, интравитреальную инъекцию, инфузию или локальную инъекцию). Процедура введения, которая обычно применяется для введения агентов, и методы введения, применяемые в данной заявке, описаны, например, в публикации Сообтап апб Сбтап, ТНе РНагтасо1одюа1 Вак15 оГ ТНегареибск, сштет еб.; Регдатоп; и КеттдЮп'к, РНаттасеибса1 Заепсек (сиггет ебйюп), Маск РиЬНкЫпд Со., Еак!оп, Ра.

Термин фармацевтически приемлемый, используемый в данной заявке, относится к материалу, который не устраняет биологическую активность или свойства агентов, описанных в данной заявке, и является относительно нетоксичным (то есть преимущества материала значительно перевешивают токсичность материала). В некоторых случаях фармацевтически приемлемый материал может вводиться индивидууму и не вызывать значительных нежелательных биологических эффектов или не вызывать неблагоприятного результата при взаимодействии с любым компонентом композиции в которой он содержится.

Используемый в данной заявке термин хирургия относится к любому способу, который может быть применён для исследования, манипуляции, изменения или получения эффекта в ткани путём физического вмешательства. Эти способы включают, но без ограничения, открытое оперативное вмешательство, эндоскопическую хирургию, лапароскопию, минимально инвазивную хирургию, роботизированную хирургию и любую процедуру, которая может действовать на раковую ткань, такую как резекция опухоли, аблация раковой ткани, стадирование рака, диагностику рака, стадирование лимфоузлов, обнаружение сигнальных лимфоузлов или лечение ракового заболевания.

Термин хирургия под контролем, используемый в данной заявке, относится к любой хирургической процедуре, когда хирург использует визуализирующий агент для контроля хирургического вмешательства.

Применяемый в данной заявке термин рак относится к любой болезни, включающей неконтролируемый рост или пролиферацию клеток в человеческом организме. Рак характеризуется также способностью клеток мигрировать из первоначального очага и распространяться в отдалённые участки (то есть метастазировать). В число видов рака входят саркомы, карциномы, лимфомы, лейкоз, бластомы или опу- 5 030795 холи зародышевых клеток. Рак может развиться во многих тканях, включая, но без ограничения, лёгкое, грудь, яичники, ободочную кишку, пищевод, прямую кишку, кости, простату, мозг, поджелудочную железу, мочевой пузырь, почку, печень, кровяные клетки, лимфоузлы и желудок.

Молекулы для селективной доставки.

Изобретение предусматривает молекулу для селективной доставки, имеющую формулу I [Ό а- с а] - А- [ см-М] -Х-В - [ с_в -Όβ ] формула I, где X представляет собой пептидный линкер, который способен к расщеплению при помощи протеазы;

с_А, с_в и с_М, каждый независимо, представляет собой остаток аминокислоты;

Ό_α и И_в представляют собой пару акцепторной и донорной флуоресцентных частиц, между которыми возможен флуоресцентный резонансный перенос энергии по механизму Фёрстера; и где [с_М-М] присоединён в любом положении к X, [И_А-с_А] присоединён к любой аминокислоте в А и [с_в-О_в] присоединён к любой аминокислоте в В, М представляет собой полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий среднюю молекулярную массу 500, 1000, 2000, 5000 или 10000 Да.

РЬОЬАО, РЬО-С(те)-АО, ЕРЬАЫУЕЗ, Ε3ΡΑΥΥΤΑ, ΌΡΕ3ΡΕ, РРЕЗРЬ, БЬСфКЕ и ЕГ0П<(Ас).

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность РЙ-ОЙ-АО.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность РЬО-С(ше)АО.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность ЕРГАЕМЕЗ.

В одном из вариантов изобретения Ό_α и Э_в означают Су5 и Су7.

В одном из вариантов изобретения Ό_α и Э_в означают Су5 и 1ЕОуе750.

В одном из вариантов изобретения Ό_α и Э_в означают Су5 и 1ЕЭуе800.

В одном из вариантов изобретения Ό_α и Э_в означают Су5 и 1СО.

3ΌΜ-25.

Визуализирующие агенты.

Согласно некоторым вариантам визуализирующий агент представляет собой краситель. Согласно некоторым вариантам визуализирующий агент представляет собой флуоресцентный фрагмент. Согласно некоторым вариантам флуоресцентный фрагмент выбран из: флуоресцентного пептида, флуоресцентного красителя, флуоресцентного материала или их комбинации.

Все флуоресцентные группы охватываются термином флуоресцентный фрагмент. Конкретные примеры флуоресцентных фрагментов, приведённые в данной заявке, не ограничивают флуоресцентные вещества, которые можно применять с нацеленными молекулами, описанными в данной заявке.

Примеры флуоресцентных красителей включают, но без ограничения, ксантены (например, родамины, родолы и флуоресцеины и их производные); биманы; кумарины и их производные (например, умбеллиферон и аминометилированные кумарины); ароматические амины (например, дансил, скваратные красители); бензофураны; флуоресцентные цианины; индокарбоцианины; карбазолы; дицианометиленпираны; полиметин; оксабензантран; ксантен; пирилий; карбостил; перилен; акридон; хинакридон; рубрен; антрацен; коронен; фенантрецен; пирен; бутадиен; стильбен; порфирин; фталоцианин; хелатные

- 6 030795 комплексы лантанидных металлов; хелатные комплексы редкоземельных металлов; а также производные таких красителей.

Примеры флуоресцентных красителей включают, но без ограничения, 5-карбоксифлуоресцеин, флуоресцеин-5-изотиацианат, флуоресцеин-6-изотиацианат и 6-карбоксифлуоресцеин.

Примеры родаминовых красителей включают, но без ограничения, тетраметилродамин-6изотиоцианат, 5-карбокситетраметилродамин, производные 5-карбоксиодола, тетраметил- и тетраэтилродамин, дифенилдиметил- и дифенилдиэтилродамин, динафтилродамин и родамина 101 сульфонилхлорид (продаваемый под названием ТЕХА8 КЕБ®).

Примеры цианиновых красителей включают, но без ограничения, Су3, СуЗВ, Су3.5, Су5, Су5.5, Су7, 1КБУЕ680, А1еха Р1иог 750, 1КБуе800СА, 1СО.

Примеры флуоресцентных пептидов включают ОРР (зелёный флуоресцентный белок) или производные СРР (например, ЕБРР, ЕВРР2, азурит, тКа1ата1, ЕСРР, лазурь, СуРе1, УРР, цитрин, Уеиик, УРе1).

Флуоресцентные метки обнаруживаются любым подходящим способом. Например, флуоресцентная метка может быть обнаружена путём возбуждения флуорохрома светом с соответствующей длиной волны и выявления возникающей флуоресценции, например, под микроскопом, при визуальном наблюдении, с помощью фотоплёнки, с применением электронных детекторов, таких как приборы с зарядовой связью (ССБк), фотоэлектрических умножителей и т.п.

Согласно некоторым вариантам в визуализирующий агент вводят метку: позитронно-активный изотоп (например, ¹⁸Р) для позитронно-эмиссионной томографии (РЕТ), гамма-активный изотоп (например, ^99тТс) для однофотонной эмиссионной томографии (8РЕСТ) или парамагнитную молекулу или наночастицу (например, хелат Сб³⁺ или наночастицу с покрытием из магнетита) для магнитной резонансной томографии (МК1).

Согласно некоторым вариантам в визуализирующий агент вводят в качестве метки хелат гадолиния, частицы оксида железа, супермагнитные частицы оксида железа, ультрамелкие парамагнитные частицы, хелат марганца или агент, содержащий галлий.

Примеры хелатов гадолиния включают, но без ограничения, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (БТРА), 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (БОТА) и 1,4,7-триазациклононан-Д,№,№'-триуксусную кислоту (ДОТА).

Согласно некоторым вариантам визуализирующий агент представляет собой флуорофор для работы в ближней ИК-области спектра, люциферазу (люциферазу светлячка, бактериальную люциферазу или люциферазу кишечнополостных) или другую люминесцентную молекулу для биолюминесцентного изображения или пузырьки, наполненные перфторуглеводородом для ультразвукового метода.

Согласно некоторым вариантам визуализирующий агент представляет собой ядерный зонд. Согласно некоторым вариантам визуализирующий агент представляет собой радионуклидный зонд для 8РЕСТ или РЕТ. Согласно некоторым вариантам визуализирующий агент выбран из хелата технеция, хелата меди, радиоактивного фтора, радиоактивного йода и хелата индия.

Примеры хелатов Тс включают, но без ограничения, ΗΥΝΙΟ БТРА и БОТА. Согласно некоторым вариантам визуализирующий агент содержит радиоактивный фрагмент, например радиоактивный изотоп, такой как ²¹¹А1, ¹³¹Ι, ¹²⁵Ι, ⁹⁰Υ, ¹⁸⁶Ке, ¹⁸⁸Ке, ¹⁵³ 8т, ²¹²Βί, ³²Р, ⁶⁴Си, радиоактивные изотопы Ьи и другие изотопы.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки формулы Ι, содержащая визуализирующий агент, применяется в хирургии под визуализационным контролем. Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки предпочтительно локализуется в раковых или других нежелательных тканях (то есть в некротических тканях). Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки формулы Ι, содержащая визуализирующий агент, применяется в хирургии под визуализационным контролем для удаления опухоли в случае колоректального рака. Согласно некоторым вариантам при хирургии под визуализационным контролем применение молекул для селективной доставки даёт возможность хирургу вырезать как можно меньший участок здоровой (то есть незлокачественной) ткани. Согласно некоторым вариантам при хирургии под визуализационным контролем применение молекул для селективной доставки даёт возможность хирургу видеть и вырезать больший участок канцерогенной ткани, чем он был бы способен вырезать в отсутствие молекул для селективной доставки. Согласно некоторым вариантам такая хирургия проводится под флуоресцентным контролем.

Макромолекулярные носители.

Термин 'носитель' означает инертную молекулу, которая модулирует период полужизни в плазме крови, растворимость или биораспределение. Согласно некоторым вариантам носитель модулирует период полужизни в плазме крови молекулы для селективной доставки, описанной в данной заявке. Согласно некоторым вариантам носитель модулирует растворимость молекулы для селективной доставки, описанной в данной заявке. Согласно некоторым вариантам носитель модулирует биораспределение молекулы для селективной доставки, описанной в данной заявке.

Согласно некоторым вариантам носитель снижает степень поглощения молекулы для селективной доставки клетками или тканями, не являющимися мишенями. Согласно некоторым вариантам носитель

- 7 030795 снижает степень поглощения молекулы для селективной доставки хрящами. Согласно некоторым вариантам носитель снижает степень поглощения молекулы для селективной доставки суставами, связанными с тканью-мишенью.

Согласно некоторым вариантам носитель повышает степень поглощения молекулы для селективной доставки клетками или тканями, являющимися мишенями. Согласно некоторым вариантам носитель снижает степень поглощения молекулы для селективной доставки печенью, когда рядом расположена ткань-мишень. Согласно некоторым вариантам носитель снижает степень поглощения молекулы для селективной доставки почками. Согласно некоторым вариантам носитель способствует поглощению молекулы для селективной доставки раковой тканью. Согласно некоторым вариантам носитель способствует поглощению молекулы для селективной доставки в лимфатических каналах и/или лимфоузлах.

Согласно некоторым вариантам носитель увеличивает период полужизни в плазме крови путём уменьшения клубочковой фильтрации.

Согласно некоторым вариантам носитель модулирует период полужизни в плазме крови путём увеличения или уменьшения метаболизма или разложения протеазой.

Согласно некоторым вариантам носитель увеличивает поглощение опухолью благодаря увеличенным проницаемости и удерживанию (ЕРК) сосудистой сети опухоли.

Согласно некоторым вариантам носитель увеличивает растворимость молекул для селективной доставки в воде.

Согласно некоторым вариантам любой Μ независимо соединён непосредственно или косвенно (например, через с_М) с_А, В или X.

Согласно некоторым вариантам любой Μ независимо соединён с_А через Ν-концевой полиглутамат.

Согласно некоторым вариантам любой Μ независимо соединён с_А (или Ν-концевым полиглутаматом) ковалентной связью.

Согласно некоторым вариантам любой Μ независимо соединён с_В через С-концевой полиаргинин.

Согласно некоторым вариантам любой Μ независимо соединён с_В (или С-концевым полиаргинином) ковалентной связью.

Согласно некоторым вариантам любой Μ независимо соединён непосредственно или косвенно с линкерами между X и А, X и В, В и СГО-концами и А и СГО-концами.

Согласно некоторым вариантам ковалентная связь представляет собой эфирную связь, тиоэфирную связь, аминную связь, амидную связь, оксимную связь, углерод-углеродную связь, углерод-азотную связь, углерод-кислородную связь или углерод-серную связь.

Согласно некоторым вариантам Μ выбирают из белка, синтетического или природного полимера, а также дендримера.

Согласно некоторым вариантам Μ выбирают из декстрана, полиэтиленгликоля (РЕС) (например, РЕС с молекулярным весом 5 кДа, РЕС с молекулярным весом 12 кДа, РЕС с молекулярным весом 20 кДа, РЕС с молекулярным весом 30 кДа и РЕС с молекулярным весом 40 кДа), альбумина или их комбинации.

Согласно некоторым вариантам Μ представляет собой РЕС.

Согласно некоторым вариантам Μ имеет молекулярный вес между 50 и 70 кДа.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с альбумином.

Согласно некоторым вариантам альбумин получен из клубочкового фильтрата при нормальных физиологических условиях.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки содержит реакционноспособную группу, такую как мальимидная группа, которая может образовать ковалентный конъюгат с альбумином. Молекула для селективной доставки, содержащая альбумин, приводит к увеличенному накоплению отщеплённых молекул для селективной доставки в опухолях в зависимости от степени отщепления.

Согласно некоторым вариантам конъюгаты альбумина обладают хорошими фармакокинетическими свойствами.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с РЕС.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с РЕС с молекулярным весом 5 кДа. Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с РЕС с молекулярным весом 12 кДа.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с РЕС с молекулярным весом 20 кДа.

Согласно некоторым вариантам РЕС с молекулярным весом 30 кДа имеет более продолжительный период полужизни по сравнению со свободными пептидами.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с РЕС с молекулярным весом 20-40 кДа, который характеризуется печёночным или почечным клиренсом.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с декстраном.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с декстраном с молекулярным весом 70 кДа.

Согласно некоторым вариантам конъюгаты декстрана являются смесью олигомеров с различными

- 8 030795 молекулярными весами и их трудно синтезировать и очищать воспроизводимо.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена со стрептавидином.

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки соединена с дендримером пятого поколения РАМАМ.

Согласно некоторым вариантам носитель является блокированным.

Согласно некоторым вариантам блокирование носителя улучшает фармакокинетику и уменьшает цитотоксичность носителя за счёт добавления гидрофильности.

Согласно некоторым вариантам блокирующий агент выбран из: ацетильной группы, сукцинильной группы, 3-гидроксипропионильной группы, 2-сульфобензоильной группы, глицидильной группы, РЕС-2, РЕО-4, РЕС-8 и РЕС-12.

Часть X (линкеры).

Согласно некоторым вариантам линкер, состоящий из одной или более аминокислот, используется для соединения пептидной последовательности А (а именно, последовательности, предназначенной для ингибирования действия по доставке пептида В), и пептидной последовательности В.

Обычно пептидный линкер не будет обладать специфической биологической активностью, отличающейся от активности присоединения молекулы или сохранения некоторого минимального расстояния или другого пространственного отношения между ними. Однако аминокислоты, составляющие линкер, могут быть выбраны так, чтобы они влияли на некоторое свойство молекулы, в том числе свёртывание, заряд сетки или гидрофобность.

В живых клетках интактная молекула для селективной доставки, описанная в данной заявке, будет неэффективной для отщепления X в здоровых клетках, так как часть А. предотвращая проникновение в клетку, будет неэффективно расщепляться внутриклеточными ферментами в здоровых клетках, потому что она не будет поглощаться и не будет получать доступ к таким внутриклеточным ферментам. Молекула для доставки, описанная в данной заявке, может быть неспособной к попаданию в клетку из-за наличия части А. Однако, когда клетка повреждена или больна (например, канцерогенные клетки, гипоксические клетки, ишемические клетки, апоптотические клетки, некротические клетки), такие внутриклеточные ферменты просачиваются из клетки и будет происходить отщепление А. что позволяет части в или группе для доставки попасть в клетку, повышая прицельную доставку части В и/или группы для доставки Ό в соседние клетки.

Согласно некоторым вариантам X отщепляется во внеклеточном пространстве.

Согласно некоторым вариантам тот факт, что капилляры часто пропускают жидкость вокруг опухолей и других травмированных участков, что повышает способность молекул с высоким молекулярным весом (то есть молекул с молекулярным весом около 30 кДа или более), попадать в интерстициальный компартмент.

Согласно некоторым вариантам клетки линкера X. которые не экспрессируют релевантную протеазу, но которые расположены непосредственно рядом с экспрессирующими клетками, подцепляют группы доставки из молекулы для селективной доставки, потому что сцепление линкера X обычно происходит во внеклеточном пространстве.

Согласно некоторым вариантам такое неспецифическое нацеливание благоприятно при лечении опухолей из-за гетерогенности клеточных фенотипов и стремления уничтожить как можно больше подозрительных клеток.

Согласно некоторым вариантам X является отщепляемым линкером.

Согласно некоторым вариантам X является гибким.

Согласно некоторым вариантам X является жёстким.

Согласно некоторым вариантам линкер имеет линейную структуру.

Согласно некоторым вариантам линкер имеет нелинейную структуру.

Согласно некоторым вариантам линкер имеет разветвлённую структуру.

Согласно некоторым вариантам линкер имеет циклическую структуру.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет от примерно 5 до примерно 30 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 6 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 8 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 10 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 12 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 14 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 16 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 18 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 20 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 25 атомов.

Согласно некоторым вариантам длина X составляет примерно 30 атомов.

Согласно некоторым вариантам линкер соединяет пептидную часть А (то есть пептидную последовательность, которая предотвращает клеточное поглощение) в пептидной частью В (то есть последовательностью, отвечающей за доставку) при помощи ковалентной связи.

- 9 030795

Согласно некоторым вариантам ковалентная связь является эфирной связью, тиоэфирной связью, аминной связью, амидной связью, оксимной связью, гидразонной связью, углерод-углеродной связью, углерод-азотной связью, углерод-кислородной связью или углерод-серной связью.

Согласно некоторым вариантам X содержит пептидную группу. Пептидная группа состоит из Ьаминокислот и/или Ό-аминокислот.

Согласно некоторым вариантам Ό-аминокислоты являются предпочтительными для того, чтобы свести к минимуму иммуногенность и неспецифическое расщепление неспецифических пептидаз или протеаз.

Известно, что клеточное поглощение последовательностей олиго-О-аргинина такое же эффективное как поглощение олиго- Ь-аргининов или лучше.

Согласно некоторым вариантам линкер X предназначен для расщепления в особых условиях или в конкретной среде. Согласно предпочтительным вариантам линкер X расщепляется в физиологических условиях. Расщепление такого линкера X может быть ускорено при помощи особых патологических сигналов или конкретной среды относительно клеток, в которые желательно доставить группы для доставки. Получение линкера X для расщепления в специфических условиях, например, с помощью специфического фермента, позволяет добиться прицельного клеточного поглощения в специфическом месте, где получаются такие условия. Таким образом, одним из ключевых способов специфического нацеливания клеточного поглощения при помощи молекул для селективной доставки желаемыми клетками, тканями или участками является получение линкерной части X, которая отщепляется при условиях, имеющихся вблизи таких клеток, тканей или участков, являющихся мишенями.

Согласно некоторым вариантам X представляет собой линкер, чувствительный к величине рН.

Согласно некоторым вариантам X расщепляется при основных значениях рН.

Согласно некоторым вариантам X расщепляется при кислых значениях рН.

Согласно некоторым вариантам X расщепляется протеазой, матриксной металлопротеиназой или их комбинацией.

Согласно некоторым вариантам X расщепляется восстановительным агентом.

Согласно некоторым вариантам X расщепляется ММР. Гидролитическая активность матриксных металлопротеиназ (ММР) органически связана с инвазивной миграцией клеток метастатической опухоли. В некоторых случаях ММР обнаруживаются вблизи сайтов воспаления. В некоторых случаях ММР обнаруживаются вблизи места апоплексического инсульта (то есть расстройства, характеризующегося повреждением мозга, сопровождающимся уменьшением поступления потока крови).

Таким образом, поглощение молекул, обладающими признаками согласно изобретению, способно направлять клеточное поглощение групп для доставки (по меньшей мере одного фрагмента Ό) специфическими клетками, тканями или участками, содержащими активные ММРк во внеклеточном окружении. Согласно некоторым вариантам линкер X включает аминокислотные последовательности РЬО-С(Ме)ЛО (§ЕЦ ГО N0: 1), РЕОЬЛО (§ЕЦ ГО N0: 2), которые расщепляются ферментами металлопротеиназами ММР-2, ММР-9 или ММР-7 (ММР8, участвующими в развитии рака и воспаления).

Согласно некоторым вариантам линкер X расщепляется протеолитическими ферментами или в присутствии восстановителя в окружающей среде, что может быть обнаружено вблизи раковых клеток. Такое окружение или такие ферменты обычно не обнаруживаются вблизи нормальных клеток.

Согласно некоторым вариантам X расщепляется серин-протеазами, включая, но без ограничения, тромбин.

Согласно некоторым вариантам X расщепляется в тканях или вблизи тканей, страдающих от гипоксии. Согласно некоторым вариантам расщепление в гипоксичных тканях или вблизи них способствует нацеливанию на раковые клетки и раковые ткани, участки, поражённые инфарктом, и другие гипоксичные участки.

Согласно некоторым вариантам X содержит дисульфидную связь.

Согласно некоторым вариантам линкер X, содержащий дисульфидную связь, предпочтительно отщепляется в гипоксичных участках и таким образом нацеливает доставку групп для доставки в клетки на таком участке. Полагают, что гипоксия вызывает большую стойкость раковых клеток к облучению и химиотерапии, а также инициирует ангиогенез. В гипоксичном окружении в присутствии, например, пропускающих жидкость клеток или некротических клеток, свободные тиолы и другие восстанавливающие агенты становятся доступными вне клеток, в то время как О2 обычно поддерживает окисление во внеклеточной среде и по определению распадается.

Согласно некоторым вариантам этот сдвиг в окислительно-восстановительном балансе, ускоряет восстановление и расщепление дисульфидной связи в линкере X. В дополнение к дисульфидным связям, которые являются преимущественными при тиол-дисульфидном равновесии, в линкере X, сконструированном таким образом, чтобы он отщеплялся в гипоксичной среде, применяются группы, включающие хинонные группы, которые распадаются при восстановлении до гидрохинонов.

Согласно некоторым вариантам линкер X расщепляется в некротической среде. Некроз часто приводит к высвобождению ферментов или других компонентов клетки, которые могут быть использованы для запуска отщепления линкера X.

- 10 030795

Согласно некоторым вариантам расщепление линкера X некротическими ферментами (например, калпаинами) позволяет группам для доставки поглощаться больными клетками и соседними клетками, которые ещё не стали полностью пропускать жидкость.

Согласно некоторым вариантам линкер X является лабильным в кислой среде.

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит ацетальную группу или группу винилового эфира. В участках повреждённой или гипоксичной ткани из-за сдвига Варбурга от окислительного фосфорилирования к анаэробному гликолизу и образования молочной кислоты наблюдается ацидоз.

Согласно некоторым вариантам ацидоз используется для запуска поглощения групп для доставки путём замены в В некоторых остатков аргинина остатками гистидина, которые становятся катионными только при величинах рН менее 7.

Следует иметь в виду, что линкер, описанный в данной заявке, может включать нестандартные аминокислоты, такие как, например, гидроксилизин, десмозин, изодесмозин или другие нестандартные аминокислоты. Линкер, описанный в данной заявке, может содержать модифицированные аминокислоты, в том числе, пост-трансляционно модифицированные аминокислоты, например метилированные аминокислоты (например, метилгистидин, метилированные формы лизина и т.п.), ацетилированные аминокислоты, амидированные аминокислоты, формилированные аминокислоты, гидроксилированные аминокислоты, фосфорилированные аминокислоты или другие модифицированные аминокислоты. Линкер, описанный в данной заявке, может также включать фрагменты пептидных миметиков, в том числе части, связанные непептидными группами, и аминокислоты, связанные неаминокислотными частями или присоединённые к ним.

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность, выбранную из

РЕОБАО (8ΕΟΙΡΝΟ:2), РЕО-С(ше)-АО (8ΕΟΙΡΝΟ:

1), КРЕАЕАКЗ (8ЕО ΙΡ N0: 7), Ε8ΡΑΥΥΤΑ (ЗЕО ГО N0: 8), ΌΡΚδΡΕ (ЗЕО ГО N0: 9),

РРКЗРЬ (8Е0 ГО N0: 10), ВЕрЬКЕ (8Е0 ГО N0: 11) и ВЕОЕК(Ас) (8Е0 ГО N0: 12).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность РЬОРАО (8Е0 ГО N0: 2).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность РЬОС(те)-АС (8Е0 ГО N0: 1).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность РБ-СхАС (8ЕС ГО N0: 27), где х обозначает остаток любой аминокислоты (природной или неприродной).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность КРЬАЬАК8 (8Е0 ГО N0: 7).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность Е8РААΥΤΑ (8ЕС ГО N0: 8).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность ΌΡΚ8ΡΕ (8Е0 ГО N0: 9).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность РРК8РБ (8Е0 ГО N0: 10).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность КБОБКБ (8Е0 ΙΌ N0: 11).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит аминокислотную последовательность КЕОЕК(Ас) (8ЕС ГО N0: 12).

Согласно некоторым вариантам линкер X содержит пептид, выбранный из РК(8/Т)(Б/1)(8/Т) (где буквы в скобках показывают, что любая одна из указанных аминокислот может быть в этом положении в последовательности)

ΟΟΑΑΝΕνΚθθ (ЗЕО ГО N0: 28); 3ΟΚΙΟΡΕΚΤΑ (8Е0 ГО N0: 29); ЗОКЗА (8Ε0ΙΡΝ0: 30); ОРЬО (8Е0

ГО N0: 31); АРАБ (8Е0 ГО N0: 32); РК; Р1С(Е1)Р-Р (8Е0 ГО N0: 33), где С(Е1) обозначает 8-этилцистеин (остаток цистеина с этильной группой, присоединённой к тиольной группе) и - обозначает типичный сайт расщепления в этой и последующих последовательностях);

ООРВСБРО (8Е0 ГО N0: 34); Н88КБС (8Е0 Π)ΝΟ: 35); БУБА-ЗЗЗРСРГ (8Е0 ГО N0:

36); 0ν8(}ΝΥ-Ρΐν0 (8Е0 ГО N0: 37); СУУОА-ЗСЕЕА (8Е0 ГО N0: 38); ί(Ρίρ)Κ-8, где ί обозначает остаток Ό-фенилаланина и Ρϊρ обозначает остаток пиперидинокарбоновой кислоты (пипеколиновой кислоты, аналог пролина, содержащий шестичленное кольцо);

□ЕУО (8Е0 ГО N0: 39). САЕНОС (8Е0 ГО N0: 40); КРЕАЕАК8 (8Е0 ГО N0: 7) или их комбинации.

Согласно некоторым вариантам X отщепляется в гипоксических условиях.

- 11 030795

Согласно некоторым вариантам X содержит остаток хинина.

Согласно некоторым вариантам X отщепляется в некротических условиях.

Согласно некоторым вариантам X содержит молекулу, отщепляющуюся под действием калпаина.

Согласно некоторым вариантам X содержит 6-аминогексаноил, 5-(амино)-3-оксапетаноил или их комбинацию.

Согласно некоторым вариантам линкер представляет собой алкил.

Согласно некоторым вариантам линкер представляет собой гетероалкил.

Согласно некоторым вариантам линкер представляет собой алкилен.

Согласно некоторым вариантам линкер представляет собой алкенилен.

Согласно некоторым вариантам линкер представляет собой алкинилен.

Согласно некоторым вариантам линкер представляет собой гетероалкилен.

Термин алкил относится к алифатической углеводородной группе. Алкил может быть насыщенным или ненасыщенным алкилом. В зависимости от структуры алкильная группа может быть монорадикалом или дирадикалом (то есть алкиленовой группой).

Алкил может содержать от 1 до 10 атомов углерода (где бы это не было указано, числовой интервал, такой как от 1 до 10, относится к каждому числу в этом интервале, например интервал от 1 до 10 атомов углерода означает, что алкильная группа может содержать 1 атом углерода, 2 атома углерода, 3 атома углерода и т. д. и может содержать 10 атомов углерода, хотя данное определение охватывает также случай, когда при приведении термина алкил не указывается количество атомов углерода).

Алкильная группа может быть также низшим алкилом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода. Алкильная группа в соединениях, описанных в данной заявке, может быть обозначена как С₁-С₄ алкил или подобным образом. Например, обозначение С₁-С₄ алкил показывает, что в алкильной цепи содержится один-четыре атома углерода, то есть алкильная группа выбрана из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Типичные алкильные группы включают, но без ограничения, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, гексил, этенил, пропенил, бутенил и т.п.

Согласно некоторым вариантам линкер содержит кольцевую структуру (например, арил). Применяемый в данной заявке термин кольцо относится к любой ковалентной циклической структуре. Кольца включают, например, карбоциклы (например, арилы и циклоалкилы), гетероциклы (например, гетероарилы и неароматические гетероциклы), ароматические группы (например, арилы и гетероарилы), и неароматические циклы (например, циклоалкилы и неароматические гетероциклы). Кольца могут быть замещенными. Кольца могут быть моноциклическими или полициклическими.

Применяемый в данной заявке термин арил относится к ароматическому кольцу, в котором каждый из атомов, образующих кольцо, является атомом углерода. Арильные кольца могут быть образованы пятью, шестью, семью, восемью, девятью или более чем девятью атомами углерода. Арильные группы могут быть замещёнными. Примеры арильных групп включают, но без ограничения, фенил, нафталинил, фенантренил, антраценил, флуоренил и инденил. В зависимости от структуры арильная группа может представлять собой монорадикал или дирадикал (то есть ариленовую группу).

Термин циклоалкил относится к моноциклическому или полициклическому неароматическому радикалу, в котором каждый из атомов, образующих кольцо (например, скелетных атомов), является атомом углерода. Циклоалкилы могут быть насыщенными или частично ненасыщенными. Циклоалкильные группы включают группы, содержащие от 3 до 10 атомов в кольце. Циклоалкилы включают, но без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил.

Согласно некоторым вариантам кольцо является циклоалканом.

Согласно некоторым вариантам кольцо является циклоалкеном.

Согласно некоторым вариантам кольцо является ароматическим. Термин ароматическое относится к плоскому кольцу, содержащему делокализованную π-электронную систему, содержащую 4η+2π электронов, где η обозначает целое число. Ароматические кольца могут быть образованы пятью, шестью, семью, восемью, девятью или более чем девятью атомами. Ароматические кольца могут быть замещёнными. Термин ароматическая охватывает как карбоциклические арильные (например, фенильные) и гетероциклические арильные (или гетероарильные или гетероароматические) группы (например, пиридиновую группу). Этот термин включает моноциклические или конденсированное полициклическое кольцо (то есть кольца, которые имеют общие соседние пары атомов углерода) группы.

Согласно некоторым вариантам кольцо представляет собой гетероцикл. Термин гетероцикл относится к гетероароматическим и гетероалициклическим группам, содержащим от одного до четырёх гетероатомов, каждый из которых выбран из О, δ и Ν, причём каждая гетероциклическая группа содержит от 4 до 10 атомов в кольцевой системе при условии, что кольцо в этой группе не содержит двух соседних атомов О или δ. Неароматические гетероциклические группы включают группы, содержащие только 3 атома в кольцевой системе, но ароматические гетероциклические группы должны содержать по меньшей мере 5 атомов в их кольцевой системе. Гетероциклические группы включают бензоконденсированные

- 12 030795 кольцевые системы. Примером 3-членной гетероциклической группы служит азиридинил. Примером 4членной гетероциклической группы служит азетидинил (полученный из азетидина). Примером 5членной гетероциклической группы является тиазолил. Примером 5-членной гетероциклической группы является пиридил и примером 10-членной гетероциклической группы служит хинолинил. Примеры неароматических гетероциклических групп включают пирролидинил, тетрагидрофуранил, дигидрофуранил, тетрагидротиенил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, тетргидротиопиранил, пиперидинил, морфолинил, тиоморфолинил, тиооксанил, пиперазинил, азетидинил, оксетанил, тинтанил, гомопиперидинил, оксепанил, тиепанил, оксазепинил, диазепинил, тиазепинил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, 2пирролинил, 3-пирролинил, индолинил, 2Н-пиранил, 4Н-пиранил, диоксанил, 1,3-диоксоланил, пиразолинил, дитианил, дитиоланил, дигидропиранил, дигидротиенил, дигидрофуранил, пиразолидинил, имидазолинил, имидазолидинил, 3-азабицикло[3.1.0]гексанил, 3-азабицикло[4.1.0]гептанил, 3Н-индолил и хинолизинил. Примеры ароматических гетероциклических групп включают пиридинил, имидазолил, пиримидинил, пиразолил, триазолил, пиразинил, тетразолил, фурил, тиенил, изоксазолил, тиазолил, оксазолил, изотиазолил, пирролил, хинолинил, изохинолинил, индолил, бензимидазолил, бензофуранил, циннолинил, индазолил, индолизинил, фталазинил, пиридазинил, триазинил, изоиндолил, птеридинил, пуринил, оксадиазолил, тиадиазолил, фуразанил, бензофуразанил, бензотиофенил, бензотиазолил, бензоксазолил, хиназолинил, хиноксалинил, нафтиридинил и фуропиридинил. Указанные выше группы могут быть С-присоединёнными или Ν-присоединёнными, где это возможно. Например, группа, полученная на основе пиррола, может быть пиррол-1-илом (Ν-присоединённым или пиррол-3-илом (Сприсоединённым). Далее группа на основе имидазола может представлять собой имидазол-1-ил или имидазол-3-ил (оба Ν-присоединённые) или имидазол-2-ил, имидазол-4-ил или имидазол-5-ил (все Сприсоединённые). Гетероциклические группы включают бензоконденсированные кольцевые системы и кольцевые системы, замещённые одной или двумя оксогруппами (=0), такие как пирролидин-2-он. В зависимости от структуры гетероциклическая группа может представлять собой монорадикал или дирадикал (то есть гетероцикленовую группу).

Согласно некоторым вариантам кольцо является конденсированным. Термин конденсированные относится к структурам, в которых два или более колец имеют одну или более общих связей.

Согласно некоторым вариантам кольцо является димером.

Согласно некоторым вариантам кольцо является тримером.

Согласно некоторым вариантам кольцо является замещённым.

Термин карбоциклическое или карбоцикл относится к кольцу, где каждый из атомов, образующих кольцо, является атомом углерода. Карбоциклы включают арил и циклоалкил. Этот термин отличает карбоцикл от гетероцикла (гетероциклического кольца), в котором кольцо содержит по меньшей мере один атом, отличающийся от атома углерода (то есть является гетероатомом). Карбоциклы включают арил и циклоалкил. Этот термин отличает карбоцикл от гетероцикла (гетероциклического кольца), в котором кольцо содержит по меньшей мере один атом, отличающийся от атома углерода (то есть гетероатом). Гетероциклы включают гетероарилы и гетероциклоалкилы. Карбоциклы и гетероциклы могут быть замещёнными.

Согласно некоторым вариантам линкер является замещённым. Термин возможно замещённая или замещённая группа означает, что такая группа может быть замещена одним или более дополнительными группой(ами), независимо и каждая, выбранными из С1-С₆алкила, С₃-С₈циклоалкила, арила, гетероарила, С2-С6гетероалициклической группы, гидроксила, С1-С6алкокси, арилокси, С1-С6алкилтио, арилтио, С1-С₆алкилсульфоксидной группы, арилсульфоксидной группы, С1-С₆алкилсульфонной группы, арилсульфонной группы, циано, галоида, С₂-С₈ацила, С₂-С₈ацилокси, нитро, С1-С₆галоидалкила, О С6фторалкила и аминогруппы, включая С1-С6алкиламиногруппу и их защищенные производные. Например, возможными заместителями могут быть ЬзКз, где каждый Ьз независимо выбран из связи, -О-, -С(=О)-, -8-, -8(=0)-, -8(=0)2-, -ΝΗ-, -ΝΗ0(=0)-, -0(=0)ΝΗ-, 5(=0)2ΝΗ-, -ΝΗ5(=0)2-, -00(=0)ΝΗ-, -ΝΗϋ(=0)0-, -(С1-С₆алкила)- или -(С₂-С₆алкенила)-; и каждый Кз независимо выбран из Н, (С1С4алкила), (С3-С8циклоалкила), гетероарила, арила и С1-С6гетероалкила. Возможно замещённые неароматические группы могут в качестве заместителей содержать одну или более оксогрупп (=0). Защитные группы, которые применяются для получения защищенных производных указанных выше заместителей хорошо известны специалистам в данной области.

Согласно некоторым вариантам молекулы для селективной доставки, описанные в данной заявке, содержат один линкер. Применение единственного механизма для опосредования поглощения как визуализирующих, так и терапевтических агентов для доставки является особенно важным, так как получение изображения с безвредными следовыми количествами может быть использовано для тестирования, если дальнейшая терапевтическая доза должна концентрироваться надлежащим образом в ткани-мишени.

Согласно некоторым вариантам молекулы для селективной доставки, описанные в данной заявке, содержат множество линкеров. Когда молекула для селективной доставки, описанная в данной заявке, включает множество линкерных групп, отделение части А от остальных частей молекулы требует отщепления всех линкерных групп X. Отщепление совокупности линкеров X может быть одновременным или последовательным. Совокупность линкеров X может включать группы X, обладающие разной специ- 13 030795 фичностью, так что отделение части А от остальных частей молекулы требует более чем одного условия или более чем одной среды (внеклеточных сигналов) для этой молекулы. Отщепление совокупности линкеров X служит, таким образом, детектором комбинаций таких внеклеточных сигналов. Например, молекула для селективной доставки может включать две части линкеров Ха и ХЬ, соединяющих основную часть В с кислой частью А. Оба линкера Ха и ХЬ должны подвергаться отщеплению до отделения кислой части А от основной части В и группы для доставки С (если она есть) для попадания в клетку. Следует иметь в виду, что участок линкера может соединяться или с основной частью В, или с группой для доставки С независимо от наличия другого линкера и что, когда это желательно, могут содержаться более чем два линкера X.

Комбинации двух или более линкеров X могут быть использованы для дальнейшей модуляции нацеливания и доставки молекул в желаемые клетки, ткани или участки. Комбинации внеклеточных сигналов используются для расширения или сужения специфичности расщепления линкеров X, когда это желательно. Когда множество линкеров связано параллельно, специфичность отщепления сужается, так как каждый линкер должен быть отщеплён до того, как часть А может отделиться от остальной части молекулы. Когда совокупность линкеров соединена последовательно, специфичность отщепления расширяется, так как отщепление любого одного линкера X позволяет части А отделиться от остальной части молекулы. Например, для того чтобы определить наличие гипоксии или протеазы (то есть расщепление X в присутствии протеазы или наличия гипоксии), линкер X должен быть таким, чтобы поместить протеазачувствительный или чувствительный к восстановлению сайты в тандеме, чтобы отщепление каждого из них було достаточным для отделения кислой части А.

Или же для того чтобы обнаружить наличие и протеазы и гипоксии (то есть для осуществления отщепления линкера X в присутствии и протеазы, и гипоксии, но не в присутствии только одного из этих факторов), линкер X должен быть таким, чтобы поместить протеазачувствительный сайт между по меньшей мере одной парой цистеинов, которые связаны дисульфидной связью друг с другом. В таком случае и отщепление при помощи протеазы, и восстановление дисульфидной связи требуются для того, чтобы произошло отделение части А.

Примеры молекул для селективной доставки

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-14.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-15.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-23.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-24.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-25.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-26.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-27.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-32.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-35.

Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает пептиды Р-3.

- 14 030795

Согласно некоторым вариантам молекула для селективной доставки имеет структуру, выбранную из δϋΜ-1, δϋΜ-2, δϋΜ-3, δϋλΙ-4. δϋΜ-5, δϋΜ-6, δϋΜ-7, δϋΜ-8, δϋΜ-9, δϋΜ-10, δϋΜ-11, δϋΜ-12, δϋΜ-13, δϋΜ-14, δϋΜ-15, δϋΜ-16, δϋΜ17, δϋΜ-18, δϋΜ-19, δϋΜ-20, δϋΜ-21, δϋΜ-22, δϋΜ-23, δϋΜ-24, δϋΜ-25, δϋΜ-26, δΏΜ-27, δϋΜ-28, δΏΜ-29, δϋΜ-30, δΏΜ-31, δϋΜ-32, δΏΜ-33, δϋΜ-34, δΏΜ-35, δϋΜ-36, δϋΜ-37, δϋΜ-38, δϋΜ-39 и δϋΜ-40.

- 15 030795

- 16 030795

- 18 030795

л

<л

О

Л о

о

Л

- 19 030795

ЗО₃Н

- 20 030795

5О₃Н

- 21 030795

- 22 030795

- 23 030795

- 24 030795

5О₃Н

- 26 030795 о

ω

ιζ ?° ο

$

V

ΖΙ

э.....

гК° η ζτ °ί τζ

- 27 030795

Дополнительные модификации.

Согласно некоторым вариантам прицельные молекулы по данному изобретению могут быть соединены с высокомолекулярными молекулами, которые увеличивают мультивалентность и авидность введения меток. Согласно некоторым вариантам высокомолекулярные молекулы представляют собой растворимые в воде полимеры. Примеры водорастворимых полимеров включают, но без ограничения, пептиды, сахариды, винильные полимеры, простые полиэфиры, полиамины, поликарбоновые кислоты и т.п. Согласно некоторым вариантам водорастворимый полимер представляет собой декстран, полиэтиленгликоль (РЕС), полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту. Крахмал или гидроксиэтилированный крахмал. Для соединения пептидов с растворимыми в воде полимерами применяется любой подходящий способ

- 28 030795 (см. Негтапзоп О., Вюсопрда1е ТесЬтциез 2^пб Еб, Лсабетк Ргезз, 1пс. 2008).

Способы применения

Молекулы для селективной доставки формулы I позволяют осуществить прицельную доставку терапевтических агентов в специфические клетки и/или ткани. Эти молекулы содержат основную пептидную последовательность (В), которая предназначена для переноса через клеточную мембрану, кислую пептидную последовательность (А), которая ингибирует поглощение пептида В клетками, линкер X, который отщепляется в специфических условиях, группы доставки (по меньшей мере О.\ и О_В), связанные с пептидами А и В, или X в качестве макромолекулярного носителя. Согласно некоторым вариантам отщепление линкера X приводит к отделению пептида В от пептида А и к переносу пептида В (и любой группы доставки, присоединённой к нему) через клеточную мембрану. Согласно некоторым вариантам молекулы для селективной доставки формулы I позволяют осуществить прицельную доставку одной или более групп доставки (например, терапевтических агентов или визуализирующих агентов) в клеточную ткань.

Согласно некоторым вариантам предусмотрена молекула селективной доставки формулы I [Ό а- с а] - А- [см-М] -Х-В - [ св - Ов ] формула I, где X представляет собой пептидный линкер, который способен к расщеплению при помощи протеазы;

□_А и О_В представляют собой пару акцепторной и донорной флуоресцентных частиц, между которыми возможен флуоресцентный резонансный перенос энергии по механизму Фёрстера; и где [с_М-М] присоединён в любом положении к X, [ О_А-с_Л| присоединён к любой аминокислоте в А и [с_В-О_В| присоединён к любой аминокислоте в В, М представляет собой полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий среднюю молекулярную массу 500, 1000, 2000, 5000 или 10000 Да.

В одном из вариантов изобретения с_А, с_В и с_М, каждый независимо, выбран из О-цистеина, Оглутамата, лизина и пара-4-ацетил-Г-фенилаланина. с_В представляет собой остаток О-цистеина.

В одном из вариантов изобретения с_А представляет собой остаток О-глутамата или лизина.

В одном из вариантов изобретения с_М обозначает остаток пара-4-ацетил-Г-фенилаланина.

РЬОЬАО, РЬО-С(ше)-АО,

КРЬАЫУКЗ, Ε8ΡΑΥΥΤΑ, ОРКЗРЬ, РРКЗРЬ, КТОиСЬ и КЪОЕК(Ас).

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность РРСР.АС.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность РРС-С(те)АС.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность КРРЛР\\'К8.

В одном из вариантов изобретения О_А и О_В означают Су5 и Су7.

В одном из вариантов изобретения О_А и О_В означают Су5 и РКОуе750.

В одном из вариантов изобретения О_А и О_В означают Су5 и РК0уе800.

В одном из вариантов изобретения О_А и О_В означают Су5 и 1СС.

δϋΜ-25.

Целевые ткани.

Согласно некоторым вариантам изобретения представляющие интерес целевые ткани являются раковыми тканями.

- 29 030795

В одном из вариантов изобретения ткань представляет собой ткань колоректального рака. Согласно некоторым вариантам изобретения рак (раковое заболевание) представляет собой СПИДассоциированный рак (например, СПИД- ассоциированную лимфому), анальный рак, базальноклеточную карциному, рак желчевыводящих путей (например, рак внепечёночных желчных протоков), рак мочевого пузыря, рак костей (остеосаркому и злокачественную фиброзную гистиоцитоксантому), рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, колоректальный рак, эндометриальный рак (например, рак матки), эпендимому, рак пищевода, рак глаза (например, внутриглазную меланому и ретинобластому), рак желудка, опухоль зародышевых клеток (например, внечерепной рак, внегонадный рак, рак яичников), рак головы и шеи, лейкемию, рак губы и ротовой полости, рак печени, рак лёгкого (например, мелкоклеточный рак лёгкого, немелкоклеточный рак лёгкого, аденокарциному лёгкого и плоскоклеточный рак лёгкого), рак яичников, рак поджелудочной железы, опухоль гипофиза, рак простаты, рак печени, рак кожи, рак тонкого кишечника, плоскоклеточный рак, рак яичек, рак горла, рак щитовидной железы, рак уретры (мочеиспускательного канала) и посттрансплантационный лимфопролиферативный синдром (РТЬП).

Согласно некоторым вариантам изобретения рак представляет собой лимфоидный рак (например, лимфому).

Согласно некоторым вариантам изобретения рак представляет собой В-клеточный рак.

Согласно некоторым вариантам изобретения раковые заболевания включают предшественник Вклеточных раковых заболеваний (например, предшественник В-клеточного/клеточной лимфобластного/лимфобластной лейкоза/лимфомы) и периферические В-клеточные раковые заболевания (например, В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/пролимфоцитарный лейкоз/мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (мелкоклеточную лимфоцитарную (8Ь) неходжкинскую лимфому (ЫНЬ, НХЛ), лимфоплазмацитоидную лимфому/иммуноцитому, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому фолликулярную лимфому (например, по цитологической классификации: I (мелкоклеточную), II (смешанную мелко- и крупноклеточную), III (крупноклеточную), и/или подтипов: диффузную и преимущественно мелкоклеточного типа), низкой степени злокачественности (малоразвитую)/фолликулярную неходжкинскую лимфому (ХНЬ), промежуточной степени злокачественности/фолликулярную ХНЬ, Вклеточную лимфому маргинальной зоны (например, внеузловую МАЬТ- типа +/- моноцитоидные В клетки) и/или узловую (например, +/- моноцитоидные В клетки)), лимфому маргинальной зоны селезёнки (например, +/- волосатых лимфоцитов), волосатоклеточный лейкоз, плазмацитому/плазмаклеточную миелому (например, миелому и множественную миелому), диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (например, первичную медиастинальную (тимическую) В-клеточную лимфому), диффузную ХНЬ промежуточной степени злокачественности, лимфому Беркитта, В-клеточную лимфому высокой степени злокачественности, иммунобластную ХНЬ типа Беркитта высокой степени злокачественности, лимфобластную ХНЬ высокой степени злокачественности, ХНЬ из мелких клеток с нерасщеплёнными ядрами высокой степени злокачественности, массивную ХНЬ, СПИД- ассоциированную лимфому и макроглобулинемию Вальденстрёма).

Согласно некоторым вариантам изобретения раковое заболевание представляет собой Т-клеточный и/или предполагаемый ΝΚ-клеточный рак.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак является предшественником Т-клеточного рака (предшественником Т-лимфобластной/лимфобластного лимфомы/лейкоза) или раковые заболевания представляют собой периферические Т-клеточные и ΝΚ-клеточные раковые заболевания (например, Тклеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/пролимфоцитарный лейкоз и лейкоз из больших гранулярных лейкоцитов (ЬСЬ) (например, Т-клеточного типа и/или ΝΚ-клеточного типа), кожную Тклеточную лимфому (например, фунгоидную гранулёму/синдром Сезари), первичные неспецифические Т-клеточные лимфомы (например, по цитологической классификации (например, среднеклеточные, смешанные средне- и крупноклеточные опухоли), крупноклеточные, из лимфоэпителиоидных клеток, подтип гепатоспленической γδ Т-клеточной лимфомы, и подкожной панникулитной Т-клеточной лимфомы), ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому (АИТЛ, АГБО), ангиоцентрическую лимфому, интестинальную Т-клеточную лимфому (например, ассоциированную с +/-энтеропатией), Т-клеточную/Тклеточный лимф ому/лейкоз взрослых (АТЬ), анапластическую крупноклеточную лимфому (АЬСЬ) (например, из клеток типа ί'.Ό30+. Т-и ноль), анапластическую крупноклеточную лимфому и лимфому типа лимфомы Ходжкина).

Согласно некоторым вариантам изобретения раковое заболевание представляет собой болезнь Ходжкина.

Согласно некоторым вариантам изобретения раковое заболевание представляет собой лейкоз.

Согласно некоторым вариантам изобретения раковое заболевание представляет собой хронический миелоцитарный I (гранулоцитарный) лейкоз, хронический миелогенный и хронический лимфоцитарный

- 30 030795 лейкоз (ХЛЛ, СЬЬ), острый лимфобластный лейкоз (лимфолейкоз, ОЛЛ, АЬЬ), острый миелоидный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз и острый миелоцитарный лейкоз (например, миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкоз).

Согласно некоторым вариантам изобретения рак представляет собой несолидную опухоль или плазмацитому.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак представляет собой экстрамедуллярную плазмацитому, солитарную миелому и множественную миелому.

Согласно некоторым вариантам изобретения плазмацитома представляет собой множественную миелому.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак представляет собой рак лёгкого.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак представляет собой рак простаты (предстательной железы).

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой аденокарциному.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой саркому, нейроэндокринную опухоль, мелкоклеточный рак, протоковый рак или лимфому.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой стадию А рака простаты (рак может не прощупываться при ректальном исследовании).

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой стадию В рака простаты (т.е. опухоль в предстательной железе содержит больше клеток (ткани), её можно обнаружить при ректальном исследовании или с помощью биопсии, которую проводят вследствие высокого уровня ПСА (Р8А)).

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой стадию С рака простаты (т.е. рак распространился за пределы предстательной железы на соседние ткани).

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой стадию Ό рака простаты. Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой андрогеннезависимый рак простаты (А1РС).

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой андрогензависимый рак простаты.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты невосприимчив к гормональной терапии.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты практически невосприимчив к гормональной терапии.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты невосприимчив к химиотерапии.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты представляет собой метастатический рак простаты.

Согласно некоторым вариантам изобретения субъектом является человек, в организме которого имеется ген, генетическая мутация или полиморфизм, ассоциированные с раком простаты (например, РКА8ЕЬ/НРС1, ЕБАС2/НРС2, 8К-А/М8К1, СНЕК2, ВКСА2, ΡΟΝ1, ΘΟΟ1, М1С-1, ТЬК4 и ΡΤΕΝ), или имеется одна или более дополнительных копий гена, ассоциированного с раком простаты.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты является НЕК2-положительным.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты является НЕК2-отрицательным.

Согласно некоторым вариантам изобретения рак простаты является метастазированным и характеризуется циркулирующими опухолевыми клетками.

Применение для визуализации.

Селективная доставка молекул формулы I обеспечивает нацеленную доставку визуализирующих агентов к конкретным клеткам и/или тканям (например, раковым тканям). Молекулы содержат основную пептидную последовательность (В), которая создана таким образом, чтобы она могла переноситься через клеточную мембрану или задерживаться в ткани, кислую пептидную последовательность (А), которая ингибирует захват и удержание пептида В в клетках, линкер X, который отщепляется в определённых условиях, визуализирующие агенты, связанные с пептидами А и В, или X и высокомолекулярный носитель.

Согласно некоторым вариантам изобретения отщепление линкера X позволяет отделить пептид В от пептида А и делает возможным перенос пептида В (и любых связанных с ним визуализирующих агентов) через клеточную мембрану или удержание пептида В в ткани.

Согласно некоторым вариантам изобретения селективная доставка молекул формулы I обеспечивает нацеленную доставку одного или более визуализирующих агентов к клетке или ткани.

Согласно некоторым вариантам изобретения селективная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику визуализировать/получать изображение конкретной ткани.

Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения раскрываются способы доставки визуализирующих агентов к целевой ткани, включающие осуществление контакта целевой ткани с молекулой формулы I

- 31 030795 [ β л- с а] - А- [см-М] -Х-В - [СВ Όβ ] формула I, где X представляет собой пептидный линкер, который способен к расщеплению при помощи протеазы;

с_А, с_в и См, каждый независимо, представляет собой остаток аминокислоты;

□_А и О_в представляют собой пару акцепторной и донорной флуоресцентных частиц, между которыми возможен флуоресцентный резонансный перенос энергии по механизму Фёрстера; и где [ο_Μ-Μ] присоединён в любом положении к X, [О_А-с_А| присоединён к любой аминокислоте в А и [с_в-1)_в| присоединён к любой аминокислоте в В, Μ представляет собой полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий среднюю молекулярную массу 500, 1000, 2000, 5000 или 10000 Да.

В одном из вариантов изобретения с_А, с_в и См, каждый независимо, выбран из Ώ-цистеина, Оглутамата, лизина и пара-4-ацетил-Г-фенилаланина. с_в представляет собой остаток Ώ-цистеина.

В одном из вариантов изобретения с_А представляет собой остаток Ώ-глутамата или лизина.

В одном из вариантов изобретения обозначает остаток пара-4-ацетил-Г-фенилаланина.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность, которая способна к расщеплению при помощи ΜΜР2, ΜΜР7, ΜΜР9 или ΜΜР14. X содержит аминокислотную последовательность, выбранную из

РГСШАС, РЬО-С(те)-АО,

КРГАЬЛУ К8, Ε8ΡΑΥΥΤΑ, ОРКЗРЬ, РРКЗРЬ, ИЕрЕКЕ и Р.ГрП<(Ас).

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность РЬСЬАС.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность РЬС-С(ше)АС.

В одном из вариантов изобретения X содержит аминокислотную последовательность КРРАРАК8.

В одном из вариантов изобретения О_А и О_в означают Су5 и !КОуе750.

В одном из вариантов изобретения О_А и О_в означают Су5 и !К0уе800.

В одном из вариантов изобретения О_А и О_в означают Су5 и К'Ст.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ΏΜ-14 субъекту и (б) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ΏΜ-15 субъекту и (б) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ΏΜ-23 субъекту и (б) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ΏΜ-24 субъекту и (б) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ΏΜ-25 субъекту и (б) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ΏΜ-26 субъекту и (б) визуа- 32 030795 лизацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ЭМ-27 субъекту и (б) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ЭМ-32 субъекту и (б) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются способы визуализации целевой ткани у нуждающегося в этом субъекта, включающие: (а) введение 8ЭМ-35 субъекту и (б) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику визуализировать/получать изображение конкретной ткани (например, раковой ткани).

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику удалять (или хирургическим методом иссекать) конкретную ткань (например, раковую ткань).

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику удалять (или хирургическим методом иссекать) конкретную ткань (например, раковую ткань) с уменьшением границ резекции.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику удалять (или хирургическим методом иссекать) опухолевую/раковую ткань и уменьшает вероятность повторного появления опухолевой/раковой ткани.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику максимально уменьшить массу опухолевой/раковой ткани.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к раковой ткани молочной железы уменьшает вероятность лишних операций или повторных операций.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику более точно отбирать целевую (например, раковую) ткань (например, проводить биопсию (например, резекционную биопсию, инцизионную биопсию, аспирационную биопсию или пункционную биопсию).

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику визуализировать/получать изображение конкретной ткани (например, раковой ткани) в иссечённой ткани, содержащей здоровую ткань. Возможность идентификации целевой ткани (например, раковой ткани) поможет патоморфологу определить, где делать срез для оценки патологии, и уменьшает шанс пропустить нездоровую ткань (например, раковую ткань) и взять образец здоровой ткани, что может дать ложноотрицательный результат.

Согласно некоторым вариантам изобретения ткань (например, раковую ткань), удалённую после визуализации с помощью соединения формулы I, используют для приготовления среза или стекла для патологического исследования.

Согласно некоторым вариантам изобретения ткань (например, раковую ткань), удалённую после визуализации с помощью соединения формулы I, используют для приготовления среза или стекла для патологического исследования, чтобы определить, является ли ткань злокачественной или доброкачественной.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к раковой ткани молочной железы позволяет специалисту-медику точно определить стадию ракового заболевания, что даёт ему возможность принимать решение относительно лечения.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к раковой ткани позволяет специалисту-медику определить размер опухоли (раковой ткани) или распространение (например, метастатическое поражение) раковой ткани.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка визуализирующего агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику определить эффективную схему лечения.

Согласно некоторым вариантам изобретения селективная доставка молекулы формулы I, содержащей визуализирующий агент, применяется в направленной хирургии (хирургии с визуализацией).

Согласно некоторым вариантам изобретения селективно доставленная молекула локализуется преимущественно в раковых или других патологических тканях с повышенной протеазной активностью (например, тканях, в которых наблюдается воспалительная реакция).

Согласно некоторым вариантам изобретения селективная доставка молекулы формулы I, содержащей визуализирующий агент, применяется в направленной хирурги для удаления колоректальной раковой опухоли.

Согласно некоторым вариантам изобретения направленная хирургия с применением селективной доставки молекулы позволяет хирургу удалить как можно меньше здоровой (т.е. нераковой, незлокачественной) ткани.

- 33 030795

Согласно некоторым вариантам изобретения направленная хирургия с применением селективной доставки молекулы позволяет хирургу визуализировать и удалять больший объём ткани, чем он мог бы удалить при отсутствии селективной доставки молекулы.

Согласно некоторым вариантам изобретения хирургия является хирургией с использованием флуоресцентной визуализации.

Визуализирующие агенты.

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент представляет собой краситель.

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент представляет собой флуоресцентную частицу.

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент выбран из: флуоресцентного белка, флуоресцентного красителя, флуоресцентного материала или их комбинации.

Все флуоресцентные частицы (агенты) охватываются термином флуоресцентная частица. Конкретные примеры флуоресцентных частиц, приводимые в настоящей заявке, являются иллюстративными и не предполагают ограничения флуоресцентных частиц для применения с нацеливающими молекулами по настоящему изобретению.

Примеры флуоресцентных красителей включают, но без ограничения, ксантены (например, родамины, родолы и флуоресцеины и их производные); Ытапек; кумарины и их производные (например, умбеллиферон и аминометилкумарины); ароматические амины (например, данзил; сквараты); бензофураны; флуоресцентные цианины; индокарбоцианины; карбазолы; (дицианометилен)-пираны; полиметин; оксабензантран; ксантен; пирилий; карбостил; перилен; акридон; рубрен; антрацен; коронен; фенантрацен; пирен; бутадиен; стильбен; порфирин; фталоцианин; хелатные комплексы лантанидов; хелатные комплексы редкоземельных металлов; и производные этих красителей.

Примеры флуоресцеиновых красителей включают, но без ограничения, 5-карбоксифлуоресцеин, флуоресцеин-5-изотиоцианат, флуоресцеин-6-изотиоцианат и 6-карбоксифлуоресцеин.

Примеры родаминовых красителей включают, но без ограничения, тетраметилродамин-6изотиоцианат, 5-карбокситетраметилродамин, производные 5-карбоксиродола, тетраметил- и тетраэтилродамин, дифенилметил- и дифенилэтилродамин, динафтил родамин, родамин 101 сульфонилхлорид (продаётся под торговой маркой ΤΕXАЗ ΕΕΌ®).

Примеры цианиновых красителей включают, но без ограничения, Су3, Су3В, Су3.5, Су5, Су5.5, Су7, ΙΕΌΥΕ680, А1еха Р1иог 750, 1Н1)\е800С\\'. 1СО.

Примеры флуоресцентных пептидов включают зелёный флуоресцентный белок ОРР (Огееп Р1иоге8сеп1 Рго1е1п) или производные ОРР (например, ЕвРР, ЕвРР2, азурит (А/игНе), тКа1ата1, ЕСРР, лазурь (Сеги1еап), САРек УРР, цитрин, Уепик, УРе1).

Флуоресцентные метки детектируют любым подходящим методом. Например, флуоресцентную метку можно детектировать, возбуждая флуорохром (флуорофор, флуоресцирующий краситель) светом соответствующей длины волны и детектируя результирующую флуоресценцию, например, исследуя под микроскопом, визуально, с помощью фотоплёнки, используя электронные детекторы, такие как приборы с зарядовой связью (ПЗС, ССОЦ фотоумножители и т.п.

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент метят позитрон-излучающим изотопом (например,¹⁸Р) для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ, РЕТ), гамма-излучающим изотопом (например, ^99тТс) для однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ЗРЕСТ) или парамагнитной молекулой или наночастицей (например, хелатом Об³⁺, или покрытой оболочкой наночастицей магнетита) для магнито-резонансной томографии (МРТ, МЕ1).

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент метят хелатом гадолиния, частицами оксида железа, суперпарамагнитыми частицами оксида железа и ультрамалыми парамагнитными частицами, агентом, содержащим хелат марганца или галлия.

Примеры хелатов гадолиния включают, но без ограничения, диэтилентриамин-пентауксусную кислоту (ЭТРА), 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (ЭОТА) и 1,4,7триазациклононан-М,№,№'-триуксусную кислоту (ЫОТА).

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент представляет собой флуорофор с полосами поглощения в ближней ИК-области для визуализации в ближней инфракрасной области (ближнем ИК-спектре), люциферазу (светляков, бактерий или кишечнополостных) или другую люминесцентную молекулу для биолюминесцентной визуализации или везикулу (пузырёк), заполненную(ый) перфторуглеродом, для ультразвуковой визуализации.

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент представляет собой ядерный зонд.

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент представляет собой ЗРЕСТ или РЕТ радионуклидный зонд.

Согласно некоторым вариантам изобретения радионуклидный зонд выбран из: хелата технеция, хелата меди, радиоактивного фтора, радиоактивного иода и хелата индия.

Примеры хелатов Тс включают, но без ограничения, ΗΥΝΙΟ, ЭТРА и ЭОТА.

- 34 030795

Согласно некоторым вариантам изобретения визуализирующий агент содержит радиоактивную частицу (радиоактивный агент), например радиоактивный изотоп, такой как ²¹¹А1, ¹³¹Ι, ¹²⁵Ι, ⁹⁰Υ, ^18бКе, ¹⁸⁸Ке, ¹⁵³8ш, ²¹²Βί, ³²Р, ^б4Си, радиоактивные изотопы Би и др.

Терапевтическое применение.

Селективная доставка молекул формулы I делает возможной нацеленную доставку терапевтических агентов к конкретным клеткам/тканям (например, раковым тканям). Эти молекулы содержат основную пептидную последовательность (В), предназначенную для переноса через клеточную мембрану, кислую пептидную последовательность (А), которая ингибируют захват пептида В в клетках, линкер X, который отщепляется в определённых условиях, терапевтические агенты, связанные с пептидами А и В, или X и высокомолекулярный носитель.

Согласно некоторым вариантам изобретения отщепление линкера X позволяет отделить пептид В от пептида А и делает возможным перенос пептида В (и любых связанных с ним терапевтических агентов) через клеточную мембрану или удержание В в ткани.

Согласно некоторым вариантам изобретения селективная доставка молекул формулы Ι обеспечивает нацеленную доставку одного или более терапевтических агентов к клетке или ткани.

Согласно некоторым вариантам изобретения нацеленная доставка терапевтического агента к клетке или ткани позволяет специалисту-медику лечить (обрабатывать) конкретную ткань.

Исходные материалы.

Описаны молекулы формулы II, имеющей структуру Αι-Χι-Вь Формула II, где XI означает отщепляемый линкер;

А₁ означает пептид, последовательность которого содержит от 5 до 9 кислых аминокислот и имеет первую реакционноспособную аминокислотную группу с_А;

Β1 означает пептид, последовательность которого содержит от 7 до 9 основных аминокислот и имеет вторую реакционноспособную аминокислотную группу с_в; и

А₁^₁-В₁ содержит третью реакционноспособную аминокислотную группу с_М в А₁ или в X!;

при этом группа (фрагмент) с_А способна реагировать с первой группой доставки, содержащей Э_А, группа с_в способна реагировать со второй группой доставки, содержащей Э_в, и группа с_М способна реагировать с макромолекулярным носителем, содержащим М, с образованием молекулы формулы I.

сА, св и сМ содержат ортогонально реакционноспособные функциональные группы.

Согласно некоторым вариантам изобретения заместители сА, св и сМ, каждый независимо, выбран из природной аминокислоты или неприродной аминокислоты.

Согласно некоторым вариантам изобретения с_А, с_в и с_М, каждый независимо, выбран из Э аминокислоты, Б аминокислоты, «-аминокислоты, β-аминокислоты или γ-аминокислоты.

Согласно некоторым вариантам изобретения сА, св и сМ, каждый независимо, выбран из любой аминокислоты, содержащей свободную тиольную группу, любой аминокислоты, имеющей Ν-концевую аминогруппу, и любой аминокислоты с боковой цепью, способной образовывать оксимную или гидразонную группу при реакции с гидроксиламином или гидразином.

Согласно некоторым вариантам изобретения с_А, с_в и с_М, каждый независимо, выбран из Э-цистеина, ϋ-глутамата, лизина и пара-4-ацетил Ь-фенилаланина.

Согласно некоторым вариантам изобретения с_в означает аминокислоту, содержащую свободную тиольную группу.

Согласно некоторым вариантам изобретения с_в означает Э-цистеин.

Согласно некоторым вариантам изобретения с_А означает любую аминокислоту, имеющую Νконцевую аминогруппу.

Согласно некоторым вариантам изобретения с_А означает Э-глутамат.

Согласно некоторым вариантам изобретения сА означает лизин.

Согласно некоторым вариантам изобретения с_М означает любую аминокислоту с боковой цепью, способной образовывать оксимную или гидразонную связь при реакции с гидроксиламиногуппой или с гидразином.

Согласно некоторым вариантам изобретения с_М означает пара-4-ацетил Ь-фенилаланин.

Выражение ортогонально реакционноспособные означает, что в ходе последовательных реакций с молекулой может связываться множество групп, которые не реагируют перекрёстно друг с другом, что позволяет каждой группе специфически связываться с молекулой в присутствии других групп. Согласно некоторым вариантам изобретения три группы (Э_А, Э_в, и Э_М) способны связываться с А₁-X₁-Β₁ через с_А, св и сМ в ходе трёх последовательных независимых не являющихся перекрёстными реакций, так что каждая группа связывается только с одним сайтом в А₁-X₁-Β₁.

Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение включает молекулу, имеющую аминокислотную последовательность

- 35 030795 где о означает 5-(амино-3-оксапентаноил);

Р(_4-Ас) означает параацетил-(Ь)-фенилаланин и

С(_Ме) означает 8-метил-(Ь)-цистеин.

Согласно некоторым вариантам изобретения молекула дополнительно содержит полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕО). Согласно некоторым вариантам изобретения полимер РЕО связан ковалентной связью с молекулой в области звена Р(_4-Ас). Согласно некоторым вариантам изобретения молекула содержит группы, которые могут реагировать ортогонально. Согласно некоторым вариантам изобретения группы, которые могут реагировать ортогонально, выбраны из амина, тиола и ацетилфенилаланина. Согласно некоторым вариантам изобретения молекула содержит аминогруппу, тиольную группу и группу фенилаланина.

Согласно некоторым вариантам изобретения полимер РЕО имеет среднюю молекулярную массу 500 Да. Согласно некоторым вариантам изобретения полимер РЕО имеет среднюю молекулярную массу 2000 Да. Согласно некоторым вариантам изобретения полимер РЕО имеет среднюю молекулярную массу 5000 Да. Согласно некоторым вариантам изобретения полимер РЕО имеет среднюю молекулярную массу 10000 Да. Согласно некоторым вариантам изобретения полимер РЕО имеет среднюю молекулярную массу 20000 Да. Согласно некоторым вариантам изобретения полимер РЕО имеет среднюю молекулярную массу 40000 Да. Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение включает применение данной молекулы в синтезе соединения (молекулы) формулы Ι.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении представлена молекула, имеющая аминокислотную последовательность

где все глутаматные и аргининовые остатки представляют собой остатки Б-аминокислот; о означает 5-(амино-3-оксапентоил);

С(_те) означает 8-метил-(Т)-цистеин;

РЕО(_3К) означает α-амино-ю-амид поли(этиленгликоль), имеющий среднюю молекулярную массу

3000 Да.

Согласно некоторым вариантам изобретения молекула дополнительно содержит флуоресцентную частицу. Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение включает применение данной молекулы в синтезе соединения (молекулы) формулы Ι.

- 36 030795

- 38 030795

- 41 030795

Примеры

Материалы и методы.

Хроматографически (ВЭЖХ) чистый ацетонитрил получали от компании р!8Ьет ЗслепрЛс (РЫШрз- 42 030795

Вагу, РА). Очищенную воду собирали, используя систему очистки воды Μίίίί-Ρ (МлШроге, ВесП'огс), МА). Р£р (пентафторфениловый) эфир 3-малеимидопропионовой кислоты получали от Мо1еси1аг Вюзшепсез (ВоиЫег, СО). Буфер ЗФР-ЭДТА получали от Текпоуа (НоШзТег, СА). Трифторуксусную кислоту (ТРА), диметилформамид (СУП) и Ν-метилморфолин (ΝΜΜ) получали от фирмы §1§та-А1йг1сЬ (Μ Пуаикее, Ш1). α-Меркаптоэтил-Ю-метокси полиоксиэтилен |Μ« (ΜΜ) 2000, 5000, 20000 и 40000) [тРЕО(2К)-8Н, тРЕО(5К)-8Н, тРЕО(20К)-8Н, тРЕО(40К)-8Н] и α-аминоксил-Ю-метокси полиоксиэтилен |Μ« (ΜΜ) 2000, 5000, 20000 и 40000) [тРЕО(2К)-ОЯН₂, тРЕО(5К)-ОЯН₂, тРЕО(20К)-ОЯН₂, тРЕО(40К)-ОЯН₂] получали от фирмы NОР Атепса СоООогайоп (Руте, СА). тРРО(1К)-Х'1^;1Х'112 получали от Хапосз (Х'е\у Уогк). ГК-Буе 800СШ малеимид (Μа1-IК^уе) и ГКБуе 750 сукцинимидиловый эфир получали от фирмы Εί-Сог Вюзшепсез (Бтсо1п, ХЕ). Лиофилизированные пептиды Р1-Р17 готовили, применяя обычные методы присоединения пептидов на стандартной смоле.

ЖХ-МС анализ проводили на жидкостном хроматографе серии Адйеп! 1200 модели 8Б в комбинации с ВЭЖХ/МС/МС системой АВ 8СГЕХ АР1 3200, снабжённой автосамплером (автоматическим скоростным дозатором) СТС РАБ, работающим при 4°С, вакуумным дегазатором, бинарным насосом, иУ-У18 детектором, соответствующей аналитической программой Апа1уз1 1.5 и колонкой РРепотепех (Кте1ех 2.6 цС18 100 А, 100x2.1 мм), или на разделительном модуле Ша1егз 2695, снабжённом двухволновым детектором поглощения \Уа1егз 2487 в комбинации с масс- спектрометром Ртшдап Ι-С’О Беса ХР. Устройство снабжено аналитическим программным обеспечением (п/о) ХсаРЪиг и колонкой Рееке 8шепййс (Трап 200 5 мкм, С18-МС, 50x2.1 мм).

ВЭЖХ проводили на системе Адйеп! (серия Адйеп! 1200) и на колонке ТРегто 8шепййс (НурегзР Оо1Р С18, 5 мкм, 250x10 мм), или на системе для препаративной ВЭЖХ \Уа1егз БеРа Ргер и на колонке Уапап (Р75Б, С18, 15 мкм, 1200 г), или на системе \Уа1егз РгерБС 8уз1ет, снабжённой двухволновым детектором поглощения \Уа1егз 2487, коллектором фракций (Ргасйоп Со11ес!ог) III, программным обеспечением (п/о) Μазз1уηx и колонкой ТРегто 8шепййс (НурегзР Оо1Р С18, 5 мкм, 250x10 мм) или колонкой РРепотепех (1ипа, С18(2), 5 мкм, 100 А АХ 150x30 мм). Подвижная фаза состояла из воды (0.05% ТРА) (растворитель А)/ацетонитрил (0.05% ТРА)м(растворитель В) градиент.

Центрифугирование проводили при 4°С на центрифуге ЕррепРог! 5810К или Весктап Μ^с^оίиβе®

18.

Типичные материалы для синтеза молекул для селективной доставки по настоящему изобретению включают, но без ограничения, любой из пептидов Р-1, Р-2, Р-3, Р-4, Р-5, Р-6, Р-7, Р-8, Р-9, Р-10, Р-11, Р12, Р-13, Р-14, Р-15, Р-16 и Р-17.

Вышеуказанные исходные материалы приведены ниже, в таблице

	Последовательности пептидов
Пептид Р-1	еееееееееоРРОС(ме)АСгптптптс
Пептид Р-2	еееееоРРОС(ме)АСгптггптс
Пептид Р-3	еееееР (4-Ас)оРРОС(Ме)АОтптптгс
Пептид Р-4	еееееееееР(4-Ас)оРРОС(ме)АСгптптптс
Пептид Р-5	(Ас)еееееоРРОС(ме)АСгптггптск
Пептид Р-6	еееееоРРОС(ме)АСгоР (₄-ас)Птггптс
Пептид Р-7	еееееееееоРРОС(ме)АСгптптптсоР(4-Ас)
Пептид Р-8	[тРЕО(2К)]сптптгОФРСгС(ме)АСгоееееек
Пептид Р-9	[тРЕСг(5К)]сптптгОФРСгС(ме)АСгоееееек
Пептид Р-10	еееееоРРОС(ме)АОтгптптс[РЕСг(зк)]

Сокращения.

Стандартные 1 буквенные сокращения применяли для всех последовательностей. Нижними символами показаны Б-аминокислоты. Все пептиды амидировали по С-концу.

о: 5-(амино-3-оксапентаноил);

Р(4-аС): параацетил-(Б)-фенилаланин;

С(шу 8-метил-(Б)-цистеин.

РЕО(3К): α-амино-Ю-амид полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 3000 Да; тРЕО(2к): α-карбокси-Щ-метокси полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 2000 Да;

- 43 030795 тРЕО(5к): а-карбокси-ю-метокси полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 5000 Да.

Ас: ацетил.

В схемах, представленных в нижеприведённых примерах, Ь означает ч; т\1 означает ммоль; О1усте означает глицин; апШие означает анилин.

К раствору пептида Р-1 (8 мг, 2.1 мкмоль) в ΌΜΡ (0.8 мл) при комнатной температуре при перемешивании в темноте прибавляли 1КЭуе 800СШ малеимид (2 мг, 1.7 мкмоль) и Ν-метилморфолин (10 мкл, 91 мкмоль). За ходом реакции следили с помощью ЖХ-МС, обычно реакция заканчивалась через 1 ч. Смесь использовали непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.

К полученной выше реакционной смеси прибавляли Ρίρ-эфир 3-малеимидопропионовой кислоты (2 мг, 6.0 мкмоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 20 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ (ОФ (обращённо-фазовой)-ВЭЖХ) дала интермедиат 5 (2.1 мг, 22% в расчёте на две стадии). Вычислено: [М+3Н]³⁺ (^₈7Η₂₉₀Ν₅₉Ο₆₄δ₆) т/ζ = 1526; Найдено: ΕδΙ: [М+3Н]³⁺(С187Н29<№9Об48б) т/ζ = 1526.

Синтез молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-2.

Смесь интермедиата 5 (1.5 мг, 0.27 мкмоль) и тРЕО(40К)-8Н (10 мг, 0.25 мкмоль) в буфере ЗФРЭДТА (0.5 мл, 137 мМ ЖС1, 7 мМ Να₂ΗΡΟ₄, 3 мМ КС1, 1.4 мМ К₃РО₄, 4 мМ ЭДТА, рН 7.4) перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 20 ч. Очисткой методом ОФ-ВЭЖХ получали молекулу для селективной доставки 8ΌΜ-2 (7.0 мг, 61%).

Молекулы для селективной доставки δΌΜ-1, δΌΜ-3, 8ΌΜ-4 и 8ΌΜ-5 получали аналогично 8ΌΜ-2 из пептида Р-1.

Пример 2. Синтез δΌΜ-6 из пептида Р-2

- 44 030795

Синтез интермедиата 7.

К раствору пептида Р-2 (378.5 мг, 0.1 мкмоль) в ОМР (25 мл) при перемешивании при комнатной температуре в темноте прибавляли Су5 малеимид (87 мг, 0.09 мкмоль) и Ν-метилморфолин (350 мкл, 3.2 мкмоль). За ходом реакции следили с помощью ЖХ-МС, обычно реакция заканчивалась через 1 ч. Смесь использовали непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.

К полученной выше реакционной смеси прибавляли Р£р-эфир 3-малеимидопропионовой кислоты (50 мг, 0.15 мкмоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 5 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала интермедиат 7 (108 мг, 27% в расчёте на две стадии). Вычислено: [М+2Н]²+ (С148Н23₅Д₅1О4484) т/ζ = 1780; Найдено Е81: [М+2Н]²⁺ т/ζ = 1780.

Синтез молекулы для селективной доставки 8СМ-6.

Смесь интермедиата 7 (95 мг, 21.2 мкмоль) и тРЕО(40К)-8Н (0.9 г, 22.5 мкмоль) в буфере ЗФРЭДТА (40 мл, 137 мМ ДаС1, 7 мМ Да₂НРО₄, 3 мМ КС1, 1.4 мМ К₃РО₄, 4 мМ ЭДТА, рН 7.4) перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 20 ч. Очисткой методом ОФ-ВЭЖХ получали молекулу для селективной доставки 3ΏΜ-6 (0.85 г, 90%).

Молекулы для селективной доставки 8ОМ-7 и 8ОМ-8 получали аналогично 8ОМ-6 из пептида Р-2.

Пример 3. Синтез 3ΏΜ-25 из пептида Р-3

- 45 030795

Синтез интермедиата 8.

К раствору пептида Р-3 (200 мг, 49.6 мкмоль) в ΌΜΡ (5 мл) при перемешивании при комнатной температуре в темноте добавляли Су5 малеимид (60 мг, 65.6 мкмоль) и Ν-метилморфолин (80 мкл, 0.73 мкмоль). За ходом реакции следили с помощью ЖХ-МС, она завершалась через 1 ч. К смеси прибавляли эфир (40 мл). Осадок получали центрифугированием, промывали эфиром (40 млХ2) и очищали с помощью ВЭЖХ (ВЭЖХ), получали интермедиат 8 (141 мг, 61%). Вычислено: [М+3Н]³+ (^52Η242Ν51Ο4384) т/ζ = 1200; Найдено Е81: [Μ+3Η]³+ (С152Н₂₄^₅₁О₄₃8₄) т/ζ = 1200.

Синтез интермедиата 9.

К раствору интермедиата 8 (101 мг, 21.8 мкмоль) в ΌΜΡ (10 мл) при комнатной температуре прибавляли сукцинимидиловый эфир Су7 карбоновой кислоты (40 мг, 41.1 мкмоль) и Ν-метилморфолин (0.2 мл, 1.8 мкмоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 36 ч. К смеси прибавляли эфир (35 мл). Осадок собирали после центрифугирования и промывали эфиром (40 млХ2). Очисткой смеси с помощью ОФ-ВЭЖХ получали интермедиат 9 (28.1 мг, 25%) и интермедиат 8 (63 мг). Вычислено: [М+3Н]³+ (^7^2^305086) т/ζ = 1421; Найдено Е81: [М+3Н]³+ (^7^2^305086) т/ζ = 1421.

Синтез молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-25.

Смесь интермедиата 9 (28.1 мг, 5.4 мкмоль) и тΡЕΟ(2Κ)-ΟNΗ₂ (17 мг, 7.6 мкмоль) в глициновом буфере (4 мл, 0.1 М, 20 мМ анилина, рН 3.0) и ацетонитриле (0.8 мл) перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч. По окончании реакции добавляли ацетофенон (10 мкл, 86 мкмоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Очисткой с помощью ОФ-ВЭЖХ получали молекулу для селективной доставки 8ΌΜ-25 (25 мг, 63%).

Молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-9, 8ΌΜ-10, 8ΌΜ-22, 8ΌΜ-23, 8ΌΜ-24, 8ΌΜ-26, 8ΌΜ27, 8ΌΜ-29 и 8ΌΜ-31 получали аналогично 8ΌΜ-25 из пептида Р-3.

Пример 4. Синтез 8ΌΜ-15 из пептида Р-4

- 46 030795

Синтез интермедиата 11.

К раствору пептида Р-4 (30 мг, 6.2 мкмоль) в ΌΜΡ (2 мл) при перемешивании в темноте при комнатной температуре прибавляли Су5 малеимид (7.5 мг, 8.2 мкмоль) и Ν-метилморфолин (15 мкл, 0.14 мкмоль). За реакцией следили методом ЖХ-МС и завершали её через 1 ч. Смесь очищали с помощью ВЭЖХ, получали интермедиат 11 (19.7 мг, 59%). Вычислено: [М+3Н]³⁺ (С178Н282^9О5634) т/ζ = 1424; Найдено Е81: [М+3Н]³+ (С178Н₂₈₂^₉О₅₆8₄) т/ζ = 1424.

Синтез интермедиата 12.

К раствору интермедиата 11 (15 мг, 2.8 мкмоль) в ΌΜΡ (1.5 мл) при комнатной температуре прибавляли сукцинимидиловый эфир Су7 карбоновой кислоты (4 мг, 4.3 мкмоль) и Ν-метилморфолин (10 мкл, 91 мкмоль). Полученную при этом смесь перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 48 ч. Очисткой с помощью ОФ-ВЭЖХ получали интермедиат 12 (5.0 мг, 30%). Вычислено: [М+3Н]³+ (С213Н322Ц,1О63 36) т/ζ = 1645; Найдено Е81: [М+3Н]³+ (С213Н₃₂^₆₁О₆₃8₆) т/ζ = 1645.

Синтез молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-15.

Смесь интермедиата 12 (1.1 мг, 0.18 мкмоль) и тРЕС(2К)-ОКН₂ (1 мг, 0.5 мкмоль) в глициновом буфере (1 мл, 0.1 М, 20 мМ анилина, рН 3.0) и ацетонитриле (0.2 мл) перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 1 дня. Очисткой с помощью ОФ-ВЭЖХ получали молекулу для селективной доставки 8ΌΜ-15 (0.6 мг, 42%).

Молекулы для селективной доставки 8ΌΜ-11, 8ΌΜ-12, 8ΌΜ-13, 8ΌΜ-14 и 8ΌΜ-28 получали аналогично 8ΌΜ-15 из интермедиата 11.

Пример 5. Синтез 8ΌΜ-16 из пептида Р-5

- 47 030795

О^ОН О,„ОН СК.ОН

О ·' Н С - О '' н ГЛ '^ΛΝ>Τ^Νγ^Ν'⁴π-^Ν'_Ι>Ν'^<γ^Ν^Ον^Νγ .

^Н°1^Н°1^Н° ° ⁰ ι^{Η н} θ⁵ сгон сХон ^М

Η₂Νψ\ΙΗ Η₂ΝγΝΗ Η₂Νψ\ΙΗ Η₂Ν^ΝΗ ΗΝ_Υ ΗΝ·. Н1\к Н1\к νη₂

-Λνη η Ο^ύΊ НО Η ο > Η Ο 1 Η ο > Η Ο | Η ο > ,Χ^νΧνΧ^νΧν^Γ^ΝίΛν^λυ^νίΛν^λυ^νΧν^λυ^νΧν^λυ^νΧνΥτ^ι

Χδ Но^НокНокНокНокНО Цн о кп ι 4ιυ ки 4ιυ

Р-5

ΝΗ

ΗΝ%Η₂

ΗΝΗΜΗ,

НН

ΗΝ%Η₂ 'ΝΗ ηγΛνη,

Су5-Ма1 ΝΜΜ, ϋΜΡ, 1 ή

ΟγΟΗ ΟγΟ Η Ο Γ Η Ο Γ Η

ΟγΟΗ

Η

Ν%^Νγ^ΛΝ%^Νγ^ΑΝ^Λτ^Ν^ο^τ^ΝΫ

Η ό к Η ό о>он α η ό ΌΗ ο ₀+Ν_Η η 0^&Ί Η ο Η Ο Λ Η ο 73 Η Ο ^! Η О к Η О к Η

Η₂ΝγΝΗ Η,Ν^,ΝΗ Η₂Ν_γΝΗ Η₂Ν^ΝΗ ΗΝ^ ΗΝ^ ΗΝ^ ΗΝ.

ТТЛ

Ο

Η ΟΊ Η ο . ..

ΝΓΑ ,^^Ν.Λ._Ν-_γΝ Η Ο

ΝΗ ΝΗ

ΗΝ^ΝΗ₂ ην%η₂

Ν>Γ Η ο

ΝΗ

ΗΙψ ΝΗ₂

< \ Ρ > Υν ην^νη₂ λ;

ο

5Ο₃Η

ΟΡίρ

ΝΜΜ, ЭМР, 20 ή

ΟγΟΗ

Ο Γ Η Ο

ΛΧ

Η ο ν^υ^ν· η ο ,ΟΗ ΟγΟΗ Η Ρ Γη

Η ο 0>0Η

Η₂Ν_γΝΗ Η₂ΝγΝΗ Η₂Ν_γΝΗ Η₂ΝγΝΗ ΗΝ., ΗΝ. ΗΝ ΗΝ.

Γ Ύ

ΗΝ'' γΤΝΗ Η Ο^ύΊ Η ο Η Ο = Η ο Λ Η Ο Τ Η ρ Τ η ο λ ..· ^Ιγ^Ν'7^Ν'γ^ΝΛ^ΑΝ^Γ^Νγ^Ν'>Γ^Νγ^Ν^ΓΝγΛΝ^_γΝγί _ν Α^ΝγΧ_ΝΛγΝ η₂

Χο но^внокнокнокнокнок_зно ϊ ϊ 7^Η

НЬГИНг ΗΝ%Η₂ ΗΝ^ΛΝΗ2 ΗΝ^ΛΝΗ2

5Ο₃3Ο₃Η тРЕС(40К)-5Н ρΗ 7.4, ΡΒ5, 20 ή

ΟγΟΗ ΟγΟΗ ΟγΟΗ о Гн о Гн о Гн ' \-^λν..ν

Η Ο ¹ к⁰

ООН Ο'^ΌΗ

Η ° Ο (-Λνη η СЛО Η ρ ,ΥΛΥ>Ν^' Λο Η Ο ⁵ Η Ο _ Μ\ν = 40,000 5Ο<

ΟΧ '

Η₂Ν.ΝΗ Η₂ΝγΝΗ Η₂Ν.ΝΗ Η₂Ν_γΝΗ ίη Λ

НЩ ΗΝ. ΗΝ ΗΝ. (Ρ3^ Ρρζ

I \ и ίΊ \ ι_ι Γ\ к

5ΌΜ-16

ΧΗ ΛΙΗ к Ί4Η кк. ην%ιη₂ ην^λνη2 ην^λνη2 ην^λνη₂ 4

3Ο₃Η

Синтез интермедиата 20.

К раствору пептида Р-5 (20 мг, 5.2 мкмоль) в ΏΜΕ (1 мл) при перемешивании в темноте при комнатной температуре прибавляли Су5 малеимид (6 мг, 6.6 мкмоль) и Ν-метилморфолин (12 мкл, 109 мкмоль). За ходом реакции следили с помощью ЖХ-МС и обычно завершали через 1 ч. Смесь использовали непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору полученной выше смеси в ΩΜΡ (1 мл) при комнатной температуре прибавляли Ρίρ-эфир 3-малеимидопропионовой кислоты (2.5 мг, 7.5 мкмоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 20 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала интермедиат 20 (7.3 мг, 30% в расчёте на две стадии). Вычислено: [М+3Н]³⁺ (Χ5₆Η₂5₀Ν₅₃0₄₆8₄) т/ζ = 1244; Найдено Ε5Ι: [М+3Н]³⁺ Χ156Η250Ν5304684) т/ζ = 1244.

Синтез молекулы для селективной доставки 8ΏΜ-16.

Смесь интермедиата 20 (1.4 мг, 0.3 мкмоль) и тΡΕС(40Κ)-8Η (14 мг, 0.35 мкмоль) в буфере ЗФРЭДТА (2 мл, 137 мМ ΝαΟ, 7 мМ Να₂ΗΡ0₄, 3 мМ КС1, 1.4 мМ Κ₃Ρ0₄, 4 мМ ЭДТА, ρΗ 7.4) перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 20 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала молекулу для селективной доставки 8ΏΜ-16 (6.5 мг, 49%).

Молекулы для селективной доставки 8ΏΜ-17, 8ΏΜ-18 получали аналогично 8ΏΜ-16 из пептида Р-5.

Пример 6. Синтез 8ΏΜ-33 из пептида Р-7

- 48 030795

Синтез интермедиата 21.

К раствору пептида Р-7 (20 мг, 4.1 мкмоль) в ΌΜΡ (1 мл) при перемешивании при комнатной температуре в темноте прибавляли Су5 малеимид (6 мг, 6.6 мкмоль) и Ν-метилморфолин (10 мкл, 91 мкмоль). За ходом реакции следили с помощью ЖХ-МС и завершали реакцию через 1 ч. Смесь очищали методом ОФ-ВЭЖХ, получая интермедиат 21 (9 мг, 40%). Вычислено: [М+3Н]³+ (^₈₂Η₂₈₉Ν₆₀Ο₅₈δ₄) т/ζ = 1458; Найдено ΕδΙ: [Μ+3Η]³+ ((78:11^60(^.,) т/ζ = 1458.

Синтез интермедиата 22.

К раствору интермедиата 21 (9 мг, 1.6 мкмоль) в ΌΜΡ (1 мл) при комнатной температуре прибавляли сукцинимидиловый эфир Су7 карбоновой кислоты (3 мг, 3.1 мкмоль) и Ν-метилморфолин (10 мкл, 91 мкмоль). Полученную при этом смесь перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала интермедиат 22 (4.9 мг, 50%). Вычислено: [М+3Н]³+ ^217Η329Ν62θ65δ6) т/ζ = 1679; Найдено ΕδΙ: [Μ+3Η]³+ (^17Η₃₂9Ν₆₂Ο₆58₆) т/ζ = 1679.

Синтез молекулы для селективной доставки δΌΜ-33.

Смесь интермедиата 22 (0.9 мг, 0.15 мкмоль) и тРЕО(10К)-ОНИ₂ (3 мг, 0.3 мкмоль) в глициновом буфере (1 мл, 0.1 М, 20 мМ анилина, ρΗ 3.0) и ацетонитриле (0.2 мл) перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 3 дней. По завершении реакции прибавляли ацетофенон (10 мкл, 86 мкмоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала молекулу для селективной доставки δΌΜ-33 (0.8 мг, 38%).

Молекулу для селективной доставки δΌΜ-34 получали аналогично δΌΜ-33 из интермедиата 22.

Пример 7. Синтез δΌΜ-36 из пептида Р-8

- 49 030795

Синтез интермедиата 23.

К раствору пептида Р-8 (10 мг, 1.7 мкмоль) в РМР (1 мл) при перемешивании в темноте при комнатной температуре прибавляли Су5 малеимид (4 мг, 4.4 мкмоль) и Ν-метилморфолин (10 мкл, 91 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 1 ч. Очистка методом ОФВЭЖХ дала интермедиат 23 (5.4 мг, 48%).

Синтез молекулы для селективной доставки 81)М-36.

К раствору интермедиата 23 (5.4 мг, 0.82 мкмоль) в ЭМР (1 мл) при комнатной температуре прибавляли сукцинимидиловый эфир Су7 карбоновой кислоты (3 мг, 3.1 мкмоль) и Ν-метилморфолин (10 мкл, 91 мкмоль). Полученную при этом смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 36 ч. Очисткой методом ОФ-ВЭЖХ получали 8РМ-36 (0.7 мг, 13%).

Молекулы для селективной доставки 8РМ-37 получали аналогично 8РМ-36 из пептида Р-8.

Пример 8. Синтез 8РМ-38 из пептида Р-10

- 50 030795

Синтез интермедиата 24.

К раствору пептида Р-10 (10 мг, 1.4 мкмоль) в ЗФР буфере (рН 7.4, 1 мл) при перемешивании в темноте при комнатной температуре прибавляли Су5 малеимид (4 мг, 4.4 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала интермедиат 24 (7.9 мг, 79%).

Синтез молекулы для селективной доставки 8ΟΜ1-38.

К раствору интермедиата 24 (7.9 мг, 1.1 мкмоль) в ΏΜΡ (1 мл) при комнатной температуре прибавляли сукцинимидиловый эфир Су7 карбоновой кислоты (2 мг, 2.0 мкмоль) и Ν-метилморфолин (10 мкл, 91 мкмоль). Полученную при этом смесь перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 36 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала молекулы для селективной доставки 8ΟΜ-38 (1.7 мг, 19%).

Молекулы для селективной доставки 8ΟΜ-39 получали аналогично 8ΟΜ-38 из пептида Р-10.

Пример 9. Синтез 8ΏΜ-40 из пептида Р-8

δϋΜ-40

Синтез интермедиата 25.

К раствору пептида Р-8 (10 мг, 1.7 мкмоль) в ΏΜΡ (1 мл) при перемешивании при комнатной температуре в темноте прибавляли Су7 малеимид (4 мг, 4.2 мкмоль) и Ν-метилморфолин (10 мкл, 91 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 1 ч. Очистка методом ОФВЭЖХ дала интермедиат 23 (3.1 мг, 28%).

Синтез молекулы для селективной доставки 8ΟΜ-40.

К раствору интермедиата 23 (3.1 мг, 0.47 мкмоль) в ΏΜΡ (1 мл) при комнатной температуре прибавляли сукцинимидиловый эфир Су5 карбоновой кислоты (2 мг, 2.1 мкмоль) и Ν-метилморфолин (5 мкл, 46 мкмоль). Полученную при этом смесь перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала 8ΏΜ-40 (1.4 мг, 41%).

Пример 10. Синтез 8ΟΜ-30 из пептида Р-3

- 51 030795

Смесь интермедиата 8 (3 мг, 0.64 мкмоль) и Су7-ΟNН₂ (3 мг, 2.9 мкмоль) в глициновом буфере (4 мл, 0.1 М, 20 мМ анилина, рН 3.0) и ацетонитриле (0.1 мл) перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 36 ч. Очисткой методом ОФ-ВЭЖХ получили интермедиат 26 (1.1 мг, 31%). Вычислено: [М+3Н]³+ (С189Н28^55О50§6) т/ζ = 1441; Найдено Е8Р [М+3Н]³+ (^89^8^505086) т/ζ = 1441. Су7ΟΝΗ₂ получали из Су7-СООН и 2-^-фталимидо-(аминоокси)]этиламина в стандартных условиях образования амидной связи с последующим снятием фталимидной защитной группы гидразином. 2-[Νфталимидо-(аминоокси)]этанамин получали из продажного Ν-Вос-этаноламина и Ν-гидроксифталимида по реакции Митсунобу с отщеплением группы Вос с помощью ТРА.

Синтез интермедиата 27.

К раствору интермедиата 26 (1.1 мг, 0.2 мкмоль) в ЭМР (1 мл) при комнатной температуре прибавляли РРр-эфир 3-малеимидопропионовой кислоты (0.5 мг, 1.5 мкмоль) и Ν-метилморфолин (5 мкл, 45 мкмоль). Полученную смесь перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 36 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала интермедиат 27 (0.8 мг, 75%). Вычислено: [М+3Н]³+ (С1₉₆Н₂₉^₅₆О₅₃ 8₆) т/ζ = 1491; Найдено Е8Р [М+3Н]³+ (Сх96Н29М6О53§6) т/ζ = 1491.

Синтез молекулы для селективной доставки 8ЭМ-30.

- 52 030795

Смесь интермедиата 27 (0.7 мг, 0.15 мкмоль) и тРЕО(10К)-8Н (3 мг, 0.3 мкмоль) в буфере ЗФРЭДТА (0.5 мл, 137 мМ ДаС1, 7 мМ Да₂НРО₄, 3 мМ КС1, 1.4 мМ К₃РО₄, 4 мМ ЭДТА, рН 7.4) перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 40 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала молекулу для селективной доставки 8БМ-30 (1.2 мг, 23%).

Молекулы для селективной доставки 8БМ-32 и 8БМ-35 получали аналогично 8БМ-30 из пептидов Р-3 и Р-4.

К раствору пептида Р-6 (30 мг, 7.6 мкмоль) в БМР (2 мл) при комнатной температуре и при перемешивании в темноте прибавляли Су5 малеимид (9 мг, 9.4 мкмоль) и Ν-метилморфолин (15 мкл, 137 мкмоль). За ходом реакции следили с помощью ЖХ-МС и реакцию завершали через 1 ч. Очистка методом ОФ-ВЭЖХ дала интермедиат 28 (24.9 мг, 68%). Вычислено: [М+3Н]³+ (С₁₅₆Н₂₄₉Д₅₂О₄₅8₄) т/ζ = 1233; Найдено Е81: [М+3Н]³+ (С15вН249Д52О4584) т/ζ = 1233.

Синтез интермедиата 29.

К раствору интермедиата 28 (17.7 мг, 3.7 мкмоль) в БМР (1.5 мл) при комнатной температуре прибавляли сукцинимидиловый эфир Су7 карбоновой кислоты (5 мг, 5.5 мкмоль) и Ν-метилморфолин (20 мкл, 0.18 мкмоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 30 ч. Очистка смеси с помощью ОФ-ВЭЖХ дала интермедиат 29 (7.1 мг, 35%). Вычислено: [М+3Н]³⁺(Сх91Н289Д54О5286) т/ζ = 1455; Найдено Е81: [М+3Н]³+ (Сх9хН2₈9Д54О5286) т/ζ = 1455.

Синтез молекулы для селективной доставки 8БМ-21.

Смесь интермедиата 29 (1.8 мг, 0.33 мкмоль) и тРЕО(10К)-ОДН₂ (4 мг, 0.4 мкмоль) в глициновом буфере (1 мл, 0.1 М, 20 мМ анилина, рН 3.0) и ацетонитриле (0.1 мл) перемешивали в темноте при комнатной температуре в течение 3 дней. Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ дала молекулу для селективной доставки 8БМ-21 (1.0 мг, 20%).

Молекулы для селективной доставки 8БМ-19 и 8БМ-20 получали аналогично 8БМ-21 из интермедиата 29.

Пример 12. Зависимые от фермента усиление флуоресценции и изменения цвета.

Молекулу для селективной доставки 9 растворяли в буфере ТСДВ (50 мМ Тпз, рН 7.5, с 10 мМ хлорида кальция, 150 мМ хлорида натрия и 0.05% ВКЛ 35) при комнатной температуре, получая раствор с концентрацией 1 цМ. Спектры флуоресценции регистрировали на флуоресцентном спектрометре Р-2500. Донор флуоресценции Су5 возбуждали, используя свет с длиной волны 625 нм, и регистрировали эмис- 53 030795 сию (излучение) в интервале волн от 660 до 800 нм. Максимальную эмиссию (пик излучения) донора Су5 наблюдается при ~670 нм, а пик РЕЕТ излучения Су7 акцептора наблюдается в области ~780 нм, как показано на фиг. 2. Отщепление пептида инициировали, добавляя матриксную металлопротеазу-2 (ММР-2) до конечной концентрации 1 нМ. Реакция отщепления завершалась через 2 ч, и спектр флуоресценции указывал на нарушение РЕЕТ (флуоресцентного резонансного переноса энергии) и большое 8-кратное увеличение эмиссии (излучения) донора Су5 и 2-кратное снижение эмиссии Су7. На самом деле снижение имманентной флуоресценции Су7 больше, однако оно перекрывается с плечом длинных волн Су5. Этот результат показывает, что ЗЭМ-9 вызывает эффективный перенос энергии от Су5 к Су7 в интактном пептиде.

Пример 13. Зависимые от фермента усиление флуоресценции и изменения цвета.

Молекулу для селективной доставки 10 растворяли в буфере ТСNΒ (рН 7.5) при комнатной температуре, получая раствор с концентрацией 1 цМ. Спектры флуоресценции регистрировали на флуоресцентном спектрометре Р-2500. Донор флуоресценции Су5 возбуждали светом с длиной волны 625 нм и измеряли эмиссию (излучение) при 669 нм. Отщепление пептида инициировали, добавляя ММР-9 до конечной концентрации 1 нМ. Реакция отщепления завершалась через 2 ч, флуоресценция усиливалась более чем в 100 раз после отщепления протеазы, фиг. 3. Значительное усиление флуоресценции (реакции) показывает, что краситель-тушитель эффективно гасит Су5 флуорофор в нерасщеплённой молекуле ЗОМ-10.

Пример 14. Флуорогенная реакция при использовании гомогената опухолевой ткани.

Клетки НТ1080 (Са1. # ССР-121; Атепсап Туре Си1!иге Со11ес!юп, УА, иЗА) выращивали в условиях фазы экспоненциального роста в атмосфере влажного воздуха с 5% СО₂ при 37°С до достижения 80100%-ного монослоя, а затем собирали для имплантации мышам. Каждую голую мышь (бестимусную мышь с мутацией пийе) удерживали руками и каждой мыши инъецировали 2х10⁶ НТ-1080 клеток в жировую ткань молочной железы, используя иглу 25-О. Опухолевые ткани НТ-1080 собирали, когда они достигали размера 100-200 мм³ (обычно через 1-2 недели после имплантации опухолевых клеток).

Опухолевые НТ-1080 ткани гомогенизировали, разрушая их с помощью ультразвука. 1 нМ ММР-9 или 10 мкл гомогенатов опухолевых тканей (ТН2 и ТН3) перемешивали с 1 мкМ ЗЭМ-10 в 100 мкл буфера в течение 24 ч при 37°С. Молекулу для селективной доставки 6 использовали в качестве флуоресцентного контроля, по размеру аналогичного интактной ЗЭМ-10. Образцы наносили на полиакриламидный гель и разделяли с помощью электрофореза. Результаты приведены на фиг. 4, они показывают, что молекула ЗЭМ-10 практически не является флуоресцентной перед отщеплением. После инкубации с гомогенатами опухолевой ткани НТ-1080 ЗЭМ-10 отщепляется и становится в высокой степени флуоресцентной. ОМ6001 является обычным широкого спектра ингибитором ММРз. Тот факт, что ОМ6001 ингибирует расщепление, показывает, что расщепление гомогената вызвано ММРз, ассоциированными с опухолями.

Пример 15. 1п У1уо визуализация флуоресцентного контраста опухоли.

Модель ксенотрансплантатов опухоли НТ-1080 получали, как описано в примере 14, и применяли для оценки способности молекул обеспечивать т У1уо флуоресцентный контраст опухоли по сравнению с окружающими тканями. Флуоресцентные конъюгаты тестировали на несущих НТ-1080 опухоль мышах по достижении размера опухоли 100-200 мм³ (обычно через 1-2 недели после имплантации опухолевых клеток). Подвижность бодрствующих мышей, несущих опухоли НТ-1080, ограничивали, используя вращающийся хвостовой инъектор (Са!.# ЕТ1; вгат!гее ЗсчепИЙс, МА, иЗА) и вводили внутривенно (в хвостовую вену) каждой мыши тестируемое соединение в дозе от 0.1 до 5 нмоль в 100 мкл физиологического раствора. При использовании препарата для визуализации мышей подвергали слабой анестезии смесью кетамин/ксилазин (Са!.# К-113; З1§та, А1йпсй, МО, иЗА) с помощью интраперитонеальной инъекции (1 мкл/г веса тела), чтобы свести подвижность к минимуму.

Серийную тотальную визуализацию (включая опухоль) проводили, используя систему полной флуоресцентной визуализации животного или флуоресцентный микроскоп на основе стереомикроскопа О1утриз. Мышей клали на спину и визуализацию осуществляли, начиная сверху, чтобы получить изображение со стороны брюшной полости животного. Длины волн возбуждения и эмиссии (излучения) выбирали с учётом применяемого красителя. Контраст рассчитывали по следующему уравнению:

Контраст = (Интенсивность флуоресценции опухоли - интенсивность флуоресценции ткани на противоположной стороне груди) / интенсивность флуоресценции ткани на противоположной стороне груди).

Величина контраста более 0.4 в организме животного в целом легко обнаруживается на глаз на изображении целого животного и является хорошим контрастом. Контраст >0.7 является высоким контрастом.

Изображения мышей получают несколько раз в течение 1-24 ч после инъекции.

Типичные результаты визуализации через два часа после введения дозы молекулы для селективной доставки 6 трём различным мышам показаны на фиг. 1. В этом конкретном случае средняя величина

- 54 030795 контраста 1.1. Другие соединения тестировали аналогичным способом и значения контраста представлены в табл. 1.

Таблица 1

Краткие сведения об ΐη νΐνο значениях контраста конъюгата пептида, полученные на модели НТ-1080 ксенотрансплантата

Молекула для селективной доставки	Максимальный контраст (>0.4 = хороший; >0.9 = высокий)	Время до максимального контраста (час) (очень быстро < 4; 4< быстро < 12; > 12 медленно)
1	Хороший	Быстро
2	Высокий	Быстро
3	Высокий	Медленно
4
5
6	Высокий	Очень быстро
7	Высокий	Медленно
8	Хороший	Очень быстро
9	Высокий	Быстро

Пример 1б. Ы νΐνο распределение и соединения с повышенным накоплением в тканях.

Для определения общего накопления красителя в различных органах мышей с НТ-1080 ксенотрансплантатами умерщвляли и образцы ткани из крови, печени, почки опухоли отбирали через б ч после введения соединений в хвостовую вену. Для каждой экспериментальной точки использовали 3-4 мыши. Образцы крови хранили при 4°С в течение ночи, а затем центрифугировали со скоростью вращения ротора 15000 об/мин для отделения сыворотки. Органы перемешивали в буфере РгоК (0.25 мг/мл Ргок, 0.1 мг/мл ДНК-азы, 150 мМ №С1, 10 мМ Ττΐδ рН 8.0, 0.2% δϋδ) в объёме 10 мкл/мг ткани и разрезали ножницами на маленькие фрагменты. Затем ткань/гидролизующий раствор подвергали ультразвуковому воздействию в течение 1 мин при б7% рабочем цикле и расщепляли в течение ночи при 37°С. После расщепления образец центрифугировали при скорости 15000 об/мин и гомогенат ткани отсасывали и хранили при 4°С.

Концентрацию флуоресцентных соединений в тканях определяли на стандартных кривых флуоресценции, полученных добавлением известных концентраций вводимых соединений в сыворотку и гомогенаты тканей (в различных разведениях) контрольных животных, которым не вводили инъекции соединений. Для каждого соединения определяли линейный интервал для каждой ткани. Измерения флуоресценции проводили либо с помощью флуоресцентного планшет-ридера, либо с помощью флуоресцентного спектрометра. Результаты биораспределения в тканях в случае молекул для селективной доставки 1, 2 и б показаны на фиг. 5. Неожиданным результатом явилось то, что распределение молекулы для селективной доставки б в опухолевой ткани в 5 раз выше по сравнению с молекулами для селективной доставки 1 и 2. Этот неожиданный результат обусловлен асимметрическим ядром, состоящим из неравного числа положительно и отрицательно заряженных аминокислот пептидного скелета. Молекулы для селективной доставки 1 и 2 имеют равное число положительно и отрицательно заряженных остовов, в результате ядро является фактически нейтральным, тогда как молекула для селективной доставки б имеет общий заряд 3+ благодаря положительно заряженным аргининовым остаткам. Это показывает, что соединения с разным числом кислых и основных аминокислот обладают улучшенными и полезными свойствами ΐη νΐνο и имеют лучшее и более полезное биораспределение по сравнению с симметричными молекулами.

Пример 17. Ы νΐνο обнаружение метастазов рака в лимфатических узлах с помощью РЕЕТ δΙ)\1.

Флуоресцентное мечение метастатических цервикальных метастатических узлов после внутривенного и перитуморального введения флуоресцентных δΙ)\1 мышам, несущим опухоль.

Нижеприведённые модель и анализы применяли для определения способности флуоресцентных δΙ)\1 детектировать метастазы рака в лимфатические узлы иммунокомпетентных вАЬв/с мышей (Сйаг1е§ [Дуег, \\'ί1ηιίιψΙοη, МА 01887), несущих сингенные опухоли уха.

Мышиная модель. Мышей, группами по 4 мыши, помещали в индивидуально вентилируемые ТУС клетки одноразового пользования (ΊηηοντνΌ, Шс., δαη I Хешем СА 92121) и обеспечивали им свободный доступ к стандартному лабораторному корму (Са!. # 2018, Наг1ап ^аЬο^аίο^^еδ, Шс. Iηά^аηарο1^δ, Ш 4б250) и питьевой воде. Животных держали в условиях регулирования окружающей среды (12-часовой световой день) в течение по меньшей мере 5 дней перед имплантацией опухолевых клеток. Все эксперименты проводили в соответствии с протоколом # ЕВ11-002-009А, одобренным кАСиС. Мышиные опухолевые клетки 4Т1 (АТСС® ХитЬе'г: СКЬ-2539™) и рака молочной железы (Рο1уοта М1бб1е Т 8119 субклон РуМТ 8119) из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Маηаδδаδ, УА 20108) и из университета Сан Диего Калифорния ^ап ϋίχ'μο, Сай&гша) (υСδ^, Ьа ΙοΠθ, СА 92093), соответственно, выращи- 55 030795 вали отдельно, используя стандартные методы культивирования клеток. Опухолевые клетки (4х10⁵ опухолевых клеток/50 мкл/мышь) суспендировали в ДЗФР/Μаΐ^^де1™ (1:1 об.) и вводили в виде подкожной инъекции в ушную раковину мыши в область выше хряща для индукции роста первичной опухоли. Ιη νίνο визуализацию метастатических цервикальных лимфатических узлов мышей, несущих опухоль уха, использовали для наблюдения за опухолью мышей в качестве суррогатной мышиной модели метастатического рака молочной железы, который появлялся через семнадцать-двадцать дней после имплантации опухолевых клеток.

Введение 8ΌΜ тестируемого соединения. Для внутривенного введения (инъекция в хвостовую вену) 8ΌΜ движение мышей ограничивали, используя вращающийся хвостовой инъектор (СаР#КТ1, Вгаш1гее 8шепййс, 1пс., Вгашйее, ΜΑ 02185), и тестируемое изделие (5-120 мкМ; 100 мкл/мышь) инъецировали мыши с помощью инсулинового шприца 28Ο^1/2 (Са!. # 14-826-79, ВесЮп Ό^Ηηδοη апб САтрапе, Ргапкйп Ьакез, N1 07417). Для осуществления перитуморальной инъекции 8ΌΜδ каждую мышь, участвующую в испытании, анестезировали смесью кетамин/кселазин (Ке1а|ес1®^: & Ху1а-_)ес1®, ΡΙκκίιιχ ΡΙκιγтасеийса1з, 8ΐ. Юзерй, ΜΟ 64506), вводимой интраперитонеально, и тестируемое изделие (5-120 мкМ; 30-60 мкл/ухо) вводили подкожно около (вокруг) первичной опухоли и в ушную раковину противоположного уха с помощью иглы 300 Ρι^^^ΟΗ^™ (Са!. # 305106, ВесЮп ^^ск^ηзοη апб САтрапе, РгапкНп Ьакез, N6 07417). После введения дозы каждую мышь возвращали в предназначенную для неё клетку и держали в условиях регулируемой окружающей среды до момента визуализации. Флуоресцентную визуализацию цервикальных лимфатических узлов проводили через 1-24 ч после введения соединения по описанной ниже методике.

Флуоресцентная визуализация. Для визуализации цервикальных лимфатических узлов применяли глубокую анестезию, вводя каждой мыши интраперитонеально смесь кетамин/ксилазин. Мышь в состоянии глубокой анестезии переносили на лист чёрного пробкового агломерата (4x4 дюймов, Оиайе!®, АССО Вгапбз, Γί^οΙ^ΗίΐΌ, 1Ь 60069, И8А) для тупого отделения и визуализации цервикальных лимфоузлов с использованием компьютеризованного флуоресцентного стереомикроскопа (8ΖΧ10, О1утриз Орйса1, СО, ЦГО, барап), снабжённого соответствующими фильтрами флуоресценции как для обнаружения одиночной интенсивности флуоресценции, так и для определения отношения флуоресценции двух флуорофоров. Например, фильтры для Су5 и Су7 применяли для определения на основе РбАЕТ 8ΌΜ с участием РбАЕТ пары Су5 и Су7. После ш νίνο визуализации флуоресценции (метод визуализации отношения см. ниже) цервикальные лимфоузлы удаляли хирургическим путём, фиксировали в 10% забуференном формалине и обрабатывали для гистологии (окрашивание гематоксилином и эозином, Н&Е), чтобы оценить корреляцию флуоресценция/раковая опухоль и определить диагностические характеристики качества 8ΌΜ.

Метод визуализации отношения (интенсивности) эмиссии (излучения). Флуоресцентные изображения получали с помощью исследовательского стереомикроскопа О1утриз 8ΖΧ10 Кезеагсй 81όιόο ΥΙιοιόзсюре (О1утриз Атепса, СеШег Vа11еу, ΡΑ). В случае Су5 и Су7 РКЕТ 8ΌΜ для получения двух изображений при различных длинах волн излучения (эмиссии) применяли фильтр возбуждения, центрированный на 620 нм (Сйгота ЕТ620/60х, Сйгота Тесйηο1οду СоОФ. Ве11ο^з Ра11з, УТ), и эмиссионные фильтры, центрированные на 700 нм и на 810 нм (фильтры Сйгота ЕТ700/75т и ЕТ810/90т). Изображения получали с помощью камеры Огса-К2 (Натата!зи, ВпбдехуаЮг, N6), соединённой с компьютером на базе ^тбοшз. Для определения отношений эмиссии (излучения) в случае лимфоузлов применяли два метода. В одном методе интенсивность усредняли в области, представляющей интерес (КО1), включающей часть лимфоузла, представляющего интерес, или весь лимфоузел, представляющий интерес. Затем рассчитывали отношение (интенсивностей) эмиссии (излучения), исходя из интенсивностей для каждой области, представляющей интерес.

отношение эмиссии Κοί = (ΓθίΙηΐ1/Εχρ1)/(Ιηΐ2/Εχρ2) (уравнение 1), где гоЙпН = усреднённая интенсивность для КО1 при длине волны эмиссии (излучения) 1 с фильтром ЕТ700/75т,

Ехр1 = время экспозиции для 1пН, гоЙп12 = средняя интенсивность для КО1 при длине волны эмиссии (излучения) 2 с фильтром ЕТ810/90т,

Ехр2 = время экспозиции для 1п!2.

Второй метод, применявшийся для определения отношения эмиссии, был основан на усреднении отношения эмиссии в области, представляющей интерес, (КО1), включающей часть лимфоузла или весь лимфоузел, представляющий интерес, полученного на основании отношения сигналов эмиссии. Отношение сигналов эмиссии получали, применяя модифицированное уравнение 1, включающее масштабный фактор, с тем, чтобы значения в пикселах были между 0 и 255 для 8-битного изображения.

Отношение эмиссии Рх = к * (ρχΙηΐ1/Εχρ1)/(ρχΙηΐ2/Εχρ2) (уравнение 2), где к = масштабный фактор, рх1пН = интенсивность в пикселах при длине волны эмиссии (излучения) 1 с фильтром ЕТ700/75т,

Ехр1 = время экспозиции для 1пН,

- 56 030795 ρχΙηΐ2 = интенсивность в пикселах при длине волны эмиссии (излучения) 2 с фильтром ЕТ810/90т,

Ехр2 = время экспозиции для Ιηΐ2.

При определении отношения (интенсивностей) эмиссии для лимфоузлов обоими методами получали количественно аналогичные результаты.

Состояние лимфоузлов, являются они метастатическими или не метастатическими, определял патоморфолог на основании окрашивания с помощью Н&Е. Затем определяли количественно контраст отношений эмиссии для каждой δϋΜ (молекулы для селективной доставки), деля среднее отношение эмиссии метастатических лимфоузлов на среднее отношение эмиссии неметастатических лимфоузлов и вычитая единицу, как показано в уравнении 3

ЕКС - Ме1АУ/СопАУ - 1 (Уравнение 3), где ЕКС = контраст отношения эмиссии,

ΜеίАУ = среднее отношение эмиссии метастатического лимфоузла,

СопАУ = среднее отношение эмиссии неметастатического лимфоузла.

Пример изображения отношения эмиссии показан на фиг. 6. На правом рисунке показан снимок (изображение) отношения, где виден высокий контраст между метастатическим лимфоузлом (очень большой узел, показанный тёмной стрелкой слева внизу) и неметастатическими узлами (показаны другими стрелками). Более высокое отношение показано в виде более светлых пикселей (метастатический узел) по сравнению с более тёмными пикселами с более низким отношением для неметастатических узлов.

Применимый для детекции раковых лимфоузлов контраст от 20 до 50% полагали хорошим, увеличение от 50 до 100% полагали высоким, тогда как увеличение выше 100% рассматривали как очень высокий контраст.

Таблица 2

Данные для δϋΜ ΐη νίνο контраста отношений, полученные на мышиной опухолевой модели 4Т1

Молекула для селективной доставки	IV Максимальный контраст (низкий <20%, хороший 20% 50%, высокий >50% - 100%, очень высокий > 100%)	Перитуморальный максимальный контраст (низкий <20%, хороший 20% - 50%, высокий >50% - 100%, очень высокий > 100%)
8ΌΜ-9	ηά	Низкий
8ΌΜ-11	ηά	Низкий
8ΌΜ-12	ηά	Хороший
8ΌΜ-13	Хороший	Хороший
8ΌΜ-14	Хороший	Очень высокий
8ΌΜ-19		Хороший
3ΌΜ-20		Низкий
8ΌΜ-21	ηά	Хороший
8ΌΜ-22		Низкий
8ΌΜ-23	Высокий	Очень высокий
8ΌΜ-24	Очень высокий	Очень высокий
8ΌΜ-25	Очень высокий	Очень высокий
8ΌΜ-27	Очень высокий	ηά
8ΌΜ-28	Хороший	Высокий
8ΌΜ -29	ηά	Высокий
3ΌΜ-30	ηά	Очень высокий
8ΌΜ-31	Низкий	ηά
8ΌΜ-32	Очень высокий	Очень высокий
8ΌΜ-33	Низкий	Высокий
8ΌΜ-35	Очень высокий	Хороший
8ΌΜ-36	Высокий	Хороший
8ΌΜ-37	Низкий	ηά
δϋΜ-38	Хороший	ηά
8ΌΜ-39	Хороший	Высокий
8ϋΜ-40	ηά	Высокий

пб = не определяли

Пример 18. Ех νίνο анализ активности по отношению к мышиной ΡуΜТ 8119 опухоли: расщепле- 57 030795 ние 8ЭМ и реакция отношения эмиссии РКЕТ в ткани раковой опухоли мышеи по сравнению со здоровой тканью.

Образцы опухолевой и мышечной ткани несущих опухоль мышей РуМТ 8119 собирали и замораживали при -80°С. Ткани размораживали и гомогенизировали в холодном ТСГОВ буфере (рН 7.5, 50 мМ ТГ18-НС1, 10 мМ СаС1₂, 150 мМ №·ιθ и 0.05% Вгу35) при 100 мг/200 мкл, разрушая ультразвуком (VСX500, 8отс§ & МаЮпаЕ Шс., №\\1о\уп. СТ). Гомогенаты центрифугировали со скоростью 15000 об/мин при 4°С в течение 20 мин, супернатанты собирали. К супернатантам (90 мкл) прибавляли АРМА (п-аминофенилртутьацетат, 90 мкл, 2 мМ в ТСNВ буфере). Полученную смесь перед употреблением инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Для расщепления 45 мкл супернатантов активированных тканей использовали 500 нМ 8ЭМ-23 (конечный объём: 50 мкл). Анализ проводили на спектрометре 8рес1гаМах М2 с использованием программы 8ойМах Рго ν4.5. Сигналы флуоресценции (Хех, 620 нм, Хет, 670 нм), (Хех, 620 нм, Хет, 773 нм) и (Хех, 720 нм; Хет, 773 нм), где Хех и Хет означают длину волны возбуждения и эмиссии (излучения), соответственно, определяли при комнатной температуре в зависимости от времени. Образцы анализировали в тройном повторе, и результатом РКЕТ 8ЭМ расщепления было повышенное отношение Су5/Су7 эмиссии флуоресценции в условия эксперимента: сигналы регистрировали Су5 (Хех, 620 нм, Хет, 670 нм) и Су7 (Хех, 620 нм, Хет, 773 нм).

Ферментативная активность при использовании тканей вызывала расщепление 8ЭМ-23 и давала большое увеличение отношения эмиссии РКЕТ (указанная первичная опухоль), как показано на фиг. 7. Увеличение отношения является результатом расщепления 8ЭМ. Эти данные показывают, что молекула 8ЭМ-23 является очень активной в раковых тканях опухоли молочной железы у мышей и расщепляется значительно интенсивнее в раковой ткани по сравнению с нормальной мышечной тканью, которая не проявляет активности в этом анализе.

Пример 19. Ех νί\Ό анализ тканей человека: расщепление 8ЭМ и реакция отношения эмиссии РКЕТ в ткани раковой опухоли человека по сравнению со здоровой тканью.

Образцы ткани раковой опухоли человеческой молочной железы и здоровой ткани человеческой молочной железы (предоставленные Сапсег Нитап Т188ие №1\\όγ1<) гомогенизировали в холодном ТСNВ буфере (рН 7.5, 50 мМ, Тп8-НС1, 10 мМ СаС1₂, 150 мМ ΝηΟ и 0.05% Вгу35) с концентрацией 100 мг/200 мкл с помощью ультразвука (VСX500, §опю8 & Ма1епаЕ Шс, Кенти, СТ). Гомогенаты центрифугировали со скоростью 15000 об/мин при 4°С в течение 20 мин, супернатанты собирали. Если не указано иначе, для расщепления 45 мкл супернатантов активированных тканей использовали 500 нМ 8ЭМ-23 (конечный объём: 50 мкл). Анализ проводили на спектрометре 8рес1гаМах М2 с использованием программы 8ойМах Рго ν4.5. Сигналы флуоресценции (Хех, 620 нм, Хет, 670 нм), (Хех, 620 нм, Хет, 773 нм) и (Хех, 720 нм; Хет, 773 нм), где Хех и Хет означают длину волны возбуждения и эмиссии (излучения), соответственно, определяли при комнатной температуре в зависимости от времени. Образцы анализировали в тройном повторе, и результатом РКЕТ 8ЭМ расщепления было повышенное отношение Су5/Су7 эмиссии флуоресценции в условия эксперимента: сигналы регистрировали Су5 (Хех, 620 нм, Хет, 670 нм) и Су7 (Хех, 620 нм, Хет, 773 нм). Пример с использованием 8ЭМ-25 показан на фиг. 8. Эксперименты с другими 8ЭМ5 проводили по той же методике. Зависимое от расщепления изменение флуоресценции можно также определять количественно как скорость расщепления отношение изменения в единицу времени, как показано на фиг. 9 для 8ЭМ-25 и 8ЭМ-32. Скорости рассчитывали на основании угла наклона кривой, построенной по данным, полученным начиная с момента 0 до 300 мин.

Пример 20. Высокая чувствительность и специфичность метода диагностики с применением 8ЭМ на модели метастатических лимфатических узлов.

Основными показателями эффективности диагностического агента являются чувствительность и специфичность. Чувствительность отражает способность правильно распознавать положительные реакции на тест. В то время как специфичность относится к способности правильно распознавать отрицательные реакции на тест.

В качестве примера высокой эффективности диагностики с помощью РКЕТ 8ЭМ мы приводим результаты, полученные при использовании 8ЭМ-24 на мышиной модели с 4Т1 метастатической опухолью лимфатических узлов. δ ЭМ-24 вводили с помощью IV инъекции в хвостовую вену. Начиная с 3 до 6 ч после этого получали изображения лимфатических узлов мыши, применяя визуализацию отношения флуоресценции, описанную выше, чтобы определить, является ли это отношение на изображении лимфатического узла высоким (определяется как положительный лимфоузел) или низким (отрицательный лимфоузел). Чувствительность и специфичность определяли на основании графика зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (КОС), или КОС кривые ОШрС/еплуПлреШа.огдЛуПл/Кесеп'ег орегайпд скагасЮгМю). Для анализа с применением КОС-кривых результаты классифицировали по бинарной шкале-положительные и отрицательные - с учётом порогового значения отношения эмиссии. Строили КОС-кривую зависимости между долей истинно положительных случаев среди положительных результатов (уровень истинно положительных результатов) и долей ложноположительных случаев среди отрицательных результатов (уровень ложноположительных результатов).

- 58 030795

Истинно положительные, ложноположительные, истинно отрицательные и ложноотрицательные результаты определяли, сравнивая прогноз на основании данных об отношении эмиссии флуоресценции и порогового значения с отнесением к положительным или отрицательным, сделанным патоморфологом на основании Н&Е окрашивания. Значения отношения эмиссии для положительных и отрицательных результатов (по определению с помощью Н&Е гистопатологии) показаны на фиг. 10. Пороговое значение постепенно корректировали от низкого до высокого, получая полную К0С-кривую от (1, 1) или полностью положительных до (0, 0) или полностью отрицательных результатов. К0С-кривая показана на фиг. 11. Для построения этой кривой использовали данные, полученные при изучении 48 лимфоузлов. Следует отметить, что чувствительность и специфичность можно определить для каждой точки на К0Скривой. Чувствительность это доля (уровень) истинно положительных результатов, тогда как специфичность имеет значение единица минус доля ложноположительных результатов (ложноположительный уровень). Уравнения, применяемые для построения К0С-кривой, показаны ниже.

ΤΡΚ = ТР/(ТР+Р^ РРК = РР/(РР+Т^ где ΊΓΚ = доля истинно положительных результатов,

РРК = доля ложноположительных результатов,

ТР = число истинно положительных результатов,

ΤN = число истинно отрицательных результатов,

РР = число ложноположительных результатов,

ΡN = число ложноотрицательных результатов.

В данном примере как чувствительность, так и специфичность составляют 100% для всех пороговых значений между 5.65 и 7.15. Это означает, что лимфатические узлы были корректно идентифицированы методом отношения эмиссии ΡΚΡΤ по сравнению с золотым стандартом диагностикигистопатологической экспертизой. Как правило, для чувствительности и специфичности значения >90% считаются очень высокими.

Пример 21. Применение 8ΌΜ для визуализации рака у больных раком молочной железы.

Больному раком молочной железы внутривенно вводили 8ΌΜ-25. Флуоресцентные частицы в 8ΌΜ-25 захватывались раковыми клетками и/или тканью после отщепления линкера. Источник света направляли на ткань-мишень. Флуоресцентные частицы излучали свет, который регистрировали с помощью фотокамеры или детектора. Результаты, полученные с помощью фотокамеры или детектора, обрабатывали, получая изображение, которое позволяло хирургу визуализировать раковые клетки или ткань. Хирург вырезал указанную ткань для биопсии.

Пример 22. Применение 8ΌΜ для визуализации рака у больных раком предстательной железы.

Больному раком предстательной железы внутривенно вводили 8ΌΜ-26. Флуоресцентные частицы в 8ΌΜ-26 захватывались раковыми клетками и/или тканью после отщепления линкера. Источник света направляли на ткань-мишень. Флуоресцентные частицы излучали свет, который регистрировали с помощью фотокамеры или детектора. Результаты, полученные с помощью фотокамеры или детектора, обрабатывали, получая изображение, которое позволяло хирургу визуализировать раковые клетки или ткань. Хирург вырезал указанную ткань для биопсии.

Пример 23. Применение 8ΌΜ для визуализации рака у больных раком головы и шеи (плоскоклеточным раком).

Больному раком головы и шеи внутривенно вводили 8ΌΜ-27. Флуоресцентные частицы в 8ΌΜ-27 захватывались раковыми клетками и/или тканью после отщепления линкера. Источник света направляли на ткань-мишень. Флуоресцентные частицы излучали свет, который регистрировали с помощью фотокамеры или детектора. Результаты, полученные с помощью фотокамеры или детектора, обрабатывали, получая изображение, которое позволяло хирургу визуализировать раковые клетки или ткань. Хирург вырезал указанную ткань для биопсии.

Пример 24. Применение 8ΌΜ для визуализации рака у больных меланомой.

Больному меланомой внутривенно вводили 8ΌΜ-24. Флуоресцентные частицы в 8ΌΜ-24 захватывались раковыми клетками и/или тканью после отщепления линкера. Источник света направляли на ткань-мишень. Флуоресцентные частицы излучали свет, который регистрировали с помощью фотокамеры или детектора. Результаты, полученные с помощью фотокамеры или детектора, обрабатывали, получая изображение, которое позволяло хирургу визуализировать раковые клетки или ткань. Хирург вырезал указанную ткань для биопсии.

Пример 25. Применение 8ΌΜ для визуализации рака у больных раком щитовидной железы.

Больному раком щитовидной железы внутривенно вводили 8ΌΜ-32. Флуоресцентные частицы в 8ΌΜ-32 захватывались раковыми клетками и/или тканью после отщепления линкера. Источник света направляли на ткань-мишень. Флуоресцентные частицы излучали свет, который регистрировали с помощью фотокамеры или детектора. Результаты, полученные с помощью фотокамеры или детектора, обрабатывали, получая изображение, которое позволяло хирургу визуализировать раковые клетки или ткань. Хирург вырезал указанную ткань для биопсии.

- 59 030795

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> АВЕЛАС БИОСАЙНСИЗ, ИНК.

<120> МОЛЕКУЛЫ ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОЙ ДОСТАВКИ И СПОСОБЫ ИХ ДОСТАВКИ <130> 39088-708.601 <140> РСТ/ИБ12/48732 <141> 2012-07-27 <150> 61/513,287 <151> 2011-07-29 <160> 41 <170> РаЬепЫп уегзгоп 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> РКТ <213> АгЬ1£1с1а1 Бедиепсе <220>

<223> БезсгЧрЬЧоп о£ АгЬ1£1с1а1 Бедиепсе: БупЬИеЬЧс рерЬШе <220>

<221> МОБ_КЕБ <222> (4)..(4) <223> Суз-Ме <400> 1

Рго Ьеи О1у Суз А1а О1у 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> РКТ <213> АгЬ1£1с1а1 Бедиепсе <220>

<223> БезсгЧрЬЧоп о£ АгЬ1£1с1а1 Бедиепсе: БупЬИеЬЧс рерЬШе <400> 2

Рго Ьеи О1у Ьеи А1а О1у

5 <210> 3 <211> 9 <212> РКТ <213> АгЬ1£1с1а1 Бедиепсе <220>

- 60 030795 <221> т1зс_ЕеаЕиге <222> (1)..(9) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 5 ог 9 <400> 3

О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и

5 гезШиез <210> 4 <211> 9 <212> РКТ <213> АгЕ1Е1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рЕ1оп о£ АгЕ1Е1с1а1 Зедиепсе рерЕЩе

ЗупЕЬеЕтс <220>

<221> т1зс_ЕеаЕиге <222> (1)..(9) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 8 ог 9 <400> 4

Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд 1 5 гезШиез <210> 5 <211> 5 <212> РКТ <213> АгЕ1Е1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рЕ1оп о£ АгЕ1Е1с1а1 Зедиепсе рерЕЩе <400> 5

О1и О1и О1и О1и О1и

5

ЗупЕЬеЕтс <210> 6 <211> 8 <212> РКТ <213> АгЕ1Е1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рЕ1оп о£ АгЕ1Е1с1а1 Зедиепсе рерЕ1Не <400> 6

Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд

5

ЗупЕЬеЕтс <210> 7 <211> 8 <212> РКТ <213> АгЕ1Е1с1а1 Зедиепсе <220>

- 61 030795

<223> Везсг1рЁ1оп	о£ ΑΓύί£ί^α1	Зедиепсе:	ЗупЬЪеШс
	рер+ФЪе
<400>	7
Α^ Рго Ьей Α1α Ьей Тгр Α^ Зег
1	5
<210>	8
<211>	8
<212>	РКТ
<213>	ΑΓύί£ί^α1 :	Зедиепсе
<220>
<223>	Везсг1рЁ1оп	о£ ΑΓύί£ίοί&1	Зедиепсе:	ЗупЬЪеШс
	рер+ФЪе
<400>	8

О1и Зег Рго А1а Туг Туг ТЪг А1а 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> РКТ <213> ΑΓύίίίοίαΙ Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рЁ1оп о£ ΑΓύίίίοίαΙ Зедиепсе: Зуп+Ъе+Фс рер+ФЪе <400> 9

Азр Рго Агд Зег РЪе Ьей

5 <210> 10 <211> 6 <212> РКТ <213> ΑΓύίίίοίαΙ Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рЁ1оп о£ ΑΓύίίίοίαΙ Зедиепсе: Зуп+Ъе+Фс рер+ФЪе <400> 10

Рго Рго Α^ Зег РЪе Ьей

5 <210> 11 <211> 6 <212> РКТ <213> ΑΓύίίί^αΙ Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рЁ1оп о£ ΑΓύίίί^αΙ Зедиепсе: ЗупЬЪеШс рер+ФЪе <400> 11

Α^ Ьей О1п Ьей Ьуз Ьей

5

- 62 030795 <210> 12 <211> 5 <212> РКТ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Ьезсг1рЕ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе: ЗупЕЬеЕ1с рерЕтбе <220>

<221> М0Ь_КЕЗ <222> (5)..(5) <223> Ьуз-Ас <400> 12

Агд Ьеи О1п Ьеи Ьуз

1	5
<210>	13
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	Ьезсг1рЕ1оп о£ АгЕ1£1с1а1	Зедиепсе: ЗупЕЬеЕ1с
	рерЕ1бе
<400>	13
О1и О1и С1и О1и С1и О1и О1и С1и	О1и
1	5

<210>	14
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	Ьезсг1рЕ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 рерЕ1бе	Зедиепсе: ЗупЕЬеЕ1с
<400>	14
Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд	Агд
1	5

<210> 15 <211> 20 <212> РКТ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<221> т1зс_£еаЕиге <222> (1)..(20) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 2-20 гезШиез

- 63 030795 <400> 15

О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и

5 10 15

О1и О1и О1и О1и <210> 16 <211> 20 <212> РКТ <213> Аг51£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1р51оп о£ Аг51£1с1а1 Зедиепсе: ЗупЕЬеШс рерШйе <220>

<221> т1зс_£еа5иге <222> (1)..(20) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 5-20 гез1йиез <400> 16

1	5	10	15
О1и	О1и О1и О1и 20

<210>	17
<211>	8
<212>	РКТ
<213>	Аг51£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	Везсг1р51оп о£ Аг51£1с1а1 Зедиепсе: ЗупЕЬеШс рерШйе

<220>
<221> т1зс_£еа5иге	епсотразз 5-8 гез15.иез
<222> <223>	(1)..(8) ТЫз зедиепсе тау
<400>	17
О1и О1и О1и О1и О1и О1и	О1и О1и
1	5

<210> 18 <211> 7 <212> РКТ <213> Аг51£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1р51оп о£ Аг51£1с1а1 Зедиепсе: ЗупЕЬеШс рер515.е

- 64 030795 <220>

<221> т1зс_£еакиге <222> (1)..(7) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 5-7 гезЩиез <400> 18

О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и

5 <210> 19 <211> 6 <212> РКТ <213> Лгк1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рк1оп о£ Агк1£1с1а1 Зедиепсе: 5упкЬек1с рерк10.е <400> 19

О1и О1и О1и О1и О1и О1и

5 <210> 20 <211> 7 <212> РКТ <213> Лгк1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рк1оп о£ Агк1£1с1а1 Зедиепсе: 5упкЬек1с рерк10.е <400> 20

О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и

5 <210> 21 <211> 8 <212> РКТ <213> Лгк1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рк1оп о£ Агк1£1с1а1 Зедиепсе: 5упкЬек1с рерк10.е <400> 21

О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и

5 <210> 22 <211> 20 <212> РКТ <213> Лгк1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рк1оп о£ Агк1£1с1а1 Зедиепсе: 5упкЬек1с рерк10.е

- 65 030795 <220>

<221> т1зс_ДеаДиге <222> (1)..(20) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 5-20 гезШиез <400> 22

Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд 1 5 10 15

Агд Агд Агд Агд 20 <210> 23 <211> 12 <212> РКТ <213> АгД1Д1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Везсг1рД1оп о£ АгД1Д1с1а1 Зедиепсе: ЗупДЬеДДс рерДШе <220>

<221> т1зс_ДеаДиге <222> (1)..(12) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 5-12 гезШиез <400> 23

Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд 1 5 10 <210> 24 <211> 9 <212> РКТ <213> АгД1Д1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ВезсгДрДДоп оД АгД1Д1с1а1 Зедиепсе: ЗупДЬеДДс рерДШе <220>

<221> т1зс_ДеаДиге <222> (1)..(9) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 7-9 гезШиез <400> 24

Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд

5 <210> 25 <211> 8 <212> РКТ <213> АгД1Д1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ВезсгДрДДоп оД АгД1Д1с1а1 Зедиепсе: ЗупДЬеДДс рерДШе

- 66 030795 <220>

<221> т1зс_£еаЁиге <222> (1)..(8) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 7-8 гезШиез <400> 25

Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд

5 <210> 26 <211> 7 <212> РКТ <213> АгЕ1£1с1а1 Бедиепсе <220>

<223> Везсг1рЁ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 Бедиепсе: ЗупкЬеЩс рерЩДе <400> 26

Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд

5 <210> 27 <211> 6 <212> РКТ <213> АгЁ1£1с1а1 Бедиепсе <220>

<223> Везсг1рЁ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 Бедиепсе: ЗупкЬеЩс рерЕтДе <220>

<221> МОБ_КЕБ <222> (4)..(4) <223> Апу албпо ас1Д <400> 27

Рго Ьеи О1у Хаа А1а О1у 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> РКТ <213> АгЕ1£1с1а1 Бедиепсе <220>

<223> Везсг1рЕ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 Бедиепсе: БупЕЬеЩс рерЕ10.е <400> 28

О1у О1у А1а А1а Азп Ьеи Уа1 Агд О1у О1у

5 10 <210> 29 <211> 10 <212> РКТ <213> АгЕ1£1с1а1 Бедиепсе

- 67 030795

<220> <223> Ьезсг1рЬ1оп о£ АгЬ1Ыс1а1	Зедиепсе:	ЗупЬНеЬ1с
	рерЬ1Эе
<400>	29
Зег О1у Агд 11е О1у РНе Ьеи Агд	ТНг А1а
1	5	10
<210>	30
<211>	5
<212>	РКТ
<213>	АгЬ1Ыс1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	Ьезсг1рЬ1оп о£ АгЬ1Ыс1а1	Зедиепсе:	ЗупЬНеЬгс
	рерЬ1Эе
<400>	30

Зег О1у Агд Зег А1а 1 5 <210> 31 <211> 4 <212> РКТ <213> АгЬ1Ыс1а1 Зедиепсе <220>

<223> Ьезсг1рЬ1оп о£ АгЬ1Ыс1а1 Зедиепсе: ЗупЬЬеЬ1с рерЬ15.е <400> 31

О1у РЬе Ьеи О1у <210> 32 <211> 4 <212> РКТ <213> АгЬ1Ыс1а1 Зедиепсе <220>

<223> Ьезсг1рЬ1оп о£ АгЬ1Ыс1а1 Зедиепсе: ЗупЬЬеЬ1с рерЬ1Эе <400> 32

А1а Ьеи А1а Ьеи <210> 33 <211> 5 <212> РКТ <213> АгЬ1Ыс1а1 Зедиепсе <220>

<223> Ьезсг1рЬ1оп о£ АгЬ1Ыс1а1 Зедиепсе: ЗупЬЬеЬ1с рерЬгЭе <220>

- 68 030795

<221> М0Ь_КЕЗ <222> (3)..(3) <223> З-еЕЬу1-Суз
<400>	33
Рго 11е Суз РЬе РЬе
1	5

<210> 34 <211> 8 <212> РКТ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе
<220> <223>	Ьезсг1рЕ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе: ЗупЕЬеЕ1с рерЕ1Ье
<400>	34
О1у О1у Рго Агд О1у Ьеи Рго О1у
1	5

<210> 35 <211> 6
<212>	РКТ
<213>	АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	Ьезсг1рЕ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе: ЗупЕЬеЕ1с рерЕ1Ье
<400>	35
Нтз Зег Зег Ьуз Ьеи О1п
1	5

<210>	36
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	Ьезсг1рЕ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 рерЕ1Ье	Зедиепсе: ЗупЕЬеЕ1с
<400>	36
Ьеи Уа1 Ьеи А1а Зег Зег Зег РЬе	О1у Туг
1	5	10

<210>	37
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	Ьезсг1рЕ1оп о£ АгЕ1£1с1а1 рерЕ1Ье	Зедиепсе: ЗупЕЬеЕ1с
<400>	37
О1у Уа1 Зег О1п Азп Туг Рго 11е	Уа1 О1у
1	5	10

- 69 030795

<210>	38
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	АгБ1£1с1а1 Зедиепсе
<220>
<223>	ЬезсгбрБбоп о£ АгБ1£1с1а1 рерБбДе	Зедиепсе: ЗупБЬеБбс
<400>	38
О1у Уа1 Уа1 О1п А1а Зег Суз Агд	Ьеи А1а
1	5	10

<210> 39 <211> 4 <212> РКТ <213> АгБ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ЬезсгбрБбоп о£ АгБ1£1с1а1 Зедиепсе: ЗупБЬеБбс рерБбДе <400> 39

Азр О1и Уа1 Азр <210> 40 <211> 6 <212> РКТ <213> АгБ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223>	ЬезсгбрБбоп о£ АгБ1£1с1а1 рерБбДе	Зедиепсе:	ЗупБЬеБбс
<400> 40 О1у Тгр О1и Нбз Азр О1у 1 5
<210> <211> <212> <213>	41 9 РКТ АгБ1£1с1а1 Зедиепсе
<220> <223>	ЬезсгбрБбоп о£ АгБ1£1с1а1	Зедиепсе:	ЗупБЬеБбс

рерБбДе <220>

<221> т1зс_£еаБиге <222> (1)..(9) <223> ТЫз зедиепсе тау епсотразз 5-9 гезбДиез <400> 41

О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и О1и

5

- 70 030795

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Молекула селективной доставки пары агентов для визуализации раковой ткани, имеющая формулу I, имеющую структуру [Ώα-са] - А- [см-М] -Х-В- [св-ϋΒ] формула I, где X представляет собой пептидный линкер, который способен к расщеплению при помощи протеазы;

А представляет собой пептид с последовательностью, содержащей 5 последовательных остатков глутамата;

В представляет собой пептид с последовательностью, содержащей 8 последовательных остатков аргинина;

с_А, с_В, и ο_Μ, каждый независимо, представляют собой остаток аминокислоты;

М представляет собой полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ);

Эд и Ό_Β представляют собой пару акцепторной и донорной флуоресцентных частиц, между которыми возможен флуоресцентный резонансный перенос энергии по механизму Фёрстера; и |ρ·,|-Μ| присоединён в любом положении к X, [И_А-с_А] присоединён к любой аминокислоте в А, [с_ВЭ_В| присоединён к любой аминокислоте в В;

Μ представляет собой полимер полиэтиленгликоль, имеющий среднюю молекулярную массу 500, 1000, 2000, 5000 или 10000 Да.
2. Молекула по п.1, в которой с_А, с_В и ο_Μ, каждый независимо, выбраны из Ό-цистеина, Όглутамата, лизина и пара-4-ацетил-Е-фенилаланина.
3. Молекула по п.1, в которой с_В представляет собой остаток Ό-цистеина.
4. Молекула по п.1, в которой с_А представляет собой остаток Ό-глутамата или лизина.
5. Молекула по п.1, в которой ο_Μ обозначает остаток пара-4-ацетил-Е-фенилаланина.
6. Молекула по п.1, в которой X способен к расщеплению при помощи матриксной металлопротеиназы.
7. Молекула по п.1, в которой X содержит аминокислотную последовательность, которая способна к расщеплению при помощи ΜΜΡ2, ΜΜΡ7, ΜΜΡ9 или ΜΜΡ14.
8. Молекула по п.1, в которой X содержит аминокислотную последовательность, выбранную из РЕОЕАО, РЕО-С(ше)-АО, КР1.Л1ЛАК8, Е8РАУУТА, ИРК8РЕ, РРК8РЕ, КРОМК. и КЕрЕК(Ас).
9. Молекула по п.1, в которой X содержит аминокислотную последовательность РЕОЕАО.
10. Молекула по п.1, в которой X содержит аминокислотную последовательность РЕО-С(ше)-АО.
11. Молекула по п.1, в которой X содержит аминокислотную последовательность КРТАТАУК8.
12. Молекула по п.1, в которой И_А и Э_В означают Су5 и Су7.
13. Молекула по п.1, в которой И_А и Э_В означают Су5 и IК^уе750.
14. Молекула по п.1, в которой И_А и Э_В означают Су5 и IК^уе800.
15. Молекула по п.1, в которой И_А и Э_В означают Су5 и !СО.
17. Молекула по п.1, причем ткань представляет собой раковую ткань молочной железы, ткань колоректального рака, ткань сквамозноклеточной карциномы, раковую ткань простаты, ткань меланомы или раковую ткань щитовидной железы.
18. Молекула по п.1, причем ткань представляет собой раковую ткань молочной железы.
19. Молекула по п.1, причем ткань представляет собой ткань колоректального рака.
20. Образец ткани для визуализации рака, содержащий (а) ткань и (Ь) молекулу по любому из пп.116.
21. Образец ткани по п.20, который представляет собой образец, помещённый на слайд, или срез для определения патологии.
22. Образец ткани по п.20, в котором ткань является раковой тканью.
23. Образец ткани по п.20, в котором раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы, раковую ткань колоректального рака, ткань сквамозноклеточной карциномы, раковую ткань простаты, ткань меланомы или раковую ткань щитовидной железы.
24. Образец ткани по п.20, в котором раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной

- 71 030795 железы.
25. Образец ткани по п.20, в котором раковая ткань представляет собой раковую ткань колоректального рака.
26. Применение молекулы по п.1 для доставки пары визуализирующих агентов в раковую ткань, включающее приведение раковой ткани в контакт с указанной молекулой.
27. Применение по п.26, причем раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы, раковую ткань колоректального рака, ткань сквамозноклеточной карциномы, раковую ткань простаты, ткань меланомы или раковую ткань щитовидной железы.
28. Применение по п.26, причем раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы.
29. Применение по п.26, причем раковая ткань представляет собой раковую ткань колоректального рака.
30. Применение молекулы по любому из пп.1-16 для визуализации раковой ткани у субъекта, нуждающегося в этом, включающее:

ι) введение субъекту указанной молекулы и ΐΐ) визуализацию по меньшей мере одного из визуализирующих агентов.
31. Применение по п.30, в котором раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы, раковую ткань колоректального рака, ткань сквамозноклеточной карциномы, раковую ткань простаты, ткань меланомы или раковую ткань щитовидной железы.
32. Применение по п.30, в котором раковая ткань представляет собой раковую ткань молочной железы.
33. Применение по п.30, в котором раковая ткань представляет собой раковую ткань колоректального рака.
34. Применение по п.30, в котором хирургическое поле, окружающее раковую ткань, уменьшается.
35. Молекула формулы 8ΌΜ-25

8ΌΜ-25.

Соп1та1а1ега1 ΐίδδΐιθ