EA030305B1 - Животная модель болезни краббе - Google Patents
Животная модель болезни краббе Download PDFInfo
- Publication number
- EA030305B1 EA030305B1 EA201590232A EA201590232A EA030305B1 EA 030305 B1 EA030305 B1 EA 030305B1 EA 201590232 A EA201590232 A EA 201590232A EA 201590232 A EA201590232 A EA 201590232A EA 030305 B1 EA030305 B1 EA 030305B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- bei
- human
- seeg
- mouse
- thb
- Prior art date
Links
- 208000010055 Globoid Cell Leukodystrophy Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 208000028226 Krabbe disease Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title abstract description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 36
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 13
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 12
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 11
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102100028496 Galactocerebrosidase Human genes 0.000 claims description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 9
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 101710156684 Galactocerebrosidase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 8
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 8
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 claims description 5
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 3
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 2
- 230000001432 effect on motor function Effects 0.000 claims 1
- 208000036546 leukodystrophy Diseases 0.000 abstract 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 38
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 28
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 101150098797 OLS gene Proteins 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 102100026608 Aldehyde dehydrogenase family 3 member A2 Human genes 0.000 description 11
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 10
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 5
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 4
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 4
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 241000182988 Assa Species 0.000 description 3
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 3
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 3
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150011812 AADAC gene Proteins 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101150112672 CABC gene Proteins 0.000 description 2
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 2
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 2
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 2
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 2
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 2
- 102000017099 Myelin-Associated Glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010013731 Myelin-Associated Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101100438536 Nicotiana plumbaginifolia CABC gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 240000005499 Sasa Species 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- LEBBDRXHHNYZIA-LDUWYPJVSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] n-[(z)-1,3-dihydroxyoctadec-4-en-2-yl]carbamate Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C/C(O)C(CO)NC(=O)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LEBBDRXHHNYZIA-LDUWYPJVSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 2
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000006057 immunotolerant effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 208000026526 progressive weakness Diseases 0.000 description 2
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 2
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102100038590 Death-associated protein-like 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010042681 Galactosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 206010027925 Monoparesis Diseases 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- 101150025129 POP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 208000013404 behavioral symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 230000002920 convulsive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150048696 dapL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 1
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 230000008111 motor development Effects 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000007830 nerve conduction Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 101150012434 sls gene Proteins 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01046—Galactosylceramidase (3.2.1.46)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к животной модели детской глобоидно-клеточной лейкодистрофии и к применению указанной животной модели для скрининга и/или оценки агентов, которые могут быть полезны в качестве лекарственного средства для лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии.
Description
Изобретение относится к животной модели детской глобоидно-клеточной лейкодистрофии и к применению указанной животной модели для скрининга и/или оценки агентов, которые могут быть полезны в качестве лекарственного средства для лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии.
030305 Β1
030305
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к животной модели детской глобоидно-клеточной лейкодистрофии и к применению указанной животной модели для скрининга и/или оценки агентов, которые могут быть полезны в качестве лекарственного средства для лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии.
Предшествующий уровень техники
Детская глобоидно-клеточная лейкодистрофия (ОЬБ, галактозилцерамидный липидоз или болезнь Краббе) представляет собой редкое, аутосомно-рецессивное наследственное дегенеративное расстройство центральной и периферической нервной системы. Частота возникновения этого заболевания в США составляет 1:100000. Оно характеризуется наличием глобоидных клеток (клеток с несколькими ядрами), дегенерацией защитного миелинового слоя нервов и потерей клеток в головном мозге. ОЬБ является причиной значительного ослабления умственной деятельности и задержки моторного развития. Она обусловлена дефицитом галактоцереброзид-Р-галактозидазы (ОАЬС), которая является важным ферментом в метаболизме миелина. Это заболевание часто поражает детей в возрасте до 6 месяцев, но оно также может появиться в юности или у взрослых. Симптомы включают возбудимость, лихорадку без какойлибо известной причины, тугоподвижность конечностей (повышенный тонус), судороги, проблемы, связанные с приемом пищи, рвоту и замедленное развитие умственных и двигательных способностей. Дополнительные симптомы включают мышечную слабость, спастичность, глухоту и слепоту.
В настоящее время не существует радикального лечения ОЬБ. Результаты очень небольшого клинического исследования, включающего пациентов с детской ОЬБ, показали, что у детей, получавших стволовые клетки из пуповинной крови неродственных доноров до появления симптомов, развивалась только легкая неврологическая инвалидность. Результаты также показали, что развитие заболевания стабилизировалось раньше у пациентов, получавших пуповинную кровь, по сравнению с пациентами, получавшими костный мозг взрослых людей. Оказалось, что трансплантация костного мозга оказывает благоприятное воздействие на больных с легкой формой заболевания при ее выполнении в самом начале заболевания. Как правило, детская ОЬБ является летальной до возраста 2 лет. Развитие заболевания, как правило, протекает мягче у пациентов с более поздним началом заболевания.
Экзогенное замещение отсутствующего или недостаточного фермента (ферментозаместительная терапия, ЕКТ) оказалось эффективным у пациентов с болезнями лизосомного накопления, такими как болезнь Гоше. Доступ к подходящей и надежной животной модели ОЬБ будет иметь исключительно большое значение для развития ферментозаместительной терапии ОЬБ.
Ген галактозилцерамидазы (ОАЬС) имеет длину примерно 60 кб и состоит из 17 экзонов. В мышином и человеческом гене ОАЬС были идентифицированы многочисленные мутации и полиморфизмы, вызывающие ОЬБ с разной степенью тяжести. В табл. 1, взятой из Таррто е! а1., 2010, указаны некоторые из этих мутаций и полиморфизмов, включая очень распространенную, так называемую 30-кб делецию. Эта делеция составляет основную часть мутантных аллелей ОАЬС у лиц европейского происхождения. Эта большая делеция приводит к классической детской форме в гомозиготном состоянии или в гетерозиготном состоянии с другой мутацией, связанной с тяжелым заболеванием. Часто, однако, наблюдаемые фенотипические различия у пациентов-людей обусловлены не только конкретными мутациями и полиморфизмами, но также другими, еще неизвестными факторами. Это делает почти невозможным прогнозирование эффекта каждой отдельной мутации в случае ее присутствия в другом окружении.
- 1 030305
Таблица 1
| Нукпеотидное (аминокислотное) замещение | Тип мутации |
| 127С>С (С43ГС) | Миссенс |
| 188С>А(В63Н) | Миссенс |
| 3340С>А (Ε114К) | Миссенс |
| 512А>Т (ϋ117ν) | Миссенс |
| 701 Т>С (Ι234Τ) | Миссенс |
| 809С>А (С2700) | Миссенс |
| 836А>С (Ν279Τ) | Миссенс |
| 870ΟΤ (5287Р) | Миссенс |
| 893А>С (Υ298Ο) | Миссенс |
| 1027_1036όβΙΑΑΟΑΟΑΟΤΤΟ (Κ343ΑίδΧ3) | Сдвиг рамки считывания |
| 1У310с1е130кЬ | Делеция |
| 1138ΟΤ (К380М) | Миссенс |
| 1139С>Т(К3801_) | Миссенс |
| 1538ΟΤ (Т513М) | Миссенс |
| 1609С>А (С537Е) | Миссенс |
| 1652А>С (Υ5513) | Миссенс |
| 17390е1Т (Ρ5803ίδΧ16) | Сдвиг рамки считывания |
| 1853с!е1Т (1_618Х) | Р!онсенс |
Природная модель ОЬЭ, известная как мышь 'ТмйсЬег" (1\νί), имеет мутацию гена ОЛЬС, вызывающую полное отсутствие ОЛЬС-активности. Различные методы лечения были опробованы на этой мышиной модели с разной степенью успеха. Однако агрессивность ОГЭ у мыши ЦуПсИег делает эту модель субоптимальной, так как на умеренный терапевтический эффект может накладываться быстрое ухудшение. Применимость мышей "ЦуПсИег" дополнительно скомпрометирована тем фактом, что мыши, как правило, умирают в возрасте приблизительно 40 суток, при этом короткая продолжительность жизни приводит к очень узкому терапевтическому диапазону. Кроме того, модель мыши "ЦуПсИег" имеет тот недостаток, что она не является иммунотолерантной к экзогенному человеческому ферменту. Действительно, у животных может развиваться возрастающий иммунологический ответ на многократно инъецируемую человеческую ОЛЬС, что может уменьшить терапевтическую эффективность и/или вызвать смертельные анафилактические реакции.
Трансгенное введение человеческой ОЛЬС мышам "ЦуПсИег" и исследования на трансгенных мышах привели к заключению, что низкие, даже невыявляемые уровни ОЛЬС-активности были способны замедлять течение ОЬЭ у мышей. На основании этих наблюдений было предсказано, что по меньшей мере 5% нормальной ОЛЬС-активности будет достаточно, чтобы задержать или даже предотвратить симптомы (Оазреп е! а1., 2004).
Посредством гомологичной рекомбинации также были созданы трансгенные мыши, содержащие полиморфное изменение, обнаруженное у людей: аминокислота в кодоне 168 в мышиной ОЛЬС была заменена с гистидина на цистеин (К168С). Исследования на этих мышах подтвердили, что проблема создания точной модели человеческого заболевания путем замены аминокислоты в белке мыши или других видов является трудной. Прежде всего, исследования трансфекции в клетках СОЗ-1 неожиданно показали незначительную корреляцию между влиянием на активность ОЛЬС конкретных аминокислотных замещений в человеческой ОЛЬС и влиянием замены тех же самых аминокислот в мышиной ОЛЬС. В частности, хотя известно, что К168С оказывает незначительное влияние на людей, она оказывает существенное влияние на активность мышиной ОЛЬС. Во-вторых, исследования также показали, что даже когда трансгенные мыши имели значительную остаточную экспрессию ОЛЬС, это могло лишь незначительно замедлить развитие ОЬЭ (Τπζΐ е! а1., 2002).
Более крупные животные модели ОБЭ включают макак-резусов, кошек и собак. Однако, подобно мышам ЦуПсИег, эти природные модели ОЬЭ не обладают иммунологической толерантностью к человеческой ОЛЬС.
Таким образом, существует необходимость в улучшенной животной модели ОЬЭ, которая иммунотолерантна к человеческой ОЛЬС и имеет достаточно медленное развитие заболевания и более длительную продолжительность жизни.
- 2 030305
Задача изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание улучшенной животной модели СЬЭ.
В частности, задачу настоящего изобретения можно рассматривать, как предложение животной модели ОБО. которая пригодна для использования в скрининге и оценке агентов, которые полезны в терапевтическом и профилактическом ведении глобоидно-клеточной лейкодистрофии.
Краткое изложение сущности изобретения
Идеальная животная модель СЬЭ должна иметь относительно мягкий фенотип, медленное развитие заболевания и быть иммунотолерантной к человеческой СЛЬС.
Таким образом, предполагается, что описанная выше задача достигается в первом аспекте изобретения путем предложения плюрипотентных или тотипотентных клеток млекопитающего, не являющегося человеком, содержащих по меньшей мере одну экзогенную нуклеиново-кислотную конструкцию, кодирующую галактоцереброзид-Р-галактозидазу (СЛЬС), где аминокислота, соответствующая глицину в положении 270 в человеческой СЛЬС, заменена на аспарагиновую кислоту, и аминокислота, соответствующая изолейцину в положении 546 в человеческой СЛЬС, заменена на треонин.
Кроме того, изобретение относится к способу создания генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, включающему следующие стадии:
(а) предоставление плюрипотентной или тотипотентной клетки млекопитающего, не являющегося человеком, согласно изобретению;
(б) введение указанной плюрипотентной или тотипотентной клетки млекопитающего, не являющегося человеком, в выделенные бластоцисты указанного млекопитающего, не являющегося человеком;
(в) имплантация указанных бластоцист, содержащих указанную плюрипотентную или тотипотентную клетку млекопитающего, не являющегося человеком, псевдобеременным самкам указанного млекопитающего, не являющегося человеком;
(г) идентификация трансмиссии зародышевой линии в потомстве беременной самки со стадии (в).
Другой аспект изобретения относится к галактоцереброзид-Р-галактозидаза-дефицитному, генетически модифицированному млекопитающему, не являющемуся человеком, содержащему по меньшей мере одну экзогенную нуклеиново-кислотную конструкцию, кодирующую галактоцереброзид-βгалактозидазу, где аминокислота, соответствующая глицину в положении 270 человеческой СЛЬС, заменена на аспарагиновую кислоту и аминокислота, соответствующая изолейцину в положении 546 человеческой СЛЬС, заменена на треонин.
Еще в одном аспекте изобретения предложено использование генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, согласно изобретению для скрининга или оценки агента, пригодного в качестве лекарственного средства для лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии.
Наконец, изобретение относится к способу оценки агента, включающему следующие стадии:
(а) предоставление генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, согласно настоящему изобретению;
(б) приведение указанного млекопитающего, не являющегося человеком, в контакт с агентом для оценки;
(в) определение, реагирует ли указанное млекопитающее, не являющееся человеком, на указанный агент после указанного контакта.
Каждый из первого, второго, третьего, четвертого и пятого аспектов настоящего изобретения может быть объединен с любыми другими аспектами. Эти и другие аспекты изобретения будут очевидны из описанных ниже воплощений и разъяснены со ссылкой на них.
Краткое описание графических материалов
Животная модель СЬЭ по изобретению будет описана ниже более подробно со ссылкой на сопровождающие графические материалы. Фигуры иллюстрируют способы реализации настоящего изобретения, но их не следует истолковывать как ограничивающие другие возможные воплощения, входящие в объем прилагаемой формулы изобретения.
Фиг. 1: Дизайн и конструкция направленного вектора для нокаута мышиного гена Са1с/нокина человеческого гена Са1с.
Фиг. 2: Фенотип гетерозиготной мыши с нокином ЬСЛЕСти1;. А: Экспрессия мРНК СЛЬС мыши в головном мозге; В: экспрессия мРНК СЛЬС человека в головном мозге; С: уровни мРНК СЛЬС человека по сравнению с мышью в различных органах.
Фиг. 3: Масса тела мышей во времени (недели). Мыши дикого типа, гетерозиготные мыши с нокином ЬСЛЬСти1 и гомозиготные мыши с нокином ЬСЛЕСти1;.
Фиг. 4: гйСЛЬС в головном мозге (хороидное сплетение), определенная посредством иммуногистохимии (20x1 с) с раЬСЛЬС (Л) и мечением ядер ЭЛР1 (В).
Фиг. 5: Уровень циркулирующей в крови рекомбинантной человеческой СЛЬС у гомозиготных мышей с нокином ЬСЛЕСти1; после внутривенной и внутрибрюшинной инъекции.
Фиг. 6: Титры антител у гомозиготных мышей с нокином йСЛЬСт^, получивших лекарственное средство.
- 3 030305
Подробное описание изобретения
Подробное описание воплощений.
Настоящее изобретение основано на наблюдении, что замена глицина в положении 270 в человеческой галактоцереброзид-Р-галактозидазе на аспарагиновую кислоту (Ο270Ό) представляет собой одну из мутаций, часто встречающихся у ОЬН-пациентов с относительно мягким фенотипом. Она часто встречается в сочетании с полиморфизмом, когда изолейцин в положении 546 заменен на треонин (Ι546Τ). Кроме того, авторы изобретения наблюдали значительное число пациентов с мутацией Ο270Ό в качестве их одной аллели и делецией в 30 пар нуклеотидов в качестве ее второй аллели. Тем не менее, эти пациенты по-прежнему имели мягкий фенотип, что указывало на то, что мутация Ο270Ό, безусловно, является мягкой мутацией у людей и приводит к мягкому фенотипу с медленным развитием заболевания также в случае ее присутствия в обеих аллелях.
Авторы настоящего изобретения изучали влияние мутации Ο270Ό и полиморфизма Ι546Τ в трансфекционных исследованиях на клетках С08-1. Они наблюдали значительно меньшую ОАЬС-активность, когда мутация экспрессировалась вместе с полиморфизмом, чем при экспрессии с "нормальным" фоном. Это было неожиданно в связи с мягким фенотипом у пациентов и привело авторов изобретения к гипотезе, что человеческая ОАЬС, несущая мутацию О270О/полиморфизм Ι546Τ, при экспрессии в подходящих видах животных, таких как мыши, будет снижать уровень активности ОАЬС в степени, достаточной для индукции симптомов ОЬО, при этом остаточной активности ОАЬС будет достаточно, чтобы замедлить развитие заболевания. Другими словами, трансгенные животные, гомозиготные в отношении мутации 02700/полиморфизма Ι546Τ, возможно могут обеспечить новый подход к разработке подходящей животной модели ОБП. Таким образом, настоящее изобретение относится к предложению животной модели ОЬО, в которой животные несут мутацию 02700/полиморфизм Ι546Τ.
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложены плюрипотентные или тотипотентные клетки млекопитающего, не являющегося человеком, содержащие по меньшей мере одну экзогенную нуклеиново-кислотную конструкцию, кодирующую галактоцереброзид-Р-галактозидазу (ОАЬС), где аминокислота, соответствующая глицину в положении 270 в человеческой ОАЬС, заменена на аспарагиновую кислоту и аминокислота, соответствующая изолейцину в положении 546 в человеческой ОАЬС, заменена на треонин.
В данном контексте фразу "аминокислота, соответствующая глицину в положении 270 в человеческой ОАЬС" следует понимать как определяющую аминокислотный остаток в данной аминокислотной последовательности, который будет находиться напротив О1у270 в аминокислотной последовательности рекомбинантной человеческой ОАЬС дикого типа, определенной в 5>ЕО ГО N0: 4, если эти две аминокислотные последовательности выровнены с наилучшим совпадением. Аналогично, фразу "аминокислота, соответствующая изолейцину в положении 546 в человеческой ОАЬС" следует понимать как определяющую аминокислотный остаток в данной аминокислотной последовательности, который находиться напротив Не546 в аминокислотной последовательности рекомбинантной человеческой ОАЬС, определенной в 5>ЕО ГО N0: 4, если эти две аминокислотные последовательности выровнены с наилучшим совпадением.
В контексте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы экзогенная нуклеиново-кислотная конструкция, определенная выше, кодировала галактоцереброзид-Р-галактозидазу, где глицин в положении 270 (О1у270) заменен на аспарагиновую кислоту и изолейцин в положении 546 (Пе546) заменен на треонин.
Допустимо, чтобы в дополнение к мутации О207О/полиморфизму Ι546Τ было возможно ввести в человеческую галактоцереброзид-Р-галактозидазу несколько других модификаций последовательности с незначительным или отсутствующим дополнительным влиянием на ферментативную активность. 5>Е0 ГО N0: 2 представляет собой последовательность человеческой ОАЬС, включающую лидерную последовательность из 26 аминокислот. Последовательность, показанная в 5>Е0 ГО N0: 3, представляет собой последовательность зрелой человеческой ОАЬС, без лидерной последовательности из 26 аминокислот.
В других воплощениях указанная галактоцереброзид-Р-галактозидаза в результате содержит последовательность, которая по существу идентична последовательности, представленной в 5>Е0 ГО N0: 3.
Термин "по существу идентичный" при использовании в отношении аминокислотных последовательностей данного и любого последующих аспектов изобретения относится к полипептиду, имеющему последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, например по меньшей мере на 96% идентична, по меньшей мере на 97% идентична, по меньшей мере на 98% идентична, по меньшей мере на 99% идентична, по меньшей мере на 99,5% идентична или, например, по меньшей мере на 99,7% идентична последовательности, представленной в 5>Е0 ГО N0: 3. В других воплощениях термин "по существу идентичный" означает, что этот полипептид обладает по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% активности полипептида, представленного в
- 4 030305
δΕρ ΙΌ N0: 3.
В данном случае "идентичность последовательности" определена как идентичность последовательности генов или белков на нуклеотидном или аминокислотном уровне соответственно. Таким образом, в данном контексте "идентичность последовательности" является критерием идентичности белков на аминокислотном уровне и критерием идентичности нуклеиновых кислот на нуклеотидном уровне. Идентичность белковой последовательности можно определить путем сравнения аминокислотной последовательности в данном положении в каждой последовательности, когда эти последовательности выровнены. Аналогично, идентичность нуклеиново-кислотной последовательности может быть определена путем сравнения нуклеотидной последовательности в данном положении в каждой последовательности, когда эти последовательности выровнены.
Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиново-кислотных последовательностей, эти последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, в первую аминокислотную или нуклеиново-кислотную последовательность могут быть введены пробелы для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеиновокислотной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и в соответствующем положении во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в этом положении. Процент идентичности двух последовательностей представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений) х 100). В одном воплощении эти две последовательности имеют одинаковую длину.
Можно вручную выравнивать последовательности и подсчитывать количество идентичных аминокислот. Альтернативно, выравнивание двух последовательностей для определения процента идентичности может быть выполнено с использованием математического алгоритма. Такой алгоритм включен в программы ΝΒΕΑδΤ и ΧΒΕΑδΤ (А118сЬи1 с1 а1., 1990).
Нуклеотидные ΒΕΑδΤ-поиски могут быть выполнены с помощью программы ΝΒΕΑδΤ, счет выравнивания = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиново-кислотным молекулам по изобретению. Белковые ΒΕΑδΤ-поиски могут быть выполнены с помощью программы ΧΒΕΑδΤ, счет выравнивания = 50, длина слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекуле белка по изобретению. Чтобы получить выравнивания с пробелами, для сравнения можно использовать Саррей ΒΕΑδΤ. Альтернативно, можно использовать ΡδΙ-ΒΙαΜ для выполнения итеративного поиска, который обнаруживает отдаленные соответствия между 30 молекулами. При использовании программ ΝΒΕΑδΤ, ΧΒΕΑδΤ и Саррей ΒΕΑδΤ можно применять значения параметров по умолчанию для этих программ. См. 1Шр://\у\у\у.псЬтп1т.пП1.доу. Альтернативно, идентичность последовательности может быть рассчитана после выравнивания последовательностей, например, при помощи программы ΒΕΑδΤ в базе данных ΕΜΒΕ (λλΛΧΛτ.ικόί.ηΙιη.βονΑβί-όίη/ΒΒΑδΤ). Как правило, для выравнивания можно использовать значения по умолчанию в отношении, например, "матрицы замен" и "штрафа за пропуск в последовательности". В контексте настоящего изобретения значения по умолчанию ΒΕΑδΤΝ и ΡδΙ ΒΕΑδΤ могут быть предпочтительными.
Процент идентичности двух последовательностей может быть определен с использованием методик, аналогичных описанным выше, с учетом пробелов или без них. При расчете процента идентичности учитываются только точные совпадения.
Галактоцереброзид-Р-галактозидаза принадлежит к Е.С. 3.1.6.46 и способна катализировать реакцию О-галактозил-И-ацилсфингозин + Н20 = Ό-галактоза + Ν-ацилсфингозин; таким образом, СΑ^С катализирует расщепление галактолипидов, например, в миелине. Человеческий ген СΑ^С кодирует продукт из 669 аминокислот, которые включают лидерную или сигнальную последовательность из 16 аминокислот. Зрелый человеческий фермент СΑ^С представляет собой гликозилированный лизосомный фермент, содержащий 643 аминокислот и имеющий молекулярную массу 72,8 кДа.
Как правило, специалист в данной области может легко разработать подходящие анализы для определения ферментативной активности. Однако трансфекция клеток Ο0δ-1 с помощью кДНК, кодирующей фермент, и последующее определение активности СΑ^С в трансфицированных клетках, как описано в данном документе, являются особенно полезным анализом для этой цели.
В других конкретных воплощениях указанная галактоцереброзид-Р-галактозидаза содержит или по существу состоит из последовательности, представленной в δΕρ ΙΌ N0: 3. Предпочтительно указанная галактоцереброзид-Р-галактозидаза состоит из последовательности, представленной в δΕρ ΙΌ N0: 3.
В одинаково предпочтительных воплощениях указанная экзогенная нуклеиново-кислотная конструкция содержит нуклеиново-кислотную последовательность, которая по существу идентична последовательности, представленной в δΕρ ΙΌ N0: 1. При использовании в данном контексте термин "по существу идентична" следует истолковывать в широком смысле как включающий нуклеиново-кислотные последовательности, в которых последовательность, представленная в δΕρ ΙΌ N0: 1, модифицирована,
- 5 030305
например, путем вставки, делеции и/или замены одного или более нуклеиново-кислотных остатков при условии, что транскрипция нуклеиново-кислотной последовательности и последующая трансляция продукта транскрипции приводят к получению галактоцереброзид-З-галактозидазы, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8Н() ГО N0: 2.
Таблица 2
Нуклеиново-кислотные последовательности и аминокислотные последовательности по изобретению
| Описание последовательности | Идентификатор последовательности |
| гИСАЬС с.С809А/с.Т1637С кодирующая последовательность | ЗЕО Ю ΝΟ: 1 |
| гИСАЬС С27СЮ/1546Т аминокислотная последовательность, включающая сигнальную последовательность | ЗЕО Ю N0: 2 |
| гИСАЬС С27СЮ/1546Т аминокислотная последовательность, без сигнальной последовательности | ЗЕО Ю N0: 3 |
| гИСАЬС ννί аминокислотная последовательность | ЗЕО Ю N0: 4 |
| гИСАЬС ννί аминокислотная последовательность без сигнальной последовательности | ЗЕО Ю N0: 5 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 1 | ЗЕО Ю N0: 6 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 2 | ЗЕО Ю N0: 7 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 3 | ЗЕО Ю N0: 8 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 4 | ЗЕО Ю N0: 9 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 5 | ЗЕО Ю N0: 10 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 6 | ЗЕО Ю N0: 11 |
| гНСА1_С кодирующая последовательность, экзон 7 | ЗЕО Ю N0: 12 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 8 | ЗЕО Ю N0: 13 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 9 | ЗЕО Ю N0: 14 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 10 | ЗЕО Ю N0: 15 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 11 | ЗЕО Ю N0: 16 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 12 | ЗЕО Ю N0: 17 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 13 | ЗЕО Ю N0: 18 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 14 | ЗЕО Ю N0: 19 |
| гИСАЬС кодирующзя послодобзтольность, экзон 15 | ЗЕО Ю N0: 20 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 16 | ЗЕО Ю N0: 21 |
| гИСАЬС кодирующая последовательность, экзон 17 | ЗЕО Ю N0: 22 |
| гИСАЬС направленный вектор | ЗЕО Ю N0: 23 |
| СА1_С с.С809А/с.Т1637С кДНК, включая последовательность интрона 2 | ЗЕО Ю N0: 24 |
Для того чтобы обеспечить трансмиссию зародышевой линии, также предпочтительно, чтобы указанная нуклеиново-кислотная конструкция была введена в геном указанной клетки млекопитающего, не являющегося человеком.
В других воплощениях изобретения указанная нуклеиново-кислотная конструкция разрушает эндогенную аллель галактоцереброзид-З-галактозидазы указанной клетки млекопитающего, не являющегося человеком. В частности, нуклеиново-кислотная конструкция может быть введена в геном указанного
- 6 030305
млекопитающего, не являющегося человеком, посредством гомологичной рекомбинации. Возможно, транскрипция рекомбинантного гена ОЛЬС может контролироваться эндогенным промотором ОЛЬС.
В предпочтительных воплощениях нуклеиново-кислотную конструкцию встраивают в экзон 1 эндогенного гена ОЛЬС в указанной клетке млекопитающего, не являющегося человеком, в положение эндогенного сайта инициации трансляции. Для того чтобы сохранить все потенциальные регуляторные элементы, запускающие экспрессию гена Оа1с, эндогенная геномная последовательность, расположенная ниже экзона 1, также может быть оставлена без изменений. В соответствии с этими воплощениями предполагается, что эндогенный белок ОЛЬС более не экспрессируется благодаря терминации транскрипции на всторенном 3'ИТК ниже человеческой кДНК.
Также в объем настоящего изобретения входит предложение плюрипотентной или тотипотентной клетки млекопитающего, не являющегося человеком, в которой рекомбинантный ген ОЛЬС получен из полноразмерной кДНК ОЛЬС, где глицин заменен на аспарагиновую кислоту и изолейцин заменен на треонин, как определено выше. Возможно, что одна или более интронных последовательностей из геномной ДНК ОЛЬС могут быть введены между последовательностями кДНК, полученными из любых двух последовательных экзонов в геномной последовательности ОЛЬС. Например, последовательность из 1-го интрона может быть встроена в нуклеиново-кислотную конструкцию между последовательностями, полученными из 1- и 2-го экзонов, и/или последовательность из 2-го интрона может быть встроена в нуклеиново-кислотную конструкцию между последовательностями, полученными из 2- и 3-го экзонов, и/или последовательность из 3-го интрона может быть встроена в нуклеиново-кислотную конструкцию между последовательностями, полученными из 3- и 4-го экзонов, и т.д.
Предпочтительно рекомбинантный ген ОЛЬС получают из полноразмерной человеческой кДНК ОЛЬС, определенной в 8Е0 ГО N0: 1. В конкретных воплощениях ген ОЛЬС содержит последовательность экзонов от 1 вплоть до 17, как определено в 8Е0 ГО N0: 6-22 в последовательном порядке, с интронной последовательностью, встроенной по меньшей мере между двух экзонных последовательностей для повышения экспрессии трансгена. Предпочтительно нуклеиново-кислотная последовательность 2-го интрона человеческого гена ОЛЬС встроена между последовательностями из экзонов 2 и 3. 2-й интрон является предпочтительным, так как это самый короткий интрон в человеческом гене ОЛЬС.
В других предпочтительных воплощениях 3'-нетранслируемая область (НТК) Оа1с была встроена в рекомбинантный ген ОЛЬС ниже стоп-кодона в последовательности экзона 17. ИТК встраивали для повышения экспрессии рекомбинантной кДНК ОЛЬС в клетках млекопитающего, не являющегося человеком, таких как мышиные клетки. Согласно этим воплощениям предполагается, что эндогенный белок ОЛЬС больше не экспрессируется из-за терминации трансляции на встроенной 3'ИТК ниже рекомбинантной кДНК.
Как очевидно специалисту в данной области, плюрипотентные или тотипотентные клетки млекопитающего, не являющегося человеком, по изобретению могут быть либо гетерозиготными, либо гомозиготными для указанного рекомбинантного гена ОЛЬС.
Плюрипотентные или тотипотентные клетки млекопитающего, не являющегося человеком, по изобретению могут быть дефицитными по галактоцереброзид-Р-галактозидазе (ОЛЬС). Как очевидно специалисту, дефицит ОЛЬС может быть вызван пониженной экспрессией гена ОЛЬС и/или снижением специфической ферментативной активности фермента. В контексте настоящего изобретения "дефицит ОЛЬС" относится к ситуациям, когда активность ОЛЬС в указанной клетке снижена до 5-60%, например составляет 5-50%, например 5-40%, таком как 10-40%, например 15-40%, таком как 15-30% от активности ОЛЬС в плюрипотентной или тотипотентной клетке из того же вида млекопитающего, не являющегося человеком, который является гомозиготным по гену ОЛЬС дикого типа.
В других воплощениях согласно изобретению дефицит галактоцереброзид-Р-галактозидазы (ОЛЬС) является индуцибельным.
Для целей настоящего изобретения предпочтительно, чтобы клетка млекопитающего, не являющегося человеком, представляла собой плюрипотентную или тотипотентную мышиную клетку.
Клетка млекопитающего, не являющегося человеком, предпочтительно представляет собой мышиную эмбриональную стволовую (Е§) клетку. В частности, клетка млекопитающего, не являющегося человеком, может быть стволовой (Е§) клеткой, полученной из мышиной линии 129 или предпочтительно из мышиной линии С57ВЬ/6. Каждый из этих двух типов клеток имеет свои преимущества и недостатки. Е§-клетки С57ВЬ/6 значительно облегчают конструирование направленных векторов, так как геном мышей С57ВЬ/6 был полностью секвенирован и доступны ВАС (бактериальная искусственная хромосома)клоны, охватывающие весь геном. Последовательности и информация о последовательностях требуются для клонирования (или синтеза) мышиных 5'- и 3'-гомологичных областей, а также 5'- и 3'-нетранслируемых областей направленного вектора. Существуют специфичные для линий вариации последовательностей, которые препятствуют эффективной рекомбинации, если последовательности С57ВЬ/6 используют для Е§-клеток 129, или наоборот. Следовательно, в настоящее время, чтобы ускорить конструирование вектора, предпочтительными являются Е§-клетки С57ВЬ/6.
- 7 030305
Недостаток Εδ-клеток С57ВЬ/6 заключается в том, что их труднее культивировать, что образование химер является менее эффективным и что важно использовать коизогенные бластоцисты. Имеется новая линия С57ВЬ/6 а1Ъшо для скрининга в отношении окраски шерсти. Так как методику гомологичной рекомбинации сначала разработали для Εδ-клеток 129, Εδ-клетки С57ВЬ/6 редко используются академическими рабочими группами.
В связи с предпочтительностью Εδ-клеток С57ВЬ/6 также предпочтительно, чтобы клетка млекопитающего, не являющегося человеком, содержала нуклеиново-кислотную последовательность, представленную в δΕΟ ГО N0: 23. Указанная нуклеиново-кислотная последовательность представляет собой направленный вектор, специально разработанный для использования в эмбриональных стволовых клетках, полученных из мышиной линии С57ВЬ/6.
Во втором аспекте изобретения предложен способ получения генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, включающий следующие стадии:
(а) предоставление плюрипотентной или тотипотентной клетки млекопитающего, не являющегося человеком, как определено выше;
(б) введение указанной плюрипотентной или тотипотентной клетки млекопитающего, не являющегося человеком, в выделенные бластоцисты указанного млекопитающего, не являющегося человеком, как определено выше;
(в) имплантация указанных бластоцист, содержащих указанные плюрипотентные или тотипотентные клетки млекопитающего, не являющегося человеком, псевдобеременным самкам указанного млекопитающего, не являющегося человеком; и
(г) определение трансмиссии зародышевой линии у потомства беременной самки со стадии (в).
В конкретных воплощениях изобретения указанное млекопитающее, не являющееся человеком, представляет собой мышь, такую как мышь мышиной линии 129 или предпочтительно линии С57ВЬ/6.
Соответственно, также предпочтительно, чтобы указанная клетка млекопитающего, не являющегося человеком, представляла собой мышиную эмбриональную стволовую клетку, такую как стволовая клетка, полученная из мышиной линии 129 или предпочтительно из линии С57ВЬ/6.
В соответствии с другими воплощениями способ включает измерение степени химеризма у химер (00) через вклад Εδ-клеток в окраску шерсти ВЛЬВ/е хозяина (черный/белый). Кроме того, способ может включать скрещивание мужского потомства с высокой степенью химеризма с самками линии С57ВЬ/6. В этих воплощениях С57ВЬ/6 партнеры спаривания могут быть немутантными (А) или мутантными в отношении присутствия гена рекомбиназы (Р1рГОе1е1ет или Сте-йе1е1ет или индуцибельный ίτοΕΒ-ύοΙοΙΟΓ или комбинация Р1р-йе1е1ет/СгеВК). Способ может дополнительно включать определение трансмиссии зародышевой линии через присутствие потомства линии С57ВЬ/6 с черной окраской (01).
В третьем аспекте изобретения предложено дефицитное по галактоцереброзид-Р-галактозидазе (0ЛЬС) генетически модифицированное млекопитающее, не являющееся человеком, содержащее по меньшей мере одну экзогенную нуклеиново-кислотную конструкцию, кодирующую галактоцереброзидβ-галактозидазу (0ЛЬС), где аминокислота, соответствующая глицину в положении 270 в человеческой 0ЛЬС, заменена на аспарагиновую кислоту и аминокислота, соответствующая изолейцину в положении 546 в человеческой 0ЛЬС, заменена на треонин.
В контексте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы указанная экзогенная нуклеиновокислотная конструкция кодировала галактоцереброзид-Р-галактозидазу, в которой глицин в положении 270 (О1у270) заменен на аспарагиновую кислоту и изолейцин в положении 546 (11е546) заменен на треонин.
В конкретных воплощениях указанная экзогенная нуклеиново-кислотная конструкция содержит последовательность экзонов с 1 по 17, как определено в δΕΟ ГО N0: 6-22 в последовательном порядке, с интронной последовательностью, встроенной по меньшей мере между двумя экзонными последовательностями для повышения экспрессии трансгена. Предпочтительно нуклеиново-кислотная последовательность 2-го интрона гена 0ЛЬС человека встроена между последовательностями 2 и 3 экзонов.
В других воплощениях указанная галактоцереброзид-Р-галактозидаза содержит последовательность, которая по существу идентична последовательности, представленной в δΕΟ ГО N0: 3. В других воплощениях указанная галактоцереброзид-Р-галактозидаза содержит или состоит по существу из последовательности, представленной в δΕΟ ГО N0: 3.
Предпочтительно указанная галактоцереброзид-Р-галактозидаза состоит из последовательности, которая идентична последовательности, представленной в δΕΟ ГО N0: 3.
В других воплощениях генетически модифицированное млекопитающее, не являющееся человеком, согласно изобретению представляет собой такое млекопитающее, у которого указанная экзогенная нуклеиново-кислотная конструкция кодирует человеческую галактоцереброзид-Р-галактозидазу (0ЛЬС).
Согласно другим воплощениям, генетически модифицированное млекопитающее, не являющееся человеком, согласно изобретению содержит по меньшей мере одну экзогенную нуклеиново-кислотную конструкцию, кодирующую человеческую галактоцереброзид-Р-галактозидазу, где указанная галактоцереброзид-Р-галактозидаза содержит последовательность, которая по существу идентична последовательности, представленной в δΕΟ ΙΌ N0: 3.
- 8 030305
В предпочтительных на данный момент воплощениях генетически модифицированное млекопитающее, не являющееся человеком, согласно изобретению представляет собой млекопитающее, у которого указанная галактоцереброзид-Р-галактозидаза содержит последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 3.
В одинаково предпочтительных воплощениях указанная экзогенная нуклеиново-кислотная конструкция содержит нуклеиново-кислотную последовательность, которая по существу идентична последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1. Опять же, при использовании в данном контексте термин "по существу идентична" следует понимать в широком смысле как включающий нуклеиново-кислотные последовательности, в которых последовательность, представленная в 8Е0 ГО N0: 1, была модифицирована, например, путем вставки, делеции и/или замены одного или более остатков нуклеиновой кислоты, при условии, что транскрипция нуклеиново-кислотной последовательности и последующая трансляция транскрипционного продукта приводят к получению галактоцереброзид-Р-галактозидазы, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 2.
Для того чтобы получить трансмиссию зародышевой линии, генетически модифицированное млекопитающее, не являющееся человеком, по изобретению может быть таким, у которого указанный рекомбинантный ген встроен в геном указанной клетки млекопитающего, не являющегося человеком.
Также предпочтительно, чтобы генетически модифицированное млекопитающее, не являющееся человеком, по любому аспекту настоящего изобретения является таким, у которого указанный рекомбинантный ген нарушает эндогенную аллель галактоцереброзид-Р-галактозидазы указанной клетки млекопитающего, не являющегося человеком, что служит средством для предотвращения экспрессии эндогенной галактоцереброзид-Р-галактозидазы.
Поскольку мыши благодаря их размеру и частой смене поколений являются предпочтительной животной моделью для изучения ОБО, предпочтительно, чтобы млекопитающее, не являющееся человеком, по изобретению представляло собой мышь.
В конкретных воплощениях изобретения предложено генетически модифицированное млекопитающее, которое обладает иммунотолерантностью к ферменту галактоцереброзид-Р-галактозидазе (ОЛЬС), кодируемому указанной экзогенной нуклеиново-кислотной конструкцией.
В других воплощениях изобретения дефицит галактоцереброзид-Р-галактозидазы (ОЛЬС) у указанного генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, является индуцибельным.
Более конкретно, дефицит галактоцереброзид-Р-галактозидазы (ОЛЬС) у указанного генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, может иметь место только у взрослых животных.
Согласно конкретным воплощениям изобретения глобоидно-клеточная лейкодистрофия проявляет себя, и у генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, начинают развиваться симптомы во время отъема от матери или через некоторое время после этого. Конкретный момент времени, когда проявляется глобоидно-клеточная лейкодистрофия и начинают появляться симптомы, зависит от вида животного; в данных предпочтительных воплощениях, согласно которым животное представляет собой мышь, симптомы могут появиться, когда возраст мыши составляет приблизительно 20 суток, например от 15 до 30 суток, например от 15 до 25 суток, от 15 до 22 суток, от 18 до 30 суток, от 18 до 25 суток, от 18 до 22 суток или, например, от 19 до 22 суток.
Как правило, ранние симптомы ОБО включают гиперчувствительность к слуховому, тактильному или визуальному раздражителю, лихорадку, тугоподвижность, судороги, трудности кормления, рвоту и замедление умственного и моторного развития. Более поздние симптомы включают мышечную слабость, спастичность, глухоту, атрофию зрительного нерва и слепоту, паралич и трудности при глотании. У мышей поведенческие симптомы ОБО, как правило, включают тремор, нарушенные двигательные функции и парез задних конечностей.
В конкретных воплощениях согласно изобретению гомозиготные гуманизированные мыши начинают набирать меньшую массу, чем гетерозиготные мыши или мыши дикого типа в возрасте 20-22 суток. Согласно этим воплощениям первые признаки тремора и судорожных движений наблюдаются, и прогрессирующая слабость задних конечностей появляется в возрасте 26-32 суток. Согласно этим воплощениям уменьшение подвижности грудной клетки появляется в возрасте 34-50 суток.
Генетически модифицированное млекопитающее, не являющееся человеком, по любому из предыдущих аспектов, где явная глобоидно-клеточная лейкодистрофия начинается в возрасте от 15 до 50 суток, например в возрасте приблизительно 20 суток, например в возрасте от 15 до 30 суток, например в возрасте от 15 до 25 суток, в возрасте от 15 до 22 суток, в возрасте от 18 до 30 суток, в возрасте от 18 до 25 суток, в возрасте от 18 до 22 суток или, например, в возрасте от 19 до 22 суток.
В четвертом аспекте изобретения предложено применение генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, по изобретению для скрининга и/или оценки агента, пригодного в качестве лекарственного средства для лечения и/или предупреждения глобоидно-клеточной лейкодистрофии. В частности, процесс скрининга и/или оценки может сочетать биохимические, электрофизиоло- 9 030305
гические, гистологические и поведенческие оценки, в том числе:
1) определение накопления психозина в центральной нервной системе и в периферической нервной системе;
2) определение какого-либо влияния на двигательные функции;
3) исчезновение глобоидных клеток.
В частности, применение по изобретению может включать определение фармакокинетики, фармакодинамики, ΆΌΜΕ (абсорбция, распределение, метаболизм и выведение), токсичности и возможных побочных эффектов при однократном введении указанного агента. Кроме того, применение может включать анализ в разные моменты времени после введения для определения зависимости терапевтических эффектов от времени.
Также применение согласно изобретению может включать повторные введения агента, например, чтобы оптимизировать схему приема, включая размер дозы и интервалы введения, и/или чтобы оценить возможные побочные эффекты, включая иммунологические побочные эффекты, повторных курсов лечения. Применение в соответствии с изобретением также может включать долгосрочные исследования для оценки полного терапевтического потенциала введения указанного агента.
Благодаря захвату клетками-реципиентами через манноза-6-фосфат зависимый эндоцитоз и лизосомную доставку внеклеточной галактоцереброзид-З-галактозидазы ферментозаместительная терапия (ΕΚΤ) может являться возможным методом лечения болезни Краббе. Таким образом, в конкретных воплощениях указанный агент представляет собой выделенную рекомбинантную галактоцереброзид-βгалактозидазу (САЬС).
Согласно дополнительным воплощениям агент представляет собой выделенную рекомбинантную человеческую галактоцереброзид-З-галактозидазу (СЛЬС).
В пятом аспекте изобретения предложен способ оценки агента, включающий следующие стадии:
а) предоставление генетически модифицированного млекопитающего, не являющегося человеком, как описано выше;
б) приведение указанного млекопитающего, не являющегося человеком, в контакт с оцениваемым агентом;
в) определение, реагирует ли указанное млекопитающее, не являющееся человеком, на указанный агент после указанного контакта.
В конкретных воплощениях указанный агент представляет собой выделенную рекомбинантную галактоцереброзид-З-галактозидазу (СЛЬС).
Согласно дополнительным воплощениям агент представляет собой выделенную рекомбинантную человеческую галактоцереброзид-З-галактозидазу (СЛЬС).
Объем настоящего изобретения изложен в прилагаемой формуле изобретения. В контексте формулы изобретения термины "содержащий" или "содержит" не исключают другие возможные элементы или стадии. Кроме того, упоминание терминов в единственном числе не следует понимать как исключение множественного числа. Кроме того, отдельные признаки, указанные в разных пунктах формулы изобретения, возможно могут быть успешно скомбинированы, и упоминание этих особенностей в разных пунктах формулы изобретения не исключает, что комбинация признаков является возможной и предпочтительной.
Дальнейшее изобретение будет проиллюстрировано с помощью примеров, которые ни в коей мере не предназначены для ограничения объема защиты.
Примеры
Пример 1. Создание иммунотолерантной мышиной модели болезни Краббе.
Стратегия эксперимента и дизайн направленного вектора для нокина.
Стратегия эксперимента включает удаление 57 кб кодирующей области гена СЛЬС из хромосомы 12 мышиного генома и замещение человеческой полноразмерной кДНК СЛЬС, несущей мутацию С.С809А (р.С270Э) и полиморфизм С.Т1637С (р.1546Т). Экспрессия встроенной мутантной человеческой кДНК САЬС должна была контролироваться с помощью эндогенного мышиного промотора САЬС и поли(А)-сигнала.
Геномная последовательность вверх от кодирующей области, 5'-нетранслируемая область и З'-нетранслируемая область мышиного гена должны оставаться нетронутыми. Старт-кодон АТС и стопкодон ТАА человеческой кДНК следовало расположить точно на мышином АТС и ТАА кодоне соответственно. Для повышения уровней экспрессии трансгена второй интрон человеческого гена САЬС (247 п.о.) следовало встроить в кДНК САЬС человека.
Чтобы обеспечить возможность гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых (Εδ) клетках, 5'-последовательность длиной ~10 кб, гомологичную геномной последовательности, расположенной выше мышиного гена САЬС, добавляли к направленному вектору (длинное гомологичное плечо). Аналогично, добавляли З'-последовательность длиной ~1,8 кб, которая гомологична геномной последовательности, расположенной ниже мышиного гена САЬС (короткое гомологичное плечо). В альтернативном подходе длина длинного гомологичного плеча составляла приблизительно 6 кб, в то время
- 10 030305
как длина короткого гомологичного плеча составляла приблизительно 4 кб.
Для этой цели посредством синтеза бе ηονο был создан остов вектора, содержащий все модули, за исключением мышиной 5'-гомологичной области. Этот вектор содержал два уникальных сайта рестрикции, которые обеспечивали последующее встраивание мышиной 5'-гомологичной области. Мышиную 5'-гомологичную область получали посредством ПЦР-амплификации, используя полученную из С57ВЬ/6 геномную ДНК или ВАС-клоны в качестве матрицы. Альтернативно, последовательность восстанавливали посредством рекомбинационной инженерии на основе ВАС-клона, включающего 5'-область мышиного гена ОАЬС. Затем 5'-гомологичную область встраивали в остов вектора.
Кассету резистентности к неомицину встраивали в направленный вектор, чтобы обеспечить позитивную селекцию Е8-клеточных клонов, в которых этот вектор был стабильно интегрирован в геном. В альтернативном подходе для позитивной селекции использовали маркер резистентности к пуромицину. Кассета резистентности была фланкирована РКТ-сайтами, чтобы обеспечить возможность удаления кассеты после создания трансгенных мышей с помощью Ρΐίρ-рекомбиназы. Удаление маркера селекции требуется для снижения риска интерференции между промотором 8У40 кассеты резистентности к неомицину и мышиным промотором ОАЬС.
Для негативной селекции Е8-клеточных клонов со случайной интеграцией вторую кассету экспрессии, кодирующую альфа-субъединицу дифтерийного токсина, добавляли к З'-концу последовательности вектора. Эта кассета не имела поли(А)-сигнала. Из-за отсутствия полиаденилирования транскрипты были нестабильными, и белок не мог транслироваться до интеграции вектора в геном. После случайной интеграции в геном клеточная РНК-полимераза транскрибировала открытую рамку считывания, пока не распознавала функциональный поли(А)-сигнал в геномной последовательности, расположенной ниже сайта случайной интеграции. мРНК была стабилизирована посредством полиаденилирования и альфасубъединица дифтерийного токсина экспрессировалась так, чтобы убить клетку. Когда вектор интегрировался сайт-специфически посредством гомологичной рекомбинации, кассета экспрессии терялась, и токсичный продукт не мог экспрессироваться. В альтернативном подходе для негативной селекции случайных интегрантов была включена кассета экспрессии тимидинкиназы.
Чтобы обеспечить возможность последующего обмена модулей последовательности направленного вектора, уникальные сайты рестрикции встраивали в положения, в которых модификации последовательности не должны были отрицательно влиять на функции вектора. Вектор был фланкирован уникальными сайтами ЕсоКУ, которые обеспечивают возможность (1) конструирования остова вектора посредством ДНК-синтеза бе ηονο в стандартных векторах, таких как рВ1ие5Спр1. и (2) вырезания направленного вектора из плазмид. Общая длина конструкции направленного вектора не превышала 18 кб.
В кратком изложении конструкция вектора была следующей:
5'-[мышиная 5'-гомологичная область, 10 кб] - [человеческая мутантная кДНК ОАЬС с интроном 2, 2,2 кб] - [мышиная З'-ИТК с поли(А), 1,6 кб] - [мышиная З'-фланкирующая область в качестве спейсера, 0,15 кб] - [£б-фланкированная кассета резистентности к неомицину, 1,4 кб] - [мышиная З'-гомологичная область, 1,8 кб] - [кассета экспрессии альфа-субъединицы дифтерийного токсина, 1,6 кб]-3'.
На фиг. 1 графически представлено конструирование вектора. Нуклеиново-кислотная последовательность направленного вектора представлена в 8ЕО ГО N0: 23.
Культура Е8-клеток и гомологичная рекомбинация.
Е8-клетки С57В^/6N выращивали на митотически инактивированном фидерном слое мышиных эмбриональных фибробластов в среде ΌΜΕΜ (среда Игла, модифицированная Дульбекко) с высоким содержанием глюкозы, содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (РА^Вю!есй, А1бепЬасй, Оегтапу) и 1200 ед/мл фактора, ингибирующего лейкемию (Е8О 1107; Μίΐΐίροΐΐ, 8ск\ц1Ьаск Оегтапу). Клетки (1х107) электропорировали линеаризованным вектором ДНК (30 мкг), используя Вю-Каб Оепе Рикег (Βίο-Каб, Мшиск Оегтапу) при 240 В и 500 мкФ. Пуромициновую селекцию (1 мкг/мл) начинали на 2-е сутки, контрселекцию с ганцикловиром (2 мкМ) на 5 сутки после электропорации. Отобранные Е8 клоны выделяли на 8 сутки и анализировали с помощью Саузерн-блоттинга в соответствии со стандартными методиками, используя подходящие рестрикционные ферменты и внутренние и внешние зонды. Правильная гомологичная рекомбинация и единичное интегрирование подтверждались в 12 из 145 Е8-клеточных клонов, что указывало на частоту нацеливания 8,3% (не показано).
Пример 2. Получение химерных мышей.
Бластоцисты выделяли из суперовулированных самок ВАЬВ/с на брс 3,5 (на 3,5 сутки после спаривания). Для микроинъекции бластоцисты помещали в капле ИМЕМ с 15% РС8 (фетальная бычья сыворотка) под минеральное масло. Плоский наконечник, пипетку для микроинъекции с пьезоэлектрическим приводом и внутренним диаметром 12-15 мкм использовали для инъекции 10-15 нацеленных С57ВЬ/6КГас Е8-клеток в каждую бластоцисту. В общей сложности 98 бластоцист были инъецированы Е8-клетками из двух нацеленных клонов. После извлечения, 8 инъецированных бластоцист переносили в каждый рог матки псевдобеременных ΝΜΚΙ-самок через 2,5 суток после спаривания. У суррогатных мышей родилось 29 детенышей, из которых 18 были химерами. Химеризм определяли по вкладу Е8-клеток в окраску шерсти хозяина ВАЬВ/с (черный/белый). Пять высокохимерных самцов мышей (>50%) спаривали с самками С57ВЬ/6, трансгенными по гену Р1р-рекомбиназы (8сйай е1 а1., 2001). Две
- 11 030305
спаренные пары произвели в общей сложности 96 детенышей. Трансмиссию зародышевой линии определяли по присутствию черного потомства линии С57ВЬ/6. Мыши, гетерозиготные по гуманизированной аллели ОАРС, были идентифицированы с помощью ПЦР-генотипирования и скрещены для получения гомозиготного потомства.
ПЦР-генотипирование.
Определение гетерозиготных и гомозиготных гуманизированных аллелей.
Праймеры:
2282_45: ССАТССААСТСАСАССАТСС, 2282_46: ААТАТСССАСАТСССТТСАСС
1260_1: САОАСТСТСССТАСТСАТСС, 1260_2: ССТТСАССААСАССТССССАС
Реакция:
5 мкл ПЦР-буфер 10х (1пуДго§еп), 2 мкл МдС12 (50 мМ), 1 мкл άΝΤΡδ (10 мМ), 1 мкл праймера 2282_45 (5 мкМ), 1 мкл праймера 2282_46 (5 мкМ), 1 мкл праймера 1260_1 (5 мкМ), 1 мкл праймера 1260_2 (5 мкМ), 0,2 мкл Тац (5 ед/мкл, 1пуЦгодеп), 35,8 мкл Н2О, 2 мкл ДНК.
Программа:
1 X 95°С 5 мин
35 циклов: 95°С 30 сек, 60°С 30 сек, 72°С 1 мин
1 X 72°С 10'
Ожидаемые фрагменты [п.о.]: 474(гум) Ожидаемые контрольные фрагменты [п.о.]: 585(к)
Фрагмент, амплифицированный с помощью олигонуклеотидов
1 (2282_45: ССАТССААСТСАСАССАТОС) + 2 (2282_46: ААТАТСССАСАТСССТТСАеС) выявил гетерозиготные и гомозиготные гуманизированные аллели. Использование условий, описанных выше, не позволит обнаружить аллель Оа1с дикого типа. Зиготность гуманизированной аллели подтверждали путем применения методики, представленной ниже, для выявления гетерозиготных и гомозиготных аллелей дикого типа. Амплификация положительного контрольного фрагмента (585 п.о. (к)) путем использования олигонуклеотидов 1260_1 и 1260_2 относится к аллели дикого типа СИ79Ь (ΝΤ_165773.2 πΐ 1771403617714620 Сйг.11) для проверки целостности ПЦР-образца.
Определение гетерозиготных и гомозиготных аллелей дикого типа.
Праймеры:
2283_48: СОТСТССТОСАСТСААСТСС, 2282_46: ААТАТСССАСАТСССТТСАСС
1260_1: САОАСТСТСССТАСТСАТСС, 1260_2: ССТТСАССААСАССТССССАС
Реакция:
5 мкл ПЦР-буфера 10х (1пуйго§еп), 2 мкл МдС12 (50 мМ), 1 мкл άΝΤΡδ (10 мМ), 1 мкл праймера 2283_48 (5 мкМ), 1 мкл праймера 2282_46 (5 мкМ), 1 мкл праймера 1260_1 (5 мкМ), 1 мкл праймера 1260_2 (5 мкМ), 0,2 мкл Тац (5И/ мкл, 1пуЦгодеп), 35,8 мкл Н2О, 2 мкл ДНК.
Программа:
1 X 95°С 5 мин
35 циклов: 95°С 30 сек, 60°С 30 сек, 72°С 1 мин
1Х 72°С 10'
Ожидаемые фрагменты [п.о.]: 316(д.т.)
Ожидаемые контрольные фрагменты [п.о.]: 585(к)
Фрагмент, амплифицированный с помощью олигонуклеотидов
3 (2283_48: СеТСТеСТОСАСТСААСТеС) + 2 (2283_46: ААТАТСССАСАТСеСТТСАСС) выявил гетерозиготные и гомозиготные аллели дикого типа. Амплификация положительного контрольного фрагмента (585 п.о. (к)) с использованием олигонуклеотидов 1260_1 и 1260_2 относится к аллели дикого типа СИ79Ь (ΝΤ_165773.2 ηΐ 17714036-17714620 СЬг.11) для проверки целостности ПЦР-образца.
Обнаружение Р1р-трансгена
Праймеры:
1307_1: Р1ре_аз_СССА0ААССАСССТТАТС6,
1307_2: Р1ре_з_САСАА6ССТТА0ТАСССАСАТ
Реакция:
5 мкл ПЦР-буфера 10х (1пуДго§еп), 2 мкл МдС12 (50 мМ), 1 мкл άΝΤΡδ (10 мМ), 1 мкл праймера 1307_1 (5 мкМ), 1 мкл праймера 1307_2 (5 мкМ), 0,2 мкл Τας (5 ед/мкл, 1пуДгодеп), 37,8 мкл Н2О, 2 мкл ДНК.
- 12 030305
Программа:
1 X 95°С 5 мин
35 циклов: 95°С 30 сек, 60°С 30 сек, 72°С 1 мин 1 X 72°С 10'
Ожидаемые фрагменты [п.о.]:343(нацел)
Обнаружение Т1р-трансгена, включение 1307+контроль для создания дополнительного контрольного фрагмента 585 п.о. (ПЦР-ΙΌ 1260).
Праймеры:
1307_1: Нре_аз_СССАСААССАСССТТАТСС,
1307_2: Р1ре_5_САСААСССТТАСТАСССАСАТ,
1260_1: ОАОАСТСТееСТАСТСАТСС, 1260_2: ΟΟΤΤΟΑΟΟΑΑΟΑΟΟΤΟΟΟΟΑΟ
Реакция:
5 мкл ПЦР-буфера 10х (1пуйгодеп), 2 мкл МдС12 (50 мМ), 1 мкл άΝΤΡδ (10 мМ), 1 мкл праймера 1307_1 (5 мкМ), 1 мкл праймера 1307_2 (5 мкМ), 1 мкл праймера 1260_1 (5 мкМ), 1 мкл праймера 1260_2 (5 мкМ), 0,2 мкл Тац (5 ед/мкл, 1пуйгодеп), 35,8 мкл Н2О, 2 мкл ДНК.
Программа:
1 X 95°С 5 мин
35 циклов: 95°С 30 сек, 60°С 30 сек, 72°С 1 мин 1 X 72°С 10'
Ожидаемые Фрагменты [п.о.]: 343(нацел)
Ожидаемые Контрольные Фрагменты [п.о.]: 585(к)
Пример 3. Патофизиологический анализ гуманизированных нокин-мышей.
Параметры.
Анализ мышей, гомозиготных по человеческому мутантному САЬС-аллелю ЬСАЬСС809А/Т1637С можно разделить на пять частей: анализ общего фенотипа, биохимическое подтверждение, анализ общего фенотипа, оценка биохимических маркеров заболевания и оценка гистологических маркеров болезни (смотри список ниже). Следует отметить, что результаты некоторых исследований определяют детали последующих анализов. Если поведенческие аномалии не обнаруживаются, тогда, например, электрофизиологические измерения проводимости нерва будут исключены. Таким образом, следующий ниже список представляет собой набор возможных анализов, которые имеют смысл, учитывая, что у гуманизированных нокин-мышей развивается легкий вариант фенотипа ЦуНсИег с увеличенной продолжительностью жизни, но явными нарушениями поведения. Анализы, которые являются обязательными для оценки фенотипа, и которые также будут выполняться в отсутствие явного фенотипа, подчеркнуты. Методы указаны в скобках.
(1) Общий фенотип: смертность; масса;
поведение (тремор, двигательные функции, парез задних конечностей).
(2) Биохимическая оценка генетической модификации: определение остаточной САЬС-активности (анализы активности); анализ человеческой мРНК САЕС (нозерн-блоттинг);
анализ человеческого САЬС-полипептида (вестерн-блоттинг);
картина экспрессии человеческой САЕС (гибридизация ΐπ δϊίιι, иммуногистохимия);
оценка САЬС-активности ΐπ δϊίιι (Х-Са1 окрашивание).
(3) Анализ общего фенотипа:
смертность, вероятная продолжительность жизни (кривые выживаемости Каплана-Мейера); прибавка массы после рождения (регулярное определение массы) поведение, в зависимости от возраста:
дрожание (визуальное наблюдение), двигательные функции (вращающийся стержень),
исследовательская активность (открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт), походка (бегущая дорожка),
скорость плавания (автоматизированная система слежения); электрофизиология (анализ потенциалов сложной двигательной активности).
(4) Оценка биохимических маркеров заболевания:
липидный профиль (тонкослойная хроматография, ΕδΙ-Μδ (ионизация электрораспылением-массспектрометрия);
количественная оценка психозина и галактозилцерамида (ТСХ, ΕδΙ-Μδ); анализ маркера астроглиоза СТАР (вестерн-блоттинг);
- 13 030305
анализ маркеров воспаления, например 1Ь-1а, 1>1β, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-10, 1Ь-17, ΙΓΝα, ΙΡΝβ, ΙΡΝγ, 1Ь-6, ΤΝΡα, ΜΙΡ1α, ΜΙΡ1β, МСР-1, ΚΆΝΤΕ3, СХСК4, ССК.7, МНС-Ι, МНС-ΙΙ, 1Ьа-1, СИ11Ь, 068, С04, С08 (количественная ПЦР, белковые чипы, вестерн-блоттинг, нозерн-блоттинг);
анализ миелиновых маркеров, например МВР (основной белок миелина), РЬР (протеолипидный белок), МАО (миелин-ассоциированный гликопротеин) (вестерн-блоттинг).
(5) Оценка гистологических маркеров заболевания:
общая гистология (НЕ(гематоксилин-эозиновое) окрашивание);
выявление глобоидных клеток (РАЗ-окрашивание (окрашивание Шифф-йодной кислотой)); инфильтрация макрофагами (окрашивание лектином); апоптоз (наборы для обнаружения апоптоза).
Более крупные группы, содержащие гомозиготных мышей соответствующей возрастной группы, например трех разных возрастов (например, в возрасте 1, 3 и 6 месяцев), анализировали параллельно для получения полных и статистически значимых данных. Мышей дикого типа соответствующей возрастной группы с одним и тем же генетическим фоном используют в качестве отрицательного контроля. ТАЙеНег-мышей можно использовать в качестве положительных контролей.
Предварительные результаты.
Гетерозиготные нокин-мыши не имеют очевидного фенотипа заболевания. Результаты анализа экспрессии мРНК человеческой ОАГСти! и мРНК мышиной ОАЕС, определенные с помощью ПЦР в режиме реального времени с зондами ТацМап, показаны на фиг. 2. Исследования показали, что 7-53% человеческой ОАЕС экспрессируется в гетерозиготных мышах по сравнению с мышиным ОАЕС.
Наблюдения за фенотипом гомозиготных нокин-мышей.
Гомозиготные нокин-мыши демонстрируют клиническое течение ОГО сравнимое с 1АйеЬегмышами. Начиная с возраста четырех недель, гомозиготные гуманизированные мыши начинают меньше набирать массу, чем гетерозиготные мыши или мыши дикого типа. Общие массы тела были низкими (табл. 3), но немного выше, чем регистрировали для 1АйеЬег-мышей. Между ΡΝΏ (сутки после рождения) 26-32 (в среднем 30,1) наблюдались первые признаки дрожания и судорожного сокращения, начинала появляться прогрессирующая слабость задней ноги и между ΡΝΏ 34-50 (в среднем 40,4) замечали пониженную подвижность корпуса. Средняя продолжительность жизни 14 наблюдаемых животных составляла 45,8±7,3 суток (среднее ± ст. отклонение). Эта ожидаемая продолжительность жизни несколько больше, чем сообщалось для 1АЙеЬег-мышей (40 д).
Таблица 3
Масса тела мышей дикого типа и трансгенных мышей
| Генотип | Масса тела |
| ννί/ννί | 18,4 г |
| 1дЛл/1 | 20,5 г |
| 1дЛд | 5,2 г |
Уровень ОАЕС-активности определяли у мышей дикого типа, гомозиготных мышей и гетерозиготных мышей. Результаты показаны в табл. 4.
Таблица 4
Уровень ОАЕС-активности у мышей дикого типа, гомозиготных и гетерозиготных мышей
Почки
| νντ | Животное 46/27/6/2т 77/20/15т Среднее | Мозг 2,50 2,50 2,50 | Сердце 0,24 0,27 0,26 | Печень 0,86 1,50 1,18 | (Б) 6,60 7,20 6,90 | δ.С. 1,50 1,70 1,60 |
| Гомоз | 46/27/6/1 т | 0,05 | 0,15 | 0,21 | 0,09 | 0,00 |
| 46/27/6/2т | 0,12 | 0,00 | 0,12 | 0,17 | 0,03 | |
| 46/27/6/61 | 0,13 | 0,12 | 0,23 | 0,07 | 0,17 | |
| Среднее | 0,10 | 0,09 | 0,19 | 0,11 | 0,07 | |
| Г етероз | 46/27/6/4т | 0,67 | 0,14 | 0,55 | 3,80 | 0,75 |
| 46/27/6/51 | 0,88 | 0,10 | 1,20 | 3,70 | 0,83 | |
| 46/27/6/71 | 1,50 | 0,29 | 0,77 | 3,60 | 0,86 | |
| Среднее | 1,02 | 0,18 | 0,84 | 3,70 | 0,81 |
гНОАГС в мозге (хороидное сплетение) определяли посредством иммуногистохимии (20x1 с) с раЬОАЕС (А) и мечения ядра с помощью ΟΑΡΙ (В). Результаты показаны на фиг. 4.
- 14 030305
Пример 4. Иммунологическая толерантность к рекомбинантной человеческой ОАЬС.
Ожидалось, что трансгенная экспрессия мутантной человеческой ОАЬС в новой гуманизированной
мышиной модели глобоидно-клеточной лейкодистрофии придаст иммунологическую толерантность внутривенно инъецированной гйОАЫС, обеспечив возможность долгосрочных ЕКТ-испытаний без иммунологических побочных эффектов. Чтобы проверить эту идею, рекомбинантную человеческую ОАЬС вводили либо посредством внутривенной инфузии в хвостовую вену, либо путем внутрибрюшинной инъекции гомозиготным мышам йОАЫСО809А/Т1637С. Уровни циркулирующей в крови рекомбинантной человеческой ОАЬС после внутривенного и внутрибрюшинного введения показаны на фиг. 5.
Для того чтобы подтвердить, что мыши иммунотолерантны к введению экзогенной ОАЬС, гйОАЫС инкубировали с сывороткой (8 стадий разведения). Антитела, связанные с гйОАЫС, осаждали после инкубации с РапзогЪт. Остаточную ОАЬС-актнвность в надосадочной жидкости определяли, используя анализ активности НПО. Как показано на фиг. 6, у обработанных мышей не было обнаружено никакого титра аОАЫС-антигел.
Литература
В Эе Сазреп, V 1_ РпебпсЬ, С Μ Регег, Е ЗепЮгк, Р Н \Л/еп, К КеПеу, С А Е1бег апб М А Сата Зоза: Тгапздепю гезсие οί КгаЬЬе сПзеазе ίη (Ье йл/НсЬег тоизе, <3епе ТРегару (2004) 11, 1188-1194. 6οί: 10.1038/з£дй 3302282 РиЬПзЬеб опПпе 27 Мау 2004.
Рао1а Ι_υζί, МоЬаттаб А. Рай, Манат 2ака, Магк Сигйз, Мапе Т. Уагпег, апб Оау|б А. \Л/епдег, Сепегайоп οί а Моизе ννίίή 1_о\л/ Са1ас(осегеЬгоз1базе Αοίίνίΐγ Ьу Сепе Тагдейпд: А Νβνν Мобе! οί С1оЬо1б СеП 1_еикобуз(горЬу (КгаЬЬе 0|зеазе), Мо1еси1аг (ЗепеИсз апс! Ме{аРоНзт, νοΙ. 73, 3, би1у 2001, Радез 211-223.
АИзсЬи! δΡ, С|зЬ \Ν, МШег \Л/, Муегз Е\Л/, Ыртап ϋΰ. Вазю 1оса1 аПдптегН зеагсЬ ίοοΙ. 2 ΜοΙ ΒίοΙ. 1990 Ос1 5;215(3):403-10 (РМЮ: 2231712).
Τθρρίηο В, В|апсЬеп Р, Моб М, Ред15 δ, СогзоНгн Р, Розз! А, 3(горр1апо М,
1_иа1б1 3, РЫтага А, ВетЫ В, ϋί Россо М, Соорег ϋΝ, РПосато М.
1бепННса1юп апб сЬагас(еп2айоп οί 15 ηονθί СА1_С депе гтЛайопз саизИд КгаЬЬе б1зеазе. Нит Ми(а(. 2010 Оес;31(12):Е1894-914. (РМЮ: 20886637)
- 15 030305
Перечень последовательностей
<110> АСЕ Вчозсчепсез А/5
<120> ЖИВОТНАЯ МОДЕЛЬ БОЛЕЗНИ КРАББЕ
<130> 47580ХХ01
<160> 31
<170> РаЛепЫп чегзчоп 3.5
<210> 1
<211> 2010
<212> ДНК
<213> Ното зартепз
| <400> 1 а£ддс£дсдд | ссдсдддЛЛс | ддсдддссдс | дссдсддЛдс | сс££дс£дс£ | д£д£дсдс£д | 60 |
| сЛддсдсссд | дсддсдсдЛа | сд£дс£сдас | дасЛссдасд | ддсЛдддссд | ддадЛЛсдас | 120 |
| ддсаЛсддсд | сддЛсадсдд | сддсддддса | ассЛсссдас | ££с£ад£ааа | ЛЛасссадад | 180 |
| ссс£а£сд££ | с£сада£а££ | дда££а£с£с | £££аадссда | а££££дд£дс | с£с£££дса£ | 240 |
| а££££аааад | ЛддаааЛадд | £дд£да£ддд | садасаасад | асддсасЛда | дсссЛсссас | 300 |
| а£дса££а£д | сас£ада£да | даа££а£££с | сдаддаЛасд | ад£дд£дд££ | даЛдааадаа | 360 |
| дсЛаадаада | ддааЛсссаа | £а££асас£с | а££ддд££дс | са£дд£са££ | ссс£дда£дд | 420 |
| сЛдддаааад | д£££сдас£д | дсс££а£д£с | аа£с££садс | £дас£дсс£а | ££а£д£сд£д | 480 |
| асс£дда££д | Лдддсдссаа | дсд££асса£ | да£££ддаса | ££да££а£а£ | £ддаа£££дд | 540 |
| аа£дададд£ | са£а£аа£дс | сааИаЬаИ | аада£а££аа | дааааа£дс£ | даа££а£саа | 600 |
| дд£с£ссадс | дад£даааа£ | са£адсаад£ | да£аа£с£с£ | дддад£сса£ | с£с£дса£сс | 660 |
| а£дс£сс££д | а£дссдаас£ | с££саадд£д | д££да£д££а | ЛаддддсЛса | ££а£сс£дда | 720 |
| асссаЛЛсад | саааадаЛдс | ааад££дас£ | дддаадаадс | £££дд£с££с | £даадас£££ | 780 |
| адсас£££аа | а£ад£даса£ | дддЛдсаддс | £дс£дддд£с | дса££££ааа | £садаа££а£ | 840 |
| а£саа£ддс£ | а£а£дас££с | сасааЛсдса | £ддаа£££ад | £ддс£ад££а | с£а£даасад | 900 |
| ££дсс££а£д | ддадаЛдсдд | д££да£дасд | дсссаададс | са£ддад£дд | дсас£асд£д | 960 |
| д£адаа£с£с | с£д£с£ддд£ | а£садс£са£ | ассас£сад£ | ИасЬсаасс | £ддс£дд£а£ | 1020 |
| ЛассЛдаада | садЛЛддсса | £££ададааа | ддаддаадсЛ | асд£адс£с£ | дас£да£ддс | 1080 |
| ЛЛадддаасс | £сасса£са£ | саЛЛдааасс | а£дад£са£а | аасаИсЬаа | д£дса£асдд | 1140 |
| ссаШсИс | сИаШсаа | £д£д£сасаа | саа£££дсса | сс£££д££с£ | £ааддда£с£ | 1200 |
| £££ад£дааа | ЛассададсЛ | асадд£а£дд | ЛаЛассааас | ЛЛддааааас | аЛссдааада | 1260 |
| адсадсЛдда | ££с£с£а£дд | с£сс££даса | дсдаЛддсад | £££сасас£д | 1320 | |
| адсс£дса£д | аада£дадс£ | д££сасас£с | ассас£с£са | ссас£дд£сд | саааддсадс | 1380 |
- 16 030305
| 5асссдс55с | с5ссаааа5с | ссадссс55с | ссаад5асс5 | а5аадда5да | ккксаакдкк | 1440 |
| да55ассса5 | 55555ад5да | адсЬссааас | 555дс5да5с | ааас5дд5д5 | а555даа5а5 | 1500 |
| 555асааа5а | 55даадассс | 5ддсдадса5 | сас55сасдс | 5асдссаад5 | 5с5саассад | 1560 |
| адассса55а | сд5дддс5дс | сда5дса5сс | аасасааЬса | д5а55а5адд | адасЬасаас | 1620 |
| 5ддассаа5с | 5дас5а5ааа | дкдкдакдкк | 5аса5адада | ссссЬдасас | аддадд5д5д | 1680 |
| 55са55дсад | даададЬааа | 5ааадд5дд5 | а5555да55а | даадЬдссад | аддаа5555с | 1740 |
| 55с5дда555 | ккдсааакдд | а5с55асадд | дккасаддкд | а555адс5дд | а5дда55а5а | 1800 |
| 5а5дс555ад | дасдкдккда | адЦасадса | аааааа5дд5 | а5асас5сас | дккааскакк | 1860 |
| ааддд5са55 | 5сдсс5с5дд | са5дс5даа5 | дасаад5с5с | 5д5ддасада | са5ссс5д5д | 1920 |
| аа5555ссаа | адаа5ддс5д | ддскдсаакк | ддаас5сас5 | сскккдаакк | 5дсасад555 | 1980 |
| дасаас555с | ккдкддаадс | сасасдсЬаа | 2010 |
<210> 2
<211> 669
<212> РКТ
<213> Ното Зар1епз
<400> 2
| Ме5 1 | А1а А1а | А1а | А1а О1у Зег А1а О1у Агд А1а А1а Уа1 | Рго | Ьеи 15 | Ьеи | |||||||||
| 5 | 10 | ||||||||||||||
| Ьеи | Суз | А1а | Ьеи | Ьеи | А1а | Рго | О1у | О1у | А1а | Туг | Уа1 | Ьеи | Азр | Азр | Зег |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Азр | О1у | Ьеи | О1у | Агд | О1и | РНе | Азр | О1у | 11е | О1у | А1а | Уа1 | Зег | О1у | О1у |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| О1у | А1а | ТНг | Зег | Агд | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Азп | Туг | Рго | О1и | Рго | Туг | Агд | Зег |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| О1п | 11е | Ьеи | Азр | Туг | Ьеи | РЬе | Ьуз | Рго | Азп | РЬе | О1у | А1а | Зег | Ьеи | Н1з |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| 11е | Ьеи | Ьуз | Уа1 | О1и | 11е | О1у | О1у | Азр | О1у | О1п | ТЬг | ТЬг | Азр | О1у | ТЬг |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| О1и | Рго | Зег | Н1з | Ме5 | Н1з | Туг | А1а | Ьеи | Азр | О1и | Азп | Туг | РЬе | Агд | О1у |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Туг | О1и | Тгр | Тгр | Ьеи | Ме5 | Ьуз | О1и | А1а | Ьуз | Ьуз | Агд | Азп | Рго | Азп | 11е |
| 115 | 120 | 125 |
- 17 030305
| ТЬг | Ьеи 130 | 11е О1у | Ьеи | Рго | Тгр 135 | Зег | РЬе | Рго | О1у | Тгр 140 | Ьеи | О1у | Ьуз | О1у | |
| РЬе | Азр | Тгр | Рго | Туг | Уа1 | Азп | Ьеи | О1п | Ьеи | ТЬг | А1а | Туг | Туг | Уа1 | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| ТЬг | Тгр | 11е | Уа1 | О1у | А1а | Ьуз | Агд | Туг | Н1з | Азр | Ьеи | Азр | 11е | Азр | Туг |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| 11е | О1у | 11е | Тгр | Азп | О1и | Агд | Зег | Туг | Азп | А1а | Азп | Туг | 11е | Ьуз | 11е |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ьеи | Агд | Ьуз | МеЬ | Ьеи | Азп | Туг | О1п | О1у | Ьеи | О1п | Агд | Уа1 | Ьуз | 11е | 11е |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| А1а | Зег | Азр | Азп | Ьеи | Тгр | О1и | Зег | 11е | Зег | А1а | Зег | МеЬ | Ьеи | Ьеи | Азр |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| А1а | О1и | Ьеи | РЬе | Ьуз | Уа1 | Уа1 | Азр | Уа1 | 11е | О1у | А1а | Н1з | Туг | Рго | О1у |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| ТЬг | Ηΐ3 | Зег | А1а | Ьуз | Азр | А1а | Ьуз | Ьеи | ТЬг | О1у | Ьуз | Ьуз | Ьеи | Тгр | Зег |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Зег | О1и | Азр | РЬе | Зег | ТЬг | Ьеи | Азп | Зег | Азр | МеЬ | О1у | А1а | Азр | Суз | Тгр |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| О1у | Агд | 11е | Ьеи | Азп | О1п | Азп | Туг | 11е | Азп | О1у | Туг | МеЬ | ТЬг | Зег | ТЬг |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| 11е | А1а | Тгр | Азп | Ьеи | Уа1 | А1а | Зег | Туг | Туг | О1и | О1п | Ьеи | Рго | Туг | О1у |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Агд | Суз | О1у | Ьеи | МеЬ | ТЬг | А1а | О1п | О1и | Рго | Тгр | Зег | О1у | Н1з | Туг | Уа1 |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Уа1 | О1и | Зег | Рго | Уа1 | Тгр | Уа1 | Зег | А1а | Н1з | ТЬг | ТЬг | О1п | РЬе | ТЬг | О1п |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Рго | О1у | Тгр | Туг | Туг | Ьеи | Ьуз | ТЬг | Уа1 | О1у | Н1з | Ьеи | О1и | Ьуз | О1у | О1у |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Зег | Туг | Уа1 | А1а | Ьеи | ТЬг | Азр | О1у | Ьеи | О1у | Азп | Ьеи | ТЬг | 11е | 11е | 11е |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| О1и | ТЬг | МеЬ | Зег | Нтз | Ьуз | Н1з | Зег | Ьуз | Суз | 11е | Агд | Рго | РЬе | Ьеи | Рго |
| 370 | 375 | 380 |
- 18 030305
| Туг 385 | РЬе | Азп | Уа1 | Зег | О1п 390 | О1п | РЬе | А1а | ТЬг | РЬе 395 | Уа1 | Ьеи | Ьуз | О1у | Зег 400 |
| РЬе | Зег | О1и | 11е | Рго | О1и | Ьеи | О1п | Уа1 | Тгр | Туг | ТЬг | Ьуз | Ьеи | О1у | Ьуз |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | О1и | Агд | РЬе | Ьеи | РЬе | Ьуз | О1п | Ьеи | Азр | Зег | Ьеи | Тгр | Ьеи | Ьеи |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Азр | О1у | Зег | РЬе | ТЬг | Ьеи | Зег | Ьеи | Н1з | О1и | Азр | О1и | Ьеи | РЬе |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| ТЬг | Ьеи | ТЬг | ТЬг | Ьеи | ТЬг | ТЬг | О1у | Агд | Ьуз | О1у | Зег | Туг | Рго | Ьеи | Рго |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Рго | Ьуз | Зег | О1п | Рго | РЬе | Рго | Зег | ТЬг | Туг | Ьуз | Азр | Азр | РЬе | Азп | Уа1 |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Азр | Туг | Рго | РЬе | РЬе | Зег | О1и | А1а | Рго | Азп | РЬе | А1а | Азр | О1п | ТЬг | О1у |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| ναι | РЬе | О1и | Туг | РЬе | ТЬг | Азп | 11е | О1и | Азр | Рго | О1у | О1и | Н1з | Н1з | РЬе |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| ТЬг | Ьеи | Агд | О1п | Уа1 | Ьеи | Азп | О1п | Агд | Рго | 11е | ТЬг | Тгр | А1а | А1а | Азр |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| А1а | Зег | Азп | ТЬг | 11е | Зег | 11е | 11е | О1у | Азр | Туг | Азп | Тгр | ТЬг | Азп | Ьеи |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| ТЬг | ТЬг | Ьуз | Суз | Азр | Уа1 | Туг | 11е | О1и | ТЬг | Рго | Азр | ТЬг | О1у | О1у | Уа1 |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| РЬе | 11е | А1а | С1у | Агд | Уа1 | Азп | Ьуз | О1у | О1у | 11е | Ьеи | 11е | Агд | Зег | А1а |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Агд | О1у | 11е | РЬе | РЬе | Тгр | 11е | РЬе | А1а | Азп | О1у | Зег | Туг | Агд | Уа1 | ТЬг |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| О1у | Азр | Ьеи | А1а | С1у | Тгр | 11е | 11е | Туг | А1а | Ьеи | О1у | Агд | Уа1 | О1и | Уа1 |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| ТЬг | А1а | Ьуз | Ьуз | Тгр | Туг | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Ьеи | ТЬг | 11е | Ьуз | О1у | Н1з | РЬе |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| А1а | Зег | О1у | МеЬ | Ьеи | Азп | Азр | Ьуз | Зег | Ьеи | Тгр | ТЬг | Азр | 11е | Рго | Уа1 |
625 630 635 640
- 19 030305
| Азп | РНе | Рго | Ьуз | Азп 645 | О1у | Тгр А1а А1а | 11е О1у ТНг Н1з 650 | Зег | РЬе 655 | О1и | |||||
| РНе | А1а | О1п | РЬе | Азр | Азп | РЬе | Ьеи | Уа1 | О1и | А1а | ТЬг | Агд | |||
| 660 | 665 | ||||||||||||||
| <210> I | 3 | ||||||||||||||
| <211> | 643 | ||||||||||||||
| <212> | РКТ | ||||||||||||||
| <213> Ното | зартепз | ||||||||||||||
| <400> I | 3 | ||||||||||||||
| Туг | Уа1 | Ьеи | Азр | Азр | Зег | Азр | О1у | Ьеи | О1у | Агд | О1и | РЬе | Азр | О1у | 11е |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| О1у | А1а | Уа1 | Зег | О1у | О1у | О1у | А1а | ТЬг | Зег | Агд | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Азп | Туг |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Рго | О1и | Рго | Туг | Агд | Зег | О1п | 11е | Ьеи | Азр | Туг | Ьеи | РЬе | Ьуз | Рго | Азп |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| РНе | О1у | А1а | Зег | Ьеи | Нчз | 11е | Ьеи | Ьуз | Уа1 | О1и | 11е | О1у | О1у | Азр | О1у |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| О1п | ТЬг | ТЬг | Азр | О1у | ТЬг | О1и | Рго | Зег | Н1з | МеЬ | Н1з | Туг | А1а | Ьеи | Азр |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| О1и | Азп | Туг | РЬе | Агд | О1у | Туг | О1и | Тгр | Тгр | Ьеи | МеЬ | Ьуз | О1и | А1а | Ьуз |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ьуз | Агд | Азп | Рго | Азп | 11е | ТЬг | Ьеи | 11е | О1у | Ьеи | Рго | Тгр | Зег | РЬе | Рго |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| О1у | Тгр | Ьеи | О1у | Ьуз | О1у | РЬе | Азр | Тгр | Рго | Туг | Уа1 | Азп | Ьеи | О1п | Ьеи |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| ТЬг | А1а | Туг | Туг | Уа1 | Уа1 | ТЬг | Тгр | 11е | Уа1 | О1у | А1а | Ьуз | Агд | Туг | Н1з |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Азр | Ьеи | Азр | 11е | Азр | Туг | 11е | О1у | 11е | Тгр | Азп | О1и | Агд | Зег | Туг | Азп |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Азп | Туг | 11е | Ьуз | 11е | Ьеи | Агд | Ьуз | МеЬ | Ьеи | Азп | Туг | О1п | О1у | Ьеи |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| О1п | Агд | Уа1 | Ьуз | 11е | 11е | А1а | Зег | Азр | Азп | Ьеи | Тгр | О1и | Зег | 11е | Зег |
| 180 | 185 | 190 |
- 20 030305
| А1а | Зег | МеЬ 195 | Ьеи | Ьеи | Азр | А1а | О1и 200 | Ьеи | РЬе | Ьуз | Уа1 | Уа1 205 | Азр | Уа1 | 11е |
| О1у | А1а | Ηΐ3 | Туг | Рго | О1у | ТЬг | Н1з | Зег | А1а | Ьуз | Азр | А1а | Ьуз | Ьеи | ТЬг |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| О1у | Ьуз | Ьуз | Ьеи | Тгр | Зег | Зег | О1и | Азр | РЬе | Зег | ТЬг | Ьеи | Азп | Зег | Азр |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| МеЬ | О1у | А1а | Азр | Суз | Тгр | О1у | Агд | 11е | Ьеи | Азп | О1п | Азп | Туг | 11е | Азп |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| О1у | Туг | МеЬ | ТЬг | Зег | ТЬг | 11е | А1а | Тгр | Азп | Ьеи | Уа1 | А1а | Зег | Туг | Туг |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| О1и | О1п | Ьеи | Рго | Туг | О1у | Агд | Суз | О1у | Ьеи | МеЬ | ТЬг | А1а | О1п | О1и | Рго |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Тгр | Зег | О1у | Н1з | Туг | Уа1 | Уа1 | О1и | Зег | Рго | Уа1 | Тгр | Уа1 | Зег | А1а | Н1з |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| ТЬг | ТЬг | О1п | РЬе | ТЬг | О1п | Рго | О1у | Тгр | Туг | Туг | Ьеи | Ьуз | ТЬг | Уа1 | О1у |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Ηΐ3 | Ьеи | О1и | Ьуз | О1у | О1у | Зег | Туг | Уа1 | А1а | Ьеи | ТЬг | Азр | О1у | Ьеи | О1у |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Азп | Ьеи | ТЬг | 11е | 11е | 11е | О1и | ТЬг | МеЬ | Зег | Н1з | Ьуз | Н1з | Зег | Ьуз | Суз |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| 11е | Агд | Рго | РЬе | Ьеи | Рго | Туг | РЬе | Азп | Уа1 | Зег | О1п | О1п | РЬе | А1а | ТЬг |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| РЬе | Уа1 | Ьеи | Ьуз | О1у | Зег | РЬе | Зег | О1и | 11е | Рго | О1и | Ьеи | О1п | Уа1 | Тгр |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Туг | ТЬг | Ьуз | Ьеи | О1у | Ьуз | ТЬг | Зег | О1и | Агд | РЬе | Ьеи | РЬе | Ьуз | О1п | Ьеи |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Азр | Зег | Ьеи | Тгр | Ьеи | Ьеи | Азр | Зег | Азр | О1у | Зег | РЬе | ТЬг | Ьеи | Зег | Ьеи |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Ηΐ3 | О1и | Азр | О1и | Ьеи | РЬе | ТЬг | Ьеи | ТЬг | ТЬг | Ьеи | ТЬг | ТЬг | О1у | Агд | Ьуз |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| О1у | Зег | Туг | Рго | Ьеи | Рго | Рго | Ьуз | Зег | О1п | Рго | РЬе | Рго | Зег | ТЬг | Туг |
- 21 030305
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Ьуз | Азр | Азр | РЬе | Азп | Уа1 | Азр | Туг | Рго | РЬе | РЬе | Зег | О1и | А1а | Рго | Азп |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| РЬе | А1а | Азр | О1п | ТЬг | О1у | Уа1 | РЬе | О1и | Туг | РЬе | ТЬг | Азп | 11е | О1и | Азр |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Рго | О1у | О1и | Н1з | Н1з | РЬе | ТЬг | Ьеи | Агд | О1п | Уа1 | Ьеи | Азп | О1п | Агд | Рго |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| 11е | ТЬг | Тгр | А1а | А1а | Азр | А1а | Зег | Азп | ТЬг | 11е | Зег | 11е | 11е | О1у | Азр |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Туг | Азп | Тгр | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг | ТЬг | Ьуз | Суз | Азр | Уа1 | Туг | 11е | О1и | ТЬг |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Рго | Азр | ТЬг | О1у | О1у | Уа1 | РЬе | 11е | А1а | О1у | Агд | Уа1 | Азп | Ьуз | О1у | О1у |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| 11е | Ьеи | 11е | Агд | Зег | А1а | Агд | О1у | 11е | РЬе | РЬе | Тгр | 11е | РЬе | А1а | Азп |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| О1у | Зег | Туг | Агд | Уа1 | ТЬг | О1у | Азр | Ьеи | А1а | О1у | Тгр | 11е | 11е | Туг | А1а |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Ьеи | О1у | Агд | Уа1 | О1и | Уа1 | ТЬг | А1а | Ьуз | Ьуз | Тгр | Туг | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Ьеи |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| ТЬг | 11е | Ьуз | О1у | Н1з | РЬе | А1а | Зег | О1у | Мер | Ьеи | Азп | Азр | Ьуз | Зег | Ьеи |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Тгр | ТЬг | Азр | 11е | Рго | Уа1 | Азп | РЬе | Рго | Ьуз | Азп | О1у | Тгр | А1а | А1а | 11е |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| О1у | ТЬг | Н1з | Зег | РЬе | О1и | РЬе | А1а | О1п | РЬе | Азр | Азп | РЬе | Ьеи | Уа1 | О1и |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| А1а | ТЬг | Агд |
<210> 4
<211> 669
<212> РКТ
<213> Ното зар1епз
<400> 4
Мер А1а А1а А1а А1а О1у Зег А1а О1у Агд А1а А1а Уа1 Рго Ьеи Ьеи
- 22 030305
1 5 10 15
| Ьей Суз | А1а | Ьей Ьей 20 | А1а | Рго О1у | О1у А1а 25 | Туг | Уа1 | Ьей | Азр 30 | Азр | Зег | ||||
| Азр | О1у | Ьей | О1у | Агд | О1и | РЬе | Азр | О1у | 11е | О1у | А1а | Уа1 | Зег | О1у | О1у |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| О1у | А1а | ТЬг | Зег | Агд | Ьей | Ьей | Уа1 | Азп | Туг | Рго | О1и | Рго | Туг | Агд | Зег |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| О1п | 11е | Ьей | Азр | Туг | Ьей | РЬе | Ьуз | Рго | Азп | РЬе | О1у | А1а | Зег | Ьей | Н1з |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| 11е | Ьей | Ьуз | Уа1 | О1и | 11е | О1у | О1у | Азр | О1у | О1п | ТЬг | ТЬг | Азр | О1у | ТЬг |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| О1и | Рго | Зег | Ηΐ3 | Ме£ | Н1з | Туг | А1а | Ьей | Азр | О1и | Азп | Туг | РЬе | Агд | О1у |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Туг | О1и | Тгр | Тгр | Ьей | Ме£ | Ьуз | О1и | А1а | Ьуз | Ьуз | Агд | Азп | Рго | Азп | 11е |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| ТЬг | Ьей | 11е | О1у | Ьей | Рго | Тгр | Зег | РЬе | Рго | О1у | Тгр | Ьей | О1у | Ьуз | О1у |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| РЬе | Азр | Тгр | Рго | Туг | Уа1 | Азп | Ьей | О1п | Ьей | ТЬг | А1а | Туг | Туг | Уа1 | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| ТЬг | Тгр | 11е | Уа1 | О1у | А1а | Ьуз | Агд | Туг | Н1з | Азр | Ьей | Азр | 11е | Азр | Туг |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| 11е | О1у | 11е | Тгр | Азп | О1и | Агд | Зег | Туг | Азп | А1а | Азп | Туг | 11е | Ьуз | 11е |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ьей | Агд | Ьуз | Ме£ | Ьей | Азп | Туг | О1п | О1у | Ьей | О1п | Агд | Уа1 | Ьуз | 11е | 11е |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| А1а | Зег | Азр | Азп | Ьей | Тгр | О1и | Зег | 11е | Зег | А1а | Зег | Ме£ | Ьей | Ьей | Азр |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| А1а | О1и | Ьей | РЬе | Ьуз | Уа1 | Уа1 | Азр | Уа1 | 11е | О1у | А1а | Н1з | Туг | Рго | О1у |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| ТЬг | Ηΐ3 | Зег | А1а | Ьуз | Азр | А1а | Ьуз | Ьей | ТЬг | О1у | Ьуз | Ьуз | Ьей | Тгр | Зег |
245 250 255
- 23 030305
| Зег | О1и | Азр | РЬе 260 | Зег | ТЬг | Ьеи | Азп | Зег 265 | Азр МеЬ | О1у | А1а | О1у 270 | Суз | Тгр | |
| О1у | Агд | 11е | Ьеи | Азп | О1п | Азп | Туг | 11е | Азп | О1у | Туг | МеЬ | ТЬг | Зег | ТЬг |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| 11е | А1а | Тгр | Азп | Ьеи | Уа1 | А1а | Зег | Туг | Туг | О1и | О1п | Ьеи | Рго | Туг | О1у |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Агд | Суз | О1у | Ьеи | МеЬ | ТЬг | А1а | О1п | О1и | Рго | Тгр | Зег | О1у | Н1з | Туг | Уа1 |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Уа1 | О1и | Зег | Рго | Уа1 | Тгр | Уа1 | Зег | А1а | Н1з | ТЬг | ТЬг | О1п | РЬе | ТЬг | О1п |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Рго | О1у | Тгр | Туг | Туг | Ьеи | Ьуз | ТЬг | Уа1 | О1у | Н1з | Ьеи | О1и | Ьуз | О1у | О1у |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Зег | Туг | Уа1 | А1а | Ьеи | ТЬг | Азр | О1у | Ьеи | О1у | Азп | Ьеи | ТЬг | 11е | 11е | 11е |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| О1и | ТЬг | МеЬ | Зег | Н1з | Ьуз | Н1з | Зег | Ьуз | Суз | 11е | Агд | Рго | РЬе | Ьеи | Рго |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Туг | РЬе | Азп | Уа1 | Зег | О1п | О1п | РЬе | А1а | ТЬг | РЬе | Уа1 | Ьеи | Ьуз | О1у | Зег |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| РЬе | Зег | О1и | 11е | Рго | О1и | Ьеи | О1п | Уа1 | Тгр | Туг | ТЬг | Ьуз | Ьеи | О1у | Ьуз |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | О1и | Агд | РЬе | Ьеи | РЬе | Ьуз | О1п | Ьеи | Азр | Зег | Ьеи | Тгр | Ьеи | Ьеи |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Азр | О1у | Зег | РЬе | ТЬг | Ьеи | Зег | Ьеи | Н1з | О1и | Азр | О1и | Ьеи | РЬе |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| ТЬг | Ьеи | ТЬг | ТЬг | Ьеи | ТЬг | ТЬг | О1у | Агд | Ьуз | О1у | Зег | Туг | Рго | Ьеи | Рго |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Рго | Ьуз | Зег | О1п | Рго | РЬе | Рго | Зег | ТЬг | Туг | Ьуз | Азр | Азр | РЬе | Азп | Уа1 |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Азр | Туг | Рго | РЬе | РЬе | Зег | О1и | А1а | Рго | Азп | РЬе | А1а | Азр | О1п | ТЬг | О1у |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Уа1 | РЬе | О1и | Туг | РЬе | ТЬг | Азп | 11е | О1и | Азр | Рго | О1у | О1и | Н1з | Нгз | РЬе |
| 500 | 505 | 510 |
- 24 030305
| ТЬг Ьеи | Агд 515 | О1п Уа1 | Ьеи Азп О1п 520 | Агд | Рго | 11е | ТЬг | Тгр 525 | А1а | А1а | Азр |
| А1а Зег | Азп | ТЬг 11е | Зег 11е 11е | О1у | Азр | Туг | Азп | Тгр | ТЬг | Азп | Ьеи |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||
| ТЬг 11е | Ьуз | Суз Азр | Уа1 Туг 11е | О1и | ТЬг | Рго | Азр | ТЬг | О1у | О1у | Уа1 |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||
| РЬе 11е | А1а | О1у Агд | Уа1 Азп Ьуз | О1у | О1у | 11е | Ьеи | 11е | Агд | Зег | А1а |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||
| Агд О1у | 11е | РЬе РЬе | Тгр 11е РЬе | А1а | Азп | О1у | Зег | Туг | Агд | Уа1 | ТЬг |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||
| О1у Азр | Ьеи | А1а О1у | Тгр 11е 11е | Туг | А1а | Ьеи | О1у | Агд | Уа1 | О1и | Уа1 |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||
| ТЬг А1а | Ьуз | Ьуз Тгр | Туг ТЬг Ьеи | ТЬг | Ьеи | ТЬг | 11е | Ьуз | О1у | Нчз | РЬе |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||
| А1а Зег | О1у | Меб Ьеи | Азп Азр Ьуз | Зег | Ьеи | Тгр | ТЬг | Азр | 11е | Рго | Уа1 |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||
| Азп РЬе | Рго | Ьуз Азп | О1у Тгр А1а | А1а | 11е | О1у | ТЬг | Нчз | Зег | РЬе | О1и |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||
| РЬе А1а | О1п | РЬе Азр | Азп РЬе Ьеи | Уа1 | О1и | А1а | ТЬг | Агд | |||
| 660 | 665 | ||||||||||
| <210> | 5 | ||||||||||
| <211> | 643 | ||||||||||
| <212> | РКТ | ||||||||||
| <213> | Ното | Зарчепз | |||||||||
| <400> | 5 | ||||||||||
| Туг Уа1 | Ьеи | Азр Азр | Зег Азр О1у | Ьеи | О1у | Агд | О1и | РЬе | Азр | О1у | 11е |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||
| О1у А1а | Уа1 | Зег О1у | О1у О1у А1а | ТЬг | Зег | Агд | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Азп | Туг |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||
| Рго О1и | Рго | Туг Агд | Зег О1п 11е | Ьеи | Азр | Туг | Ьеи | РЬе | Ьуз | Рго | Азп |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||
| РЬе О1у | А1а | Зег Ьеи | Нчз 11е Ьеи | Ьуз | Уа1 | О1и | 11е | О1у | О1у | Азр | О1у |
| 50 | 55 | 60 |
- 25 030305
| Ο1η ТЪг ТЪг Азр О1у ТЪг О1и | Рго | Зег | Н1з | МеЬ 75 | Н1з | Туг | А1а | Ьеи | Азр 80 | ||||||
| 65 | 70 | ||||||||||||||
| О1и | Азп | Туг | РЪе | Агд | О1у | Туг | О1и | Тгр | Тгр | Ьеи | МеЬ | Ьуз | О1и | А1а | Ьуз |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ьуз | Агд | Азп | Рго | Азп | 11е | ТЪг | Ьеи | 11е | О1у | Ьеи | Рго | Тгр | Зег | РЪе | Рго |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| О1у | Тгр | Ьеи | О1у | Ьуз | О1у | РЪе | Азр | Тгр | Рго | Туг | Уа1 | Азп | Ьеи | Ο1η | Ьеи |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| ТЪг | А1а | Туг | Туг | Уа1 | Уа1 | ТЪг | Тгр | 11е | Уа1 | О1у | А1а | Ьуз | Агд | Туг | Н1з |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Азр | Ьеи | Азр | 11е | Азр | Туг | 11е | О1у | 11е | Тгр | Азп | О1и | Агд | Зег | Туг | Азп |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Азп | Туг | 11е | Ьуз | 11е | Ьеи | Агд | Ьуз | МеЬ | Ьеи | Азп | Туг | Ο1η | О1у | Ьеи |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Ο1η | Агд | Уа1 | Ьуз | 11е | 11е | А1а | Зег | Азр | Азп | Ьеи | Тгр | О1и | Зег | 11е | Зег |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| А1а | Зег | МеЬ | Ьеи | Ьеи | Азр | А1а | О1и | Ьеи | РЪе | Ьуз | Уа1 | Уа1 | Азр | Уа1 | 11е |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| О1у | А1а | Н1з | Туг | Рго | О1у | ТЪг | Н1з | Зег | А1а | Ьуз | Азр | А1а | Ьуз | Ьеи | ТЪг |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| О1у | Ьуз | Ьуз | Ьеи | Тгр | Зег | Зег | О1и | Азр | РЪе | Зег | ТЪг | Ьеи | Азп | Зег | Азр |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| МеЬ | О1у | А1а | О1у | Суз | Тгр | О1у | Агд | 11е | Ьеи | Азп | Ο1η | Азп | Туг | 11е | Азп |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| О1у | Туг | МеЬ | ТЪг | Зег | ТЪг | 11е | А1а | Тгр | Азп | Ьеи | Уа1 | А1а | Зег | Туг | Туг |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| О1и | Ο1η | Ьеи | Рго | Туг | О1у | Агд | Суз | О1у | Ьеи | МеЬ | ТЪг | А1а | Ο1η | О1и | Рго |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Тгр | Зег | О1у | Н1з | Туг | Уа1 | Уа1 | О1и | Зег | Рго | Уа1 | Тгр | Уа1 | Зег | А1а | Н1з |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| ТЪг | ТЪг | Ο1η | РЪе | ТЪг | Ο1η | Рго | О1у | Тгр | Туг | Туг | Ьеи | Ьуз | ТЪг | Уа1 | О1у |
305 310 315 320
- 26 030305
| Ηΐ3 | Ьеи | О1и | Ьуз | О1у О1у 325 | Зег | Туг | Уа1 | А1а 330 | Ьеи | ТЬг | Азр | О1у | Ьеи 335 | О1у | |
| Азп | Ьеи | ТЬг | 11е | 11е | 11е | О1и | ТЬг | МеЬ | Зег | Н1з | Ьуз | Н1з | Зег | Ьуз | Суз |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| 11е | Агд | Рго | РЬе | Ьеи | Рго | Туг | РЬе | Азп | Уа1 | Зег | О1п | О1п | РЬе | А1а | ТЬг |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| РЬе | Уа1 | Ьеи | Ьуз | О1у | Зег | РЬе | Зег | О1и | 11е | Рго | О1и | Ьеи | О1п | Уа1 | Тгр |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Туг | ТЬг | Ьуз | Ьеи | О1у | Ьуз | ТЬг | Зег | О1и | Агд | РЬе | Ьеи | РЬе | Ьуз | О1п | Ьеи |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Азр | Зег | Ьеи | Тгр | Ьеи | Ьеи | Азр | Зег | Азр | О1у | Зег | РЬе | ТЬг | Ьеи | Зег | Ьеи |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Ηΐ3 | О1и | Азр | О1и | Ьеи | РЬе | ТЬг | Ьеи | ТЬг | ТЬг | Ьеи | ТЬг | ТЬг | О1у | Агд | Ьуз |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| О1у | Зег | Туг | Рго | Ьеи | Рго | Рго | Ьуз | Зег | О1п | Рго | РЬе | Рго | Зег | ТЬг | Туг |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Ьуз | Азр | Азр | РЬе | Азп | Уа1 | Азр | Туг | Рго | РЬе | РЬе | Зег | О1и | А1а | Рго | Азп |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| РЬе | А1а | Азр | О1п | ТЬг | О1у | Уа1 | РЬе | О1и | Туг | РЬе | ТЬг | Азп | 11е | О1и | Азр |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Рго | О1у | О1и | Н1з | Н1з | РЬе | ТЬг | Ьеи | Агд | О1п | Уа1 | Ьеи | Азп | О1п | Агд | Рго |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| 11е | ТЬг | Тгр | А1а | А1а | Азр | А1а | Зег | Азп | ТЬг | 11е | Зег | 11е | 11е | О1у | Азр |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Туг | Азп | Тгр | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг | 11е | Ьуз | Суз | Азр | Уа1 | Туг | 11е | О1и | ТЬг |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Рго | Азр | ТЬг | О1у | О1у | Уа1 | РЬе | 11е | А1а | О1у | Агд | Уа1 | Азп | Ьуз | О1у | О1у |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| 11е | Ьеи | 11е | Агд | Зег | А1а | Агд | О1у | 11е | РЬе | РЬе | Тгр | 11е | РЬе | А1а | Азп |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| О1у | Зег | Туг | Агд | Уа1 | ТЬг | О1у | Азр | Ьеи | А1а | О1у | Тгр | 11е | 11е | Туг | А1а |
- 27 030305
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Ьеи | О1у | Агд | Уа1 | О1и | Уа1 | ТЪг | А1а | Ьуз | Ьуз | Тгр | Туг | ТЪг | Ьеи | ТЪг | Ьеи |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| ТЪг | 11е | Ьуз | О1у | Н1з | РЪе | А1а | Зег | О1у | МеУ | Ьеи | Азп | Азр | Ьуз | Зег | Ьеи |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Тгр | ТЪг | Азр | 11е | Рго | Уа1 | Азп | РЪе | Рго | Ьуз | Азп | О1у | Тгр | А1а | А1а | 11е |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| О1у | ТЪг | Нтз | Зег | РЪе | О1и | РЪе | А1а | О1п | РЪе | Азр | Азп | РЪе | Ьеи | Уа1 | О1и |
| 625 | 630 | 635 | 640 |
А1а ТЪг Агд
<210> 6
<211> 179
<212> ДНК
<213> Ното зар1епз
<400> 6
адсУсддУас ссддддаУсс УУаУсадссд ссаУддсУдс ддссдсдддУ Усддсдддсс
дсдссдсддУ дсссУУдсУд сУдУдУдсдс УдсУддсдсс сддсддсдсд УасдУдсУсд
асдасУссда сдддсУдддс сдддадУУсд асддсаУсдд сдсддУсадс ддсддсддд
60
120
179
<210> 7
<211> 69
<212> ДНК
<213> Ното зар1епз
<400> 7
дсаассУссс дасУУсУадУ аааУУассса дадсссУаУс дУУсУсадаУ аУУддаУУаУ
сУсУУУаад
60
69
<210> 8
<211> 64
<212> ДНК
<213> Ното зар1епз
<400> 8
ссдааУУУУд дУдссУсУУУ дсаУаУУУУа ааадУддааа УаддУддУда Удддсадаса
асад
60
64
<210> 9
<211> 114
<212> ДНК
<213> Ното зартепз
- 28 030305
60
114
<400> 9
асддсаскда дсссксссас акдсаккакд саскадакда дааккакккс сдаддакасд
адкддкддкк дакдааадаа дскаадаада ддааксссаа каккасаскс аккд
<210> 10
<211> 140
<212> ДНК
<213> Ното зарчепз
<400> 10
ддккдссакд дксаккссск ддакддскдд дааааддккк сдаскддсск какдксаакс
кксадскдас кдсскаккак дксдкдасск ддаккдкддд сдссаадсдк кассакдакк
кддасаккда ккакаккдда
60
120
140
| <210> | 11 |
| <211> | 39 |
| <212> | ДНК |
| <213> | Ното зарчепз |
| <400> | 11 |
| акккддаакд ададдксака каакдссаак какаккаад |
39
| <210> <211> <212> <213> | 12 131 ДНК Ното | ' заргепз | ||||
| <400> | 12 | |||||
| акаккаадаа | ааакдскдаа | ккаксааддк | скссадсдад | кдааааксак | адсаадкдак | |
| аакскскддд | адкссакскс | кдсакссакд | скссккдакд | ссдааскскк | сааддкддкк |
дакдккакад д
60
120
131
<210> 13
<211> 156
<212> ДНК
<213> Ното зарчепз
<400> 13
ддсксаккак сскддаассс акксадсааа адакдсааад ккдаскддда адаадскккд
дксккскдаа даскккадса скккааакад кдасакдддк дсаддскдск ддддксдсак
кккаааксад ааккакакса акддскакак дасккс
<210> 14
<211> 125
<212> ДНК
<213> Ното зарчепз
<400> 14
сасааксдса кддаакккад кддскадкка скакдаасад ккдссккакд ддадакдсдд
дккдакдасд дсссаддадс сакддадкдд дсаскасдкд дкадаакскс скдкскдддк
60
120
156
60
120
- 29 030305
| аДсад | 125 | ||||||
| <210> | 15 | ||||||
| <211> | 128 | ||||||
| <212> | ДНК | ||||||
| <213> | Нотс | ' зар1епз | |||||
| <400> | 15 | ||||||
| сДсаДассас | ДсадДДДасД | саассДддсД | ддДаДДассД | даадасадДД | ддссаДДДад | 60 | |
| адаааддадд | аадсДасдДа | дсДсДдасДд | аДддсДДадд | даассДсасс | аДсаДсаДДд | 120 | |
| ааассаДд | 128 | ||||||
| <210> | 16 | ||||||
| <211> | 90 | ||||||
| <212> | ДНК | ||||||
| <213> | Нотс | ' зар1епз | |||||
| <400> | 16 | ||||||
| адДсаДааас | аДДсДаадДд | саДасддсса | ДДДсДДссДД | аДДДсааДдД | дДсасаасаа | 60 | |
| ДДДдссассД | ДДдДДсДДаа | дддаДсДДДД | 90 | ||||
| <210> | 17 | ||||||
| <211> | 87 | ||||||
| <212> | ДНК | ||||||
| <213> | Нотс | ' зар1епз | |||||
| <400> | 17 | ||||||
| адДдаааДас | сададсДаса | ддДаДддДаД | ассааасДДд | дааааасаДс | сдааадаДДД | 60 | |
| сДДДДДаадс | адсДддаДДс | ДсДаДдд | 87 | ||||
| <210> | 18 | ||||||
| <211> | 151 | ||||||
| <212> | ДНК | ||||||
| <213> | Ното | ' зар1епз | |||||
| <400> | 18 | ||||||
| сДссДДдаса | дсдаДддсад | ДДДсасасДд | адссДдсаДд | аадаДдадсД | дДДсасасДс | 60 | |
| ассасДсДса | ссасДддДсд | саааддсадс | ДасссдсДДс | сДссааааДс | ссадсссДДс | 120 | |
| ссаадДассД | аДааддаДда | ДДДсааДдДД | д | 151 | |||
| <210> | 19 | ||||||
| <211> | 181 | ||||||
| <212> | ДНК | ||||||
| <213> | Ното | ' зар1епз | |||||
| <400> | 19 | ||||||
| аДДасссаДД | ДДДДадДдаа | дсДссааасД | ДДдсДдаДса | аасДддДдДа | ДДДдааДаДД | 60 | |
| ДДасаааДаД | ДдаадасссД | ддсдадсаДс | асДДсасдсД | асдссаадДД | сДсаассада | 120 | |
| дасссаДДас | аДдддсДдсс | даДдсаДсса | асасааДсад | ДаДДаДадда | дасДасаасД | 180 |
- 30 030305
д 181
<210> 20
<211> 164
<212> ДНК
<213> Ното заряепз
<400> 20
| дассааЕсЕд асЕаЕааадЕ | дЕдаЕдЕаЕа | саЕададасс | ссЕдасасад | даддЕдЕдЕЕ | 60 |
| саЕЕдсадда ададЕаааЕа | ааддЕддЕаЕ | ЕЕЕдаЕЕада | адЕдссадад | дааЕЕЕЕсЕЕ | 120 |
| сЕддаЕЕЕЕЕ дсаааЕддаЕ | сЕЕасадддЕ | ЕасаддЕдаЕ | ЕЕад | 164 | |
| <210> 21 <211> 77 <212> ДНК <213> Ното заряепз | |||||
| <400> 21 сЕддаЕддаЕ ЕаЕаЕаЕдсЕ | ЕЕаддасдЕд | ЕЕдаадЕЕас | адсааааааа | ЕддЕаЕасас | 60 |
| ЕсасдЕЕаас ЕаЕЕаад | 77 | ||||
| <210> 22 <211> 181 <212> ДНК <213> Ното заряепз | |||||
| <400> 22 ддЕсаЕЕЕса ссЕсЕддсаЕ | дсЕдааЕдас | аадЕсЕсЕдЕ | ддасадасаЕ | сссЕдЕдааЕ | 60 |
| ЕЕЕссааада аЕддсЕдддс | ЕдсааЕЕдда | асЕсасЕссЕ | ЕЕдааЕЕЕдс | асадЕЕЕдас | 120 |
| аасЕЕЕсЕЕд Еддаадссас | асдсЕааЕас | ЕЕаасддддс | ссддааЕЕса | сдсдЕддЕас | 180 |
| с | 181 | ||||
| <210> 23 <211> 16922 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность | |||||
| <220> <223> гНСАЬС направленный вектор | |||||
| <220> <221> т1зс_ЕеаЕиге <222> (16899)..(16906 <223> п представляет | ) собой а, с, | д или Е | |||
| <400> 23 ЕЕсадаЕаЕс асЕадЕсссЕ | дЕЕЕсЕддад | ддаЕдсЕЕсЕ | сЕЕдасЕдад | даддсЕддса | 60 |
| ааЕсЕдсЕЕд ЕаЕсаадаад | адааассадс | адЕдЕЕдЕдд | ддасаддааа | ЕЕдсдсЕсдЕ | 120 |
| аЕЕЕЕдЕсаЕ аадссааЕда | ддаадсадсс | ЕЕЕЕааЕдад | ааддсЕЕасЕ | ЕЕдЕсЕдадЕ | 180 |
- 31 030305
| ЕсааддаЕсс | ЕЕсЕдЕасЕЕ | ЕЕаадсдаЕд | ЕЕЕдддЕсаЕ | ЕЕасЕдЕсаЕ | дЕдаЕЕЕЕса | 240 |
| ЕаасссаЕЕс | ЕЕЕЕЕдЕаЕс | ЕЕааЕЕаЕаа | аЕдааЕасЕЕ | аЕаЕдЕаЕдс | сЕаЕЕЕсаЕд | 300 |
| саЕаЕдЕаЕд | ЕдЕсЕдаЕдЕ | аЕдсасасаЕ | дЕдЕаЕдсад | сЕдЕдЕсасс | адЕаЕдсасЕ | 360 |
| сЕЕЕЕддааа | ссаддаассЕ | дЕссЕдЕЕЕд | ссЕЕЕсЕсЕд | ссЕЕаЕдссЕ | сЕдсасаддд | 420 |
| ссЕсЕЕасЕд | аЕссЕддаас | ЕддасЕддЕд | дсЕадсаадс | ЕссадЕдаЕс | ЕЕссЕдЕсЕс | 480 |
| адсЕЕдЕсса | сЕдЕдЕЕддд | дсЕсЕсадса | ЕссдсаЕЕад | ЕЕаЕдсаЕад | сЕЕЕЕаасЕЕ | 540 |
| дадсасЕадд | аЕсЕсадссс | аддЕссЕсаЕ | асЕдЕдсадс | аадсасЕсЕЕ | ссссадаЕЕЕ | 600 |
| ЕсаЕсЕсЕас | асссЕсЕдаа | ЕЕЕдаЕдсЕд | ЕЕсЕЕаасаЕ | ЕдсаассаЕЕ | сааЕссЕЕЕа | 660 |
| саЕсаЕсЕЕс | аЕссЕдЕЕсс | ЕдсаЕсЕдсс | дЕЕадаЕЕда | сЕдЕдсаддс | аЕсЕасасад | 720 |
| дЕссЕдасЕа | ЕЕссдЕддаа | аЕдадсаЕад | ссссаЕдЕаа | дададддсЕа | ЕаЕЕсдсЕда | 780 |
| сасссЕддаЕ | дссссадаад | сададдЕада | сддЕЕсЕада | ЕдсЕсаЕдаа | Едадасадда | 840 |
| ЕдадЕааЕсЕ | дддЕдЕдадд | аЕддададдс | ЕасЕдЕддас | сасЕдЕдддд | ЕдадсЕддЕЕ | 900 |
| саЕдаадааЕ | ааадсадаад | аддсадааЕд | ддаЕЕддЕда | ЕЕасЕдЕддЕ | ЕЕаасадсаа | 960 |
| аасЕаддсдд | ддаЕдЕдадЕ | аддЕсаадад | адссаасЕЕЕ | дддадаасЕЕ | ЕЕЕЕсЕдЕЕс | 1020 |
| ЕЕсЕддддаа | сЕааЕасдаЕ | ЕддаЕдЕаЕа | дЕаЕЕЕдаЕЕ | асадааЕсас | ЕЕЕсЕсЕЕсЕ | 1080 |
| адЕааЕссЕс | ЕдддааЕада | ааасадЕдаЕ | ЕссЕаааадс | адсЕдаЕддд | асЕддассад | 1140 |
| асаааЕадаЕ | ааЕсаЕдсаа | ЕдЕдааааЕд | ЕдЕЕЕаЕдад | ЕдсЕаЕадаЕ | ЕаЕЕаЕЕЕЕа | 1200 |
| ааасдсЕааЕ | дсадЕасЕЕЕ | аасааадЕаа | аасЕаЕаадЕ | адЕЕаааЕса | аадЕдаааЕЕ | 1260 |
| адЕЕЕсЕада | асаЕсссасЕ | ЕЕЕдадаааа | дЕЕадасаЕа | аЕЕЕЕЕааас | ЕдЕаЕЕссаа | 1320 |
| ЕааасЕЕЕда | ЕЕадаааЕЕа | аддсЕаддаЕ | аЕЕаЕЕЕЕаЕ | аадЕасдааа | ЕсааЕЕдада | 1380 |
| дЕддааааЕЕ | сЕаасЕЕааЕ | ЕЕЕаддсЕсЕ | асЕсаддаЕа | ЕдссаадЕсЕ | дЕдЕЕЕдЕад | 1440 |
| аЕддаааааа | ааадЕдсЕсЕ | ЕаЕдаЕаЕас | ЕЕдадасаЕЕ | ЕсЕЕсссдса | дЕЕаасЕдЕд | 1500 |
| дЕаЕадаада | ддааЕдЕааа | ддсЕЕЕЕдаа | ааЕЕссЕЕад | ЕаЕаЕсЕЕЕа | ЕдааЕсаЕаа | 1560 |
| аааЕаЕдссд | дсЕдЕддЕдд | сасасаЕсЕЕ | ЕааЕсссадс | аЕсЕдддадд | саддддсада | 1620 |
| ЕддаЕсЕсЕд | адЕЕсааддс | ЕадссЕддЕс | ЕаЕссадЕда | дЕЕссаддаЕ | адаЕададЕа | 1680 |
| сасЕсЕддсЕ | сааааасаад | саадсаадса | адсаадсаад | саадсааада | аасааасааа | 1740 |
| саадсадЕаа | сдаааааааа | дааЕдаЕааа | ааЕааЕдааЕ | ЕЕдЕдаадЕа | ЕЕсаадааЕЕ | 1800 |
| ЕдЕаааЕаас | аадЕадЕаас | ЕдааааЕсЕс | аддаЕаЕаЕЕ | дЕсаЕЕддда | ЕдаЕддаааа | 1860 |
| ЕЕааддЕааа | аЕдЕасааас | ааЕааЕдасс | ЕдаддсдЕЕа | дддсЕЕдддд | дЕддддддЕс | 1920 |
| сдсЕЕааЕас | адддЕЕЕссс | ЕЕдсаассаЕ | ддадаЕЕсда | дЕЕсдадсЕЕ | саддадсаад | 1980 |
| дЕссааасад | ЕсасдЕдЕдд | ЕддсаЕаЕда | ЕсаЕдаЕссЕ | аддссЕддда | аддсададдс | 2040 |
- 32 030305
| аддсаааскс | кдддккааад | ааадасккдк | скккадккка | даадааадаа | саааададаа | 2100 |
| кддкдаадсс | кдаддаасаа | дксссааддк | ддсссксадд | скддсасаса | сакскдсаса | 2160 |
| саксасксас | акасакасак | асадааасаа | дддааккааа | аакккдссаа | аакдаааака | 2220 |
| акаакккскд | кскдсксакд | асдасааксс | ссакдкскск | кккккдсккд | дккккдсаса | 2280 |
| кккдкскаас | кдккдкккск | аккксакддд | кадкксасда | кккдсасаак | акскаакккк | 2340 |
| асскадакад | ассакасккс | кскккккада | дааададкак | ккксасаксс | акаккааака | 2400 |
| кскакдсаск | ккасксккса | аасаскддад | дааааааааа | ааададдакд | кадккадада | 2460 |
| асакдадааа | касааасккк | дасккскдск | касадаадаа | ааааакдкка | дкдадсаааа | 2520 |
| аккдскксск | ксасасаадд | адасаскдас | ккккдкддак | кскдсакскк | дкккадккаа | 2580 |
| ааскдсаскд | дкдссакакк | каасссадкд | дсакккааак | даакадккдд | сдааакккса | 2640 |
| дадсссадад | асасддаддс | аккккдасаа | какаааддсс | аааксаакаа | асааккаккс | 2700 |
| адаасаккдд | скккакдддд | ксаддаккск | ккдссадкса | дккккскдак | сккскдадак | 2760 |
| сасадкдддс | асссаасаск | ддссададдс | адсдсасккд | ддсккаааас | дддааасддд | 2820 |
| дсааакдаак | дкддкссдкс | кддаккасад | сккскссакд | сддкадасад | сдкддкадкк | 2880 |
| аккскдскда | кдааддасак | кккссксскк | кскссккккк | аадскдсакс | асккдкскдд | 2940 |
| кдсааккксс | дадаккаааа | асадсддкса | аакадддсаа | ддксаадккс | кдасассскд | 3000 |
| дкакдсаккс | ксакккккак | ккскскккак | асакккаакк | адксакдккд | какккдкддс | 3060 |
| скдакдаааа | адддкксккд | дсадааадкд | ададкддаас | аддскакддд | кккадккккд | 3120 |
| ааададдкда | ссакдадсаа | кдддааддск | ддддккскдд | дскссдкдск | кддддааакс | 3180 |
| скдккдасак | ссаааккккд | акакаадааа | кксакааадд | аадддскккк | адааааккаа | 3240 |
| дкакдаадас | аакаакакад | ккккккакка | аккааакакд | дсдааддкаа | какскддддк | 3300 |
| каадкаааак | аааскаксаа | ддккаакдкк | скдссккдас | аккадкакдд | скаакадааа | 3360 |
| дкксдаакдс | кскскдкдкк | кддкдккскс | кскскдксдд | дсадсаккдк | дскддакдкк | 3420 |
| дааакааксд | ккскдккдаа | скдкдккдкд | дкккдаасаа | дааасдкккс | дсадаасскд | 3480 |
| кдкдкдааса | сккддккссс | аскддсадкд | скдкккдадд | ааддккдкад | аасссккаад | 3540 |
| ддссадкааа | аакдддссск | даккккдкса | кадкскдксс | ссасккскка | ксаскдкдкд | 3600 |
| ккксскдскк | дкддасасаа | ддкдассадд | сссакдасас | скдакдссск | дккакссскд | 3660 |
| скдкдакдка | ккааасдккд | кскксаасак | каддасааак | ааассскскс | ксссксаадк | 3720 |
| кдскксккдс | садккакккд | дккасадкда | садааааска | даааасаадд | дкааккааса | 3780 |
| каааскдкса | ккккскксад | сдскдскадд | адсксадкад | аскскаааак | кссксксккд | 3840 |
| асадккдака | ккдасадккд | аааддадаск | аадсакасдк | ссдскдсадс | акдддаскда | 3900 |
| аассксскдд | скккскакка | сккдаасааа | кскккдсадк | ааасаккаск | дасаааддад | 3960 |
- 33 030305
| сЁасаддсад | аддаддсадЁ | 555сасад5д | дадддаббдд | с5д5са5да5 | сасаббсдсс | 4020 |
| ааддас5а5а | 55садссддс | д55с555дс5 | дсааасааса | дааасбдбад | Ёсассбддсс | 4080 |
| сааааадЁда | 55дддааа5с | дд5садда5а | 5а5а5дд5сс | а5да5с5а5д | сададсссбд | 4140 |
| аддаЁдаддс | 55ададаааа | 5дд55адада | Ёададаасдд | аааассаддЁ | сассссассб | 4200 |
| ада5а55сад | д55адда5дд | сас5дс5дас | ссса55д5дс | 5ддсссс55д | аддасас555 | 4260 |
| адс5ддад5с | 5с5д5ддсас | 5сс5дддд55 | ссад5а5да5 | ада5сса55с | Ёсааасдбса | 4320 |
| с5с555саад | д5сааад5дс | адс55сдадд | адс5да55да | аддд5с5дд5 | 5ас5д5сада | 4380 |
| дсс5дсас5д | даадсаадаа | дадддааасЁ | с5дс5а5с55 | са55с5ддаа | ддсадбсдаа | 4440 |
| 55с5дсс5сс | саасасдс55 | адсасЁдддс | адсадбдаба | ддса5ада55 | абсабадаас | 4500 |
| саааасЁсад | адсаааасаа | дддс5дда5а | да5дсс5сад | Ёдддсааадд | 5дасса5са5 | 4560 |
| саадс55дс5 | дасссаад55 | 5ааассс5дд | дадссс5д5д | дбдддаддда | ассбсбдасс | 4620 |
| сса5д5д5д5 | дсад5д5сс5 | дадЁдсдсаа | ссссссааад | ааасааадаб | сбсабаааад | 4680 |
| дадаааааад | адааааадсс | 55аааасаад | аасдсааааа | саааадбдса | сбсадбссдс | 4740 |
| ас5с5ддаа5 | аааЁссааас | сааЁасаааа | д5адааа5с5 | а5555ссс5д | а555дс5дад | 4800 |
| абдбдддддд | ддддддддда | адд5асас5с | аааасасссЁ | а55да5ааа5 | 55д5ааа5са | 4860 |
| 555а5д5адс | а5дс5д5аа5 | дссасдддсЁ | да5сас5с55 | 55дадддс5д | 5д5даа5ас5 | 4920 |
| аас55дас5д | аа5с5сс5ас | 5дд5дсаа5д | с5ддса5сад | 555д5ададд | дддабасбса | 4980 |
| адЁссааадд | ддс5аад5дс | сд5а5сса5а | асс5а5асс5 | ад5адд55дд | аддададада | 5040 |
| 555даддсса | адс5д5с5дд | адасЁаадад | ссааса55д5 | 5ассасад55 | ад5са5ддс5 | 5100 |
| 55а5а5дса5 | д5ас5с55аа | ддааадсссс | дбааасаабд | 5асаа55сас | 5дааса5дд5 | 5160 |
| дда55с555с | с5с5даасса | 5555са55дс | 5а5с5аадда | 5а5дадд5аа | садаасбсба | 5220 |
| 55а5д5а55с | аааа55555а | 5555а555а5 | абдддбдЁаб | а5а5д5с5дд | 5а5ас555д5 | 5280 |
| асасссадЁд | сссаЁасадд | ссадаададд | д5дасада5с | сс55ддда55 | адддббасад | 5340 |
| а5дд55д5дс | 5ссасса5а5 | ддд5ас5дад | аа5сдаасс5 | ддд5са5с5д | даадад55д5 | 5400 |
| са55дс5с55 | аа5сс55а5с | 5с5дада55с | 5са55а5д5д | 5д5са5с5а5 | с5асс5д5с5 | 5460 |
| а5с5а5с5д5 | д5а5аа555д | 5аааа55а5а | 5а55ааса55 | а5а5а5аас5 | 5а5д5д5а5д | 5520 |
| аа5д555д5д | ад5дса55са | саса5д5д5д | ад5са5а5д5 | д5аа5а5а5д | 5аа5а5д555 | 5580 |
| а5а55асааа | 5д555а5д55 | а5д5дса5да | а5д5д5с5д5 | д5дад5д5д5 | дсасдсабаб | 5640 |
| 55д5с5дса5 | д555д5ада5 | ададдсадда | садссадасЁ | адддбдЁЬдд | с5дас5адд5 | 5700 |
| асаддаддад | 55ааадд5д5 | 55дс5да5дс | садас55дда | аадбасбддд | абссадасбс | 5760 |
| 5ад5дс5ссс | асс5с5дса5 | д5ад5дс5с5 | 5аассс5дад | ссабсбсасс | адссссабаа | 5820 |
- 34 030305
| ксасадаккс | кккддакдда | сдкксаккка | каадккдскд | ксадааасаа | сддсааксад | 5880 |
| асаасксдак | ссададккда | аадсксадак | дкасаадсад | акаккасадд | акдкскдкаа | 5940 |
| ададакаадс | ккксакаксс | ккккасаскс | кддддакасс | кассксааад | даакдккксс | 6000 |
| аасаскккка | дкдадкаакк | дккксакскк | акскссксак | дкдассадкд | асккккккка | 6060 |
| сдкксаадаа | ккакасаска | аскасдкдка | кдадккддас | аскдсккада | асакдсакдк | 6120 |
| асакакасас | кдкдакадаа | садакакдак | дддскддкак | даассккаак | садсаскккк | 6180 |
| дсккаааадд | саадаккдск | сакскккскс | ааддккдакк | ксксксккаа | сккасадааа | 6240 |
| ддадаадккк | кдаддаасак | ааакаддска | сксадаааса | сккскааккк | аааакддккк | 6300 |
| аааадаасас | акккдаааса | кдадасскдд | дасскксскс | ккскадкскк | акдксаксда | 6360 |
| ксскдааксс | акасакккаа | дадаасскак | даасаддакк | дсккскскда | кааскдкдак | 6420 |
| кксксккккк | сксасакаск | ддкдаакккк | сккккссадк | скдсакасак | даскккдскк | 6480 |
| аасаддаака | ккксккдккк | дккккссдад | какадаксад | аааксддааа | саададскдк | 6540 |
| дкдскккдак | ссакдааскд | кадкдскксс | адддкдддка | ксакккскдк | каакддкккс | 6600 |
| кдкаксскак | кскдкаккдк | ксасссаккд | сасаааакск | дсаассадкд | кдссааккад | 6660 |
| аадккддаак | ддсакдскас | адкакддсак | дкдскдкакд | ккддскксаа | аскксскдкк | 6720 |
| кксакдадкд | кддкакдкдк | кссаддкккд | акдададасс | скаасксааа | акадааддка | 6780 |
| аадададккк | дддааакдас | ксадксдака | адаасасаск | дсксаадсак | дддасакака | 6840 |
| асаддкддса | ддсааскдка | аксссадкдс | кксададддк | дааддадаса | дакадаккас | 6900 |
| кдсассккдс | кдкксадкда | даааксккдк | сксаадддаа | кааддкадаа | адкдакадад | 6960 |
| асадасассс | даддасскдс | кскддссккк | ккдаддаскс | акдкдсасак | скскааакак | 7020 |
| дкккдаакак | аааасасаса | сакксакаса | сакадасаса | саааккакдк | даададкккд | 7080 |
| аддаадссас | ккдскккдаа | ссаскддкск | асасасасас | асасасасас | асасасасас | 7140 |
| асасдаадаа | дааддаддад | даддадааад | аддаакдаас | асаддкакад | каккдсксад | 7200 |
| ааадасаакд | дкккдакккк | акссккксак | акаакккссс | акакккдкдк | ккдкддкддк | 7260 |
| каакскксак | каксаасккд | аскдааккка | дааксассас | аааасасасс | кскдддсдкд | 7320 |
| кскакдаадд | ксккссскда | аадасккакс | кдаададдда | адскдксака | адксскддак | 7380 |
| ддаасааааа | дааддаадка | ааскдаакдс | садсакдккс | ассксксккд | даккксскда | 7440 |
| скддадакдс | аасассасса | ддкдксксдд | ддкаскдскд | ксакдаскск | сскдссаадд | 7500 |
| аккдсассск | ссааскдкаа | дссаадасаа | асскккскдк | скккаадккс | кккадсасак | 7560 |
| адкасааккд | ккасадсасс | дадкаааадк | аскдаадаса | дкадксккда | аасасадакк | 7620 |
| каддкккдкс | кккааддддд | адсасааскк | аккссааада | кадккакдса | аадсскакда | 7680 |
| ксксккаадс | сссадддсск | дксскдкдкс | ккскссккдс | саскскддкд | ксксаддддс | 7740 |
- 35 030305
| ЕЕдддЕддда | аасЕсадсЕЕ | аЕЕдЕаЕдсЕ | ЕЕсЕасЕааа | дддддадада | дадададада | 7800 |
| дадададада | дадададада | дадададада | дадаЕЕдаЕЕ | ЕсЕасааааЕ | ЕаддддааЕс | 7860 |
| ЕаааЕЕсЕса | ддасадЕЕса | сЕЕЕссЕаЕс | асаЕсадЕсЕ | ЕасЕдасадЕ | ддааддЕадс | 7920 |
| ЕЕаЕдаЕЕдЕ | ЕЕсдаддаад | саЕааЕЕЕса | ссЕЕЕдЕсаЕ | ссЕЕдддЕсс | ЕаадааЕЕаа | 7980 |
| асЕдсЕдЕда | садасЕадаЕ | ддаЕдаадса | саЕаааЕЕЕа | адЕЕасаддд | сасаддддса | 8040 |
| ЕасссЕаада | ааЕЕдаадас | Ессссссссс | ааасааасаа | асааасааас | адЕЕааЕдаЕ | 8100 |
| ааасаЕдсЕд | ааЕсЕдаЕса | ддадсааЕЕЕ | аддЕЕдЕааа | аЕдЕдссадд | садададдса | 8160 |
| дададдсада | даддсаддса | дададасада | дадададдса | дададдсада | даддсадада | 8220 |
| ддсаддсада | даддсадада | ддсадададд | сададдсада | даддсадада | ддсадададд | 8280 |
| сададдсадд | садаасЕсЕс | ЕдадЕЕсаад | дЕдадасЕдд | ЕадаЕддаас | аадЕЕсЕаад | 8340 |
| аасасаадсЕ | дссадсаддс | асдЕссаасс | ЕЕЕЕсЕЕаЕс | сЕдасасЕаЕ | дЕЕдЕссдсЕ | 8400 |
| аЕадасЕЕса | сасЕЕдаддЕ | сЕдсасадЕЕ | дасЕаЕЕЕЕа | аЕсаЕааааа | дЕсасадааЕ | 8460 |
| дЕсЕЕдадЕЕ | аадЕЕЕаЕдЕ | асааЕЕЕЕдд | ддЕадддЕдс | ЕЕЕсаЕадса | аЕсаЕсЕдсЕ | 8520 |
| ссаЕдЕддЕс | Есаддсасад | дЕЕддаЕдса | ссЕдссаддд | ЕаЕЕЕаасЕд | ддЕададаад | 8580 |
| ЕдааЕаддаа | ддсаадддЕЕ | асЕдЕаасад | дадЕЕддсаа | асаЕЕассас | ЕЕссЕсЕаЕд | 8640 |
| ЕаадЕсаддд | саЕсЕЕЕсаЕ | аадЕдаЕЕЕЕ | саЕадЕсаЕЕ | ЕЕЕЕаЕЕсаа | дааасадааЕ | 8700 |
| аааддЕссда | дЕаЕЕсЕдаа | ссЕаЕЕдЕаЕ | ЕЕЕЕЕаддЕс | ЕсдсааЕЕса | ааЕЕасЕаЕа | 8760 |
| ЕадсаасаЕЕ | ЕЕддасдадЕ | ааЕсаЕаЕЕа | асЕсЕЕЕЕаа | ддсЕаааада | ссЕддаЕаЕа | 8820 |
| дсадасЕасЕ | сааЕсдааса | аасЕЕЕдЕса | дсЕадсаЕЕЕ | дсЕаадЕдЕа | ЕаЕаадЕдса | 8880 |
| сааЕЕаЕдас | ЕЕсссдадЕд | ссЕаЕЕаЕсЕ | ЕасЕЕЕЕаЕс | ЕЕаЕссддад | ЕЕсссЕдасЕ | 8940 |
| ЕдсЕдЕЕсЕд | дЕсЕсасддЕ | ддЕЕЕадааа | ааЕЕсадддЕ | ссЕсаадсса | адсдасЕсаа | 9000 |
| ссааддЕдас | сдсЕЕаасЕд | ддддсдсЕЕа | аадссаддЕс | сЕсаЕЕдсЕд | ЕЕЕссЕасЕд | 9060 |
| ддааЕдсЕсд | дсЕададЕад | дассасЕсаа | адсссЕсЕЕЕ | ЕдассдЕЕдЕ | ЕдассаЕЕса | 9120 |
| сЕЕсссдЕЕЕ | ЕсЕаадаЕда | ЕссаЕсаддЕ | даддЕаддаа | дадЕддЕсас | ЕаадЕааЕЕа | 9180 |
| сасдсадада | ссддЕсссдс | сЕсЕЕЕдаса | садаадЕдас | ааддсааадс | ЕсдсЕсаасс | 9240 |
| адссссссас | сссдсссссс | садсЕсааса | саасадсддс | Едсдсддаса | дсссдсадсс | 9300 |
| сЕсасЕЕаад | аЕддсдааад | сЕЕссЕсадс | сдсссдсЕсЕ | ЕсЕЕссЕсад | ддаддсдаЕс | 9360 |
| дддсссдссЕ | ссссдддсдс | сасадЕсдсд | Едасссдсас | ааЕддсЕдад | ЕддсЕасЕсЕ | 9420 |
| сддсЕЕссЕд | дсаасдссда | дсдааадсЕа | ЕдасЕдсддс | сдсдддЕЕсд | дсдддссдсд | 9480 |
| ссдсддЕдсс | сЕЕдсЕдсЕд | ЕдЕдсдсЕдс | Еддсдсссдд | сддсдсдЕас | дЕдсЕсдасд | 9540 |
| асЕссдасдд | дсЕдддссдд | дадЕЕсдасд | дсаЕсддсдс | ддЕсадсддс | ддсддддсаа | 9600 |
- 36 030305
| ссЕсссдасЕ | ЕсЕадЕаааЕ | Еасссададс | ссЕаЕсдЕЕс | ЕсадаЕаЕЕд | даЕЕаЕсЕсЕ | 9660 |
| ЕЕааддЕааЕ | даааасаЕаа | ЕЕаЕЕЕсаЕд | дЕассЕдЕда | ЕаЕЕЕЕадаа | аЕЕддаЕддЕ | 9720 |
| дааЕЕЕсасс | аЕадааЕЕЕа | ЕЕадссЕсас | ааЕЕсЕадЕЕ | ЕЕЕдаааааа | ЕддсасаЕЕа | 9780 |
| сЕЕЕЕддааЕ | аааЕЕдсЕаЕ | ЕЕдаадЕЕЕЕ | дсЕЕЕЕдЕЕЕ | ЕЕдсдЕсЕдЕ | аааассЕаад | 9840 |
| дсадЕааЕЕа | дЕааЕЕдЕсЕ | ЕдаадсЕЕса | ЕасааЕасаа | сасЕаЕдЕЕа | аЕасЕдЕЕас | 9900 |
| ЕЕсЕЕЕЕсас | адссдааЕЕЕ | ЕддЕдссЕсЕ | ЕЕдсаЕаЕЕЕ | ЕаааадЕдда | ааЕаддЕддЕ | 9960 |
| даЕдддсада | саасадасдд | сасЕдадссс | ЕсссасаЕдс | аЕЕаЕдсасЕ | адаЕдадааЕ | 10020 |
| ЕаЕЕЕссдад | даЕасдадЕд | дЕддЕЕдаЕд | ааадаадсЕа | адаададдаа | ЕсссааЕаЕЕ | 10080 |
| асасЕсаЕЕд | ддЕЕдссаЕд | дЕсаЕЕсссЕ | ддаЕддсЕдд | дааааддЕЕЕ | сдасЕддссЕ | 10140 |
| ЕаЕдЕсааЕс | ЕЕсадсЕдас | ЕдссЕаЕЕаЕ | дЕсдЕдассЕ | ддаЕЕдЕддд | сдссаадсдЕ | 10200 |
| ЕассаЕдаЕЕ | ЕддасаЕЕда | ЕЕаЕаЕЕдда | аЕЕЕддааЕд | ададдЕсаЕа | ЕааЕдссааЕ | 10260 |
| ЕаЕаЕЕаада | ЕаЕЕаадааа | ааЕдсЕдааЕ | ЕаЕсааддЕс | ЕссадсдадЕ | дааааЕсаЕа | 10320 |
| дсаадЕдаЕа | аЕсЕсЕддда | дЕссаЕсЕсЕ | дсаЕссаЕдс | ЕссЕЕдаЕдс | сдаасЕсЕЕс | 10380 |
| ааддЕддЕЕд | аЕдЕЕаЕадд | ддсЕсаЕЕаЕ | ссЕддаассс | аЕЕсадсааа | адаЕдсааад | 10440 |
| ЕЕдасЕддда | адаадсЕЕЕд | дЕсЕЕсЕдаа | дасЕЕЕадса | сЕЕЕаааЕад | ЕдасаЕдддЕ | 10500 |
| дсадасЕдсЕ | ддддЕсдсаЕ | ЕЕЕаааЕсад | ааЕЕаЕаЕса | аЕддсЕаЕаЕ | дасЕЕссаса | 10560 |
| аЕсдсаЕдда | аЕЕЕадЕддс | ЕадЕЕасЕаЕ | даасадЕЕдс | сЕЕаЕдддад | аЕдсдддЕЕд | 10620 |
| аЕдасддссс | аддадссаЕд | дадЕдддсас | ЕасдЕддЕад | ааЕсЕссЕдЕ | сЕдддЕаЕса | 10680 |
| дсЕсаЕасса | сЕсадЕЕЕас | ЕсаассЕддс | ЕддЕаЕЕасс | ЕдаадасадЕ | ЕддссаЕЕЕа | 10740 |
| дадаааддад | даадсЕасдЕ | адсЕсЕдасЕ | даЕддсЕЕад | ддаассЕсас | саЕсаЕсаЕЕ | 10800 |
| дааассаЕда | дЕсаЕаааса | ЕЕсЕаадЕдс | аЕасддссаЕ | ЕЕсЕЕссЕЕа | ЕЕЕсааЕдЕд | 10860 |
| ЕсасаасааЕ | ЕЕдссассЕЕ | ЕдЕЕсЕЕаад | ддаЕсЕЕЕЕа | дЕдаааЕасс | ададсЕасад | 10920 |
| дЕаЕддЕаЕа | ссааасЕЕдд | ааааасаЕсс | дааадаЕЕЕс | ЕЕЕЕЕаадса | дсЕддаЕЕсЕ | 10980 |
| сЕаЕддсЕсс | ЕЕдасадсда | ЕддсадЕЕЕс | асасЕдадсс | ЕдсаЕдаада | ЕдадсЕдЕЕс | 11040 |
| асасЕсасса | сЕсЕсассас | ЕддЕсдсааа | ддсадсЕасс | сдсЕЕссЕсс | ааааЕсссад | 11100 |
| сссЕЕсссаа | дЕассЕаЕаа | ддаЕдаЕЕЕс | ааЕдЕЕдаЕЕ | асссаЕЕЕЕЕ | ЕадЕдаадсЕ | 11160 |
| ссааасЕЕЕд | сЕдаЕсааас | ЕддЕдЕаЕЕЕ | дааЕаЕЕЕЕа | саааЕаЕЕда | адасссЕддс | 11220 |
| дадсаЕсасЕ | ЕсасдсЕасд | ссаадЕЕсЕс | аассададас | ссаЕЕасдЕд | ддсЕдссдаЕ | 11280 |
| дсаЕссааса | сааЕсадЕаЕ | ЕаЕаддадас | ЕасаасЕдда | ссааЕсЕдас | ЕасааадЕдЕ | 11340 |
| даЕдЕаЕаса | Еададасссс | Едасасадда | ддЕдЕдЕЕса | ЕЕдсаддаад | адЕаааЕааа | 11400 |
| ддЕддЕаЕЕЕ | ЕдаЕЕадаад | Едссададда | аЕЕЕЕсЕЕсЕ | ддаЕЕЕЕЕдс | аааЕддаЕсЕ | 11460 |
| ЕасадддЕЕа | саддЕдаЕЕЕ | адсЕддаЕдд | аЕЕаЕаЕаЕд | сЕЕЕаддасд | ЕдЕЕдаадЕЕ | 11520 |
- 37 030305
| асадсааааа | ааУддУаУас | асУсасдУУа | асУаУУаадд | дУсаУУУсас | сУсУддсаУд | 11580 |
| сУдааУдаса | адУсУсУдУд | дасадасаУс | ссУдУдааУУ | УУссааадаа | УддсУдддсУ | 11640 |
| дсааУУддаа | сУсасУссУУ | УдааУУУдса | садУУУдаса | асУУУсУУдУ | ддаадссаса | 11700 |
| сдсУааУсса | сасддддсдУ | саадасаУда | УУУддаУУУУ | сУаУУУУУда | УУУУддУУса | 11760 |
| дддсдааУУс | УдаУУУУдаУ | ддаУсУаУаУ | аУдадссУУУ | даддсУаасд | аУааУдадда | 11820 |
| дУаааУаддд | дасаУддУдс | аУУУУУдсУд | даУссУдУда | ааддУУУаУУ | УададссдаУ | 11880 |
| Уссададддд | аУдсаддУад | УсУУУдасас | УсУсУдУддУ | адсУсУсаад | дсссасддУУ | 11940 |
| дУУсадУссс | аУссУУсадд | ддУдсУУддд | сдддУУсУдс | ссУУдсадсс | УУсдсасУаа | 12000 |
| УассааддУа | дсУсаУУсса | саУУдУУУдУ | аааУдаУсдУ | дсаддсаасУ | ддддссасад | 12060 |
| аддадсУУУУ | дУдадссУад | ссасасдссУ | садУсааддс | УУссУУадаа | даУддУдаУд | 12120 |
| сУсаадддда | аасУдаУдад | сасУасадсд | адУасУУсас | УдУдсадУсд | УсУсУсссУс | 12180 |
| УсссУссаУс | УссссУсссс | УсасссаУдс | ссУссссссс | ссссссадда | УдаУасУУУУ | 12240 |
| ддадУУдУдУ | дадаУдаУдд | УдддаУдаУУ | УдасааУУас | сУсаУУааУа | аасУаасасУ | 12300 |
| даадссаУУУ | сУдсадУааУ | аааааасаас | садаУУаасУ | дддУУдУУУд | УасУУУУУаа | 12360 |
| сдаУсУУаса | УссаасУУУУ | адаУдУУаУс | асссУУаУаа | ссдссУУдад | сасаУУУссс | 12420 |
| ссаУаУаадс | УддУдссдУа | ддсдааУсУа | асУдсУУссс | УдУУсаУУУс | УУдУдссУУУ | 12480 |
| УдсадУдадУ | ссУсасаадд | ддсУсУдаас | дсадсссадс | ассддУдааУ | дссУУсаУсУ | 12540 |
| дУсааУдУдУ | ддсаддаддд | ассдссдадд | дУУУаасУад | сУсасадаУУ | УддаУсаУсУ | 12600 |
| ссУдаУдУУУ | УУддаУадаУ | дсасУУааУа | УаУУсссадд | дУУУадаУУУ | аааУдУУдсУ | 12660 |
| аадсаУдУУУ | сУсаУУадУа | УдаУУУаУдУ | аасаУУааУд | УаасУсУУад | ааасадасса | 12720 |
| дУУсУссаУд | УдддУааадУ | даасУсУдда | аУУсУУУаУа | аддаааасУУ | асУсаУУдас | 12780 |
| аУаасдсУдс | УссаУдддаа | УУддУадУдс | Уссадсдадд | садаадУаса | дУдаддУсУд | 12840 |
| УаУУасУУсс | даааасУУда | аассааддсУ | аааУдаУУУа | сУдУУУадаУ | УУУаааУУаУ | 12900 |
| УУУУдааааа | УаасаУасаа | дУдУааУУУа | УаУдУсУУаа | ааУаУУсУса | УУУУаадУдУ | 12960 |
| сУадУУУдУУ | УУааУааУУУ | УдУааасаУУ | сссУдУаасс | сасасУссаа | УдаадсУасУ | 13020 |
| дааУаУУУдс | аУсасУссад | ааадУУсУсУ | дсУаУассУд | УдсааУссаУ | УссдсУсасУ | 13080 |
| ссУааУУУса | адсаасадУд | аУдУсУсУдУ | УдссааааУа | УУдУУУдУУУ | УдааадсаУд | 13140 |
| даадУдасад | даУдсдсУдУ | ддасУсУУсУ | ддаУдУдУдУ | УУУссдУсад | сдддаУдсУд | 13200 |
| УаадаУУУдУ | ссадУдУдУа | аддУУУУдсс | ааадУддУас | асУдсУссУУ | аУУУсУдаад | 13260 |
| ддадсадсаУ | УдааУддаУд | сассассаУУ | ддУУУУссаУ | сУссУаУУУУ | УаУдадаУда | 13320 |
| ааааУаааад | УсаУсасадс | асУаасаУас | аааУсУУУда | дааУУУдсаУ | УУдУУсУУсУ | 13380 |
- 38 030305
| ддаЕЕааЕдд | дддадддддд | ададаЕЕасЕ | адсЕсЕддЕд | ЕЕаадаЕЕЕд | ЕЕЕаасЕЕса | 13440 |
| Еаадааассд | ссадсаЕЕсс | ЕсаадаЕддЕ | ссЕдсдаЕдЕ | ЕасасЕсдсс | ЕсадсдЕдас | 13500 |
| дЕсдаадЕЕс | сЕаЕЕссдаа | дЕЕссЕаЕЕс | ЕсЕадааадЕ | аЕаддаасЕЕ | сЕдЕдЕсадЕ | 13560 |
| ЕадддЕдЕдд | ааадЕсссса | ддсЕссссад | дсаддсадаа | дЕаЕдсааад | саЕдсаЕсЕс | 13620 |
| ааЕЕадЕсад | саассаддЕд | ЕддааадЕсс | ссаддсЕссс | садсаддсад | аадЕаЕдсаа | 13680 |
| адсаЕдсаЕс | ЕсааЕЕадЕс | адсаассаЕа | дЕсссдсссс | ЕаасЕссдсс | саЕсссдссс | 13740 |
| сЕаасЕссдс | ссадЕЕссдс | ссаЕЕсЕссд | ссссаЕддсЕ | дасЕааЕЕЕЕ | ЕЕЕЕаЕЕЕаЕ | 13800 |
| дсададдссд | аддссдссЕс | ЕдссЕсЕдад | сЕаЕЕссада | адЕадЕдадд | аддсЕЕЕЕЕЕ | 13860 |
| ддаддссЕад | дсЕЕЕЕдсаа | ааадсЕсссд | ддадсЕЕдЕа | ЕаЕссаЕЕЕЕ | сддаЕсЕдаЕ | 13920 |
| саададасад | даЕдаддаЕс | дЕЕЕсдсаЕд | аЕЕдаасаад | аЕддаЕЕдса | сдсаддЕЕсЕ | 13980 |
| ссддссдсЕЕ | дддЕддадад | дсЕаЕЕсддс | ЕаЕдасЕддд | сасаасадас | ааЕсддсЕдс | 14040 |
| ЕсЕдаЕдссд | ссдЕдЕЕссд | дсЕдЕсадсд | саддддсдсс | сддЕЕсЕЕЕЕ | ЕдЕсаадасс | 14100 |
| дассЕдЕссд | дЕдсссЕдаа | ЕдаасЕдсад | дасдаддсад | сдсддсЕаЕс | дЕддсЕддсс | 14160 |
| асдасдддсд | ЕЕссЕЕдсдс | адсЕдЕдсЕс | дасдЕЕдЕса | сЕдаадсддд | аадддасЕдд | 14220 |
| сЕдсЕаЕЕдд | дсдаадЕдсс | ддддсаддаЕ | сЕссЕдЕсаЕ | сЕсассЕЕдс | ЕссЕдссдад | 14280 |
| ааадЕаЕсса | ЕсаЕддсЕда | ЕдсааЕдсдд | сддсЕдсаЕа | сдсЕЕдаЕсс | ддсЕассЕдс | 14340 |
| ссаЕЕсдасс | ассаадсдаа | асаЕсдсаЕс | дадсдадсас | дЕасЕсддаЕ | ддаадссддЕ | 14400 |
| сЕЕдЕсдаЕс | аддаЕдаЕсЕ | ддасдаадад | саЕсаддддс | Есдсдссадс | сдаасЕдЕЕс | 14460 |
| дссаддсЕса | аддсдсдсаЕ | дсссдасддс | даддаЕсЕсд | ЕсдЕдассса | ЕддсдаЕдсс | 14520 |
| ЕдсЕЕдссда | аЕаЕсаЕддЕ | ддааааЕддс | сдсЕЕЕЕсЕд | даЕЕсаЕсда | сЕдЕддссдд | 14580 |
| сЕдддЕдЕдд | сддассдсЕа | ЕсаддасаЕа | дсдЕЕддсЕа | сссдЕдаЕаЕ | ЕдсЕдаадад | 14640 |
| сЕЕддсддсд | ааЕдддсЕда | ссдсЕЕссЕс | дЕдсЕЕЕасд | дЕаЕсдссдс | ЕсссдаЕЕсд | 14700 |
| садсдсаЕсд | ссЕЕсЕаЕсд | ссЕЕсЕЕдас | дадЕЕсЕЕсЕ | дадсдддасЕ | сЕддддЕЕсд | 14760 |
| аааЕдассда | ссаадсдасд | сссаассЕдс | саЕсасдада | ЕЕЕсдаЕЕсс | ассдссдссЕ | 14820 |
| ЕсЕаЕдааад | дЕЕдддсЕЕс | ддааЕсдЕЕЕ | Ессдддасдс | сддсЕддаЕд | аЕссЕссадс | 14880 |
| дсддддаЕсЕ | саЕдсЕддад | ЕЕсЕЕсдссс | ассссаасЕЕ | дЕЕЕаЕЕдса | дсЕЕаЕааЕд | 14940 |
| дЕЕасаааЕа | аадсааЕадс | аЕсасаааЕЕ | ЕсасаааЕаа | адсаЕЕЕЕЕЕ | ЕсасЕдсаЕЕ | 15000 |
| сЕадЕЕдЕдд | ЕЕЕдЕссааа | сЕсаЕсааЕд | ЕаЕсЕЕаЕда | адЕЕссЕаЕЕ | ссдаадЕЕсс | 15060 |
| ЕаЕЕсЕсЕад | ааадЕаЕадд | аасЕЕсасдс | дЕЕададссЕ | сЕдаЕдсЕдЕ | дсассдЕдЕс | 15120 |
| ЕддааЕадас | ЕдадаЕЕЕсЕ | дсасаЕасад | ЕЕаЕдЕсаЕс | ЕдЕддссасд | дЕдсЕЕЕддс | 15180 |
| ЕЕссЕЕссЕд | дсаЕдЕсЕдс | ЕЕЕддддсда | ддЕЕЕсЕдсс | ЕЕЕдЕдсЕдд | сЕдсаасЕЕЕ | 15240 |
| саддЕссаЕс | асЕдддаадЕ | аЕЕаадддЕд | ЕЕЕдсссЕса | сЕЕЕдЕЕсса | ЕсЕЕадддад | 15300 |
- 39 030305
| адЕдЕсЕЕЕс | сЕдЕЕадЕдЕ | ааЕаЕссЕад | сЕдасЕЕсЕЕ | ЕЕсссЕсЕЕс | ссЕЕЕсЕЕЕа | 15360 |
| сЕаЕсЕЕЕад | аЕдссадЕЕЕ | ЕсЕдадаЕЕЕ | ЕЕЕааааааЕ | аЕаадЕадда | аЕЕадаЕЕЕд | 15420 |
| ЕЕаааЕассс | адЕЕЕдаЕда | даЕааЕЕдЕа | ЕдЕЕЕаЕсЕд | ЕЕЕаЕдЕаЕа | ЕаЕЕЕЕасЕс | 15480 |
| ЕЕаЕсЕдЕЕа | ЕдсЕдЕаЕаЕ | ЕдсаЕЕдЕсЕ | ааЕдЕссада | ЕаЕЕааасаЕ | сЕсЕдсдЕЕс | 15540 |
| сЕЕадаЕаЕд | ЕсаЕдсЕдаа | сддддЕЕссс | сасссЕдЕсЕ | сЕасаЕЕддс | ддаЕсЕсадЕ | 15600 |
| ЕасаадсаЕЕ | ддааЕааддд | ЕаЕЕЕдсаЕс | ЕаЕасссаЕд | ЕдсадЕаЕЕд | сссЕдЕЕЕЕЕ | 15660 |
| аааааЕЕаЕа | ЕсЕЕЕдЕсЕд | дЕЕЕсадсЕа | дадЕддЕссс | ЕЕсЕааааЕЕ | аасЕдддада | 15720 |
| ЕддЕсЕсЕсЕ | ЕссЕЕдЕЕЕЕ | ЕЕЕЕЕЕсссс | сааЕасЕЕЕд | ЕдадаЕЕсЕЕ | аааЕсЕЕада | 15780 |
| аЕЕЕЕсЕсад | ЕсадддЕсса | дасдааадас | адаадасада | аассасасса | даааадсааа | 15840 |
| асаасаасаа | саасаасааа | аЕЕаааасаа | аааЕаасаса | ааддаЕдаЕа | асЕадссада | 15900 |
| ЕдадаЕааас | ЕасЕаадааЕ | ЕаааадааЕЕ | сЕааЕддасЕ | ЕсаадааЕсс | ассаддссЕд | 15960 |
| ЕсасадасЕд | ссЕдсааЕсс | саасасссад | даддсЕдадс | дЕдааЕЕааа | ддасассЕдЕ | 16020 |
| дсЕдсасадЕ | дааасасЕдс | ЕЕсаЕЕЕсса | сссаадсаЕс | адЕададасс | адсЕасдЕсс | 16080 |
| ЕЕддсЕдсад | ЕадссЕасса | адсасасадс | ададдссЕЕЕ | сЕсасаддсЕ | даЕдсЕЕддс | 16140 |
| ЕсЕсссддаа | дсЕддЕЕЕаа | сЕЕсадсссЕ | дааддЕсЕдс | аадЕЕЕссЕд | адсЕдсаЕас | 16200 |
| ЕддадсЕддс | аассаддааа | ссЕдсЕЕЕсЕ | ддаЕсддаса | саадасЕдас | ааадддссаа | 16260 |
| аЕасЕЕаааа | ЕсЕсЕдасдЕ | дЕдЕаасасс | дасадЕЕсдЕ | аддсасадаЕ | сааасЕЕдаа | 16320 |
| адддадЕаад | ЕЕЕаЕЕсЕдд | адсаааасаЕ | дадЕдасЕсд | адсссаддаа | сасадасЕЕа | 16380 |
| ддЕсаЕссса | аасдсаЕдсЕ | ЕсЕсЕдЕддЕ | адсаЕЕЕЕса | дддаддЕсЕЕ | ададЕаасаа | 16440 |
| аасаасадаа | дссаЕсааЕс | ааЕдЕасЕЕЕ | ЕааадаЕдаа | ЕсдаЕадсаЕ | ЕадЕадаЕдд | 16500 |
| дЕаасадсаа | ддддсЕдддЕ | дсадЕЕЕсса | дсЕаЕдддЕс | ЕсадсЕдаЕЕ | сЕЕддЕЕЕдд | 16560 |
| ддЕсадЕдда | адссаддддс | сЕдЕЕсаЕас | ааЕсЕсаааа | дддЕЕЕЕаЕЕ | ЕдадддЕсас | 16620 |
| аддаЕдЕЕаа | ддЕсаЕдсад | адЕЕдЕсааЕ | садЕЕааадд | дЕааадаЕад | сссаадаЕад | 16680 |
| ЕЕЕддЕЕсЕа | дассЕдаааЕ | аЕЕссадсЕс | ЕдсаЕадЕЕа | садаааЕЕсЕ | ааЕсадссаа | 16740 |
| ЕсадссЕЕдд | адааЕсЕаЕЕ | асаЕадаЕдс | ЕаЕЕаЕЕсЕд | ддааЕсадЕЕ | сЕааЕаЕсЕс | 16800 |
| аЕааааааЕЕ | сЕдаЕаасЕЕ | сЕсаадаааа | ЕсЕсЕсЕЕдд | даадЕссаса | сссаЕЕЕЕЕд | 16860 |
| дЕдЕдЕаЕЕс | ЕЕаЕЕЕЕссс | аадаЕсЕЕсЕ | садЕсдаспп | ппппппЕсдс | дадаЕаЕсЕЕ | 16920 |
| са | 16922 | |||||
| <210> 24 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность |
- 40 030305
<220>
<223> олигонуклеотид 2282_45
<400> 24
дсабддаадб дасаддабдс 20
<210> 25
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид 2282_46
<400> 25
аабабсссад абсдсббсад д 21
<210> 26
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид 1260_1
<400> 26
дадасбсбдд сбасбсабсс 20
<210> 27
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид 1260_2
<400> 27
ссббсадсаа дадсбдддда с 21
<210> 28
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид 2283_48
<400> 28
сдбсбдсбдс адбсаадбдд 20
<210> 29
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид 2283_46
- 41 030305
<400> 29
ааДаДсссад аДсдсДДсад д 21
<210> 30
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид 1307_1
<400> 30
ддсадаадса сдсДДаДсд 19
<210> 31
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотид 1307_2
<400> 31
дасаадсдДД адДаддсаса Д 21
Claims (14)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Плюрипотентная или тотипотентная мышиная клетка для создания мыши, представляющей собой модель глобоидно-клеточной лейкодистрофии, содержащая по меньшей мере одну экзогенную нуклеотидную конструкцию, кодирующую человеческую галактоцереброзид-З-галактозидазу (ОАЬС), аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности ЗЕЦ ГО N0: 3 и в которой аминокислота, соответствующая глицину в положении 270 человеческой ОАЬС, заменена на аспарагиновую кислоту и аминокислота, соответствующая изолейцину в положении 546 человеческой ОАЬС, заменена на треонин.
- 2. Клетка по п.1, где аминокислотная последовательность указанной человеческой галактоцереброзид-З-галактозидазы по меньшей мере на 99% идентична последовательности ЗЕЦ ГО N0: 3.
- 3. Клетка по любому из пп.1, 2, где указанная человеческая галактоцереброзид-З-галактозидаза имеет аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 3.
- 4. Клетка по любому из пп.1-3, где указанная конструкция встроена в геном указанной мышиной клетки.
- 5. Клетка по п.4, где указанная конструкция нарушает эндогенную аллель галактоцереброзид-Згалактозидазы указанной мышиной клетки.
- 6. Клетка по любому из пп.1-5, которая является гетерозиготной по указанной конструкции.
- 7. Клетка по любому из пп.1-5, которая является гомозиготной по указанной конструкции.
- 8. Способ создания генетически модифицированной мыши, включающий следующие стадии:(а) получение плюрипотентной или тотипотентной мышиной клетки по любому из пп.1-7;(б) введение указанной плюрипотентной или тотипотентной мышиной клетки в выделенные бластоцисты указанной мыши;(в) имплантация указанных бластоцист, содержащих указанную плюрипотентную или тотипотентную мышиную клетку, псевдобеременной самке указанной мыши;(г) определение трансмиссии зародышевой линии у потомства беременной самки со стадии (в).
- 9. Дефицитная по галактоцереброзид-З-галактозидазе (ОАЬС) генетически модифицированная мышь, представляющая собой модель глобоидно-клеточной лейкодистрофии, содержащая по меньшей мере одну экзогенную нуклеотидную конструкцию, кодирующую человеческую галактоцереброзид-Згалактозидазу (ОАЬС), аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности ЗЕЦ ГО N0: 3 и в которой аминокислота, соответствующая глицину в положении 270 человеческой ОАЬС, заменена на аспарагиновую кислоту и аминокислота, соответствующая изолейцину в положении 546 человеческой ОАЬС, заменена на треонин.
- 10. Генетически модифицированная мышь по п.9, где аминокислотная последовательность указан- 42 030305ной человеческой галактоцереброзид-З-галактозидазы по меньшей мере на 99% идентична последовательности ЗГС) ΙΌ ΝΟ: 3.
- 11. Генетически модифицированная мышь по любому из пп.9, 10, где указанная галактоцереброзидβ-галактозидаза имеет аминокислотную последовательность ЗГС) ГО ΝΟ: 3.
- 12. Применение генетически модифицированной мыши по любому из пп.9-11 для скрининга или оценки агента, пригодного в качестве лекарственного средства для лечения и/или предупреждения глобоидно-клеточной лейкодистрофии.
- 13. Способ оценки агента на пригодность в качестве лекарственного средства для лечения и/или предупреждения глобоидно-клеточной лейкодистрофии, включающий следующие стадии:(а) приведение генетически модифицированной мыши по любому из пп.9-11 в контакт с оцениваемым агентом;(б) определение реакции указанной мыши на указанный агент после указанного контакта,где указанный агент оценивают на основании реакции указанной мыши, включающей определение:(1) накопления психозина в центральной нервной системе и в периферической нервной системе;(2) какого-либо влияния на двигательные функции;(3) исчезновения глобоидных клеток.
- 14. Способ по п.13, где указанный агент представляет собой выделенную рекомбинантную человеческую галактоцереброзид-З-галактозидазу (САБС).ПЦР амплификация
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA201270467 | 2012-08-07 | ||
| PCT/DK2013/050260 WO2014023314A1 (en) | 2012-08-07 | 2013-08-07 | Animal model of krabbe's disease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201590232A1 EA201590232A1 (ru) | 2015-07-30 |
| EA030305B1 true EA030305B1 (ru) | 2018-07-31 |
Family
ID=48985927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201590232A EA030305B1 (ru) | 2012-08-07 | 2013-08-07 | Животная модель болезни краббе |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9986722B2 (ru) |
| EP (1) | EP2882284B1 (ru) |
| CN (1) | CN104735976B (ru) |
| EA (1) | EA030305B1 (ru) |
| HK (1) | HK1211790A1 (ru) |
| WO (1) | WO2014023314A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020505317A (ja) * | 2017-01-20 | 2020-02-20 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | 臍帯血移植（ｕｃｂｔ）および増加したガラクトセレブロシダーゼの発現によるクラッベ病の処置 |
| JP2022525848A (ja) * | 2019-02-26 | 2022-05-20 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | クラッベ病の治療に有用な組成物 |
| US20230310652A1 (en) | 2020-05-22 | 2023-10-05 | Neuway Pharma Gmbh | Vlp for the treatment of leukodystrophies |
| CN113265461B (zh) * | 2021-07-02 | 2022-05-13 | 北京华诺奥美医学检验实验室有限公司 | 一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011163651A2 (en) * | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR CNS DELIVERY OF β-GALACTOCEREBROSIDASE |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01149718A (ja) * | 1987-12-07 | 1989-06-12 | Yoshikatsu Eto | 脳血液関門を通過し易いリポゾーム製剤 |
| AU2001271656A1 (en) * | 2000-06-29 | 2002-01-14 | Deltagen, Inc. | Transgenic mice containing targeted gene disruptions |
| GB0718824D0 (en) * | 2007-09-26 | 2007-11-07 | Univ Ramot | Methods of treating lysosomal storage disorders |
-
2013
- 2013-08-07 EP EP13749977.8A patent/EP2882284B1/en active Active
- 2013-08-07 CN CN201380042380.9A patent/CN104735976B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-08-07 WO PCT/DK2013/050260 patent/WO2014023314A1/en active Application Filing
- 2013-08-07 EA EA201590232A patent/EA030305B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-08-07 US US14/418,038 patent/US9986722B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-12-23 HK HK15112630.4A patent/HK1211790A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011163651A2 (en) * | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR CNS DELIVERY OF β-GALACTOCEREBROSIDASE |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| A. MALANDRINI; C. D’ERAMO; S. PALMERI; C. GAUDIANO; S. GAMBELLI; F. SICURELLI; G. BERTI; P. FORMICHI; A. KUQO; M. T. DOTTI; A. FED: "Peripheral neuropathy in late-onset Krabbe disease: report of three cases", NEUROLOGICAL SCIENCES ; OFFICIAL JOURNAL OF THE ITALIAN NEUROLOGICAL SOCIETY, SPRINGER-VERLAG, MI, vol. 34, no. 1, 25 January 2012 (2012-01-25), Mi, pages 79 - 83, XP035167927, ISSN: 1590-3478, DOI: 10.1007/s10072-012-0956-6 * |
| FURUYA, H. ; KUKITA, Y. ; NAGANO, S. ; HAYASHI, K. ; KOBAYASHI, T.: "4-13-02 Adult onset globoid cell leukodystrophy (Krabbe disease): Analysis of galactosylceramidase cDNA from four Japanese patients", JOURNAL OF NEUROLOGICAL SCIENCES., ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHING CO, AMSTERDAM., NL, vol. 150, 1 September 1997 (1997-09-01), NL, pages S228, XP027387102, ISSN: 0022-510X * |
| GUSTAVO MAEGAWA, JAMESON RIBBENS, CASSANDRA OBIE, HIROKAZU FURUYA, NORIO SAKAI: "A proposed cell-based high-throughput screening assay to identify potential small molecules agents for treatment of Krabbe disease", MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM, ACADEMIC PRESS, vol. 102, no. 2, 1 February 2011 (2011-02-01), pages S27 - S28, XP055083255, ISSN: 10967192, DOI: 10.1016/j.ymgme.2010.11.092 * |
| LEPAGE DAVID F; CONLON RONALD A: "Animal models for disease: knockout, knock-in, and conditional mutant mice", METHODS IN MOLECULAR MEDICINE, HUMANA PRESS, vol. 129, 1 January 2006 (2006-01-01), pages 41 - 67, XP009165396, ISSN: 1543-1894 * |
| PAOLA LUZI, RAFI MOHAMMAD A., ZAKA MARIAM, CURTIS MARK, VANIER MARIE T., WENGER DAVID A.: "Generation of a Mouse with Low Galactocerebrosidase Activity by Gene Targeting: A New Model of Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease)", MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM, ACADEMIC PRESS, vol. 73, no. 3, 1 July 2001 (2001-07-01), pages 211 - 223, XP055083225, ISSN: 10967192, DOI: 10.1006/mgme.2001.3194 * |
| R DE GASPERI, FRIEDRICH V L, PEREZ G M, SENTURK E, WEN P H, KELLEY K, ELDER G A, GAMA SOSA M A: "Transgenic rescue of Krabbe disease in the twitcher mouse", GENE THERAPY, MACMILLAN PRESS LTD., vol. 11, no. 15, 1 August 2004 (2004-08-01), pages 1188 - 1194, XP055083206, ISSN: 09697128, DOI: 10.1038/sj.gt.3302282 * |
| WENGER DAVID A ET AL: "Krabbe disease: Genetic aspects and progress toward therapy", MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM, ACADEMIC PRESS, AMSTERDAM, NL, vol. 70, no. 1, 1 May 2000 (2000-05-01), AMSTERDAM, NL, pages 1 - 9, XP002464426, ISSN: 1096-7192, DOI: 10.1006/mgme.2000.2990 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2882284B1 (en) | 2017-11-15 |
| EP2882284A1 (en) | 2015-06-17 |
| US9986722B2 (en) | 2018-06-05 |
| HK1211790A1 (en) | 2016-06-03 |
| CN104735976B (zh) | 2017-03-01 |
| US20150196014A1 (en) | 2015-07-16 |
| CN104735976A (zh) | 2015-06-24 |
| EA201590232A1 (ru) | 2015-07-30 |
| WO2014023314A1 (en) | 2014-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200370054A1 (en) | Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a c9orf72 locus | |
| CN109072218B (zh) | 基因修饰非人生物、卵细胞、受精卵以及目的基因的修饰方法 | |
| Sodhi et al. | Generation of mice harbouring a conditional loss-of-function allele of Gata6 | |
| CN106163273B (zh) | 具有人源化FC-γ受体的非人动物 | |
| US20220136002A1 (en) | Transgenic mouse models supporting innate immune function | |
| EA030305B1 (ru) | Животная модель болезни краббе | |
| Yong et al. | Embryonic lethality in homozygous human Her-2 transgenic mice due to disruption of the Pds5b gene | |
| JP2024500103A (ja) | ヒトａｐｐまたはヒト化ａｐｐと変異型ヒトｐｓｅｎ１とを発現する遺伝子改変免疫不全マウス | |
| CN113105555B (zh) | Mhc分子人源化的非人动物的构建方法及应用 | |
| CN112779284B (zh) | Thpo基因人源化的非人动物的构建方法及应用 | |
| US11432537B2 (en) | Method for producing blood chimeric animal | |
| JP5939487B2 (ja) | Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス | |
| Orzechowski et al. | Neurotoxic effects of ivermectin administration in genetically engineered mice with targeted insertion of the mutated canine ABCB1 gene | |
| FR2822161A1 (fr) | Cellule et animal transgenique modelisant les reponses humaines allergiques mediees par les ige, et leurs utilisations | |
| JP4590629B2 (ja) | Ｐｓｆ１遺伝子欠損動物およびその利用方法 | |
| US9592306B2 (en) | Mitochondrial-nuclear exchanged cells, tissues, organs and animals | |
| CN114747541A (zh) | 一种psgl-1人源化非人类动物模型的构建方法及应用 | |
| JP2004154135A (ja) | ノックアウト非ヒト動物 | |
| Aryal | Exploring Adipose Biology in Zebrafish | |
| JPH1132627A (ja) | Ｓｅｚ−６遺伝子発現が抑制された哺乳動物 | |
| JP2003092956A (ja) | チミジンホスホリラーゼ発現不全動物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |