EA029946B1 - СОЛИ СОЕДИНЕНИЯ БЕНЗОТИАЗОЛОНА В КАЧЕСТВЕ АГОНИСТОВ β-2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к кристаллической форме ацетатной соли (R)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[d]тиазол-2(3H)-она, фармацевтическим композициям на его основе, способам лечения или профилактики мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении, а также применению упомянутого выше соединения в получении лекарственного средства.

Description

изобретение относится к кристаллической форме ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[й]тиазол-2(3Н)-она, фармацевтическим композициям на его основе, способам лечения или профилактики мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении, а также применению упомянутого выше соединения в получении лекарственного средства.

029946 Β1

029946

Настоящее изобретение относится к кристаллической форме ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она, ее медицинскому применению в качестве агониста β-2-адренорецепторов и к лекарственным средствам, фармацевтическим композициям и комбинациям, содержащим ее.

Соединения бензотиазолона, которые являются агонистами β-2-адренорецепторов, описаны в \УО 2004/16601 и \УО 2006/056471. В \УО 2005/110990 также описаны бензоконденсированные гетероциклы в качестве β-2 агонистов.

Тогда как β-2-агонисты давно известны в отношении бронходилатирующих свойств, они также известны в отношении способности вызывать гипертрофию скелетных мышц.

Множество исследований направлены на терапевтические применения анаболических свойств β-2агонистов в отношении облегчения мышечной атрофии и улучшения функции мышц. Однако указанный класс соединений также ассоциирован с нежелательными побочными эффектами, включая повышенный риск нежелательных сердечно-сосудистых эффектов. Следовательно, применение β-2-агонистов при заболеваниях с атрофией мышц пока было ограничено гипертрофией сердца и потенциально вредными воздействиями на сердечно-сосудистую функцию.

Существует необходимость в обеспечении новых β-2-агонистов, которые являются хорошими лекарственными средствами-кандидатами. В частности, новый β-2-агонист должен эффективно связываться с β-2-адренорецептором, при этом проявляя небольшое сродство к другим рецепторам, таким как, например, β-1-адренорецептор, а-1А-адренорецептор или 5НТ_2С рецептор, и проявлять функциональную активность в качестве агониста. Он должен быть метаболически стабильным и обладать благоприятными фармакокинетическими свойствами. Он должен быть нетоксичным и демонстрировать немного побочных эффектов, в частности меньше кардиальных побочных эффектов, чем известные на рынке β-2агонисты, такие как, например, формотерол. Более того, идеальное лекарственное средство-кандидат должно существовать в физической форме, которая является стабильной, негигроскопичной и легко составляемой.

Соединение по изобретению представляет собой селективный β-2-агонист. В частности, он проявляет повышенное сродство к β-2-адренорецептору, которое превосходит его сродство к β-1адренорецептору или а-1А-адренорецептору по сравнению с известными β-2-агонистами, такими как формотерол. Неожиданно оно также проявляет более низкое сродство к рецепторам серотонина (5НТ_2С) и более низкую функциональную эффективность в 5НТ2С-экспрессирующих клетках, чем его рацемат или его соответствующий энантиомер, показывая, что он не влияет на двигательную активность и потребление пищи, что может вызывать снижение массы тела, потенциально противодействуя гипертрофии скелетных мышц, индуцированной β-2-агонистами. Отрицательные эффекты агонистов рецепторов 5НТ_2С на потребление энергии и массу тела описаны 1. НаЛогб и 1. Нагго1б в НапбЬ Ехр РЬагшасо1. 2012; (209) 349-56.

Соединение по настоящему изобретению является, следовательно, потенциально применимым в лечении широкого диапазона заболеваний, особенно в лечении или профилактике заболеваний с атрофией мышц, таких как мышечная дистрофия, атрофия от бездействия, кахексия или саркопения.

Лечение кахексии также является предполагаемым применением. Все формы кахексии являются потенциально поддающимися лечению с помощью соединений по настоящему изобретению, включая, например, раковую кахексию.

В первом аспекте изобретения, следовательно, обеспечивают кристаллическую форму ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она.

Далее представлены варианты осуществления изобретения.

Вариант осуществления 1.

Соединение по первому аспекту изобретения.

Вариант осуществления 2.

Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении, содержащая терапевтически эффективное количество соединения согласно варианту осуществления 1 и один или более фармацевтически приемлемых носителей.

Вариант осуществления 3.

Комбинация для лечения или профилактики мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении, содержащая терапевтически эффективное количество соединения согласно варианту осуществления 1 и одно или более терапевтически активных соагентов, выбранных из группы содержащей тестостерон, агонисты андрогенов, селективные модуляторы рецепторов андрогенов, ЮР-1 миметики, блокаторы миостатина и его рецептора Ас®ИА/В, блокаторы ΤΟΡβ и активина, ингибиторы лигазы МиН/МАРЬх Е3, ингибиторы НОАС. онколитические средства, НПВС, блокаторы ΤΝΡ или 1Ь-1Ь, агонисты РРАК, миметики 1Б-15; блокаторы Ь(1) (например, небивалол), АКВ, антисмысловые олигонуклеотиды для пропуска экзонов для дистрофии, грелин, прогестин или антагонисты МС-4 и пищевые добавки с высоким содержанием белка.

- 1 029946

Вариант осуществления 4.

Способ лечения или профилактики мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения согласно варианту осуществления 1 пациенту, нуждающемуся в этом.

Вариант осуществления 5.

Применение кристаллической формы ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она для лечения или профилактики мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении.

Вариант осуществления 6.

Применение соединения согласно варианту осуществления 1 в получении лекарственного средства для лечения или профилактики мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано увеличение скелетно-мышечной массы и массы сердца у крыс, которым вводили формотерол, по сравнению с соединением А (соединение по изобретению) - (значения представлены как среднее ± δΕΜ (п=5-6); совокупность скелетных мышц (икроножная-камбаловидная-большеберцовая) нормализована по исходной массе тела; масса сердца нормализована по массе головного мозга.

На фиг. 2а показано увеличение частоты сокращений выделенных синоатриальных узлов кроликов при использовании формотерола по сравнению с соединением А (соединение по изобретению).

На фиг. 2Ь показано увеличение активности искусственного водителя ритма в выделенных сердцах кролика при использовании формотерола по сравнению с соединением А (соединение по изобретению).

На фиг. 3 а и 3Ь показано изменение частоты сердечных сокращений у крыс после п/к болюсной инъекции соединения А (соединение по изобретению) или формотерола соответственно.

На фиг. 3 с сравнивают средние изменения частоты сердечных сокращений у крыс при введении формотерола по сравнению с соединением А (соединение по изобретению).

На фиг. 4а и 4Ь показаны изменения частоты сердечных сокращений у макак резус при болюсной п/к инъекции соединения А (соединение по изобретению) или формотерола соответственно.

На фиг. 5 показана порошковая рентгеновская диффрактограмма кристаллического свободного основания соединения А (соединение по изобретению).

На фиг. 6 показана порошковая рентгеновская диффрактограмма кристаллической ацетатной соли соединения А (соединение по изобретению).

На фиг. 7 показана порошковая рентгеновская диффрактограмма кристаллической гликолятной соли соединения А (соединение по изобретению).

Как используется в настоящем описании, абсолютную стереохимию устанавливают в соответствии с системой Кана-Ингольда-Прелога К-δ. Когда соединение является чистым энантиомером, стереохимия на каждом хиральном углероде может быть установлена или К, или δ. Разделенные соединения, чья абсолютная конфигурация неизвестна, могут быть обозначены как (+) или (-) в зависимости от направления (право- или левовращающие), в котором они вращают плоскость поляризующего света при длине волны Ό линии натрия. Любой асимметричный атом (например, углерод или подобные) соединения может присутствовать в рацемически или энантиомерно обогащенной, например (К)-, (δ)- или (К,8)-конфигурации. Рацемическую смесь стереоизомеров 50:50 обозначают как (Κ,δ), и энантиомерно обогащенные формы по энантиомерному избытку от (К) до (δ), соответственно, или от (δ) до (К) формам. Энантиомерный избыток представлен обычно уравнением ее=((т1-т2)/(т1+т2))-100%, где т1 и т2 представляют собой массу соответствующих энантиомерных форм К и δ.

Соединение по настоящему изобретению содержит один асимметричный центр, который определяют в отношении абсолютной стереохимии как (К).

В определенном варианте осуществления изобретения асимметричный атом имеет по меньшей мере 95, 98 или 99% энантиомерного избытка в (К)-конфигурации.

Следовательно, в одном варианте осуществления изобретения обеспечивают ацетатную соль (К)-7(2-( 1 -(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1 -гидроксиэтил)-5-гидроксибензо [б]тиазол-2(3Н)-она по меньшей мере в 95% энантиомерном избытке.

В другом варианте осуществления изобретения обеспечивают ацетатную соль (К)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она по меньшей мере в 98% энантиомерном избытке.

В еще одном варианте осуществления изобретения обеспечивают ацетатную соль (К)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она по меньшей мере в 99% энантиомерном избытке.

В одном варианте осуществления изобретения обеспечивают фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и один или более фармацевтически приемлемых носителей, где ацетатная соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2- 2 029946

иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она присутствует по меньшей мере в 95% энантиомерном избытке.

В другом варианте осуществления изобретения обеспечивают фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и один или более фармацевтически приемлемых носителей, где ацетатная соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она присутствует по меньшей мере в 98% энантиомерном избытке.

В еще одном варианте осуществления изобретения обеспечивают фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и один или более фармацевтически приемлемых носителей, где ацетатная соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она присутствует по меньшей мере в 99% энантиомерном избытке.

Изобретение относится к (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-ону в форме ацетатной соли.

Обеспечивают (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-он в форме гликолятной соли.

Соединение по настоящему изобретению, включая его соли, гидраты и сольваты, может по своей природе или путем модификаций образовывать полиморфы.

Обеспечивают ацетатную соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она в кристаллической форме.

Наличие примесей реакции и/или производственных примесей может быть определено аналитическими методиками, известными в области техники, такими как, например, хроматография, ядерная магнитно-резонансная спектроскопия, масс-спектрометрия или инфракрасная спектроскопия.

В другом аспекте изобретение относится к кристаллической форме ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она, которая имеет порошковую рентгеновскую дифрактограмму по меньшей мере с одним, двумя или тремя пиками, имеющими значения угла рефракции 2 тета (θ), выбранные из 8,8, 11,5, 16,4, 17,6, 18,2, 19,6, 20,1, 20,8 и 21,1° при измерении с использованием излучения СиК_а, в частности, где указанные значения составляют плюс или минус 0,2° 2θ.

В одном варианте осуществления изобретение относится к кристаллической форме ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол2(3Н)-она, которая имеет порошковую рентгеновскую дифрактограмму с пиком значений угла рефракции 2θ 8,8° при измерении с использованием излучения СиК_а, в частности, где указанное значение составляет плюс или минус 0,2° 2θ.

В одном варианте осуществления изобретение относится к кристаллической форме ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол2(3Н)-она, которая имеет порошковую рентгеновскую дифрактограмму с пиком при значениях угла рефракции 2θ 16,4° при измерении с использованием излучения СиК_а, в частности, где указанное значение составляет плюс или минус 0,2° 2θ.

В одном варианте осуществления изобретение относится к кристаллической форме ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол2(3Н)-она, которая имеет порошковую рентгеновскую дифрактограмму с пиком при значении угла рефракции 2θ 20,8° при измерении с использованием излучения СиК_а, в частности, где указанное значение составляет плюс или минус 0,2° 2θ.

В одном варианте осуществления изобретение относится к кристаллической форме ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол2(3Н)-она, которая имеет порошковую рентгеновскую дифрактограмму, показанную на фиг. 6, при измерении с использованием излучения СиК_а. Для подробностей см. пример 6.

Термин "по существу такая же" со ссылкой на положения пиков порошковой рентгеновской дифрактограммы обозначает, что принимают во внимание типичное положение пика и вариабельность интенсивности. Например, специалист в данной области техники понимает, что положения пиков (2θ) показывают некоторую вариабельность приборов, обычно такую как 0,2°. Кроме того, специалист в данной области техники понимает, что относительные интенсивности пиков показывают вариабельность от прибора к прибору, а также вариабельность из-за степени кристалличности, предпочтительной ориентации, поверхности полученного образца и других факторов, известных специалисту в данной области техники, и должны приниматься только как качественные показатели.

Специалист в данной области техники также понимает, что порошковая рентгеновская дифрактограмма может быть получена с ошибкой измерения, которая зависит от используемых условий измерения. В частности, известно, что интенсивность в порошковой рентгеновской дифрактограмме может ко- 3 029946

лебаться в зависимости от используемых условий измерения. Дополнительно необходимо понимать, что относительная интенсивность может также варьироваться в зависимости от условии эксперимента, и, соответственно, точный порядок интенсивности не нужно принимать во внимание. Кроме того, ошибка измерения угла дифракции для обычной порошковой рентгеновской дифрактограммы обычно составляет примерно 5% или менее, и такую степень ошибки измерения необходимо принимать во внимание в отношении вышеупомянутых углов дифракции. Следовательно, необходимо понимать, что кристаллические формы по настоящему описанию не ограничены кристаллической формой, которая обеспечивает порошковую рентгеновскую дифрактограмму, полностью идентичную такой порошковой рентгеновской дифрактограмме, которая изображена на сопутствующей фиг. 6, описанной в настоящем описании. Любые кристаллические формы, которые обеспечивают порошковые рентгеновские дифрактограммы, по существу, идентичные таким, которые описаны на сопутствующей фиг. 6, попадают в рамки объема настоящего раскрытия. Способность уточнить значительную идентичность порошковых рентгеновских дифрактограмм находится в компетенции обычного специалиста в данной области техники.

Формула, данная в настоящем описании, также предназначена представлять немеченые формы, а также формы соединения, меченные изотопами. Соединения по изобретению, меченные изотопами, имеют структуру, изображенную формулой, данной в настоящем описании, за исключением того, что один или более атомов заменены атомом, имеющим выбранную атомную массу или массовое число. Примеры изотопов, которые могут быть введены в соединение по изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, такие как Н, Н, С, С, С, Ν, Ρ, Р, ³²Р, ³⁵8, ³⁶С1, ¹²⁵1 соответственно. Изобретение включает различные соединения, меченные изотопами, как определено в настоящем описании, например, такие, в которые введены радиоактивные изотопы, такие как ³Н и ¹⁴С, или такие, в которых присутствуют нерадиоактивные изотопы, такие как ²Н и ¹³С. Такие соединения, меченные изотопами, являются применимыми в метаболических исследованиях (с ¹⁴С), исследованиях кинетики реакции (с, например, ²Н или ³Н), методиках определения или визуализации, таких как позитронно-эмиссионная томография (РЕТ) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (8РЕСТ), включая исследования распределения лекарственного средства или субстрата в тканях или при лучевом лечении пациентов. В частности, ¹⁸Ρ или меченое соединение могут быть особенно предпочтительны для исследований РЕТ или 8РЕСТ. Соединения формулы (I), меченные изотопами, могут, как правило, быть получены обычными методиками, известными специалисту в области техники, или способами, аналогичными описанным в сопутствующих примерах с использованием соответствующих реагентов, меченных изотопами, вместо немеченых реагентов, используемых ранее.

Кроме того, замена более тяжелыми изотопами, особенно дейтерием (т.е. ²Н или И), может давать определенные терапевтические преимущества в результате большей метаболической стабильности, например увеличение периода полужизни ίη νίνο или снижение дозировки или улучшение терапевтического индекса. Понимают, что дейтерий в таком контексте расценивается как заместитель соединения формулы (I). Концентрация такого более тяжелого изотопа, в частности дейтерия, может быть определена по фактору обогащения изотопом. Термин "фактор обогащения изотопом", как используется в настоящем описании, обозначает соотношение между распространенностью изотопа и естественной распространенностью конкретного изотопа. Если заместителем в соединении по настоящему изобретению указан дейтерий, такое соединение имеет фактор изотопного обогащения для каждого обозначенного атома дейтерия по меньшей мере 3500 (52,5% включения дейтерия на каждом обозначенном атоме дейтерия), по меньшей мере 4000 (60% включения дейтерия), по меньшей мере 4500 (67,5% включения дейтерия), по меньшей мере 5000 (75% включения дейтерия), по меньшей мере 5500 (82,5% включения дейтерия), по меньшей мере 6000 (90% включения дейтерия), по меньшей мере 6333,3 (95% включения дейтерия), по меньшей мере 6466,7 (97% включения дейтерия), по меньшей мере 6600 (99% включения дейтерия) или по меньшей мере 6633,3 (99,5% включения дейтерия).

Как используется в настоящем описании, термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические средства, средства, замедляющие абсорбцию, соли, консерванты, стабилизаторы лекарственных средств, связующие вещества, эксципиенты, дезинтегрирующие вещества, смазывающие средства, подсластители, ароматизаторы, красители и т.п. и их комбинации, как понимает специалист в данной области (см., например, РетищЮп! РЬагтасеи11са1 8с1епсе8, 181Н Еб. Маек Рг1п11пд Сотрапу, 1990, рр. 1289-1329). Кроме случаев, когда любой обычный носитель является несовместимым с активным ингредиентом, предусматривается его применение в терапевтических или фармацевтических композициях.

Термин "терапевтически эффективное количество" соединения по настоящему изобретению относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое вызывает у пациента биологический или медицинский ответ, например, снижение или подавление активности фермента или белка, или облегчает симптомы, облегчает состояния, замедляет или откладывает прогрессирование заболевания или предотвращает заболевание и т.д. В одном неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении пациенту является эффективным, по меньшей мере частичного, для облегче- 4 029946

ния, ингибирования, предотвращения и/или улучшения состояния, или расстройства, или заболевания, ассоциированного с активностью β-2-адренорецептора, или увеличения или обеспечения активности β-2адренорецептора.

В другом неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении в клетку, или ткань, или неклеточный биологический материал, или среду является эффективным по меньшей мере для частичного увеличения или обеспечения активности β-2-адренорецептора. Значение термина "терапевтически эффективное количество", как проиллюстрировано в вышеуказанном варианте осуществления для β-2-адренорецептора, также имеет то же значение относительно любых других белков/пептидов/ферментов, таких как ЮР-1 миметики или блокаторы ЛсШПВ/миостатина и т.п.

Как используется в настоящем описании, термин "пациент" относится к животному. Обычно животным является млекопитающее. Пациент также относится, например, к приматам (например, людям, мужчинам или женщинам), коровам, овцам, козам, лошадям, собакам, кошкам, кроликам, крысам, мышам, рыбам, птицам и т.п. В определенных вариантах осуществления пациентом является примат. В еще одном варианте осуществления пациентом является человек.

Как используется в настоящем описании, термин "ингибирует", "ингибирование" или "ингибируя" относится к снижению или подавлению заданного состояния, симптома или расстройства, или заболевания, или достоверному снижению исходного уровня биологической активности или процесса.

Как используется в настоящем описании, термин "лечить", "подвергаемый лечению" или "лечение" любого заболевания или расстройства относится в одном варианте осуществления к облегчению заболевания или расстройства (т.е. замедлению, или остановке, или уменьшению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления "лечить", "подвергаемый лечению" или "лечение" относится к облегчению или улучшению по меньшей мере одного физического параметра, включая такие, которые могут не ощущаться пациентом. В еще одном варианте осуществления "лечить", "подвергаемый лечению" или "лечение" относятся к модуляции заболевания или расстройства либо физически (например, стабилизация определенного симптома), либо физиологически (например, стабилизация физического параметра), или к тому и к другому. В еще одном варианте осуществления "лечить", "подвергаемый лечению" или "лечение" относятся к предотвращению или отсрочке начала или развития или прогрессирования заболевания или расстройства.

Как используется в настоящем описании, пациент "нуждается в" лечении, если такой пациент в результате такого проведенного лечения получит пользу биологически, с медицинской точки зрения, или в отношении качества жизни.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую соединение по настоящему изобретению в форме ацетатной соли и фармацевтически приемлемый носитель. В частности, описание относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество кристаллической формы ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и один или более фармацевтически приемлемых носителей.

Фармацевтическая композиция может быть составлена для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, чрескожное введение, парентеральное введение, ректальное введение, подкожное введение и др. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены в твердой форме (включая без ограничения капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или суппозитории), или в жидкой форме (включая без ограничения растворы, суспензии или эмульсии). Фармацевтические композиции могут быть подвергнуты обычным фармацевтическим действиям, таким как стерилизация, и/или могут содержать обычные инертные разбавители, смазывающие средства или буферы, а также адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажняющие средства, эмульгаторы и буферы и др.

Обычно фармацевтические композиции представляют собой таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент вместе с

a) разбавителями, например лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином;

b) смазывающими средствами, например диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее солью магния или кальция и/или полиэтиленгликолем; для таблеток также

c) связующими средствами, например алюмосиликатом магния, пастой крахмала, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, карбоксиметилцеллюлозой натрия и/или поливинилпирролидоном; если требуется

б) дезинтегрирующими средствами, например крахмалами, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью, или шипучими смесями; и/или

е) абсорбентами, красителями, ароматизаторами и подсластителями.

Таблетки могут быть или покрыты пленочным покрытием, или покрыты кишечно-растворимым покрытием в соответствии с методами, известными в области техники.

- 5 029946

Подходящие композиции для перорального введения включают эффективное количество соединения по изобретению в форме таблеток, пастилок, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул или сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, получают в соответствии с любым методом, известным в области техники для получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или более средств, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов, с целью обеспечения фармацевтически привлекательных и приятных на вкус препаратов. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые являются подходящими для производства таблеток. Такие эксципиенты представляют собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие средства, например кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие средства, например крахмал, желатин или аравийская камедь; и смазывающие средства, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки не имеют покрытия или обеспечиваются покрытием с помощью известных методик для замедления разложения и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечения пролонгированного действия в течение более длительного периода. Например, могут быть использованы материалы для отсрочки времени, такие как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Составы для перорального применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешивают с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешивают с водной или масляной средой, например арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

Соединение по изобретению можно вводить перорально доклиническим видам в виде жидкой лекарственной формы с лекарственным средством в растворе или в суспензионном носителе. Носителирастворители могут состоять из поверхностно-активного вещества (например, кремофора или солютола), растворителя (например, пропиленгликоля) и буферного средства (например, цитратного буфера). Составы суспензий могут содержать поверхностно-активное вещество (например, Т\\геп 80), полимерное средство (например, метилцеллюлозу (МЦ)) и буферное средство (например, фосфат).

Примеры составов растворов, подходящих для доклинических исследований, представлены ниже.

Ингредиент (% масс/масс)	Раствор 1	Раствор 2
Кремофор НН40	10	-
Солютол Н515	-	10
Цитратный буфер 50 мМ, рН 3	90	90

Получение: ацетатную соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она) сначала растворяют в поверхностно-активном веществе и перемешивают до получения раствора. Затем добавляют буфер и раствор перемешивают для обеспечения прозрачного раствора. Составы растворов 1 и 2 способны поддерживать дозу вплоть до 10 мг/мл. Оба состава являются химически и физически стабильными после 1 недели при к.т.

Примеры составов суспензий, подходящих для доклинических исследований, представлены ниже.

Ингредиент (% масс/масс)	Суспензия 1	Суспензия 2
0,5% МЦ в 50 мМ рН 6,8 фосфатного буфера	100	99, 5
Тмееп 80	-	0,5

Получение: ацетатную соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она) диспергируют в поверхностно-активном веществе и смешивают для гомогенизации суспензии. Затем по каплям добавляют полимерный раствор и перемешивают. Гомогенную суспензию получают с мелкими частицами. Суспензия является химически и физически стабильной после 1 недели при к.т.

Определенными инъекционными композициями являются водные изотонические растворы или суспензии, и суппозитории преимущественно получают из жирных эмульсий или суспензий. Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или содержать адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, увлажняющие или эмульгирующие средства, стимуляторы растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они также могут содержать другие терапевтически важные вещества. Указанные композиции получают в соответствии с обычными методиками смешивания, гранулирования или покрытия оболочкой, соответственно, и содержат примерно 0,1-75% или содержат примерно 1-50% активного ингредиента.

Подходящие композиции для подкожного введения включают, например, соединение по изобрете- 6 029946

нию с 2,5% полоксамера 407 в 0,9% хлориде натрия. Примеры подходящих устройств для инъекционных композиций включают инфузионные помпы, такие как система 1пзи1е1'з ОттРой.

Соединение по изобретению также можно вводить посредством многодозовых подкожных инъекций с использованием автоинжектора или ручки-инжектора. Композиции составов, подходящих для такой подкожной инъекции, представлены ниже.

Компонент Состав 1 Состав 2

Соединение А	1,00 мг	1,00 мг
Уксусная кислота	0,60 мг	0,60 мг
Маннит	5 0 мг	5 0 мг
Бензиловый спирт	8,00 мг	10,00 мг
1 н. гидроксид натрия	Доведение до рН 5,0	Доведение до рН 5,0
Вода для инъекций	Добавить до 1,016 г	Добавить до 1,016 г

Было обнаружено, что бензиловый спирт (по сравнению с фенолом или м-крезолом) является особенно подходящим консервантом для составов для подкожных инъекций.

Следовательно, в одном варианте осуществления описания обеспечивают фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество соединения А или его фармацевтически приемлемой соли (например, соединения А в форме ацетатной соли) и бензиловый спирт.

В дополнительном варианте осуществления описания обеспечивают фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество соединения А или его фармацевтически приемлемой соли (например, соединения А в форме ацетатной соли) и между 0,1 и 10; 0,1 и 5; 0,5 и 2; 0,5 и 1,5; или 0,9 и 1,1% (мас./об.) бензилового спирта.

Подходящие композиции для трансдермального применения включают эффективное количество соединения по изобретению с подходящим носителем. Носители, подходящие для трансдермальной доставки, включают впитываемые фармакологически приемлемые растворители для облегчения прохождения через кожу хозяина. Комбинация РО/ОА (пропиленгликоль/олеиловый спирт) является примером подходящего растворителя. Например, трансдермальные устройства могут быть в форме повязки, включающей основной слой, резервуар, содержащий соединение необязательно с носителями, необязательно барьер, контролирующий скорость доставки соединения в кожу хозяина с контролируемой и заранее определенной скоростью в течение длительного периода времени, и средства для крепления устройства на коже.

Подходящие композиции для местного применения, например на коже и глазах, включают водные растворы, суспензии, мази, кремы, гели или распыляемые составы, например, для введения посредством аэрозоля или т.п. Такие системы для местной доставки, в частности, являются подходящими для кожного применения. Они являются особенно приспособленными для применения в местных, включая косметические, составах, хорошо известных в области техники. Они могут содержать растворители, стабилизаторы, средства усиливающие тоничность, буферы и консерванты.

Как используется в настоящем описании, местное применение может также относиться к ингаляции или к интраназальному применению. Таковые удобно вводить в форме сухого порошка (или отдельно, в виде смеси, например сухой смеси с лактозой, или частиц смешанных компонентов, например, с фосфолипидами) из ингалятора сухого порошка или аэрозольного спрея из герметичного контейнера, насоса, распылителя, пульверизатора или небулайзера с или без использования подходящего пропеллента.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, так как вода облегчает разложение определенных соединений.

Безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы по изобретению могут быть получены с использованием безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием жидкости и условий с низким содержанием влаги или низкой влажности. Безводная фармацевтическая композиция может быть получена и храниться при сохранении ее безводной природы. Соответственно, безводные композиции упаковывают с использованием материалов, известных как предотвращающие воздействие воды, так, чтобы их можно было включать в подходящие рецептурные наборы. Примеры подходящих упаковок включают, но не ограничиваются этим, герметично закрытые фольгированные упаковки, пластиковые упаковки, однодозовые контейнеры (например, флаконы), блистерные упаковки и контурные упаковки.

Изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтические композиции и лекарственные формы, которые содержат одно или более средств, которые снижают скорость, с которой соединение по настоящему изобретению разлагается в качестве активного ингредиента. Такие средства, которые называют в

- 7 029946

настоящем описании как "стабилизаторы," включают, но не ограничиваются этим, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, рН буферы или солевые буферы и т.д.

Кристаллическая форма ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она проявляет ценные фармакологические свойства, например свойства модуляции β-2-адренорецепторов, например, как показано в исследованиях ίη νίΐτο и ίη νίνο, как представлено в следующих разделах, и, следовательно, показаны для терапии или для применения в качестве исследуемых химических веществ, например в качестве рабочего соединения.

Соединение по изобретению может быть применимо в лечении показаний, выбранных из мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении.

Следовательно, в качестве дополнительного варианта осуществления настоящее изобретение обеспечивает кристалличесую форму ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она в качестве лекарственного средства.

Следовательно, в качестве дополнительного варианта осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение кристаллической формы ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она в терапии. В дополнительном варианте осуществления терапию выбирают из заболевания, которое можно лечить активацией β-2-адренорецепторов. В другом варианте осуществления заболевание выбирают из мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ лечения заболевания, которое лечат активацией β-2-адренорецепторов, включающий введение терапевтически приемлемого количества кристаллической формы ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она.

В дополнительном варианте осуществления заболевание выбирают из мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении.

В качестве дополнительного варианта осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение кристаллической формы ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)1-гидроксиэтил)-5-идроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она для получения лекарственного средства. В дополнительном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для лечения заболевания или расстройства, которое можно лечить активацией β-2-адренорецепторов. В другом варианте осуществления заболевания выбирают из вышеупомянутого перечня, соответственно, мышечной атрофии, в частности мышечной дистрофии, атрофии от бездействия, кахексии или саркопении.

Соединение по настоящему изобретению можно вводить или одновременно с, или до, или после одного или более других терапевтических средств. Соединение по настоящему изобретению можно вводить отдельно посредством того же или иного пути введения или вместе с той же фармацевтической композицией в качестве других средств.

В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает продукт, содержащий кристаллическую форму ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и по меньшей мере одно другое терапевтическое средство в качестве комбинированного препарата для одновременного, отдельного или последовательного применения в лечении. В одном варианте осуществления терапия представляет собой лечение заболевания или состояния, модулируемого агонизмом к β-2-адренорецепторам. Продукты, представленные в виде комбинированного препарата, включают композицию, содержащую кристаллическую форму ацетатной соли (К)-7(2-( 1 -(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1 -гидроксиэтил)-5-гидроксибензо [б]тиазол-2(3Н)-она и другое терапевтическое средство(а) вместе в одной фармацевтической композиции, или кристаллическую форму ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и другое терапевтическое средство(а) в отдельной форме, например в форме набора.

В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую кристаллическую форму ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и другое терапевтическое средство(а). Необязательно фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, как описано выше.

Следовательно, дополнительный аспект изобретения относится к комбинации, содержащей терапевтически эффективное количество кристаллической формы ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и одно или более терапевтически активных соагентов.

В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает набор, включающий две или более отдельных фармацевтических композиции, по меньшей мере одна из которых содержит кристаллическую форму ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она. В одном варианте осуществления набор включает средства для отдельного содержания указанных композиций, такие как контейнер, разделенная бутыль или разделенный

- 8 029946

фольтированный пакет. Примером такого набора является блистерная упаковка, которая обычно используется для упаковки таблеток, капсул и т.п.

Набор по изобретению может быть использован для введения различных лекарственных форм, например пероральных и парентеральных, для введения отдельных композиций с различными интервалами введения, или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. Для содействия соблюдения режима лечения набор по изобретению обычно включает инструкции по введению.

В комбинированной терапии по изобретению соединение по изобретению и другое терапевтическое средство может производить и/или составлять один и тот же или разные производители. Более того, соединение по изобретению и другое терапевтическое средство могут быть объединены в комбинированной терапии: (ί) перед выпиской комбинированного продукта врачом (например, в случае набора, включающего соединение по изобретению и другое терапевтическое средство); (ίί) самим врачом (или под руководством врача) непосредственно перед введением; (ίίί) самими пациентами, например, во время последовательного введения соединения по изобретению и другого терапевтического средства.

Соответственно, изобретение обеспечивает применение кристаллической формы ацетатной соли (Р)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[й]тиазол-2 (3Н)-она для лечения заболевания или состояния, опосредуемого агонизмом к β-2-адренорецепторам, где лекарственное средство получают для введения с другим терапевтическим средством. Изобретение также обеспечивает применение другого терапевтического средства для лечения заболевания или состояния, опосредуемого агонизмом к β-2-адренорецепторам, где лекарственное средство вводят с кристаллической формой ацетатной соли (Р)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)5-гидроксибензо[й]тиазол-2(3Н)-она.

Изобретение также обеспечивает кристаллическую форму ацетатной соли (Р)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[й]тиазол-2(3Н)-она для применения в способе лечения заболевания или состояния, модулируемых агонизмом к β-2-адренорецепторам, где соединение формулы (I) получают для введения с другим терапевтическим средством. Изобретение также обеспечивает другое терапевтическое средство для применения в способе лечения заболевания или состояния, модулируемого агонизмом к β-2-адренорецепторам, где другое терапевтическое средство получают для введения с кристаллической формой ацетатной соли (Р)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[й]тиазол-2(3Н)-она.

Изобретение также обеспечивает кристаллическую форму ацетатной соли (Р)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[й]тиазол-2(3Н)-она для применения в способе лечения заболевания или состояния, модулируемого агонизмом к β-2-адренорецепторам, где кристаллическую форму ацетатной соли (Р)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[й]тиазол-2(3Н)-она вводят с другим терапевтическим средством. Изобретение также обеспечивает другое терапевтическое средство для применения в способе лечения заболевания или состояния, модулируемого агонизмом к β-2-адренорецепторам, где другое терапевтическое средство вводят с кристаллической формой ацетатной соли (Р)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1 -гидроксиэтил)-5 -гидроксибензо [й]тиазол-2(3Н)-она.

Изобретение также обеспечивает применение кристаллической формы ацетатной соли (Р)-7-(2-(1(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1 -гидроксиэтил)-5 -гидроксибензо [й]тиазол-2(3Н)-она для лечения заболевания или состояния, модулируемого β-2-адренорецепторами, где пациента ранее (например, в течение 24 ч) лечили другим терапевтическим средством.

В одном варианте осуществления терапевтическое средство выбирают из тестостерона, агонистов андрогенов или БАРМ (селективных модуляторов рецепторов андрогенов); ЮР-1 миметиков; блокаторов миостатина и его рецептора Ас1Р11А/В; блокаторов ΤΟΡβ и активина (в качестве средств против атрофии); ингибиторов лигазы МиЛ/МАРЬх Е3; ингибиторов НИАС или любых онколитических средств (например, для раковой кахексии); противовоспалительных средств, таких как НПВС, блокаторов ΤΝΡ или 1Ь-1Ь; метаболических модуляторов, подобных агонистам РРАР или миметикам 1Ь-15; сердечнососудистых средств, таких как блокаторы Ь(1) (например, небивалол) или АРВ (например, для кардиальной кахексии); антисмысловых олигонуклеотидов для пропуска экзонов (например, для дистрофии); усилителей аппетита, таких как грелин, прогестин или антагонисты МС-4; пищевых добавок с высоким содержанием белка и т.п.

Фармацевтическая композиция или комбинация по настоящему изобретению может находиться в стандартной дозировке примерно 0,05-1000 мг активного ингредиента для пациента весом примерно 5070 кг, или примерно 0,05-500 мг, или примерно 0,05-250 мг, или примерно 0,05-150 мг, или примерно 0,05-100 мг, или примерно 0,05-50 мг, или примерно 0,05-10 мг активных ингредиентов. Терапевтически эффективная дозировка соединения, фармацевтической композиции или их комбинации зависит от вида пациента, массы тела, возраста и индивидуального состояния, заболевания или расстройства, которое лечат, или его тяжести. Обычный врач, клиницист или ветеринар может легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для предотвращения, лечения или ингибирования прогрессирования расстройства или заболевания.

- 9 029946

Вышеуказанные свойства дозировок демонстрируют в исследованиях ίη νίίτο и ίη νίνο с использованием преимущественно млекопитающих, например мышей, крыс, собак, обезьян, или выделенных органов, тканей и их препаратов. Соединение по настоящему изобретению можно применять ίη νίίτο в форме растворов, например водных растворов, и ίη νίνο либо энтерально, либо парентерально, преимущественно подкожно, например, в виде суспензии или водного раствора. Дозировка ίη νίίτο может варьироваться между примерно 10^-3 молярной и 10^-9 молярной концентрациями. Терапевтически эффективное количество ίη νίνο может варьироваться в зависимости от пути введения между примерно 0,01-500 мг/кг, или между примерно 0,01-100 мг/кг, или между примерно 0,01-1 мг/кг, или между примерно 0,01-0,1 мг/кг.

Активность соединения по настоящему изобретению может быть оценена следующим методом ίη νίίτο. Кроме того, методы ίη νίνο дополнительно описаны в примерах.

Тест 1: функциональный клеточный анализ ίη νίίτο с использованием клеток СНО и клеток скелетных мышц.

цАМФ. Человеческие клетки скелетных мышц (8кМС) получали от СатЬгех (каталожный № СС2561) и культивировали в 8ке1е1а1 Ва8а1 Мебшт (8КВМ), полученной от СатЬгех (каталожный № #СС3161). Ответы цАМФ измеряли с использованием цАМФ динамического 2 порционного набора для НТКР-А88ау, полученного от СйЬю ογ С18 Стрейте [теШденсе (каталожный № 62АМ4РЕС). Клетки 8кМС культивировали в течение 1 дня в среде для культивирования клеток 8КВМ, дополненной 20% РС8 в 384-луночных планшетах при 37°С, 5% СО₂. На следующий день клетки промывали дважды с помощью 50 мкл РВ8 и дифференцировали в течение 3 дней в среде 8КВМ без сыворотки в присутствии 1 мкМ 8В431542, ингибитора АЬК 4/5, полученного от 8щта (каталожный № 84317) при 37°С, 7,5% СО₂. На 4 день 8КВМ без сыворотки, дополненную 1 мкМ 8В431542, удаляли, клетки промывали дважды с помощью 50 мкл РВ8 и дополнительно дифференцировали в течение 1 дня в 8КВМ без сыворотки без 8В431542 (50 мкл на лунку) при 37°С, 7,5% СО₂. Крысиные 8кМС и клетки кардиомиоцитов выделяли у новорожденных крыс стандартным образом и обрабатывали, как описано выше. Клетки яичника китайского хомяка (СНО) стабильно трансфицированные человеческими β-адренорецепторами (β1 или β2), получали в Nονа^ί^8 ИъЙиШ ίοτ ВюМейса1 Ке8еагсЬ и культивировали, как описано ранее (ί. Ρίκιπικιοοί. Ехр. ТЬег. 2006 Мау; 317(2):762-70).

Соединения получали в стимулирующем буфере в 2-кратной требуемой концентрации, и серийные разведения в стимуляционном буфере 1:10 получали в 96-луночном планшете (И-формы). ИМ8О контроль нормализовали по содержанию ЭМ8О наивысшего разведения, например 0,1% ИМ8О (х2) для концентрации 10^-5М (х2) первого разведения соединения. Исследование проводили в 384-луночных планшетах в 20 мкл стимуляционного объема и анализе конечного объема 40 мкл на лунку. В день эксперимента культуральную среду удаляли из 384-луночных планшетов для культивирования клеток путем переворачивания и смахивания на бумагу 2-3 раза. В 384-луночный планшет сначала добавляли 10 мкл свежей культуральной среды на лунку. После 10 мин инкубации при комнатной температуре к клеткам добавляли рабочие разведения соединений 10 мкл на лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. В течение этого времени рабочие растворы реагентов получали путем разведения маточного раствора анти-сАМР криптата и цАМФ Ό2 1:20 в лизирующем буфере, поставляемом с набором. После 30 мин инкубации соединения 10 мкл САМР-Э2 и 10 мкл анти-сАМР криптата последовательно добавляли к анализируемым планшетам. После 1 ч инкубации при комнатной температуре в темноте проводили измерения с помощью РНега81аг (длина волны возбуждения: 337 нм, длины волн излучения: 620 и 665 нм).

Са²+. Клеточную линию человеческих адренергических а1А СНО-К1 приобретали у Регкт Е1тег (УаЮсгеен™ стабильная рекомбинантная клеточная линия ОРСК, каталожный № Е8-036-С, партия № М1\У-С1. Вο8ίοη, Ма88асЬи8ей8, И8А). За день до эксперимента замороженные клетки а1А (10 млн на 1 мл и на флакон) оттаивали на водяной бане при 37°С. Суспензию клеток центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспендировали в культуральной среде для клеток. Клетки высевали в черные 384-луночные планшеты с прозрачным дном с плотностью 8000 клеток на лунку в 50 мкл среды для культивирования клеток. Планшеты инкубировали в течение примерно 24 ч при 37°С, 5% СО₂. В день эксперимента среду удаляли с использованием промывателя клеток (ТЕСАЫ Р^М3). После конечной промывки в лунках оставалось 10 мкл. Добавляли 40 мкл нагрузочного буфера, и клетки загружали в течение 60 мин при 37°С, 5% СО₂. Планшеты промывали ТЕСАЫ Р\У3 20 мкл оставшегося анализируемого буфера и инкубировали в течение по меньшей мере 20 мин при КТ перед проведением эксперимента РЫРК. Затем соединения характеризовали по типу агониста и/или антагониста. Для подтверждения анализа тот же протокол использовали со свежими клетками. В таком случае клетки открепляли от 150 см² колбы с использованием 3 мл Трипсин-ЕИТА, центрифугировали и ресуспендировали в среде для культивирования клеток.

Клетки стимулировали путем добавления 5 мкл соединений (5х) с использованием головки РЫРК. Соединения, действующие как агонисты, индуцируют транзиторное увеличение внутриклеточного кальция. Данные регистрировали на системе РЫРК. Измерение исходного сигнала сначала записывали каж- 10 029946

дую секунду в течение 2 мин перед введением соединений. Измерения кальция проводили путем возбуждения клеток лазером на ионах аргона при 488 нм при мощности лазера 0,6 Вт и регистрировали сигнал флуоресценции с помощью камеры ССЭ (апертура 0,4 с) в течение 2 мин. Нижний контроль (нестимулированные клетки) определяли с добавлением 5 мкл анализируемого буфера. Верхний контроль определяли с добавлением 5 мкл известного агониста в высокой концентрации ЕС_|00 (А-61603 при 1 мкМ), и контрольное соединение-агонист также добавляли в каждый планшет.

Соединение по изобретению проявляло активность в тесте 1 с ЕС₅₀ менее чем 10 нМ. Специфическая активность показана в примере 10.

Дополнительные специфические активности соединения по изобретению описаны в примерах 1115.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации изобретения и не должны расцениваться как ограничивающие его. Температуры даны в градусах Цельсия. Если не указано иное, все выпаривания проводили при пониженном давлении, обычно между примерно 15 и 100 мм рт.ст. (=20-133 мбар). Структуру конечных продуктов, промежуточных соединений и исходных материалов подтверждали стандартными аналитическими методами, например, микроанализом и спектроскопическими характеристиками, например, МС, ИК, ЯМР. Используемые сокращения являются обычными в области техники.

Все исходные материалы, структурные элементы, реагенты, кислоты, основания, дегидратирующие средства, растворители и катализаторы, используемые для синтеза соединения по настоящему изобретению, являются либо коммерчески доступными, либо могут быть получены методами органического синтеза, известными обычному специалисту в области техники (НоиЬеи-Аеу1 4Ηι Еб. 1952, МеШобз о£ Огдатс Зуи1Ье818, ТЫете, Уо1ите 21). Кроме того, соединение по настоящему изобретению может быть получено методами органического синтеза, известными обычному специалисту в области техники, как показано в следующих примерах.

Примеры

Список сокращений.

1М - одномолярный,

АРС1 - химическая ионизация при атмосферном давлении, водн. - водный,

АК- адренорецептор,

атм. -атмосфера,

шир. - широкий.

см - сантиметры,

д - дуплет,

дд - двойной дуплет,

ддд - двойной двойной дуплет,

(ΌΗΌΟ)₂ΡΗΑΕ - 1,4-фталазиндииловый диэфир гидрохинидина,

ЭМАС - диметилацетамид,

ΌΜ8Ο - диметилсульфоксид,

Э8С - дифференциальная сканирующая калориметрия, ее -энантиомерный избыток, экв. -эквивалент,

Е8 - электрораспыление, г -граммы,

ч - часы,

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

НКМ8 - масс-спектроскопия с высоким разрешением, м - мультиплет,

МЦ - метилцеллюлоза, мбар - миллибар,

МеОН - метанол, мин - минуты, мл - миллилитры,

МС - масс-спектроскопия,

МТВЕ - метил трет-бутиловый эфир, нм - нанометры,

ЯМР - ядерный магнитный резонанс,

КТ - время удержания, к.т. - комнатная температура, с - синглет,

насыщ. - насыщенный, септ. - септет, т - триплет,

- 11 029946

ТРА - трифторуксусная кислота, мкм - микрометры, мас./об - масса/объем,

ХРРГ) - порошковая рентгеновская дифракция.

Если не указано иное, спектры ВЭЖХ/МС регистрировали на Адйеп! 1100 серии ЬС/ЛдИеп! М8 6210 9иабгиро1е. Использовали колонку Аа1ег9 8утше1гу С8 (3,5 мкм; 2,1x50 мм) (ШЛТ200624). Применяли следующий метод градиента (% = процент по объему): А = вода + 0,1% ТРА/В = ацетонитрил + 0,1% ТРЛ; 0,0-2,0 мин 90А:10В-5А:95В; 2,0-3,0 мин 5А:95В; 3,0-3,3 мин 5А:95В-90А:10В; скорость потока 1,0 мл/мин; температура колонки 50°С. Все соединения ионизировали по типу АРС1.

¹Н-ЯМР спектры регистрировали на приборе Уапап Мегсигу (400 МГц) или Вгикег Абуапсе (600 МГц).

Вращение плоскости поляризации света измеряли на Регкт Е1тег Ро1апте1ег 341.

ЖХМС состояние для примеров 2Ь, 2с, 2б, 2е, 2ц.

Условия масс-спектра: Адйеп! 6130 квадруполь ЖХ/МС с ИРРС Адйеп! 1200; колонка: Адйеп! ΖοτЬах 8В-С18 (быстрое растворение), 2,1x30 мм, 3,5 мкм; подвижные фазы: В: 0,1% муравьиная кислота в воде; С: 0,1% муравьиная кислота в МеСЫ; 1,0 мин до 6,0 мин, 95% В до 5% В и 5% С до 95% С; 6,0 мин до 9,0 мин, 5% В и 95% С; заключительное время: 2,0 мин; скорость потока: 0,8 мл/мин; температура колонки: 30°С; УФ-детекция: 210 нм и 254 нм; МС+/МС^-: 80-1000; метод ионизации: АР1-Е8.

Условия НКМ8 для примера 2Р

Прибор: Аа1ег5 Асцийу ИРРС, соединенный с 8упар1 9-ТОР М8; колонка: Аа1ег9 Асцийу ИРРС ВЕН С18, 2,1x50 мм, 1,7 мкм, подвижная фаза: А: 0,1% муравьиная кислота в воде, В: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле; температура колонки: при комнатной температуре; УФ-определение: сканирование от 190 нм до 400 нм; скорость потока: 0,5 мл/мин.

Условия градиента:

Время (мин)	Фаза В (%)
0	5
1	5	Начало поступления
9	95
11	95	Завершение поступления
11, 10	5
14	5	Следующее введение

Метод ионизации: Е81+; диапазон сканирования МС: 100-1000 т/ζ.

Промежуточное соединение А: 2-(4-бутоксифенил)-1,1-диметилэтиламин.

a) 4-(2-Метил-2-нитропропил)фенол.

Смесь 4-(гидроксиметил)фенола (20 г), КО1Ви (27,1 г) и РМАС (200 мл) перемешивали магнитной мешалкой. 2-Нитропропан (21,5 г) медленно добавляли в течение 20 мин. Смесь нагревали до 140°С в течение 5 ч перед охлаждением до к.т. Смесь медленно добавляли к прохладному водному раствору НС1 (3,0%, 600 мл), затем экстрагировали МТВЕ (300 млх1, 200 млх1). Органические слои объединяли, промывали водой (300 млх2) и насыщ. водным раствором ЫаС1 (50 млх1), затем сушили над безводным Ыа₂8О₄. Смесь фильтровали и концентрировали в вакууме с получением твердого вещества светложелтого цвета (28,5 г), которое использовали для следующей стадии без дополнительной очистки.

[М-1]+=194,2; КТ=5,3 мин.

¹Н-ЯМР (400 МГц, СОС1₃) м.д. 6,96 (д, 1=8,5 Гц, 2Н), 6,75 (д, 1=8,5 Гц, 2Н), 3,11 (с, 2Н), 1,56 (с, 6Н).

b) 1 -Бутокси-4-(2-метил-2-нитропропил)бензол.

Смесь 4-(2-метил-2-нитропропил)фенола (20,4 г), 1-бромбутана (28,7 г), РМАС (200 мл), К₂СО₃ (21,6 г), йодида тетрабутиламмония (38,7 г) перемешивали магнитной мешалкой и нагревали до 85°С в течение 17 ч. Смесь охлаждали до 0-10°С и добавляли воду (700 мл). Смесь экстрагировали МТВЕ (300 млх1, 200 млх1). Объединенные органические фазы промывали водой (250 млх2), затем концентрировали в вакууме с получением масла красно-коричневого цвета (27,8 г), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

¹Н-ЯМР (400 МГц, СОС1₃) м.д. 7,0 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 6,81 (д, 1=8,8 Гц, 2Н), 3,93 (т, 1=6,6 Гц, 2Н), 3,12 (с, 2Н), 1,74 (м, 2Н), 1,56 (с, 6Н), 1,48 (м, 2Н), 0,97 (т, 3Н).

c) 2-(4-Бутоксифенил)-1,1-диметилэтиламин.

В гидрирующем реакторе (1 л) затем добавляли раствор 1-бутокси-4-(2-метил-2нитропропил)бензола (27,8 г) в АсОН (270 мл) с влажным № Ренея (7,0 г). Смесь продували Н₂ 3 раза, затем нагревали до 60°С и продолжали перемешивать при 5,0 атм. в течение 16 ч. Смесь фильтровали, полученный фильтрат концентрировали в вакууме. Полученный остаток разводили водой (150 мл)/нгептаном (80 мл), водный слой снова промывали н-гептаном (80 мл). Водный слой доводили с помощью

- 12 029946

ЫаОН (~20%) до рН ~11, затем экстрагировали МТВЕ (100 млх1) и ЕЮАе (150 млх2). Слой среды удаляли. Все верхние слои объединяли и промывали насыщенным ЫаНСО₃ (100 мл) и насыщенным ЫаС1 (100 мл) перед сушкой безводным Ыа₂ЗО₄. После фильтрации смесь концентрировали. Полученный остаток перемешивали и добавляли раствор НС1 в изопропиловом спирте (2М, 40 мл). Суспензию нагревали до 60°С и добавляли н-гептан (120 мл). Смесь охлаждали до 20°С, затем фильтровали, осадок промывали некоторым количеством н-гептана. Твердое вещество белого цвета сушили на воздухе в течение 2 дней с получением 10 г чистой НС1 соли продукта. Выход: 35,2%.

[МН]+=222,2; КТ=5,0 мин.

¹Н-ЯМР (400 МГц, 6-ΌΜ3Ο) м.д. 8,13 (с, 3Н), 7,12 (д, 1=8,6 Гц, 2Н), 6,88 (д, 1=8,5 Гц, 2Н), 3,93 (т, 1=6,4 Гц, 2Н), 2,80 (с, 2Н), 1,67 (м, 2Н), 1,42 (м, 2Н), 1,18 (с, 6Н), 0,92 (т, 3Н).

Пример 1 (справочный пример). (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-он

a) 1 -трет-Бутокси-3-фтор-5-изотиоцианатобензол.

Добавляли тиофосген (33,6 г) в СНС1₃ (250 мл) и К₂СО₃ (64,7 г) в Н₂О (450 мл) отдельно и одновременно по каплям к раствору 3-трет-бутокси-5-фторфениламина (42,9 г) в СНС1₃ (350 мл) при 0°С. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры в течение ночи. Органические слои отделяли и промывали водой (3х), солевым раствором (1 х), сушили над МдЗО₄, фильтровали и растворитель удаляли в вакууме. Указанное в заголовке соединение получали флэш-хроматографией (силикагель, элюент дихлорметан/изогексан 1:3).

¹Н ЯМР (СОС1з, 400 МГц); 6,70 (м, 3Н), 1,40 (с, 9Н).

b) О-изопропиловый эфир (3-трет-бутокси-5-фторфенил)тиокарбаминовой кислоты.

1-трет-Бутокси-3-фтор-5-изотиоцианатобензол (24,0 г) и триэтиламин (10,9 г) растворяли в изопропаноле (150 мл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 18 ч и растворитель удаляли вакуумом. Сырой продукт растворяли в гексане:диэтиловом эфире (19:1). Диэтиловый эфир удаляли в вакууме и раствор охлаждали до 0°С в течение 3 ч. Раствор фильтровали с получением указанного в заголовке соединения.

¹Н ЯМР (СЮС1₃, 400 МГц); 8,10 (шир.с, 1Н), 6,65 (шир.с, 2Н), 6,45 (ддд, 1Н) 5,60 (септет, 1Н), 1,35 (д, 6Н), 1,30 (с, 9Н).

c) 5-трет-Бутокси-2-изопропоксибензотиазол-7 -карбальдегид.

О-изопропиловый эфир (3-трет-бутокси-5-фторфенил)тиокарбаминовой кислоты (2,2 г) растворяли в сухом тетрагидрофуране (20 мл). Реакционную смесь охлаждали до -78°С и трет-бутиллитий (15,2 мл,

- 13 029946

1,5М раствор) добавляли в течение 20 мин. Затем реакционную смесь нагревали до -10°С в течение 75 мин. Затем реакционную смесь повторно охлаждали до -78°С, добавляли Ν,Ν-диметилформамид (1,5 г) и реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры, затем перемешивали при -10°С в течение 1 ч. Реакционную смесь гасили НС1(_водн) (5 мл, 2М раствора), органические слои разделяли между этилацетатом/водой и удаляли в вакууме. Указанное в заголовке соединение получали флэшхроматографией (силикагель, элюент этилацетат/изогексан 1:9).

МС (ЕБ+) т/е 294 (МН+).

б) 5-трет-Бутокси-2-изопропокси-7-винилбензотиазол РБ₃РМе.Вг (5,0 г) растворяли в сухом тетрагидрофуране (100 мл) в атмосфере аргона. Ν-бутиллитий (8,8 мл, 1,6М раствора) добавляли при комнатной температуре в течение 10 мин и реакционную смесь перемешивали в течение дополнительных 30 мин. Раствор 5-трет-бутокси-2-изопропоксибензотиазол-7-карбальдегида (1,25 г) в дихлорметане (40 мл) добавляли по каплям к реакционной смеси и реакционную смесь перемешивали в течение 4,5 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме, снова растворяли в этилацетате, промывали водой (3х), солевым раствором (1х), сушили над Мд§0₄, фильтровали и растворитель удаляли в вакууме. Указанное в заголовке соединение получали флэш-хроматографией (силикагель, элюент этилацетат/изогексан 1:9).

МС (ЕБ+) т/е 292 (МН+).

е) (К)-(3 -трет-бутокси-2-изопропоксибензотиазол-7-ил)этан-1,2-диол.

К₃Ре(СЫ)₆ (1,2 г), К₂С0₃ (0,5 г), (ΌΗρΌ)₂ΡΗΑΙ (19 мг) растворяли в трет-бутаноле/воде (15 мл, смесь 1:1) в атмосфере аргона и перемешивали в течение 15 мин. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и затем добавляли 0к0₄ (3,1 мг) с 5-трет-бутокси-2-изопропокси-7-винилбензотиазолом (0,35 г).

Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили метабисульфатом натрия (1 г) и перемешивали в течение 1,5 ч. Добавляли этилацетат, органические слои отделяли, промывали (2х) водой, (1 х) солевым раствором, сушили над Мд§0₄, фильтровали и растворитель удаляли в вакууме. Указанное в заголовке соединение получали флэш-хроматографией (силикагель, этилацетат/изогексан 2:5).

МС (ЕБ+) т/е 326 (МН+).

ί) (К)-2-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо[б]тиазол-7-ил)-2-гидроксиэтил-4-метилбензолсульфонат.

В 500 мл трехгорлую круглодонную колбу, продутую и поддерживаемую в инертной атмосфере азота, помещали раствор (К)-1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо[б]тиазол-7-ил)этан-1,2-диола (20 г, 59,05 ммоль) в пиридине (240 мл) и 4 А молекулярные сита (5 г). За этим следовало добавление раствора хлорида толуолсульфоновой кислоты (тозилхлорид) (15,3 г, 79,73 ммоль) в пиридине (60 мл) по каплям при перемешивании при 0°С. Полученный раствор перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь гасили добавлением 1000 мл 1М соляной кислоты. Полученный раствор экстрагировали 2х300 мл этилацетата и органические слои объединяли. Органическую фазу промывали 1х500 мл 1М НС1, 1х500 мл 10% бикарбоната натрия и 300 мл солевого раствора. Смесь сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Остаток наносили на колонку из силикагеля с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:10). Это давало 26 г (87%) (К)-2-(5-трет-бутокси-2изопропоксибензо[б]тиазол-7-ил)-2-гидроксиэтил-4-метилбензолсульфоната в виде масла желтого цвета.

ЖХ/МС КТ=2,47 мин; (т/ζ): 480 [М+Н]+.

’Н-ЯМР: (400 МГц, ΌΜ§0-6₆): δ (м.д.) 7,57 (д, 2Н); 7,36 (д, 2Н); 7,17 (д, 1Н); 6,79 (д, 1Н); 6,32 (д, 1Н); 5,37-5,26 (м, 1Н); 4,97-4,90 (м, 1Н); 4,12-4,00 (м, 2Н); 2,40 (с, 3Н); 1,45-1,38 (м, 6Н); 1,32 (с, 9Н).

д) (К)-1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо [б]тиазол-7 -ил)-2-( 1 -(4-бутоксифенил)-2-метилпропан2-иламино)этанол.

В 1000-мл 4-горлую круглодонную колбу помещали раствор (К)-2-(5-трет-бутокси-2изопропоксибензо[б]тиазол-7-ил)-2-гидроксиэтил-4-метилбензолсульфоната (26 г, 51,55 ммоль, 1,00 экв.) в толуоле (320 мл) и 2-(4-бутоксифенил)-1,1-диметилэтиламин (промежуточное соединение А) (22 г, 99,47 ммоль, 1,93 экв.). Раствор перемешивали в течение 24 ч при 90°С на масляной бане. Полученную смесь концентрировали в вакууме. Остаток наносили на колонку с силикагелем с помощью этилацетата/петролейного эфира (1:8). В результате получали 16 г (58%) (К)-1-(5-трет-бутокси-2изопропоксибензо[б]тиазол-7-ил)-2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)этанола в виде масла светло-желтого цвета.

ЖХ/МС: КТ=2,24 мин; (т/ζ): 529 [М+Н]+.

’Н-ЯМР: (600 МГц, ΌΜ§0-6₆): δ (м.д.) 7,12 (с, 1Н); 6,83 (д, 2Н); 6,77 (с, 1Н); 6,63 (д, 2Н); 5,80 (шир.с, 1Н); 5,38-5,30 (м, 1Н); 4,70-4,66 (м, 1Н); 3,90 (т, 2Н); 2,81-2,61 (м, 2Н); 2,50-2,39 (м, 2Н); 1,71-1,62 (м, 2Н); 1,47-1,41 (м, 2Н); 1,41 (д, 6Н); 1,22 (с, 9Н); 0,91 (кв, 3Н); 0,88 (с, 3Н); 0,83 (с, 3Н).

Б) (К)-7-(2-( 1 -(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1 -гидроксиэтил)-5-гидроксибензо [б]тиазол-2(3Н)-он.

Раствор (К)-1 -(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо [б]тиазол-7 -ил)-2-( 1 -(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)этанола (3,5 г) в муравьиной кислоте (40 мл) перемешивали в течение 68 ч при

- 14 029946

комнатной температуре. Добавляли 50 мл воды и полученную смесь выпаривали досуха (ротационный испаритель, 15 мбар, 40°С) с получением 3,8 г сырого продукта. Полученное вещество распределяли между насыщенным водным бикарбонатом натрия (50 мл) и этилацетатом (50 мл) с целью удаления муравьиной кислоты. Водный слой экстрагировали 3х этилацетатом (30 мл каждый). Объединенные органические экстракты сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали с получением 3 г сырого свободного основания. Полученное вещество подвергали флэш-хроматографии (силикагель; градиент 0-60% метанола в дихлорметане). Чистые фракции собирали и выпаривали досуха с получением 1,74 г аморфного полутвердого вещества.

Полученное вещество подвергали хиральной препаративной хроматографии [колонка: СЫга1рак 1С (20 мкм) 7,65x37,5 см; элюент: н-гептан/дихлорметан/этанол/диэтиламин 50:30:20 (+0,05 диэтиламин); скорость потока=70 мл/мин; концентрация: 2,5 г/50 мл элюента; определение: УФ, 220 нм] с получением чистого энантиомера (100% ее).

Полученное вещество растворяли в 45 мл ацетонитрила при 60°С. Раствору позволяли остыть до комнатной температуры в течение 18 ч, вплоть до появления осадка. Смесь разбавляли с помощью 5 мл холодного (4°С) ацетонитрила и фильтровали через воронку Висйпег. Фильтровальный осадок промывали дважды холодным ацетонитрилом. Затем влажное твердое вещество собирали и сушили в вакууме (0,2 мбар) при комнатной температуре в течение ночи с получением 1,42 г (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она в виде бесцветного порошка.

ЖХ/МС: КТ=1,81 мин (т/ζ): 431 [М+Н]+.

¹Н-ЯМР: (600 МГц, ΌΜ8Θ-ά₆): δ (м.д.) 11,5 (шир.с, 1Н); 9,57 (шир.с, 1Н); 6,99 (д, 2Н); 6,76 (д, 2Н); 6,52 (с, 1Н); 6,47 (с, 1Н); 5,63 (шир.с, 1Н); 4,53-4,48 (м, 1Н); 3,90 (т, 2Н); 2,74-2,63 (м, 2Н); 2,54-2,45 (м, 2Н); 1,71-1,62 (м, 2Н); 1,49-1,40 (м, 2Н); 0,93 (кв, 3Н); 0,89 (с, 6Н).

Оптическое вращение: [α]_ο ²²=-43° (с=1,0 г/100 мл МеОН).

Пример 2 (справочный пример). Альтернативный путь получения (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она

а) 1-трет-Бутокси-3-фтор-5-изотиоцианатобензол.

1,1'-Тиокарбонилдиимидазол (423 г, 2,37 моль) растворяли в дихлорметане (3200 мл). Смесь перемешивали в атмосфере Ν₂, тогда как раствор 3-трет-бутокси-5-фторанилина (435 г, 2,37 моль) в дихлорметане (800 мл) медленно добавляли в течение 2 ч. Затем смесь продолжали перемешивать при 20°С в течение 16 ч. Смесь разбавляли водой (3000 мл). Отделенную фазу дихлорметана снова промывали водой (3000 мл) перед сушкой безводным №₂8О₄ в течение 2 ч. Смесь фильтровали и фильтрат концентриро- 15 029946

вали в вакууме с удалением растворителя с получением 1-трет-бутокси-3-фтор-5-изотиоцианатобензола (499 г).

¹Н-ЯМР (400 МГц, СОС1₃): 6,63-6,68 (м, 3Н), 1,37 (с, 9Н).

b) О-изопропиловый эфир (3-трет-бутокси-5-фторфенил)тиокарбаминовой кислоты.

К раствору 1-трет-бутокси-3-фтор-5-изотиоцианатобензола (460 г, 2,04 моль) в безводном изопропиловом спирте (3250 мл) добавляли триэтиламин (315 г, 3,06 моль). Смесь кипятили с обратным холодильником в атмосфере Ν₂ в течение 16 ч и температуру охлаждали до 40-50°С. После концентрирования полученный темный остаток разводили н-гептаном (1000 мл) и нагревали до 60°С. Смесь медленно охлаждали до 25°С, в то же время добавляли затравку. Наблюдали суспензию и медленно перемешивали при 25°С в течение 16 ч перед охлаждением до 0-10°С в течение 2 ч. После фильтрации и промывки нгептаном (200 мл) собранное твердое вещество сушили в печи в вакууме при 40-45°С в течение 18 ч с получением О-изопропилового эфира (3-трет-бутокси-5-фторфенил)тиокарбаминовой кислоты (453,1 г).

ЖХМС: [М+Н]+=286,1; КТ=7,2 мин.

Ή-ЯМР (400 МГц, СОС1₃): 8,18 (с, 1Н), 6,81 (м, 2Н), 6,51 (дт, 1=10,2 Гц, 1Н), 5,66 (гептет, 1=6,3 Гц, 1Н), 1,42 (д, 1=6,2 Гц, 6Н), 1,37 (с, 9Н).

c) 1-(5-трет-Бутокси-2-изопропоксибензотиазол-7-ил)-2-хлорэтанон.

В атмосфере азота раствор трет-бутиллития (481 мл, 737,6 ммоль, 1,6М) добавляли по каплям к раствору О-изопропилового эфира (3-трет-бутокси-5-фторфенил)тиокарбаминовой кислоты (200 г, 700,83 ммоль) в 2-Ме-ТНР (1600 мл) при температуре ниже -65°С. Температуру реакции повышали до -35°С и вторую часть трет-бутиллития (388 мл, 737,6 ммоль, 1,9М) медленно добавляли при поддержании температуры ниже -35°С. Затем реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 3 ч и охлаждали до -70°С. Раствор №метил-№метоксихлорацетамида (96,4 г, 700,83 ммоль) в 2-Ме-ТНР (300 мл) добавляли к реакционной среде при поддержании температуры ниже -70°С. Затем смесь нагревали до -30°С и перемешивали в течение 45 мин. Холодную реакционную смесь гасили добавлением по каплям 30% НС1 в изопропаноле (240 г) с последующим добавлением 1500 мл воды. Органический слой промывали последовательно 1000 мл воды, 1500 мл насыщенного водного №-1НСО₃ и 1500 мл солевого раствора. После концентрирования полученный остаток светло-коричневого цвета добавляли к изопропанолу (135 мл). Смесь нагревали до 50°С и медленно охлаждали до 25°С. н-Гептан (135 мл) добавляли по каплям к раствору и смесь перемешивали в течение ночи. Суспензию фильтровали, и фильтровальный осадок промывали н-гептаном (40 мл) с последующим добавлением другой части н-гептана (20 мл). Осадок сушили в вакууме с получением 1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензотиазол-7-ил)-2-хлорэтанона в виде порошка не совсем белого цвета (42,8 г, 17,9% выход).

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): 7,60 (д, 1=2,0 Гц, 1Н), 7,45 (д, 1=2,0 Гц, 1Н), 5,40 (гептет, 1=6,3 Гц, 1Н), 4,77 (с, 2Н), 1,47 (д, 1=6,3 Гц, 6Н), 1,40 (с, 9Н).

ЖХМС: [М+Н]+=342,1, КТ=7,29 мин.

й) (К)-1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензотиазол-7-ил)-2-хлорэтанол.

Суспензию 1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо[й]тиазол-7-ил)-2-хлорэтанона (70 г, 204,8 ммоль) и КиС1 (п-цимол) [(8,8)-Тк-ОРЕК| (1,954 г, 3,07 ммоль) в метаноле/ЭМР (1330 мл/70 мл) дегазировали и перезаполняли Ν₂ три раза. Дегазированную заранее полученную смесь муравьиной кислоты (28,3 г) в Εΐ₃Ν (124,3 г) медленно добавляли при поддержании внутренней температуры от 15 до 20°С. Полученную суспензию желтого цвета нагревали до 30°С. Через 2 ч реакционную смесь охлаждали до 25°С, затем в реакционную смесь добавляли воду (750 мл) с последующим добавлением уксусной кислоты (56 мл) одной порцией. Смесь концентрировали и затем разбавляли ТВМЕ (1000 мл). Водную фазу отделяли и экстрагировали ТВМЕ (1000 мл). Объединенные органические фазы промывали последовательно водой и солевым раствором и затем сушили с помощью №₂8О₄ и концентрировали в вакууме с получением (К)-1 -(5 -трет-бутокси-2-изопропоксибензотиазол-7-ил) -2-хлорэтанола (72 г).

ЖХМС (метод А): [М+Н]+=343,1, КТ=5,67 мин.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): 7,29 (д, 1=2,0 Гц, 1Н), 6,83 (д, 1=2,0 Гц, 1Н), 5,37 (гептет, 1=6,3 Гц, 1Н), 4,96 (м, 1Н), 3,74 (м, 2Н), 3,01 (с, 1Н), 1,46 (д, 1=6,2 Гц, 6Н), 1,36 (с, 9Н).

е) (К)-5-трет-бутокси-2-изопропокси-7 -оксиранилбензотиазол.

К раствору (К)-1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо[й]тиазол-7-ил)-2-хлорэтанола (140 г, 407,1 ммоль) в ТВМЕ (42 0 мл) добавляли по каплям водный раствор №ОН (2М, 420 мл) с последующим добавлением одной порцией йодида тетрабутиламмония (7,52 г, 20,36 ммоль). Через 4 ч при 26°С добавляли 400 мл ТВМЕ и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали ТВМЕ (400 мл). Объединенные органические слои промывали водой (400 мл) и солевым раствором (400 мл) с получением (К)-5трет-бутокси-2-изопропокси-7-оксиранилбензотиазола (122 г).

ЖХМС: [М+Н]+=308,0, КТ=6,80 мин.

Ή ЯМР (400 МГц, СИСЬ) м.д. 7,28 (д, 1=2,0 Гц, 1Н), 6,85 (д, 1=2,0 Гц, 1Н), 5,38 (м, 1Н), 3,96 (м, 1Н), 3,15 (дд, 1=4,3, 5,5 Гц, 1Н), 2,94 (дд, 1=4,3, 5,5 Гц, 1Н), 1,45 (д, 1=Гц, 6Н), 1,37 (с, 9Н).

ί) (К)-1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо[й]тиазол-7-ил)-2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан2-иламино)этанол.

(К)-5-трет-Бутокси-2-изопропокси-7-оксиранилбензотиазол (145 г, 471,7 ммоль) и 2-(4-бутокси- 16 029946

фенил)-1,1-диметилэтиламин (114,8 г, 518,9 ммоль) растворяли в БМ8О (850 мл). Реакционную смесь нагревали до 80°С и перемешивали в течение 27 ч. Затем смесь охлаждали до 25°С и добавляли к перемешиваемой смеси воду (1500 мл) и ТВМЕ (1500 мл). Водный слой отделяли и экстрагировали ТВМЕ (1000 мл). Объединенные органические слои последовательно промывали водой (1500 мл) и солевым раствором (1000 мл), сушили над безводным Ыа₂8О₄. После концентрирования остаток очищали колоночной хроматографией (элюируя 10% Е1ОАс в н-гептане до 33% Е1ОАс в н-гептане). Твердый продукт (К)-1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо[й]тиазол-7-ил)-2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)этанола получали (140 г) в виде твердого вещества не совсем белого цвета.

НКМ8: [М+1] 529,2996.

'II ЯМР (400 МГц, СБС1₃): 7,26 (м, 1Н), 7,01 (м, 1Н), 6,99 (м, 1Н), 6,78-6,80 (м, 3Н), 5,39 (м, 1Н), 4,65 (дд, 1=3,8, 8,8 Гц, 1Н), 3,83 (т, 1=6,4 Гц, 2Н), 2,96 (дд, 1=3,8, 12 Гц, 1Н), 2,74 (дд, 1=8,8, 12 Гц, 1Н), 2,60 (дд, 1=13,6, 17,6 Гц, 2Н), 1,72-1,79 (м, 2Н), 1,50 (м, 2Н), 1,46 (д, 1=2,0 Гц, 3Н), 1,45 (д, 1=2,0 Гц, 3Н), 1,35 (с, 9Н), 1,06 (с, 3Н), 1,04 (с, 3Н), 0, 98 (т, 1=7,2 Гц, 3Н).

д) (К)-7-(2-( 1 -(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1 -гидроксиэтил)-5-гидроксибензо [й]тиазол-2(3Н)-он.

К (К)-1-(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо[й]тиазол-7-ил)-2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан2-иламино)этанолу (7,5 г) в изопропаноле (30 мл) и воде (25 мл) добавляли 1М водный раствор НС1 (43 мл). Затем реакционную смесь нагревали до 60°С и перемешивали в течение 2,5 ч. Смесь охлаждали до 50°С и затем медленно добавляли 2М водный раствор ЫаОН (18 мл) до рН 8,2-8,4. Реакционную смесь затем охлаждали до 30°С с последующей экстракцией ТВМЕ (первый раз с 40 мл, второй раз с 25 мл). Два органических слоя объединяли и промывали водой (38 мл два раза) перед сушкой с безводным Ыа₂8О₄. После фильтрации фильтрат концентрировали и затем растворяли в МеСЫ (145 мл). Раствор обрабатывали активным углеродом (0,6 г) и нагревали до 60°С. После второй фильтрации осадок промывали МеСЫ (10 мл два раза), фильтрат кристаллизовали при 60°С с получением (К)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[й]тиазол-2(3Н)-она (3,8 г). е.е.=97,6%.

ЖХМС (метод А): [М+Н]+=431,2.

'Н ЯМР (400 МГц, БМ8Ой₆): 9,5 (шир.с, 1Н), 6,81 (д, 1=8,5 Гц, 2Н), 6,57 (д, 1=8,6 Гц, 2Н), 6,33 (д, 1=2,2 Гц, 1Н), 6,30 (д, 1=2,2 Гц, 1Н), 4,43 (шир.с, 1Н), 3,69 (т, 1=6,4 Гц, 2Н), 2,58-2,59 (м, 2Н), 2,24-2,31 (м, 2Н), 1,41-1,48 (м, 2Н), 1,15-1,25 (м, 2Н), 0,78 (с, 6Н), 0,70 (т, 1=1,4 Гц, 3Н).

Пример 3. Ацетатная соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[а]тиазол-2(3Н)-она.

500 мг (1,161 ммоль) свободного основания (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[а]тиазол-2(3Н)-она суспендировали в 10,0 мл ацетонитрила и 0,25 мл воды в 50 мл четырехгорлой колбе и лопастью перемешивали при к.т. Суспензию нагревали при внутренней температуре 50°С (температура кожуха 75°С) и добавляли 72 мг уксусной кислоты (1,161 ммоль) (образовывался прозрачный раствор желтого цвета). Раствор охлаждали в течение 30 мин при к.т. и добавляли 0,15 мл воды.

Затем раствор затравляли с помощью ацетата (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[а]тиазол-2(3Н)-она и перемешивали в течение ночи (16 ч) при к.т. Затем суспензию фильтровали при к.т. через стеклянный фильтр и промывали три раза с помощью 1 мл ацетонитрила. 510 мг фильтрованного осадка сушили досуха в сушильной печи в течение ночи (16 ч) при к.т. Выход: 508 мг порошка белого цвета (89,1%).

Получение затравочных кристаллов ацетата (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1 -гидроксиэтил)-5-гидроксибензо [й]тиазол-2(3Н)-она.

57,0 мг (0,132 ммоль) свободного основания (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[а]тиазол-2(3Н)-она и 8,03 мг (0,132 ммоль) уксусной кислоты растворяли в 1,0 мл ацетонитрила и 0,05 мл воды. Раствор перемешивали при к.т. с помощью магнитной мешалки. Осаждение имело место в течение ночи. Затем раствор фильтровали при к.т. через стеклянный фильтр и промывали три раза 0,5 мл ацетонитрила. Влажный фильтровальный осадок сушили досуха в сушильной печи в течение ночи (16 ч) при к.т. Выход: 57 мг порошка белого цвета.

Пример 3а. Альтернативная методика получения ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1 -гидроксиэтил)-5 -гидроксибензо [й]тиазол-2(3Н)-она.

(К)-1 -(5-трет-бутокси-2-изопропоксибензо [й]тиазол-7-ил)-2-( 1 -(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)этанол (1 экв.) суспендировали в изопропаноле. При 50-60°С 1М водный раствор соляной кислоты (3 экв.) добавляли в течение примерно 30-60 мин. После завершения реакции (приблизительно 2,5 ч при 60°С) раствор охлаждали до 20°С и постепенно добавляли гидроксид натрия 2М (3 экв.) при указанной температуре. После полного добавления эмульгированное свободное основание (К)-7-(2-(1-(4бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[а]тиазол-2(3Н)-она экстрагировали в этилацетат и органический слой промывали водой. Органический слой обрабатывали активированным углеродом и фильтровали с использованием микрокристаллической целлюлозы в качестве вспомогательного фильтра. Фильтровальный осадок промывали этилацетатом. Фильтрат, содержащий

- 17 029946

свободное основание (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она, осторожно концентрировали до определенного остаточного объема путем дистилляции при температуре кожуха 55°С при пониженном давлении. Затем добавляли изопропилацетат и частично удаляли дистилляцией до определенного остаточного объема при температуре кожуха 55°С при пониженном давлении. Дополнительный изопропилацетат и раствор уксусной кислоты в изопропилацетате добавляли к теплому остатку дистилляции при 50-55°С. Во время добавления уксусной кислоты партию затравляли ацетатной солью (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она для начала контролируемой кристаллизации ацетатной соли ранее при 50-55°С. После постепенного охлаждения до 0°С суспензию продукта фильтровали и промывали дважды холодным изопропилацетатом. Фильтровальный осадок сушили при 50-90°С при пониженном давлении до постоянной массы с получением кристаллической ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол2(3Н)-она с типичным выходом приблизительно 80%.

Примеры 5, 6 и 7. ΧΚΡΏ и И8С анализ кристаллического (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и его ацетатной соли.

ΧΙ1ΡΙ) анализ свободного основания кристаллического (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она и его ацетатной соли проводили в следующих экспериментальных условиях:

ΧΚΡΌ метод

Прибор

Излучение

Шаг

Тип сканирования Время сканирования Диапазон сканирования

Вгикег Ώ8 АсВ/апсе (отражение) СиКа (40 кВ, 30 мА)

0,017 град

Непрерывное сканирование 107,1 сек

2°-40° (значение 2 тета)

И8С анализ проводили в следующих условиях эксперимента:

ЮЗС метод

Прибор Регк1п Е1тег Штатопс!

Диапазон температур 30°-300С

Масса образца 2-3 мг

Кювета для образцов Закрыта алюминием

Поток азота 20-50 К/мин

Пример 5 (справочный пример). ΧΚΡΏ анализ кристаллического (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она.

Свободное основание (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она рекристаллизовали, как описано ниже перед ΧΚΡΏ анализом.

4,0 г (2,232 ммоль) (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она суспендировали в 24,0 мл этилацетата в 100 мл четырехгорлой колбе и лопастями перемешивали при к.т. Суспензию растворяли при внутренней температуре 70°С (температура кожуха 90°С) с получением прозрачного раствора желтого цвета. Раствор охлаждали в течение 30 мин при к.т. и затравляли с помощью свободного основания (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1 -гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она при внутренней температуре 35°С (кристаллизация начиналась очень медленно) и перемешивали в течение ночи (16 ч) при к.т. Затем раствор фильтровали при к.т. через стеклянный фильтр (быстрая фильтрация, продолжительность: <1 мин) и промывали 3x2,0 мл этилацетата (прозрачная материнская жидкость желтого цвета). 5,82 г влажного фильтровального осадка сушили в сушильной печи в течение ночи 16 ч при к.т. и 16 ч при 40°С. Выход: 3,63 г порошка белого цвета (90,75%).

Пример 6. ΧΚΡΏ анализ кристаллической ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2метилпропан-2-иламино)-1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она.

Кристаллическую ацетатную соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она анализировали посредством ΧΚΡΏ, характеристические пики показаны в таблице ниже (см. также фиг. 6). Из них пики на 8,8, 11,5, 16,4, 17,6, 18,2, 19,6, 20,1, 20,8 и 21,1° 2θ являются наиболее характеристическими.

- 18 029946

Угол (2-тета °)	Интенсивность, %	Угол (2-тета °)	Интенсивность, %
8,8	высокая	19,1	низкая
10, 0	низкая	19, 6	средняя
11,5	высокая	20, 1	высокая
14,2	низкая	20, 8	высокая
14, 6	низкая	21,1	средняя
15,7	низкая	23,3	средняя
16, 4	высокая	26, 2	низкая
17, 6	средняя	26, 6	средняя
18,2	высокая	27,1	средняя

Кристаллическую ацетатную соль (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)-1гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она анализировали посредством БЗС и обнаружили, что она имеет широкую эндотерму при примерно 170°С.

Пример 8. Способ получения фармацевтического состава, подходящего для подкожного введения соединения А в форме ацетатной соли.

Для 1,00 л раствора лекарственного продукта приблизительно 900 г воды для инъекций помещали в прозрачный сосуд, подходящий для составления фармацевтических композиций. 50 г маннита, 0,60 г уксусной кислоты и 10 г бензилового спирта добавляли и растворяли в воде для инъекций. Затем добавляли и растворяли 1,00 г соединения А. рН доводили до целевого значения, например 5,0, с помощью 1н. раствора гидроксида натрия. Затем к целевому раствору продукта массой 1,016 кг добавляли воду для инъекций. Раствор лекарственного продукта стерильно фильтровали через 0,22 мкм ΡνΌΡ мембрану в мытые апирогенные флаконы, закрытые стерильными резиновыми пробками, и запечатывали. Флаконы окончательно стерилизовали автоклавированием.

Пример 8а. Альтернативный способ получения фармацевтического состава, подходящего для подкожного введения соединения А в форме ацетатной соли.

Для 1,00 л раствора лекарственного продукта приблизительно 900 г воды для инъекций помещали в прозрачный сосуд, подходящий для составления фармацевтических композиций. 50 г маннита и 10 г бензилового спирта добавляли и растворяли в воде для инъекций. Затем добавляли 1,14 г ацетатной соли соединения А и растворяли. рН доводили до целевого значения, например 5,0, с помощью раствора уксусной кислоты. Затем добавляли воду для инъекций к раствору целевого продукта массой 1,016 кг. Раствор лекарственного продукта стерильно фильтровали через 0,22 мкм ΡνΌΡ мембрану в промытые апирогенные флаконы, закрытые стерильными резиновыми пробками, и закупоривали. Флаконы окончательно стерилизовали автоклавированием.

Пример 9. Сравнительные растворимости форм свободного основания, ацетатной соли и гликолятной соли соединения А.

Анализировали относительные растворимости форм свободного основания и ацетатной и гликолятной солей соединения А, результаты показаны в таблице ниже. Растворы титровали с добавлением НС1 или ЫаОН для регуляции рН. Улучшенная водная растворимость форм ацетатной и гликолятной соли относительно формы свободного основания соединения А делает форму ацетатной и гликолятной солей соединения А более подходящими для подкожной инъекции или инфузии._

Растворимость свободного основания соединения А в Н2О	Растворимость ацетатной соли соединения А в Н2О	Растворимость гликолятной соли соединения А в Н2О
РН	Конц. в мг/мл	РН	Конц. в мг/мл	РН	Конц. в мг/мл
6,2	0,27	5,9	1,33	5,1	13, 1
7,0	0, 05	6, 0	1,11	5,3	6, 39
7,3	<0, 01	6,1	1, 10	5,4	4,47
7,8	<0, 01	6,2	0, 55

- 19 029946

Пример 10. Ιη νΐίΓΟ клеточные профили соединения по изобретению (соединение А), его энантиомера (соединение В), его рацемата (соединение А/В) и формотерола.

Соединение по изобретению (соединение А) показывает следующие значения ЕС₅₀ в тесте 1, как описано в настоящем описании ранее.

Соединения	Клетки СНО# ЕС50 (Етах %)	Первичные клетки; ответ цАМФ ЕС50 (Етах %)
β2 АН	βΐ АН	ОС.1А АН	Человеческие зкМС	Крысиные зкМС	Крысиные кардиомиоциты
Формотерол	0,7 нМ (99%**)	со с° А	190 нМ	0,2 нМ	0, 9 нМ	2,9 нМ
Соединение А (К)	5,6 нМ (8 8%**)	5 60 нМ (32%**)	>10 мкМ	0,7 нМ (96%*)	3,4 нМ (98%*)	5,7 нМ (71%**)
Соединение В (5)	950 нМ (83%**)	>10 мкМ	>30 мкМ	280 нМ (100%*)	н. о.	н. о.
Соединение А/В	11 нМ (87%**)	68 4 нМ (38%**)	н. о .	0, 63 нМ (100%*)	н. о.	н. о.
Ацетатная соль соединения А(К)	2,5 нМ (91%**)	н. о.	н. о .	1,7 нМ (93%**)	н. о.	н. о.

зкМС: дифференцированные скелетные миотрубочки; *: по сравнению с формотеролом;

**: по сравнению с изопреналином;

#: цАМФ для β1 и β2, Са²⁺ для а1А; н.о. - не определяли.

Соединение по изобретению (соединение А) является сильным и селективным агонистом β2 АК с очень низкой внутренней эффективностью в отношении β 1 АК и отсутствием активности в отношении а1А АК. Его энантиомер соединение В является слабым в отношении β2 АК с ЕС₅₀ 9 5 0 нМ.

Пример 11. Действие формотерола и соединения А на скелетные мышцы и массу сердца ίη νίνο.

Самцов крыс М1з1аг Нап Ю8 (1п£егпаЕопа1 Оепебс 8£апбагб) (Сг1:^1(Нап)) массой 350-400 г приобретали у СЕаг1ез Ккег ЕаЪога£опез. Крыс акклиматизировали к окружающей среде в течение 7 дней. Животных размещали в группы по 3 животных при 25°С с циклом свет-темнота 12:12 ч. Они получали стандартный лабораторный корм, содержащий 18,2% белка и 3,0% жира с энергетической ценностью 15,8 МДж/кг (КАЕАО 3890, КНЪа, Вазе1, 8\сЕ/ег1апб). Пищу и воду обеспечивали по потребности. Формотерол или соединение А растворяли в носителе, показанном ниже, для достижения диапазона доз 0,0030,03 мг/кг/сутки для формотерола и 0,01-0,1 мг/кг/сутки для соединения А с помощью Аке! модели 2МЕ4 в течение 28 дней. Помпы заполняли раствором и держали в течение нескольких часов при 37°С в РВ8 вплоть до хирургической имплантации. Крысам подкожно вводили Тетдез1с в дозе 0,02 мг/кг с объемом 1 мл/кг по меньшей мере за 30 мин перед операцией, и затем помпы, заполненные раствором, указанным выше, имплантировали подкожно в спину крыс под анестезией изофлураном в концентрации 3%. Тетдез1с вводили подкожно крысам через 24 ч и 48 ч после операции. Массу тела измеряли два раза в неделю. Клипсы удаляли через 10 дней после операции под анестезией. Через четыре недели после лечения крыс умерщвляли с помощью СО₂, и переднюю малоберцовую, икроножную и камбаловидную мышцы, сердце и головной мозг иссекали и взвешивали. Массу головного мозга использовали для нормализации массы органов. Результаты выражены как среднее ± 8ЕМ. Статистический анализ проводили с использованием критерия множественного сравнения Даннетта с последующим односторонним дисперсионным анализом для сравнения групп лечения с контрольной группой. Различия расценивали как достоверные, когда значение вероятности составляло <0,05: *: статистический анализ проводили посредством ОгарЕРаб Рпзт νе^з^οη 5.0 (ОгарЕРаб 8оИ\саге, 1пс., Еа бо11а, СА). Массу мышц нормализовали относительно массы тела в день 0 (исходная масса тела) и массу сердца нормализовали относительно массы головного мозга.

Исследование 1. Формотерол_

Группа	Лечение	Доза (мг/кг)	Путь	Схема
1	Носитель*	0	п/к	Минипомпа ΑΙζθΗ 2МЪ4 в течение 4 недель
2	формотерол	0, 003
3	формотерол	0, 01
4	формотерол	0, 03

^Носитель: 20% 1:2 кремофор:этанол в солевом растворе (0,9% №С1).

- 20 029946

Исследование 2. Соединение А

Группа	Лечение	Доза (мг/кг)	Путь	Схема
1	Носитель*	0	п/к	Минипомпа А1геС 2МЬ4 в течение 4 недель
2	Соединение А	0, 01
3	Соединение А	0, 03
4	Соединение А	о, 1

*Носитель: 20% 1:2 кремофор:этанол в солевом растворе (0,9% КаС1).

На фиг. 1 показано, что формотерол индуцирует и гипертрофию скелетных мышц, и увеличение массы сердца в той же степени, тогда как соединение А индуцирует гипертрофию скелетных мышц с минимальным влиянием на массу сердца, показывая, что соединение А оказывает селективный эффект на скелетные мышцы относительно сердечной мышцы. Соединение А достоверно индуцирует гипертрофию скелетных мышц на 11% в дозе 0,01 мг/кг/сутки со стабильной концентрацией в плазме ~0,2 нМ, тогда как не было изменений в отношении гистопатогистологии сердца даже в дозе 0,1 мг/кг/день со стабильной концентрацией ~2 нМ.

Пример 12. Действие формотерола и соединения А на функцию изолированных органов (сокращение левого предсердия, частота сокращений синоатриального узла и автоматизм всего сердца).

Метод.

Сокращение левого предсердия. Анализ сокращения левого предсердия проводили в Кюегса Βίοδοίοηοοδ, ББС (каталожный номер 407500 Адгепегдю Ье!а1), с использованием левых предсердий морских свинок Бипкт НагНеу с массой тела 600±80 г (АгсН. Ιπί. Рйагтасодуп. 1971:191:133-141).

Частота сокращений синоатриального узла. Белых самок новозеландского кролика умерщвляли путем кровопускания под глубокой анестезией с использованием смеси кетамин/ксилазин, в/в. Сердце быстро удаляли и помещали в раствор Тирода. Указанный раствор непрерывно заполняли газом 95% О₂, 5% СО₂, и предварительно нагревали до приблизительно 36±0,5°С. Правое предсердие отделяли от остальной части сердца. Препараты помещали в тканевую баню и держали при 37±0,5°С в течение по меньшей мере 1 ч стабилизации. Потенциалы действия (ПД) регистрировали внутриклеточно с помощью стандартного стеклянного микроэлектрода, заполненного 3М КС1, соединенного с усилителем нейтрализации высокого входного сопротивления (УБ-180 микроэлектродный усилитель, Вю-Бодю). ПД отображались на цифровом осциллоскопе (НМ-407 осциллоскоп, НЛМЕО), их анализировали посредством системы обработки данных высокого разрешения (программное обеспечение ΝοΐοοοΜ Нет 4.2, Νοΐοοοίά δΑ, С^ο^δδу, Бгапсе). После 1 ч стабилизации соединения добавляли в раствор Тирода в увеличивающихся концентрациях, каждую концентрацию поддерживали в течение 30 мин. Между двумя концентрациями не было отмывок. Электрофизиологические измерения получали во время протокола эксперимента в конце периода перфузии 30 мин путем анализа действия потенциалов. Спонтанную частоту δΑ оценивали путем подсчета количества сокращений каждые 10 с, чтобы получить результаты количества ударов в минуту (уд./мин). Данные представлены как среднее ± δΕΜ.

Автоматизм. Автоматизм оценивали в выделенных перфузируемых сердцах кроликов по БапдепάοιΐΕ, проводимых I НтбецНет РНагтасеиНсаБ ^^N4^ Ν.ν., В-8400 Οοδΐеηάе, Ве1дшт. Тест проводили на сердцах самок кроликов-альбиносов массой примерно 2,5 кг и имеющих возраст приблизительно 3 месяца. Действие соединения измеряли в полностью автоматизированной модели с использованием выделенных сердец кроликов, перфузируемых в соответствии с методикой 1.01^110()14. Спонтанно сокращающееся сердце ретроградно перфузировали увеличивающимися концентрациями исследуемого соединения. Один электрод аккуратно помещали на левое предсердие с целью записи продолжительности цикла автоматизма синусового узла.

На фиг. 2а и 2Ь показаны результаты, полученные при сравнении формотерола с соединением по изобретению (соединение А).

Соединение А не показало эффекта относительно сокращения левого предсердия до 10 мкМ и менее прямых эффектов на активность водителя ритма по сравнению с формотеролом.

- 21 029946

Значения на фиг. 2а и 2Ь выражены как среднее ± ЗЕМ; синоатриальный узел (п=6), выделенное сердце (п=3).

Пример 13. Действие формотерола и соединения А на частоту сердечных сокращений Ιη νίνο.

Крыс \\н81аг Нап (^-Н) ЮЗ (1п1етаПопа1 ОепеНс 31апс1агс1) (Сг1:^1 (Нап)) приобретали у СЬаг1е8 КЕег ЬаЬогаЩпез. Катетеры в бедренную артерию и вену имплантировали на постоянной основе и выводили наружу посредством пружинной узловой подвижной системы и помещали в специализированные камеры. Артериальный катетер соединяли с датчиком давления для непрерывного измерения пульсового давления, среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений, которые получали из сигнала артериального давления, посредством цифровой системы регистрации данных. Соединения вводили посредством п/к катетера, имплантированного через складку кожи. Значения представлены как среднее ± ЗЕМ (п=3).

Соединение А показало меньшее увеличение частоты сердечных сокращений по сравнению с формотеролом при введении п/к болюсом, до 0,3 мг/кг, как показано на фиг. 3а, 3Ь и 3с.

Пример 14. Действие формотерола и соединения А на частоту сердечных сокращений ш νί\Ό.

Резус макак, 24 самки с массой тела примерно 4-8 кг, рандомизировали на 4 группы с п=6. Животных обездвиживали на стуле в течение до 4 ч после однократного подкожного введения соединений и затем возвращали в их камеры. Частоту сердечных сокращений измеряли с использованием устройства Зшд^е1 У3304. Значения выражены как среднее ± ЗЕМ (п=6).

Соединение А показало меньшее увеличение частоты сердечных сокращений по сравнению с формотеролом при введении в виде п/к болюса до 0,03 мг/кг, как показано на фиг. 4а и 4Ь.

Пример 15. Действие соединения А, его энантиомера (соединения В) и его рацемата (соединения А/В) на рецептор серотонина 5-НТ_2С.

Мембраны человеческих рекомбинантных клеток СНО Ьг5-НТ_2С (Вю81дпа1 Раскагб, иЗА) и ³НМе§и1ег§1пе (NЕN 1нГе Зс1епсе Ргобнс18, иЗА, 1 нМ) использовали для измерения аффинности связывания соединений с рецептором 5-НТ_2С человека. Неспецифическое связывание оценивали в присутствии 1 мкМ Ме§и1ег§1пе. Пятьдесят мкл каждого из мембран, лиганда и соединения в общем объеме 250 мкл инкубировали в 96-луночных планшетах в течение 60 мин при 22°С в буфере, содержащем 50 мМ Ττΐδ, 0,1% аскорбиновой кислоты, 10 мкМ паргилина, рН 7,7. Планшеты фильтровали, промывали 3 раза в ледяном 50 мМ Ττΐδ, сушили и измеряли в ТорсоипТ

Клетки СНО-К1, коэкспрессирующие митохондриальный апоэкворин, рекомбинантный 5-НТ_2Спе серотонина и случайный О белок Оа₁₆, выращенные до середины фазы логарифмического роста в культуральной среде без антибиотиков, открепляли с помощью РВЗ-ЕИТА, центрифугировали и ресуспендировали в аналитическом буфере (ИМЕМ/НАМ'8 Р12 с НЕРЕЗ, без фенола красного + 0,1% ВЗА без протеазы) в концентрации 1х10⁶ клеток/мл. Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 4 ч с коэлентеразином Ь. Контрольным агонистом был а-метил-5-НТ. Для исследования агониста 50 мкл суспензии клеток смешивали с 50 мкл тестируемого или контрольного агониста в 96луночном планшете. Полученное излучение света регистрировали с использованием люминометра системы функционального скрининга лекарственных средств Натата18н 6000 (Г1)ЗЗ 6000).

Агонистическую активность тестируемого соединения выражали как процент активности контр ольного агониста в его концентрации ЕС1₀₀.__

5-НТ2с серотонин	Связывание	СНО ЕС50 (Етах %)
5-НТ	н. о.	0,24 нМ
Соединение А (К)	11 мкМ	280 нМ (83%)
Соединение В (5)	0,8 мкМ	19,7 нМ (99%)
Соединение А/В	1,7 мкМ	25 нМ (113%)

Соединение А было в 50 раз менее активным в отношении 5-НТ_2С при сравнении с β2 АК агонистической активностью (5,6 нМ), тогда как его энантиомер-соединение В было очень слабым в отношении β2 АК с ЕС₅₀ 950 нМ, но гораздо более сильным в отношении 5-НТ_2С с ЕС₅₀ 19,7 нМ, показывая обратную селективность в отношении цели.

Соединение А также было более чем в 10 раз менее активным в отношении 5-НТ_2С при сравнении с рацематом или (З) энантиомером, предполагая, что профиль побочных эффектов указанного соединения является преимущественным.

Claims (3)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Кристаллическая форма ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она.

2. Кристаллическая форма по п.1, отличающаяся порошковой рентгеновской дифрактограммой,

- 22 029946

включающей три пика, имеющих значения угла рефракции 2θ, выбранные из 8,8±0,2°, 16,4±0,2°, 20,8±0,2° при измерении с использованием излучения СиК_а.

3. Кристаллическая форма ацетатной соли (К)-7-(2-(1-(4-бутоксифенил)-2-метилпропан-2-иламино)1-гидроксиэтил)-5-гидроксибензо[б]тиазол-2(3Н)-она по п.1, которая имеет порошковую рентгеновскую дифрактограмму, по существу, такую же, как порошковая рентгеновская дифрактограмма, показанная на