EA029170B1 - Наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели и наночастицы оксидов железа, биосовместимые водные коллоидные системы, включающие в себя наночастицы, феррилипосомы, и их использование - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены способы получения наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели и наночастиц оксидов железа на основе механохимического синтеза, наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели и наночастицы оксидов железа сверхмалого размера с большой удельной поверхностью, получаемые данными способами, биосовместимые водные коллоидные системы, включающие в себя наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели и наночастицы оксидов железа, феррилипосомы, содержащие наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели и наночастицы оксидов железа, и способы их применения в медицине.

Description

изобретение относится к способам изготовления наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, согласно формуле (III)

Со_хРе₃._хО₄ (III)

включающий следующие шаги: ί) смешение РеС1₃, СоС1₂, Ыа₂СО₃

и Са(ОН)₂ предпочтительно в соотношении приблизительно

- 5 029170

2:1:3:1,

ΐΐ) добавление №С1 к смеси, полученной в шаге ΐ),

ΐΐΐ) истирание и/или измельчение смеси, полученной в шаге ΐΐ),

предпочтительно истирание в планетарной мельнице, более предпочтительно герметизация смеси ΐΐ) в стальном цилиндре со стальными шарами и истирание в планетарной мельнице, и где истирание выполняют предпочтительно приблизительно от 5 мин до приблизительно до 3 ч, в особенности от приблизительно 10 мин до приблизительно 60 мин,

ίν) промывание и/или просушивание продукта ΐΐΐ) по необходимости,

характеризующийся тем, что РеС1₃ и СоС1₂ в шаге ΐ) находятся в форме кристаллогидратов солей, и характеризующийся добавлением №С1 к смеси ΐ) предпочтительно в соотношении от приблизительно 1:0,5 до приблизительно 1:4, предпочтительно от приблизительно 1:2 до при близительно 1:3 смеси ΐ) к КаС1.

Реакция идет следующим путем:

2РеС1₃ + СоС1₂ + Са(ОН)₂ + ЗЫа₂СО₃ = Со_хРе₃._хО₄ + СаС1₂ + 6№С1 + ЗСОД + Н₂О, где 0.1<х<0.99, предпочтительно 0.6<х<0.98.

В одном предпочтительном воплощении используют кристалогидрат соли РеС1₃-6Н₂О и кристаллогидрат соли СоС1₂-6Н₂О.

В другом предпочтительном воплощении соотношение массы стальных шаров к массе реакционной смеси согласно шага ΐΐ) является приблизительно от 1:1 до 50:1, предпочтительно приблизительно 20:1.

Непременными условиями для достижения заданного технического эффекта изобретения являются строгое соблюдение соотношений массы реакционной смеси к массе инертного компонента, равного приблизительно от 1:2 до 1:3, и массы порошка (реакционной смеси) к массе шаров предпочтительно приблизительно 1:20 и времени осуществления механохимического синтеза в течение от 10-60 мин.

В другом предпочтительном воплощении атмосферой в планетарной мельнице служат вакуум, воздух или инертный газ, в особенности Аг.

В другом предпочтительном воплощении механохимический синтез в планетарной мельнице осуществляется в планетарной мельнице МНВ (мельница с водяным охлаждением).

В другом предпочтительном воплощении механохимический синтез в планетарной мельнице осуществляется в планетарной мельнице с весом от приблизительно 30 до приблизительно 100 г, предпочтительно приблизительно 60 г.

В другом предпочтительном воплощении промывание наночастиц в соответствии с методами по данному изобретению осуществляется путем промывания в дистиллированной воде.

В другом предпочтительном воплощении промывание наночастиц в соответствии с методами по данному изобретению осуществляется путем промывания на фильтре.

В другом предпочтительном воплощении промывание наночастиц в соответствии с методами по данному изобретению осуществляется до полного вымывания солей из фильтра.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к наночастицам оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, полученным вышеописанным способом и в соответствии с формулой

Со_хРе₃-_хО_4;

где 0.1<х<0.99, предпочтительно 0.6<х<0.98.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к наночастицам оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, полученным вышеописанным способом согласно настоящего изобретения с размером наночастиц менее 50 нм, в особенности менее 15 нм и высокой удельной поверхностью, лежащей в пределах значений от 50-200 м²/г, в особенности 100-160 м²/г.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу изготовления наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели согласно формуле (IV)

Мп_хРе₃._хО₄ (IV)

включающий следующие шаги:

ΐ) смешение РеС1₃, МпО₂, №₂СО₃ и ΝαΟΗ предпочтительнов в соотношении приблизительно 2:1:6,

ΐΐ) добавление №С1 к смеси, полученной в шаге ΐ),

ΐΐΐ) истирание и/или измельчение смеси, полученной в шаге ΐΐ),

предпочтительно истирание в планетарной мельнице, более предпочтительно герметизация смеси ΐΐ) в стальном цилиндре со стальными шарами и истирание в планетарной мельнице, и где истирание выполняют предпочтительно приблизительно от 5 мин до приблизительно до 3 ч, в особенности от приблизительно 10 мин до приблизительно 60 мин,

ΐν) промывание и/или просушивание продукта ΐΐΐ) по необходимости,

характеризующийся тем, что РеС1₃ и СоС1₂ в шаге ΐ) находятся в форме кристаллогидратов солей, и характеризующийся добавлением №С1 к смеси ΐ) предпочтительно в соотношении от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:3 смеси ΐ) к №С1.

Реакция идет следующим путем:

- 6 029170

2РеС1₃ 6Н₂О + ΜηΟ₂ + 6ЯаОН -> Мп_хРе₃._хО₄ +6ИаС1 + 15Н₂О + 1/2О₂, где 0.1<х<0.99, предпочтительно 0.6<х<0.98.

В одном предпочтительном воплощении используют кристалогидрат соли РеС1₃-6Н₂О. В другом предпочтительном воплощении соотношение массы стальных шаров к массе реакционной смеси согласно шага ΐΐ) является приблизительно от 1:1 до 50:1, предпочтительно приблизительно 20:1.

В другом предпочтительном воплощении атмосферой в планетарной мельнице служат вакуум, воздух или инертный газ, в особенности Аг.

В другом предпочтительном воплощении механохимический синтез в планетарной мельнице осуществляется в планетарной мельнице МПВ (мельница с водяным охлаждением).

В другом предпочтительном воплощении механохимический синтез в планетарной мельнице осуществляется в планетарной мельнице с весом от приблизительно 30 до приблизительно 100 г, предпочтительно приблизительно 60 г.

В другом предпочтительном воплощении промывание наночастиц в соответствии с методами по данному изобретению осуществляется путем промывания в дистиллированной воде.

В другом предпочтительном воплощении промывание наночастиц в соответствии с методами по данному изобретению осуществляется путем промывания на фильтре.

В другом предпочтительном воплощении промывание наночастиц в соответствии с методами по данному изобретению осуществляется до полного вымывания солей из фильтра.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к наночастицам оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, полученным вышеописанным способом и в соотвествии с формулой Мп_хРе_3-хО₄, где 0.1<х<0.99, предпочтительно 0.6<х<0.98.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к наночастицам оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, полученным вышеописанным способом согласно настоящего изобретения с размером наночастиц менее 50 нм, в особенности менее 15 нм и высокой удельной поверхностью, лежащей в пределах значений от 50-200 м²/г, в особенности 100-160 м²/г.

Как показано в примерах, было доказано, что новейшие наночастицы оксида железа являются ультрамелкими и сферическими с узким распределением по размеру и высокой удельной площадью поверхности и могли бы быть успешно сформированы в стабильную коллоидную систему. Более того, частицы обладают более высокой релаксивностью, чем коммерческие МРТ контрастные агенты, обеспечивая сверхчувствительное МРТ исследование, (фиг. 2а). Кроме того, было обнаружено улучшение релаксивности г₂ 20-70% по сравнению с лучшими наночастицами оксидов железа, описанных в литературе. Кроме того, было показано, что наночастиц нетоксичные (примеры 14 и 18) и на удивление эффективны для целевой доставки ΐη νίνο.

Как показано в примере 2 получение наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели химического состава Со_хРе_3-хО₄, где 0.1<х<0.99, позволяет получить целевой продукт, обладающий высокими контрастными свойствами при Т₁ и Т₂-релаксации (фиг. 26, 27).

В предпочтительном воплощении полученные наночастицы оксидов железа или оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению имеют диаметр от приблизительно 1 до приблизительно 50 нм, предпочтительно от 1 до приблизительно 30 нм и еще более предпочтительно от приблизительно 1 до 15 нм.

В другом предпочтительном воплощении более 70% наночастиц оксидов железа или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению имеют диаметр менее чем приблизительно 8 нм. В предпочтительном варианте более чем приблизительно 70%, в более предпочтительном варианте более чем приблизительно 80% наночастиц имеют диаметр более чем приблизительно 1 нм.

Новые наночастицы оксидов железа по данному изобретению имеют распределение по размеру, указанное в примере 1.

Таким образом, в другом воплощении настоящее изобретение относится к классу частиц оксидов железа и/или частиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, получаемых вышеописанными способами, в особенности в которых по меньшей мере приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, наночастиц имеют:

ΐ) диаметр менее чем приблизительно 50 нм, более предпочтительно менее чем приблизительно 30 нм, еще более предпочтительно менее чем приблизительно 15 нм, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 8 нм, и/или

ΐΐ) диаметр по меньшей мере приблизительно 1 нм, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 3 нм, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 5 нм.

В другом предпочтительном воплощении отрицательный дзета-потенциал поверхности наночастиц оксидов железа и/или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению варьируется от приблизительно 20 до приблизительно 30 мВ, в особенности от приблизительно 28 мВ при рН 7,4 и 37°С. Новые наночастицы оксидов железа по данному изобретению имеют дзета- 7 029170

потенциал, указанный в примерах.

В другом предпочтительном воплощении способ изготовления наночастиц оксидов железа или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению далее включает этап суспендирования наночастиц оксидов железа или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в биосовместимом солевом растворе.

В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет собой суспензию наночастиц оксидов железа по данному изобретению или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению, получаемых вышеописанным образом.

В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет собой способ изготовления биосовместимой водной коллоидной системы, содержащей наночастицы оксидов железа или наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, который состоит из следующих этапов:

ί) суспендирование наночастиц оксидов железа или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, предпочтительно наночастиц оксидов железа или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в виде порошка в биосовместимом солевом растворе,

ίί) разрушение образующихся в ί) агломератов с помощью ультразвука, предпочтительно разрушение с помощью ультразвукового дезинтегратора, в особенности разрушение с помощью ультразвукового дезинтегратора с частотой от приблизительно 10 до приблизительно 40 кГц, предпочтительно приблизительно 20 кГ ц,

ίίί) удаление оставшихся агломератов путем центрифугирования предпочтительно при ускорении от приблизительно 100 до приблизительно 1000 г, более предпочтительно от приблизительно 200 до приблизительно 800 г, еще более предпочтительно при приблизительно 500 г.

В предпочтительном воплощении данного изобретения в шаге ί) используются наночастицы оксидов железа или наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению.

Неожиданно было выявлено образование устойчивых коллоидных систем без образования агломератов (см. пример 3), что служит предпосылкой для их применения в медицине.

В другом предпочтительном воплощении на этапе ί) описываемого метода могут быть использованы такие наночастицы оксидов железа как Еспбсх®. ферукарботран, §НИ 555С или цинксодержащие частицы, раскрываемые в патенте \УО 2008/127031. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения биосовместимый солевой раствор содержит по меньшей мере один компонент буфера, в особенности по меньшей мере один компонент буфера, выбранный из группы, включающей цитрат, ΗΕΡΕδ ΛΌΆ, Бицин, МЕ§ и Трис, в особенности цитрат и ΗΕΡΕδ с общей концентрацией компонентов буфера от приблизительно 5 до приблизительно 100 мМ, еще более предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 70 мМ. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения биосовместимый солевой раствор состоит из от приблизительно 50 до приблизительно 500 мМ ЫаС1, предпочтительно от приблизительно 80 до приблизительно 400 мМ ЫаС1, более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 350 мМ ЫаС1, еще более предпочтительно приблизительно 108 мМ ЫаС1.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения биосовместимый солевой раствор имеет рН от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0, предпочтительно от приблизительно 5,5 до приблизительно 9,0, более предпочтительно от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5, еще более предпочтительно приблизительно 7,4.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения биосовместимый солевой раствор содержит, в особенности состоит из 20 мМ цитрата натрия, 108 мМ ЫаС1 и 10 мМ ΗΕΡΕδ, при этом рН биосовместимого солевого раствора составляет 7,4, что соостветствует физиологическому значению.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения биосовместимый солевой раствор является стерильным.

В другом воплощении настоящее изобретение представляет собой биосовместимую водную коллоидную систему, содержащую наночастицы оксидов железа или наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, получаемые в соответствии со способами по данному изобретению для изготовления биосовместимой водной коллоидной системы.

В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет собой способ изготовления феррилипосом, включающий:

ί) гидратирование сухой липидной пленки, содержащей по меньшей мере один липид, предпочтительно по меньшей мере один фосфолипид с помощью биосовместимой водной коллоидной системы по данному изобретению или суспензии по данному изобретению,

ίί) получение липосом предпочтительно методом экструзии или ультразвуковой сонификации, более предпочтительно методом экструзии, и

ш) промывание и/или отделение феррилипосом по необходимости.

В предпочтительном воплощении шаг ίίί) включает:

а) удаление неинкапсулированных частиц оксидов железа предпочтительно путем гель-фильтрации,

б) отделение феррилипосом магнитным способом, в особенности с помощью магнитного разделителя, и

- 8 029170

в) по необходимости промывание феррилипосом и/или суспендирование феррилипосом в растворе, в особенности в биосовместимом солевом растворе.

В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет собой феррилипосому, ί) получаемую в соответствии со способом изготовления феррилипосом по данному изобретению и/или и) содержащую:

а) по меньшей мере одну наночастицу оксидов железа и/или наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению, или по меньшей мере одну наночастицу оксидов железа и/или наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели из суспензии по данному изобретению, или по меньшей мере одну наночастицу оксидов железа и/или наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели из биосовместимой водной коллоидной системы по данному изобретению, и

б) по меньшей мере один липид, в особенности один фосфолипид. Феррилипосомы по настоящему изобретению чрезвычайно эффективны при направленной доставке ίη νίνο и ίη νίίτο, как показано в примерах 8, 10, 15, 16 и 21, а также в параграфах "Подавление роста опухоли молочной железы при феррилипосомной доставке 1РМ-565" и "Эффективность феррилипосом как системы доставки лекарств ίη νίνο по данным МРТ". Также показано, что феррилипосомы нетоксичны (пример 14).

В предпочтительном воплощении способ изготовления феррилипосом по данному изобретению или феррилипосома по данному изобретению, отличаются тем, что:

а) по крайней мере одним фосфолипидом является фосфатидилхолин, а именно Ь-афосфатидилхолин, и/или

б) феррилипосомы по данному изобретению или сухая липидная пленка, используемая при изготовлении феррилипосом по данному изобретению, в дальнейшем содержат один пегилированный липид (ПЭГ-липид), в особенности 1,2-дистеарил-8п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-П-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000].

Из фиг. 7 видно, что степень поглощения макрофагами пегилированных феррилипосом по данному изобретению существенно снижена. Известно, что модификация поверхности липосом полиэтиленгликолем резко снижает опсонизацию липосом и их последующее устранение ретикулоэндотелиальной (мононуклеарной фагоцитарной) системой, тем самым значительно увеличивая полупериод циркуляции. Это было подтверждено в ходе эксперимента на клетках, результат которого проиллюстрирован на фиг. 7. Благодаря размеру, гидрофобным и гидрофильным особенностям, биосовместимости, а также наличию внутреннего незаполненного пространства (см. фиг. 7) система феррилипосом по данному изобретению позволяет одновременную инкапсуляцию наночастиц оксидов железа или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели вместе с другими веществами, такими как терапевтически активные вещества, и их последующую направленную доставку в организме млекопитающих, более предпочтительно человека.

В примерах показано, что феррилипосомы по данному изобретению являются магниточувствительными и могут воздействовать как на опухоль, так и на ее микроокружение. Наноразмерные феррилипосомы демонстрируют исключительные свойства в качестве контрастного средства для Т₂ магнитно-резонансного сканирования (г₂=573-1286 с^-1 мМ^-1) ίη νίίτο и ίη νίνο в опытах на трансгенных мышах-опухоленосителях, позволяя неинвазивное наблюдение за доставкой лекарственных средств. При исследовании ίη νίνο обнаружено успешное поражение микроокружения опухоли и накопление средства, доставляемого с помощью феррилипосом. В результате направленной доставки ингибитора протеаз, вырабатываемых опухолью, к опухоли молочной железы у мышей и ее микроокружению значительно сократился размер опухоли по сравнению с системной доставкой того же лекарственного средства.

В предпочтительном воплощении феррилипосома по данному изобретению в дальнейшем содержит по меньшей мере одно терапевтически активное вещество, и/или по меньшей мере одно диагностически активное вещество, и/или по меньшей мере одно вещество, позволяющее нацеливание феррилипосомы, предпочтительно

ί) в которой терапевтически активное вещество и/или диагностически активное вещество включено в липосому или интегрировано в бислой, и/или

ίί) в которой по меньшей мере одно терапевтически активное вещество выбирается из группы, включающей токсин, химиотерапевтическое средство, в особенности алкилирующий агент, и/или антиметаболит, и/или растительный алкалоид, и/или таксан, и/или ингибитор топоизомеразы, и/или антибластомное средство, более предпочтительно доксорубицин, радиоактивное вещество, ингибитор протеазы, в особенности ингибитор катепсина, более предпочтительно 1РМ-565, препарат, вызывающий апоптоз, и противовоспалительное средство, в особенности нестероидные противовоспалительные средства, предпочтительно выбранные из группы, включающей салицилат, производное пропионовой кислоты, производное уксусной кислоты, производное эноловой кислоты и производное фенамовой кислоты, селективный ингибитор ЦОГ-2 и сульфонанилид или в особенности стероидные противовоспалительные средства, предпочтительно глюкокортикоид, и/или

ш) в которой по меньшей мере одно диагностически активное вещество выбрано из группы, включающей радиоактивное вещество, парамагнитное вещество, визуализирующий агент для ПЭТ, визуали- 9 029170

зирующий агент для МРТ, флуорофор, в особенности А1еха Ииот, хромофор, фосфоресцирующее вещество, хемолюминесцентное вещество и биолюминесцентное вещество.

Как показано в примерах, доксорубицин и ингибитор катепсинов можно с успехом нацеливать на приблизительноопухолевую область при раке молочной железы у мышей, что значительно сокращает рост опухоли без каких-либо неблагоприятных эффектов (см. примеры, параграф "Подавление роста опухоли молочной железы при феррилипосомной доставке ΙΡΜ-565", примеры 9 и 15).

В одном из воплощений настоящее изобретение представляет собой феррилипосому по данному изобретению, или наночастицу оксидов железа по данному изобретению, и/или наночастицу оксидов ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению для применения в медицине, в особенности:

ί) для применения в диагностике заболеваний, предпочтительно неопластических, нейронных и/или воспалительных заболеваний, и/или

ίί) для применения в качестве МРТ-контрастных средств.

В другом воплощении настоящее изобретение представляет собой феррилипосому по данному изобретению, или наночастицу оксидов железа по данному изобретению, и/или наночастицу оксидов ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению для изготовления медикаментов и/или диагностических средств, в особенности:

ί) для диагностики заболеваний, предпочтительно неопластических, нейронных и/или воспалительных заболеваний, и/или

ίί) для изготовления МРТ-контрастных средств.

В другом воплощении настоящее изобретение представляет собой метод диагностирования и/или лечения заболевания, предпочтительно неопластического, нейронного и/или воспалительного заболевания, который подразумевает введение пациенту диагностически и/или терапевтически эффективной дозы феррилипосом по данному изобретению, или наночастиц оксидов железа по данному изобретению, или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению. В предпочтительном воплощении пациентом является млекопитающее, в особенности человек.

В предпочтительном воплощении данный метод в дальнейшем подразумевает применение магнита для создания магнитного поля, в особенности приложение магнитного поля локально в месте, подлежащем диагностике и/или лечению. Как правило, магнитное поле находится в диапазоне от приблизительно 0,3 до приблизительно 4,5 Тл, в особенности в диапазоне от приблизительно 1,0 до приблизительно 3,5 Тл.

Настоящее изобретение в дальнейшем представляет собой наночастицы оксидов железа и наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, а также феррилипосомы, которые обеспечивают направленную доставку наночастиц и феррилипосом соответственно к месту исследования с помощью магнитного поля. Таким образом, наночастицы оксидов железа и наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, а также феррилипосомы при магнитно-резонансной визуализации представляют собой (МРТ) - видимые системы доставки лекарств. Наночастицы оксидов железа и наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, а также феррилипосомы пригодны для определения распределения лекарств с помощью МРТ, а также для органо-, ткане- и/или сайт-специфической доставки лекарств.

Наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели и наночастицы оксидов железа могут изготавливаться и применяться в виде фармацевтического препарата.

Поэтому настоящее изобретение также представляет собой фармацевтический препарат, содержащий по меньшей мере одну феррилипосому по данному изобретению, или наночастицу оксидов железа по данному изобретению, или наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению, или биосовместимую водную коллоидную систему по данному изобретению.

Фармацевтический препарат по данному изобретению содержит терапевтически и/или диагностически эффективные дозы наночастиц оксидов ферримагнетиков со структурой шпинели и/или наночастиц оксидов железа, и/или феррилипосом по данному изобретению и, как правило, соответствующий фармацевтический носитель, разбавитель или наполнитель, например стерильную воду, физиологический раствор, бактериостатический раствор, т.е. раствор, содержащий 0,9% мг/мл бензилового спирта, фосфатный буферный раствор, раствор Хенкса, раствор Рингера лактат, лактозу, декстрозу, сахарозу, трегалозу, сорбит, маннит и т.п. В предпочтительном воплощении может использоваться состав в виде биосовместимого раствора по данному изобретению, который факультативно содержит нижеуказанные наполнители и добавки. В другом предпочтительном воплощении может использоваться биосовместимая водная коллоидная система по данному изобретению, которая факультативно содержит нижеуказанные наполнители и добавки. Препарат, как правило, представляет собой коллоидную или дисперсную систему или суспензию. Его введение осуществляется при помощи системы внутривенно, перорально, подкожно, внутримышечно, в виде ингаляций, путем вдыхания и/или приема лекарственных средств с замедленным высвобождением. Предпочтительно введение препарата осуществляется при помощи системы, а именно внутривенно.

Термин "терапевтически эффективная доза" в общем смысле означает количество терапевтически

- 10 029170

активного вещества в соответствующих случаях, в результате применения которого достигается желаемый терапевтический эффект. Типичный диапазон доз составляет от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 1000 мг за один прием.

Термин "диагностически эффективная доза" в общем смысле означает количество наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели и/или наночастиц оксидов железа и/или феррилипосом по данному изобретению, в результате применения которого достигается ожидаемый диагностический эффект без нежелательных побочных эффектов. Типичный диапазон доз составляет от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 1000 мг за один прием.

Обычно введение пациенту наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, и/или наночастиц оксидов железа, и/или феррилипосом, и/или фармацевтического препарата пациенту осуществляется один или несколько раз, например один или несколько раз в день, или один или несколько раз в неделю, или в течение более длительного периода времени в зависимости от конкретного случая. В диагностических целях может быть достаточно однократного применения.

В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет собой носитель, включающий по меньшей мере одну наночастицу оксидов железа и/или наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению, или по меньшей мере одну наночастицу оксидов железа, и/или наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели из суспензии по данному изобретению, или по меньшей мере одну наночастицу оксидов железа, и/или наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели из биосовместимой водной коллоидной системы по данному изобретению, в которой предпочтительно носитель выбран из группы, включающей нанотрубку, липосому, липоплекс, полимерсому, мицеллу, наногель, наночастицу мезопористого кремнезема, дендример и нанооболочку, в особенности носителем является липосома.

В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет собой комплект, включающий:

а) по меньшей мере одну феррилипосому по данному изобретению, и/или по меньшей мере одну наночастицу оксидов железа, и/или по меньшей мере одну наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению, и

б) по меньшей мере один магнит.

В одном из воплощений наночастицы оксидов железа могут использоваться в качестве контрастных веществ для Т₂ магнитно-резонансного сканирования. Негативный контраст при Т₂-сканировании ярко выражен, так как на Т₂-взвешенных изображениях МР-сигнал затухает вблизи места накопления контрастного вещества.

В одном из воплощений наночастицы оксидов способствуют усилению контрастности на МРТ изображениях и/или усилению сигнала. В предпочтительном воплощении усиленный сигнал обеспечивает более короткие времена экспозиции, и/или более высокое пространственное разрешение, и/или уменьшение дозы контрастного средства.

В другом воплощении наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в соотвтствии с формулой Со_хРез_-хО4 могут быть использованы как Т₁ и Т₂ контрастных средств.

Под словом "приблизительно" по данному изобретению понимается диапазон экспериментальных ошибок, в особенности ±5 или ±10%.

Под термином "наночастица" по данному изобретению понимается частица диаметром, который в по меньшей мере одном измерении превышает по меньшей мере приблизительно 1 нм, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 нм, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 нм. В предпочтительном воплощении наночастица имеет диаметр, который по меньшей мере в двух измерениях, предпочтительно по меньшей мере в трех измерениях превышает по меньшей мере приблизительно 1 нм, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 нм, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 нм при определении методом динамического рассеяния света, как описано в примерах. В предпочтительном воплощении наночастица имеет сферическую форму. В дальнейшем предпочтительном воплощении размер наночастицы составляет менее чем приблизительно 1 мкм, предпочтительно менее чем 150 нм в диаметре по меньшей мере в одном измерении, предпочтительно по меньшей мере в двух измерениях, более предпочтительно по меньшей мере в трех измерениях.

Под термином "наночастица оксидов железа" по данному изобретению понимаются наночастицы, состоящие из по меньшей мере приблизительно 80%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% оксида железа. В частности, под оксидом железа понимается Ре₃О₄ или РеО-Ре₂О₃.

Под термином "шпинель" по данному изобретению понимаются соединения формулы

где А - двухвалентный металл, предпочтительно Ре²⁺, Си, Со, Νί, Мд или Мп, в особенности А Ре²⁺, и где В - 3- или 4-валентный металл, например А1, Ре³⁺, V, Сг, Тц в особенности В - Ре³⁺, и где у=0 или 1.

Под термином "оксидные ферримагнетики со структурой шпинели" по данному изобретению по- 11 029170

нимается шпинель с формулой М²⁺Ре³⁺2О₄ или ΜΙΙΟ Ре₂О₃, где М - двухвалентный металл, предпочтительно Ре²⁺, Си, Со, Νί или Мп, в особенности Ре²⁺. Соответствующие оксидные ферримагнетики со структурой шпинели включают, например, Ре₃О₄, СиРе₂О₄, №Ре₂О₄, МдРе₂О₄ и СоРе₂О₄, предпочтительно Ре₃О₄ и нестехиометрические оксидные ферримагнетики со структурой шпинели включают, например, Со_хРе_3-хО₄ и Мп_хРе_3-хО₄, где 0.1<х<0.99, предпочтительно 0.6<х<0.98.

Под термином носитель (сатег) по данному изобретению понимается химический структурный элемент, длина которого по меньшей мере в одном измерении превышает по меньшей мере приблизительно 1 нм, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 нм, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 100 нм и который обеспечивает ковалентное и нековалентное связывание нижеуказанных компонентов. В предпочтительном воплощении данного изобретения носитель выбирается из группы, включающей нанотрубку, липосому, липоплекс, полимерсому, мицеллу, наногель, наночастицу мезопористого кремнезема, дендример или нанооболочку, в особенности носитель является липосома. В случае липосомы наночастицы и в соответствующих случаях терапевтическое и/или диагностическое средство может быть инкапсулировано в липосому, или в соответствующих случаях терапевтическое и/или диагностическое средство может быть интегрировано в бислой липосомы. Получение липосом осуществляется специалистами с помощью общеизвестных методов. В частности, получение липосом может осуществляться путем экструзии, как показано в примере 4, или путем сонификации. В другом воплощении, например, в виде дендример, наночастицы по данному изобретению и в соответствующих случаях терапевтическое и/или диагностическое средство ковалентно присоединяются к дендримеру предпочтительно через связывающий агент (линкер). Синтез и использование нанотрубки, липосомы, липоплекса, полимерсомы, мицеллы, наногеля, наночастицы мезопористого кремнезема, дендримера и нанооболочки описаны, например, в работах Опте и др., 2009.

Под термином "липосома" по данному изобретению понимается пузырек (везикула), стенка которого состоит из липидного бислоя. Липосома может содержать один или более липидов, в особенности фосфолипидов, более предпочтительно фосфатидилхолинов. Липосома может содержать в дальнейшем липиды, предпочтительно пегилированные липиды. В предпочтительном воплощении липид должен присутствовать. Такой липид описан в примере 4. Липосома может быть однослойной или многослойной. Стенки многослойных липосом могут состоять из 2, 3, 4, 5 или более слоев.

Под термином "феррилипосома" по данному изобретению понимается липосома, содержащая одну или более наночастиц оксидов железа и/или наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по данному изобретению. В предпочтительном воплощении наночастицы находятся в незаполненном пространстве липосомы. Феррилипосома может содержать в дальнейшем активные терапевтические и/или диагностические средства, как указано выше. Также феррилипосома может иметь покрытие из функционализированного полимера. Например, феррилипосома может быть покрыта декстраном или функционализированным декстраном. Феррилипосомы, покрытые декстраном, конъюгированным с А1еха Р1иог, описаны в примере 4. Как правило, диаметр феррилипосом варьируется от приблизительно 20 нм до приблизительно 1 мкм, предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 500 нм, более предпочтительно от приблизительно 80 до приблизительно 200 нм, еще более предпочтительно от приблизительно 90 до приблизительно 110 нм. Феррилипосома может быть однослойной или многослойной. Стенки многослойных феррилипосом могут состоять из 2, 3, 4, 5 или более слоев.

Под термином "терапевтическое средство" по данному изобретению понимается химическое вещество, способное оказывать терапевтический эффект при введении пациенту в эффективной дозе. Терапевтическое средство предпочтительно выбирается из группы, включающей

химиотерапевтическое средство, в особенности алкилирующий агент, и/или антиметаболит, и/или растительный алкалоид, и/или таксан, и/или ингибитор топоизомеразы, и/или антибластомное средство, более предпочтительно доксорубицин, радиоактивное вещество,

ингибитор протеазы, в особенности ингибитор катепсина, более предпочтительно 1РМ-565, препарат, вызывающий апоптоз, и

противовоспалительное средство, в особенности нестероидные противовоспалительные средства, предпочтительно выбранные из группы, включающей салицилат, производное пропионовой кислоты, производное уксусной кислоты, производное эноловой кислоты и производное фенамовой кислоты, селективный ингибитор ЦОГ-2 и сульфонанилид, или в особенности стероидные противовоспалительные средства, предпочтительно глюкокортикоид.

Подразумевается, что выбор терапевтического средства зависит от заболевания, подлежащего лечению.

Под термином "диагностическое средство" по данному изобретению понимается химическое вещество, которое может быть обнаружено. Предпочтительно химическое вещество может быть обнаружено ίη уйго, ех νί\Ό или ίη νί\Ό. предпочтительно ίη νί\Ό. Диагностическое средство предпочтительно выбирается из группы, включающей

радиоактивное вещество, парамагнитное вещество, визуализирующий агент для ПЭТ,

- 12 029170

визуализирующий агент для МРТ, флуорофор, в особенности А1еха Ииот, хромофор,

фосфоресцирующее вещество, хемолюминесцентное вещество и биолюминесцентное вещество.

Под термином "биосовместимость" по данному изобретению понимается свойство раствора не вызывать каких-либо местных или системных реакций у животных, в особенности у человека, при его введении в организм. В предпочтительном варианте введение препарата осуществляется цри помощи системы.

Фигуры

Фиг. 1. Характеристика частиц оксидов железа и феррилипосом.

а. Микрофотографии наночастиц оксидов железа, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии (ЕМ-125). На врезке показана соответствующая картина дифракции электронов.

б. Распределение наночастиц оксидов железа по размеру и их средний размер (И=6.65 нм).

в. Изображение водной коллоидной системы наночастиц оксидов железа, полученное методом растровой электронной микроскопии с помощью эмиссионной электронной пушки.

г. Данные, полученные методом динамического рассеяния света, для коллоидной дисперсии оксидов железа: распределение кластеров наночастиц по диаметру и их средний размер (0=38.95 нм).

д. Феррилипосомы и их изображение, полученное методом атомно-силовой микроскопии.

е. Определение размера феррилипосом методом динамического рассеяния света и их средний размер (И=92.3 нм).

Фиг. 2. МРТ-контрастные свойства электростатически стабилизированных наночастиц оксидов железа.

а. Скорость спин-решеточной 1/Т₁ и спин-спиновой 1/Т₂ релаксации для наночастиц оксидов железа диаметром 39 и 57 нм в сравнении с с коммерчески доступными МРТ-контрастными агентами (Репбех® (АМАО РйагтасеийсаП), МадпеуЩ® (Вауег НеаИйСате АО)). Символами обозначены измеренные значения, линии соответствуют уравнению 1/Т₁=г₁-с+1/Т₁₀, где г₁ - релаксивность, с - концентрация, Т₁₀ - время релаксации 1%-ного раствора агарозы, и ί равно 1 для Т₁ и 2 для Т₂. Скорости релаксации η и г₂ находили путем сравнения измеренных и теоретических значений.

б. МРТ изображение фантомов на основе агарозы при разных концентрациях наночастиц оксидов железа диаметром 39 и 57 нм: Ц-взвешенный (ТЕ=8,5 мс, ТК=400 мс) и Т₂-взвешенные МРТ изображения (ТЕ=60 мс, ТК=2000 мс). Представленные данные показывают, что наночастицы оксидов железа могут использоваться в качестве положительных (Т₄) и негативных (Т₂) контрастных средств для МРТ.

в. Т₂-взвешенное МРТ изображение (ТЕ=60 мс, ТК=2000 мс) четырех образцов фантомов, содержащих 1% агарозы (7, 3), 3,4 мМ наночастиц оксидов железа, введенных в центр образца с 1% агарозного геля (2), и 3,4 мМ наночастиц оксидов железа, распределенных в 1%-ном растворе агарозы под действием приложенного магнитного поля (4), и профили интенсивности сигнала вдоль линий ί и ίί. Образец меньшего размера - фантом, содержащий раствор Сц8О₄-Н₂О (5).

Фиг. 3. Мониторинг направленной доставки и высвобождения феррилипосом ίη νίνο.

а. Т₂-взвешенные МРТ изображения (ТЕ=60 мс, ТК=2000 мс, толщина среза=1 мм) трансгенной ММТУ-РуМТ мыши ίη νίνο за 1 ч до и спустя 48 ч после внутрибрюшинного введения 200 мкл суспензии феррилипосом (концентрация 3.4 мМ) под действием магнитного поля, приложенного в течение 1 ч к нижней правой молочной железе. Ткань опухоли, имеющая высокий МРТ сигнал, окрашена в желтокрасный цвет на исходных Т₂-взвешенных изображениях. Однородное затемнение на опухоли, находящейся под действием магнита с индукцией 0,33 Тл (белая стрелка), указывает на избирательное накопление феррилипосом. На врезке показана область МРТ сканирования, обозначенная красным прямоугольником.

б. Флуоресцентные изображения первичных раковых клеток типа ММТУ-РуМТ и фибробластов эмбрионов мышей, инкубированных с феррилипосомами, функционализированными А1еха Р1иот 555™, в течение 3 ч при 37°С. Масштабная полоска соответствует 20 мкМ. Показаны результаты трех отдельных экспериментов.

в. При направленной доставке феррилипосом с Ό-люциферином у трансгенных мышей с экспрессией люциферазы (РУВ.1ис1§/+; РуМТ1§/+) получен высокоинтенсивный сигнал люциферазы, ассоциированный с опухолью. Феррилипосомы с Ό-люциферином вводили внутрибрюшинно РУВ.1ис1д/+; РуМТ1§/+ мышам с приложением магнита (нацеленные ФЛ) и без него (ненацеленные ФЛ). Спустя 24 ч после инъекции магнит убирали и проводили сканирование мышей на системе визуализации 1У1§® (5 мин, 1У1§® 100 8епе% Активность люциферазы детектировали только в области опухоли, находящейся под действием магнита с индукцией 0,33 Тл (черная стрелка), что указывает на эффективное высвобождение Ό-люциферина только из нацеленных феррилипосом ίη νίνο. Шкала измеряется в фотонах/с/см²/ср.

Фиг. 4. Антиопухолевый эффект феррилипосом с ингибитором цистеиновых протеаз 1РМ-565.

- 13 029170

а. Объем опухолей для каждого дня лечения *Р<0,05, **Р<0,01 и **Р<0,001 по сравнению с другими группами.

б. Изображения отдельных опухолей, взятых у мышей из контрольной группы и группы мышей, получавших лечение методом феррилипосомной доставки 1РМ-565.

в. Активность цистеиновых катепсинов в ткани опухоли после введения 1РМ-565. Опухоли готовили спустя 24 ч после последней инъекции, активность цистеиновых катепсинов измеряли гидролизом флуорогенного субстрата Ζ-РЬе-Агд-АМС.

г-д. Спустя 24 ч после последнего введения степень пролиферации и экспрессии Е-кадгерина сравнивали методом иммунного окрашивания Κί-67 и окрашивания Е-кадгерина: г) определение количества Κ167+ клеток в процентах от общего количества клеток, процент Κί67+ клеток рассчитывали в 10 полях зрения на животное с помощью автоматизированного анализа данных с использованием программного обеспечения Н|81оОие81 (фирма Т188иеОио8ЙС8). Данные представлены в виде средних значений и стандартных отклонений, п=5. Анализ статистики проводили на основе критерия Стьюдента, д) изображения контрольных опухолей и опухолей, обработанных ингибитором 1РМ-565 из феррилипосом, с окрашиванием Е-кадгерина (зеленая флуоресценция) приведены слева, в середине - объединенные изображения Екадгерин/НоесЙ81 33342 (зеленый/синий). Изображение с большим увеличением в белом прямоугольнике показывает разные картины локализации Е-кадгерина - цитозольная в контрольных опухолях и ассоциированная с клеточной мембраной в опухолях, обработанных "1РМ+РЫ". Масштабная полоска соответствует 100 и 25 мкм на изображениях с большим увеличением.

Фиг. 5. Детектирование флуоресцирующих феррилипосом в опухолях ίη νίνο.

а. Ιη νίνο детектирование феррилипосом, нацеленных на опухоли, при внутрибрюшинном введении. Слева: флуоресцентные изображения тканей указывают на присутствие феррилипосом, несущих А1еха Р1иог 546™ (красная флуоресценция), в микроокружении опухоли, окрашенном ИАР1 (ядерный краситель, синяя флуоресценция). Врезка: изображение с большим увеличением отдельной клетки стромы опухоли из области в белом прямоугольнике. Справа: соответствующий срез, окрашенный гематоксилином и эозином. Пунктирная линия разделяет стромальное и опухолевое пространства ткани опухоли.

б. Совместное окрашивание опухоль-ассоциированных макрофагов (маркер СЭ206 для поочередно активированных макрофагов; зеленая флуоресценция) с феррилипосомами, нагруженными красителем А1еха Р1иог 555™ (красная флуоресценция), после двукратного внутривенного введения феррилипосом.

в. Совместное окрашивание клеток опухоли (эпителиальный маркер Е-кадгерин; зеленая флуоресценция) с феррилипосомами, нагруженными А1еха Р1иог 555™ (красная флуоресценция). На фигурах показано клеточное поглощение феррилипосом, несущих А1еха Р1иог 555™, стромальными (белые стрелки) и опухолевыми клетками (ярко-красные стрелки). Масштабная полоска соответствует 200 (а), 40 (б,

в) и 20 мкм (врезка).

Фиг. 6. Коллоидная стабильность наночастиц оксидов железа при разных значениях рН и концентрациях солей.

Суспензию наночастиц оксидов железа готовили в стабилизирующем буфере а. и тестировали ее коллоидную стабильность при разных значениях ионной силы: 216 мМ ЫаС1 (б), 324 мМ ЫаС1 (в); и рН 5,5 (г), 9,0 (д). Средний размер наночастиц оксидов железа определяли методом динамического рассеяния света.

Фиг. 7. Влияние пегилирования липосом на поглощение макрофагами.

Интенсивность флуоресценции принимали в качестве меры поглощения непегилированных (РЕО-) и пегилированных (РЕО+) липосом с красителем А1еха Р1иог 565™ клетками ТНР-1, вмакрофагальный фенотип (**р<0,01).

Фиг. 8. Изображения феррилипосом, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии.

Образец феррилипосом, приготовленный в аморфном льду, суспендированном на пористой угольной подложке. ПЭМ-изображения (ШпоПпадшд 8ег\1се8. 1пс., СА, И8А) феррилипосом. Масштабная полоска соответствует 100 нм.

Фиг. 9. Сравнение МРТ-контрастных свойств неинкапсулированных наночастиц оксидов железа и феррилипосом, нагруженных данными наночастицами.

МРТ изображения неинкапсулированных наночастиц оксидов железа (а) и феррилипосом (б) в сравнении со стабилизирующим буфером или раствором пустых липосом соответственно: Τι-взвешенное (ТЕ=8.5 мс, ТК=400 мс) и Т₂-взвешенное МРТ изображения (ТЕ=60 мс, ТК=2000 мс) при концентрации наночастиц оксидов железа 0,085 мМ. Данные показывают, что как наночастицы оксидов железа, так и феррилипосомы могут использоваться в качестве положительных (Т₂) и негативных (Т₂) контрастных средств для МРТ.

Фиг. 10. Анализ клеточной токсичности феррилипосом и наночастиц оксидов железа.

Фибробласты эмбрионов мышей и клетки первичной РуМТ опухоли инкубировали с феррилипосомами, содержащими 3,4 мМ наночастиц или 3,4 и 55 мМ наночастиц оксидов железа при 37°С в течение 24 ч. Затем клетки метили красителем Аппехш Υ-РЕ в присутствии 5 мкг/мл пропидиум иодида. Интен- 14 029170

сивность флуоресценции измеряли методом проточной цитометрии и анализировали данные с использованием программы Се11 ОнеЧ. Значительной разницы в гибели клеток между разными группами не обнаружено. Результаты представлены в виде средних 3 независимых экспериментов, выраженных в процентах от общего количества клеток.

Фиг. 11. Гистопатологический анализ органов здоровых животных после введения наночастиц оксидов железа.

Однократную дозу наночастиц оксидов железа (500 мг/кг) вводили обычным здоровым крысам тем же способом, что и в остальных экспериментах. На 7 день после введения проводили гистопатологический анализ а., легких б., печени в., почек г., селезенки с применением гематоксилина и эозина. Никаких морфологических изменений у испытуемых животных не выявлено. Масштабная полоска соответствует 100 мкм.

Фиг. 12. МРТ сканирование нацеленных на опухоль феррилипосом ίη νίνο после их внутрибрюшинного введения.

Четыре последовательных коронарных среза Т₂-взвешенных МРТ изображений (ТЕ=60 мс, ТК=2000 мс, толщина среза=1 мм) трансгенной ММТУ-РуМТ мыши ίη νίνο за 1 ч до и спустя 48 ч после внутрибрюшинного введения 200 мкл раствора феррилипосом (концентрация 3,4 мМ) под действием магнитного поля (0,33 Тл), приложенного в течение 1 ч к нижней правой молочной железе (белые стрелки). На опухоли, находящейся под действием магнита, видно четкое однородное затемнение, что указывает на избирательное накопление феррилипосом. Фантом, используемый в качестве образца, показан в левых верхних углах первых срезов. Срезы снизу - полутоновые изображения фиг. 3а.

Фиг. 13. МРТ сканирование нацеленных на опухоль феррилипосом ίη νίνο после их внутрибрюшинного введения.

Т₂-взвешенные МРТ изображения поперечных срезов (ТЕ=60 мс, ТК=2000 мс, толщина среза=1 мм) трансплантированной опухоли молочной железы ίη νίνο: до и спустя 24 ч после инъекции 200 мкл раствора феррилипосом под действием приложенного магнитного поля (0,33 Тл). На опухоли, находящейся под действием магнита в течение 24 ч (белые стрелки), качественно видно четкое затемнение, указывающее на избирательное накопление феррилипосом в центре опухоли.

Фиг. 14. МРТ мониторинг распределения феррилипосом ίη νίνο после их внутривенного введения.

Т₂-взвешенные МРТ изображения (ТЕ=60 мс, ТК=2000 мс, толщина среза=1 мм) трансгенной ММТУ-РуМТ мыши ίη νίνο за 3 ч до и 48 ч после внутривенного введения 200 мкл раствора феррилипосом (концентрация 3,4 мМ) под действием магнитного поля, приложенного в течение 1 ч к нижней левой молочной железе. Ткань опухоли, имеющая высокий МРТ сигнал, окрашена в желто-красный цвет на Т2взвешенных изображениях. Однородное затемнение на опухоли, находящейся под действием магнита с индукцией 0,33 Тл (белая стрелка), указывает на избирательное накопление феррилипосом.

Фиг. 15. Направленная доставка феррилипосом с Ό-люциферином у трансгенных мышей с экспрессией люциферазы (РУВ.1ис1д/+).

Феррилипосомы с Ό-люциферином вводили внутривенно РУВ.1ис1д/+ мышам, после чего прикладывали магнитное поле. Спустя 24 ч после инъекции магнит убирали и сканировали мышей на системе визуализации 1УГ5® (5 мин, 1УГ5® 100 Зепех). Активность люциферазы детектировали только в области опухоли, находящейся под действием магнита с индукцией 0,33 Тл (черная стрелка), что указывает на эффективное нацеливание и высвобождение Ό-люциферина ίη νίνο. Шкала измеряется в фотонах/с/см²/ср.

Фиг. 16. Выведение феррилипосом ίη νίνο.

Люминесцентный сигнал измеряли при помощи дорсальных снимков трансгенных мышей с экспрессией люциферазы спустя 24 ч после внутривенного (а, в/в) или внутрибрюшинного (б, в/б) введения феррилипосом с Ό-люциферином и магнитного нацеливания на системе 1У18®. В обоих случаях биолюминесценция отслеживалась по ходу мочевыводящих путей мышей, что указывала на выведение наночастиц посредством почечного клиренса, одинаково в независимости от способа введения феррилипосом.

Фиг. 17. Люминесцентная визуализация биораспределения феррилипосом ех νίνο после анатомирования.

Феррилипосомы с Ό-люциферином вводили внутривенно РУВ.1ис1д/+ мыши, после чего прикладывали магнитное поле. Спустя 24 ч после инъекции магнит убирали, мышь умерщвляли, извлекали органы и сканировали их на системе визуализации 1У1З® (2 мин, 1У1З® 100 §епе8). Обнаружена значительно более высокая активность люциферазы в опухоли и почках, чем в других органах, что свидетельствует об эффективной доставке и высвобождении Ό-люциферина ίη νίνο. Шкала измеряется в фотонах/с/см²/ср.

Фиг. 18. Усиленный и пролонгированный антиопухолевый эффект доксорубицина при его феррилипосомной доставке.

Динамика сокращения объема опухолей после лечения доксорубицином (15 мг/кг) по традиционной схеме путем системного введения (Όοχ;·) и с применением направленной доставки системы феррилипосом (Όοχ+РЫ; А). Магнитная индукция равна 0,33 Тл. Каждое значение является средним плюс стандартное отклонение из 4 экспериментов. *Р<0,05 по сравнению с группой Όοχ согласно данным провер- 15 029170

ки по критерию Стьюдента.

Фиг. 19. Схематическое изображение модели лечения и терапевтических групп.

а. Клетки первичной опухоли, полученные от 14-ти недельных трансгенных ММТУ-РуМТ мышей культивировали и трансплантировали в левую паховую молочную железу мыши (мышь линии РУВ/Ν).

б. Курс из 10 внутрибрюшинных инъекций для всех групп проводили каждые два дня после того, как объем опухоли (Τν) достигал 125 мм³.

Фиг. 20. Антиопухолевый эффект ингибитора цистеиновых протеаз 1РМ-565 при его феррилипосомной доставке.

На следующий день после последней инъекции мышей умерщвляли, и измеряли окончательный объем удаленных опухолей. Данные представлены в виде средних плюс стандартное отклонение. Анализ статистики проводили на основе критерия Стьюдента.

Фиг. 21. Экспрессия цистеиновых катепсинов после лечения ингибитором цистеиновых протеаз 1РМ-565.

Сравнение уровня экспрессии мРНК катепсина В, катепсина Ь, катепсина Н и катепсина X в образцах опухолей из разных групп после лечения, который определяли методом НЦР в режиме реального времени. Данные представлены в виде средних значений плюс стандартное отклонение, п=3-4, выраженных в процентах от контрольной величины (100%).

Фиг. 22. Активность цистеиновых катепсинов в разных органах после введения 1РМ-565.

Нечень, легкие, почки и поджелудочные железы готовили спустя 5 ч после последней инъекции, и измеряли активность цистеиновых катепсинов гидролизом флуорогенного субстрата Ζ-РЬе-Агд-АМС. Данные представлены в виде средних значений и стандартных отклонений. *Р<0,05 согласно данным проверки по критерию Стьюдента.

Фиг. 23. Детектирование внутрибрюшинно введенных феррилипосом ίη νίνο во внутрибрюшных лимфатических узлах.

Флюоресцентная микроскопия почечных лимфатических узлов после внутрибрюшинного введения феррилипосом с красителем А1еха Р1иог 555™. Красная флуоресценция А1еха Р1иог 555™ указывает на остаточное присутствие феррилипосом в лимфатическом узле при отсутствии их преимущественного накопления. Масштабная полоска соответствует 200 мкм.

Фиг. 24. Влияние лечения ингибитором 1РМ-565 на пролиферацию карцином молочных желез.

Нролиферирующие клетки определяли в ходе иммуногистохимического анализа на основе маркера пролиферации Κί67 (коричневое окрашивание). Приведены представительные изображения для контрольных мышей и мышей, подвергнутых лечению ингибитором цистеиновых катепсинов 1РМ-565. Масштабная полоска соответствует 200 мкм.

Фиг. 25. Васкуляризация карцином молочной железы после лечения ингибитором 1РМ-565.

Нредставительные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания эндотелиальных клеток специфическим маркером СЭ31 (красное окрашивание). Крысиное анти-СЭ31 антитело (фирма ΒΌ РЬагшшдеп; разведение 1:100) и вторичное Су3-маркированное ослиное антикрысиное антитело (фирма 1аск8оп 1штипоКе8еагсЬ; разведение 1:200) использовали для иммунологического анализа эндотелиальных клеток в криоконсервированых срезах опухолей. Масштабная полоска соответствует 200 мкм.

Фиг. 26. Гистограмма распределения наночастиц оксидного ферримагнетика со структурой шпинели в соответствии с формулой Со₀.₈₄Ре₂₄₆О₄ по размерам.

Фиг. 27. Зависимость времени релаксации а) Т₁ и б) Т₂ от концентрации наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в соответствии с формулой Со₀.₈₄Ре₂₄₆О₄ в стабилизирующем буффере (а. биосовместимом коллоидном растворе).

Фиг. 28 Магнито-резонансный (МР) снимок трех образцов, содержащих различные концентрации наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в соответствии с формулой Со₀.₈₄Ре₂₄₆О₄ в 1% агарозе (1: 1% агароза; 2: 0.017 мМ; 3: 0.17 мМ; 4: 1.7 мМ и 5: фантом, содержащий Си8О₄-Н₂О) и зависимость контраста от времени релаксации: а) Τι МР-снимок при времени эхо Т_е=8.5 мс и времени релаксации Т_р=400 мс; б) Т₂ МР-снимок при Т_е=60 мс и Т_р=2000 мс.

Фиг. 29. Схема образцов из 1% агарозы, один из которых содержит локально добавленные наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в соответствии с формулой: Со₀.₈₄Ре₂₄₆О₄ а) и их магнитно-резонансные (МР) поперечные снимки: б) Т₁ МР-снимок при времени эхо Т_е=8.5 мс и времени релаксации Т_р=400 мс; в) Т₂ МР-снимок при Т_е=60 мс и Т_р=2000 мс с соответствующими им графическими профилями МР сигнала.

Фиг. 30. Магнитно-резонансные (МР) сагиттальные снимки: а) Т₁ МР-снимок при времени эхо Т_е=8.5 мс и времени релаксации Т_р=400 мс; б) Т₂ МР-снимок при Т_е=60 мс и Т_р=2000 мс с соответствующими им графическими профилями МР сигнала.

Фиг. 31. Схематическое изображение наночастиц наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в соответствии с формулой Со₀.₈₄Ре₂₄₆О₄, инкапсулированных в липосому и гипотетическое химическое вещество а) и снимок атомносиловой микроскопии магнитолипосом б).

Фиг. 32. Магнитно-резонансное сканирование "ш \Ао" нацеленных магнитолипосом (Т_Е=60 мс,

- 16 029170

Т_к=2000 мс, толщина слайда равна 1 мм) трансплантированной опухоли молочной железы у мыши: до введения 200 мл феррилипосом с последующим магнитным нацеливанием и через 24 ч после введения.

Литература.

Αϊ Н εί а1 Мадпей1е-1оайей ро1утепс гшсеПез аз ийгазепзйке тадпейс-гезопапсе ргоЬез Айуапсей Ма1епа1з 17 1949-+ 2005

АггиеЪоа М Регпапйег-РасЬесоа К Нэаггаа М К & ЗаШатапа 8 Мадпейс папорагйс1ез Гог йгид Йе1кегу Хапо1ойау 2 22-32 2007

А1апазуеу1с Т ЗЬизГеД М Рат Р & ЙазапоГГ А Са1сшт-зепзЬке ΜΚΙ сопйаз! адеп!з Ьазей оп зиреграгатадпейс йоп οχϊάε папорагйс1ез апй са1тойийп Ргос ИаЙ Асай 8εί и 8 А 103 14707-14712 2006

ВаЫпсоуа М Масйоуа Е 1999 Оехйап епйапсез са1сшт-тйисей аддгедайоп оГ рйозрйаййу1зеппе Ирозотез роззПЯе ппрНсайопз Гог ехосу1оз1з Рйузю1 Кез 48 319-21

Васп й Реггупзкл К. 8а1т ϋ СаЬий V МаззагГ К. I 1990 1отс Геггойшйз а сгоззтд оГ сйеппзй-у апй рйузйз I Мадп Мадп Ма1 85 27-32

Ве11-МсОшпп К ОагГаП А Водуо М Напайап ϋ & йоусе I А 1пЫЫйоп оГ суз1ете саЛерзт рго1еазе асйуйу епйапсез сйетойгегару гедтепз Ьу йесгеазтд Штог дгоМй апй туазкепезз ϊη а тоизе тойе1 оГти1йз!аде сапсег Сапсег Вез 67 7378-7385 2007

Водйапоу А А Магйп С \\/е1зз1ейег К & Вгайу Т й Тгарртд оГ Цехйап-Соа1ей Со11о1Йз ϊη Ь1ро8оте5 Ьу Тгапз1еп1 Втйтд ΐο АтторйозрйоИрЫ - Ргерагайоп оГ Реггозотез ВЬа-ВютетЬгапез 1193 212-218 1994

Вийе й Ψ йе Сиурег М Оезргез ϋ & Ргапк Й А ЗйогЕ уз 1опд-с1гси1айпд тадпекйрозотез аз Ьопе тагго\у-зеектд МК сопйаз! адеШз й Мадп Кезоп 1тадтд 9 329335 1999

Вийе й XV М йе Сиурег М Оезргез ϋ & Ргапк й А Ргерагайоп ге1ахоте!гу апй Ыоктейсз оГ РЕОу1а1ей тадпейэНрозотез аз МК соп1газ! адеп! й Мадп Мадп Ма1ег 194 204-209 1999

Вийе й Ψ М е1 а1 Зе1есйуе Мг 1тадтд оГ ЬаЬе1ей Нитап Репрйега1-В1оой Мопопис1еаг-Се11з Ьу Е1розоте МеФайей 1псогрогайоп оГ ИехЕап-МадпеЛе Рагйс1ез Мадпе1 Кезоп Мей 29 32-37 1993

Сее1еп XV Р & Р1еззпег Μ Р 1пГгареп1опеа1 Легару Гог регйопеа1 Штогз Ыорйуз1сз апй сйтса1 еугйепсе Ыай Кеу С1т Опсо1 7 108-115 2010

СотеП й А 1991 ТЬе Гййпд оГ ЗсйеГГё-Суре тойе1з Гог езйтайпд зойЛШйез оГ тиШзокеп! зузйетз й Вюрйагт 8ГаГ 2 303-329

ϋϊ Рао1о ϋ εί а1 Е1розоте-теЛа1ей Легару оГ пеигоЫазйота МеЛойз Епгуто! 465 225-249 2009

Рогйп-КГросйе й Ρ εί а1 Мадпейс 1агдейпд оГ тадпеЮйрозотез ίο зойй Лтогз \νϊΛ МК 1тадтд топйоппд ϊη пйсе ГеазЛПйу КайЫоду 239 415-424 2005

Оа1апгйа Е I εί а1 Ιη νϊνο тадпейс еппсйтеЫ апй ти1йр1ех рйоЛасоизйс йе1есйоп оГсйсЫайпд Штоиг се11з №ΐ Шпо1есйпо1 4 855-860 2009

Оосйеуа V е1 а1 1Й-4 тйисез саЛерзт рпйеазе асйуйу ϊη 1итог-аззос1а1ей тасгорйадез ίο ргото1е сапсег дгоуйй апй туазюп Оепез ϋεν 24 241-255 2010

ОгеепЬаит ϋ εί а1 СЬепйса1 арргоасйез Гог ГипсйопаПу ргойтд Ле рго1еоте Мо1 СеП Ркйеопйсз 1 60-68 2002

ОгеепЬаит ϋ МейгЛгайзгку К Р Вигйпдате А & Водуо Μ Εροχϊάε ексЕорййез аз асйуйу-йерепйеп! суз1ете рпйеазе ргоййпд апй Лзсоуегу Ло1з СЬет Βϊοΐ 7 569-581 2000

Оиу С Т СагЛГГ К ϋ & Ми11ег XV й 1пйисйоп оГ таттагу Штогз Ьу ехргеззюп оГ ро1уотаУ1гиз пййй1е Т опсодепе а Еапз-детс тоизе тойе1 Гог тейазйайс Лзеазе Мо1 СеП Βϊοΐ 12 954-961 1992

- 17 029170

1оусе I Α εί а1 СаФерзт сузкте ргоказез аге е££ес1огз о£ туазАе дгоуЛк апк апдюдепез15 киппд ти1йз1аде Штопдепез13 Сапсег Се11 5 443-453 2004

Κίιη Д ΑΥ Оакпгка Е I ЗНазккоу Е V Мооп Η М & /Нагоу V Ρ Оо1кеп сагЬоп папоШЬез аз ти1йтока1 рко1оасоизйс апк рко1о1кегта1 Ыдк-сопйаз! то1еси1аг адегйз На! ΝηηοίεεΡηοΙ 4 688-694 2009

Бее I εί а1 АгййсгаПу епдтеегек тадпейс папораШскз Гог икга-зепзШуе то1еси1аг та§т§ ИаШге Мексте 13 95-99 2007

БюИа Ь А & Кокп Е С Тке ткгоепукоптеп! оГ ΐΐιε !итоиг-Ьоз1 т1ег£асе Ыа1иге 411 375-379 2001

Ьорег 1 Α Оопгакг Р ВошНа Р А /атЬгапо О Оотег Μ Е 2010 8уп1Ьез13 апб скагаскпгайоп о£ РеЗО4 тадпейс папойшк КеУ1з1а Ьайпоатепсапа ке Ме1а1иг§1а у Ма1епа1ез 30 60-66

МаПта М 8 εί а1 Оепегайоп о£ зиреграгатадпейс Нрозотез геуеакк аз Ы§Ыу ε££ιεΐεηί ΜΚΙ сопйаз! адеп1з £ог ϊη νίνο тадтд I Ат Скет 8ос 127 10676-10685 2005 Мекагоуа Ζ Ркат XV Раггаг С Ре1коуа V & Мооге Α Ιη νίνο тадтд о£ 3ΪΚΝΑ кеНуегу апк зНепстд ίη Штогз №ί Мек 13 372-377 2007

Мокатек Μ М & 81оапе В Р Сузкте са1керзтз ти1й£ипсйопа1 епгутез ίη сапсег Иа1 Кеу Сапсег 6 764-775 2006

Мога1з Р С 8ап1оз 1 О ЗПуепа Ь В Оапзаи С Визке N Иипез Ψ С 81ппескег 1Р 2004 ЗизсерйЪПку 1пуезйдайоп о£ 1ке папорагйск соайпд-1ауег е££ес1 оп 1ке рагйск ткгасйоп ίη ЬюсотракЫе тадпейс Йшкз 1оигпа1 о£ Мадпейзт апк Мадпейс Макпа1з 272 2328-2329 ϋΟΙ ϋΟΙ 10 1016/] ]ттт 2003 12 473

Мога1з Р С ЗапЮз К. й Ртеп1а А С М Агеуеко К. В Рта Е С ϋ 2006 Ргерагайоп апк скагаскпгайоп о£ икга-з1аЫе ЫосотрайЫе тадпейс йшкз изтд скгак-соакк сокак Γειτίίε папорагйскз ТЫп Зокк РНтз 515 266-270 ΏΟΙ ϋΟΙ 10 1016/] ΐδ£ 2005 12 079

МиеПег Μ М & Ризетд N Е Рпепкз ог £оез - Ыро1аг е££ес1з о£ 1ке Штоиг зйота ίη сапсег Яа1 Кеу Сапсег 4 839-849 2004

Иа Η В εί а1 ϋενείοριηεηί о£а Т1 сопйаз1 адеп! £ог тадпекс гезопапсе тадтд изтд МпО папорагйскз Апдеху Скет Ιηί Ек Епд146 5397-5401 2007

Иа^кеп Е εί а1 Мадпейс ргорегйез апк з1гис1ига1 рагатекгз о£ папоз1гек ох1ке Геглтадпе! ρον/кегз ргокисек ку тескапоскегшса1 зуп1кез18 £гот зак зоШйопз Ркузкз о£ 1ке зокк з1а1е 5 891-900 2003

Иа1кеп Е гкигауку V Ιίΐη V Тегеккоуа О Мадаеуа А Гуапоу Υ 2008 Мадпейс ргорегйез апк з!гисШга1 рагатекгз о£ папоз1гек ох1ке Геттадпе! ρον/кегз ргокисек ку тескапоскегшса1 зуп1кез13 £гот зак зокйопз Ркузкз о£ 1ке зокк з1а1е 50 894-900

Иаппк! Υ εί а1 Α ηονεί тадпейс сгуз1а1-Нр1к папозкисШге Гог тадпейсаку дшкек ίη νίνο депе кекуегу №ΐ Иапокскпо! 4 598-606 2009

Οπνε О Апкиа Е Рекгаг 1 й Етепск ϋ Р 2009 Вютакпа1з Гог рготойпд Ъгат рго!есйоп герак апк гедепегайоп ИаШге Кеукхуз Неигозскпсе 10 682-ΕΙ47 ϋΟΙ ϋοί 10 1038/№п2685

Коз1 N Ь & Мпкт С А ИапозкисШгез ίη ВюФадпозйсз Скет Кеу 105 1547-1562

2005

Козз1 А Оеуегаих С Тигк В & 8ак А СотргекепзАе зеагск Гог сузкте са1керзтз ίη 1ке китап депоте ΒίοΙ Скет 385 363-372 2004

ЗакадЫат А М е1 а1 Оез1дп зуШкез1з апк еуаШайоп о£ ίη νίνο рокпсу апк зексйуку о£ ерохузисстукказек тЫЬкогз о£ рарат-Гатйу суз!ете рго1еазез Скет ΒίοΙ 14 499-511 2007

ЗапШз А М Шпд 1 Αζίζ N КгззП 1 Ь & Риге Е Тагдейпд йкгоЫаз! асйуайоп ргокт тЫЪкз 1итог зйотадепез13 апк дгоуйк ίη тке Ί Скп Ιηνεδΐ 119 3613-3625 2009

8скипд1 и εί а1 Тпа1 о£ 1ке сузкте са1керзт ίηΕΐΒϊίοΓ ΙΡΜ-ΟΕί оп еаг1у апк акуапсек таттагу сапсег з1адез ίη 1ке ММТУ-РуМТкгапздешс тоизе токе1 ΒίοΙ Скет 389 1067-1074 2008

8ео \У 3 εί а1 РеСо/дгарккк-зкеИ папосгуз1а1з аз акуапсек тадпейс-гезопапсегтадтд апк пеаг-т£гагек адеШз ИаШге Ма1епа1з 5 971-976 2006

Зеуетск Б εί а1 8упегд1зйс апйШтог е££ес1з о£ сотктек са1керзт В апк са!керзт Ζ кейскпскз оп Ьгеаз! сапсег ргодгеззкп апк те1аз1аз13 ίη тке Ргос ИаЙ Асак δει и 8 А 107 2497-2502 2010

Зкарпо М О А1апазуеУ1С Т Рааз Н ХУезйпеуег О О & 1азапо££ А Оупапис тадтд лукк ΜΚΙ сопказГ адеп1з циапй1айуе сопз1кегайопз Мадп Кезоп 1тадтд 24 449-462 2006

31оапе В Ρ εί а1 Сагкерзт В апк Штог ргоко1уз13 сопйккийоп о£ 1ке Штог гтсгоепупоптеШ Зетт Сапсег ΒίοΙ 15 149-157 2005

31о11£изз 1 С εί а1 Кес1а1 сагстота Ыдк-зрайаЕгезоШйоп МК гтадтд апк Т2 диапййсайоп ίη гес1а1 сапсег зрескпепз Какюкду 241 132-141 2006

- 18 029170

ТогсЫПп V Ми1б£ипсбопа1 апб збтиЬ-зепз1буе рЬагтасеибса1 папосатегз Еиг I РЬагт ВюрЬагт 71 431-444 2009

ТогсЫПп V Р е1 а1 Ро1у ЕФу1епе О1усо1 оп Фе Ырозоте 8иг£асе - оп Фе МесЬашзт о£Ро1утег-Соа1еб Ырозоте ЬопдеуЬу ВЪа-ВютетЬгапез 1195 11-20 1994

Уазфеуа О & Тигк В Оиа1 сопбазбпд го1ез о£ суз1ете саФерзтз ϊη сапсег рго§гезз!оп арор1оз1з уегзиз Фтоиг туазюп ВюсЫгше 90 380-386 2008

Уазфеуа О е! а1 Етегдтд го1ез о£ сузФте саФерзтз ΐη сНзеазе апб Фей ро!епба1 аз бгид 1агде1з Сигг РЬагт Оез 13 387-403 2007

Уазфеуа О εΐ а1 Кебисеб Фтоиг се11 ргоЬ£егабоп апб <1е1ауес1 беуеЫртеп! о£ЫдЬдгабе таттагу сагстотаз ϊη саФерзт В-бебс1еп1 пбсе Опсодепе 27 4191-4199 2008

УазЩеуа О е! а1 Титог се11-бебуеб апб тасгорЬаде-бепуеб саФерзт В ргото!ез ргодгеззюп апб 1ипд те1аз1аз18 о£ таттагу сапсег Сапсег К.ез 66 5242-5250 2006

У1азкои ϋ е1 а1 Мадпебс апб АсоизбсаПу Асбуе ЫрозрНегез £ог МадпебсаПу Тагде1еб ИисЫс Αοΐ6 Оебуегу Α6ν Рипс1 Ма1ег 20 3881-3894 2010

ХУепбег Р А е! а1 К.еа1-бте апа1уз1з о£ ир1аке апб Ьюасбуа1аЫе с1еауаде о£ ЫсЫегтбапзробег софидакез ΐη бапздетс геройег пбсе Ргос Ыаб Асаб 8сШ 8 А 104 10340-10345 2007

2Ьао М ФзерНзоп Ь Тапд Υ & \Уе!зз1ебег К Мадпебс зепзогз £ог рго!еазе аззауз Апделу СЬет Ιηΐ Еб Епд1 42 1375-1378 2003

Примеры

Получение и характеристики феррилипосом.

Частицы оксидов железа по данному изобретению получали путем механохимического синтеза с использованием кристаллогидратов солей (см. пример 1). Благодаря применению кристаллогидратов солей вместо безводных солей, используемых в традиционных методах, удается заменить твердофазный механизм на мягкий механохимический синтез в присутствии воды, что приводит к значительному увеличению скорости реакции. Более того, данный способ обеспечивает образование сверхмалых сферических частиц диаметром 3-14 нм (>70% менее чем 8 нм) (фиг. 1а, б).

Основным ограничивающим фактором для применения наночастиц, в особенности наночастиц оксидов железа, ιη νίνο является их низкая коллоидная стабильность.

Концентрацию частиц оксидов железа измеряли методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии, а средний размер наночастиц определяли методом динамического рассеяния света (фиг. 1с, фиг. 6). Полученные наночастицы оксидов железа имеют отрицательный дзета-потенциал поверхности 27,9±4.3 мВ при рН 7,4 и 37°С.

Суспензия по данному изобретению имеет высокую коллоидную устойчивость в физиологических условиях, а также при различных значениях рН и ионных сил (пример 1, фиг. 6).

Стабилизированные наночастицы оксидов железа инкапсулировали в стерильные липосомы, покрытые полиэтиленгликолем (пегилированные или стелс-липосомы), формируя таким образом феррилипосомы диаметром приблизительно 100 нм. Известно, что модификация липосом полиэтиленгликолем значительно снижает опсонизацию липосом и их последующее устранение ретикулоэндотелиальной (мононуклеарной фагоцитарной) системой, тем самым существенно увеличивая полупериод циркуляции. Это было подтверждено в ходе эксперимента на клетках (фиг. 7). По данным атомно-силовой микроскопии липосомы, нагруженные наночастицами оксидов железа, имеют форму сфероидов 0,09-0,11 мкм в диаметре (фиг. 1д), что согласуется с данными, полученными методом динамического рассеяния света, для феррилипосом, средний диаметр которых составляет 92,3 нм (фиг. 1е). Благодаря размеру, гидрофобным и гидрофильным особенностям, биосовместимости, а также наличию внутреннего незаполненного пространства (фиг. 7) система феррилипосом по данному изобретению позволяет одновременную инкапсуляцию наночастиц оксидов железа вместе с другими веществами, такими как лекарственные средства или ДНК, и их последующую направленную доставку в организме млекопитающих, предпочтительно человека.

Наночастицы оксидных ферримагнетков со структурой шпинели согласно формуле Со₀.₈₄Ре₂.₁₆О₄ были приготовлены путем мягкого механохимического синтеза с использованием кристаллогидратов солей (пример 2) с распеределением частиц по размерам (фиг. 26).

Размер наночастицы оксидных ферримагнетков со структурой шпинели в суспензии (адиеоиз со11оШа1 8у81еш) был измерен с помощью динамического светорассеяния (Эупашю 8саКепп§ Эе1ес1ог

РЭ 2000 ЭЬЗ Р1из). Концентрацию ионов определяют Паше-спектроскопией с помощью Уапап 8рес1г АА 110 атомно-абсорбционного спектрометра.

Характеристики МРТ-контрастных свойств наночастиц оксидов железа т νΐΐΐΌ.

МРТ-контрастные свойства стабилизированной суспензии наночастиц т νΐΐΐΌ оценивали с помощью фантома на основе агарозы, моделирующего опухолевую ткань, с процентным содержанием агарозы 1% при Т₂«80 мс, что соответствует параметрам опухолевых тканей. Фантомы на основе агарозы, содержащие наночастицы и нанокластеры оксидов железа, средний гидродинамический диаметр которых составлял 39 и 57 нм соответственно, сканировались для определения МРТ-контрастных свойств. Про- 19 029170

дольное (Т₁) и поперечное (Т₂) время релаксации измеряли при различной концентрации наночастиц оксидов железа, при этом г₁- и г₂-релаксивность составляла 12 и 573 с^-1мМ^-1 для наночастиц диаметром 39 нм и 31 и 1286 с^-1мМ^-1 для наночастиц оксидов железа диаметром 57 нм. Но сравнению с коммерчески доступным препаратом на основе суперпарамагнитных наночастиц оксида железа Рейбех® (фирма Вауег НеаНЬСаге РЬаттасеийсаЦ) и стандартным ^-контрастным препаратом на основе гадолиния Мадпеу181® (фирма Вауег НеаНЬСаге РЬаттасеийсаЦ) наночастицы оксидов железа имеют в несколько раз большую релаксивность, чем коммерческие МРТ-контрастные средства, обеспечивая тем самым сверхчувствительное МРТ сканирование (фиг. 2а). Кроме того, было обнаружено увеличение г₂-релаксивности на 2070% по сравнению с наиболее эффективными наночастицами на основе оксида железа, описанными в литературе. Высокая г₂-релаксивность, вероятнее всего обусловленная кластеризацией наночастиц оксидов железа, подтверждается увеличением релаксивности наночастиц оксидов железа с большим гидродинамическим диаметром кластеров. Это свидетельствует о том, что наночастицы оксидов железа являются высокоэффективным МРТ-контрастным средством, которое обеспечивает чрезвычайно высокую чувствительность Т₂-взвешенных МР-изображений.

Для проверки эффективности наночастиц оксидов железа, выступающих в качестве Т₁положительных и Т₂-негативных контрастных средств, были получены Т₁- и Т₂-взвешенные изображения контрольных фантомов и фантомов на основе агарозы, содержащих 0,017 мМ наночастиц оксидов железа диаметром 39 нм и 0,17 мМ наночастиц оксидов железа диаметром 57 нм (фиг. 2б). Выявлено значительное снижение интенсивности сигнала для данных фантомов на Т₂-взвешенных изображениях, в то время как на Т₁ -взвешенных изображениях МР-сигнал усиливался при той же концентрации наночастиц оксидов железа (фиг. 2б). Таким образом, одновременно продемонстрированы уникальные Т₁ и Т₂ МРТконтрастные свойства наночастиц оксидов железа, которые указывают на возможность их использования в качестве отдельных контрастных средств для получения Т₁- и Т₂-взвешенных МР-изображений, благодаря чему удается улучшить диагностические характеристики МР-сканирования. Также в 2 раза более высокая чувствительность наночастиц оксидов железа диаметром 57 нм по сравнению с нанокластерами диаметром 39 нм на Т₂-взвешенных МР-изображениях (фиг. 2б) указывает на то, что первые являются чрезвычайно эффективными контрастными веществами. Однако для доставки лекарственных средств предпочтительно использовать нанокластеры диаметром 39 нм в виду их исключительных свойств.

Для того чтобы проиллюстрировать эффективность нацеливания суспензии магнитных наночастиц и их МРТ-контрастные свойства при интернализации в фантом, использовали два способа доставки наночастиц оксидов железа в фантом на основе агарозы: (ί) прямая инъекция раствора с наночастицами оксидов железа иглой 0,3 мм в центр фантома на основе агарозы (образец 2, фиг. 2в) и (ΐΐ) нанесение эмульсии наночастиц оксидов железа на поверхность фантома на основе агарозы путем расположения магнита (В=0,33 Т) снизу цилиндра (образец 4, фиг. 2в). Как видно на Т₂-взвешенном МР-изображении и из профиля интенсивности МК-сигнала, оба способа доставки оказались эффективными, демонстрируя четкую разницу между МР-сигналами наночастиц оксидов железа и фантома. Более того, МР-сигнал образца 4 полностью исчезал, что свидетельствует об успешном проникновении наночастиц оксидов железа сквозь материал фантома вследствие нацеливания с помощью внешнего магнитного поля. Нолученные результаты показывают, что наночастицы оксидов железа по данному изобретению можно использовать в качестве несущих компонентов для многофункциональных систем направленной доставки с возможностью одновременного МРТ сканирования. МРТ-контрастные свойства наночастиц оксидов железа не изменяются после их инкапсулирования в липосомы (фиг. 9), что подтверждает возможность использования феррилипосом в медицине.

Характеристики МРТ-контрастных свойств наночастиц оксидных ферримагнетков со структурой шпинели в соответствии с формулой Со₀.₈₄Ре₂.₁₆О₄ ίη νίίτο.

Времена релаксации Т1 и Т2 измеряют для различных концентраций наночастиц оксидных ферримагнетков со структурой шпинели в 1% агарозе при комнатной температуре при частоте ¹Н ЯМР уН=100 МН/ (фиг. 28). Время Т1 спин-решеточной релаксации измеряют с частотой релаксации ТК=15 с и временем между импульсами 140μ3-15 с. Спин-спиновое время релаксации Т2 измеряют последовательным спин-эхо при времени повторения ТК=500 мс при различном входящем времени эхо. Время эхо было от 15 мкс до 500 мс. Нродольную (г1) и поперечную (г2) степени релаксации определяют в размере г1=22 8¹тМ^-1, г2=503 8^-1тМ^-1. Возможность позитивного и негативного контрастирования наночастиц оксидных ферримагнетков со структурой шпинели проверяют на магните 2.35 Т при комнатной температуре. Готовят Т1 и Т2 снимки образцов 1% агарозных фантомов, содержащих различные концентрации наночастиц с использованием следующих параметров частоты спин.эхо: площадь обзора равна 3 см, толщина слайдов равна 1 мм, размер матрикса 256x256. Было использовано отношение ТК/ТЕ=60/2000 мс. Образец с концентрацией наночастиц 0.34 мМ показал полное исчезновение магнитно-резонансного (МР) сигнала (фиг. 29, 30).

Также потеря сигнала наблюдалась в образце с концентрацией наночастиц, равной 3.4 мМ. Для концентрации 0.034 мМ интенсивность сигнала была сопоставима с интенсивностью сигнала 1% агарозы. Результаты продемонстрировали возможность использования наночастиц в качестве контрастных

- 20 029170

агентов при выборе нужной концентрации. Свойства наночастиц оксидных ферримагнетков со структурой шпинели как Τι и Т₂ контрастного агента также были продемонстрированы с использованием образца, содержащего 1% агарозу, в который локально добавлен раствор 0.34 мМ наночастиц. Наночастицы были инъецированы в середину агарозного фантома (фиг. 30).

На Т₂ МР снимке негативный контраст наблюдался на той же позиции внутри образца. Это доказывает контрастный эффект наночастиц феррошпинели при концентрации 0.34 мМ. Параметры МР сканирования были те же, что и выше.

Эффективность феррилипосом как видимой на МРТ системы доставки лекарств ίη νίνο.

Для определения эффективности феррилипосом, изготовленных для применения ίη νίνο, использовали трансгенную мышиную модель рака молочной железы человека (ММТУ-РуМТ), который приводит к трансформации эпителия молочной железы и развитию множественных аденокарцином молочной железы. Вначале было показано, что феррилипосомы являются нецитотоксичными для фибробластов эмбрионов мышей и клеток первичной опухоли мыши (фиг. 10). Возможные неблагоприятные воздействия наночастиц оксидов железа дополнительно оценивали в ходе острого токсикологического эксперимента на крысах. Спустя 7 и 12 дней после введения не было замечено никаких значительных различий в показателях биохимического анализа крови и гистопатологического анализа у контрольных животных и животных с введенными в количестве 500 мг/кг наночастицами оксидов железа (табл. 1, фиг. 11).

Таблица 1

Биохимия крови после введения наночастиц оксидов железа в остром токсикологическом эксперименте

Групп ы мышей	Креатин ин, мкг/л	Азот мочеви ны крови, мг/л	Аланинамино -трансфераза, ед/л	Аспартатаминотрансфераза ед/л	Креатинфосфокиназа ед/л	Общий билирубин, мкг/л
Контрольна я	34.0 ±0.82	4.18 ±0.27	142.5 ±6.31	170.5 ±5.23	3471 ±96	7.2 ±0.31
7 дней	34.0 ±0.83	5.81 ±0.4	94.44 ±4.38	178.4 ±6.06	515Η331	8.7 ±0.45
12 дней	39.0 ±0.87	4.11 ±0.25	91.57 ±3.41	205.3 ±3.53	4010±264	8.3 ±0.61

После того как было показано, что система пригодна для применения ίη νίνο, феррилипосомы вводили внутрибрюшинно ММТУ-РуМТ мышам с опухолью под действием магнитного поля в течение 1 ч, приложенного к опухоли первой левой паховой молочной железы. Наночастицы оксидов железа, доставляемые с помощью феррилипосом, определялись как темная область на Т2-взвешенных МРизображениях спустя 1 и 48 ч после введения (фиг. 3а, 12), что подтвердило их успешное нацеливание на опухоль и очевидное контрастное действие в МРТ. Помимо способности проникать сквозь ткань опухоли, было обнаружено, что наночастицы могут проникать в области, прилегающие к опухоли, т.е. в микроокружение опухоли (фиг. 12). Данная способность феррилипосом является особо значимой для развития новых стратегий лечения рака, преимущество которых заключается в возможности управления процессом доставки с помощью магнитного поля (фиг. 13). Эффективность системы была также подтверждена при внутривенном введении феррилипосом (фиг. 14). Полученные результаты совокупно указывают на эффективность применения феррилипосом для направленной доставки лекарственных средств под действием магнитного поля и на возможность мониторинга их распределения с использованием неинвазивной технологии МРТ. Подтверждение внутриклеточной доставки нацеленных феррилипосом было получено для опухолевых и стромальных клеток; для этого в качестве модельного лекарственного средства использовали флуоресцентный маркер (А1еха Р1иог 555™). Клетки первичной опухоли и фибробласты эмбрионов ММТУ-РуМТ мышей инкубировали в течение 3 ч с суспензией феррилипосом, нагруженных красителем А1еха Р1иог 555™. Методом люминесцентной микроскопии выявлена крайне эффективная интернализация красителя А1еха Р1иог 555™ в клетки обоих типов (фиг. 3б). Кроме того, компартментализация флуоресцентных частиц во внутриклеточных везикулах клеток первичной опухоли и фибробластов ярко свидетельствует об успешном эндоцитозе содержимого феррилипосом. Таким образом, описываемая система-носитель представляется перспективной для направленной доставки лекарств в опухоли и их микроокружение и, следовательно, более эффективного лечения рака. Чтобы подтвердить ίη νίνο высвобождение лекарства из феррилипосом, ММТУРуМТ мыши (РуМТ1§/+) скрещивались с мышами линии РУВ/Ν с экспрессией люциферазы под контролем β-актин промотора (РУВ.1ис1§/+). У дважды трансгенных мышей (РУВ.1ис1д/+;РуМТ1д/+) развивался рак молочной железы с одновременной экспрессией люциферазы по всему организму. Спустя 24 ч после введения и направленной доставки феррилипосом, несущих субстрат люциферазы Э-люциферин, к опухоли люминесцентный сигнал визуализировался точно в области опухоли (фиг. 3в), указывая на успешное высвобождение субстрата. Эффективность системы была также подтверждена при внутривенном введении феррилипосом (фиг. 15). Впоследствии наночастицы выводились из организма без видимых признаков накопления (фиг. 16, 17), что явля- 21 029170

ется еще одним критическим параметром для их применения ίη νίνο.

Эффективность феррилипосом как видимой на МРТ системы доставки лекарств ίη νίνο для наночастиц оксидных ферримагнетков со структурой шпинели согласно формуле: Со₀.₈₄Ре₂1₆О₄ показана на фиг. 32. Высветление на месте крепления магнита 0.3 Т (белая стрелка) и на Т₁-МР сканограммах и соответствующее затемнение на месте крепления магнита (пунктирная белая стрелка) на Т₂-МР сканограммах показывает преимущественную аккумуляцию магнитолипосом, подтверждающее их возможное использование как одновременно позитивного и негативного МР контрастного средства.

Подавление роста опухоли молочной железы при феррилипосомной доставке 1РМ-565. Первоначальное тестирование системы феррилипосом для направленной доставки лекарств было

проведено с использованием традиционного химиотерапевтического препарата для лечения рака - доксорубицина. Лечение однократной дозой доксорубицина, доставляемого феррилипосомами, привело к сокращению объема опухоли на 90% спустя две недели после введения по сравнению с уменьшением на 60% после лечения доксорубицином по традиционной схеме (фиг. 18). В независимом исследовании было выявлено, что лечение препаратом, применение которого считалось неэффективным из-за низкой биодоступности, становится эффективным. Для этого брали препарат 1РМ-565 - низкомолекулярный ингибитор цистеиновых катепсинов широкого спектра действия, который очень хорошо зарекомендовал себя в лечении опухолей из островковых клеток поджелудочной железы у мышей, но являлся совершенно неэффективным для ММТУ-РуМТ мышиной модели рака молочной железы из-за своей крайне низкой биодоступности, хотя путем генетического удаления нескольких катепсинов удалось замедлить рост опухолей у ММТУ-РуМТ мышей. Цистеиновые катепсины, участвующие в процессе многоступенчатого развития опухоли, в основном вырабатываются клетками микроокружения, что дает возможность проверить новую концепцию нацеливания лекарств на микроокружение опухоли и новую систему доставки лекарств с целью усовершенствования методов лечения рака. Для того чтобы снять ограничения трансгенной мышиной модели ММТУ-РуМТ, в которой сложно отслеживать множественные очаги рака молочной железы, а также чтобы защитить функциональную иммунную систему (в отличие от ксенотрансплантации), была разработана мышиная модель ортотопической трансплантации рака молочной железы путем инокуляции 5х10⁵ первичных раковых клеток типа ММТУ-РуМТ в молочную железу конгенной иммунокомпетентной мыши-реципиента (линия мышей РУВ/Ν) (фиг. 19а). В отличие от исходной трансгенной модели модель ортотопической трансплантации позволила получить одну опухоль, которую легко отслеживать благодаря меньшей гетерогенности роста опухоли, вследствие чего данная опухоль становится идеальной для изучения эффективности лекарственных средств. Исходный объем опухоли равнялся 125 мм³, феррилипосомы, содержащие ингибитор 1РМ-565 в концентрации 100 мг/кг, вводились внутрибрюшинно 10 раз каждые два дня с приложением магнитного поля, направленного на опухоль. Размеры опухоли измеряли через сутки после каждой инъекции. В конце курса лечения опухоли вырезали и определяли их объем. Сравнивали антиопухолевый эффект ненагруженных феррилипосом, а также разное лечебное воздействие разных форм ингибитора 1РМ-565 (фиг. 19б). У мышей, подвергнутых лечению нацеленными феррилипосомами с ингибитором 1РМ-565, обнаружена значительная задержка роста опухоли по сравнению с остальными группами (фиг. 4а), без неблагоприятных эффектов. Также объемы удаленных опухолей в группе мышей, подвергнутых лечению нацеленными феррилипосомами с ингибитором 1РМ-565, были значительно меньше, чем в других группах (фиг. 4б, 20), что свидетельствует об успешном подавлении катепсинов в данной группе. Подтверждением этому служит существенное снижение активности цистеиновых катепсинов, уровень которых измерялся исключительно в образцах опухоли из данной группы (фиг. 4в), в то время как различий в экспрессии катепсина между всеми группами не выявлено (фиг. 21). В соответствии с предыдущими исследованиями значительное подавление цистеиновых катепсинов обнаружено в органах, расположенных вблизи брюшины (фиг. 22). Также подтверждено их последующее выведение из брюшины через лимфатическую систему (фиг. 23). Чтобы изучить роль цистеиновых катепсинов в биологических процессах, протекающих в опухолевых тканях, исследовали влияние подавления катепсинов на пролиферацию, васкуляризацию и инвазивность опухолей. Пролиферацию клеток измеряли методом иммуногистохимического определения маркера пролиферации Κί67. Выявлено значительное снижение скорости пролиферации опухолей, подвергнутых воздействию нацеленного ингибитора 1РМ-565, по сравнению с другими группами мышей (фиг. 46, 19), что указывает на снижение роста опухолей в данной группе. По данным распределения маркера эндотелиальных клеток СЭ31 не выявлено различий в васкуляризации опухолей после терапии (фиг. 20). Однако в ходе лечения нацеленным ингибитором 1РМ-565 наблюдалась тенденция к транслокации протеина клеточной адгезии Е-кадгерина из цитозоля на поверхность клетки (фиг. 4е), в результате чего снижалась инвазивность и развитие рака. С целью контроля качества доставки ингибитора 1РМ-565 к опухоли схему лечения имитировали путем нагружения феррилипосом флуоресцентным маркером (А1еха Р1иог 546™). Четко установлены успешная доставка данных феррилипосом к месту опухоли и поглощение их содержимого клетками микроокружения опухоли (фиг. 5а). Также показана ίη νίνο компартментализация маркера во внутриклеточных везикулах стромальных клеток опухоли (врезка на фиг. 5а). Последний факт имеет особое значение, так как предполагается, что катепсины из стромы опухоли играют важную роль в процессах,

- 22 029170

приводящих к развитию опухоли.

Помимо внутрибрюшинного введения терапевтических средств, которое является важной процедурой в хирургии и системной химиотерапии рака у некоторых пациентов, была также оценена эффективность внутривенного введения системы направленной доставки к опухоли и ее микроокружению у женских особей трансгенных ММТУ-РуМТ мышей. Обнаружено, что флуоресцируюущее вещество (А1еха Р1иог 555™), доставляемое феррилипосомами, солокализуется как со стромальными (фиг. 5Ъ, маркер СЭ206 для опухоль-ассоциированных макрофагов), так и с опухолевыми клетками (фиг. 5 с, эпителиальный маркер Е-кадгерин) в РуМТ ткани-мишени. Полученные результаты ясно показывают потенциальную пригодность феррилипосом для различных схем лечения.

Пример 1. Синтез наночастиц оксидов железа по данному изобретению.

Синтезируемые наночастицы оксидов железа являются предпочтительно ферримагнетиками (ферримагнитная шпинель, магнетит Ре₃О₄) могут также называться РМЮ (Геттаупейс 1гоп охк1е папорагйс1е8 - наночастицы оксидных ферримагнетиков). Ианочастицы оксидных ферримагнетиков (простых ферритов- таупеШе, Ре₃О₄) изготавливали путем механохимического синтеза. Механохимический синтез наночастиц простых ферритов описан, например, в работе \ак!еп е! а1., 2003. Однако в соответствии с данным изобретением для получения наночастиц оксидов железа впервые использованы кристаллогидраты солей. В частности, для получения магнетита (Ре₃О₄) применяли кристаллогидраты солей Ре8О₄-7Н₂О и РеС1₃-6Н₂О. Во избежание нагрева смеси реагентов во время активации дополнительно вводили хлорид натрия в качестве инертного компонента в пропорции 1:2. Механохимический синтез осуществляли в планетарной мельнице с водяным охлаждением МПВ (МРУ) при ускорении 60 у и весовом соотношении порошка (т. е. реагирующей смеси, содержащей два кристаллогидрата солей и \'а(О I) к стальным шарам 1:20. Время механической обработки в планетарной мельнице составило 30 мин. Полученный продукт промывали на фильтре дистиллированной водой до полного вымывания солей.

Электронно-микроскопические изображения и распределение по размеру наночастиц оксидов железа приведены на фиг. 1. Из рисунка видно, что полученные наночастицы оксидов железа имеют узкое распределение по размеру. Благодаря использованию кристаллогидратов солей вместо безводных солей, применяемых в традиционных методах, удается заменить твердофазный механизм синтеза на мягкий механохимический синтез в присутствии воды, что приводит к значительному увеличению скорости реакции. Также данный способ модификации обеспечивает образование сверхмалых сферических частиц диаметром 3-14 нм (> 70% менее чем 8 нм).

Пример 2. Синтез наночастиц оксидных ферримагнетков со структурой шпинели в соотвествии с формулой СохРе_3-хО₄, 0.1<х<0.99 согасно настоящего изобретения.

Получают наночастицы оксидных ферримагнетков со структурой шпинели механохимическим синтезом с использованием в качестве основных реагентов хлоридов железа и кобальта в присутствии инертного компонента - хлорида натрия по следующей реакции:

2РеС1₃ + СоС1₂ + Са(ОН)₂ + 3Νη₂<30₃ = Со_хРе₃._хО₄ + СаС1₂ + 6ШС1 + ЗСО₂| + Н₂О где 0.1<х<0.99.

Значение 0.6<х<0.98 является предпочтительным.

В качестве исходных материалов для синтеза применяют соли РеС1₃, СоС1₂ в форме кристаллогиратов. С целью изменения соотношения кобальта и железа в конечном продукте, предотвращения нагрева смеси реагентов и агрегации наночастиц дополнительно вводят инертный компонент - хлорид натрия. Полученную смесь герметизируют в закаленных стальных барабанах со стальными шарами диаметром 45 мм. Механохимический синтез проводят в планетарной мельнице МПВ (ускорение 55-60 у). Непременными условиями для достижения заданного технического эффекта изобретения являются строгое соблюдение соотношений массы реакционной смеси к массе инертного компонента, равного 1:(1-4), и масс порошка и шаров, равного 1:20, осуществление механохимического синтеза в течение 10-60 мин. Полученный продукт после термической обработки при 100°С в течение 0.5-1 ч или без нее промывают на фильтре дистиллированной водой до полного удаления солей и высушивают при комнатной температуре, после чего, если необходимо, обрабатывают ультразвуком и центрифугируют (УЗДН-2Т и "Вектап 12-21").

Фазовый состав, морфологию, дисперсность и параметры структуры наноразмерных порошков определяют с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА, установка "8с1итас1/и ΧΚΏ-6000", СиК_аизлучение) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ, прибор ЭМ-125), площадь удельной поверхности (8) - методом тепловой десорбции азота ("СОРБИ" N 4.1"), химический состав - методом рентгеновского флуоресцентного анализа (РФА, установка "8сЫта1/и ΧΕΏ-1800") и атомноэмиссионный спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ЮАР-6300 Оно, Тйегто 8с1епййс). Данные рентгеноструктурного анализа обрабатывают, используя программу полнопрофильного анализа РО\\'[)НК СЕЬЬ 2.5. Из значений площади удельной поверхности и плотности частиц рассчитывают их средний диаметр.

При исследовании магнитных свойств синтезированной феррошпинели кобальта используют методы анализа температурных зависимостей начальной магнитной проницаемости на частоте 10 кГц, а так- 23 029170

же кривых намагничивания и их производных, полученных в импульсных магнитных полях напряженностью до 3 Тл по методике, описанной в (В.Ю. Креслин, Е.П. Найден/ПТЭ, 2001, № 5, с. 63).

Исследование конечных продуктов механохимического синтеза показывает, что порошок состоит из слабосвязанных друг с другом наноразмерных сферических частиц с диаметром 3-20 нм (фиг. 26). Конечный продукт в зависимости от условий содержит 60-96 об.% феррошпинели кобальта кубической сингонии и другие фазы (табл. 2, 3).

Таблица 2

Влияние продолжительности активации на химический и фазовый состав наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели (Со_хРе_3-хО₄)

(ускорение 60 д, масса шаров:масса реагирующей смеси=20:1, масса ЫаС1:масса реагирующей смеси=2:1, реагенты РеС1₃-6Н₂О, СоС1₂-6Н₂О)

Время механоактивации, мин.	Химическая формула	Фазовый состав
5	Οθο.7ΐΡε2.29θ4	шпинель - 35% Ре2О3-11% β-РеООН - 50% аморф - 4%
10	Соо.ббРег.здСД	шпинель - 60% Ре2О3 - 7% β-РеООН - 27% аморф - 4%
15	СооетРег.ззОд	шпинель - 77% Ре2О3 - 4% β-РеООН - 15% аморф - 4%
25	СоотоРег.зоСЦ	шпинель - 94% Ре2О3-1% β-РеООН - 1% аморф - 2%
30	Соо.б9Ре2.з104	шпинель - 95% Ре2О3-1% β-РеООН - 0% аморф - 4%
40	Οθο.69Ρε2.3ΐ04	шпинель - 96% Ре2О3-1% β-РеООН - 0% аморф - 3%
50	СОо.71ре2 29θ4	шпинель - 87% Ре2О3- 1% β-РеООН -11% аморф - 4%
60	СОо.75ре2.2504	шпинель - 85% Ре2О3 - 0% β-РеООН - 14% аморф - 3%

Таблица 3

Влияние соотношения массы реакционной смеси к массе инертного разбавителя (ЫаС1) на химический и фазовый состав наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели (Со_хРе_3-хО₄) (ускорение 60 д, продолжительность механохимического синтеза 30 мин, масса шаров:масса реагирующей смеси=20:1, реагенты РеС1₃-6Н₂О, СоС1₂-6Н₂О)

Отношение массы реакционной смеси к массе инертного разбавителя	Химическая формула	Фазовый состав .
1:1	Соо^ЕеглбС^	шпинель - 57.96% Ре2О3 -12.48% β -РеООН - 29.56 %
1:2	Соо.84Ре2лб04	шпинель - 91.25% Ре2О3-3.56% β-РеООН-15.19% аморф - 0.02%
1:3	СОо.98Ее2.02С>4	шпинель - 84.53% Ре2О3 - 7.4% β -РеООН - 8.07%
1:4	Соо.99Ее2.<н04	шпинель - 90.22% Ре2О3-3.19% β -РеООН - 6.59%

Площадь удельной поверхности полученного наночастиц феррошпинели кобальта равна 113 м²/г, удельная намагниченность насыщения О - 22-25 Гс-см³/г.

Увеличение содержания инертного разбавителя с 1:2 до 1:(3 или 4) при продолжительности меха- 24 029170

нохимического синтеза 30 мин приводит к получению продукта практически стехиометрического состава (Со₀.₉₉Ре₂.₀₁О₄) вместо продукта с химической формулой Со₀.₈₄Ре₂.₁₆О₄ (табл. 3).

С дальнейшим увеличением в составе инертного компонента в реакционной смеси до 5:1 выход конечного продукта значительно уменьшается. В этом отношении более низкое граничное значение отношения массы смеси реакции к массе инертного компонента, как предполагалось, было 1:3.

Выход конечного продукта также определяется условиями механохимического синтеза. При соотношении масс шаров или хлорида натрия к массе реакционной смеси, равном 20:1 и 2:1 соответственно, и продолжительности механохимической активации 5 мин и менее степень превращения мала, соответственно очень низок (35%) выход целевого продукта (табл.2).

При дальнейшем увеличении продолжительности механохимической активации до 10 мин выход целевого продукта возрастает до 60% (нижнее значение), а после обработки в течение 25-40 мин выход составляет 94-96% (верхнее значение). В результате значение соотношения массы реакционной смеси к массе инертного компонента, равное 1:2, принято за верхнее граничное значение. Продолжительность механохимической активации, равная 60 мин, при прочих равных условиях определяется некоторым снижением выхода целевого продукта (до 85%) с ростом времени механической обработки. При дальнейшем увеличении продолжительности механохимического процесса выход продукта существенно не изменяется.

Таким образом, целесообразно осуществлять процесс механохимической активации в интервале параметров: отношение массы хлорида натрия к массе реакционной смеси равно (2:1)-(3:1); продолжительность механохимической активации 10-60 мин. Термическая обработка продукта механохимической активации при 100±20°С в течение 0.5-1 ч способствует получению целевого продукта химического состава Со_хРе_3-хО₄, где 0.1<х<0.99, и, как показано ниже, обладающего высокими контрастными свойствами при Т₁ и Т₂-релаксации.

Пример 3. Синтез наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в соотвествии с формулой Мп_хРе_3-хО₄,_где 0.1<х<0.99 согласно настоящего изобретения.

Исследование конечных продуктов механохимического синтеза показывает, что порошок кубической марганцовой феррошпинелей состоит из наноразмерных частиц сферической формы с диаметрами в интервале 5-19 нм.

Конечные продукты содержат в зависимости от условий синтеза до 90-99 об.% шпинельной фазы, остальное в основном β-ЕеООИ и гематит.

Химический состав наноразмерных порошков кубических феррошпинели марганца, полученной при отношении массы реакционной смеси к массе инертного компонента (№С1), равном 1:2, и продолжительности механохимического синтеза 30-40 мин, заметно отличается, как показывает метод рентгенофлуоресцентного анализа, от стехиометрического, и его химическая формула имеет вид Мп_хРе_3-хО₄, где х=0.50-0.96. Увеличение содержания инертного разбавителя до (1:4) приводит к получению порошков практически стехиометрического состава (табл. 4).

Магнитоуправляемость определяется магнитными свойствами наноразмерных порошков кубических феррошпинелей, удельная намагниченность которых составляет 20-30 Гс-см³/г.

Таблица 4

Химический и фазовый состав конечного продукта в зависимости от отношения массы реагентов к массе инертного разбавителя ΝαίΊ (масса шаров:масса реагирующей смеси=20:1, время активации 30 мин, термообработка 1 ч при 100°С)

Отношение массы реагентов к массе инертного разбавителя №С1	Химическая формула	Фазовый состав, об.%
1:1		Мп0.б2ре2.38О4	шпинель -81.4

		Ре2О3-6.1 β-ΡεΟΟΗ-12.5
1:2	Мп0.7оРе2.зо04	шпинель - 93.7% Ре2О3 - 2.4% β-ΡεΟΟΗ-3.9%
1:3	Мпо.84Ре2.1б04	шпинель - 98.2 Ре2О3- 1.8
1:4	Μπι .04Ре1..9бО4	шпинель - 99,8 Ре2О3 - 0,2

Пример 4. Стабилизация наночастиц оксидов железа по данному изобретению.

Наночастицы оксидов железа из примера 1 суспендировали в стабилизирующем буфере (буфере с

рН 7,4, содержащем 20 мМ цитрата натрия, 108 мМ ΝαίΊ и 10 мМ ИЕРЕ8; (рН 7.4), обрабатывали в ультразвуковом дезинтеграторе (ультразвуковой дезинтегратор Вгапзоп) с частотой 20 кГц в течение 3 мин и

- 25 029170

центрифугировали с ускорением 500 д в течение 3 мин, чтобы отделить оставшиеся неразрушенные агломераты. Полученную стабильную коллоидную суспензию неагрегирующих кластеров наночастиц изучали методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии на атомно-абсорбционном спектрометре Уапап §рес!гАА 110 (фирма Уапап, Ми1дгауе, Австралия) методом динамического рассеяния света с помощью системы РППЬ§/Ва1сЬР1и8 ДуЧет (фирма Ргесыоп Эе1есЮг5) и методом растровой электронной микроскопии на микроскопе ΡΕδΕΜ §ИРКА 35 УР (фирма Саг1 2е188), оснащенном системой энергодисперсионной спектроскопии 1пса 400 (фирма ОхГогП РЩгшпеШД. Дзета-потенциал наночастиц оксидов железа измеряли на анализаторе дзета-потенциала 2е1аРАЬ§ Уег. 3.19 при рН 7,4 и Т=37°С. Результат показан на фиг. 1а, б.

Пример 5. Коллоидная стабильность наночастиц оксидов железа.

Наночастицы оксидов железа суспендировали в стабилизирующем буфере (содержащем 20 мМ цитрата натрия, 108 мМ ЫаС1 и 10 мМ ΗΕΡΕ§; рН 7.4). Полученные агломераты диспергировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (Вгапзоп), а затем отделяли оставшиеся агломераты центрифугированием с ускорением 500 д в течение 3 мин (центрифуга БррепйогГ 5417С, БррепйогГ). Этап просушивания наночастиц, являющийся частью оригинальной процедуры (ЬаЛеп, е1 а1., 2003), пропускали. Коллоидную стабильность наночастиц оксидов железа тестировали путем повышения ионной силы раствора (концентрации ЫаС1 со 108 до 324 мМ) при двух разных показателях рН (рН 5,5, рН 9,0) раствора. Коллоидную стабильность оценивали путем измерения средних размеров кластеров оксидов железа в полученных суспензиях методом динамического рассеяния света (Пупапис ПдП1 ксаИегшд ЭЬЗ) с помощью системы РППЬ§/Ва1сЬР1и8 ДуЧет (Ргешкюп Эе1есЮг5). Показано, что данные буферные растворы позволяют получать стабильные суспензии.

Пример 6. Коллоидная стабильность наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели согласно формуле Со₀.₈₄Ре₂.1₆О₄.

Суспензию наночастиц Со₀.₈₄Ре₂₄₆О₄ в стабилизирующем буфере получают (рН 7) методом ультразвуковой дезинтеграции (ВаиПеНп). Для приготовления наносуспензии, например, 100 мг наночастиц растворяют в стабилизирующем буфере (20 мМ цитрата натрия, 108 мМ хлорида натрия, 10 мМ ΗΕΡΕ§ (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) и сонифицируют (20 кГц, 50 В) в течение 5 мин. Во время сонификации крупные агрегаты наночастиц разбиваются и покрываются макромолекулами цитрата натрия, предотвращая обратную агрегацию. Неразбитые частицы осаждают в гравитационном поле 500 д.

Пример 7. Синтез феррилипосом по данному изобретению.

Липосомы с наночастицами оксидов железа (феррилипосомы) изготавливали из смеси с процентным содержанием Ь-а-фосфатидилхолина (фирма АуапП ЫрЛк) 95% и 1,2-дистеарил-8п-глицеро-3фосфоэтаноламин-Ы-[метокси(полиэтиленгликоля-2000] (фирма АуапП ЫрШз) 5% с общей концентрацией липидов 2.75 мМ. Органический растворитель выпаривали в концентраторе БррегЛогГ 5301 (РррегЛогГ) до получения сухих липидных пленок. Затем их гидратировали буфером (рН 7,4), содержащим 20 мМ цитрата, 108 мМ ЫаС1 и 10 мМ ΗΕΡΕ§ с наночастицами оксидов железа, и получали многослойные везикулы, заполненные наночастицами. Многослойные везикулы экструдировали миниэкструдером, содержащим поликарбонатную мембрану с размером пор 100 нм (фирма АуапП ЫрШз), с целью получить наноразмерные липосомы, которые образуют феррилипосомы. Неинкапсулированные наночастицы удаляли путем гель-фильтрации на колонне с сорбентом ДерПаПех™ 0-25 М РЭ-10 (фирма ΟΕ НеаППсаге). Феррилипосомы отделяли магнитным способом от пустых липосом на магнитном сепараторе Эупа1 МРС-Д (фирма Эупа1) и ресуспендировали в стабилизирующем буфере. Морфологию и размер феррилипосом контролировали методом атомно-силовой микроскопии (изображения получали с помощью сканирующего зондового микроскопа Ыапоксоре III Ми1ПтоПе (фирма Э1дПа1 ИЩгитеШЦ), работающего в полуконтактном режиме) и методом динамического рассеяния света (ЭЬД).

Для изучения флуоресценции феррилипосомы функциализировали декстраном, который метили красителем А1еха Р1иог 546™ (фирма 1пуИгодеп) или неконъюгированным красителем А1еха Р1иог 555™ (фирма 1пуИгодеп). Красители А1еха Р1иог 546™ или А1еха Р1иог 555™ суспендировали (100 мкг/мл) в стабилизирующем буфере, содержащем наночастицы оксидов железа, а затем инкапсулировали в пегилированные липосомы согласно описанной методике. Флуоресцирующие феррилипосомы отделяли от неинкапсулированного красителя А1еха Р1иог путем гель-фильтрации на колонне с сорбентом ДерПаПех™ 0-25 М (фирма 0Ε НеаНПсаге).

Липосомы (фееррилипосомы), нагруженные оксидными ферримагнетиками со структурой шпинели согласно формуле Со₀.₈₄Ре₂₄₆О₄, были приготовлены. Аликвоту липидов (2.6 мМ фосфатидилхолина и 0.2 мМ 1,2-дистеарол-8п-глицеро-3-фосфоэтанламин-М-[метокси(полиэтилен гликоля)-2000] (АуапП Ро1аг Ыр1Й8, 1пс.)), растворенных в хлороформе, помещают в вакуум для испарения растворителя с формированием сухих липидных пленок. Сухие пленки гидратируют добавлением стабилизированных наночастиц (3.4 мМ).

Дисперсию эмульсифицируют сонификацией на ультразвуковой бане в течение 5 мин. Размер липосом определяют с помощью динамического светорассеяния (Пупапис ЫдЫ ДсаПеПпд Эе1есЮг РЭ 2000

- 26 029170

ΌΌδ Р1из). Липосомальные сфероиды диаметром 90-110 нм были визуализированы атомной силовой микроскопией (АСМ).

Пример 8. Животные модели.

Использовали самок ΡνΒ/Ν и Р’У^гВ/№Тд№ММТ’У^гРу’^)634Ми1 мышей в соответствии с протоколом, выпущенным Управлением ветеринарии республики Словения (νΑΚδ) и правительственного Комитета по этике. Правила содержания и использования животных соблюдались в соответствии с политикой Комитета здравоохранения по гуманному содержанию и использованию лабораторных животных и "Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных" (ΝΙΗ риЬРсайоп 86-23, 1996). Опухоли для исследования лечения генерировали следующим образом: клетки первичной ММТ^РуМТ опухоли получали от 14-ти недельных трансгенных ММТV-РуМТ мышей, размножали в культуре, суспендировали в 200 мкл бессывороточной модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ИМЕМ) (ЛпуПгодеп), а затем 5х10⁵ клеток вводили в левую паховую молочную железу мыши-реципиента (линия мышей ΡνΒ/Ν).

Пример 9. МРТ сканирование ш укго и ш νί\Ό.

Все МРТ-эксперименты проводили на МРТ-спектрометре ТесМад Аро11о с горизонтальным сверхпроводящим магнитом с индукцией 2.35 Тл (фирма ОхГогк 1п8ГтитепГ8) с использованием 25миллиметровой седлообразной радиочастотной катушки Вгикег. Время спин-решеточной и спинспиновой релаксации (Т₁ и Т₂) измеряли при разных концентрациях наночастиц оксидов железа в 1%ном растворе агарозы при комнатной температуре методом инверсии-восстановления и спинового эха соответственно. Продольную (г₄) и поперечную (г₂) релаксивность рассчитывали по формуле г₁=(1/Т₁1/Т₁₀)/с, где с - концентрация наночастиц оксидов железа в мМ, Т₁ - время релаксации при концентрации с, Т₁₀ - время релаксации 1%-ного раствора агарозы, и 1=1, 2 для Т₁ и Т₂. Двумерные МРТ изображения получали с помощью стандартной последовательности многократных эхо-импульсов со временем появления эхо-сигнала (ТЕ) 8,5 мс и временем повторения импульса (ТК) 400 тз для Ц-взвешенных изображений, и ТЕ=60 мс, ТК=2000 мс для Т₂-взвешенных изображений. Область сканирования составляла 40 мм с разрешением в плоскости 156 мкм и толщиной среза 1 мм. Наличие феррилипосом определяли ех νί\Ό на Т₂-взвешенных изображениях до и после введения 50 мкл раствора феррилипосом (3.4 мМ наночастиц) в одну из опухолей. Для визуализации феррилипосом ш νί\Ό к правой паховой молочной железе 12-ти недельной мыши приклеивали цианакрилатным клеем внешний магнит с индукцией 0,33 Тл (диаметром 4,5 мм) и вводили внутрибрюшинно 200 мкл феррилипосом (3.4 мМ наночастиц). Магнит убирали через 1 ч после удаления с помощью ацетона. Т₂-взвешенные изображения получали перед введением, через 1 ч после введения и через 48 ч после введения феррилипосом. Сканирование мыши проводили под анестезией после подкожного введения кетамина/ксилазина/ацепромазин (50/10/1.0 мг/кг).

Пример 10. Культура клеток и оценка интернализации феррилипосом ех νί\Ό.

Клетки первичной ММТ^РуМТ опухоли изолировали и культивировали, как описано в [36]. Фибробласты эмбрионов мышей брали от эмбрионов ΡνΒ/Ν мышей через 12,5 дней после коитуса, причем для экспериментов использовали только клетки с низким количеством пассажей (в общем <4 пассажей). Все первичные клетки хранили в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки (фирма 81дта), 2 мМ Ь-глутамина (фирма 1пуПгодеп). 100 единиц пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (фирма 1пуПгодеп). Культивируемые клетки хранили при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂. Для микроскопического исследования флуоресценции клетки первичной ММТV-РуМТ опухоли культивировали с 500 мкл феррилипосом, функционализированных красителем А1еха Р1иог 555™, в нормальной питательной среде на предметных стеклах ЬаЬ-Тек™ (фирма Νιιικ). После инкубирования с наночастицами в течение 3 ч клетки промывали в ФСБ, окрашенном красителем НоесЬзГ 33342 (фирма Р1ика), и изучали на флюоресцентном микроскопе О1утриз 1X81 (фирма О1утриз) с программным обеспечением 1тадшд 5>оП\\аге Гог ЫГе 8с1епсе Мктозсору Се11Г

Пример 11. Оценка нацеливания и интернализации феррилипосом ш νί\Ό методом биолюминесценции.

Самки Р’У^гВ/№Тд№ММТ’У^гРу’^)634Мц1 мышей (РуМТд/+), у которых развивались множественные аденокарциномы, скрещивали с мышами линии Ρνβ/Ν с экспрессией люциферазы под контролем βактин промотора (Р'9^гВ.1исГд/+)30. У полученных дважды трансгенных мышей ^'УВЛисГдА; РуМТд/+) развивался рак молочной железы с одновременной экспрессией люциферазы по всему организму. Для контроля ш νί\Ό за распределением феррилипосом и высвобождением их содержимого феррилипосомы функционализировали Ό-люциферином (фирма 81дта) путем суспендирования в стабилизирующем буфере с наночастицами (2.5 мг/мл) и затем инкапсулирования в пегилированные липосомы. Феррилипосомы с Ό-люциферином (30 мг/кг) вводили в дозе 400 мкл внутрибрюшинно 10-ти недельной Р'9^гВ.1исГд/+; РуМТд/+ мыши и прикрепляли магнит к опухоли первой правой грудной молочной железы. В контрольном эксперименте магнит отсутствовал. Спустя 24 ч после введения феррилипосом магнит убирали и проводили сканирование мышей с помощью системы визуализации ΐνΐδ® (время интеграции 5 мин, ΐνΐδ® 100 Бепез). Сканирование мышей проводили под газовой анестезией 5% изофлюраном при 37°С. Благодаря присутствию люциферазы во всех клетках высвобождение Ό-люциферина и его после- 27 029170

дующее преобразование люциферазой привело к эмиссии биолюминесцентного сигнала, который визуализировался с помощью системы визуализации ΐνΐδ®.

Пример 12. Исследование лечения.

Режим дозирования для лечения ингибитором ДРМ-565 определяли на основе данных исследований, в которых использовали мышей линий К1Р1-Тад2 и ММТУ-РуМТ [33-35, 45]. Ингибитор 1РМ-565 не оказывал заметных побочных и токсических эффектов у испытуемых животных [33, 45]. Регулярное введение препарата с помощью магнитного нацеливания осуществляли, когда объем опухолей достигал 125 мм³. Ингибитор 1РМ-565 растворяли в стабилизирующем буфере, содержащем наночастицы оксида железа, и затем инкапсулировали в пегилированные липосомы. Феррилипосомы с 1РМ-565 вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг 10 раз каждые два дня (1РМ+РЫ, η=9). Магниты с индукцией 0,33 Тл (диаметром 4,5 мм) прикрепляли к опухоли перед первой инъекцией и убирали через 24 ч после последней инъекции, как описано выше. В контрольных группах проводили лечение с применением стабилизирующего буфера (контроль, η=7), феррилипосом с магнитным нацеливанием (РЫ, η=5), ингибитора 1РМ565 в стабилизирующем буфере с наночастицами ОРМ, η=7) и феррилипосом, содержащих ингибитор 1РМ-565 без магнитного нацеливания (ХРМ+РЬ, η=7).

Горизонтальный и вертикальный диаметры опухолей измеряли цифровым штангенциркулем каждые два дня до окончания лечения, объем опухолей рассчитывали по формуле У=(ахЬ2)п/6, где а и Ь больший и меньший диаметры опухоли. На следующий день после последней инъекции мышей умерщвляли, и вырезали опухоли в рассчитанных объемах.

Пример 13. Флуоресцентный анализ направленной доставки феррилипосом и их интернализация ίη

νίνο.

Для исследования ίη νίνο 200 мкл феррилипосом функционализировали красителем А1еха Рйюг 546™ и вводили внутрибрюшинно мышам с ортотопически трансплантированным раком молочной железы ежедневно в течение 3 дней. Также феррилипосомы, функционализированные красителем А1еха Рйюг 555™, вводили внутривенно трансгенным РуМТ мышам с раком молочной железы ежедневно в течение 2 дней. Приложение магнитного поля к опухоли осуществляли в течение 12 ч сразу после каждой инъекции. На следующий день после последней инъекции мышей умерщвляли и производили резекцию соответствующих опухолей, которые помещали на ночь в 10%-ный раствор формалина, дегидратировали на гистопроцессоре фирмы δΐιηηάοη (δίκπιάοη С.’Па<к1 1000) и заключали в парафин (станция для заливки в парафин Мкгот ЕС 350) или мгновенно замораживали в жидком азоте. Затем готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм и заключали их в среду с красителем ЭАР1 (антифединговый реагент ΓΓοΙοηβΑ. Οο1ά с ЭАР1. фирма Ιηνίίτο^η) и визуализировали, как описано выше.

Пример 14. Иммуногистохимическое исследование.

Гистологическое исследование пролиферации путем окрашивания маркером Κί67 и скорости васкуляризации опухоли с использованием маркера СЭ31 проводили, как описано в работах [38, 46]. Для оценки данных случайным образом выбирали 10 участков опухоли с помощью объектива с увеличением 40х и измеряли с помощью программы ТЫнеОиеЧ (фирма Т188ие0гю81к8). Иммунологический анализ белка межклеточной адгезии Е-кадгерина проводили на криоконсервированных срезах опухолей с использованием кроличьего антимышиного Е-кадгерина (фирма АЬсат; разведение 1:100) и вторичных антикроличьих антител козы А1еха Рйюг 488 (фирма Ιηνίίτο^η; разведение 1:100). Р1ТС-меченые моноклональные крысиные антимышиные антитела СЭ206 (1:100; фирма АЬИ δе^οίес) использовали для определения опухоль-ассоциированных макрофагов на криоконсервированных срезах опухолей. Образцы докрашивали красителем Нцес^ 33342 (5 мкг/мл, фирма Р1ика) и помещали в антифединговый реагент Р^ο^οηд® Οο1ά (фирма Ιηνίίτο^η), а затем изучали на флюоресцентном микроскопе О1утри8 IX 81 (фирма О1утри8) с программным обеспечением 1тадшд δοΠ\\ΉΐΌ Гэг Ы£е δс^еηсе М^с^ο8сοру Се11Г.

Пример 15. Статистический анализ.

Количественные данные представлены в виде средних значений плюс/минус стандартное отклонение. Различия в результатах лечения ингибитором 1РМ-565 сравнивали с помощью критерия Стьюдента. В случае р-значений, равных 0,05 и меньше, различия считались статистически значимыми.

Пример 16. Влияние пегилирования липосом на поглощение макрофагами.

Для данного исследования выращивали моноциты линии ТНР-1 при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂. Клетки культивировали на среде КРМ1 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ Ь-глутамина, 100 единиц пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10 мМ НΕРΕδ буфера. Клетки ТНР-1 дифференцировали в макрофаги путем добавления 30 мкл раствора, содержащего 10 мМ форбол12-миристат-13-ацетата, и выдерживания в течение 24 ч. Затем клетки инкубировали с аликвотами (100 мкл) пегилированных и непегилированных липосом, функционализированных красителем А1еха Рйюг 546™, в среде Игла в модификации Дульбекко на 96-луночном планшете с оптическим плоским дном (фирма Ыипс, США) в течение 15 мин. На следующем этапе клетки промывали 3 раза фосфатным буфером с рН 7,4 и изучали на спектрофотометре для чтения 96-луночных планшетов δτιρίιίτ^ (фирма ТЕСАН Австрия) при длине волны возбуждения и излучения 561 и 572 нм соответственно.

Пример 17. Ιη νίίτο анализ на токсичность.

- 28 029170

Фибробласты эмбрионов мышей и первичные ММТУ-РуМТ клетки хранили в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки (фирма 81дша), 2 мМ Ьглутамина (фирма Ιηνίίτο^η), 100 единиц пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (фирма Ιηνίίτο^η) при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂.

Для ίη νίίτο анализа на токсичность клетки инкубировали с феррилипосомами, содержащими 3.4 мМ наночастиц оксидов железа или 3.4 мМ и 55 мМ наночастиц оксидов железа, в фосфатном буфере с рН 7,4 в течение 24 ч при 37°С. В контрольном эксперименте наночастицы отсутствовали. Влияние фосфатидилсерина и фрагментацию ДНК определяли путем мечения клеток красителем Аппехт У-РЕ в присутствии пропидиум иодида в соответствии с инструкцией производителя. Затем клетки анализировали методом проточной цитометрии на проточном цитометре РАСЗсайЬит (фирма ВесЮн ΌίοΚίηδοη, США) с использованием программного обеспечения СеПОиеЛ

Пример 18. Лечение доксорубицином.

Данный способ лечения исследовали с использованием недавно разработанной мышиной модели ортотопической трансплантации рака молочной железы на конгенных мышах (как описано в рукописном экземпляре).

Доксорубицина гидрохлорид (фирма 8щта) растворяли в стабилизирующем буфере, содержащем наночастицы ферримагнитных оксидов железа, и затем инкапсулировали в пегилированные липосомы. Спустя три недели после трансплантации первичных клеток (когда средний объем опухоли достиг 75 мм³) феррилипосомы с доксорубицином вводили в дозе 15 мг/кг (Όοχ+ΡΌί, п=4). Магниты с индукцией 0,33 Тл (диаметром 4,5 мм) приклеивали цианакрилатным клеем к опухоли перед инъекцией и убирали с помощью ацетона через 24 ч после введения препарата. В контрольной группе лечение проводили методом системного введения доксорубицина без нацеливания (Όοχ, п=4). Горизонтальный и вертикальный диаметры опухолей измеряли цифровым штангенциркулем два раза в неделю, объем опухолей рассчитывали по формуле У=(ахЬ2)п/6, где а и Ь - больший и меньший диаметр опухоли соответственно.

Пример 19. Дополнительная оценка нацеливания и интернализации феррилипосом ίη νίνο методом биолюминесценции.

Клетки первичной ММТУ-РуМТ опухоли, полученные от 14-ти недельных трансгенных ММТУРуМТ мышей, размножали в культуре, суспендировали в 200 мкл бессывороточной среды Игла в модификации Дульбекко (фирма Ιηνίίτο^η), а затем вводили (5x10 клеток) в левую паховую молочную железу реципиентной самки РУВ/Ν мыши с экспрессией люциферазы под контролем промотора β-актина (РУВ.1иСд/+). Для контроля ίη νίνο за распределением феррилипосом и высвобождением их содержимого феррилипосомы функционализировали Ό-люциферином (фирма 8щта) путем суспендирования в стабилизирующем буфере с наночастицами (2.5 мг/мл) и затем инкапсулирования в пегилированные липосомы. Феррилипосомы с Ό-люциферином (30 мг/кг) вводили в дозе 400 мкл внутрибрюшинно РУВ.1иСд/+мыши с трансплантированной опухолью, и прикрепляли магнит к опухоли левой паховой молочной железы. Спустя 24 ч после введения феррилипосом магнит убирали и сканировали мышей неинвазивным методом с помощью системы визуализации 1У18® (время интеграции 5 мин, 1У18® 100 8егтев). Сканирование мышей проводили под газовой анестезией 5%-ным изофлюраном при 37°С. По завершении сканирования всего организма мышей умерщвляли, их органы брали на исследование и сканировали на системе 1У18® (2 мин, 1У18® 100 8епе% Благодаря присутствию люциферазы во всех клетках высвобождение Ό-люциферина и его последующее преобразование люциферазой привело к эмиссии биолюминесцентного сигнала, который визуализировался с помощью системы визуализации 1У18®.

Пример 20. Оценка выделения феррилипосом ίη νίνο.

С целью выяснить путь выведения феррилипосом использовали трансгенных мышей с экспрессией люциферазы по всему организму и феррилипосомы, нагруженные субстратом люциферазы Όлюциферином, вводимые внутрибрюшинно или внутривенно с магнитным нацеливанием. Мышей сканировали неинвазивным методом на системе визуализации 1У18® (время интеграции 5 мин, 1У18® 100 8епе5 для в/б введения, 1У18 8рес1гит для в/в введения). Сканирование мышей проводили под газовой анестезией 5%-ным изофлюраном при 37°С. В обоих случаях люминесцентный сигнал четко определялся по ходу мочевыводящих путей мышей, указывая на выведение наночастиц посредством почечного клиренса, одинаково для обоих способов введения феррилипосом.

Пример 18. Исследование острой токсичности.

Самкам крыс вводили 500 мг/кг наночастиц оксидов железа (η=16) и стабилизирующий буфер (η=8) в качестве контроля. Мышей умерщвляли на 7 и 12 день после инъекции. Кровь собирали, и проводили разделение сыворотки методом центрифугирования в пробирках с Όί-гепарином 0,6 мл (фирма Рир Р1юЮ Рйт Си., Όίά. МГе 8аеисе РгокиСз Όίνίδίοη). Анализ биохимических показателей - креатинина, азота мочевины, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, креатинфосфокиназы и общего билирубина в крови - проводили с помощью биохимического анализатора Ри)Ш1т ΌΚΙ СНЕМ 3500Ϊ (фирма Рир Р1юЮ Рйт СЬ., Όίά. БОс 8с1еисе РгокисД Όίνίδίοη). Ткани почек, селезенки, печени, сердца и легких собирали и помещали в 10%-ный раствор нейтрального формалина. Органы дегидрировали и помещали в парафиновые блоки. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином для

- 29 029170

гистопатологического анализа. Наночастицы оксидов железа в тканях животных обнаруживали методом окраски берлинской лазурью по Перлсу с кармином (фирма Зфша).

Пример 22. Анализ активности цистеиновых катепсинов.

Криоконсервированные ткани первичных опухолей, легких, почек, поджелудочных желез и печени разрушали в 200 мкл 0,1М трис буфера (5 мМ ЭДТА, 200 мМ хлорида натрия, 0,2% додецилсульфата натрия (3Ό3), рН 8.5) с использованием диспергатора ШРаШиггах (фирма ΙΚΑ, 31аи£еп, Германия) и центрифугирования при 1000 д в течение 10 мин. Активность цистеиновых катепсинов определяли путем гидролиза субстрата катепсинов 2-РЬе-Агд-7-амидо-4-метилкумарина (Ζ-РЬе-Агд-АМС, 25 мМ; фирма Васкеш, ВиЪепбогЦ Швейцария) в 0,1М фосфатном буфере с рН 6,0, содержащим 1 мМ ЭДТА, 0,1% ПЭГ и 1 мМ дитиотреитола. Осуществляли непрерывный мониторинг кинетики гидролиза субстрата в течение 10 мин методом спектрофлуориметрии при длине волны возбуждения и излучения 370 и 460 нм соответственно.

Пример 23. Количественная ПЦР в реальном времени.

Выделяли тотальную РНК из образцов опухолей и проводили обратную транскрипцию мРНК в кДНК. Количественную ПЦР в реальном времени проводили методом детекции интеркалирующего красителя ЗУВК Сгееп во вновь образованных продуктах ПЦР на системе ПЦР в реальном времени Мх3005РТМ (фирма АдДеп!, 31га1адепе РгобиЫз). Относительную величину экспрессии целевых генов нормализовали по отношению к β-актин транскриптам. Праймеры: Ъ-актин.1:

5'-АСС САО ОСА ТТО СТО АСА ОО-З'

(8Е(2 Ш Νο. 1); Ь-актин.2: 5'-ООА САО ТОА ООС САО ОАТ ОО-З' (ЗЕО ГО Νο. 2);

С1зЬ.1: 5-ТОС ОТТ СОО ТОА ООА САТ АО-3' (ЗЕ(2 ГО Νο. 3); С1зЬ.2: 5'-СОО ОСА ОТТ

ООА ССА ТТО-3' (8Е<2 ГО Νο. 4); С1з1.1: 5'-ОСА СОО СТТ ТТС САТ ООА-3' (8Е0 ГО

Νο. 5); СЫ.2: 5'-ССА ССТ ОСС ТОА АТТ ССТ СА-3' (ЗЕО ГО Νο. 6); Οίδχ.Ι: 5'-ТАТ ОСС

АОС ОТС АСС АОО ААС-3' (8Е<3 ГО Νο. 7); С1зх.2: 5'-ССТ СТТ ОАТ ОТТ ОАТ ТСО

ОТС ТОС-3' (ЗЕ(2 ГО Νο. 8); С1зЬ.1: 5'- САТ ООС ТОС ААА ООА ООТ СТ-3' (ЗЕ(3 ГО

Νο. 9); С1зЬ.2: 5'-СТО ТСТ ТСТ ТСС ΑΤΟ АТО ССС-3' (8Е<3 ГО Νο. 10).

Пример 24. Флюоресцентный анализ накопления феррилипосом в брюшных лимфатических узлах.

С целью оценить клиренс из брюшной полости для феррилипосом трансгенной РуМТ мыши с раком молочной железы ежедневно вводили 200 мкл феррилипосом, функционализированных красителем А1еха Р1иог 555™, в течение 3 дней. Магнитное поле прикладывали на 12 ч сразу после каждой инъекции. Спустя 24 ч последней инъекции мышей умерщвляли, и вырезали почечные лимфатические узлы, которые помещали на ночь в 10%-ный раствор формалина, дегидрировали на гистопроцессоре фирмы ЗЬапбоп (ЗЬапбоп Скас1е1 1000) и заключали в парафин (станция для заливки в парафин Мгогош ЕС 350). Затем готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм, и заключали их в среду с красителем Г)АР1 антифединговый реагент Рго1опд@ Сток! с 1)АРР фирма 1пуЦгодеп) и визуализировали, как описано выше.

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ изготовления наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели для Т₁ и/или Т₂ магнитно-резонансного сканирования (МРТ) в соответствии с формулой

   где 0<х<1, предпочтительно 0,05<х<1, и

   где М выбран из Ре, Си, Со, Νί, Мд и Мп, в особенности М представляет собой Ре, включающий следующие шаги:

   ι) смешение по крайней мере одной кристаллогидрата неорганической соли Ре, в особенности РеС1₃, по крайней мере одной кристаллогидрата неорганической соли М, гидроксида и/или карбоната щелочного металла, в особенности №О1 Р

   ϊϊ) добавление инертного разбавителя, в особенности №С1 к смеси ι),

   ϊϊϊ) истирание и/или измельчение в мельнице смеси ϊϊ),

   ιν) промывание и/или просушивание продукта ίίί) по необходимости.
2. 2. Способ изготовления наночастиц по п.1, отличающийся тем, что в качестве М выбран Ре для изготовления упомянутых частиц, при этом на шаге ι) осуществляют смешение кристаллогидрата соли РеС1₃-6Н₂О и кристаллогидрата соли РеЗО₄-7Н₂О и №О11 предпочтительно в соотношении 2:1:8, на шаге ϊϊ) осуществляют добавление №С1 к смеси ι) предпочтительно в весовом соотношении от 1:0,5 до 1:4, предпочтительно в соотношении 1:2 в смеси ι) к №С1, на шаге истирания и/или измельчения смеси ϊϊ), ϊϊϊ) осуществляют истирание в планетарной мельнице предпочтительно путем герметизации смеси ϊϊ) в стальные цилиндры со стальными шарами и истирания в планетарной мельнице с ускорением от 30 д до около 100 д, предпочтительно при 60 д, и в котором истирание предпочтительно осуществляется в течение от 5 мин до 3 ч, в особенности в течение приблизительно 30 мин.
3. 3. Способ изготовления наночастиц по п.1, отличающийся тем, что вышеупомянутый М есть Со для

   - 30 029170

   изготовления вышеупомянутых наночастиц в соответствии с формулой

   где 0,1<х<0,99, предпочтительно 0,6<х<0,98; и

   где смесь в шаге ί) состоит из РеС1₃, СоС1₂, Ыа₂СО₃ и Са(ОН)₂ предпочтительно в соотношении 2:1:3:1,

   где добавляют ЫаС1 к смеси ί) в шаге ίί) предпочтительно в соотношении от 1:0,5 до 1:4, предпочтительно от 1:2 до 1:3 смеси ί) к ЫаС1;

   где истирания и/или измельчения смеси ίί) осуществляют:

   истирание в планетарной мельнице путем герметизация смеси ίί) в стальные цилиндры со стальными шарами и истирания в планетарной мельнице в течение от 5 мин до 3 ч, предпочтительно в течение 10 до 60 мин,

   где РеС1₃, СоС1₂ в шаге ί) имеет форму кристаллогидрата соли.
4. 4. Способ изготовления наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели для Т₁ и/или Т₂ магнитно-резонансного сканирования (МРТ) в соответствии с формулой

   где 0,1<х<0,99, а именно 0,6<х<0,98. и включающий следующие шаги:

   ί) смешение РеС1₃, МпО₂ и ЫаОН предпочтительно в соотношении приблизительно 2:1:6; ίί) добавление ЫаС1 к смеси ί);

   ίίί) истирание и/или измельчение в мельнице смеси ίί), предпочтительно истирание в планетарной мельнице путем герметизации смеси ίί) в стальные цилиндры со стальными шарами и истирание измельчением в планетарной мельнице, в которой истирание осуществляется в течение от 5 мин до 3 ч, в особенности в течение приблизительно 30 мин;

   ΐν) промывание и/или просушивание продукта ίίί) по необходимости, в котором РеС1₃ в шаге ί) имеет форму кристаллогидрата соли РеС1₃, и где добавляют ЫаС1 к смеси ί) в шаге ίί) предпочтительно в соотношении от приблизительно 1:1 до 1:3 смеси (ί) к ЫаС1.
5. 5. Наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, получаемые способом по любому из пп.1-4, обладающие одновременно Т₁ и Т₂ МРТ-контрастными свойствами, где:

   а) диаметр наночастиц составляет от 1 до 50 нм, предпочтительно от 1 до 30 нм, еще более предпочтительно от 1 до 15 нм, наиболее предпочтительно от 3 до 14 нм, и/или

   б) более чем 70% наночастиц имеют диаметр менее чем 8 нм, и/или

   в) диаметр наночастиц составляет менее чем 50 нм, более предпочтительно менее чем 30 нм, еще более предпочтительно менее чем 15 нм, и/или

   г) удельная поверхность наночастиц варьируется от 50 до 200 м²/г, более предпочтительно от 100 до 160 м²/г, и/или

   д) отрицательный дзета-потенциал поверхности наночастиц варьируется от 20 до 30 мВ, предпочтительно составляет 28 мВ при рН 7,4 и 37°С.
6. 6. Способ изготовления биосовместимой водной коллоидной системы, обладающей одновременно Т₁ и Т₂ МРТ-контрастными свойствами, включающий суспендирование в биосовместимом солевом растворе наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой типа шпинели, характеризующихся химической формулой

   где 0<х<1, предпочтительно 0,05<х<1, и

   где М выбран из Ре, Си, Со, Νί, Мд и Мп, в особенности М представляет собой Ре, которые получают выполнением последовательности операций по одному из пп.1-4.
7. 7. Биосовместимая водная коллоидная система, содержащая наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, получаемая способом по п.6, обладающая одновременно Т₁ и Т₂ МРТконтрастными свойствами.
8. 8. Способ по п.6, отличающийся тем, что состоит из следующих шагов:

   ί) суспендирование наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, предпочтительно наночастиц оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели в виде порошка, в биосовместимом солевом растворе,

   ϊϊ) разрушение образующихся в шаге ί) агломератов с помощью ультразвука, предпочтительно разрушение с помощью ультразвукового дезинтегратора с частотой от 10 до 40 кГц, предпочтительно приблизительно 20 кГ ц,

   ίίί) удаление оставшихся агломератов путем центрифугирования при ускорении от 100 до 1000 д, более предпочтительно от 200 до 800 д, еще более предпочтительно при 500 д,

   где наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по п.5 используются в шаге ί).
9. 9. Способ по любому из пп.6, 8, где биосовместимый солевой раствор представляет собой многокомпонентный буферный раствор, состоящий из:

   ί) от 50 до около 500 мМ №С1, предпочтительно от 80 до 400 мМ №С1, более предпочтительно от

   - 31 029170

   100 до 350 мМ №С1, еще более предпочтительно 100 мМ №С1, и

   ίί) от 200 до 2 мМ цитратный буферный раствор, предпочтительно от 100 до 10 мМ цитратный буфер, более предпочтительно от 20 мМ цитратный буферный раствор,

   ш) от 100 до 1 мМ НЕРЕЗ, предпочтительно от 50 до 5 мМ НЕРЕЗ, более предпочтительно от 10

   мМ НЕРЕЗ и/или

   ίν) является стерильным; и где рН буфера составляет от 4.0 до 10.0, предпочтительно рН составляет от 5,5 до 9,0, более предпочтительно рН составляет от 6,5 до 8,5, еще более предпочтительно рН составляет 7,4.
10. 10. Способ по п.9, где биосовместимый солевой раствор содержит 20 мМ цитрата натрия, 108 мМ ΝαΟ и 10 мМ НЕРЕЗ, и в котором рН биосовместимого солевого раствора составляет приблизительно 7,4.
11. 11. Биосовместимая водная коллоидная система, содержащая наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, обладающая одновременно Т₁ и Т₂ МРТ-контрастными свойствами, получаемая по любому из пп.8-10.
12. 12. Биосовместимая водная коллоидная система, содержащая наночастицы оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели, получаемых по любому из пп.1-4 и/или 8-10 для применения в медицине, в особенности для использования в диагностировании заболеваний, предпочтительно неопластических, нейронных и/или воспалительных заболеваний.
13. 13. Способ изготовления феррилипосом, обладающих одновременно Т₁ и Т₂ МРТ-контрастными свойствами, включающий:

    ί) гидратирование сухой липидной пленки, содержащей по меньшей мере один липид, предпочтительно по меньшей мере один фосфолипид, с помощью биосовместимой водной коллоидной системы по п.11 или суспензии по п.7,

    ίί) получение липосом методом экструзии или ультразвуковой сонификации, предпочтительно методом экструзии, и

    ш) промывание и/или отделение феррилипосом по необходимости.
14. 14. Способ по п.13, в котором шаг ίίί) включает:

    а) удаление неинкапсулированных частиц оксидов железа предпочтительно путем гель-фильтрации,

    б) отделение феррилипосом магнитным способом, в особенности с помощью магнитного разделителя, и

    в) по необходимости промывание феррилипосом и/или суспендирование феррилипосом в растворе, в особенности в биосовместимом солевом растворе.
15. 15. Способ по п.13 или 14,

    а) где по меньшей мере одним фосфолипидом является фосфатидилхолин, в особенности Ь-афосфатидилхолин, и/или

    б) сухая липидная пленка в дальнейшем содержит один пегилированный липид, в особенности 1,2дистеарил-8η-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000].
16. 16. Феррилипосома, обладающая одновременно Т₁ и Т₂ МРТ-контрастными свойствами, ί) получаемая способом по пп.13, 14 или 15, и/или

    ίί) содержащая

    а) по меньшей мере одну наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по п.5, или биосовместимую водную коллоидную систему по п.7, или биосовместимую коллоидную систему по п.11, и

    б) по меньшей мере один липид, в особенности один фосфолипид.
17. 17. Феррилипосома по п. 16, в которой

    а) по меньшей мере одним фосфолипидом является фосфатидилхолин, в особенности Ь-афосфатидилхолин, и/или

    б) феррилипосома содержит один пегилированный липид, в особенности 1,2-дистеарил-δη-глицеро3-фосфоэтаноламин-^[метокси(полиэтиленгликоль)-2000].
18. 18. Феррилипосома по п.16 или 17, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере одно терапевтически активное вещество и/или по меньшей мере одно диагностически активное вещество:

    ί) в которой терапевтически активное вещество и/или диагностически активное вещество включено в липосому или интегрировано в бислой, и/или

    ίί) в котором по меньшей мере одно терапевтически активное вещество выбирается из группы, включающей

    токсин,

    химиотерапевтическое средство,

    в особенности алкилирующий агент, и/или антиметаболит, и/или растительный алкалоид, и/или таксан, и/или ингибитор,

    топоизомеразы и/или антибластомное средство, более предпочтительно доксорубицин, радиоактивное вещество,

    ингибитор протеазы, в особенности ингибитор катепсина, более предпочтительно 1РМ-565,

    - 32 029170

    препарат, вызывающий апоптоз, и

    противовоспалительное средство, предпочтительно нестероидные противовоспалительные средства, предпочтительно выбранные из группы, включающей салицилат, производное пропионовой кислоты, производное уксусной кислоты, производное эноловой кислоты и производное фенамовой кислоты, селективный ингибитор ЦОГ-2, и сульфонанилид, или предпочтительно стероидные противовоспалительные средства, предпочтительно глюкокортикоид, и/или

    ϊϊϊ) в которой по меньшей мере одно диагностически активное вещество выбрано из группы, включающей

    радиоактивное вещество, парамагнитное вещество, визуализирующий агент для НЭТ, визуализирующий агент для МРТ, флуорофор, в особенности А1еха Р1иог, хромофор,

    фосфоресцирующее вещество, хемолюминесцентное вещество и биолюминесцентное вещество.
19. 19. Феррилипосома по любому из пп.16-18 для применения в медицине, в особенности при диагностики заболеваний, предпочтительно неопластических, нейронных и/или воспалительных заболеваний, в качестве Т₁ и/или Т₂ МРТ-контрастных средств.
20. 20. Комплект для диагностики и/или лечения, включающий:

    а) по меньшей мере одно из нижеперечисленного:

    наночастицу оксидных ферримагнетиков со структурой шпинели по п.5, биосовместимую водную коллоидную систему по п.7 или 11, феррилипосому по пп. 16-19, и

    б) по меньшей мере один магнит.

    - 33 029170

    (Ьйапсе (р1хе!з)