EA027609B1 - Способ получения интерферона бета-1альфа и фармацевтическая композиция, содержащая интерферон бета-1альфа - Google Patents

Abstract

Предложен пособ получения фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента интерферон бета-1α, в форме раствора для инъекций. Предпочтительно раствор для инъекций используется в виде преднаполненного шприца. Предложенный способ обеспечивает получение фармацевтической композиции с высокой степенью стабильности относительно биологической активности.

Description

Изобретение относится к области биотехнологической и фармацевтической промышленности, в частности, к способу получения фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, содержащей в качестве активного агента интерферон бета 1-альфа, и фармацевтической композиции, полученной в соответствии с заявленным способом.

Уровень техники

Интерфероны подразделяются на три класса, обозначаемых от типа I до типа III согласно соответствующим комплексам рецептора. Интерферон-альфа вместе с интерфероном-бета представляют собой интерфероны типа 1. Интерферон-гамма является единственный интерфероном типа II у человека. К относительно новому подклассу интерферонов типа III, который обозначается как интерферон лямбда, относятся интерлейкины ГЬ-28А и (И-29 (ΖίΙ/тапп е! а1., 2006).

Хотя интерферон-альфа и интерферон-бета используют один и тот же комплекс рецептора ΣΕΝΑΚΣ, ίη νίνο и ίη νίΐτο они демонстрируют различные эффекты, обусловленные различным сродством связывания этих белков (1айш е! а1., 2006). Определено несколько протеинов, индуцированных интерфероном типа I, которые влияют на размножение вируса. Активация РНК-азы эндонуклеазы Ь и возникающая в результате деградация вирусных мРНК запускается формированием олигонуклеотида ррр ррр (А2'р) ηΑ (2-5А), катализируемого синтетазой 2-5А. Полирибосомная трансляция вирусных мРНК ингибируется РКК, называемой протеинкиназой, и инактивацией фактора инициации пептида еГР2. Эти два механизма вовлечены в репликацию РНК-содержащих мелких вирусов, таких как ЕМСУ, пикорнавирусы, и также вовлечены в репликацию других групп вирусов. Кроме того, описано, что протеины Мх специфически ингибируют репликацию других групп вирусов (Меадег, 2002).

Рекомбинантный интерферон бета-ία (ΓΒ1α) является гликозилированным цитокином, используемым в лечении рецидивирующих форм рассеянного склероза (М8), хронического прогрессирующего заболевания, поражающего центральную нервную систему.

Рекомбинантный интерферон бета-1 α является аналогом интерферона, продуцируемого диплоидными фибробластами человека, относительно последовательности аминокислот (166 аминокислот), дисульфидных связей и сходного механизма гликозилирования. Это означает, что оба типа интерферона имеют сходные структурные и иммунологические характеристики. Рекомбинантный интерферон бета-1а обладает противовирусными, антипролиферативными и иммуномодулирующими свойствами.

Краткое описание изобретения

Изобретение описывает способ получения фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента интерферон бета-1а, в форме раствора для инъекций. Предпочтительно раствор для инъекций используется в виде преднаполненного шприца. Предложенный способ обеспечивает получение фармацевтической композиции с высокой степенью стабильности относительно биологической активности. Интерферон бета-1а представляет собой гликопротеид, используемый в виде подкожной инъекции, и назначается для лечения рецидивирующих форм рассеянного склероза.

Способ получения фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций включает стадии получения концентрированного раствора активного ингредиента и смешивания концентрированного раствора и буфера, и отличается тем, что каждую стадию выполняют при температуре 4,0°С±0,5°С; буфер добавляют к концентрированному раствору интерферона бета-1 α со скоростью 1 л в минуту, не размешивая; при этом буфер готовят в течение времени, не превышающего 5 мин.

Другой аспект изобретения касается фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, полученной предложенным способом, содержащей в качестве активного ингредиента интерферон бета-1а и вспомогательные вещества, включая растворители, стабилизирующие вещества, буферы и разбавители.

Перечень фигур

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

фиг. 1С и 1Ό - кривые зависимости доза-эффект стандартных образцов, анализ 1 (фиг. 1С) и анализ 2 (фиг. 1Ό);

фиг. 2ЕШ - представлены кривые зависимости доза-эффект образцов, полученных заявленным способом, анализ 1;

фиг. 2Ι-2Ν - представлены кривые зависимости доза-эффект образцов, полученных заявленным способом, анализ 2;

фиг. 3 - данные молекулярной массы интерферона бета-1а; фиг. 4 и 5 - распределение гликоформ интерферона бета-1 α;

фиг. 6-8 - пептидное картирование Интерферона бета-1а, используемого в фармацевтической композиции согласно изобретению, при расщеплении трипсином и эндолизином (распределение мол.мас.);

фиг. 9 - спектры УФ-поглощения, Коэффициент экстинкции 1.574 (мг/мл)^-1 см^-1; фиг. 10 - спектры флюоресцентной эмиссии; фиг. 11 - дальний УФ СО спектр; фиг. 12 - ближний УФ СЭ спектр;

- 1 027609 фиг. 13 - масс-спектр, соответствующий трипсинизированному невосстановленному образцу; фиг. 14 - масс-спектр, соответствующий трипсинизированному, ΌΤΤ восстановленному образцу.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение описывает способ получения фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента интерферон бета-1а в форме раствора дл инъекций (препарат Генфаксон). Предпочтительно, раствор для инъекций используется в виде преднаполненного шприца. Предложенный способ обеспечивает получение фармацевтической композиции с высокой степенью стабильности относительно биологической активности.

Способ получения фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций включает стадии получения концентрированного раствора активного ингредиента и смешивания концентрированного раствора и буфера, и отличается тем, что каждую стадию выполняют при температуре 4,0±0,5°С; причём буфер добавляют к концентрированному раствору интерферона бета-1а со скоростью 1 л в минуту, не размешивая; при этом буфер готовят в течение времени, не превышающего 5 мин.

В предпочтительном варианте при приготовлении буферного раствора маннитол и ацетат натрия растворяют в воде для инъекций (90% от конечного объема приготовляемого раствора) при указанной температуре в течение пяти минут. Затем полученый раствор медленно, при скорости 1 л в минуту, добавляют в концентрированный раствор интерферона бета-1а, не размешивая.

Спустя 5 мин регулируют рН, и немедленно разбавляют водой для инъекций до требуемого конечного объема. Раствор фильтруют и затем переходят к заполнению шприцов.

Существенные отличительные признаки заявленного способа, такие как указанные значения температуры, порядок смешивания буфера и концентрированного раствора активного ингредиента, время смешивания буфера с концентрированным раствором интерферона бета-1а и отсутствие перемешивания при добавлении буфера к концентрированному раствору интерферона бета-1а, обеспечивают стабильность белковой структуры, связанной с боковыми цепями остатков, важных для биологической активности интерферона бета-1а, что обеспечивает, в свою очередь, по сравнению с известными методами, высокую степень воспроизводимости конечного продукта и его увеличенную стабильность. Предложенный способ обеспечивает однородную биологическую активность конечного продукта различных партий (высокую степень совместимости) в течение срока хранения. Продукт можно хранить при температуре от 2 до 25°С в течение максимум одного месяца; и затем при регулярной температуре хранения от 2 до 8°С до даты окончания срока действия, причём биологическая активность остается стабильной.

Другой аспект изобретения касается фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, полученной предложенным способом, содержащей в качестве активного ингредиента интерферон бета-1а и вспомогательные вещества, включая растворители, стабилизирующие вещества, буферы и разбавители. Продукт заявленного способа обладает высокой стабильностью биологической активности во время периода срока хранения при высокой степени соответствия биологической активности в различных партиях.

Предпочтительно, в качестве стабилизирующих веществ используют сывороточный альбумин человека и маннитол, для получения буфера - ацетат натрия и уксусную кислоту, и воду для инъекций - в качестве разбавителя.

Сывороточный альбумин человека, главный белок плазмы, обладает хорошими связывающими свойствами для воды, Са²'. Να'. К', жирных кислот, гормонов, билирубина и лекарственных средств. Его главная функция состоит в регулировании коллоидного осмотического давления крови. Главный транспортер цинка в плазме, как правило, связывает приблизительно 80% всего цинка плазмы. При получении конечного продукта интерферона бета-1а предложенного способа этот белок играет важную роль в стабилизации раствора (стабилизация молекулярной структуры интерферона бета-1а). Альбумин, кроме того, понижает уровень адсорбции белков на поверхностях контейнеров, является криопротектором и предотвращает формирование агрегатов.

Маннитол обеспечивает изотоническую среду, стабилизируя раствор. Ацетат натрия и уксусная кислота действуют в качестве буфера и регулируют рН раствора.

Физическая нестабильность, которая нарушает активность и эффективность интерферона бета-1а в фармацевтических составах, включает денатурацию и формирование растворимых и нерастворимых аггрегатов, что, как известно, приводит к потере биологической активности интерферона бета-1а или сокращению сроков его хранения.

Образование продуктов деградации приводит к возникновению нежелательных побочных эффектов. Высокая или непостоянная температура во время процесса изготовления интерферона бета-1а вызывает нестабильность его молекулы. Даже при невысокой, но не постоянной температуре во время процесса изготовления, некоторые молекулы также могут подвергнуться денатурации или образовывать агрегаты, что делает раствор для инъекций нестабильным и уменьшает биологическую активность. При соблюдении строгого контроль температуры от 3,5 до 4,5°С в течение всего процесса изготовления обеспечивается высокая стабильность заявленной фармацевтической композиции. Химическая нестабильность включает гидролиз, образование имидов, окисление, рацемизацию и деамидирование. Причиной

- 2 027609 окисления может быть перемешивание раствора, быстрое и энергичное смешивание буфера и концентрированного раствора активного ингредиента и длительный период времени изготовления конечного продукта. Оптимизация времени протекания процесса получения фармацевтической композиции и отсутствие перемешивания при добавлении буфера к концентрированному раствору активного ингредиента обеспечивает сохранение молекул интерферона бета-1а и, следовательно, стабильность раствора. Эта стабильность продемонстрирована воспроизводимостью биологической активности во время срока хранения продукта при соблюдении условий хранения.

Пример 1. Характеристики интерферона бета-1а как активного ингредиента в составе заявленной фармацевтической композиции (предварительно наполненные шприцы).

Молекулярная масса

Рекомбинантный человеческий интерферон бета-1а представляет собой гликопротеин с единственной цепью с молекулярной массой приблизительно 22500 Да. Это подтверждается анализом 8Ό8-ΡΆΘΕ (фиг. 3), где полоса 1 соответствует предварительно окрашенным стандартам низкого диапазона, и полоса 2 соответствуют интерферону бета-1а согласно изобретению.

Профиль (распределение) гликоформ (фиг. 4 и 5).

Зрелый интерферон бета-1а представляет собой протеин из 166 аминокислот, содержащий один участок Ν-гликозилирования в Άδπ-80. Природные гликоформы возникают при дифференцированном гликозилировании участка Ν-гликозилирования, приводя к различиям в профиле ветвления и различной степени сиалирования в гликане. Гликоформы интерферона бета-1а подтверждаются данными массспектрометрии (МС). Согласно данным Европейской фармакопеи, существуют 6 гликоформ интерферона бета-1а при анализе МС (табл. 1).

Таблица 1

Пик МС	Гликоформы *	Ожидаемая М	Уровень сиалирования
А	2А281Р	22375	Дисиалирование
В	2А281Р	22084	Моносиалирование
С	ЗА281Р и/или 2А281Р + 1 НехШсНех повтор	22739	Дисиалирование
ϋ	3Α381Ρ	23031	Трисиалирование
Е	4А381Р и/или 3Α381Ρ + 1 НехИасНех повтор	23400	Трисиалирование
Г	2А081Р	21793	Без сиалирования
* 2А-олигосахарид с двойным профилем ветвления; ЗА-олигосахарид с тройным профилем ветвления; 4А-олигосахарид с четырехкомплексным профилем ветвления; 08- без сиалирования; 18-моносиалирование; 28-дисиалирование; 38-трисиалирование; 1Р-фукозилирование

Для подтверждения распределения гликоформ интерферона бета-1а в соответствии с изобретением был проведен сравнительный анализ стандартной партии СК8 1 интерферона бета-1а и интерферона бета-1а, используемого в качестве активного ингредиента в составе заявленной фармацевтической композиции согласно изобретению, методом спектрометрии ΜΆΕΌΙ-ΤΘΕ.

Результаты, представленные на фиг. 5 и 6, показывают, что структура гликоформ Интерферона бета-1а, используемого в качестве активного ингредиента в составе заявленной фармацевтической композиции согласно изобретению, сопоставима со структурой гликоформ стандартной партии СК8 1 и соответствует требованиям Европейской Фармакопеи. Пики А-Е в партии интерферона бета-1а согласно изобретению соответствуют гликформам А-Е стандартной партии СК8 1 интерферона бета-1а (табл. 2).

Таблица 2. Распределение гликоформ в интерфероне бета-1а и стандартной партии СК8 1 интерферона бета-1а

Глико- формы	Ожидаемая мол. масса согласно Европейской Фармакопее	Пик мол. масс, Интерферон бета-1а согласно изобретению	Пик мол. масс, стандартная партия СК8 1 интерферона бета-1а
		Дальтон	% отклонения	Дальтон	% отклонения
А	22 375	22 359	0,07	22 365	0,04
В	22 084	22 061	0,10	22 094	0,05
С	22 739	22 736	0,01	22 731	0,04
Ό	23 031	23 028	0,01	23 016	0,07
Е	23 400	23 392	0.03	23 384	0,07
Р	21 793	21 804	0,04	21 813	0,09

- 3 027609

Результаты, полученные методом ΜΑΡΌΙ-ΤΟΕ указывают, что гликоформы, существующие в Интерфероне бета-ία изобретения, соответствуют гликоформам Α-Р в стандартной партии СИЗ 1 интерферона бета-ία, и аналогичны структуре изоформ согласно требованиям Европейской Фармакопеи (01/2009:1639).

Первичная структура Интерферона бета-ία, используемого в качестве активного ингредиента в составе заявленной фармацевтической композиции согласно изобретению (данные получены методом масс-спектрометрии МаМЙТОР, табл. 3 и 4 и фиг. 6-8).

Таблица 3. Пептидное картирование интерферона бета-ία при расщеплении трипсином (распределение мол.мас.)

Наблюдаема я мол. масса	Теорети- ческая мол. масса	Пептид	Положение	Модификации
973,691	973,489	ΝΡΥΡΙΝΚ	153-159
1235,611	1235,598	ΜΝΡϋΙΡΕΕΙΚ	36-45
1341,681	1341,698	ΜδΥΝΙΤ,ΟΡΕΟΚ	1-11
1421,751	1421,663	ΕΥ3ΝΟΑ\νΤΐνΚ	137-147	(1хСуз САМ)
2258,165	2258,153	ΕϋΛΆΙΤΙΥΕΜΕρΝΙΡΑΙΡΚ	53-71

Таблица 4. Пептидное картирование Интерферона бета-ία при расщеплении эндолизином С (распределение мол. масс)

Наблю-	Теорети	Пептид	Поло-	Модифика-
даемая	-ческая		жение	ции
мол.	мол.
масса	масса
1481,587	1481,838	КУУОМЬНУЬК	124-134
1506,543	1506,726	ϋΚΜΝΡϋΙΡΕΕΙΚ	34-45
1805,733	1805,973	ЫАЦЕКОКТЕУСЕК	20-33	(1хСуз САМ)
2320,887	2321,117	Μ8ΥΝΕΕΟΡΕ0Κ88ΝΡ0ε0Κ	1-19	(1хСуз САМ)

Данные, представленные в табл. 3 и 4, демонстрируют, что девять пептидов имеют последовательности, соответствующие последовательности интерферона бета-ία. Пептиды, полученные при расщеплении трипсином и эндолизином, покрывают приблизительно 60% последовательности Интерферона бета-ία, положение 17 (Суз) включено.

Вторичная и третичная структура (спектроскопия циркулярного дихроизма и флюоресцентная спектроскопия)

На фиг. 9 показаны спектры УФ поглощения образца. Коэффициент экстинкции составляет 1,574 (мг/мл)^-1 см^-1.

На фиг. ί0 представлены спектры флюоресцентной эмиссии. Длина волны максимальной эмиссии составляет 343 нм.

Спектроскопия циркулярного дихроизма проводилась в дальнем и ближнем УФ-спектрах с целью анализа вторичной и третичной структуры Интерферона бета-ία, используемого в качестве активного ингредиента в составе заявленной фармацевтической композиции согласно изобретению.

Данные, представленные на фиг. 11 (дальний УФ СИ спектр), демонстрируют, что белок имеет структуру альфа-спирали.

Анализ дисульфидных связей Суз 31-Суз 141 проводился методом масс-спектрометрии (Ма1ФТОР). До расщепления трипсином нативный белок обработали йодоацетамидом (ΙΑΑ) для алкилирования всех свободных остатков цистеина (Суз). Затем образец разделили на две части: одну часть обработали дитиотреитолом (ΌΤΤ) для восстановления дисульфидных связей между остатками цистеина, а вторую часть не обрабатывали с целью обнаружить дипептиды с дисульфидными связями, если таковые имеются (данные распределения мол. масс пептидов, полученных без и с обработкой ΌΤΤ представлены в табл. 5 и 6 и на фиг. 13 и 14, соответственно).

- 4 027609

1. Расщепление трипсином после обработки ΙΑΑ, но без восстановления дисульфидных связей ΌΤΤ. Таблица 5

Полученная мол. масса	Ожидаемая мол.масса	Пептид	Положение	Известные модификации
714,436	714,3682	ΚΥΥΟΚ	124-128
722,517	722,4195	ЬТОУЬК	160-165
786,542	786,4872	ΙΙΉΥΙ,Κ	129-134
919,608	919,4996	(уидаок	6-52
928,653	928,5284	ЬМ88ЬНЬК	116-123
973,679	973,489	ΝΡΥΡΙΝΚ.	153-159
998,637	998,436	88ΝΡ()Ο(2Κ	12-19	(Суз САМ: 17)
999,795	99,584	ЬЬЖЩЬЮК	20-27
1341,997	1341,698	ΜδΥΝΙΧΟΡΙΛϊΚ	1-11

Пик, соответствующий дипептиду кЕУСкК-ЕУ8ПСАШ'ПУК (теоретическая мол.масса 2130,9 Да), обнаруживается в образце с невосстановленными дисульфидными связями, что указывает на правильное формирование дисульфидной связи Суз 31-Суз 141 в молекуле используемого в заявленном способе интерферона бета-1а (фиг. 13). С другой стороны этот пик не обнаруживается в восстановленном образце (фиг. 14).

2. Расщепление трипсином после обработки ΙΑΑ и последующим восстановлением дисульфидных связей ΌΤΤ.

После восстановления дисульфидных связей с помощью ΌΤΤ обнаружен пептид, содержащий Суз 141 (мол. масса 1364.6 Да) (фиг. 14). Его алкилированный аналог (мол.масса 1421,6 Да) не был обнаружен, что указывает на то, что Суз в этом положении не является свободным в нативном белке. Пептид мол. массы 1364,6 Да отсутствуют в невосстановленном образце (фиг. 14). Как пептид БЕУСБК с теоретической мол. массой 768,39 Да, так и его алкилированный аналог (мол. масса 825,4 Да) не были обнаружены. Все эти данные указывают, что дисульфидная связь Суз31-Суз141 правильно сформирована в нативном белке.

Таблица 6

Полученная мол. масса	Ожидаемая мол.масса	Пептид	Положение	Известные модификации
999,46	999,573	ΙΑ\ν()ΕΝΟΚ	20-27
998,335	998,436	δδΝΡΟΟΟΚ	12-19	(Суз САМ: 17
1235,53	1235,598	ΜΝΡϋΙΡΕΕΙΚ	36-45
1341,623	1341,698	ΜδΥΝΙΧΟΡϋΟΚ	1-11
1364,639	1364,642	ΕΥδΗΑΑΊΤνΚ.	137-147
2257,994	2258,153	ΕϋΑΑΕΤΓΥΕΜϋΟΝΙΡΑΙΡΚ	53-71

Данные, представленные в табл. 5 и 6, также демонстрируют наличие пептидов, имеющие последовательности, соответствующие последовательности интерферона бета-1а и покрывающие приблизительно 85% его последовательности, положение 17 (Суз) включено.

Пример 2. Биологическая активность интерферона бета-1а Активность интерферона бета-1а, используемого в заявленном способе, оценивали путем анализа его способности защищать клетки от вирусного цитопатического эффекта по сравнению с человеческим рекомбинантным интерфероном бета1α международного стандарта (ИЕВЗС 00/572). Используя стандартную культуру клеточной линии А549 (АТСС № ССБ-185), чувствительной к цитопатическому эффекту вируса энцефаломиокардита (ВЭМК, АТСС № УК-129В) и чувствительную к интерферону, проводили анализ биологической активности в соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи (01/2005:50600). Активность оценивали, используя статистическое программное обеспечение для анализа параллельных проб (РЕА 2.0, 8Ре§шапп 8узРешз).

В табл. 7 представлены результаты биологической активности 6 различных партий интерферона бета-1а, используемого при получении фармацевтической композиции согласно изобретению.

- 5 027609

Таблица 7

Приведённые результаты показывают, что интерферон бета-ία, используемый при получении фармацевтической композиции согласно изобретению (препарат Г енфаксон) является стабильным и идентичен человеческому интерферону бета 1-α по структуре и биологической активности.

Пример 3. Получение интерферона бета-ία.

Ген человеческого интерферона бета-ία (который присутствует в хромосоме 9, локус 9ς2ί) был изолирован из библиотеки кДНК печени эмбриона человека с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и клонирован в вектор экспрессии, используя ферменты рестрикции Νοί I апб ХЬа I. Полученный вектор был введен в штамм ИН5а ЕзсйепсЫа сой для амплификации и дальнейшей трансфекции клеток СНО. Стабильные трансфектанты были подвергнуты отбору для дальнейшего клонирования и амплификации.

Банк клеток был получен из выбранного амплифициованого клона после анализа его продуктивности и качества рекомбинантного интерферона бета-ία. Банк хранили в паровой фазе из жидкого азота при -150°С; далее банк анализировали на чистоту, жизнеспособность, идентичность и стабильность.

Концентрированный раствор интерферона бета-ία был получен с использованием непрерывной ферментации суспендированной культуры. Супернатант был получен, осветлен и очищен с помощью псевдоаффинной хроматографии, гидрофобной и гель-фильтрационной хроматографии.

Стерильный интерферон бета-ία хранили при температуре ниже -20°С в стерильном, непирогенном баллоне из РЕТС (полиэтилен терефталат сополимер, модифицирванный гликолем), с резьбовым колпачком из полиэтилена высокой плотности (НИРЕ) в защищенном от света месте.

Пример 4. Получение фармацевтической композиции в виде преднаполненных шприцев согласно изобретению.

Используемое оборудование: магнитная мешалка;

стеклянные контейнеры - стерильные и непирогенные - различного объема;

реактор из нержавеющей стали с улавливающей трубкой и резиновой трубкой, альтернативно с металлическим погружным устройством, используемым для фильтрации раствора, подаваемого перистальтическим насосом;

дистиллятор, обеспечивающий воду для инъекции; система перистальтического насоса для фильтрации; фильтр: 0,22 мкм;

промышленный паровой стерилизатор; наполнитель шприцев и стопорная машина; шкаф с ламинарным потоком воздуха.

Маннитол и ацетат натрия растворяют путем легкого помешивания в стеклянном контейнере, стерилизованном и депирогенизированным, содержащим объем 80% от заключительного объема воды для инъекции.

Интерферон бета-ία добавляют к этому раствору с легким помешиванием, избегая формирования пены, затем разводят водой для инъекции до необходимого объема. До этого регулируют рН. Далее раствор фильтруют и наполняют шприцы. Проводят анализ качества выпускаемой партии.

В предпочтительном варианте получения фармацевтической композиции согласно изобретению маннитол и ацетат натрия ратстворяют в воде для инъекции (90% от заключительного объема изготовляемого раствора) при температуре 4°С±0,5°С в течение 5 мин, затем добавляют к концентрированному раствору интерферона бета-ία без размешивания со скоростью ί л в минуту. Спустя 5 мин регулируют рН и немедленно разбавляют водой для инъекций при температуре 4°С±0,5°С до требуемого заключительного объема. После фильтрации производят наполнение шприцев.

В предпочтительном варианте продукт, полученный в соответствии с заявленным способом, представляет раствор для инъекций в предварительно наполненных шприцах со следующим составом (табл. 8 и 9):

- 6 027609

Таблица 8

Компонент
Интерферон бета-1а	44 г (12 ММЕ)
Человеческий альбумин	4.0 мг
Маннитол	27.3 мг
Ацетат натрия	0.4 мг
Уксусная кислота	1.85 мг
Вода для инъекции	0.5 мл

Таблица 9

Компонент
Интерферон бета-1 а	22 г (6 ММЕ)
Человеческий альбумин	2.0 мг
Маннитол	27.3 мг
Ацетат натрия	0.4 мг
Уксусная кислота	1.85 мг
Вода для инъекции	0.5 мл

Пример 4. Стабильность фармацевтической композиции, полученной заявленным способом. Фармацевтическая композиция согласно изобретению является более стабильной относительно биологической активности, чем композиция, полученная известным способом.

В табл. А представлен список партий продукта (образцов) с результатами анализа биологической активности в течение срока хранения 6, 12, 18 и 24 месяца, полученных согласно заявленному способу и известному способу.

Таблица А

Биологическая активность (%)

Партия	Концентрация (мкг/шприц)	0	6 месяцев	12 месяцев	18 месяцев	24 месяца
Способ согласно изобретению
ΙΝ221Α	44 (12 млн МЕ)	99	98	100	100	99
ΙΝ222Α	44	100	100	100	99	99
ΙΝ223Α	44	98	98	99	99	98
ΙΝ224Α	44	96	97	98	99	97
АЦ002588	44	95	95	95	95	95
ΙΝ441Β	88	101	102	101	101	102
ΙΝ442Β	88	103	102	102	102	102
ΙΝ443Β	88	104	105	104	106	104
ΙΝ444Β	88	100	101	100	101	101
АЦ002498	88	102	102	102	102	102
Стандартный способ
ΙΟ221Α	44	99	80	93	82	79
ΙΟ222Α	44	89	106	82	101	84
ΙΟ441Β	88	80	88	75	91	80
ΙΟ442Β	88	100	111	90	81	84

Представленные данные демонстрируют, что в партиях, произведенных в соответствии с обычным производственным процессом, наблюдается большая вариабельность биологической активности в различные периоды времени, причём вариабельность биологической активности двух партий превышает предел, допустимый согласно требованиям Европейской фармакопеи (80-125%). Партии, изготовленные

- 7 027609 в соответствии с предложенным методом, демонстрируют стабильную высокую биологическую активность в различные периоды времени хранения. Данные биологической активности образцов согласно изобретению, полученные на 30 месяц хранения, по существу, не отличались от данных, полученных на 24 месяц хранения.

С целью изучения зависимости доза-эффект, было выполнено два различных анализа биологической активности. Первый анализ включал следующие образцы: ΙΝ221Α, ΙΝ222Α, ΙΝ223Α, ΙΝ224Α и АИ002588. Второй анализ включал образцы ΙΝ441Β, ΙΝ442Β, ΙΝ443Β, ΙΝ444Β и Αυ002498.

Кривые зависимости доза-эффект (отношение доза-ответ) стандартных образцов (контроль) представлены на фиг. 1С (анализ 1) и фиг. 1Ό (анализ 2).

Кривые зависимости доза-эффект (отношение доза-ответ) образцов, полученных заявленным способом, представлены на фиг. 2Ε-2Ι (анализ 1) и фиг. 2Ι-2Ν (анализ 2).

Полученные результаты свидетельствуют, что добавление буфера к концентрированному раствору интерферона бета-1а со скоростью 1 л в минуту, не размешивая, при строго определенном температурном режиме способствует стабильности конечного продукта, минимизируя инкорпорацию воздуха с последующим окислением и деградацией молекул.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает получение фармацевтической композиции с высокой степенью стабильности относительно биологической активности во время всего срока хранения, причём срок хранения композиции, полученной заявленным способом, составляет 30 месяцев вместо 24 месяцев в соответствии со стандартным способом.

Claims (4)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, содержащей в качестве активного ингредиента интерферон бета-1 а, предусматривающий получение концентрированного раствора активного ингредиента из культуры клеток СНО, трансформированных вектором экспресии, содержащим ген интерферона бета-1 а, путём очистки с помощью хроматографии и смешивания концентрированного раствора и буфера, отличающийся тем, что при температуре 4,0±0,5°С маннитол и ацетат натрия растворяют в воде для инъекции в течение 5 мин, затем добавляют к концентрированному раствору интерферона бета-1а со скоростью 1 л/мин не размешивая; спустя 5 мин регулируют рН и немедленно разбавляют водой для инъекции при температуре 4,0±0,5°С до требуемого конечного объёма.
2. 2. Фармацевтическая композиция, полученная способом по п.1.
3. 3. Фармацевтическая композиция по п.2, содержащая вспомогательные вещества, включающие ацетат натрия и кислоту уксусную в качестве буфера, маннитол и сывороточный альбумин человека в качестве стабилизатора.
4. 4. Фармацевтическая композиция по п.2, содержащая интерферон бета-1а в количестве 44 мкг (12 ММЕ) в предварительно наполненном шприце.