EA023778B1 - Лечение дискинезии при различных расстройствах - Google Patents

Abstract

Впервые описываются способы лечения болезни Паркинсона при поддержании низкого уровня развития дискинезии и способы реверсирования дискинезии, включающие в себя введение терапевтически эффективного количества соединения по изобретению. Далее настоящее изобретение относится к рецептурам и фармацевтическим композициям упомянутых соединений для производства лекарственных средств для лечения указанного заболевания.

Description

Область техники

Аспекты изобретения относятся к способам лечения болезни Паркинсона с поддержанием низкого уровня развития дискинезии и к способам реверсирования дискинезии, включающим введение терапевтически эффективного количества соединения, раскрытого в описании изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению и фармацевтическим композициям указанных соединений для приготовления лекарственных средств для лечения указанного или других расстройств движения, таких как хорея Г ентингтона.

Уровень техники

Применение допаминозамещающих агентов при симптоматическом лечении болезни Паркинсона (ΡΌ) является, несомненно, успешным для улучшения качества жизни пациентов. Ь-допа, которая применяется в течение многих лет и остается золотым стандартом при лечении ΡΌ, смягчает моторные симптомы ΡΌ, характеризуемые медлительностью движения (брадикинезиа), ригидностью и/или тремором. Понятно, что Ь-допа действует как пролекарство, которое биометаболизируется в допамин (ЬА). ΌΑ, в свою очередь, активирует допаминовые рецепторы в мозгу, которые подразделяются на два класса: Όι- и Ь₂-рецепторы. Ь^рецепторы могут быть разделены на Όι- и Ш-рецепторы. в то время как Ь₂-рецепторы могут быть разделены на Ό₂-, Ό₃- и О₄-рецепторы. Однако допаминозамещающая терапия имеет ограничения, особенно проявляющиеся при долговременном лечении. Продолжительность развития реакции на дозу Ь-допа становится последовательно все короче с течением лет, и периоды, в которые пациент получает курс лекарства, осложняются возникновением ряда побочных эффектов.

Побочные эффекты могут проявляться в виде дискинезий, которые могут наблюдаться или когда пациент получает допаминозамещающую терапию, или даже когда пациент не получает терапию. Дискинезии представляют собой аномальные непроизвольные расстройства движения. Аномальные движения могут проявляться как хорея (непроизвольные, быстрые, нерегулярные, толчкообразные движения, которые могут затрагивать лицо, руки, ноги или туловище), дрожательный паралич (непроизвольные движения, аналогичные хорее, но более интенсивные и сильные), дистония (длительные мышечные сокращения, обычно приводящие к скручивающим и периодически повторяющимся движениям или аномальным осанке или позам) и/или атетоз (периодически повторяющиеся непроизвольные, медленные, поворотные, волнообразные движения, которые особенно серьезны в руках).

Пациенты с симптомами ΡΌ могут иметь цикл, включающий в себя периоды включения, которые осложнены дискинезией, и периоды отключения, в которых они жестко паркинсоновские. Как следствие, они могут иметь эпизоды полной недееспособности, несмотря на то, что Ь-допа остается эффективным антипаркинсоновским агентом в течение болезни (ОЬеко, с1 а1. №иго1о§у 2000, 55, δ.13-23). Допаминовые агонисты, такие как бромкриптин, лисурид, прамипексол, ропинирол и перголид, являются менее эффективными, чем Ь-допа, особенно в случае от умеренного до сильного ΡΌ. Однако их профиль побочных эффектов отличается от профиля Ь-допа; достойно внимания, что допаминовые агонисты действительно вызывают меньшие уровни дискинезии, чем Ь-допа, но это имеет ограниченное значение для ΡΌ пациентов с дискинезиями, так как многие из них имеют от умеренной до сильной ΡΌ и, таким образом, они нуждаются в эффективности Ь-допа.

Дискинезии и другие расстройства движения, возникающие как следствие дисфункции базального ядра, имеют важное социально-экономическое значение. Было сделано много попыток найти средства для предотвращения и/или лечения дискинезии, но такие попытки имели ограниченный успех. Следовательно, существует необходимость предоставления новых агентов для лечения дискинезии.

Модель паркисонизма, основанная на повреждениях действием 6-гидроксидопамина (6-ΟΗΌΑ) на крысах, является бесценным инструментом при доклинических исследованиях ΡΌ и для оценки новых терапевтических возможностей (Бсйтегйид и Ни81ои, Бгод. №игоЬю1. 1996, 50, 275-331). Одна из наиболее широкоприменяемых систем эксперимента на основе 6-ΟΗΌΑ состоит в оценке ротационного поведения на крысах, которые имеют локализованную дегенерацию допаминоэргического нигростриарного пути (имеющего отношение к эфферентной связи черного вещества с полосатым телом) (ипдег51еб1, АЬиййиой, Вташ Ке5. 1970, 24, 485). На этой модели осуществляется односторонняя инъекция 6-ΟΗΌΑ в нигростриарный путь, полосатое тело или медиальный переднемозговой пучок (МРВ), что создает функциональный дисбаланс между допаминоэргическими нигростриарными системами. Введение лекарственного средства прямо стимулирует допаминовые рецепторы, так как метаболический предшественник допамина, Ь-допа, и допаминовые агонисты апоморфин продуцируют ротационное поведение, происходящее с той стороны тела, в которой осуществлена инъекция 6-ΟΗΌΑ.

В добавление к двигательным расстройствам 6-ΟΗΌΑ модель может быть применена для создания других признаков ΡΌ. Развитие как активированного ротационного поведения, так и аномальных непроизвольных движений (ΑΙΜ5) наблюдается у крыс после инъекции 6-ΟΗΌΑ или в полосатое тело, или в МРВ (медиальный пучок переднего мозга), и при хроническом лечении Ь-допа; следовательно, предоставляется дополнительная животная модель для исследования вызываемой Ь-допа дискинезии (ЬиибЫаб, е! а1. Еиг. 1. №ито5С1. 2002, 15, 120-132). В этой модели при хроническом лечении Ь-допа, но не бромкриптином, вызывает последовательное развитие ΑΙΜ5. Основываясь на этих наблюдениях, было установлено, что крысы с 6-ΟΗ^Α-повреждениями обнаруживают двигательные расстройства, которые об- 1 023778 наруживают существенные функциональные аналогии с дискинезией Паркинсона и могут быть применены для изучения потенциала терапии для нахождения лечения дискинезии.

В попытках найти новые терапии для лечения дискинезии и других расстройств движения, авторами изобретения неожиданно было найдено, что (4аК,10аК)-1-н-пропил-1,2,3,4,4а,5,10,10а-октагидробензо[д]хинолин-6,7-диол, который представляет собой мощный О₁/О₂-агонист [соединение 10]; (6аК,10аК)-7-н-пропил-6,6а,7,8,9,10,10а,11-октагидро-1,3-диокса-7-азациклопента[а]антрацен [соединение 11] и (4аК,10аК)-1-н-пропил-2,3,4,4а,5,7,8,9,10,10а-декагидро-1Н-бензо[д]хинолин-6-он [соединение 12] имеют благоприятные профили на крысах с односторонними 6-ОНОЛ-повреждениями. Они вызывают меньшие уровни дискинезии, чем Ь-допа и апоморфин, и уменьшают вызванные Ь-допа дискинезии более эффективно, чем О₂-агонисты, как, например, прамипексол. Таким образом, соединения 10, 11 и 12 потенциально могут стать первыми ΡΌ лекарствами с эффективностью на уровне Ь-допа и благоприятным профилем не только в отношении развития дискинезии, но также и в качестве средства для снижения уровней дискинезии.

Согласно этому, ожидается, что описанные выше соединения могут применяться для лечения дискинезии и других относящихся к движению расстройств, такие как хорея Гентингтона. Кроме того, настоящее изобретение предполагает применение соответствующей рацемической транс-смеси. Настоящее изобретение, кроме того, предоставляет способы лечения болезни Паркинсона с низким уровнем развития дискинезии, включающим введение терапевтически эффективного количества упомянутого соединения. В одном аспекте лечение болезни Паркинсона является таким же эффективным, как лечение Ь-допа. Далее предоставлены способы понижения уровней дискинезии или лечения болезни Паркинсона, включающие введение упомянутого соединения и его фармацевтических композиций.

Сущность изобретения

Один аспект изобретения относится к применению (6аК,10аК)-7-н-пропил-6,6а,7,8,9,10,10а,11октагидро-1,3-диокса-7-азациклопента[а]антрацена или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства для лечения болезни Паркинсона при поддержании низкого уровня развития дискинезии.

Отдельный аспект изобретения относится к применению (6аК,10аК)-7-н-пропил6,6а,7,8,9,10,10а,11-октагидро-1,3-диокса-7-азациклопента[а]антрацена или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства для реверсирования дискинезии.

Подробное описание

Соединения по настоящему изобретению содержат два хиральных центра (обозначенных * на формуле ниже)

Соединения по изобретению могут существовать в двух различных диастереомерных формах, циси транс-изомерах, обе из которых могут существовать в двух энантиомерных формах. Настоящее изобретение относится только к транс-рацемату и (4аК,10аК)-энантиомеру.

Как указано ранее, настоящее изобретение основано на открытии, что (4аК,10аК)-1-н-пропил1,2,3,4,4а,5,10,10а-октагидробензо[д]хинолин-6,7-диол (соединение 10) реверсирует дискинезии, вызываемую Ь-допа/бенсеразидом и апоморфином на крысах, имеющих 6-ОНПЛ-повреждения.

Соответствующий транс-рацемат также попадает в объем этого изобретения.

Кроме того, соединение по настоящему изобретению содержит два хиральных центра (обозначенных * на формуле ниже)

- 2 023778

Соединение по изобретению может существовать в двух различных диастереомерных формах, циси транс-изомерах, обе из которых могут существовать в двух энантиомерных формах. Настоящее изобретение относится только к транс-рацемату и (6аК,10аК)-энантиомеру.

Как указано ранее, настоящее изобретение основано на открытии, что (6аК,10аК.)-7-н-пропил6,6а,7,8,9,10,10а,11-октагидро-1,3-диокса-7-азациклопента[а]антрацен (соединение 11) реверсирует дискинезии, вызываемые Ь-допа/бенсеразидом и апоморфином на крысах, имеющих 6-ОНЭА-повреждения.

Кроме того, настоящее изобретение основано на открытии, что (4аК,10аК)-1-н-пропил2,3,4,4а,5,7,8,9,10,10а-декагидро-1Н-бензо[д]хинолин-6-он (соединение 12) имеет благоприятные профили на крысах с односторонними 6-ОНЭА-повреждениями. Оно вызывает меньшие уровни дискинезии, чем Ь-допа и апоморфин, и уменьшает вызванные Ь-допа дискинезиии более эффективно, чем Э₂агонисты, как, например, прамипексол.

Изобретение раскрывается более детально ниже, но это описание не предназначено описывать все различные пути, которыми изобретение может быть осуществлено, или все признаки, которые могут быть добавлены в настоящее изобретение.

Определения

Применяемый термин дискинезия относится к состоянию, характеризуемому аномальными непроизвольными движениями, которые связаны с расстройствами отделов мозга, известными как базальное ядро. Дискинезия может представлять собой обусловленную Ь-допа дискинезию, которая возникает как следствие и представляет собой осложнение лечения болезни Паркинсона (наиболее обычное заболевание базального ядра). Дискинезия может физически проявляться в двух формах, хорее и дистонии. Хорея характеризуется непроизвольными, постоянными, непреднамеренными, резкими, быстрыми, короткими, непродолжительными и нерегулярными движениями, которые перемещаются от одной части тела к другой. Дистония характеризуется постоянным мышечным напряжением, которое вызывает скручивание и периодически повторяющиеся движения или необычные позы.

Лечение относится к замедлению развития болезни или расстройства или физически (например, нормализация наблюдаемого симптома), физиологически (например, нормализация физического параметра) или обоих и замедлению развития по меньшей мере одного физического параметра, который может быть не заметен пациенту. Кроме того лечение относится к замедлению развития болезни или расстройства или, по меньшей мере, их симптомов у пациента, который может быть подвержен или предрасположен болезни или расстройству даже несмотря на то, что пациент не имеет проявления болезни или не обнаруживает симптомов болезни или расстройства.

Терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения, которое при введении пациенту для лечения болезни или расстройства является достаточным для достижения такого лечения болезни или расстройства. Терапевтически эффективное количество будет варьировать в зависимости от соединения, болезни или расстройства, его тяжести, возраста и массы излечиваемого пациента.

Применяемое здесь определение при поддержании низкого уровня дискинезии относится к уровню дискинезии, который наблюдается у пациентов, проходящих курс лечения путем постоянной допаминоэргической стимуляции. Курсы лечения, включающие в себя постоянную допаминоэргическую стимуляцию, описаны в 81оссЫ. О1апо\у. №иго1оду 2004, 62, 8.56-863; и НПагу, с! а1, 1оитиа1 οί №иго1оду 2004, 251, 11, 1370-1374.

Применяемый в качестве мощного ЭфЭ^агониста (4аК,10аК)-1-н-пропил-1,2,3,4,4а,5,10,10аоктагидробензо[д]хинолин-6,7-диол (соединение 10).

Применяемый (6аК,10аК)-7-н-пропил-6,6а,7,8,9,10,10а,11-октагидро-1,3-диокса-7-азациклопента [а]антрацен (соединение 11).

- 3 023778

Применяемый (4аК,10аК)-1-н-пропил-2,3,4,4а,5,7,8)9,10,10а-декагидро-1Н-бензо[д]хинолин-6-он (соединение 12).

Соединения 10, 11 или 12 могут применяться для лечения дискинезии в виде монотерапии (т.е. соединение применяется отдельно); как дополнение к композициям для предотвращения дискинезических побочных эффектов, вызываемых композицией (например, как добавка к Ь-допа или апоморфину, вводимых для лечения паркинсоновских пациентов) или, альтернативно, соединение может вводиться в комбинации с другими терапиями, которые также уменьшают дискинезию (например, антагонистами опиатного рецептора, антагонистами а₂-адренорецептора, антагонистами каннабиноидного СВ1рецептора, антагонистами ΝΜΟΆ-рецептора, антагонистами холинергического рецептора, агонистами гистаминового НЗ-рецептора, и повреждением бледного шара чечевицеобразного ядра/субталамического ядра/глубокой стимуляцией головного мозга).

Настоящее изобретение далее относится к одновременному, отдельному или последовательному применению при лечения болезни Паркинсона для уменьшения дискинезии, вызываемой Ь-допа или допаминовым агонистом, включающем в себя введение терапевтически эффективного количества соединений 10, 11 или 12 или их фармацевтической соли.

В одном варианте осуществления дискинезия связана с расстройством движения, обусловленным базальным ядром.

В другом варианте осуществления дискинезия связана с болезнью Паркинсона.

Один вариант осуществления относится к дискинезии, ассоциированной с идиопатической болезнью Паркинсона или постэнцефалитическим паркисонизмом.

В одном варианте осуществления дискинезия обусловлена активной фазой дистонии при болезни Паркинсона.

В отдельном варианте осуществления дискинезия возникает как побочный эффект терапевтического препарата при лечении болезни Паркинсона.

В других вариантах осуществления дискинезия связана с допаминозамещающей терапией. В одном варианте осуществления допаминозамещающее терапевтическое средство является выбранным из группы, состоящей из ротиготина, ропинирола, прамипексола, каберголина, бромкриптина, лисурида, перголида, Ь-допа и апоморфина.

В одном варианте осуществления дискинезия наблюдается как результат повторяющегося введения Ь-допа.

Как указано ранее, настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, включающую в себя соединения 10, 11 или 12 или его фармацевтически приемлемую соль для приготовления лекарственного средства для лечения болезни Паркинсона при поддержании низкого уровня развития дискинезии, и фармацевтическую композицию, включающую в себя рацемический транс-1-н-пропил1,2,3,4,4а,5,10,10а-октагидро-бензо[д]хинолин-6,7-диол для приготовления лекарственного средства для лечения болезни Паркинсона при поддержании низкого уровня развития дискинезии.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает в себя МАО-В ингибитор.

В одном варианте осуществления МАО-В ингибитор представляет собой селегин.

В следующем варианте осуществления МАО-В ингибитор представляет собой расагилин.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в себя терапевтически эффективное количество соединения 10, 11 или 12 или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и наполнителей.

В специфическом варианте осуществления по изобретению млекопитающее представляет собой человеческого индивидуума.

Терапевтически эффективное количество соединения 10, 11 или 12 вычисляется как дневная доза упоминаемого соединения 10, 11 или 12 в виде свободного основания, соответственно, в диапазоне 0,01125 мг/день, более предпочтительно 0,05-100 мг/день, например предпочтительно 0,1-50 мг/день.

В специфическом варианте осуществления дневная доза соединения 10, 11 или 12 находится в диапазоне 1,0-10 мг/день.

В другом варианте осуществления дневная доза соединения 10, 11 или 12 составляет менее чем приблизительно 1,0 мг/день.

В отдельном варианте осуществления дневная доза соединения 10, 11 или 12 составляет приблизительно 0,10 мг/день.

В следующем варианте осуществления изобретение предоставляет пероральную композицию, включающую в себя от 0,001 до 125 мг соединения 10, 11 или 12.

В следующем варианте осуществления изобретение предоставляет пероральную композицию, включающую в себя от 0,001 до 0,100 мг соединения 10, 11 или 12.

В следующем варианте осуществления изобретение предоставляет пероральную композицию, включающую в себя от 0,001 до 1 мг соединения 10, 11 или 12.

В следующем варианте осуществления изобретение предоставляет пероральную композицию,

- 4 023778 включающую в себя от 0,10 до 10 мг соединения 10, 11 или 12.

Фармацевтически приемлемые соли

Соединение 10, 11 или 12 образует фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты с широким спектром органических и неорганических кислот. Такие соли также представляют собой часть настоящего изобретения.

Фармацевтически приемлемая соль присоединения кислоты соединения 10, 11 или 12 образуется из фармацевтически приемлемой кислоты, как это хорошо известно в технике. Такие соли включают в себя фармацевтически приемлемые соли, перечисленные в 1оигиа1 οί Р1агтасеийса1 Зс1епсе. 1911, 66, 2-19 и известны для специалиста в данной области. Типичные неорганические кислоты, применяемые для образования таких солей, включают в себя соляную, бромоводородную, иодоводородную, азотную, серную, фосфорную, гипофосфорную, метафосфорную, пирофосфорную и подобные. Также могут применяться соли, полученные из органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые и гидроксиалкандиовые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты. Таким образом, такие фармацевтически приемлемые соли включают в себя хлорид, бромид, иодид, нитрат, ацетат, фенилацетат, трифторацетат, акрилат, аскорбат, бензоат, хлорбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, метилбензоат, ортоацетоксибензоат, изобутират, фенилбутират, α-гидроксибутират, бутин-1,4дикарбоксилат, гексин-1,4-дикарбоксилаткапрат, каприлат, циннамат, цитрат, формиат, фумарат, гликолат, гептаноат, гиппурат, лактат, малат, малеат, гидроксималеат, малонат, манделат, мезилат, никотинат, изоникотинат, оксалат, фталат, терафталат, пропиолат, пропионат, фенилпропионат, салицилат, себацинат, сукцинат, суберат, бензолсульфонат, парабромбензолсульфонат, хлорбензолсульфонат, этилсульфонат, 2-гидроксиэтилсульфонат, метилсульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, нафталин-1,5-сульфонат, паратолуолсульфонат, ксилолсульфонат, тартрат и подобные.

Фармацевтические композиции

Способы получения твердых фармацевтических композиций также хорошо известны в технике. Таким образом, таблетки могут быть получены путем смешения активного компонента с обычными адъювантами, наполнителями и разбавителями и затем прессования смеси в соответствующей машине таблетирования. Примеры адъювантов, наполнителей и разбавителей включают в себя микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, помидорный крахмал, лактозу, маннит, сорбитный тальк, стеарат магния, желатин, лактозу, смолы, и подобные. Любой другой адъювант или добавка, такие как красители, ароматизаторы, консерванты, и т.д., также могут применяться при условии, что они являются совместимыми с активными компонентами.

В частности, таблетированные рецептуры по изобретению могут быть получены прямым прессованием соединения 10, 11 или 12 в смеси с традиционными адъювантами или разбавителями. Альтернативно, влажные гранулы, или расплавленные гранулы соединения 10, 11 или 12, необязательно в смеси с традиционными адъювантами или разбавителями могут быть применены для прессования таблеток.

Растворы соединений 10, 11 или 12 для инъекций могут быть получены путем растворения активного компонента и возможных добавок в части растворителя для инъекции, предпочтительно стерильной воде, нормализации раствора до желаемого объема, стерилизации раствора и заливки в пригодные ампулы или пузырьки. Могут быть добавлены любые пригодные добавки, обычно применяемые в технике, такие как средства, регулирующие тоничность, консерванты, антиоксиданты, повышающие растворимость средства и т.д.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - кристаллическая структура энантиосоединения 10. Абсолютная конфигурация определена по аномальному рассеянию тяжелого атома брома.

Фиг. 2 - кривая доза-отклик для зависимой от концентрации стимуляции внутриклеточного высвобождения Са²+ под действием допамина в НЩ-трансфектированных СНО-Оа16 клетках.

Экспериментальная часть

Данные ЬС/МЗ-анализа получали на приборе РЕ Зшех АР1 150ЕХ, с фотоионизацией при атмосферном давлении и хроматографом 31итаб/и ЬС-8А/ЗЬС-10А. Чистоту определяли интегрированием УФ-спектра (254 нм) и ЕЬЗО-следов. Масс-спектрометр от РекИег (АР1) был снабжен АРР1-источником и функционировал в режиме положительного иона. Времена удержания по линии УФ-датчика (КТ) выражали в минутах. Растворитель А приготовляли в виде 0,05% раствора ТРА в воде, растворитель В приготовляли в виде 0,035% раствора ТРА в 5% воды в ацетонитриле. Использовались несколько различные способы.

Способ 25: АР1 150ЕХ и хроматограф ЗОтаб/и ЬСШАО/ЗЬС-ЮА. Колонка: 6С-18, 4,6x30 мм, 3 мкм (АбапОк. \Уа1егк). Температура колонки: 40°С. Градиент: обратная фаза с ион-спариванием. Поток: 3,3 мл/мин. Инжектируемый объем: 15 мкл. Градиент: 2% В в А до 100% В в течение 2,4 мин, затем 2% В в А в течение 0,4 мин. Общее время пробега: 2,8 мин.

Способ 14: АР1 150ЕХ и хроматограф ЗОтаб/и ЬС8/ЗЬС-10А. Колонка: С-18, 4,6x30 мм, 3,3 мкм (Зуттейу, \Уа1егк). Температура колонки: комнатная. Градиент: обратная фаза с ион-спариванием. По- 5 023778 ток: 2 мл/мин. Инжектируемый объем: 10 мкл. Градиент: 10% В в А до 100% В в течение 4 мин, затем 10% В в А в течение 1 мин. Общее время пробега: 5 мин.

Рентгеноструктурный анализ структуры кристалла проводили, как описано ниже. Кристалл соединения охлаждали до 120 К с использованием охлаждающей системы Стуо81теат на газообразном азоте. Данные собирали на дифрактометре З1етепз ЗМАКТ Р1айогт с ССИ-чувствительным детектором. Разрешение структур проводили прямыми методами и уточняли полноматричным методом наименьших квадратов по Р² для всех данных. Атомы водорода в структурах были найдены методом вычитания электронной плотности. Неводородные атомы уточняли анизотропно. Все атомы водорода находились при вычисленных положениях с применением модели с длинами связей О-Н=0,84, С-Н=0,99-1,00, Ν-Η=0,920,93 А. Для всех атомов водорода термические параметры являлись фиксированными [И(Н)=1,2 и для присоединенного атома]. Переходные х-параметры находились в диапазоне 0,0(1)-0,05(1), указывая на то, что абсолютные структуры являются правильными. Программами, применявшимися для сбора данных, обработки данных и уточнения, являлись ЗМАКТ, 8ΛΙΝΤ и ЗАИАВЗ [см. ЗМАКТ апб 8ΛΙΝΤ. Агеа Ие1ее1от Сои!то1 апб Шедтайои Зойтате, Версия 5.054, Вгикег Аиа1уйеа1 Х-Кау 1и81гитеп18 1пс., МабЬон ИЗА (1998), ЗЬе1бйск ЗАИАВЗ, Ргодгат йог Етршса1 Соттесйои ой Агеа Ие1ес1от Иа1а, Версия 2.03, ИшуещЬу ой ОоЫидеп, Оеттаиу (2001)]. Для разрешения структур и для рисования молекул применялась программа ЗНЕЬХТЬ [сй. ЗЬе1бпск ЗНЕЬХТЬ, З1тис1ите Ие1етт1иайои Ргодгатк, версия 6.12, Вгикег Аиа1уйса1 Х-Кау 1и81гитеи18 1ис., МабЬон ИЗА (2001)].

Синтез соединений по изобретению (соединения 10 и 11).

Начиная от соединения 1, чей синтез описан в литературе, и которое получали, как описано в ТаЬет е1 а1., 1. Ат. СЬет. Зос, 124(42), 12416 (2002), соединение 8 может быть получено в восемь стадий, как описано ниже. Это вещество может быть расщеплено на энантиомеры методом хиральной ЗРС, как описано здесь, что дает соединения 9 и энантио-9. После удаления Вос-защитной группы восстановительное аминирование может быть использовано для введения н-пропильной группы к атому азота. Полученные защищенные катехоламины могут быть освобождены от защиты в стандартных условиях путем обработки 48% НВг или путем реакции с ВВг₃, что дает соединения 10 и энантио-10. Далее реакция 10 с СН₂С1Вг или эквивалентным реагентом в присутствии основания может быть использована для получения соединения по изобретению (соединение 11).

7-Иод-1,2,6-триметоксинафталин (соединение 2).

К перемешиваемому раствору соединения 1 (26,2 г; получено, как описано в ТаЬег е1 а1., 1. Ат. СЬет. Зос, 124(42), 12416 (2002) в сухом ТГФ (200 мл) под аргоном и при -78°С медленно добавляли

- 6 023778 втор-бутиллитий (1,2 М в циклогексане, 110 мл). Раствор перемешивали при -78°С в течение 3 ч. Раствор йода (30,5 г) в сухом ТГФ (50 мл) добавляли в течение 10 мин. Полученную смесь затем перемешивали в течение еще 10 мин при -78°С. Реакционную смесь тушили добавлением насыщенного ΝΗ₄Ο1 (100 мл), воды (240 мл), и Е1₂О (240 мл). Органический слой промывали 10% водным раствором сульфита натрия (100 мл), высушивали (№₂8О₄) и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали путем отгонки непрореагировавшего исходного вещества. Далее остаток очищали хроматографией на силикагеле (ЕЮЛс/гептан) для получения неочищенного твердого вещества, который очищали осаждением из системы ЕЮЛс/гептан, что дало 11,46 г соединения 2.

(Е/2)-3-(3,7,8-Триметоксинафталин-2-ил)акрилонитрил (соединение 3)

К суспензии соединения 2 (3,41 г) в сухом ацетонитриле (10,7 мл) в ампулу для микроволнового реактора добавляли акрилонитрил (1,19 мл) Рй(ОАс)₂ (73 мг) и триэтиламин (1,48 мл). Ампулу запаивали, смесь нагревали в течение 40 мин при 145°С с микроволновым облучением. Это методику проводили еще два раза (с использованием общего количества 10,23 г соединения 5). Неочищенные реакционные смеси объединяли, катализатор отфильтровывали, фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток распределяли между Е1₂О (300 мл) и 2М НС1 (150 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором (100 мл), высушивали (№₂8О₄) и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество (7,34 г) очищали хроматографией на силикагеле (ЕЮЛс/гептан) для получения 5,23 г соединения 3 в виде смеси изомеров по двойной связи.

3-(3,7,8-Триметоксинафталин-2-ил)пропионитрил (соединение 4)

Соединение 3 (5,23 г) растворяли в смеси СНС1₃ (15 мл) и 99% ЕЮН (100 мл). Добавляли 10% Рй/С (0,8 г) и раствор гидрировали в течение 45 мин под давлением водорода 3 бар (300 кПа) с применением вибростенда Рагг. Катализатор отфильтровывали и фильтрат пропускали через небольшую подушку силикагеля (элюент: 99% ЕЮН). Выход: 4,91 г соединения 4 в виде белого твердого вещества.

трет-Бутиловый эфир [3-(3,7,8-триметокси-1,4-дигидронафталин-2-ил)пропил]карбаминовой кислоты

Соединение 4 (5,0 г) растворяли в 99% ЕЮН (150 мл) и смесь нагревали до кипения с обратным холодильником в атмосфере азота. Металлический натрий (5 г) добавляли в виде небольших обрезков в течение 3 ч. Смесь кипятили с обратным холодильником в течение еще 2 ч перед тем, как начать перемешивание при комнатной температуре в течение 2 дней. Затем смесь нагревали до кипения с обратным холодильником снова и добавляли дополнительный металлический натрий (3,68 г), смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. После охлаждения в ледяной бане реакцию тушили добавлением твердого хлорида аммония (20 г) и воды (25 мл). Полученную смесь фильтровали, фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток распределяли между диэтиловым эфиром (50 мл) и водой (50 мл). Водный слой нейтрализовали 37% НС1 и экстрагировали диэтиловым эфиром (2x50 мл). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным солевым раствором (50 мл), высушивали (Мд§О₄) и концентрировали в вакууме, что дало масло. Это вещество растворяли в ТГФ (50 мл) и обрабатывали Вос₂О (2,34 г) и η^Ν (1,78 мл) при комнатной температуре. Через шесть дней летучие продукты удаляли в вакууме и остаток очищали хроматографией на силикагеле (ЕЮЛс/гептан). Это приводило к неочищенному соединению 5 (1,52 г).

Гидрохлорид рацемический 6,7-диметокси-2,3,4,4а,5,10-гексагидробензо[д]хинолина (соединение 6)

- 7 023778

Соединение 5 (1,52 г из предшествующей стадии) растворяли в МеОН (20 мл). Добавляли 37% НС1 (3,5 мл) и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 4 ч. Летучие продукты удаляли в вакууме, толуол использовали для азеотропной отгонки воды. Это приводило к неочищенному соединению 6 (0,89 г) в виде желтого масла.

Рацемический трет-бутиловый эфир транс-6,7-диметокси-3,4,4а,5,10,10а-гексагидро-2Нбензо[д]хинолин-1-карбоновой кислоты (соединение 8)

Соединение 6 (0,89 г) растворяли в МеОН (10 мл) и добавляли Ν;·ιί.’ΝΒΗ₃ (0,19 г). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную смесь охлаждали в бане со льдом, затем смесь тушили 2М НС1 в ЕьО (1 мл). Смесь распределяли между ЕьО (50 мл), водой (50 мл), и 2М ΝαΟΗ (10 мл). Водный слой экстрагировали диэтиловым эфиром (3x50 мл). Объединенные органические слои сушили (М§ЗО₄) и концентрировали в вакууме, что дало нечистый свободный амин (соединение 7). Это вещество растворяли в ТГФ (25 мл) и обрабатывали Вос₂О (0,68 г) и Εΐ₃Ν (0,86 мл) при комнатной температуре в течение 1 ч. Неочищенную смесь концентрировали в вакууме, остаток очищали хроматографией на силикагеле (ЕЮАс/гептан) для получения 1,18 г слегка загрязненного рацемического соединения 8.

ЗРС-разделение энантиомеров рацемического трет-бутилового эфира транс-6,7-диметокси3,4,4а,5,10,10а-гексагидро-2Н-бензо[д]хинолин-1-карбоновой кислоты (соединения 9 и энантио-9)

Соединение 8 (19,7 г) расщепляли на его энантиомеры с применением хиральной ЗРС на приборе Вегдег ЗРС тиШдтат II, снабженного колонкой СЫга1се1 ΟΌ 21,2x250 мм. Система растворителей: СО₂/ЕЮН (85:15), способ: постоянный градиент со скоростью потока 50 мл/мин. Сбор фракций проводили с контролем по УФ 230 нм. Энантиомер, элюирующийся первым (4аК,10аК энантиомер; соединение 9): 9,0 г белого твердого вещества. Энантиомер элюировавшийся медленнее (4аЗ,10аЗ энантиомер; соединение энантио-9): 8,1 г белого твердого вещества.

Гидрохлорид (4аЗ,10аЗ)-6,7-диметокси-1,2,3,4,4а,5,10,10а-октагидробензо[д]хинолина (соединение энантио-9')

соединение энантио-9 соединение энантио-9 (аз, юз энантиомер) (45 юз энантиомер)

Соединение энантио-9 (0,52 г) растворяли в МеОН (15 мл) и обрабатывали 5М НС1 в Е1₂О (7,5 мл) при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь концентрировали в вакууме, твердый продукт сушили в вакууме, что дало соединение энантио-9' в виде белого твердого вещества. ЬС/МЗ (способ 14): время удержания 1,31 мин.

Гидробромид (4аК,10аК.)-1-пропил-1,2,3,4,4а,5,10,10а-октагидробензо[д]хинолин-6,7-диола

Соединение 9 (0,5 г) растворяли в 99% ЕЮН (5 мл) и обрабатывали 2М НС1 в Е1₂О (4 мл) в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную смесь концентрировали в вакууме, остаток распределяли между ЕЮАс и 10% водным №ЮН (5 мл). Водный слой экстрагировали ЕЮАс и объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, высушивали (М§ЗО₄), концентрировали в

- 8 023778 вакууме. Остаток растворяли в 99% ЕЮН (5 мл) и обрабатывали пропионовым альдегидом (0,52 мл), Ν;·ιί'.'ΝΒΗ₃ (0,45 г), и АсОН (3 капли) в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную смесь прибавляли к смеси насыщенного водного №НС.'О₃, (12,5 мл), воды (12,5 мл), и ЕЮАс (2x25 мл).

Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором, высушивали (М§8О₄) и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (МеОН/ЕЮАс). Полученный полупродукт обрабатывали 48% НВг (3 мл) при 150°С в течение 1 ч с микроволновым облучением, затем неочищенную смесь выдерживали при 4°С в течение ночи. Выпавшее в осадок вещество выделяли фильтрованием и высушивали в вакууме. Выход соединения 10: 103 мг в виде твердого вещества. ЬС/М8 (способ 25): время удержания 0,77 мин.

Гидробромид (4а8,10а8)-1-пропил-1,2,3,4а,5,10,10а-октагидробензо[д]хинолин-6,7-диола (соединение энантио-10)

Методика, описанная для соединения 10, была использована для синтеза исходя из соединения энантио-9* (0,5 г; НС1 соль была переведена в основание путем распределения между ЕЮАс и 10% водным ΝαΟΗ перед стадией восстановительного аминирования). Выход соединения энантио-10: 70 мг в виде твердого вещества. ЬС/М8 (способ 25): время удержания 0,70 мин. Небольшой образец соединения энантио-10 растворяли в МеОН и позволяли кристаллизоваться медленно при комнатной температуре в течение 2 месяцев. Образующиеся белые кристаллы собирали и подвергали рентгеноструктурному анализу (см. фиг. 1). Абсолютную конфигурацию соединения энантио-10 определяли рентгеноструктурным анализом, что сделало возможным однозначное определение стереохимии соединений 9 и 10 и, следовательно, их производных.

Гидрохлорид (6аК,10аК.)-7-н-пропил-6,6а,7,8,9,10,10а,11-октагидро-1,3-диокса-7азациклопента[а]антрацена (соединение 11)

Соединение 10 (7,80 г), С§₂СО₃ (18,6 г), СН₂ВгС1 (2,2 мл) и ΌΜΡ (180 мл) нагревали до 100°С в течение 1 ч под атмосферой аргона. Неочищенную реакционную смесь перемещали в делительную воронку и разбавляли смесью лед/вода (300 мл). Полученную смесь экстрагировали Е1₂О (3x300 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (200 мл), высушивали (М§80₄) и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (ЕЮАс/МеОН), что дало бледно-красное твердое вещество, которое растворяли в МеОН (25 мл) и осаждали в виде хлористоводородной соли добавлением 2М НС1 в Е1₂О (20 мл) и Е1₂О (100 мл). Выпавший в осадок продукт выделяли фильтрованием и высушивали в вакууме. Выход соединения 11: 5,1 г. ЬС/М8 (способ 111): время удержания 0,70 мин. 10.8П 100%. УФ: 97,0%. МН+: 274,0.

(4аК,10аК.)-н-1-пропил-2,3,4,4а,5,7,8,9,10,10а-декагидро-1Н-бензо[д]хинолин-6-он (соединение 12)

Синтез соединения 12 может быть проведен, как описано в патенте ЕР 1274411, который включен в данное описание в качестве справочного материала. В указанном выше патенте соединение 12 обозначается как (-)-ОМС6650.

Фармакологическое тестирование

Пример 1. Соединения 11 и 12 метаболизируются в пирокатехинсодержащий активный метаболит соединения 10 при введении ίη νίνο

Активный метаболит (т.е. соединение 10), как было найдено, функционирует как мощный агонист как для Э]-. так и О₂-рецепторов ίη νίΐτο. Как обсуждается более подробно ниже, данные, полученные из экспериментов ίη νίνο, показывают, что этот активный метаболит обладает превосходным профилем по

- 9 023778 сравнению с другими допаминовыми агонистами и имеет эффективность, сопоставимую с эффективностью, которую можно наблюдать при лечении Ь-допа/апоморфином.

Пример 2. Фармакологическое тестирование соединения 10.

Όι/сАМР исследование.

Способность соединений или стимулировать, или ингибировать опосредованный Э₁-рецептором синтез сАМР в СНО-клетках, стабильно экспрессирующих человеческий рекомбинантный Э₁-рецептор, измеряли, как описано ниже. Клетки высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 11000 клеток/лунку за три дня перед экспериментом. В день эксперимента клетки промывали один раз предварительно нагретым О буфером (1 мМ М§С1₂, 0,9 мМ СаС1₂, 1 мМ ΙΒΜΧ (3-трет-бутил-1-метилксантин) в ΡΒδ (фосфатный буферный физиологический раствор)) и исследование начинали добавлением 100 мкл смеси 30 нМ А68930 и тестового соединения в растворе О буфера (антагонизм) или тестовое соединение в растворе О буфер (агонизм).

Клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°С, реакцию останавливали добавлением 100 мкл δ буфера (0,1 М НС1 и 0,1 мМ СаС1₂) и планшеты помещали в термостат при 4°С на 1 ч. Добавляли 68 мкл N буфера (0,15 М ΝαΟΗ и 60 мМ ЫаОЛс) и планшеты помещали во встряхиватель на 10 мин. 60 мкл реакционного раствора переносили в сАМР-флэш-планшеты (ΌιιΡοηΙ ΝΕΝ), содержащие 40 мкл 60 мМ ацетата натрия при рН 6,2 и добавляли 100 мкл 1С-смеси (50 мМ ацетата натрия при рН 6,2, 0,1% азида натрия, 12 мМ СаС1₂, 1% ΒδΑ (бычий сывороточный альбумин) и 0,15 микро-СЕмл ¹²⁵1-сАМР). После 18 ч инкубации при 4°С планшеты промывали один раз и измеряли на счетчике \Уа11ас ТпЬих. Как было установлено, соединение 10 действует как Э^агонист в этом исследовании.

Э₂/сАМР исследование.

Способность соединений или стимулировать, или ингибировать опосредованное Э₂-рецептором ингибирование синтеза сАМР в СНО-клетках с трансфектированным Э₂-рецептором человека измеряли, как описано ниже. Клетки высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 8000 клеток/лунку за три дня перед экспериментом. В день эксперимента клетки промывали один раз предварительно нагретым О буфером (1 мМ М§С1₂, 0,9 мМ СаС1₂, 1 мМ ΙΒΜΧ в ΡΒδ) и исследование начинали добавлением 100 мкл смеси 1 мкМ хинпирола, 10 мкМ форсколина и тестового соединения в О буфере (антагонизм) или 10 мкМ форсколина и тестового соединения в О буфере (агонизм).

Клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°С, реакцию останавливали добавлением 100 мкл δ буфера (0,1М НС1 и 0,1 мМ СаС1₂) и планшеты помещали в термостат при 4°С на 1 ч. Добавляли 68 мкл N буфера (0,15 М №ГОН и 60 мМ ацетата натрия) и планшеты помещали во встряхиватель на 10 мин. 60 мкл реакционного раствора переносили в сАМР-флэш-планшеты ΌιιΡοηΙ ΝΕΝ), содержащие 40 мкл 60 мМ №ГОАс при рН 6,2 и добавляли 100 мкл 1С-смеси (50 мМ №ГОЛс, рН 6,2, 0,1% азида натрия, 12 мМ СаС1₂, 1% ΒδΑ и 0,15 микро-СЕмл ¹²⁵1-сАМР). После 18 ч инкубации при 4°С планшеты промывали один раз и измеряли на счетчике \Уа11ас ТпЬих. Соединение 10, как было установлено, действует как Ό₂агонист в этом исследовании.

О₅-исследование.

Зависимая от концентрации стимуляция внутриклеточного высвобождения Са²' под действием допамина в Ш₅-трансфектированных СНО-Оа16 клетках. Клетки прокрашивали йиот-4, кальцийевым индикаторным красителем в течение 1 ч. Кальциевый отклик (изменение флуоресценции) измеряли на РЫРК (флуорометрический сканирующий планшет-ридер) в течение 2,5 мин. Величины пиков (ЕС₅₀) усредняли по дублированным лункам для каждой точки данных и переносили на график с концентрациями лекарства (см. фиг. 2 для допамина). Соединение 10, как было установлено, действует как Э₅агонист в этом исследовании.

6-ОНЭА-модель на крысах.

Допаминовые агонисты могут иметь активность или в отношении Όι-рецепторов, или Ό₂рецепторов, или обоих.

Вращательный отклик на крысах с односторонними 6-ОНОА-повреждениями может быть применен для оценки потенциала соединений стимулировать оба типа рецепторов и вызывать вращение (иидетк1еб1, АгЬиШиоИ, Βιηίη Кек., 1910, 24, 485; δβΐΐβτ, е! а1. Еиг. 1. Рйагтасо1., 1978, 50(4), 419; апб Ипдегк!еб1„ е! а1. Абуапсек ίη Оораийпе Кекеагсй (Койкака, Еб.), Регдатоп Ргекк, 1982, ОхГогб, с. 219). 6ΟΗΌΑ (6-гидроксидопамин) представляет собой нейротоксин, применяемый нейробиологами для селективного уничтожения допаминоэргических нейронов в месте инъекции в мозг у экспериментальных животных. В 6-ОНОА модели нигростриарные допаминовые клетки разрушаются на одной стороне мозга (односторонне) путем инъекции 6-ОНОА в медиальный переднемозговой пучок, локализованный в передней стороне черного вещества. Эта односторонняя инъекция, объединенная со стимуляцией под действием допаминовых агонистов, таких как апоморфин, будет вызывать вращательное поведение, так как только одна сторона мозга стимулирована. Эксперименты заключаются в определении минимума эффективной дозы (ΜΕΌ) для возникновения вращения исследуемым соединением. Если величина ΜΕΌ определена, проводится второй эксперимент для определения ΜΕΌ соединения преодолевать немонапридовую блокировку (ΜΕΌ _{немонаприд}). Немонаприд представляет собой О₂-антагонист, который блокирует Э₂- 10 023778 рецептор, следовательно, любые наблюдаемые вращения должны зависеть от активности на Όιрецепторе. В конечном итоге, если ΜΕΌ _{немонаприд} известна, проводится третий эксперимент с применением дозы ΜΕΌ _{немонаприд} и наблюдается эффект Э^антагониста, 8СН 23390 отдельно, Э₂-антагониста, немонаприда отдельно и затем эффект совместного действия 8СН23390 и немонаприда. Этот третий эксперимент подтверждает активность соединения на обоих рецепторах, так как любой из двух антагонистов по отдельности может только частично ингибировать вращательный отклик, вызываемый тестовым соединением, в то время как комбинированная обработка полностью блокирует все вращения на крысах [Ατηΐ, Нуйе1; Р5усЬорЬаттасо1оду, 85(3), 346 (1985); аиб 8оиза11а, е1 а1., I. РЬагтасо1. Ехр. ТЬег., 247(1), 180, (1988)]. Эта модель подтверждена с применением апоморфина в качестве кернового соединения для смешанных Э₁/П₂-агонистов.

В этой модели соединение 10 обладает апоморфин-подобными профилями с Э₁/П₂-соотношением около 2-4, что можно сравнить с соотношением около 3 для апоморфина. Кроме того, продолжительность наблюдаемого действия для соединения составляет около 18 ч, что значительно больше, чем продолжительность, которую можно наблюдать для Ь-допа/апоморфина. Όι-компонента может не наблюдаться для Э₂-агонистов. как, например, в случае прамипексола и ротиготина.

Модель сравнительного превосходства.

Апоморфин и Ь-допа способны восстанавливать недостаточные уровни подвижности в модели тяжелого допаминового истощения на мышах. Как апоморфин, так и Ь-допа стимулируют Ό]- и Ό₂допаминовые рецепторы. Прамипексол, агонист Э₂-рецепторов, неэффективен в этой модели.

Эксперименты проводили следующим образом: использовали мышей, предварительно обработанных МРТР (2x15 мг/кг, подкожно), и имевших стабильные повреждения; обработанные носителем мыши служили в качестве нормализованного контроля. МРТР (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) представляет собой нейротоксин, который вызывает непрерывные симптомы болезни Паркинсона путем уничтожения определенных нейронов в черном веществе мозга. Он применяется для исследования болезни на обезьянах и мышах. В день эксперимента мышей обрабатывали АМРТ (250 мг/кг подкожно), затем возвращали в их родные клетки на 1,5 ч, после чего мышей помещали в индивидуальные клетки в подвижной секции. АМРТ (α-метил-р-тирозин) представляет собой лекарство, которое временно уменьшает катехоламиновую активность мозга (в этом случае особенно допаминовые уровни). Через 3 ч после инъекции АМРТ предпринималась попытка восстановить дефициты подвижности действием соединения 10, активность регистрировалась в течение еще 1,5 ч. Данные, собранные в первые 30 мин после восстанавливающей обработки, являлись некорректными ввиду стресса у животных от контакта с руками и инъекции, что было доказано увеличенными уровнями у контрольных животных, обработанных носителем; таким образом, для анализа использовались данные, собранные в последний 1 ч записи данных. Различные допаминоэргические соединения тестировали на их способность восстанавливать недостаточные уровни подвижности, полученные в этой модели. Как Ь-допа/бенсеразид, так и апоморфин восстанавливали подвижность на мышах зависимым от дозы образом. Бенсеразид представляет собой ингибитор допа-декарбоксилазы, который неспособен проникать через гематоэнцефалический барьер, он применяется для блокировки превращения Ь-допа в допамин вне пределов мозга. В противоположность этому, Ό₂агонисты, прамипексол и бромкриптин не восстанавливали подвижности на мышах.

Эту модель использовали для исследования того, обнаруживает соединение 10 или нет то же превосходство, как и Ь-допа и апоморфин, по сравнению с Э₂-агонистами. Для соединения 10 проводили эксперимент доза-отклик; наблюдалась зависимая от дозы общая тенденция восстановления гипокинезических дефицитов, вызываемых серьезным истощением эндогенного допамина. Проводили конечный эксперимент, прямо сравнивая эффекты апоморфина, прамипексола и соединения 10 в этой модели и было подтверждено, что соединение 10 способно восстанавливать подвижность на обработанных МРТР мышах и превосходит прамипексол.

Модель индукции дискинезии на крысах с 6-ОНЭА-повреждениями мозга.

Двадцать самцов крыс Спрейга Доули (8ртадие Ό;·ι\νΚν) с односторонними 6-ΟΗΌΑповреждениями использовали для исследования индукции дискинезии под действием соединения 10 (вводили подкожно; и=7; группа 1) по сравнению с Ь-допа/бенсеразидом (6 мг/кг/15 мг/кг подкожно; и=7; группа 2) и апоморфином (1 мг/кг подкожно; и=6; группа 3). Бенсеразид представляет собой ингибитор допа-декарбоксилазы, который неспособен преодолевать гематоэнцефалический барьер; он применяется для блокировки превращения Ь-допа в допамин вне пределов мозга. Через три недели после инъекции 6-ΟΗΌΑ, животных тестировали на их вращательный отклик, вызываемый 2,5 мг/кг амфетамина, который вызывает ипсилатеральное движение по кругу (амфетамин увеличивает уровень допамина в мозге через незатронутые нейроны на неповрежденной стороне, вызывая вращение животных в противоположном направлении по сравнению с их откликом на прямые агонисты, такие как Ь-допа и апоморфин, которые действуют преимущественно на поврежденную сторону мозга). Все животные, включенные в это исследование, соответствовали критерию более чем 350 вращений в 60 мин. Затем крыс случайным образом распределяли на три группы обработки, выравнивая группы по вращательному отклику животных на амфетамин.

- 11 023778

В течение проводимых экспериментов по дискинезии, крысы получали один раз в день подкожно инъекции тестовых соединений и наблюдались в течение 3 ч после инъекции. Каждое животное наблюдалось в течение 1 мин каждые 20 мин в течение 3-часового периода на присутствие дискинезии с применением шкалы аномальных непроизвольных движений (ΑΙΜδ), как описано ранее (ЬиибЫаД с1 а1., Еиг. I. №ито8С1., 15, 120, (2002)). Крысы получали лекарство в течение 14 последовательных дней и делались отметки на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10 и 12 день. Двусторонние повторные измерения ΑΝΟνΑ показали, что существует значительный эффект лечения, временной эффект и обработка взаимодействием во времени (р<0,001, во всех случаях). После этого сравнения с применением способа Холма-Сидака (Но1т-81бак) показали, что животные, обработанные соединением 10, имеют значительно меньший уровень дискинезии (в единицах шкалы около 30) по сравнению с животными, обработанными или Ь-допа или апоморфином (в единицах шкалы около 70). Не имелось различий между группами, обработанными Ь-допа и апоморфином. Следуя этому эксперименту, все крысы получили подкожные инъекции соединения 10 в дни 15-19 для того, чтобы определить, как пример I влияет на тяжесть дискинезии, наблюдаемую в группах апоморфина и Ь-допа. Измерение уровня дискинезии проводили на 19-й день эксперимента (что соответствовало 5 дням в случае соединения 10). Данные показали частичное обращение дискинезии, вызываемых Ь-допа и апоморфином, приблизительно до уровня дискинезий, вызываемых соединением 10 (которое не вызывает увеличения дискинезий в группе 1 по сравнению с уровнем по шкале около 30, наблюдаемым после 12 дней лечения).

Модель дискинезий на крысах.

Отдельное исследование дискинезий было направлено на восстановление вызванных Ь-допа уровней дискинезий, или действием прамипексола, или соединения 10. Кратко, 18 животных обрабатывали с Ь-допа/бенсеразидом (6/15 мг/кг подкожно) в течение 7 дней. Животные наблюдались на 1, 3 и 5 дни и регистрировались уровни по шкале ΑΙΜδ. Величины на 5 день затем использовались для разделения животных на три группы из 6 животных в каждой. Группа 1 продолжала получать ежедневное лечение Ьдопа. Группу 2 обрабатывали соединением 10 (вводимым подкожно). Группу 3 обрабатывали прамипексолом (0,16 мг/кг подкожно). Лечение продолжали ежедневно в течение 10 дней и уровни дискинезий измеряли на 1, 5, 9 и 10 день. Двусторонний анализ повторных измерений колебания показал, что животные, обработанные соединением 10, имели значительно меньшие уровни дискинезий, чем как в группе прамипексола, так и в группе Ь-допа/бенсеразида. Группа прамипексола имела значительно меньшие уровни дискинезий, чем группа Ь-допа/бенсеразида. Таким образом, соединение 10 имело профиль, превосходящий профиль прамипексола в отношении понижения уровней дискинезий, вызываемой Ь-допа.

Антипаркинсоновские эффекты на обработанных МРТР обыкновенных игрунках.

Эксперименты проводили с использованием шести обработанных МРТР мартышек (2,0 мг/кг, растворенных в стерильном 0,9% физиологическом растворе, ежедневно в течение до 5 последовательных дней). Всех животных предварительно обрабатывали Ь-допа (12,5 мг/кг р.о., вместе с карбидопа 12,5 мг/кг р.о.), вводимого ежедневно в течение до 30 дней для того, чтобы вызвать дискинезию. Перед исследованием все индивидуумы проявляли стабильные двигательные расстройства, включая заметное снижение базальной двигательной активности, слабую координацию движений, аномальную и/или напряженную позу, уменьшенную проворность и сравнивающие движения головой. Домперидон вводили за 60 мин перед любым из тестовых соединений. Домперидон представляет собой антидопаминоэргическое лекарство, которое подавляет тошноту и рвоту. Двигательная активность оценивалась с применением клеток для экспериментов, которые включали в себя 8 фотоэлектрических переключателей, включающих в себя 8 инфракрасных лучей, которые помещали в клетку по плану и прерывание луча регистрировалось как одно движение. Общее число прерываний лучей на отрезке времени затем представляли в виде графика по ходу времени или отображали как область под кривой (АиС) для общей активности. Оценку двигательной нетрудоспособности проводили опытным наблюдателем, не информированным о лечении.

Ь-допа (12,5 мг/кг, р.о.) увеличивало двигательную активность и уменьшало двигательную нетрудоспособность, как ранее описано (διηίΐΐι. с1 а1. Μον. Όίδοτά. 2002, 17(5), 887). Доза, выбранная для этой сложной задачи, находилась на верхней части кривой доза-отклик для этого лекарства. Соединение 10 (вводимое подкожно) приводило к зависимым от дозы увеличениям двигательной активности и сокращению двигательной нетрудоспособности, имея тенденцию создавать отклик больший, чем в случае Ьдопа (12,5 мг/кг, р.о.). Оба тестовых соединения приводили к продолжительному уменьшению двигательной нетрудоспособности по сравнению с Ь-допа и были такими же эффективными, как Ь-допа. Соединение 10 приводило к продолжительному снижению двигательной нетрудоспособности по сравнению с Ь-допа и было таким же эффективным, как Ь-допа.

Пример 3. Фармакологическое тестирование соединения 11.

Όι/сЛМР исследование.

Способность соединений или стимулировать, или ингибировать опосредованный Όι-рецептором синтез сАМР в СНО-клетках, стабильно экспрессирующих человеческий рекомбинантный Όι-рецептор, измеряли, как описано ниже. Клетки высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 11000 клеток/лунку за три дня перед экспериментом. В день эксперимента клетки промывали один раз предвари- 12 023778 тельно нагретым О буфером (1 мМ М§С1₂, 0,9 мМ СаС1₂, 1 мМ ΙΒΜΧ (3-трет-бутил-1-метилксантин) в ΡΒδ (фосфатный буферный физиологический раствор)) и исследование начинали добавлением 100 мкл смеси 30 нМ А68930 и тестового соединения в растворе О буфера (антагонизм) или тестового соединения в растворе О буфера (агонизм).

Клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°С, реакцию останавливали добавлением 100 мкл δ буфера (0,1 М НС1 и 0,1 мМ СаС1₂); планшеты помещали в термостат при 4°С на 1 ч. Добавляли 68 мкл N буфера (0,15 М №ОН и 60 мМ №ЮЛс) и планшеты помещали во встряхиватель на 10 мин. 60 мкл реакционного раствора переносили в сАМР-флэш-планшеты (ΩηΡοπΙ ΝΕΝ), содержащие 40 мкл 60 мМ ацетата натрия при рН 6,2 и добавляли 100 мкл 1С-смеси (50 мМ ацетата натрия при рН 6,2, 0,1% азида натрия, 12 мМ СаС1₂, 1% ΒδΑ (бычий сывороточный альбумин) и 0,15 микро-СЬмл ¹²⁵1-сАМР). После 18 ч инкубации при 4°С планшеты промывали один раз и измеряли на счетчике Аа11ас ТпЬих. Активный метаболит или соединение 10, как было установлено, является Όί-агонистом в этом исследовании.

О₂/сАМР исследование.

Способность соединений или стимулировать, или ингибировать опосредованное О₂-рецептором ингибирование синтеза сАМР в СНО-клетках с трансфектированным О₂-рецептором человека измеряли, как описано ниже. Клетки высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 8000 клеток/лунку за три дня перед экспериментом. В день эксперимента клетки промывали один раз предварительно нагретым О буфером (1 мМ М§С1₂, 0,9 мМ СаС1₂. 1 мМ ΙΒΜΧ в ΡΒδ) и исследование начинали добавлением 100 мкл смеси 1 мкМ хинпирола, 10 мкМ форсколина и тестового соединения в О буфере (антагонизм) или 10 мкМ форсколина и тестового соединения в О буфере (агонизм).

Клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°С, реакцию останавливали добавлением 100 мкл δ буфера (0,1 М НС1 и 0,1 мМ СаС12) и планшеты помещали в термостат при 4°С на 1 ч. Добавляли 68 мкл N буфер (0,15 М №ЮН и 60 мМ ацетата натрия) и планшеты помещали во встряхиватель на 10 мин. 60 мкл реакционного раствора переносили в сАМР-флэш-планшеты (ΌπΡοηΐ ΝΕΝ), содержащие 40 мкл 60 мМ №ЮАс при рН 6,2 и добавляли 100 мкл 1С-смеси (50 мМ №ЮАс. рН 6,2, 0,1% азида натрия, 12 мМ СаС1₂, 1% ΒδΑ и 0,15 микро-СЬмл ¹²⁵1-сАМР). После 18 ч инкубации при 4°С планшеты промывали один раз и измеряли на счетчике Аайас ТпЬих. Активный метаболит, или соединение 10, как было установлено, представляет собой О₂-агонист в этом исследовании.

□ -исследование.

Зависимая от концентрации стимуляция внутриклеточного высвобождения Са²+ под действием допамина в ЬО₅-трансфектированных СНО-Оа16 клетках. Клетки выдерживали с йиог-4, кальциевым индикаторным красителем в течение 1 ч. Кальциевый отклик (изменение флуоресценции) измеряли на ΡΕΙΡΚ (флуорометрический визуализирующий планшет-ридер) в течение 2,5 мин. Величины пиков (ЕС₅₀) усредняли по дублированным лункам для каждой точки данных и переносили на график с концентрациями лекарства. Активный метаболит, или соединение 10, как было установлено, представляет собой Ό₅агонист в этом исследовании.

6-ОНОА-модель на крысах.

Допаминовые агонисты могут иметь активность или в отношении □₁-рецепторов, или Ό₂рецепторов, или обоих. Вращательный отклик на крысах с односторонними 6-ОНОА-повреждениями может быть применен для оценки потенциала соединений стимулировать оба типа рецепторов и вызывать вращение (ипдегйеФ, АтЪйЬпой, Βπιίη Кек. 24, 485 (1970); δοΐ1θΓ, с1 а1., Еиг. I. ΡЬа^тасо1.. 50(4), 419 (1978); апб ипдегйеШ, е1 а1., Абуапсек ίη □оратте КекеагсЬ (КоЬкака, Ей), Ρе^датоη Ριόκκ, 1982, ОхГогй с. 219). 6-ОНЭА (6-гидроксидопамин) представляет собой нейротоксин, применяемый нейробиологами для селективного уничтожения допаминоэргических нейронов в месте инъекции в мозг у экспериментальных животных. В 6-ОНЭА модели нигростриарные допаминовые клетки разрушаются на одной стороне мозга (односторонне) путем инъекции 6-ОНЭА в медиальный переднемозговой пучок, локализованный в передней стороне черного вещества. Эта односторонняя инъекция, объединенная со стимуляцией под действием допаминовых агонистов, таких как апоморфин, будет вызывать вращательное поведение, так как только одна сторона мозга стимулирована. Эксперименты заключаются в определении минимума эффективной дозы (ΜΕΌ) для возникновения вращения исследуемым соединением. Если величина ΜΕΌ определена, проводится второй эксперимент для определения ΜΕΌ соединения преодолевать блокировку немонаприда (ΜΕΌ _{немонаприд}). Немонаприд представляет собой О₂-антагонист, который блокирует О₂-рецеитор, следовательно, любые наблюдаемые вращения должны зависеть от активности на Όι-рецепторе. В конечном итоге, когда ΜΕΌ немош^вд известна, проводится третий эксперимент с применением дозы ΜΕΌ _не_мона_прид и наблюдается эффект Όι-антагониста, δί'Ή23390 отдельно, Э₂антагониста, немонаприда отдельно и затем эффект совместного действия δί'Ή23390 и немонаприда. Этот третий эксперимент подтверждает активность соединения на обоих рецепторах, так как любой из двух антагонистов по отдельности может только частично ингибировать вращательный отклик, вызываемый тестовым соединением, в то время как комбинированная обработка полностью блокирует все вращения на крысах |Агп1, Нуйе1; ΡκусЬоρЬа^тасо1о§у, 85(3), 346 (1985); апб δоηκа11а, е1 а1., ί. Гйагтасо1. Εχρ. ТЬег., 247(1), 180, (1988)]. Эта модель подтверждена с применением апоморфина в качестве керно- 13 023778 вого соединения для смешанных О^г-агонистов.

В этой модели активный метаболит, или соединение 10, и соединение 11 обладают апоморфинподобными профилями с О₁/П₂-соотношением около 2, что можно сравнить с соотношением около 3 для апоморфина. Кроме того, продолжительность наблюдаемого действия для соединения составляет около 18 ч, что значительно больше, чем продолжительность, которую можно видеть для Ь-допа/апоморфина. Όι-компонента может не наблюдаться для О₂-агонистов. как, например, в случае прамипексола и ротиготина.

Модель сравнительного превосходства.

Апоморфин и Ь-допа способны восстанавливать недостаточные уровни подвижности в модели тяжелого допаминового истощения на мышах. Как апоморфин, так и Ь-допа стимулируют Ό₁- и Ό₂допаминовые рецепторы. Прамипексол, агонист Э₂-рецепторов, неэффективен в этой модели.

Эксперименты проводили следующим образом: использовали мышей, предварительно обработанных МРТР (2x15 мг/кг, подкожно) и имевших стабильные повреждения; в качестве нормализованного контроля служили обработанные носителем мыши. МРТР (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) представляет собой нейротоксин, который вызывает непрерывные симптомы болезни Паркинсона путем уничтожения определенных нейронов в черном веществе мозга. Он применяется для исследования болезни на обезьянах и мышах. В день эксперимента мышей обрабатывали АМРТ (250 мг/кг подкожно), затем возвращали в их родные клетки на 1,5 ч, после чего мышей помещали в индивидуальные клетки в подвижной секции. АМРТ (α-метил-р-тирозин) представляет собой лекарство, которое временно уменьшает катехоламиновую активность мозга (в этом случае особенно допаминовые уровни). Через 3 ч после инъекции АМРТ предпринималась попытка восстановить дефициты подвижности действием активного метаболита или соединения 10, активность регистрировалась в течение еще 1,5 ч. Данные, собранные в первые 30 мин после восстанавливающей обработки, являлись некорректными ввиду стресса у животных от контакта с руками и инъекции, что было доказано увеличенными уровнями у контрольных животных, обработанных носителем, таким образом, для анализа использовались данные, собранные в последний 1 ч записи данных. Различные допаминоэргические соединения тестировали на их способность восстанавливать недостаточные уровни подвижности, полученные в этой модели. Как Ьдопа/бенсеразид, так и апоморфин восстанавливали подвижность на мышах зависимым от дозы образом. Бенсеразид представляет собой ингибитор допа-декарбоксилазы, который неспособен проникать через гематоэнцефалический барьер, он применяется для блокировки превращения Ь-допа в допамин вне пределов мозга. В противоположность этому Э₂-агонисты, прамипексол и бромкриптин не восстанавливали подвижности на мышах.

Эту модель использовали для исследования того, обнаруживает или нет активный метаболит, или соединение 10, то же превосходство, как и Ь-допа и апоморфин, по сравнению с Э₂-агонистами. Проводили эксперимент доза-отклик; наблюдалась зависимая от дозы общая тенденция восстановления гипокинезических дефицитов, вызываемых серьезным истощением эндогенного допамина. Проводили конечный эксперимент, прямо сравнивая эффекты апоморфина, прамипексола и соединения 10 в этой модели. Было подтверждено, что соединение 10 способно восстанавливать подвижность на обработанных МРТР мышах и превосходит прамипексол.

Модель дискинезии на крысах.

Модель дискинезии на крысах, описанную в литературе (ЬиибЫаб, с1 а1., Еиг. 1. №иго8ст, 2002, 15, 120) применяли для исследования эффектов активного метаболита по сравнению с Ь-допа/бенсеразидом в отношении уровней дискинезии, которые оценивались как аномальные непроизвольные движения (ΑΙΜδ) на паркинсоновских крысах.

Проведение исследования.

Во время исследования животные получали Ь-допа/бенсеразид (6 мг/кг и 15 мг/кг подкожно) или активный метаболит (соединение 10) (группа В) один раз в день в моменты времени -20 мин и 0-180 мин. Уровни дискинезии животных измеряли. Дни 1-14: все животные получали дозу Ь-допа/бенсеразид (группа А) или активного метаболита (соединение 10) (группа В).

На 1, 3, 5, 8 и 12 день на животных проводили замеры ΑΙΜ путем регистрации уровней дискинезии с применением шкалы аномальных непроизвольных движений (ΑΙΜ8), как описано ранее (ЬиибЫаб, е1 а1., Еиг. 1. №иго8ст, 2002, 15, 120). Дни 15-26: группу А животных обрабатывали тестируемым лекарством (как группу В) вместо Ь-допа/бенсеразида. Дни 15, 16, 17, 19, 22, 24 и 26: Замеры на животных согласно шкале ΑΙΜ.

Уменьшение вызванных Ь-допа уровней дискинезии на 6-ОНЭА-крысах.

После восьми дней лечения группа А животных имела уровни дискинезии порядка 10-12, которые оставались постоянными до 12-го дня. В противоположность этому группа В животных имела значительно более низкие уровни дискинезии (порядка 2-4). Для группы В степень дискинезии не изменялась в течение исследования. После того как группа А животных начинала получать вместо Ьдопа/бенсеразида тестовое лекарство, их уровень дискинезии постепенно уменьшался до уровня, наблюдаемого для другой группы животных. Таким образом, соединение 11 вызывает значительно меньшие

- 14 023778 уровни дискинезии, чем Ь-допа, и способно уменьшать уровни дискинезии, вызываемой Ь-допа.

Антипаркинсоновские эффекты на обработанных МРТР обыкновенных игрунках.

Эксперименты проводили с использованием шести обработанных МРТР мартышек (2,0 мг/кг, растворенных в стерильном 0,9% физиологическом растворе, ежедневно в течение до 5 последовательных дней). Всех животных предварительно обрабатывали Ь-допа (12,5 мг/кг р.о., вместе с карбидопа 12,5 мг/кг р.о.), вводимого ежедневно в течение до 30 дней для того, чтобы вызвать дискинезию. Перед исследованием все индивидуумы проявляли стабильные двигательные расстройства, включая заметное снижение базальной двигательной активности, слабую координацию движений, аномальную и/или напряженную позу, уменьшенную проворность и сравнивающие движения головой. Домперидон вводили за 60 мин перед любым из тестовых соединений. Домперидон представляет собой антидопаминоэргическое лекарство, которое подавляет тошноту и рвоту. Двигательная активность оценивалась с применением тестовых клеток, которые включали в себя 8 фотоэлектрических переключателей, включающих в себя 8 инфракрасных лучей, которые помещали в клетку по плану и прерывание луча регистрировалось как одно движение. Общее число прерываний лучей на отрезке времени затем представляли в виде графика по ходу времени или отображали как область под кривой (АИС) для общей активности. Оценку двигательной нетрудоспособности проводили опытным наблюдателем, не информированным о лечении.

Ь-допа (12,5 мг/кг, р.о.) увеличивало двигательную активность и уменьшало двигательную нетрудоспособность, как ранее описано (διηΠίι, е! а1. Μον. ΌίδΟΓά. 2002, 17(5), 887). Доза, выбранная для этой сложной задачи, находилась на верхней части кривой доза-отклик для этого лекарства. Соединение 11 (вводимое р.о.), так же как соединение 10 (вводимое подкожно), приводило к зависимым от дозы увеличениям двигательной активности и сокращению двигательной нетрудоспособности, имея тенденцию создавать отклик больший, чем в случае Ь-допа (12,5 мг/кг, р.о.). Оба тестовых соединения приводили к продолжительному уменьшению двигательной нетрудоспособности по сравнению с Ь-допа и были такими же эффективными, как Ь-допа.

Исследование гепатоцитов ίη νίΐΓΟ.

Консервированные заморозкой объединенные гепатоциты самцов крыс Спрейга-Доули (Зргадле Эа\у1еу) и объединенные гепатоциты человека от 10 доноров (мужские и женские) были закуплены в ίη νίίτο Тес11по1още5 1пс., ВА, И8А. Клетки отогревали при 37°С в водяной бане, живые клетки считали и засевали в общем объеме 100 мкл в модифицированной по Дульбекко (Эн1Ьессо) среде Игла (с высоким содержанием глюкозы) с 5 мМ буфера Нерек на 96-луночные планшеты, где каждая лунка содержала 250000 и 500000 клеток/мл для гепатоцитов крысы и человека соответственно. Инкубации начинали через 15 мин после преинкубации и останавливали в моменты времени 0, 5, 15, 30 и 60 мин для гепатоцитов крысы и 0, 30, 60, 90 и 120 мин для гепатоцитов человека. Инкубации останавливали добавлением равного объема охлажденного льдом ацетонитрила, содержащего 10% 1М НС1. После центрифугирования 20 мкл супернатантов инжектировали на НРЬС-колонку Λΐΐαηΐίδ 6С18 3 мкм, 150x2,1 мм ί.ά. (^а!егз, МА, И8А). Подвижная фаза имела следующий состав: А: 5% ацетонитрила, 95% Н₂О, 3,7 мл/л 25% водного ΝΗ₃, 1,8 мл/л муравьиной кислоты. Подвижная фаза В: 100% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты. Скорость потока составляла 0,3 мл/мин. Градиент варьировали от 0 до 75% В за время от 5 мин до 20 мин и элюат анализировали с применением масс-спектрометра С-ТОРнпсго (^а!егз, МА, И8А).

Образование метаболита подтверждали методом масс-спектра высокого разрешения и сравнивали с синтезированным стандартом, что приводило к точно совпадающим временам удержания. В этом исследовании было продемонстрировано метаболическое превращение соединения 11 в соединение 10.

Пример 4/ Фармакологическое тестирование соединения 12/

И₁/сАМР исследование/

Способность соединений или стимулировать, или ингибировать опосредованный И^рецетором синтез сАМР в СНО-клетках, стабильно экспрессирующих человеческий рекомбинантный Όι-рецетор, измеряли, как описано ниже. Клетки высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 11000 клеток/лунку за три дня перед экспериментом. В день эксперимента клетки промывали один раз предварительно нагретым С буфером (1 мМ М§С1₂, 0,9 мМ СаС1₂, 1 мМ 1ВМХ (3-трет-бутил-1-метилксантин) в ΡΒδ (фосфатный буферный физиологический раствор)); исследование начинали добавлением 100 мкл смеси 30 нМ А68930 и тестового соединения в растворе С буфера (антагонизм) или тестового соединения в растворе С буфера (агонизм).

Клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°С, реакцию останавливали добавлением 100 мкл δ буфера (0,1 М НС1 и 0,1 мМ СаС12) и планшеты помещали в термостат при 4°С на 1 ч. Добавляли 68 мкл N буфера (0,15 М №ЮН и 60 мМ №ОАс) и планшеты помещали во встряхиватель на 10 мин. 60 мкл реакционного раствора переносили в сАМР-флэш-планшеты (ΌπΡοηί ΝΕΝ), содержащие 40 мкл 60 мМ ацетата натрия при 6,2 и добавляли 100 мкл 1С-смеси (50 мМ ацетата натрия при рН 6,2, 0,1% азида натрия, 12 мМ СаС1₂, 1% ВδА (бычий сывороточный альбумин) и 0,15 микро-С1/мл ¹²⁵1-сАМР). После 18 ч инкубации при 4°С планшеты промывали один раз и измеряли на счетчике \Ма11ас ТггЬих. Активный метаболит (т.е. соединение 10), как было найдено, является И₁-агонистом в этом исследовании.

Ό,/сАМР исследование.

- 15 023778

Способность соединений или стимулировать, или ингибировать опосредованное И₂-рецептором ингибирование синтеза сАМР в СНО-клетках с трансфектированным И₂-рецептором человека измеряли, как описано ниже. Клетки высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 8000 клеток/лунку за три дня перед экспериментом. В день эксперимента клетки промывали один раз предварительно нагретым О буфером (1 мМ МдС1₂, 0,9 мМ СаС1₂, 1 мМ 1ВМХ в РВЗ) и исследование начинали добавлением 100 мкл смеси 1 мкМ хинпирола, 10 мкМ форсколина и тестового соединения в О буфере (антагонизм) или 10 мкМ форсколина и тестового соединения в О буфере (агонизм).

Клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°С, реакцию останавливали добавлением 100 мкл З буфера (0,1 М НС1 и 0,1 мМ СаС12) и планшеты помещали в термостат при 4°С на 1 ч. Добавляли 68 мкл N буфера (0,15 М №ГОН и 60 мМ ацетата натрия) и планшеты помещали во встряхиватель на 10 мин. 60 мкл реакционного раствора переносили в сАМР-флэш-планшеты (ИиРои! ΝΕΝ), содержащие 40 мкл 60 мМ №ОАс при рН 6,2 и добавляли 100 мкл 1С-смеси (50 мМ №ОАс, рН 6,2, 0,1% азида натрия, 12 мМ СаС1₂, 1% ВЗА и 0,15 микро-СКмл ¹²⁵1-сАМР). После 18 ч инкубации при 4°С планшеты промывали один раз и измеряли на счетчике \Уа11ас ТпЬих. Активный метаболит (т.е. соединение 10), как было установлено, представляет собой И₂-агонист в этом исследовании.

И-исследование.

Зависимая от концентрации стимуляция внутриклеточного высвобождения Са²+ под действием допамина в ЬИ₅-трансфектированных СНО-Оа16 клетках. Клетки выдерживали с й1иог-4, кальциевым индикаторным красителем в течение 1 ч. Кальциевый отклик (изменение флуоресценции) измеряли на РЬ1РК (флуорометрический визуализирующий планшет-ридер) в течение 2,5 мин. Величины пиков (ЕС₅₀) усредняли по дублированным лункам для каждой точки данных и переносили на график с концентрациями лекарства (см. фиг. 1 для допамина). Активный метаболит (т.е. соединение 10), как было установлено, представляет собой И₅-агонист в этом исследовании.

6-ОНИА-модель на крысах.

Допаминовые агонисты могут иметь активность или в отношении Όι-рецепторов, или И₂рецепторов, или обоих. Вращательный отклик на крысах с односторонними 6-ОНИА-повреждениями может быть применен для оценки потенциала соединений стимулировать оба типа рецепторов и вызывать вращение Шпдегк1еб1, апб АгЬиШпой; Вгаш Кек., 24, 485 (1970); ЗеЙег, е1 а1., Еиг. 1. РЬагтасо1, 50(4), 419 (1978); апб ипдегк1еб1, е1 а1., Абуаисек ш Иоратте КекеагсЬ (КоЬкака, Еб.), Регдатои Ргекк, 1982, Охйогб, с. 219)). 6-ОНИА (6-гидроксидопамин) представляет собой нейротоксин, применяемый нейробиологами для селективного уничтожения допаминоэргических нейронов в месте инъекции в мозг у экспериментальных животных. В 6-ОНИА модели нигростриарные допаминовые клетки разрушаются на одной стороне мозга (односторонне) путем инъекции 6-ОНИА в медиальный переднемозговой пучок, локализованный в передней стороне черного вещества. Эта односторонняя инъекция, объединенная со стимуляцией под действием допаминовых агонистов, таких как апоморфин, будет вызывать вращательное поведение, так как только одна сторона мозга стимулирована. Эксперименты заключаются в определении минимума эффективной дозы (МЕИ) для возникновения вращения исследуемым соединением. Если величина МЕИ определена, проводится второй эксперимент для определения МЕИ соединения преодолевать немонапридную блокировку (МЕИ _{немоноприд}). Немонаприд представляет собой И₂антагонист, который блокирует И₂-рецептор, следовательно, любые наблюдаемые вращения должны зависеть от активности на И^рецепторе. В конечном итоге, если МЕИ _{немоноприд} известна, проводится третий эксперимент с применением дозы МЕИ _{немоноприд} и наблюдается эффект И^антагониста, ЗСН23390 отдельно, И₂-антагониста, немонаприда отдельно и затем эффект совместного действия ЗСН23390 и немонаприда. Этот третий эксперимент подтверждает активность соединения на обоих рецепторах, так как любой из двух антагонистов по отдельности может только частично ингибировать вращательный отклик, вызываемый тестовым соединением, в то время как комбинированная обработка полностью блокирует все вращения на крысах [Ат!, Ну11е1; РкусЬорЬагтасо1оду, 85(3), 346 (1985); апб Зопка11а, е1 а1., 1. РЬагтасо1. Ехр. ТЬег., 247(1), 180, (1988)]. Эта модель подтверждена с применением апоморфина в качестве кернового соединения для смешанных И1/И₂-агонистов.

В этой модели соединение 10 и соединение 12 обладают апоморфин-подобными профилями с И;/И₂-соотношением приблизительно 2-4, что можно сравнить с соотношением около 3 для апоморфина. Кроме того, продолжительность наблюдаемого действия для соединения составляет около 18 ч, что значительно больше, чем продолжительность, которую можно наблюдалась для Ь-допа/апоморфина. И]компонента может не наблюдаться для И₂-агонистов, как, например, в случае прамипексола и ротиготина.

Модель сравнительного превосходства.

Апоморфин и Ь-допа способны восстанавливать недостаточные уровни подвижности в модели тяжелого допаминового истощения на мышах. Как апоморфин, так и Ь-допа стимулируют И!- и И₂допаминовые рецепторы. Прамипексол, агонист И₂-рецепторов, неэффективен в этой модели.

Эксперименты проводили следующим образом: использовали мышей, предварительно обработанных МРТР (2x15 мг/кг, подкожно) и имевших стабильные повреждения; в качестве нормализованного контроля служили обработанные носителем мыши. МРТР (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин)

- 16 023778 представляет собой нейротоксин, который вызывает непрерывные симптомы болезни Паркинсона путем уничтожения определенных нейронов в черном веществе мозга. Он применяется для исследования болезни на обезьянах и мышах. В день эксперимента мышей обрабатывали АМРТ (250 мг/кг подкожно), затем возвращали в их родные клетки на 1,5 ч, после чего мышей помещали в индивидуальные клетки в подвижной секции. АМРТ (α-метил-р-тирозин) представляет собой лекарство, которое временно уменьшает катехоламиновую активность мозга (в этом случае особенно допаминовые уровни). Через 3 ч после инъекции АМРТ предпринималась попытка восстановить дефициты подвижности действием соединения 10, активность регистрировалась в течение еще 1,5 ч. Данные, собранные в первые 30 мин после восстанавливающей обработки, являлись некорректными ввиду стресса у животных от контакта с руками и инъекции, что было доказано увеличенными уровнями у контрольных животных, обработанных носителем, таким образом, для анализа использовались данные, собранные в последний 1 ч записи данных. Различные допаминоэргические соединения тестировали на их способность восстанавливать недостаточные уровни подвижности, полученные в этой модели. Как Ь-допа/бенсеразид, так и апоморфин восстанавливали подвижность на мышах зависимым от дозы образом. Бенсеразид представляет собой ингибитор допа-декарбоксилазы, который неспособен проникать через гематоэнцефалический барьер, он применяется для блокировки превращения Ь-допа в допамин вне пределов мозга. В противоположность этому Ό₂агонисты, прамипексол и бромкриптин не восстанавливали подвижности на мышах.

Эту модель использовали для исследования того, обнаруживает или нет соединение 10 то же превосходство, как и Ь-допа и апоморфин, по сравнению с О₂-агонистами. Проводили эксперимент дозаотклик; наблюдалась зависимая от дозы общая тенденция восстановления гипокинезических дефицитов, вызываемых серьезным истощением эндогенного допамина. Проводили конечный эксперимент, прямо сравнивая эффекты апоморфина, прамипексола и соединения 10 в этой модели. Было подтверждено, что соединение 10 способно восстанавливать подвижность на обработанных МРТР мышах и превосходит прамипексол.

Модель дискинезии на крысах.

Описанную в литературе модель дискинезии на крысах (ЬииДЫаД, е1 а1., Еиг. 1. №иго8С1., 2002, 15, 120) применяли для исследования эффектов активного метаболита по сравнению с Ь-допа/бенсеразидом в отношении уровней дискинезии, которые оценивались как аномальные непроизвольные движения (ΑΙΜδ) на паркинсоновских крысах.

Проведение исследования.

Во время исследования животные получали Ь-допа/бенсеразид (6 мг/кг и 15 мг/кг подкожно) или соединение 12 (группа В) один раз в день в моменты времени -20 мин и 0-180 мин. Уровни дискинезии животных измеряли. Дни 1-14: все животные получали дозу Ь-допа/бенсеразид (группа А) или соединения 12 (группа В).

На 1, 3, 5, 8 и 12 день на животных проводили замеры ΑΙΜ путем регистрации уровней дискинезии с применением шкалы аномальных непроизвольных движений (ΑΙΜδ), как описано ранее. Дни 15-26: группу А животных обрабатывали тестируемым лекарством (как группу В) вместо Ь-допа/бенсеразида. Дни 15, 16, 17, 19, 22, 24 и 26: замеры на животных согласно шкале ΑΙΜ.

Результаты.

После восьми дней лечения группа А животных имела уровни дискинезии порядка 70-80, которые оставались постоянными до 15-го дня. В противоположность этому группа В животных имела значительно более низкие уровни дискинезии (порядка 10-25). Для группы В степень дискинезии не изменялась в течение исследования. После того как группа А животных начинала получать вместо Ьдопа/бенсеразида соединение 12 в течение 10 дней, их уровень дискинезии постепенно уменьшался до уровня порядка 30-35. Таким образом, соединение 12 вызывает значительно меньшие уровни дискинезии, чем Ь-допа, и способно уменьшать уровни дискинезии, вызываемой Ь-допа.

Антипаркинсоновские эффекты на обработанных МРТР обыкновенных игрунках.

Эксперименты проводили с использованием шести обработанных МРТР мартышек (2,0 мг/кг, растворенных в стерильном 0,9% физиологическом растворе, ежедневно в течение до 5 последовательных дней). Всех животных предварительно обрабатывали Ь-допа (12,5 мг/кг р.о., вместе с карбидопа 12,5 мг/кг р.о.), вводимого ежедневно в течение до 30 дней для того, чтобы вызвать дискинезию. Перед исследованием все индивидуумы проявляли стабильные двигательные расстройства, включая заметное снижение базальной двигательной активности, слабую координацию движений, аномальную и/или напряженную позу, уменьшенную проворность и сравнивающие движения головой. Домперидон вводили за 60 мин перед любым из тестовых соединений. Двигательная активность оценивалась с применением тестовых клеток, которые включали в себя 8 фотоэлектрических переключателей, включающих в себя 8 инфракрасных лучей, которые помещали в клетку по плану и прерывание луча регистрировалось как одно движение. Общее число прерываний лучей на отрезке времени затем представляли в виде графика по ходу времени или отображали как область под кривой (АИС) для общей активности. Оценку двигательной нетрудоспособности проводили опытным наблюдателем, не информированным о лечении.

Ь-допа (12,5 мг/кг, р.о.) увеличивало двигательную активность и уменьшало двигательную нетрудоспособность, как ранее описано (διηίΐΐι. е1 а1. Μον. Όίδοτά. 2002, 17(5), 887). Доза, выбранная для этой

- 17 023778 сложной задачи, находилась на верхней части кривой доза-отклик для этого лекарства. Соединение 12 (вводимое р.о.), так же как соединение 10 (вводимое р.о.), приводило к зависимым от дозы увеличениям двигательной активности и сокращению двигательной нетрудоспособности, имея тенденцию создавать отклик больший, чем в случае Ь-допа (12,5 мг/кг, р.о.). Оба тестовых соединения приводили к продолжительному уменьшению двигательной нетрудоспособности по сравнению с Ь-допа и были такими же эффективными, как Ь-допа.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение (6аЕ,10аЕ)-7-н-пропил-6,6а,7,8,9,10,10а,11-октагидро-1,3-диокса-7-азациклопента[а]антрацена или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства для лечения болезни Паркинсона при поддержании низкого уровня развития дискинезии.
2. 2. Применение по п.1, где дискинезия обусловлена двигательным расстройством, связанным с базальным ядром.
3. 3. Применение по п.1, где дискинезия обусловлена идиопатической болезнью Паркинсона или постэнцефалитическим паркисонизмом.
4. 4. Применение по п.3, где дискинезия обусловлена активной фазой дистонии при болезни Паркинсона.
5. 5. Применение по п.4, где дискинезия возникает как побочный эффект терапевтического препарата при лечении болезни Паркинсона.
6. 6. Применение по п.5, где дискинезия обусловлена допаминозамещающей терапией.
7. 7. Применение по п.6, где препарат для допаминозамещающей терапии выбран из группы, состоящей из ротиготина, ропинирола, прамипексола, каберголина, бромкриптина, лисурида, перголида, Е-допа и апоморфина.
8. 8. Применение по п.7, где дискинезия развивается как результат повторного введения Е-допа.