EA023630B1

EA023630B1 - Биомаркер для детекции высокогорной адаптации и высокогорного отека легких

Info

Publication number: EA023630B1
Application number: EA201291228A
Authority: EA
Inventors: Бхавана Прашер; Шилпи Аггарвал; Мохаммед Абдул Кадар Паша; Митали Мукерджи
Original assignee: Каунсел Оф Сайентифик & Индастриал Рисёч
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2011-10-13
Publication date: 2016-06-30
Also published as: AU2011340228A1; EA201291228A1; AU2011340228B2; US20140030709A1; WO2012076943A1; AU2017202485A1; AU2011340228A9

Abstract

Настоящее изобретение относится к биомаркерам для детекции восприимчивости к высокогорной адаптации и гипоксии и способу их получения. Изобретение, в частности, относится к генным вариантам SNP ID rs479200 и rs480902 в первом интроне гена EGLN1 (пролилгидроксилазы 2) в качестве биомаркеров адаптации к большой высоте и предрасположенности к высокогорному отеку легких и восприимчивости к гипоксии, использование которых предусматривает новый комплексный подход с применением концепций фенотипирования согласно Аюрведе вместе с популяционной генетикой и геномикой заболеваний. Более конкретно, С-аллель SNP ID rs480902 и Т-аллель rs479200 гена EGLN1 чаще встречаются у пациентов с НАРЕ (высокогорным отеком легких) и практически отсутствуют у уроженцев горной местности. Согласно настоящему изобретению также предложены праймеры и способы, подходящие для детекции этих аллельных вариантов, с целью предсказания индивидуальной адаптируемости к большой высоте и гипоксии и/или с целью проведения генетического анализа гена EGLN1 в популяции.

Description

Настоящее изобретение относится к биомаркеру, полезному для предсказания предрасположенности индивида к высокогорной адаптации и высокогорному отеку легких (НАРЕ), характеризующемуся наличием однонуклеотидного полиморфизма С/Т в положении 27 в §ЕЦ ГО N0: 1 и Т/С в положении 27 в §ЕЦ ГО N0: 2 гена Ε0ΕΝ1. Изобретение также относится к способу детекции высокогорной адаптации и высокогорного отека легких с использованием маркеров, имеющих отношение к Ε0ΕΝ-1. Изобретение относится к биомаркерам, ассоциируемым с низким и высоким риском болезненного состояния, связанного с большой высотой, использование которых предусматривает новый комплексный подход с применением концепций фенотипирования согласно Аюрведе вместе с популяционной генетикой и геномикой заболеваний. Более конкретно, настоящее изобретение относится к аллельным вариантам гена пролилгидроксилазы 2 (ΡΗΌ2) человека и разработке праймеров, подходящих для детекции этих аллельных вариантов с целью предсказания индивидуальной адаптируемости к большой высоте и гипоксии и/или с целью проведения генетического анализа гена Ε0ΕΝ1 в популяции.

Предшествующий уровень техники

При выявлении биомаркеров, связанных с восприимчивостью к заболеваниям и реакцией на внешнюю среду, сталкиваются со многими проблемами, обусловленными большой межиндивидуальной вариабельностью внутри популяций (Ега/сг и др., 2009; МсС1е11ап и Κίη§, 2010). Для описания популяций недостаточно использования характеристик этнической принадлежности ввиду существования большого разнообразия эндофенотипов в пределах популяций, которые имеют разную предрасположенность к различным заболеваниям и условиям окружающей среды. В сопоставимых по возрасту, полу и этнической принадлежности исследованиях методом случай-контроль наблюдается четкая зависимость от значительных различий в восприимчивости к заболеванию и/или адаптируемости между пациентами и контролями, если контроли не имеют очевидного клинического заболевания и в основном представляют собой гетерогенные эндофенотипы. Получается, что идентификация эндофенотипов среди нормальных контролен, соответствующих различной восприимчивости к заболеванию/адаптируемости, вероятно приведет к более эффективному обнаружению биомаркера. Аюрведа, древняя система индийской медицины, зафиксированная документально и практикуемая с 1500 г. до н.э., рассматривает межиндивидуальную вариабельность в рамках персонализированной и прогностической медицины. Эта система медицины фенотипически классифицирует индивидов на семь основных типов конституции, называемых пракрити, среди которых вата (V), питта (Р) и капха (Κ) являются самыми чистыми типами конституции, которые демонстрируют легко узнаваемые фенотипы (§йатта Ρ.ν. 2000; Ртавйет и др., 2008). Интеграция этого эндофенотипического подхода с генетическими исследованиями может перекинуть мост от фенотипа к генетическими вариациям.

Поскольку наличие таких генетических вариаций также могло бы определять течение заболевания и приводить к развитию отдельных болезненных состояний, детекция их присутствия могла бы помочь в разработке персонализированного плана их лечения. Это также позволило бы осуществить разработку и распространение профилактического режима лечения, включающего в себя диету и образ жизни, чтобы избежать или отсрочить развитие таких болезненных состояний.

В 2008 г. Ртазйег и др. продемонстрировали имеющееся различие в экспрессии всего генома и биохимических профилях для образцов аюрведических эндофенотипов среди этих чистых типов конституций. Среди по-разному экспрессирующегося набора генов было обнаружено значительное представительство генов хаба (активаторного хроматинового блока; англ. йиЬ-узловая станция) и генов домашнего хозяйства, что могло приводить к общесистемным эффектам. В более раннем исследовании (Ртазйет и др., 2008) было установлено, что ген ΕΟΕΝ1 присутствует среди 251 различным образом экспрессирующегося гена для трех чистых эндофенотипов (вата (V), питта (Р), капха (Κ)) среди нормальных индивидов индоевропейского (ΙΕ) происхождения.

ЕОЬМ (пролилгидроксилаза 2) представляет собой кислород-сенсорный ген (охудеп зепзот деп), который играет ключевую роль в гомеостазе кислорода путем регуляции ΗΙΡ-1Α (гипоксияиндуцибельного фактора) (Ропд и Такеба, 2008) и ввиду этого имеет большое значение в целом ряде клеточных, физиологических и системных процессов.

В нормоксических условиях ΕΟΕΝ1 гидроксилирует конститутивно экспрессирующийся ΗΙΡ по двум его остаткам пролина, что приводит к его полиубиквитинированию под действием Е-3 лигазного комплекса фон Хиппеля-Линдау (АПЬ) и деградации под действием протеасомного комплекса (5>етеп/а. 2009). В условиях гипоксии ΕΟΕΝ1 неактивна, что приводит к стабилизации ΗΙΡ, который индуцирует экспрессию генов, опосредующих адаптивные ответы на клеточном (посредством гликолитических ферментов, гемоксигеназы), местном (через сосудистый эндотелиальный фактор роста) и системном (через эритропоэтин) уровне (διηίΐΐι и др., 2008). Вариации в ΕΟΕΝ1 могли бы способствовать различиям в физиологическом ответе на гипоксию, влияя тем самым на функциональные характеристики в условиях большой высоты.

В настоящем изобретении рассматриваются вариации ΕΟΕΝ1, благодаря которым различают типы конституции у субъектов, у которых развивается НАРЕ, состояние, в норме присутствующее у не акклиматизировавшихся, временно находящихся на высотах свыше 2500 м людей, и которое является причи- 1 023630 ной большинства случаев смерти от высотной болезни (Кобтау и др., 2003).

Данное заболевание характеризуется гипоксией, индуцирующей легочную вазоконстрикцию, вызванную эндотелиальной дисфункцией и задержкой интраваскулярной жидкости. Несмотря на то, что риску подвержены некоторые семейства и индивиды, те из них, предки которых длительное время проживали на большой высоте, подвержены меньшему риску. Кроме этого, индивиды, у которых был НАРЕ, подвержены большему риску повторных событий. Такие данные подтверждают наличие сильного генетического компонента восприимчивости к НАРЕ. Вполне вероятно, что длительное воздействие пребывания на большой высоте обеспечивает естественное положительное адаптивное давление на аллели, предупреждающее данную болезнь (Айкай и др., 2004). Незамедлительный спуск с высоты пациентов с НАРЕ не только предупреждает обострение НАРЕ, но также улучшает патогенез данного заболевания (Наскей и др., 2001).

Генетическая предрасположенность. Несмотря на то, что вариации в генах путей, связанных с гипоксией (как например, ΗΙΡ-1), функцией эндотелия (ЕТ1 (эндотелин-1)) и ремоделированием сосудов (АСЕ (ангиотензин-превращающий фермент), еЫОБ (эндотелиальная синтаза оксида азота)) были изучены (Могйтег и др., 2004; Рабат Ракйа и др., 2001; Могге11 и др., 1999; 8тйй и др., 2008; Ыи и др., 2007; Айкап и др., 2004), ни в одном из исследований до сих пор не сообщалось об участии ΕΟΕΝ1 в НАРЕ. Эти исследования проводились как исследования связи методом случай-контроль.

В недавнем полногеномном исследовании населения, проведенном среди жителей Тибета, сообщалось о том, что гаплотипы генов ΕΟΕΝ1 и РРАКА (рецептор, активируемый пролифератором пероксисом, тип а) ассоциированы с НАА (Тайип и др., 2010). Однако там, в отличие от настоящего изобретения, не конкретизировано расположение δΝΡ/область ДНК, авторами не проведено изучение ни НАРЕ, ни частоты этих гаплотипов в популяциях, проживающих на большой высоте в мировых масштабах. Ни в одном из исследований генетической предрасположенности в популяциях не рассматривались эндофенотипы, которые могли бы быть по-разному предрасположены к высокогорной адаптации (НАА).

Определения

8ΝΡ - однонуклеотидные полиморфизмы (8ΝΡ) представляют собой наиболее общий тип генетической вариации. 8ΝΡ представляет собой мутацию одной пары оснований в конкретном локусе, обычно состоящем из двух аллелей.

Прогностический маркер - генетическая вариация (например, 8ΝΡ). ассоциированная с риском или предотвращением конкретного заболевания либо ответом на терапию.

Пракрита или тип конституции - пракрити или конституция тела индивида представляет собой проявление относительного соотношения трех энергий (трех дош) вата (V), питта (Р) и капха (К). Три доши работают совместно и поддерживают гомеостаз в течение всей жизни, начиная с оплодотворения. Каждой доше приписаны отдельные качества и функции.

Вата - вата представляет собой одну из трех энергий, составляющих тридоши (ТгЮокНак). Она способствует проявлению формы, делению клеток, передаче сигналов, движению, выведению отходов, познанию, а также регулирует активности капха и питта.

Капха - капха представляет собой одну из трех энергий, составляющих тридоши. Она отвечает за рост и поддержание структуры, сохранение и стабильность.

Питта - питта представляет собой одну из трех энергий, составляющих тридоши. Она в первую очередь отвечает за метаболизм, терморегуляцию, гомеостаз энергии, пигментацию, зрение и общий контроль (йок! кигуеШапсе).

Эндофенотипы - индивиды в пределах популяции, которые могут быть классифицированы на основании сходства физических, физиологических, поведенческих характеристик и т.д.

Гипоксия - гипоксия представляет собой патологическое состояние, при котором организм в целом (генерализованная гипоксия) или участок тела (тканевая гипоксия) недостаточно снабжается кислородом.

ΗΟΌΡ - проект Разнообразие генома человека.

СЕРН - Центр по изучению полиморфизма человека.

ΙΟνΟ - Индийский консорциум по геномным вариациям.

ΙΕ-пул - пул индоевропейских больших популяций.

Задача изобретения

Основной задачей настоящего изобретения является разработка биомаркера, полезного для предсказания предрасположенности индивида к высокогорной адаптации и высокогорному отеку легких (НАРЕ), характеризующемуся наличием однонуклеотидного полиморфизма С/Т в положении 27 в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 (гк479200) и Т/С в положении 27 в 8ΕΤ) ГО ΝΟ: 2 (гк480902) гена ЕОЬШ.

Сущность изобретения

Согласно настоящему изобретению предложены биомаркеры для детекции восприимчивости к высокогорной адаптации и гипоксии и способ их получения.

В одном из воплощений настоящего изобретения предложены биомаркеры, представляющие собой варианты гена ΕΟΕΝ1 с однонуклеотидным полиморфизмом С/Т в положении 27 в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1 (гк479200) и Т/С в положении 27 в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 2 (гк480902) гена ΕΟΕΝ1, полезные для предсказания

- 2 023630 предрасположенности индивида к высокогорной адаптации и высокогорному отеку легких (НАРЕ).

В другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости Т-аллеля 8ΝΡ ГО т§479200 у пациентов с НАРЕ составляет 0,64, а у индивидов с пракрити капха составляет 0,71.

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости Т-аллеля Т8479200 у уроженцев горной местности составляет 0,21, а у индивидов с пракрити питта составляет 0,36.

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости Т-аллеля Т8479200 у пациентов с НАРЕ составляет 0,64, а у уроженцев горной местности составляет 0,21 (значение р составляет 4,36 х 10^-17).

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости Т-аллеля Т8479200 у пациентов с НАРЕ составляет 0,64, а у индивидов с пракрити питта составляет 0,36 (значение р составляет 0,000272).

В следующем воплощении настоящего изобретения частота встречаемости Т-аллеля т§479200 у индивидов с пракрити капха составляет 0,71, а у индивидов с пракрити питта составляет 0,36 (значение р составляет 2,17 х 10^-4).

В другом воплощении настоящего изобретения ТТ-генотип 8ΝΡ ГО т§479200 гена ΕΟΕΝ1 чаще встречается у пракрити капха и ассоциирован с высоким риском НАРЕ.

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения ТТ-генотип т§479200 был представлен преобладающим образом в типах пракрити капха, и также была обнаружена корреляция с высокой экспрессией гена ΕΟΕΝ1.

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения ТС и СС-генотип т§479200 был недостаточно представлен в типах пракрити капха, и также была обнаружена корреляция с низкой экспрессией гена ΕΟΕΝ1.

В другом воплощении настоящего изобретения экспрессия гена ΕΟΕΝ1, ассоциированного с ТС и СС-генотипом т§479200, значительно отличалась от таковой для ТТ-генотипа (значение р составляет 0,017).

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости С-аллеля Т8480902 у пациентов с НАРЕ составляет 0,63, а у индивидов с капха составляет 0,69.

В следующем другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости С-аллеля 8ΝΡ ГО Т8480902 у уроженцев горной местности составляет 0,28, а у индивидов с питта составляет 0,36.

В другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости С-аллеля т§480902 у пациентов с НАРЕ составляет 0,63, а у индивидов с питта составляет 0,36 (значение р составляет 0,000447).

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости С-аллеля Т8480902 у пациентов с НАРЕ составляет 0,63, а у уроженцев горной местности составляет 0,28 (значение р составляет 7,69 х 10^-12).

В другом воплощении настоящего изобретения частота встречаемости С-аллеля т§480902 у индивидов с капха составляет 0,69, а у индивидов с питта составляет 0,36 (значение р составляет 4,55 х 10^-4).

В другом воплощении настоящего изобретения СС-генотип 8ΝΡ ГО т§480902 гена ΕΟΕΝ1 чаще встречается в типах пракрити капха и ассоциирован с высоким риском НАРЕ.

В следующем воплощении настоящего изобретения Т-аллель 8ΝΡ ГО т§480902 и С-аллель Т8479200 гена ΕΟΕΝ1 ассоциированы с низким риском НАРЕ и непосредственно зафиксированы у уроженцев горной местности.

В следующем воплощении настоящего изобретения С-аллель 8ΝΡ ГО т§480902 и Т-аллель Т8479200 гена ΕΟΕΝ1 чаще встречаются при НАРЕ и практически отсутствуют у уроженцев горной местности.

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения предложен праймер, полезный для амплификации биомаркеров, имеющий последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

- 3 023630

ЗЕО Ю N0: 5, представленной как 5'-ТАТТСТОТСТТСООСАСАОО-3', что является последовательностью прямого праймера;

ЗЕО Ю N0: 6, представленной как 5'-АОСААОСАААОАААООСОАО3', что является последовательностью обратного праймера;

ЗЕО Ю N0: 7, представленной как 5'АООАСТТТТАТТАТТОСТТОТТА-З', что является последовательностью ЗМаРзМоЕпраймера;

ЗЕО Ю N0; 8, представленной как 5'-АТТОСТТОООАООТТОТТОО-3', что является последовательностью прямого праймера;

ЗЕО Ю N0: 9, представленной как 5'-ТТТСАСТООАОТТОТОООАО-3', что является последовательностью обратного праймера;

ЗЕО Ю N0:10, представленной как 5'-ОАТСТСССАОТОАСТСА-3*, что является последовательностью ЗМаРзИоТпраймера.

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения предложен способ получения биомаркеров, включающий:

a) выделение геномной ДНК из субъекта, являющегося человеком;

b) конструирование и синтез прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров, имеющих 0:0 ГО N0: 8 и 9, для плюс-цепи интрона 1 гена Ε0ΕΝ1;

c) амплификацию плюс-цепи интрона 1 гена Ε0ΕΝ1, имеющей 0:0 ГО N0: 3, с использованием праймеров, синтезированных на стадии (Ь), для получения биомаркера с последовательностью ГО N0: 2, имеющей 8ΝΡ ГО гз480902;

б) конструирование и синтез прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров, имеющих 8ΕΟ ГО N0: 5 и 6, для минус-цепи интрона 1 гена Ε0ΕΝ1;

е) амплификацию минус-цепи интрона 1 гена 1:(041, имеющей 0:0 ГО N0: 4, с использованием праймеров, синтезированных на стадии (б), для получения биомаркера с последовательностью ГО N0: 1, имеющей 8\Р ГО гз479200;

ί) определение 8\Р у пациентов с НАРЕ и у уроженцев горной местности с использованием 8\аРδΕοί-праймеров с 0:0 ГО N0:7 и 10 для 8\Р ГО гз479200 и 8\Р ГО гз480902, соответственно.

В еще одном другом воплощении настоящего изобретения предложен способ детекции высокогорной адаптации и предрасположенности индивида к высокогорному отеку легких, включающий стадии:

a) выделения геномной ДНК из субъекта, являющегося человеком;

b) конструирования и синтеза прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров, имеющих 0:0 ГО N0: 8 и 9, для плюс-цепи интрона 1 гена Ε(Ο4Ί;

c) амплификации плюс-цепи интрона 1 гена ΕΟΕΜ, имеющей 0:0 ГО N0: 3, с использованием праймеров, синтезированных на стадии (Ь), для получения биомаркера с последовательностью ГО N0: 2, имеющей ГО гз480902;

б) конструирования и синтеза прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров, имеющих 0:0 ГО N0: 5 и 6, для минус-цепи интрона 1 гена Ε(Ο4Ί;

е) амплификации минус-цепи интрона 1 гена ΕΟΕΜ, имеющей 0:0 ГО N0: 4, с использованием праймеров, синтезированных на стадии (б), для получения биомаркера с последовательностью ГО N0: 1, имеющей ГО гз479200;

ί) определения 54Р у пациентов с НАРЕ и у уроженцев горной местности с использованием 8№РзйоЕпраймеров с 0:0 ГО N0:7 и 10 для ГО гз479200 и ГО гз480902 соответственно;

д) подсчета частот встречаемости ТТ-, ТС- и СС-генотипов в популяциях со стадии (ί) для установления взаимосвязи данных генотипов с высокогорной адаптацией и высокогорным отеком легких;

И) прогнозирования и статистического анализа различий в распределении аллельных вариантов (Т, С) в популяции, где ТТ-генотип гз479200 и СС-генотип гз480902 в гене 1:(044 связаны с высоким риском высокогорного отека легких, а СС-генотип гз479200 и ТТ-генотип гз480902 в гене 1:(041 связаны с низким риском высокогорного отека легких. В другом воплощении настоящего изобретения предложен набор для детекции высокогорной адаптации и предрасположенности индивида к высокогорному отеку легких, содержащий:

) праймеры, имеющие 0:0 ГО N0: 5, 6, 7, 8, 9, 10;

2) подходящие реагенты;

3) техническую документацию.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение биомаркеров для предсказания предрасположенности индивида к высокогорной адаптации и высокогорному отеку легких (НАРЕ), характеризующейся наличием однонуклеотидного полиморфизма Т/С в положении 21782 в 0:0 ГО N0:3 (гз480902) и С/Т в положении 12964 в 04 ГО N0: 4 (гз479200) гена БСЕМ.

В другом аспекте настоящего изобретения с помощью биомаркеров детектируют восприимчивость

- 4 023630 к высокогорной адаптации и гипоксии, и способ их применения включает:

1) эндофенотипирование нормальных здоровых людей для анализа типов пракрити и отбор участников исследования для геномного анализа;

2) выделение геномной ДНК и РНК с последующим генотипированием известными методами;

3) детекцию однонуклеотидных полиморфизмов в гене ΕΟΕΝ1 с использованием набора ПЦРпраймеров для 8ΝΡ ГО гв479200, имеющих 8ΕΟ ГО N0: 5 и 6;

4) детекцию однонуклеотидных полиморфизмов в гене ΕΟΕΝ1 с использованием набора ПЦРпраймеров для 8ΝΡ ГО гв480902, имеющих 8Ε0 ГО N0: 8 и 9;

5) определение 8ΝΡ у пациентов с НАРЕ и уроженцев горной местности с использованием 8ΝαΡвйоЕпраймеров с 8Ε0 ГО N0: 7 и 10 для 8ΝΡ ГО гв479200 и 8ΝΡ ГО гв480902 соответственно;

6) повторное секвенирование состоящего из 11746 п.о. участка интрона 1 гена Ε0ΕΝ1, начиная от положения на хромосоме еЬг1 229598510 до 229610256 (АвветЫ1у-Маг.2006 (ΝΟΒΙ36/Ε§18)).

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 - связь между гв479200, имеющим отношение к высокогорной адаптации, и различными типами конституции, ΙΕ-пулом, уроженцами высокогорной местности и пациентами с НАРЕ:

(а) Частота встречаемости ТТ-генотипа гв479200 у различных типов конституции (К, Р, V), ΥΡΚ (ν+Ρ+Κ), ΙΕ, уроженцев высокогорной местности и пациентов с НАРЕ;

(Ы) Частота встречаемости Т-аллеля гв479200 у различных типов конституции (К, Р, V), νΡΚ, ΙΕ, уроженцев высокогорной местности и пациентов с НАРЕ. Числа над каждым из столбцов представляют собой значения р, полученные при сравнении каждой из групп с группой НАРЕ.

Фиг. 2 - связь между гв480902, имеющим отношение к высокогорной адаптации, и различными типами конституции, ΙΕ-пулом, уроженцами высокогорной местности и пациентами с НАРЕ:

(а) Частота встречаемости СС-генотипа гв480902 у различных типов конституции (К, Р, V), νΡΚ, ΙΕ, уроженцев высокогорной местности и пациентов с НАРЕ;

(Ы) Частота встречаемости С-аллеля гв480902 у различных типов конституции (К, Р, V), νΡΚ, ΙΕ, уроженцев высокогорной местности и пациентов с НАРЕ. Числа над каждым из столбцов представляют собой значения р, полученные при сравнении каждой из групп с группой НАРЕ.

Фиг. 3 - корреляция генотипов ΕΟΕΝ1, имеющих гв479200, с генной экспрессией.

Ящичковая диаграмма, представляющая величины АО генной экспрессии ΕΟΕΝ1 по данным ПЦР в режиме реального времени (КТ ΡΟΚ) в ТТ- и ТС и СС-генотипах гв479200 для аюрведических образцов.

Фиг. 4 - распределение частоты встречаемости Т-аллеля гв480902 в различных ΙΟνϋ- и ΗΟΌΡпопуляциях, проживающих на разной высоте:

(а) Частота встречаемости в 24-х IΟVС-популяциях и высота их проживания.

Ы) Карта пространственной частоты встречаемости гв480902 в IΟVС-популяциях. Градиент цвета, расположенный ниже карты, отображает диапазон наблюдаемых частот встречаемости Т-аллеля от минимума к максимуму.

(с) Распределение частоты встречаемости в ΗΟΌΡ-панели из 52 популяций вместе с высотами их проживания. Разнообразные континентальные популяции, проживающие на большой высоте, избирательно сохраняют передаваемый по наследству Т-аллель.

Фиг. 5 - распределение частоты встречаемости аллеля гв480902 в ΗΟΌΡ-популяциях.

(а) Корреляция частоты встречаемости Т-аллеля гв480902 с увеличением высоты (К² = 0,1056) в ΗΟΌΡ-популяциях.

(Ы) Карта пространственной частоты встречаемости гв480902 в ΗΟΌΡ-популяциях, взятая из браузера для просмотра данных ΗΟΌΡ-отбора (ΗΟΌΡ 5е1еейои Ыго^вег). Частоты встречаемости передаваемого по наследству Т-аллеля, предпочтительно присутствующего в популяциях, проживающих на большой высоте, и происходящего из него С-аллеля представлены темными и светлыми оттенками, соответственно.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к детекции предрасположенности к НАРЕ и высокогорной адаптации. В частности, оно относится к аллельным вариантам гена ΕΟΕΝ1 (8Ε0 ГО Ν0: 1 и 8Ε0 ГО Ν0: 2), который связан с гомеостазом кислорода посредством регуляции ΗΙΡ-1Α, гипоксия-индуцируемого фактора, и ввиду этого имеет важное значение в целом ряде клеточных, физиологических и системных процессов. Данные, изложенные в настоящем описании, демонстрируют, что ТТ-генотип гв479200 гена ΕΟΕΝ1 встречался чаще, и было обнаружено, что он ассоциирован с высоким риском НАРЕ (фиг. 1а). Этот ТТ-генотип гв479200 был представлен преобладающим образом в типах пракрити капха, и также была обнаружена корреляция с высокой экспрессией гена ΕΟΕΝ1 (фиг. 3). Наряду с этим частота встречаемости ТТ-генотипа была значительно ниже для пракрити питта, и было обнаружено, что он практически отсутствует у индивидов - уроженцев горной местности. Таким образом, индивиды с пракрити питта являются носителями протективных С-аллелей, ответственных за адаптацию к большой высоте, в то время как тип пракрити капха является носителем рисковых Т-аллелей, ответственных за плохую адаптацию к большой высоте, соответственно (фиг. 1Ы). Для другого 8ΝΡ гв480902 в гене ΕΟΕΝ1

- 5 023630 было обнаружено, что С-аллель ассоциирован с высоким риском НАРЕ, в то время как Т-аллель ассоциирован с низким риском (защитой от) НАРЕ (фиг. 2Ь). Было обнаружено, что протективный Таллель чаще встречается у индивидов с пракрити питта, а также у уроженцев горной местности, в то время как рисковый аллель чаще встречается в типах капха и у пациентов с НАРЕ. Важнейшим результатом данного изобретения является то, что разрозненные генетические линии, проживающие на большой высоте, совместно имеют один и тот же передаваемый по наследству протективный Т-аллель Г5480902 в мировом масштабе (фиг. 4 и 5).

Эндофенотипирование

Опросник (рег. № авторского права 8^-2284/2005, дата регистрации 13 мая 2005 г.) для проведения клинического фенотипирования был разработан на основе аюрведической литературы по фенотипам и методам оценки пракрити (анализ основных конституций), подробное описание которых приведено в опубликованной ранее статье. Фенотипическая классификация, в целом, учитывает параметры, связанные с анатомическими особенностями, подобные телосложению, скелету, размеру и симметрии частей тела, физиологии, физической выносливости и способностям.

Проводили скрининг 850 индивидов на предмет анализа конституции их тела (пракрити). Среди них были выявлены 96 индивидов с преобладающей в пракрити дошей, в том числе ватой (39), питтой (29) и капхой (28), и они были отобраны для сбора образцов.

Эти индивиды из возрастной группы 18-40 лет (средний возраст ~23 ± 4 года) имели индоевропейское происхождение и включали приблизительно одинаковое число представителей обоих полов (РгакЬег и др., 2008).

Генотипирование

Исследуемые субъекты

1) 96 образцов от индивидов, классифицированных на основе типов их конституции, и в том числе индивидов с типами вата (39), питта (29) и капха (28).

2) 552 образца от 24 различных популяций, проживающих в Индии, из существующей панели Индийского консорциума по геномным вариациям (ЮУС). Эти популяции охватывают различные этнические и языковые группы, проживающие в различных географических регионах, и представляют весь генетический спектр Индии. Они составляли часть от 55 популяций, которые были использованы в Фазе I Индийского проекта по геномным вариациям для установления генетического родства среди различных популяций в Индии (Индийский консорциум по геномным вариациям, 2005, 2008). Этим популяциям присваивается код на основании групп языковой принадлежности (индоевропейская, ΙΕ; дравидийская, ИР; тибето-бирманская, ТВ; южно-азиатская, АА), затем на основании географической зоны (северная, Ν; южная, 8; восточная, Е; западная, V; центральная, С; северо-восточная ΝΕ) и этнической принадлежности (каста ЬР; род ΙΡ; религиозная группа, 8Р). Описание каждой популяции можно найти в проведенном ранее исследовании. Популяция 0С-\У-1Р1 известного африканского происхождения была включена в качестве внешней группы.

3) 96 не состоящих в кровном родстве мужчин, пациентов с НАРЕ, индоевропейского происхождения были отобраны в 8ΝΜ (8опат ΝοΦιι Метопа1) госпитале (г. Лех (высота ~3500 м), штат Джамму и Кашмир, Индия). НАРЕ диагностировали на основании стандартных критериев, что включало оценку начала типичных симптомов вследствие пребывания на большой высоте, в том числе кашля и одышки в состоянии покоя, отсутствия инфекции, наличия легочных хрипов и цианоза, исчезновения симптомов и признаков в течение 3 суток с начала лечения путем предоставления дополнительного кислорода и соблюдения постельного режима (АЬкап и др., 2004). Рентгенографическое обследование грудной клетки показало присутствие инфильтрата, указывающего на отек легких, что подтвердило наличие данного заболевания. После выздоровления пациентов с НАРЕ обследовали, чтобы исключить наличие любых предшествующих заболеваний сердца и легких. Помимо этого при проведении исследований авторы изобретения использовали 96 образцов ДНК жителей Леха, не состоящих в кровном родстве.

Отбор генов и 8ΝΡ

Была отобрана подгруппа из 30 генов, которые по данным более раннего исследования демонстрировали различия в экспрессии. В среднем из 6Ь8МР (базы данных по 8ΝΡ) были отобраны от 6 до 8 целевых 8ΝΡ на один ген на основании расстояния между маркерами, гетерозиготности, частоты встречаемости и их валидационного статуса в различных популяциях. Целевые 8ΝΡ из СЕРН-популяции идентифицировали, используя алгоритм селекции Таддег (№№№.Ьгоаб.тй.еби/тр§/1аддег/) с попарным мечением при отсечении для г² (коэффициента корреляции), составляющем 0,8. Они в основном представляли собой подтвержденные 8ΝΡ с описанной гетерозиготностью.

Генотипирование 8ΝΡ и качественный контроль

Для генотипирования использовали по 250 нг геномной ДНК на один образец (5 мкл раствора образца ДНК в концентрации 50 нг/мкл), применяя платформу ВеабАггау и анализ Оо1бепОа1е от 111ит1па в соответствии с протоколом производителя. Обработку начальных данных по интенсивности гибридизации, кластеризацию и определение генотипа (депоЦре еаШпд) осуществляли, используя относящуюся к генотипированию независимую часть программ (§епо1урш§ тоби1е) в пакете программ Веаб81ибю (вер- 6 023630 сия 3). Определение генотипа выполняли, используя независимую часть СепСа11 пакета программ Веабδΐιιύίο. Кластеры генотипов, сформированные с использованием СепСа11 для каждого δΝΡ-содержащего локуса, редактировали вручную после визуального просмотра кластеризации на двумерном графике. 8ΝΡ, которые не соответствовали Н\УЕ (равновесию Харди-Вайнберга) на уровне значимости 1% (Р < 0,01) более чем в 90% популяций, удаляли из окончательного набора данных. По результатам последующего анализа были исключены 17 8ΝΡ, поскольку 5 из них не соответствовали Н\УЕ, а 12 не были полиморфными в генотипированных образах.

С использованием платформы ВеабАггау от 111ит1па (Ьйр://1цуЪго№5еглд1Ъ.ге5лп) в образцах УРК, а также в 1СУС-панели были генотипированы в общей сложности 158 8ΝΡ из 30 генов, которые по данным предыдущего исследования авторов изобретения демонстрировали различия в экспрессии, и 2060 8ΝΡ, которые были использованы для популяционной стратификации.

Генотипирование Г5480902 и Г5479200 в образцах пациентов с НАРЕ и уроженцев гор проводили, используя анализ удлинения праймера на одно основание (набор άάΝΤΡ (дидезоксинуклеозидтрифосфатов) для удлинения праймеров δΝηΡδΗοΙ™, АррНеб Вю5у51ет5) на генетическом анализаторе АВ1 Ρπ5ΐη 3100 после ПЦР-амплификации.

Данные о генотипах 8ΝΡ в гене ΕΟΕΝ1 из 52 популяций брали из НОЭР-данных по 8ΝΡгенотипированию (Стэнфорд), полученных на чипах 650Υ от 111ит1па. Данные о генотипах, а также круговую диаграмму, отображающую частоту встречаемости Г5480902 по всем различным популяциям, (фиг. 5Ъ) брали из браузера для просмотра данных ΗΟΌΡ-отбора ОШрЕ/Нцбр.исНюацо.еби/ссрЫп/оЪго\У5е/НСОР/).

Высоту места проживания каждой из популяций из ΗΟΌΡ-панели брали из проекта Соод1е Планета Земля (Соод1е Еаг1й), используя координаты широты и долготы из ΗΟ^Ρ-панели.

Количественный ПЦР-анализ

Для количественного определения различия в экспрессии ЕСЕШ среди разных типов пракрити проводили ТацМап-ПЦР, в которой используется специально разработанный анализ с применением ТЬИА (чипа низкой плотности ТацМап; англ. ТацМап Ьоте Эеп511у Аггау) (АррНеб Вю5у51ет5), на приборе АВ1 7900.

Статистический анализ

Популяционная стратификация и установление генетической гомогенности исследуемой популяции

Для анализа популяционной стратификации использовали данные изменчивости для 2060 8ΝΡ, не связанных с локусом ЕСЕ-ΝΕ которые были генотипированы в 24-х популяциях в Индии как часть проекта Индийского консорциума по геномным вариациям, а также в 96 аюрведических образцах.

Для детекции популяционной стратификации среди 1СУС- и исследуемой популяции использовали Е1СЕИ8ТКАТ ^псе и др., 2006).

Данные о генотипах для 2060 8ΝΡ из 24-х популяций в Индии брали из данных Индийского консорциума по геномным вариациям (Фаза II). Частоты встречаемости аллелей и генотипов рассчитывали методом подсчета генов (депе-соипйпд те1йоб).

Отклонения от Н\УЕ тестировали, используя точный критерий Фишера. Распределения частот встречаемости аллелей среди групп с разными конституциями сравнивали, используя точный критерий Фишера, выполненный в К.

Точный тест Фишера также выполняли для оценки взаимосвязи генотипа и аллелей с НАРЕ. Распределение аллеля сравнивали у пораженных болезнью и здоровых индивидов, используя точный критерий Фишера (РЕТ) и считая значение р <0,05 значимым.

Коррекцию для множественного тестирования проводили, используя метод РЭР (контроля ложных эффектов; англ. Га15е Ф5соуегу га!е).

Для изучения корреляции 'высоты' с различными 8ΝΡ в ЕСЕ-ΝΕ генотипированными в 1СУС- и НСОЕ-популяциях, использовали корреляцию рангов Кендалла.

Диагностические наборы

Согласно данному изобретению также предложен диагностический набор, содержащий последовательности, имеющие ГО ΝΟ:5, 6, 7, 8, 9, 10. Наборы по настоящему изобретению могут содержать одну или более пар аллель-специфичных олигонуклеотидов, гибридизующихся с различными полиморфными формами. В некоторых наборах предложены аллель-специфичные олигонуклеотиды, иммобилизованные на подложке. Например, одна и та же подложка может содержать аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды для детекции, по меньшей мере, выявленного полиморфизма в гене ЕСЬИТ Возможные дополнительные компоненты набора включают, например, рестрикционные ферменты, обратную транскриптазу или полимеразу, нуклеозидтрифосфаты в качестве субстратов, средства, используемые для введения метки (например, конъюгат авидин-фермент, и субстрат для фермента, и хромоген, если метка представляет собой биотин), и соответствующие буферы для обратной транскрипции, ПЦР или реакций гибридизации. Набор также может содержать инструкцию для осуществления способов по настоящему изобретению. В инструкции просто описываются воплощения изобретения, изложенные в данном описании.

- 7 023630

Нуклеиновокислотные векторы

Вариантные гены можно экспрессировать с использованием экспрессирующего вектора, в котором вариантный ген функционально связан со своим природным или другим промотором. Обычно промотор представляет собой эукариотический промотор для экспрессии в клетке млекопитающего. Регулирующие транскрипцию последовательности обычно включают в себя гетерологичный промотор и возможно энхансер, которые узнаются хозяином. Выбор соответствующего промотора, например промоторов !гр (триптофанового оперона), 1ас (лактозного оперона), фаговых промоторов, промоторов гликолитических ферментов и промоторов тРНК, зависит от выбранного хозяина. Кроме того, можно использовать имеющиеся в продаже экспрессирующие векторы. Подходящие клетки хозяина включают клетки бактерий, таких как Е. сой, дрожжей, мицелиальных грибов, клетки насекомых, клетки млекопитающих, обычно иммортализованные, например, мышиные клеточные линии, клеточные линии СНО (яичника китайского хомячка), человека и обезьяны и их производные. Предпочтительные клетки хозяина способны осуществлять процессинг продукта вариантного гена с получением соответствующего зрелого полипептида.

Следующие далее примеры приведены для иллюстрации настоящего изобретения и их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Эндофенотипирование

Проводили скрининг 850 индивидов на предмет анализа конституции их тела (пракрити). Среди них были выявлены 96 индивидов с преобладающей в пракрити дошей, в том числе ватой (39), питтой (29) и капхой (28), и они были отобраны для сбора образцов. Эти индивиды из возрастной группы 18-40 лет (средний возраст ~23 ± 4 года) имели индоевропейское происхождение и включали приблизительно одинаковое число представителей обоих полов (1).

Пример 2. Отбор субъектов и сбор образцов

Идентификацию индивидов с преобладающими типами пракрити проводили два врача Аюрведы. Чтобы избежать какого-либо искажения результатов наблюдений вследствие популяционной стратификации, исследование проводили на больших популяциях людей, говорящих на индоевропейских языках, преимущественно из Северной Индии. Предварительная оценка пракрити была проведена в общей сложности на 850 добровольцах, примерно поровну двумя практикующими врачами, с использованием субъективной оценки и скринингового опросника. Кроме того, независимо составляли укороченный список индивидов, отобранных для подробного фенотипирования. Эти два врача-клинициста производили обмен индивидами, внесенными в укороченный список, и подробно оценивали их в отношении пракрити, используя опросник. Сюда входили примерно 120 индивидов с преобладающим типом пракрити и 200 индивидов со смешанным типом пракрити.

Примерно 80% составило соответствие в оценке пракрити двумя врачами-клиницистами. После этого были выявлены и включены в исследование 96 здоровых, не состоящих в кровном родстве этнически равноценных индивидов с преобладанием или ваты (39 индивидов), или питты (29), или капхи (28), с равным представительством обоих полов (п = 48 в каждом случае) и принадлежностью к возрастной группе 18-40 лет (средний возраст ~23 ± 4 года).

Образцы периферической крови отобранных индивидов собирали с использованием стандартных методик, следуя этическим нормам Индийского совета по медицинским исследованиям (Индия), и с осознанного согласия добровольцев. Отбор образцов проводили с разрешения ведомственного комитета по биоэтике (1ВС). За три часа до отбора образцов всем добровольцам предоставляли одинаковое питание без какого-либо промежуточного приема пищи, напитков или курения. Следили за тем, чтобы субъект не оказался больным или не находился под воздействием какого-либо лекарственного средства. Кровяное давление, пульс и менструальный цикл, если он имелся, также регистрировали. До проведения исследования с использованием этих отобранных образцов образцы кодировали для сохранения их анонимности.

Пример 3. Выделение геномной ДНК

Г еномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови отобранных индивидов чистых типов пракрити, используя модифицированную методику высаливания (МШег и др., 1988).

1) Кислый цитратный буфер на основе декстрозы (АСИ) 0,48 г лимонной кислоты,

1,32 г цитрата натрия,

1,47 г глюкозы.

Растворить в воде в конечном объеме 100 мл. Стерилизовать в автоклаве и хранить при 4°С.

2) Буфер для лизиса РВС (эритроцитов) (10х)

- 8 023630

ΝΗ₄0Ι 8,20 г, №НСО₃ 0,84 г,

ΕϋΤΑ (этилендиаминтетрауксусная кислота) 0,37 г.

Растворить в 100 мл дистиллированной воды, стерилизовать в автоклаве и хранить при 4°С.

Рабочее разведение (1х).

На 500 мл буфера для лизиса КВС (1 х): 50 мл буфера для лизиса КВС (10х) + 450 мл стерилизованной в автоклаве воды.

3) Буфер для лизиса ядер (ΝΕβ) 10мМтрис-НС1, 400 мМ №С1, мМ Να₂-ΕΌΤΆ (рН 8,0) (стерилизовали в автоклаве и хранили при комнатной температуре). Для 400 мл:

М трис-НС1 (рН 8,0) - 4 мл,

М №С1 - 32 мл,

0,5 Μ ΕϋΤΑ (рН 8,0) - 1,6 мл.

Конечный объем подвести до 400 мл (стерилизовали в автоклаве и хранили при комнатной температуре).

4) Раствор протеиназы К (20 мг/мл) мг протеиназы К растворяли в 1 мл стерилизованной в автоклаве дистиллированной воды. Хранили при 4°С.

5) 10%-ный 8Ό8 (додецилсульфат натрия)

Для 100 мл: 10г 8Ό8 растворяли в стерилизованной в автоклаве дистиллированной воде.

Конечный объем подводили до 100 мл (хранили при комнатной температуре).

6) 6 М насыщенный раствор Х’аС1 Να(4 - 35,064 г.

Растворяли в дистиллированной воде и конечный объем подводили до 100 мл.

7) ТЕ-буфер (200 мл) 10 мМ трис (рН 8,0), мМ ΕΌΤΆ (рН 8,0).

Стерилизовали в автоклаве и хранили при 4°С.

Выделение ДНК из крови • Отобрать по 2-10 мл крови и перенести в соответственно помеченные пробирки.

• Удалить из крови плазму центрифугированием при 2000 об./мин в течение 10 мин.

• К оставшемуся объему крови добавить буфер для лизиса КВС (1 х), подводя объем до 50 мл.

• Перемешать суспензию, переворачивая пробирки несколько раз, пока она не станет полупрозрачной.

• Выдержать ее при комнатной температуре в течение приблизительно 20 мин со слабым встряхиванием, пока полностью не завершится действие буфера для лизиса.

После этого отцентрифугировать лизированную кровь при 2500 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре.

Слить супернатант в гипохлорит.

К осадку центрифугирования добавить 15 мл буфера для лизиса КВС и смешать путем недолгого перемешивания на вортексе.

Еще раз отцентрифугировать при 1000 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре.

Слить супернатант в гипохлорит.

К осадку центрифугирования добавить 12 мл буфера для лизиса ядер и перемешать на вортексе.

Добавить 0,8 мл 10%-ного 8Ό8 и 50 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл) и хорошо перемешать.

Инкубировать пробирки при температуре 65°С в течение 2 ч в водяной бане.

Добавить 4 мл насыщенного раствора Х'аС1 (6 М) и энергично встряхивать в течение 15 с.

Незамедлительно отцентрифугировать пробирку при 3500 об./мин в течение 30 мин при комнатной температуре.

Аккуратно отобрать супернатант, не затрагивая осадка центрифугирования, добавить 2 объема (то есть довести объем до 50 мл) абсолютного этанола (то есть 100%-ного) и оставить при комнатной температуре.

Осадить (рр!) ДНК, очень медленно переворачивая 10-20 раз (или оставить на ночь при -20°С).

Перенести осажденную ДНК, используя наконечник пипетки, в микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл 70%-ного этанола.

Пробирки недолго перемешать на вортексе и отцентрифугировать при 13000 об./мин в течение 10 мин.

Аккуратно извлечь супернатант, не затрагивая осадка центрифугирования.

Осадок центрифугирования высушить на воздухе в течение 1-2 ч и ресуспендировать в 0,5-1 мл ТЕбуфера (трис+ΕΌΤΆ), рН = 8,0.

Растворить ДНК, оставив ее при температуре 65°С на 2 ч, и хранить при температуре -20°С.

- 9 023630

Пример 4. Конструирование и синтез праймеров (ПЦР- и ЗЫаРзйоПпраймеров)

Пары ПЦР-праймеров, а также ЗЫаРзйоРпраймеры конструировали для выбранных 5ΝΡ, используя праймер 3 и программное обеспечение Аззау Пе81§пег от Зециепот. Запланированные праймеры были синтезированы в ТСОЛ (Центре прикладной геномики; англ. Тйе Сепйе Гог Сепот1с АррНсайопз).

	Праймеры	Последовательность
Г8479200
ЗЕО Ю ΝΟ: 5	Прямой праймер	5'-ТАТТСТОТСТТСООСАОАОО-3'
ЗЕО ΙϋΝΟ:6	Обратный праймер	5'-АОСААОСАААОАААООСОАО-3'
ЗЕО Ю ΝΟ: 7	3№Р51ю1-праймер	5’-АООАСТТТТАТТАТТОСТТОТТА-3'
Г5480902
ЗЕО Ю ΝΟ: 8	Прямой праймер	5'-АТТОСТТОООАООТТОТТОО-3’
ЗЕО Ю ΝΟ: 9	Обратный праймер	б'-ТТТСАСТООАОТТОТОООАО-З'
ЗЕО Ю ΝΟ; 10	ЗЫаРзМоЦпраймер	5'-ОАТСТСССАОТОАСТСА-3'

Пример 5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Реагенты:

1. 25 мМ МдС12 (100 мл)

Сначала приготовить 1 М МдС1₂ (50 мл).

№ = (50 х 203,31 х 1)/1000 = 10,1655 г.

Растворить 10,1655 г МдС1₂ в 50 мл МНЕ 9, затем стерилизовать автоклавированием.

Для 25 мМ МдС1₂ (100 мл):

мМ х 100 мл = 1 х 1000 мМ х X мл,

X мл = 2500/1000 = 2,5 мл. Затем смешать 2,5 мл 1 М МдС1₂ и 97,5 мл стерилизованной автоклавированием МНИ 9.

2. 10х буфер для ПЦР (100 мл) 100 мМ трис рН 9,0,

500 мМ КС1, 0,1% желатина.

(a) 1 М трис (рН = 9,0) (50 мл) № = (1 х 121,44 х 50)/1000 = 6,07 г.

Сначала 6,07 г триса растворяют в 40 мл стерилизованной автоклавированием воды, очищенной с использованием системы Ε1ΐχ.

Подвести рН до 9,0 и довести объем до 50 мл.

(b) 50 мл 1 М КС1 № = (1 х 50 х 74,55)/1000 = 3,72 г.

Растворить 3,72 г КС1 в 50 мл стерилизованной автоклавированием воды, очищенной с использованием системы Ε1ΐχ.

(c) 0,1% желатина

Для 100 мл 10х буфера для ПЦР:

М трис= 10 мл,

М КС1 = 50 мл, желатин = 100 мг (первоначально растворенный в воде).

Затем довести объем до 100 мл и стерилизовать автоклавированием.

3. 25 мМ каждого из άΝΤΡ (дезоксинуклеозид-трифосфатов) (50 мл) Концентрированный раствор каждого из άΝΤΡ = 100 мМ. Рабочая концентрация = 25 мМ.

Для 50 мл 25 мМ раствора каждого из άΝΤΡ: Ν1ν1 =Ν2ν2

100 мМ х V1(мкл) = 2 мМ х 50000 мкл ν1 =(2 х 50000)/100 ν1 = 1000 мкл или 1 мл. Так добавить 1 мл άΑΤΡ, 1 мл άΤΤΡ, 1 мл άΟΤΡ, 1 мл 6СТР и 46 мл воды МНЕ 9.

4. Τа^ ДНК-полимераза (Сепец Вап§а1оге; 3 ед/мкл)

5. Локус-специфные праймеры

Для стандартной ПЦР-реакции в объеме 10 мкл.

- 10 023630

Компоненты реакционной смеси	Исходная концентрация	Конечная концентрация	Объем
ПЦР-буфер	10χ	1х	1 мкл

МдС1₂	25 мМ	1 мМ	0,4 мкл
Прямой праймер	10 пМ	0,4 пМ	0,4 мкл
Обратный праймер	10 пМ	0,4 пМ	0,4 мкл
Геномная ДНК	10 нг/мкл	1 нг/мкл	1 мкл
άΝΤΡ	2 мМ	200 мкМ	1 мкл
Тад ДНК-полимераза Стерильная вода	3 ед/мкл	0,03 ед/мкл	0,1 мкл до 10 мкл

ПЦР-реакции проводили с начальной денатурацией при 94°С в течение 5 мин, затем следовали 30 циклов денатурации при 94°С по 30 с и стадия удлинения при 72°Св течение 45 с. Стадию отжига проводили в течение 30 с, а температура отжига составляла 56°С. Реакцию завершали, выполняя конечную стадию удлинения при 72°С в течение 10 мин.

Контроль в геле

1. 50х ТАЕ (рН 8.5) Для 1000 мл: трис: 242 г, ΕΏΤΆ: 37,2 г, ледяная уксусная кислота: 56 мл. Довести объем до 1000 мл.

2. Раствор бромистого этидия

1000х концентрированный раствор (0,5 мг/мл): 50 мг Е1Вг, 100 мл Н₂О. Защищать от света.

3. 10х Краситель для нанесения образцов 50% глицерина,

0,25% бромфенолового синего,

0,25% ксиленцианола.

Проверку ПЦР-продукта выполняли на 2%-ном агарозном геле, используя лэддер длиной 100 п.о. Если происходила амплификация конкретной зоны, то процесс продолжали.

Пример 6. Протокол очистки ПЦР-продукта с использованием ПЭГ (полиэтиленгликоля)

ПЭГ/раствор ацетата натрия:

ПЭГ 8000 13,3 г,

М МдС1₂ 333 мкл,

М ЫаОАс, рН 4,8 10 мл.

Довести до конечного объема 50 мл, используя Н₂О ΜίΙΙίΟ.

Два объема раствора ПЭГЖаОЛе добавляли к ПЦР-продукту, тщательно перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. ДНК осаждали центрифугированием при 3200 об./мин в течение 30-60 мин в зависимости от размера продукта амплификации. Супернатант удаляли, переворачивая ПЦР-планшет на бумажную салфетку и центрифугируя при 500 об/мин. Осадок центрифугирования дважды промывали двумя объемами 70%-ного этанола, используя центрифугирование при 3200 об./мин в течение 10 мин. Этанол полностью удаляли и осадок центрифугирования сушили на воздухе.

Пример 7. Генотипирование 3ΝΡ с использованием 3\аРзНо1-метода

Авторы изобретения проводили реакции удлинения праймера на одно основание (набор άάΝΤΡ для удлинения праймеров 8ЖР§Ьо™1, ЛррПес! ВюзуДету). Кратко, ЗХаРзПоЦреакцию проводили с использованием очищенного с помощью ПЭГ ПЦР-продукта, 1 мкл генотипирующего праймера (2 пг/мкл), 0,5 мкл готовой реакционной смеси ЗХаРзПоГ 0,8 мкл 5хбуфера для разведения (200 мМ трис, рН 9,0; 5 мМ МдС1₂) и воды МИНС), для доведения объема до 5 мкл. ПЦР проводили в следующих условиях: 94°С в течение 3 мин, затем 40 циклов при 96°С по 10 с, при 50°С по 5 с и при 60°С по 30 с. Неинкорпорированные άάΝΤΡ среди продуктов 8№Р§Ьо1-реакции переваривали посредством инкубации образцов с 0,25 единицами щелочной фосфатазы кишечника теленка (С1Р) при 37°С в течение 1 ч, затем посредством инкубации с С1Р при 72°С в течение 15 мин. По 2 мкл продуктов 3\аРзНо1-реакпии смешивали с 8 мкл Ηΐ-Ώΐ (высокоочищенного деионизованного) формамида и вносили в генетический анализатор 3100.

Пример 8. Количественный ПЦР-анализ

ΤΆ()ΜΛΝ-Ι IIЦР, в которой используется специально разработанный анализ с применением ΤΡΟΑ (ЛррНеб Вю8у81еш§), проводили на приборе ΑΒΙ 7900. Каждый эксперимент проводили в трех повторах. РНК из всех образцов подвергали обратной транскрипции с получением кДНК, используя набор архивов кДНК высокой емкости (ΝίρΠ Сараейу сО\Л ЛтеЫуе кН; .ЛррПес! Вю§у81еш8, Ро§1ег Сйу, СЛ), следуя рекомендованным производителем протоколам. кДНК амплифицировали, используя универсальную мастер-смесь 'ГарМаи для ПЦР (/ЛррПес! Вю8у§1еш8, Ро§1ег СПу, СЛ). Следили за тем, чтобы количество матрицы кДНК, добавленное в каждую реакционную смесь, находилось в определенных пределах с це- 11 023630 лью получения относительно узкого диапазона С1 (порогового цикла; англ. сус1е ШгезйоШ), определяемого в качественном контрольном измерении кДНК 188 рРНК.

Пример 9. Анализ ОоШепОа1е от 111итта

Платформа от 111итта подходит для генотипирования сотен δΝΡ в одной многоканальной системе с тысячами образцов (Рап и др., 2006). Этот анализ позволяет достигать высокой степени мультиплексирования локусов (1ос1 ти1йр1ехт§), при этом 1536 полиморфизмов можно изучать одновременно в 96 образцах или кратном 96 количестве образцов. Концентрацию ДНК в образцах оценивали, используя метод РюоОгееп, и образцы разбавляли до 50 нг/мкл. На один образец использовали аликвоту 5 мкл (250 нг) разбавленной ДНК.

После отбора δΝΡ все образцы δΝΡ направляли в Лззау Эе81§п Тоо1 (устройство для разработки анализа) от 111итта для выставления баллов в отношении разработки ОРА (весь пул олигонуклеотидов). δΝΡ-баллы были выставлены с помощью 111итта, и значения δΝΡ-баллов лежали в диапазоне от 0 до 1,1. δΝΡ-балл отражает возможность разработки успешного анализа.

δΝΡ-балл < 0,4.

δΝΡ-балл 0,4-0,6.

δΝΡ-балл 0,6-1,1

Низкая вероятность успеха, высокая степень риска для ОРА.

Умеренная вероятность успеха, умеренная степень риска для ОРА.

Высокая вероятность успеха, низкая степень риска для ОРА.

В настоящем исследовании δΝΡ-балл 0,4 был выбран в качестве нижнего предела. δΝΡ, не достигшие этого балла, заменяли на близлежащие δΝΡ и еще раз направляли в 111итта для выставления баллов. Окончательный список δΝΡ с баллом > 0,4 затем был направлен в 111итта для разработки ОРА и синтеза.

Краткое введение в данный метод представлено ниже. Для каждого δΝΡ синтезируют три олигонуклеотида (олига): два аллель-специфичных олига (ΑδΟ), которые узнают аллели δΝΡ, и один локусспецифичный олиг (Ь8О) сразу за этим δΝΡ. Кроме того, последовательности ΑδΟ и Ь8О содержат целевые последовательности для набора универсальных праймеров (Р1 и Р2 для двух ΑδΟ и РЗ для ΕδΟ), при этом каждый ΡδΟ также содержит конкретные адресные последовательности (Шитюойе), комплементарные последовательностям, присоединенным к гранулам. Все олиги, с помощью которых уточняют набор δΝΡ, синтезируются и объединяются в общий пул в 111итта. Для проведения анализа этот объединенный набор олигов (ОРА) гибридизуют одновременно с геномной ДНК, представленой в одном(й) образце/реакционной лунке. После осуществления реакций удлинения аллель-специфичного праймера и лигирования добавляют набор флуоресцентно меченных универсальных праймеров (Р1 и Р2, меченных Су3 и Су5, соответственно) и проводят ПЦР, генерируя множественные меченые продукты амплификации, представляющие сотни различных δΝΡ. Затем эти флуоресцентные продукты объединяют с гранулами на 8с'п1п\ Аггау Ма1йх (матрице чипа δеηί^^x) (δΑΜ). Адресные последовательности в продуктах ПЦР-амплификации гибридизуются с соответствующими им последовательностями на гранулах, и флуоресценцию от каждой гранулы измеряют количественно, получая сигнал, ассоциированный с конкретной адресной последовательностью. Каждая адресная последовательность указывает на конкретный локус, и присутствие Су3, Су5 или обоих сигналов на данном типе гранул указывает на генотипы АА, ВВ или АВ.

Перед проведением эксперимента в 96-луночный ПЦР-планшет вносили по 250 нг ДНК на один образец (5 мкл раствора в концентрации 50 нг/мкл). Чтобы убедиться в воспроизводимости анализа, 10% образцов готовили в двух повторах. Эти 96-луночные ПЦР-планшеты обрабатывали согласно рекомендациям. После гибридизации проводили сканирование δΑΜ, используя ридер для чипов с гранулами (Ъеайаггау геайег) Веайз1айоп 500. Интенсивности сигналов гибридизации с ридера для чипов с гранулами применяли для обработки данных, кластеризации и определения генотипа, используя относящуюся к генотипированию независимую часть программ в пакете программ Веаάδίиά^о (версия 3). Определение генотипа выполняли, используя независимую часть ОепСа11 пакета программ Веаάδίиά^о. Кластеры генотипов, сформированные для каждого локуса δΝΡ с использованием ОепСа11, редактировали вручную после визуального просмотра кластеров на двумерном графике. Все кластеры генотипов проверяли и корректировали вручную; был установлен порог для ОепТгат-балла >0,25, чтобы считать δΝΡ успешно генотипированным (Рап и др., 2006). Все повторы, использованные для проверки точности установления генотипа, показали уровень совпадения >99%. Большинство образцов хорошо зарекомендовали себя и показали высокий уровень идентификации (са11 га!е) среди всех δΝΡ, генотипированных в диапазоне 85100% (средний уровень идентификации 0,99 ± 0,02).

Пример 10. Статистический анализ

Частоты встречаемости аллелей и генотипов рассчитывали методом подсчета генов. I Ι\ΥΕ рассчитывали, используя точный критерий Фишера. Распределения частот встречаемости аллелей среди групп с

- 12 023630 разными пракрити сравнивали, используя программу Рйпк. Коррекцию для множественного тестирования проводили, используя метод ΕΌΚ. Точный тест Фишера также выполняли для оценки взаимосвязи генотипа и аллелей с НАРЕ. Распределение аллеля сравнивали у пораженных болезнью и здоровых индивидов, используя точный критерий Фишера (ЕЕТ) и считая значение р <0,05 значимым.

Из панели образцов из 64 генов авторы изобретения идентифицировали два контрольных гена (А8АН1 и ΜΑΝ1Α1), используя деИОКМ (Уапбезотре1е и др., 2002), общепринятый алгоритм (апплет УБА для Мюгозой Ехсе1), в качестве внутреннего контроля для измерения относительной экспрессии ΕΟΕΝ1 среди разных типов конституции. Кратко, в этом методе идентифицируют наиболее стабильные контрольные гены из панели генов-кандидатов. С использованием деNΟΚΜ рассчитывают меру стабильности генной экспрессии М для контрольного гена как среднюю попарную вариацию V для этого гена со всеми другими тестируемыми контрольными генами. Поэтапное исключение генов с наиболее высокими величинами М позволяет ранжировать контрольные гены-кандидаты в соответствии со стабильностью их экспрессии. Затем определяют нормирующий множитель генной экспрессии для каждого образца на основе среднего геометрического определенного пользователем числа генов домашнего хозяйства. На основании низких или высоких средних величин АС! делали заключение о стимулирующей регуляции или об угнетающей регуляции, соответственно. Сравнение различий в экспрессии ΕΟΕΝ1 относительно генотипов гз479200 проводили, используя односторонний критерий Стьюдента. Для изучения корреляции высоты с частотой встречаемости Т гз480902, а также с 8ΝΡ в ΕΟΕΝ1, генотипированными в обеих 1ОУС- и НОИР-популяциях, авторы изобретения использовали корреляцию рангов Кендалла.

Преимущества

Настоящее изобретение полезно для выявления индивидов, которые могут быть подвержены риску развития НАРЕ, когда они путешествуют или направляются в высокогорные места. Данная информация может быть полезна для молекулярной диагностики как на генетическом уровне, так и на уровне экспрессии, для предсказания адаптируемости индивида к большой высоте, сопротивляемости, восприимчивости к НАРЕ и другим заболеваниям, в которые вовлечена гипоксия, например к сердечнососудистым заболеваниям, прогрессированию рака, астме, нейродегенерации, ишемии, инсульту, болезням печени, заболеваниям кожи, артриту и т.д., а также восприимчивости к ингибиторам РНО2.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Биомаркер, пригодный для прогнозирования предрасположенности индивидуума к высокогорной адаптации и высокогорному отеку легких (НАРЕ), имеющий однонуклеотидный полиморфизм С/Т в положении 27 в 8Е() ΙΌ ΝΟ: 1 и Т/С в положении 27 в 8Е() ГО ΝΟ: 2 гена ΕΟΕΝ1.

2. Биомаркер по п.1, имеющий 81:0 ГО ΝΟ: 2, где частота встречаемости С-аллеля гз480902 у людей, у которых развивается высокогорный отек легких, существенно (значение р<0,05) выше таковой у людей, проживающих на большой высоте.

3. Биомаркер по п.1, имеющий 81:0 ГО ΝΟ: 1, где частота встречаемости С-аллеля гз479200 у людей, проживающих на большой высоте, существенно (значение р<0,05) выше таковой у людей, проживающих на незначительной высоте.

4. Биомаркер по п.1, имеющий 81:0 ГО ΝΟ: 2, где частота встречаемости СС-генотипа гз480902 у людей, у которых развивается высокогорный отек легких, существенно (значение р<0,05) выше таковой у людей, проживающих на большой высоте.

5. Биомаркер по п.1, имеющий 81:0 ГО ΝΟ: 1, где частота встречаемости Т-аллеля гз479200 у людей, у которых развивается высокогорный отек легких, существенно (значение р<0,05) выше таковой у людей, проживающих на большой высоте.

6. Биомаркер по п.1, имеющий 8ЕО ГО ΝΟ: 1, где частота встречаемости ТТ-генотипа гз479200 у людей, у которых развивается высокогорный отек легких, существенно (значение р<0,05) выше таковой у людей, проживающих на большой высоте.

7. Биомаркер по п.1, имеющий 81:0 ГО ΝΟ:2, где частота встречаемости Т-аллеля гз480902 у людей, проживающих на большой высоте, существенно (значение р<0,05) выше таковой у людей, проживающих на незначительной высоте.

8. Праймер, пригодный для амплификации биомаркера по пп.1-7, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ЗЕО Ю ΝΟ: 5, представленной как б'-ТАТТСТСТСТТССОСАСАСС-З', которая является последовательностью прямого праймера;

ЗЕО Ю ΝΟ: 6, представленной как б'-АССААССАААСАААССССАС3', которая является последовательностью обратного праймера;

- 13 023630

ЗЕО Ю ΝΟ: 7, представленной как 5'АССАСТТТТАТТАТТОСТТСТТА-3', которая является последовательностью ЗМаРзЬоЕпраймера;

5ЕО Ю ΝΟ: 8, представленной как б'-АТТССТТОССАСОТТОТТОО-З', которая является последовательностью прямого праймера;

ЗЕО Ю N0: 9, представленной как б'-ТТТСАСТОСАСТТСТСССАС-З', которая является последовательностью обратного праймера;

ЗЕО Ю N0: 10, представленной как б'-САТСТСССАСТОАСТСА-З', которая является последовательностью 8№РзЬо1-праймера.

9. Способ получения биомаркера по п.1, включающий:

a) выделение геномной ДНК из субъекта, являющегося человеком;

b) конструирование и синтез прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров, имеющих 8Е0 ГО N0: 8 и 9, для плюс-цепи интрона 1 гена ЕСЕ\1;

c) амплификацию плюс-цепи интрона 1 гена ΕΟΚΝ1, имеющей 8Е0 ГО N0: 3, с использованием праймеров, синтезированных на стадии (Ь), для получения биомаркера с последовательностью 8Е0 ГО N0: 2, имеющей 8ΝΡ ГО гз480902;

ά) конструирование и синтез прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров, имеющих 8Е0 ГО N0: 5 и 6, для минус-цепи интрона 1 гена Е0Ь-М1;

е) амплификацию минус-цепи интрона 1 гена ЕОЬ№, имеющей 8Е0 ГО N0: 4, с использованием праймеров, синтезированных на стадии (ά), для получения биомаркера с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1, имеющей 8NР ГО гз479200;

ί) определение 8NР у пациентов с НАРЕ и у уроженцев горной местности с использованием 8№РзЬоЕпраймеров с 8Е() ГО N0: 7 и 10 для 8NР ГО гз479200 и 8NР ГО гз480902 соответственно.

10. Способ детекции высокогорной адаптации и предрасположенности индивидуума к высокогорному отеку легких, включающий стадии:

a) выделения геномной ДНК из субъекта, являющегося человеком;

b) конструирования и синтеза прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров, имеющих 8Е0 ГО N0: 8 и 9, для плюс-цепи интрона 1 гена ЕСП.\1;

c) амплификации плюс-цепи интрона 1 гена Е0ЬМ1, имеющей 8Е0 ГО N0: 3, с использованием праймеров, синтезированных на стадии (Ь), для получения биомаркера с последовательностью 8Е0 ГО N0: 2, имеющей 8NР ГО гз480902;

ά) конструирования и синтеза прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров, имеющих 8Е0 ГО N0: 5 и 6, для минус-цепи интрона 1 гена Е0ЬМ1;

е) амплификации минус-цепи интрона 1 гена Е0ЕМ1, имеющей 8Е0 ГО N0: 4, с использованием праймеров, синтезированных на стадии (ά), для получения биомаркера с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1, имеющей 8NР ГО гз479200;

ί) определения 8NР у пациентов с НАРЕ и у уроженцев горной местности с использованием 8№РзЬоЕпраймеров с 8Е() ГО N0: 7 и 10 для 8NР ГО гз479200 и 8NР ГО гз480902 соответственно;

д) подсчета частот встречаемости ТТ-, ТС- и СС-генотипов в популяциях со стадии (ί) для установления взаимосвязи данных генотипов с высокогорной адаптацией и высокогорным отеком легких;

Ь) прогнозирования и статистического анализа различий в распределении аллельных вариантов (Т, С) в популяции, где ТТ-генотип гз479200 и СС-генотип гз480902 в гене ЕСП.\1 связаны с высоким риском высокогорного отека легких, а СС-генотип гз479200 и ТТ-генотип гз480902 в гене Е0Е\1 связаны с низким риском высокогорного отека легких.

11. Набор для детекции высокогорной адаптации и предрасположенности к высокогорному отеку легких у человека, содержащий:

1) праймеры, имеющие 8Е() ГО N0: 5, 6, 7, 8, 9, 10;
2) подходящие реагенты;
3) техническую документацию.

12. Применение биомаркеров для прогнозирования предрасположенности индивидуума к высокогорной адаптации и высокогорному отеку легких (НАРЕ), имеющих однонуклеотидный полиморфизм С/Т в положении 27 в 8Е() ГО N0: 1 и Т/С в положении 27 в 8Е() ГО N0: 2 гена ЕОЕ\Е