EA023383B1

EA023383B1 - Способ подавления роста опухоли и лечения заболеваний путем избирательного ингибирования участков рецепторов с тирозинкиназной активностью

Info

Publication number: EA023383B1
Application number: EA201200380A
Authority: EA
Inventors: Илья Валерьевич ТИМОФЕЕВ
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Русские Фармацевтические Технологии"
Priority date: 2012-01-23
Filing date: 2012-01-23
Publication date: 2016-05-31
Also published as: EA201200380A1

Abstract

Изобретение относится к медицине и включает способ подавления роста опухоли, основанный на избирательном ингибировании конкретных участков рецепторов с тирозинкиназной активностью, состоящих из аминокислот, находящихся на клетках опухоли или сосудов. Избирательное ингибирование участков рецепторов с тирозинкиназной активностью, описанных в настоящем изобретении, без ингибирования остальной части рецептора и/или других рецепторов в случае мультикиназных ингибиторов приводит к достоверному повышению противоопухолевой эффективности применяемых ингибиторов тирозинкиназ, снижению токсичности проводимого лечения, возможности использовать низкую концентрацию агента для полного блокирования, проводить длительное лечение. Преимущество изобретения заключается в разработке нового класса лекарственных препаратов для лечения злокачественных новообразований и других болезней.

Description

(57) Изобретение относится к медицине и включает способ подавления роста опухоли, основанный на избирательном ингибировании конкретных участков рецепторов с тирозинкиназной активностью, состоящих из аминокислот, находящихся на клетках опухоли или сосудов. Избирательное ингибирование участков рецепторов с тирозинкиназной активностью, описанных в настоящем изобретении, без ингибирования остальной части рецептора и/или других рецепторов в случае мультикиназных ингибиторов приводит к достоверному повышению противоопухолевой эффективности применяемых ингибиторов тирозинкиназ, снижению токсичности проводимого лечения, возможности использовать низкую концентрацию агента для полного блокирования, проводить длительное лечение. Преимущество изобретения заключается в разработке нового класса лекарственных препаратов для лечения злокачественных новообразований и других болезней.

Краткое описание изобретения

Полное описание изобретения

Известно, что в основе развития злокачественных новообразований лежит избыточная пролиферация клеток, а также образование кровеносных сосудов в опухоли, через которые происходит ее питание (ангиогенез) (ΐ. Ро1ктап с1. а1. ШШгс: 339, 58 (1989). Образование новых кровеносных сосудов происходит из уже существующего эндотелия и является важным компонентом многих заболеваний и нарушений, в том числе таких как рост и метастазирование опухолей, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетическая ретинопатия, ретролентальная фиброплазия, неоваскулярная глаукома, гемангиомы, иммунное отторжение трансплантированной роговицы и других тканей, а также хронические воспаления.

Пролиферация клеток опухоли, равно как и эндотелиальных клеток, может быть вызвана различными факторами, которые естественным образом встречаются в природе. Данные факторы связываются с рецепторами на поверхности опухолевых, эндотелиальных и других клеток, что приводит к активации рецепторов и проведению сигнала внутрь клетки с последующим делением.

По многочисленным данным рецепторы с тирозинкиназной активностью часто экспрессированы на клетках опухолей, что приводит к пролиферации клеток самой опухоли и эндотелиоцитов, способствует опухолевой прогрессии. Зачастую активирующие мутации рецепторов с тирозинкиназной активностью также изменяют течения болезни и чувствительность к проводимой терапии.

К данной группе рецепторов относятся рецепторы фактора роста эндотелия сосудов (УЕОРК), рецепторы эпидермального фактора роста (ЕОРК), рецепторы инсулиноподобного фактора роста (1ОРК), рецепторы фактора роста фибробластов (РОРК). Например, роль последних доказана в развитии ряда злокачественных новообразований, в частности почечно-клеточного рака, рака легкого (указывается как одна из причин резистентности к ЕОРК ингибиторам), рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака яичников, рака эндометрия, колоректального рака.

Рецепторы с тирозинкиназной активностью объединены общим признаком - внутриклеточная часть представлена тирозинкиназой. Фосфорилирование тирозинкиназы приводит к активации рецептора и распространению сигнала внутрь клетки. К другим частям рецепторов относятся надмембранная и внутримембранная (трансмембранная) части. Надмембранная и внутримембранная части различных типов рецепторов с тирозинкиназной активностью отличаются между собой: как по первичной аминокислотной последовательности, так и по вторичной, третичной структуре. В некоторых случаях отмечается гомология структуры рецепторов. Трансмембранная часть рецепторов с тирозинкиназной активностью содержит 1 трансмембранный домен. В настоящее время создано большое количество таргетных препаратов, блокирующих/ингибирующих активность различных типов рецепторов с тирозинкиназной активностью. К ним относятся ингибиторы тирозинкиназы, а также моноклональные антитела. Существующие препараты снижают активность внутриклеточной тирозинкиназы путем блокирования различных активных частей одного или, как правило, нескольких рецепторов. Неизбирательное блокирование сопряжено со снижением эффективности воздействия на опухолевые клетки, клетки сосудов, а также другие структуры, экспрессирующие соответствующий тип рецептора.

В настоящем изобретении описывается способ избирательного ингибирования определенных участков рецепторов с тирозинкиназной активностью без влияния на остальную часть рецептора и/или другие рецепторы в случае мультикиназных ингибиторов, что приводит к достоверному повышению противоопухолевой эффективности применяемых ингибиторов тирозинкиназ, возможности использовать низкую концентрацию агента для полного блокирования, а следовательно, снижению токсичности проводимого лечения, проводить длительное лечение. Описываемое в заявке избирательное воздействие на рецепторы с тирозинкиназной активностью отличается также тем, что направлено против определенных аминокислотных последовательностей, зачастую не являющихся активными центрами связывания рецептора со специфическим лигандом (фактором роста), что приводит к разрушению рецептора и потере его активности. Описываемое избирательное воздействие также подразумевает, что лиганд может связаться с рецептором, однако активации внутриклеточной части - тирозинкиназы - все равно не произойдет. Кроме того, описываемое в изобретении селективное ингибирование может проводиться в отношении некоторых аминокислот активных центров рецепторов с тирозинкиназной активностью. В настоящем изобретении показано, что угнетение роста, например, опухолевых клеток, может быть вызвано пу- 1 023383 тем ингибирования определенной аминокислотной последовательности и не зависит от наличия определенных рецепторов УЕОРК, РОРК и других. То есть все рецепторы могут быть представлены на клетках, не требуется ингибитор против каждого - угнетение роста может быть достигнута путем ингибирования нескольких аминокислотных последовательностей.

Основным объектом настоящего изобретения является способ избирательного ингибирования аминокислотной последовательности, которая может встречаться в структуре рецепторов с тирозинкиназной активностью, что приводит к вышеуказанным эффектам. Основная аминокислотная последовательность приводится на фиг. 1. Данная аминокислотная последовательность может отличаться на несколько аминокислот, и это не повлияет на эффективность создаваемых ингибиторов. Например, на фиг. 2 и 3 представлены возможные аминокислотные последовательности, в которых добавлены аминокислоты с одного из концов.

Создаваемые ингибиторы по основному объекту изобретения могут блокировать любые фрагменты аминокислотной последовательности, указанной на фиг. 1, что не приведет к изменению эффективности. Например, предметом блокирования могут быть участки аминокислотной последовательности, как указано на фиг. 4-10.

Отличительной особенностью настоящего изобретения является разрушение не только активных центров рецептора, но и других его компонентов. Так, воздействие на аминокислотную последовательность, указанную на фиг. 11, может привести к инактивации рецепторов и может быть использовано в лечении.

Терапевтическое использование способа

Для использования способа, описанного в настоящем изобретении, в терапевтической практике любые антагонисты указанных аминокислотных последовательностей по способу вводятся млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой форме, включая введение внутривенно, а также следующими путями: внутримышечным, интраперитонеальным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, внуртисиновиальным, внутриоболочечным, оральным, локальным или ингаляционным.

Антагонисты также могут вводиться внутриопухолевым, околоопухолевым, внутриочаговым и околоочаговым путями для обеспечения локального действия наряду с системным терапевтическим действием. Подобные формы введения включают фармацевтически приемлемые носители, которые по своей природе не обладают ни токсическим, ни терапевтическим действием. Примерами таких носителей являются ионообменные вещества, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, белки плазмы (такие, как белок плазмы человека), буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных овощных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидная окись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества с целлюлозной основой и полиэтиленгликоль. Носители для локальной или основанной на геле форм антагонистов включают полисахариды, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или метилцеллюлозы, поливинилпирролидон, полиакрилаты, полимеры полиоксиэтиленполиоксипропиленового блока, полиэтиленгликоль и спирты. Для введения во всех случаях используются обычные лекарственные формы, получаемые со складов. К таким формам относятся, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные препараты, аэрозоли, подъязычные таблетки и препараты с постоянным высвобождением вещества. Антагонист в таких препаратах будет обычно содержаться в концентрации примерно от 0,001 до 100 мг/мл.

Подходящие примеры препаратов с постоянным высвобождением вещества включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антагонист; подобные матрицы имеют определенную форму, например это могут быть пленки или микрокапсулы. К примерам матриц с постоянным высвобождением относятся полиэфиры, гидрогели [например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат)], описанные Лангером и др. (1. ВюшеД. Ма1ег. Кек. 15, 167 (1981) и Лангером (СЬет. ТесЬ. 12 (1982), или поли(винилалкоголь), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гаммаэтил-Ь-глутамата, описанные Сидман и др. (Вюро1утегк 22, 547 (1983), недеградируемый этиленвинилацетат (Лангер и др. см. выше), деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как Ьиргои Эеро1 (инъецируемые микросферы, состоящие из полимеров молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида), и поли-Э-(-)-3-гидроксибутировой кислоты. В то время, как такие полимеры, как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, способны к постоянному высвобождению молекул в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Когда инкапсулированные полипептидные антагонисты остаются в организме на долгое время, они могут денатурировать или агрегироваться в результате воздействия влаги при температуре 37°С, что ведет к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. С целью стабилизации могут быть разработаны разумные стратегии, в зависимости от действующего механизма. Например, если обнаружен механизм агрегации, выражающийся в формировании межмолекулярной δ-δ-связи посредством тиодисульфидного обмена, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации с целью удаления кислых растворов, контролирования влажности, использования соответствующих добавок и разработки специфических полимерных

- 2 023383 матричных составов.

Антагонистические составы с постоянным высвобождением антагониста включают также антагонистические антитела, заключенные в липосомах. Липосомы, содержащие антагонисты, могут быть получены известными в данной области методами, например, описанными Эпстейном и др. (Ргос. ΝηΙ. Асай. 8с1. 82, 3688 (1985); Хуанг и др. (Ргосс. Ыа1. Асай. 8с1. 77, 4030 (1980); патент США №4485045 и патент США №4544545. Липосомы, как правило, имеют небольшую величину (величиной около 200-800 А) и принадлежат к однослойному типу, в котором содержание липидов выше, чем 30 мол.% холестерина; выбранное соотношение может изменяться для подбора оптимальных условий терапии. Липосомы с продолжительным сроком циркуляции покрываются патентом США №5013556.

Еще одним путем использования данного изобретения является инкорпорирование антагониста внутрь изделий, имеющих определенную форму. Такие изделия могут быть использованы для модулирования роста клеток эндотелия и ангиогенеза. Кроме того, такие изделия могут быть использованы для модулирования инвазии опухолей и метастазов.

Возможна конъюгация антагониста по способу и другого лечебного средства. При профилактике или лечении заболевания необходимая доза антагониста будет зависеть от типа заболевания, от его степени серьезности и протекания, от того, вводятся ли антитела с профилактической или терапевтической целью, от предыдущей терапии, от истории болезни пациента и его реакции на антагонист и от указаний лечащего врача. Антагонист может вводиться пациенту различными способами, единовременно или в качестве серии назначений.

Антагонисты, избирательно воздействующие на аминокислотные последовательности по настоящему способу, могут быть использованы для лечения различных неопластических и ненеопластических заболеваний и нарушений. Опухоли и близкие состояния, которые поддаются такому лечению, включают рак молочной железы, немелкоклеточный и мелкоклеточный рак легкого, опухоли трахеи, рак желудка, рак пищевода, колоректальный рак, рак печени, рак яичников, рак шейки матки, рак тела матки, гиперплазию эндометрия, эндометриоз, фибросаркомы, хондросаркомы, опухоли головы и шеи, гепатобластому, саркому Капоши, меланому, рак кожи, гемангиому, кавернозную гемангиому, гемангиобластому, рак поджелудочной железы, рак надпочечников, ретинобластомы, астроцитому, глиобластому, шванному, олигодендроглиому, медуллобластому, нейробластому, рабдомиосаркому, остеогенную саркому, лейомиосаркому, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, рак полового члена, рак предстательной железы, опухоль Вилмса, аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами.

Возможно применение способа при неонкологических заболеваниях, которые поддаются лечению, включая такие как ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетические и другие ретинопатии, фиброплазии, неоваскулярную глаукому, тироидные гиперплазии (в том числе болезнь Граве), трансплантацию роговицы и других тканей, хронические воспаления, воспаление легких, нефротический синдром, асцит, преэклампсию, перикардиальный выпот (например, связанный с перикардитом) и плевральный выпот. В зависимости от типа заболевания и от степени его серьезности первоначальная доза для введения пациенту будет составлять от 1 мкг/кг до 30 мг/кг и может вводиться путем одного или многих отдельных назначений/введений или путем постоянного вливания. Обычная дневная доза может варьировать примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг и более в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного назначения в течение нескольких дней и более в зависимости от условий лечение повторяется, пока не будет достигнуто желаемое подавление симптомов болезни. Однако могут использоваться и другие режимы дозировки. Успех лечения легко определяется обычными методами и анализами, например методами рентгено-визуализации опухолей.

В соответствии с другим применением изобретения эффективность антагониста в предотвращении или лечении болезней может быть улучшена путем введения антагониста серийно или же в комбинации с другим веществом, эффективным для данной цели, таким, например, как фактор некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины; антитела и низкомолекулярные ингибиторы, способные нейтрализовать или ингибировать активность фактора роста эндотелия сосудов и/или его рецепторов, и/или фактора роста гепатоцитов и/или его рецепторов, и/или эпидермального фактора роста и/или его рецепторов, и/или фактора роста плаценты и/или его рецепторов, и/или эпидермального фактора роста и/или его рецепторов, и/или инсулиноподобного фактора роста и/или его рецепторов, и/или фактора роста фибробластов и/или его рецепторов, и/или тТОК, и/или других внутриклеточных киназ, или одно или более обычных терапевтических веществ, таких как, например, алкилирующие соединения, антибиотики, антиметаболиты, антрациклины, винкаалкалоиды, эпиподофиллотоксины, другие цитостатики. Подобные вещества могут присутствовать во вводимом составе или могут вводиться отдельно. Кроме того, антагонист по способу может вводиться серийно или же в комбинации с радиологическим лечением.

Один антагонист или более вводятся пациенту с опухолью в терапевтически эффективных дозах, определенных, например, при наблюдении некроза опухоли или ее метастатических фокусов, если они имеются. Такая терапия продолжается до тех пор, пока перестает наблюдаться дальнейшее улучшение, или клиническое обследование показывает, что опухоль или ее метастазы исчезли. При прогрессировании болезни вводится одно или несколько описанных выше веществ(о) или используются другие методы лечения. Поскольку эффективность дополнительных веществ будет варьировать, желательно сравнить их

- 3 023383 влияние на опухоль путем стандартного матричного скрининга. Производится повторное введение антагониста и дополнительного агента, пока не будет достигнут желаемый клинический эффект. В альтернативном случае антагонист(ы) по способу вводятся совместно и, при желании, вместе с дополнительными веществами.

Антагонисты по способу могут быть использованы с препаратами поддерживающей и сопроводительной терапии, например, с эритропоэтинами, препаратами, стимулирующими лейкопоэз или повышающими количество тромбоцитов и/или нейтрофилов, макрофагов, с нутритивной поддержкой, нестероидными противовоспалительными средствами, компонентами крови, дексаметазоном, золедроновой кислотой, антителами против КАЫКЬ.

Ниже в качестве примеров представлены некоторые доказательства способа подавления роста опухоли, заключающегося в блокировании аминокислотных последовательностей, приведенных в настоящем изобретении. Нижеследующие примеры предлагаются только в качестве иллюстрации и не должны восприниматься как в чем-либо ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1. Результаты исследования: анализ выживания или пролиферации опухолевых клеток ίη νίΐτο при добавлении моноклинального антитела, блокирующего аминокислотную последовательность, указанную на фиг. 1.

Следующие клеточные линии были выбраны для проведения исследования:

1) человеческого немелкоклеточного рака легкого;

2) человеческого рака предстательной железы;

3) человеческого рака молочной железы;

4) человеческого почечно-клеточного рака;

5) человеческого рака желудка;

6) человеческого рака носоглотки;

7) человеческого рака яичников.

На клетках указанных клеточных линий в стандартном анализе Вестерн-блоттинг была определена гиперэкспрессия рецепторов различных факторов роста, а именно УЕОРК, РОРК, ЕОРК, ЮРК, а также фактора роста тромбоцитов (ΡΌΟΡΚ). Общий уровень экспрессии факторов на опухолевых клетках колебался в пределах 30-100% в зависимости от типа рецептора и клеточной линии. С помощью секвенирования было доказано, что регионы рецепторов с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 1-11, присутствуют на клетках всех линий кроме линии человеческого рака носоглотки. Основываясь на полученных данных, человеческие линии почечно-клеточного рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, немелкоклеточного рака легкого, рака желудка и рака яичников были отобраны для дальнейших исследований. В качестве антагониста, блокирующего аминокислотную последовательность, указанную на фиг. 1, использовалось специфическое высокоаффинное (Кб =1,7 нМ) мышиное моноклональное антитело 10-10. Термин моноклональное антитело используется здесь для обозначения антитела, полученного из популяции достаточно однородных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны в своей специфичности и сродству, за исключением возможных, естественно встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Блокирующее мышиное антитело 10-10 было специально разработано на основании гибридомного метода (О. КбЫег, С. Μίΐδίοίη. ί ЫаЩгс 256, 495 (1975) для проведения настоящих исследований. Мышь иммунизировали антигеном, представляющим пептид из аминокислотной последовательности, указанной на фиг. 1.

Клетки опухолевых линий были высеяны с плотностью 10⁴ клеток/мл в 6-луночных пластинках. В каждую лунку было добавлено блокирующее моноклональное антитело 10-10 в концентрации 100 мкг/мл и в равном объеме. Также в качестве контроля к части культуры было добавлено постороннее моноклонального антитела без нейтрализующей способности (приобретенное в ЛЬсаш, концентрация 100 мкг/мл). После инкубации в каждую лунку была добавлена комбинация факторов роста (УЕОР, РОР, 1ОР, ЕОР) по 1 нг/мл. В качестве дополнительного контроля часть клеток выращивалась в отсутствие как антитела, так и факторов роста. После роста культуры в течение 3 недель клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе НеШей Раскагб 5>сап)е1 (США).

Как показано на фиг. 12, моноклональное антитело 10-11 полностью ингибировало способность добавленных факторов роста поддерживать рост и выживание клеток всех указанных опухолевых линий (более чем на 90%). Моноклональное антитело без нейтрализующей способности (АЬсат) не вызвало изменений в выживаемости клеток. В опыте было выявлено, что подавление пролиферативной активности не зависит от дозы агента, блокирующего аминокислотную последовательность (эффективность нескольких доз была одинаковой).

Общий вывод по данному примеру: при избирательном воздействии блокирующим агентом, в данном случае антителом, на аминокислотную последовательность, указанную в фиг. 1, достигается сильное ингибирование роста опухолевых клеток в отношении нескольких клеточных линий.

Пример 2. Результаты исследования: изучение и сравнение эффективности изолированного блокирования аминокислотной последовательности, указанной на фиг. 1, и блокирования нескольких рецепторов с тирозинкиназной активностью стандартными ингибиторами тирозинкиназ.

- 4 023383

В исследовании в качестве экспериментальной клеточной линии была выбрана линия человеческого почечно-клеточного рака типа Сай, клетки которой экспрессируют различные рецепторы с тирозинкиназной активностью, в частности в 80-100% - УЕОРР, РОРК и РИОРР, что было выявлено в предыдущем исследовании. В связи с этим данная клеточная линия использовалась в экспериментах как модель.

Клетки были высеяны в 96-луночных пластинках объемом 90 мкл/лунка. После 24 ч инкубации в увлажненном инкубаторе при температуре 37С, 5% СО₂ и 95% воздуха к клеткам были добавлены тестируемые растворенные агенты в количестве 100 мкг/мл. В качестве тестируемых агентов использовались низкомолекулярные ингибиторы: 1) ингибитор ΙΟ -11, полученный путем химического синтеза для данного исследования, целенаправленно блокирующий аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 1, и 2) коммерчески приобретенный ΒΙΒΡ 1120, который является ингибитором УЕОРР, РИОРР, РОРК, демонстрируя 1С50 в пределах (20-100 нмоль/л).

Ингибиторы были добавлены к клеткам, часть клеток осталась без добавления какого-либо агента (контрольная группа). Через сутки после инкубации с ингибиторами к клеткам была добавлена смесь факторов роста УЕОР, РИОР, РОР в количестве 10 нмоль/л. В случае, если ингибиторы блокировали активность рецепторов с тирозинкиназной активностью, добавленные факторы роста не должны были оказать свое действие. Клетки контрольной группы были разделены на две подгруппы, к одной были добавлены факторы роста, другая осталась без стимуляции.

Инкубация с факторами роста продолжалась на протяжении 2 суток, после чего все клетки были посчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе Нс\у1сО Раскагб 5>сап]е1 (США).

Уровень ингибирования в процентах был оценен как отношение количества клеток в группе с ингибиторами к клеткам, которые не получали лечение и были стимулированы факторами роста. Уровень ингибирования для ΙΟ-11 составил 95%, уровень ингибирования для В1ВР 1120 был 54%. Статистические отличия по количеству клеток для ΙΟ-11 и В1ВР 1120 были достоверны (Р=0,003), что означает преимущества в ингибировании для ΙΟ-11. Количество клеток в контрольной группе без стимуляции было достоверно ниже, чем в контрольной группе со стимуляцией факторами роста (Р=0,001). Ингибитор ΙΟ11 значимо подавлял эффекты добавленных факторов роста, количество клеток по сравнению со стимулированным контролем было достоверно ниже (Р<0,001). Результаты графически показаны на фиг. 13.

Общий вывод: избирательное ингибирование аминокислотной последовательности, указанной на фиг. 1, приводит к лучшим результатам эффективности, чем неселективное ингибирование рецепторов УЕОРР, РОРР, РИОРР. Факторы роста оказывают стимулирующее воздействие на пролиферацию опухолевых клеток; их эффекты достоверно подавляются при ингибировании аминокислотной последовательности, указанной на фиг. 1.

Пример 3. Результаты исследования: ингибирование роста опухоли ίη νίνο при блокировании аминокислотной последовательности, указанной на фиг. 1, 2, 4 и 11.

Самкам мышей (Веще/пибе) возрастом 8 недель (приобретенным в Наг1ап Зргадие ИаМеу, 1пс. (Индианаполис, США) были подкожно введены 2х10⁶ опухолевых клеток линии человеческого почечноклеточного рака (Сакт) в 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (ФРФБ). После того как установился рост опухоли (1 мм³), мыши были разделены на 7 групп.

Первой (лечебной) группе мышей (N=10) вводили инграперитонеально 2 раза в неделю моноклональное антитело ΙΟ-10, описанное в предыдущих примерах, в дозе 10 мг/кг.

Второй (лечебной) группе мышей (N=10) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю ингибитор ΙΟ-11, описанный в предыдущих примерах, в дозе 10 мг/кг.

Третьей (лечебной) группе мышей (N=10) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю ингибитор ΙΟ-11/2, полученный путем химического синтеза и блокирующий аминокислотную последовательность, указанную на фиг. 2, в дозе 10 мг/кг.

Четвертой (лечебной) группе мышей (N=10) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю ингибитор ΙΟ-11/4, полученный путем химического синтеза и блокирующий аминокислотную последовательность, указанную на фиг. 4, в дозе 10 мг/кг.

Пятой (лечебной) группе мышей (N=10) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю ингибитор ΙΟ-11/11, полученный путем химического синтеза и блокирующий аминокислотную последовательность, указанную на фиг. 1, в дозе 10 мг/кг.

Шестая (контрольная) группа мышей (N=10) лечения не получала.

Седьмая (контрольная) группа мышей (N=10) получала лечение неспецифическим иммуноглобулином (1дО), интраперитонеально, в дозе 10 мг/кг.

Размер опухоли и вес животных измеряли каждые 3 дня. Мыши подвергались эвтаназии при достижении опухоли размера 2000 мм³ или на 60 день эксперимента.

График роста опухоли в группах представлен на фиг. 14. На рисунке видно, что у тех мышей, которым были введены антагонисты (моноклональное антитело или низкомолекулярные ингибиторы) аминокислотной последовательности, указанной на фигурах 1,2,4,11 рост опухоли был достоверно замедлен, чем у мышей из контрольных групп.

Медиана объема опухоли мышей контрольных групп была достоверно больше по сравнению с мышами лечебных групп (Р<0,001).

- 5 023383

У более 60% мышей, получавших антагонисты, объем опухоли не достиг критического значения в 2000 мм³ на протяжении контрольного срока исследования - 60 дней, в отличии от мышей контрольных групп, где на 32 день эвтаназии была подвергнута последняя мышь, тк объем опухоли достиг 2000 мм³.

Общий вывод: селективные антагонисты (как моноклональные антитела, так и ингибиторы, полученные химическим путем), аминокислотных последовательностей (фиг. 1, 2, 4, 11) оказывают достоверное торможение опухолевого роста, тем самым влияя на продолжительность жизни.

Пример 4. Результаты исследования: сравнение эффективности избирательного ингибирования аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1, и общего блокирования рецепторов с тирозинкиназной активностью в отношении опухолевого роста ίη νίνο.

Самкам мышей (Вадс/пибс) возрастом 6-8 недель (приобретенным в Наг1ап 8ргадие Оау1еу, 1пс. (Индианаполис, США) были подкожно введены 2х10⁶ опухолевых клеток линии человеческого почечноклеточного рака (Сакл) в 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (ФРФБ). После того как установился рост опухоли (1 мм³), мыши были разделены на 6 групп.

Первая (контрольная) группа мышей (N=10) лечения не получала.

Третьей (лечебной) группе мышей (N=10) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю ингибитор ΙΟ-11, описанный в предыдущих примерах, в дозе 50 мг/кг.

Четвертой (лечебной) группе мышей (N=10) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю ингибитор ΒΙΒΡ 1120, блокирующий УЕОРК, ΡΌΟΡΚ, РОРК, в дозе 10 мг/кг.

Пятой (лечебной) группе мышей (N=10) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю ингибитор ΒΙΒΡ 1120, блокирующий УЕОРК, ΡΌΟΡΚ, РОРК, в дозе 50 мг/кг.

Изменение медианы объема опухоли и время до достижения размера опухоли 2000 мм³ приведено в таблице.

Как видно из таблицы, через 15 дней лечения достигнуты достоверные отличия в медиане объема опухоли между группами 2 и 4. Повышение дозы ингибитора ΙΟ-11 влияния на эффективность не оказывало, а, следовательно, даже небольшая доза сопровождается выраженным эффектом. На 20-й день получены достоверные отличия в размере опухоли в пользу ΙΟ-11 для всех лечебных групп.

Было отмечено замедление опухолевого роста в группах мышей, получавших ΙΟ-11.

Общий вывод: ингибирование аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1, является более эффективным в отношении подавления роста опухоли, чем ингибирование рецепторов УЕОРК, ΡΌΟΡΚ, РОРК. Использование ингибиторов, избирательно блокирующих данную амино кислотную последовательность, позволяет снижать дозу препарата без потери эффективности, что будет сопровождаться меньшей токсичностью.

Пример 5. Результаты исследования: анализ выживания или пролиферации эидотелиалъпых клеток ίη νίίτο при добавлении моноклонального антитела ΙΟ-10.

Для анализа выживания эндотелиальных клеток в среде факторов роста эндотелия сосудов (УЕОРА) и фактора роста фибробластов (ЬРОР) и при блокировании аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1, был проведен подобный эксперимент, что и при блокировании фактора роста эндотелия сосудов, описанный в патенте США №20090022716 (Коскуе11; РаГпОа еί а1. И8 Ρаίеηί 20090022716).

В качестве модели эндотелиоцитов использовались бычьи клетки капиллярного эндотелия коры надпочечников (КЭКН) (К Реггага еί а1. Ргос. №й. Асаб. 8ск 84: 5773 (1987).

В начале мы выявили высокую экспрессию УЕОРК и РОРК на КЭКН в стандартном анализе Вестерн-блоттинг.

Затем КЭКН были высеяны с плотностью 5х10⁴ клеток/мл в 12-луночных пластинках. В каждую лунку были добавлены УЕОР-А 10 нг/мл и ЬРОР 10 нг/мл в присутствии или в отсутствие моноклонального антитела ΙΟ-10 (10 мкг/мл), а также постороннего моноклонального антитела без нейтрализующей активности (АЬсат (10 мкг/мл)). После роста культуры в течение 5 дней клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе НеубеН Раскагб 8сап]е1 (США). В качестве дополнительного контроля КЭКН выращивались в отсутствие факторов роста.

Как показано на фиг. 15, моноклинальное антитело ΙΟ-10 подавляло способность добавленных факторов роста поддерживать рост и выживание бычьих КЭКН.

Моноклональное антитело без нейтрализующей активности (АЬсат) не оказывало никакого действия на клетки.

Таким образом, пример демонстрирует, что при блокировании пути указанной на фиг. 1 аминокислотной последовательности, эндотелиальные клетки перестают размножаться и теряют митогенную активность, что может приводить к нарушению ангиогенеза в опухоли.

- 6 023383

Перечень аминокислотных последовательностей

Аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ: 1)

КМЕККЬНАУРААЫТУКГКСРАССЫРМРТМКИЬКЫСКЕРК0ЕНК1ССУКУКЫ0НИ81.1МБ5

УУР$ОКЗМУТС7УБНЕУЙ$ГМНТУНЬСУ7ЕК$РНРР1Ь0АСЕРАМА5ТУУ5еОУЕГУСКУ

У5ОАСРН10М1КНУЕКМСЗКУСР0СЬРУЬКУЬКААОТМТТОКЕ1ЕУЪ¥1КМУТГЕОАСЕУ

ТСЬАС№ТС15ЕН5АИЕТУЪРАРСР.ЕКЕТТА5Р0УЕЕТАГУС16УРЕГАСМ7УТУ1ЕС

Аминокислотная последовательность (§Εζ> ΙΟ ΝΟ: 2).

РУМТМТЕКМЕКРЬНАУРААЦТУКЕКСРА(ЗСКРМРТМЕ№ЕКМСКЕРК0ЕНК113СУКУР

Ν0ΗΜ5ΕΙΜΕ2ννΡ50Κ0ΝΥΤ€ννΕΝΕΥ68ΙΝΗΤΥΗΕΌννΕΗ5ΡΗΚΡΙΕ0Α8ΕΡΑΝΑ5Τνν

ΟαϋνΕΓνσκνΥδΟΑΟΡΗΙΟ^ΚΗνΕΚΝΟδΚΥαΡΟαΕΡΥΕΚνΕΚΑΑσνΝΤΤΟΚΕΙΕνί-ΥΙΡ

МУТГЕОАСЕУТСЕАСН51С12ЕНЗАИ1ТУЪРАРСКЕКЕ1ТАЗРО¥ЪЕ1А1УС1С7ГЫАС

Μνντνιι,σ

Аминокислотная последовательность (8Е() ГО ΝΟ: 3).

КМЕКЕЬНАУР ΑΑΝΤνΚΕΡΟΡ АССЫРМРТМК ИЬКЫСКЕРКС) ЕНК1ССУКУК ЫОНИЗЫМБЗ ννΡ$ΡΚ(5ΝΥΤ 0ννΕΝΕΥ23Ι ΝΗΤΥΗΣΟννΕ КЗРНРР1Ы2А ЗЬРАМАЗТУУ СЗБУЕГУСКУ

ΥδϋΑΩΡΗΙΟΜ ΙΚΗνΕΚΝΰδΚ УСРОСЬРУЬК УЬКААСУЫТТ ΌΚΕΙΕνΣΥΙΚ ΝνΤΕΕΌΑΰΕΥ

ТСЕАСЫЗКП ЗЕНЗАИЬТУЬ ΡΑΡ6ΚΕΚΕΙΤ Α3ΡΌΥΕΕΙΑΙ УСЮТЕЫАС ΜνντνίΙΌΚΜ

Аминокислотная последовательность (8Е(? ГО ΝΟ: 4).

ΚΜΕΚΒΕΗΑνΡΑΑΝΤνΚΓΡ0ΡΑΰ2ΝΡΜΡΤΜΚ1^ΚΝ3ΚΕΓΚζ>ΕΗΚΙ33Υϊ<νΚΝΐ2ΗΗ3ΕΙΜΕ3 ννΡ5ΕΚ5ΝΥΤ 0ννΕΝΕΥ35Ι ΝΗΤΥΗΙΌ К5РНВР1Ы2А 3[,ΡΑΝΑ5Τνν ССОУЕЕУСКУ

ΥδΌΑίΡΗΙΟΜ ΙΚΗΛΈΚΝΰδΚ УСРОСЬРУЪК νΕΚΑΑΰνΝΤΤ ΟΚΕΙΕνΣΥΙΕ ΝνΤΕΕΌΑΰΕΥ

ТСЬАСМ3131 ЗЕНЗАИЕТ

Аминокислотная последовательность (8Ε<^ ГО ΝΟ: 5).

ΙΕ£Α0ΕΡΑΝΑ$Τνν6ΰ0νΕΕνςκνΥ50Ας>ΡΗΐς)ΝΐΚΗνΕΚΝ<35ΚΥ3Ρ0<3ΕΡΥΣΚ

7ЪКААС7ЫТТ0КЕ1ЕУЪ¥1ЕМУТРЕ0АСЕУТСЬАСЫ5ТС12ГНЗАИЬТ¥Ъ

РАРСРЕКЕ1ТА5Р0УЬЕ1А1УС1С7ЕЫАСМУ7Т71ЬС

Аминокислотная последовательность (8Е<2 ГО N0: 6), кмекрьнаур ΑΑΝτνκΓΡΑί усюугыас ΜνντνίΕο

Аминокислотная последовательность ($Е<3 ГО N0: 7).

ΚΜΕΚΕΕΗΑνΡΑΑΝΤνΚΓΡΑΙΝΗΊΪΗί0ννΕΚ3ΡΗΒΡΓΕ2Α3ΕΡΑΝΑ3ΤννΰΟ0νΕΕνσΚνΥ3ΟΑζ)ΡΚΙ2Μ

ΙΚΗνΕΚΝΰ5ΚΥΰΡΌ3ΑΡΥΣΚνΓΚΑΑ3νΝΤΤ0ΚΕΙΕνΣΥΙΡΝντΕΕϋΑ(3ΕΥΥ2ΕΑ(5Ν5Ι(3Γ5ΕΗ5ΑΝΕΤ

Аминокислотная последовательность (8Е<3 ГО ΝΟ: 8).

ΚΜΕΚΚΕΗΑνΡΑΑΝΤνΚΓΚ€ΡΑ6ΟΝΡΜΡΤΜΚΝΕΚΝ6ΚΕΓΚ0ΕΗΚΙ00ΥΚνΒΝ0ΗΜ5ΕΙΜΕ5ννΡ5ϋΚ<3Ν¥Τ

ΟννΕΝΕΥΰδΙ^ΤΥΗΕΌννΕΗδΡΗΗΡΙΕφΑΰΕΡΑΝΑδΤννΰΟΏνΕΓνΟΚνΥδΏΑίΡΗΙΰΜΙΚΗνΕΚΝΰδΚ

Υ3ΡΟ2ΕΡΥΕΚνΕΚΑΑ3νΝΤΤ0ΚΕΙΕνΕΥΙΡΝνΤΡΕ0Α2ΕΥΤ0ΕΑ2Ν8Ι0Ι3ΡΗΞΑΗΕΤ

Аминокислотная последовательность (5Е<2 ГО N0: 9).

ΚΜΕΚΕΕΗΑνΡΑΑΝΤνΚΕ3ΡΗΕΡΙΕΟΑ3ΕΡΑΝΑ3Τνν£ΰθνΕΕνθΚνΥ3&ΑΟΡΗΙΏΝΙΚΗνΕΚΝ65ΚΥ(:ΐ<3νΓΕΙΑΟ

Аминокислотная последовательность (8Е<? ГО ΝΟ: 10).

ννΕΚ3ΡΗΚΡΙ3ΓΗ3ΑΝΕΤνΕΡΑΡ3ΚΕΚΕΙΤΑ3Ρ0ΥΕΕΙ

Аминокислотная последовательность (5Е<5 ГО ΝΟ: 11).

ΑΙУСТСУГЕТАСМУУТУТЕС

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ подавления роста опухоли или лечения заболеваний, связанных с активностью тирозинкиназного рецептора, включающий введение ингибиторов, избирательно воздействующих на аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 1 в структуре тирозинкиназного рецептора или на последовательность, отличающуюся от §ЕЦ ГО N0: 1 вставкой нескольких аминокислотных остатков, или на фрагмент последовательности §ЕЦ ГО N0: 1.
2. Способ по п.1, где последовательности, отличающиеся от §ЕЦ ГО N0: 1 вставкой нескольких аминокислотных остатков, представляют собой §ЕЦ ГО N0: 2 и 3.
3. Способ по п.1, где фрагменты последовательности §ЕЦ ГО N0: 1 представляют собой §ЕЦ ГО N0: 4-11.

Изменение медианы объема опухоли и время до достижения размера опухоли 2000 мм³ в группах мышей

Медиана объема опухоли, мм³ Дни от начала эксперимента 10 15 20 60 1. Контрольная группа (N=10) 950 1200 1800 ΝΑ 2.10-11,10 мг/кг (N=10) 350 400 400 800 3.10-11,50 мг/кг 300 350 400 950 4. ΒΙΒΡ 1120, 10 мг/кг (N=10) 450 1000 1500 ΝΑ 5. ΒΙΒΡ 1120, 50 мг/кг (N=10) 350 600 1050 1800

Количество животных, опухоль которых достигла 2000 мм³, Ν(%) Дни ог начала эксперимента 15 20 34 60 1. Контрольная группа (N=10) 3(30) 6(60) 10(100) - 2.10-11, 10 мг/кг (N=10) 0(0) 1(10) 3(30) 4(40) 3.10-11,50 мг/кг 0(0) 0(0) 2(20) 4(40) 4. ΒΙΒΡ 1120, 10 мг/кг (N=10) 1 (10) 4(40) 10(100) - 5. ΒΙΒΡ И 20,50 мг/кг (N=10) 0(0) 2(20) 8(80) 9(90)

NΑ - оценить невозможно (все животные были подвергнуты эвтаназии ранее, так как размер опухоли составил более 2000 мм³)

Аминокислотная последовательность (8Е() 1В ΝΟ: 1)

ΚΜΕΚΕΙ,ΗΑνΡΑΑΝΤνΚΓΜ;ΡΑε5ΝΡΜΡΤΜΗΗΙ.Κ№3ΚΕΓΚΐ3ΕΗΕΐεθΥΚνΐΤΝ(2ΗΗ3Ι,ΙΜΕ3

УУР30КСН¥ТСУУЕНЕ¥С31МНТУН1ЖУУЕК5РНКР1Ц2АСЬРАЫАЗТУУ0С0УЕРУСКУ

ΥΒΟΑΟΡΗΙΟΜΙΚΗνΕΚΝΟΒΚΥΕΡΕΧΠ,ΡΥΙ,κνΑΚΑΑΟνΝΤΤΟΚΕΙΕνί,ΥΙΚΝνΤΕΈΟΑσΕΥ

ТСВАеЫЗИЛЗЕНЗАНЬТУЬРАРеКЕКЕТТАЗРОУЕЕТМУСЮТЕЫАСМУУТУПХ

Фиг. 1

Аминокислотная последовательность (8Е<3 ГО ΝΟ: 2).

РУИТМТЕКМЕКЕЬНАУРААМТУКЕРСРАбСНРМРТМНМЬКЫСКЕЕКОЕНКТССУКУК

ВДНИЗЫМЕЗУУРЗ ϋΚαΝΥΤσννΕΝΕΥΕΒ I ΝΒΤΥΗΕθννΕΚ3ΡΗΚΡΙΕ0ΑΌΕΡΑΚΑ3Τνν

ΟΟΟνΕΓνςΚνΥδΟΑΟΡΗΙΟΜΙΚΗνΕΚΝεδΚΥΟΡΟεΕΡΪΕΚνΕΚΑΑσνΜΤΤΟΚΕΙΕνΕΥΙΕ

МУТЕЕ0АСЕУТСЬАСР31С13ГНЗАИЬТУЕРАРСЕЕКЕ1ТАЗР0УЬЕ1А1УС1еУРЫАС

ΜννΤνίΤ,Ε

Фиг. 2

Аминокислотная последовательность (8Е0 Ιϋ N0: 3).

КМЕККЬНАУР ААКТУКРЕСР АСЗМРМРТМК ИЬКЯСКЕГКС ЕНРТССУЮ/В. №2НИЗЫМЕЗ ννΡ30Κι3Ν¥Τ €ννΕΝΕΥ03Ι ΝΗΤΥΗΕΟννΕ К5РНКР1Ь£А СЬРАМАЗТУУ ССОУЕР/СЮ/

Υ50Ας)ΡΚΙζ>Μ ТКНУЕКНбЗК УСРОСЬРУЬК νΐ,ΚΑΑΟνΝΤΤ ΟΚΕΙΕνίΑίΙΒ. ΝνΤΕΕΩΑΰΕΥ тсьасмз1С1 зрнзанътуь РАРСКЕКЕ1Т азроуье1А1 усютрыас ΜνντνιυΕΚΜ

Фиг. 3

- 8 023383

Аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ: 4).

ΚΜΕΚΚηΗΑνΡΑΜΤνΚΓΚΟΡΑεεΝΡΜΡΤΜΚΗΙ,ΚΝΟΚΕΓΚ0ΕΗΚΙ(30ΥΚνΚΝ(2ΗΗΕΙ.ΙΜΕ5 ννΡΕϋΚεΚΥΤ СУУЕНЕУС£1 νητυηβο кзрнкрхьоа сьрамаэтуу ссоуеруску υ3οαορηι(3» 1кнуекг1С5к усросьруьк νι,ΚΑΑενΝττ οκΕίΕνΣγικ кутеесабеу тсьасмвхс! зензаиьт

Фиг. 4

Аминокислотная последовательность (8 РА) 1ϋ ΝΟ: 5).

IЫЗАСЬРАИАЗТ УУССИУБГУСКУ Υ 3 ОАО РН I ОИ I КН УЕ КИСЗ К Υ3 Р ОСЬ Ρ ΥI. К

УЬКААбУМТТОКЕ ΐ ΕνίΛΙΚΗνΤΕΈΟΑΟΕΥΤΟΤ,ΑΟΝΞΙΟΙ Ξ ГНЗАИЬТУЪ

РАРСКЕКЕХТАЗРОУЪЕХА!УСГОУРЫАСМУУТУ1ЕС

Фиг. 5

Аминокислотная последовательность (8Εί) № ΝΟ: 6).

КМЕККЬИАУР ΑΑΝΤνΚΓΚΑΤ УСТЕУРЫйС МУУТУТЕС

Фиг. 6

Аминокислотная последовательность (ЗЕ<) ГО ΝΟ: 7).

КМЕККЬНАУРААИТУКРВАШНТУНЬСУУЕКеРНКРИдагЬРАНАЗТУУССОУЕГУСКУУЗОАОРНЦгИ

1КНУЕКНСЗКУСР0СЬР¥ЬКУЬКААСУМТГ0КЕ1ЕУЬУ1НМУТРЕ0АСЕУТСЬАСМ£1С13РН5АНЕТ

Фиг. 7

Аминокислотная последовательность (5Е<) ГО ΝΟ: 8).

ΚΜΕΚΚΕΗΑνΡΑΑΝΤνΚΓΙίΟΡΑ5ΰΝΡΜΡΤΜΒ№ΚΜΟΚΕΓΚ0ΕΗΚΙ0σΥΚν№Κ)ΗΜ£υΜΕ3ννΡ30ΚεΝΥΤ θννΕΝΕΥΟ3ΙΝΗΤΥΗΕθννΕΚ5ΡΗΚΡΙΙ,ΟΑεΐ,ΡΑΝΑ3Τννθ0ΕνΕΕ·ν(:ΚνΥ5ΟΑι2ΡΗΙ·<2ίίΙΚΗνΕΚΝ63Κ ¥СР0еЬР¥ЬКУЬКААСУНТТСКЕ1БУЬ¥1КНУТЕЕ0АСЕ¥ТСЬАСИ51Е1грН5АИЬТ

Фиг. 8

Аминокислотная последовательность |ЗЕ<) ГО N0:9).

КМЕККЬНАУРААЫТУККЗРНКРВДАСЛРАНАНТУУССОУЕГУСКУУЗОА'ЗРНЖТКНУЕКНеЗКУСЩУШАС

Фиг. 9

Аминокислотная последовательность (8Е<) Ц> ΝΟ: 10),

УУЕК5РНЕ.Р15ГНЗАН1,ТУЬРАРеКЕКЕ1ТА8Р0У1,Е1

Фиг. 10

Аминокислотная последовательность (8Е<) Ю ΝΟ: 11).

ΑΙ УСIСУРЫΑΟΜνντνιьс

Фиг. 11

- 9 023383

Ипгнбироианнс роста колоний клеток иол действием моноклоналынд о антитела 1010 против аминокислотной носледовательпое!н ХЕ(} 11) N0:1

НМРЛ РПЖ РМЖ ПКР РЖ РЯ

Обозначения:

НМРЛ - немелкокле1очиы11 рак легкого

ΡΙ ГЖ - рак пролетательной железы

РМЖ - рак мелочней железы

ПК!' - почечноклеточный рак

РЖ - рак желудка

1*Я - рак яичников

График:

Столбец 1 Контроль: клетки без лобл|цге111Ш каких-либо агентов

Столбец? - Моноклональное антитело 10-10. 1 СЮ мкг/мл

(..‘голбец ? - 1 ^специфический !цС, КХ) мкг/мд

Столбец 4 - Контроль; клетки, стимулированные факторами роста, бет добавления моноклонального антитела или 1гС

Фиг.12

Ингибирование роста колоний к легок нал лейст кием гт ш ноптора 10-11 про гик амн1Н)К1(с.||отноГ| последовательности 8ЕР II) N0:1 н другою......шбитпра рецепторов гнрозкнкннаты