EA023361B1 - Process for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide sorbed vaccine against a/h5n1 pandemic influenza - Google Patents

Process for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide sorbed vaccine against a/h5n1 pandemic influenza Download PDF

Info

Publication number
EA023361B1
EA023361B1 EA201300554A EA201300554A EA023361B1 EA 023361 B1 EA023361 B1 EA 023361B1 EA 201300554 A EA201300554 A EA 201300554A EA 201300554 A EA201300554 A EA 201300554A EA 023361 B1 EA023361 B1 EA 023361B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
vaccine
influenza
virus
dose
concentration
Prior art date
Application number
EA201300554A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
EA201300554A1 (en
Inventor
Абылай Рысбайулы Сансызбай
Жайлаубай Кыдырбаевич КЫДЫРБАЕВ
Нурлан Тамамбаевич САНДЫБАЕВ
Берик Мухитович ХАЙРУЛЛИН
Кайсар Казыбаевич ТАБЫНОВ
Ольга Викторовна Червякова
Шолпан Жанбырбаевна Рыскельдинова
Сейдигапбар Мамадалиевич МАМАДАЛИЕВ
Нурика Нарынбековна Асанжанова
Мархабат Мелисбекович Касенов
Куляйсан Турлыбаевна Султанкулова
Original Assignee
Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан filed Critical Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан
Priority to EA201300554A priority Critical patent/EA023361B1/en
Publication of EA201300554A1 publication Critical patent/EA201300554A1/en
Publication of EA023361B1 publication Critical patent/EA023361B1/en

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

The invention relates to medical biotechnology and provides a process for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide vaccine against A/H1N1 pandemic influenza from recombinant strain A/AstanaRG/6:2/2009, produced by an inverse genetics method in the Scientific-Research Institute for Biological Safety Problems of the Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhastan Committee of Science for developing pandemic vaccine. The essence of the invention is characterized by that for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide vaccine against A/H5N1 influenza optimum (moderate) regimen of the strain A/AstanaRG/6:2/2009 inactivation with formaline is used having the concentration 0.05%, the strain is further subjected to purification and concentration by chromatographic and filtration methods and an aluminium hydroxide adjuvant is added. The invention provides to prepare a pandemic vaccine for preventing A/H5N1 influenza with high virus purification efficiency and, accordingly, with enhanced safety and immunogenicity, the process of producing of which is more technological and economical.

Description

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к способу получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа Α/Η5Ν1.The invention relates to medical biotechnology, in particular to a method for producing inactivated pan-pandemic influenza vaccine Α / Η5Ν1 adsorbed on whole hydroxide aluminum hydroxide.

Известен способ приготовления вакцины инактивированной цельновирионной вакцины против пандемического гриппа Α/Η5Ν1 [ИиНей δΟιΚ5 РаГепГ Аррйсайоп РиЬйеайои, РиЬ. иитЬег: υδ 2009/0060950 А1, Вах1ег 1пГегпайопа1 1пс. МеГйой Гог Ргойисйоп Уйа1 Уассшек]. В соответствии с данным способом два диких штамма А/У1еГпат1203/2004 и А/1пйопейа/05/2005 культивируются в перевиваемой культуре клеток Уего (клетки почки африканской зеленой мартышки). Накопленный вирусный материал подвергается инактивации, сначала посредством обработки формалином (в конечной концентрации 0,92 г/л при температуре 32±2°С в течение 24 ч) для обезвреживания внеклеточного вируса, а затем ультрафиолетового облучения (20 циклов со скоростью 240 л с помощью установки УГОЕСО У18А с мощностью ультрафиолетовых ламп 110В), так как в питательной среде культуры клеток Уего имеется много органических компонентов, способных адсорбировать ультрафиолетовые сигналы. Инактивированный вирусный материал далее очищается и концентрируется с помощью изопикнического проточного центрифугирования в линейном градиенте сахарозы (на лабораторной центрифуге КК-6, 35000 об/мин). Полученный при этом пиковый пул вируса для недопущения агрегирования вирусных частиц трижды обрабатывается под высоким давлением (800 бар) на гомогенизаторе Νδ 1001Ь Рапйа (Νί-го δоаνί δ.ρ.Α.). После чего для разрушения клеточной ДНК к гомогенизированной суспензии добавляется бензоназа (нуклеаза) в конечной концентрации 3 ед./мл. Полученная смесь под давлением фильтруется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и инкубируется при 32°С в течение ночи. После окончания времени инкубации суспензия подвергается ультрафильтрации (30 кд, фильтрационная площадь 0,1 м2) и последующей диафильтрации против 10-ти объемов трис-буфера. Далее снова проводится инактивация вируса формальдегидом в конечной концентрации 0,025% при комнатной температуре в течение 24 ч. Остаточное содержание формальдегида также удаляется посредством ультрафильтрации (мембраны с диаметром пор 30 кд) и диафильтрации против 5-ти объемов трис-буфера. Далее проводится микрофильтрация материала через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, при этом вирусный материал предварительно обрабатывается под высоким давлением (800 бар) на гомогенизаторе Νδ 1001Ь Рапйа для уменьшения потери вируса.There is a method of preparing a vaccine inactivated whole-virus vaccine against pandemic influenza Α / Η5Ν1 [IuNey δΟιΚ5 RaGepG Arreysayop Riyeoyoi, Rb. Italy: υδ 2009/0060950 A1, Bax1eg 1pGegpiopa1 1ps. MeGoy Gog Rgoisyop Uya1 Wasszhek]. In accordance with this method, two wild strains A / U1eGpat1203 / 2004 and A / 1pyopeia / 05/2005 are cultivated in an inoculated culture of Huego cells (African green monkey kidney cells). The accumulated viral material is inactivated, first by treatment with formalin (at a final concentration of 0.92 g / l at 32 ± 2 ° C for 24 hours) to neutralize the extracellular virus and then ultraviolet irradiation (20 cycles at a rate of 240 l using UGOESO U18A installations with a power of ultraviolet lamps of 110V), since there are many organic components in the nutrient medium of a Ugo cell culture that can absorb ultraviolet signals. Inactivated viral material is further purified and concentrated using isopycnic flow centrifugation in a linear sucrose gradient (KK-6 laboratory centrifuge, 35,000 rpm). The resulting peak pool of the virus in order to prevent aggregation of viral particles is processed three times under high pressure (800 bar) using a Νδ 1001b Rapya homogenizer (Νί th δоаνί δ.ρ.Α.). Then, to destroy cellular DNA, benzonase (nuclease) is added to the homogenized suspension at a final concentration of 3 units / ml. The resulting mixture under pressure is filtered through membrane filters with a pore diameter of 0.22 μm and incubated at 32 ° C overnight. After the end of the incubation time, the suspension is subjected to ultrafiltration (30 cd, filtration area of 0.1 m 2 ) and subsequent diafiltration against 10 volumes of Tris buffer. Then virus inactivation is again carried out with formaldehyde at a final concentration of 0.025% at room temperature for 24 hours. The residual formaldehyde content is also removed by ultrafiltration (membrane with a pore diameter of 30 cd) and diafiltration against 5 volumes of Tris buffer. Next, microfiltration of the material is carried out through membrane filters with a pore diameter of 0.22 μm, while the viral material is pre-processed under high pressure (800 bar) on a 100δ 1001b Rapya homogenizer to reduce virus loss.

Полученный таким образом моновалентный полуфабрикат гриппозной вакцины содержит в среднем 74,6 мкг/мл вирусного гемагглютинина (выход 38%), протеины культуры клеток Уего - 4,7 мкг/мл (уменьшение на 75%), общий белок - 385 мкг/мл (уменьшилось на 50%), клеточное ДНК - 0,27 мкг.Thus obtained monovalent prefabricated influenza vaccine contains an average of 74.6 μg / ml of viral hemagglutinin (38% yield), Ugo cell culture proteins - 4.7 μg / ml (75% decrease), total protein - 385 μg / ml ( decreased by 50%), cellular DNA - 0.27 μg.

Клинические испытания (ΙΙΙ-фаза) данной вакцины на волонтерах в возрасте от 18 до 60 лет показали ее эффективность в режиме двукратной вакцинации с препаратом, содержащим гемагглютинин 7,5 мкг/доза. При этом процент сероконверсии на 42 сутки после вакцинации составил 73% [Ейгйсй Η4.. Мийег М., Ой Н.М., ТатЬуай Р.А., Фоикйайаг С., МопГотой Е., Р15йег Ό., Веге/ик О., РгйзсЬ δ., Боте Ва5еШ А., Уагйап Ν., ВоЬго\'5ку К., Раν1оνа В.О., РойаЬаиег Е.М., К15Гпег О., Ваггей Р.К; ВахГег Η5Ν1 Рапйетю Iиί1иеиζа Уассше Сйшса1 δΐийу Теат. А сйшса1 1па1 оГ а \у1ю1е-\аги5 Η5Ν1 \'ассте йегАей Ггот се11 сийиге. Ν Еп§1 1 Мей. 2008 1ип 12; 358(24):2573-84].Clinical trials (ΙΙΙ-phase) of this vaccine on volunteers aged 18 to 60 years have shown its effectiveness in a double vaccination regimen with a preparation containing hemagglutinin 7.5 μg / dose. Moreover, the percentage of seroconversion on 42 days after vaccination was 73% [Eygys Η4 .. Miyeg M., Oy N.M., Tatuay R.A., Foikyayag S., MopGotoi E., P15yeg Ό., Vege / ik O. , Przelb δ., Baute BaaеeS A., Huagap Ν., Bogo 5ku K., Paν1oνa V.O., Royaаeg E.M., K15Gpeg O., Waggay R.K; WahGeg Η5Ν1 Rapietu Iiί1ieiζa Wassche Syshsa1 δΐiyu Theater. And sysssa1 1pa1 oG a \ u1yu1- \ agi5 Η5Ν1 \ 'asstegaegaey Ggot se11 siyige. Ν Ep§1 1 May. 2008 1ip 12; 358 (24): 2573-84].

Необходимо отметить, что данный способ получения вакцины инактивированной цельновирионной вакцины против пандемического гриппа А/Н5Ш с успехом применяется компанией Вах1ег 1п1егпайопа1 1пс. (США), однако следует отметить, что вследствие использования в качестве субстрата для культивирования вирусов гриппа перевиваемой культуры клеток Уего, которая может содержать в себе онкогенные факторы, технологический процесс получения препарата, а именно этап очистки вируса по сравнению с технологиями, основанными на куриных эмбрионах, значительно усложнен. Более того, в процессе производства вирусный материал трижды подвергается этапу инактивации с помощью как химических, так и физических факторов, что безусловно сказывается на иммуногенности конечного препарата. Следует также отметить, что значительной проблемой для производителя является то, что все штаммы, рекомендуемые ВОЗ для производства пандемических гриппозных вакцин, не адаптированы к культурам клеток, вследствие чего выход вируса незначительный. Данное обстоятельство побуждает производителя накапливать непомерно большие объемы вирусного материала. В целом, процесс получения данной вакцины по вышеуказанному способу в технологическом отношении сложен и к тому же весьма дорогостоящий, поскольку для ее производства используются дикие штаммы, требующие обеспечение высокого уровня биологической безопасности на предприятии.It should be noted that this method of obtaining a vaccine for the inactivated whole-virionic vaccine against pandemic influenza A / H5Sh is successfully used by the company Вах1ег 1п1egпайоп1 1пс. (USA), however, it should be noted that due to the use of a transplantable cell culture of Ugo, which may contain oncogenic factors, the technological process of obtaining the drug, namely the stage of virus purification in comparison with technologies based on chicken embryos, as a substrate for the cultivation of influenza viruses significantly complicated. Moreover, in the production process, viral material undergoes the inactivation phase three times using both chemical and physical factors, which certainly affects the immunogenicity of the final drug. It should also be noted that a significant problem for the manufacturer is that all strains recommended by WHO for the production of pandemic influenza vaccines are not adapted to cell cultures, as a result of which the virus yield is negligible. This circumstance prompts the manufacturer to accumulate exorbitantly large volumes of viral material. In General, the process of obtaining this vaccine according to the above method is technologically complicated and also very expensive, because for its production wild strains are used that require a high level of biological safety at the enterprise.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа А/Н5Ш [ИшГей δ!Οθ5 РаГепГ, РаГепГ, № υδ 7316813 В2, διηίΙΙιΚΠικ Веесйат Рйагта ОтЬн & Со КО 1пПиеп/а Уассше Сотро5111оп|, основанный на использовании куриных эмбрионов в качестве субстрата для культивирования вируса гриппа. Согласно данному способу куриные эмбрионы 9-11-суточного возраста заражаются штаммом А/У1еГпат/1194/2004 вируса птичьего гриппа. Инфицированные эмбрионы инкубируются при оптимальной температуре в течение 48-96 ч. По истечении срока инкубации куриные эмбрионы подвергаются умерщвлению путем охлаждения при температуре 2-8°С в течение 12-60 ч и ис- 1 023361 пользуют для сбора аллантоисной жидкости. Очистку вирусной суспензии от куриных белков проводят с помощью последующих технологических операций:Closest to the technical nature of the claimed invention is a method of producing an inactivated all-virion hydroxylaluminium vaccine against influenza A / H5H [IshGey δ! Οθ5 RaGepG, RaGepG, no. the use of chicken embryos as a substrate for the cultivation of influenza virus. According to this method, chicken embryos 9-11 days old are infected with the strain A / U1eGpat / 1194/2004 of the bird flu virus. Infected embryos are incubated at the optimum temperature for 48-96 hours. At the end of the incubation period, chicken embryos are sacrificed by cooling at 2-8 ° C for 12-60 hours and used to collect allantoic fluid. Purification of the viral suspension of chicken proteins is carried out using the following technological operations:

осветление путем низкоскоростного центрифугирования (4000-14000 д);clarification by low-speed centrifugation (4000-14000 d);

адсорбция путем добавления в осветленную суспензию геля СаНРО4, содержащего 0,5 моль/л Ыа2НРО4 и 0,5 моль/л СаС12 в конечной концентрации, из расчета от 1,5 до 3,5 г на литр вирусного материала. После 8-часового осаждения сливается надосадочная жидкость, а осадок, содержащий вирусы гриппа, ресуспендируют 0,26 моль/л раствором ΕΩ-ΤΛ-Να2 в зависимости от содержания СаНРО4;adsorption by adding CaHPO 4 gel to a clarified suspension containing 0.5 mol / L Na 2 NDO 4 and 0.5 mol / L CaCl 2 in a final concentration, from 1.5 to 3.5 g per liter of viral material. After 8 hours of precipitation, the supernatant is drained, and the precipitate containing influenza viruses is resuspended with 0.26 mol / L solution of ΕΩ-ΤΛ-Να 2 depending on the content of CaHPO 4 ;

фильтрация ресуспендированного осадка через фильтры с диаметром пор 6 мкм; изопикническое проточное центрифугирование вирусного концентрата в линейном градиенте сахарозы (0,55%), содержащем 100 мкг/мл тиомерсала - 8-15 л в час. К концу центрифугирования содержание ротора с помощью рефрактометра делится на четыре фракции: 1) 55-52% сахарозы; 2) 52-38% сахарозы; 3) 38-20% сахарозы; 4) 20-0% сахарозы. Для приготовления вакцины используются фракции 2 и 3. Фракция 3 для снижения концентрации сахарозы до 6% промывается буферным раствором с помощью диафильтрации. После чего фракции 2 и 3 собираются в один пул, разводятся буферным раствором до получения конечного объема 40 л. Полученный продукт называется моновалентный цельновирионный вирусный концентрат.filtering the resuspended precipitate through filters with a pore diameter of 6 μm; isopycnic flow centrifugation of the viral concentrate in a linear sucrose gradient (0.55%) containing 100 μg / ml of thiomersal - 8-15 l per hour. By the end of centrifugation, the content of the rotor using a refractometer is divided into four fractions: 1) 55-52% sucrose; 2) 52-38% sucrose; 3) 38-20% sucrose; 4) 20-0% sucrose. Fractions 2 and 3 are used to prepare the vaccine. Fraction 3 is washed with a buffer solution by diafiltration to reduce sucrose concentration to 6%. After that, fractions 2 and 3 are collected in one pool, diluted with buffer solution until a final volume of 40 l is obtained. The resulting product is called a monovalent whole-virus virus concentrate.

Центрифугирование в градиенте сахарозы с диоксихолатом натрия.Centrifugation in a sucrose gradient with sodium dioxholate.

Полученный материал снова подвергается проточному центрифугированию в линейном градиенте сахарозы (0,55%), содержащем 0,7-1,5% натрия диоксихолата - 8-15 л в час. Центрифугирование проводится на ультрацентрифуге ΕΝΙ-Магк II (ротор К3). К концу центрифугирования содержание ротора делят на три фракции, при этом фракцию 2 (47-18%) используют для дальнейшей работы.The resulting material is again subjected to flow centrifugation in a linear sucrose gradient (0.55%), containing 0.7-1.5% sodium dioxholate - 8-15 liters per hour. Centrifugation is carried out on an ΕΝΙ-Magk II ultracentrifuge (K3 rotor). By the end of centrifugation, the rotor content is divided into three fractions, while fraction 2 (47-18%) is used for further work.

Стерильная фильтрация.Sterile filtration.

Материал с расщепленным вирусом фильтруется через мембранные фильтры с диметром пор 0,2 мкм. Перед фильтрованием материал разводится 5-кратно буферным раствором.The material with the cleaved virus is filtered through membrane filters with a pore diameter of 0.2 μm. Before filtering, the material is diluted with 5-fold buffer solution.

Инактивация вируса.Inactivation of the virus.

Фильтрованный моновалентный материал инкубируется при температуре 22±2°С в течение 84 ч. Для снижения концентрации общего белка в материале до 250 мкг/мл (максимум) он разводится с фосфатным буфером. Далее в суспензию вносят формальдегид в конечной концентрации 50 мкг/мл, смесь инкубируют при температуре 20±2°С в течение 72 ч.Filtered monovalent material is incubated at a temperature of 22 ± 2 ° C for 84 hours. To reduce the total protein concentration in the material to 250 μg / ml (maximum), it is diluted with phosphate buffer. Next, formaldehyde is added to the suspension at a final concentration of 50 μg / ml, the mixture is incubated at a temperature of 20 ± 2 ° C for 72 hours.

Ультрафильтрация.Ultrafiltration.

Инактивированный расщепленный вирусный материал концентрируется не менее чем 2 раза на ультрафильтрационной установке с целлюлозно-ацетатными мембранами (20 кД М\УСО). а затем промывается фосфатно-солевым буфером.Inactivated cleaved viral material is concentrated at least 2 times in an ultrafiltration unit with cellulose-acetate membranes (20 kD M \ USO). and then washed with phosphate-buffered saline.

Заключительная стерилизующая фильтрация.Final sterilizing filtration.

Материал после ультрафильтрации фильтруется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. После чего фильтры промываются фосфатно-солевым буферным раствором. Концентрация общего белка в фильтрованном материале не должна превышать 500 мкг/мл. Конечный моновалентный полуфабрикат вакцины хранится при температуре 2-8° С в течение 18 месяцев.After ultrafiltration, the material is filtered through membrane filters with a pore diameter of 0.22 μm. Then the filters are washed with phosphate-buffered saline. The concentration of total protein in the filtered material should not exceed 500 μg / ml. The final monovalent prefabricated vaccine is stored at 2-8 ° C for 18 months.

Для приготовления готового препарата расщепленный моновалентный полуфабрикат вакцины объединяется в соотношении 1:1 с адъювантом А1(ОН)3 на буферном растворе [дистиллированная вода - 0,8 л, №С1 - 7,699 г, КС1 - 0,2 г, МдС12х6Н2О - 0.1 г, №2НРО4х12Н2О - 2.6 г, КН2РО4 - 0.373 г] и сорбируется в соответствии с оптимальным режимом.To prepare the finished product, the split monovalent prefabricated vaccine is combined in a 1: 1 ratio with adjuvant A1 (OH) 3 in a buffer solution [distilled water - 0.8 L, No. C1 - 7.699 g, KC1 - 0.2 g, MDC1 2 x6H 2 O - 0.1 g, № 2 HPO 4 h12N 2 O - 2.6 g, KH 2 PO 4 - 0.373 g] and adsorbed according to the optimal mode.

Полученный таким образом готовый препарат вакцины соответствует следующей спецификации: общий белок <600 мкг/100 мкг НА; овальбумин <2 мкг/100 мкг НА; сахароза <0,4 мг/100 мкг НА; эндотоксин <200 МЕ/100 мкг НА; А1(ОН)3 - 0,38 мг/мл; живой вирус отсутствует; стерильна.The finished vaccine preparation thus obtained complies with the following specification: total protein <600 μg / 100 μg HA; ovalbumin <2 μg / 100 μg HA; sucrose <0.4 mg / 100 μg HA; endotoxin <200 IU / 100 μg HA; A1 (OH) 3 - 0.38 mg / ml; no live virus; sterile.

Оценка иммуногенной активности (ΙΙ-фаза клинических испытаний) данной вакцины на волонтерах в возрасте от 18 до 16 лет при двукратном введении показала, что в группе привитых вакциной в дозе 3,8, 7,5, 15,0, 27 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 67, 63, 71, 90% соответственно; кратность прироста титров антител составила 10,5, 9,1, 12,4, 32,4; уровень серопротекции - 69, 63, 71, 90% соответственно [Ьегоих-КоеЦ I., ВегпЬагй К., Оегагй Р., Игате М., Напоп Ε., с1 а1. (2008) Вгоай С1айе 2 Сго88-Кеасйуе 1ттипИу 1пйисей Ьу ап ЛйщуаШей С1айе 1 ιΉ5Ν1 Рапйеш1С 1пГ1иеп/а Уассше. РЬо8 О№ 3(2): е1665. Йо1:10.1371/)оигпа1.ропе.0001665].Evaluation of the immunogenic activity (ΙΙ-phase of clinical trials) of this vaccine on volunteers aged 18 to 16 years with a double dose showed that in the group vaccinated with the vaccine at a dose of 3.8, 7.5, 15.0, 27 μg per share of individuals with 4-fold seroconversions was 67, 63, 71, 90%, respectively; the rate of increase in antibody titers was 10.5, 9.1, 12.4, 32.4; the level of seroprotection is 69, 63, 71, 90%, respectively [Legoih-KoeZ I., Vegpagi K., Oegagi R., Igate M., Napopu., s1 a1. (2008) Vgoai Claie 2 Cgo88-Keasue 1tipIu 1piseyy u ap LishchuyShey Claye 1 ΉΉ5Ν1 Rapyesh1C 1pG1iep / a Wassche. PbO8 O3 (2): e1665. Yo1: 10.1371 /) oigpa1.rope.0001665].

Следует отметить, что данный способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа ΑΉ5Ν1 налажен на производственных предприятиях компании ЗтЪЬКИпе ВеесЬат РЬагта ОтЬН & Со КО (Нидерланды) и позволяет получать продукцию, полностью отвечающую требованиям Европейской фармакопеи. Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что технологический процесс производства, а именно этап очистки и концентрирования вируса основан на зональной центрифужной технологии, требующей дорогостоящего оборудования и не менее дешевого обслуживания. Данное обстоятельство является значительным барьером в использовании данной технологии в странах со слаборазвитой экономикой, но не менее остро нуждающихся в качественных противогриппозных вакцинах.It should be noted that this method of producing inactivated all-virion hydroxylaluminium vaccine against influenza ΑΉ5Ν1 was established at the production facilities of ZtBKipe Veesbat Ragta OTN & Co (Netherlands) and allows to obtain products that fully meet the requirements of the European Pharmacopoeia. At the same time, it must be emphasized that the technological process of production, namely, the stage of purification and concentration of the virus, is based on zonal centrifuge technology, which requires expensive equipment and no less cheap maintenance. This fact is a significant barrier to the use of this technology in countries with underdeveloped economies, but no less urgently in need of high-quality influenza vaccines.

- 2 023361- 2 023361

Сущность изобретения состоит в том, что применяется оптимальный режим инактивации формалином в концентрации 0,05%, проводимой до этапа хроматографической очистки и концентрирования с помощью последовательных технологических операций микрофильтрации, ультра/диафильтрации и гельфильтрации, стерилизующей фильтрации с использованием нового рекомбинантного штамма А/А51аиаКС/6:2/2009, полученного методом обратной генетики в НИИПББ КН МОН РК, что обеспечивает получение антигена с высокой степенью очистки с минимальным содержанием остаточного формалина в препарате для повышения безопасности и иммуногенности приготовляемой пандемической вакцины, полностью соответствующей требованиям Государственной фармакопеи Республики Казахстан и Европейской фармакопеи.The essence of the invention lies in the fact that the optimal mode of inactivation with formalin at a concentration of 0.05% is applied, carried out before the stage of chromatographic purification and concentration using successive technological operations of microfiltration, ultra / diafiltration and gel filtration, sterilizing filtration using a new recombinant strain A / A51aiaKS / 6: 2/2009, obtained by the reverse genetics method at the NIIPBB KN MON RK, which ensures the production of antigen with a high degree of purification with a minimum residual content ormalina in the formulation to improve the safety and immunogenicity is prepared pandemic vaccines, fully compliant with the requirements of the State Pharmacopoeia of the Republic of Kazakhstan and the European Pharmacopoeia.

В основу настоящего изобретения положена задача повышения технологичности процесса получения вакцины, расширения технологических возможностей за счет использования более щадящего метода инактивации, повышения производительности метода очистки и концентрирования, повышения безопасности и иммуногенности полученной таким способом вакцины.The present invention is based on the task of improving the manufacturability of the vaccine production process, expanding technological capabilities through the use of a more gentle inactivation method, increasing the efficiency of the cleaning and concentration method, and increasing the safety and immunogenicity of the vaccine obtained in this way.

Техническим результатом предложенного способа является получение пандемической вакцины для профилактики птичьего гриппа Α/Η5Ν1 с высокой степенью очистки вируса и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является более технологичным и экономичным.The technical result of the proposed method is to obtain a pandemic vaccine for the prevention of bird flu Α / Η5Ν1 with a high degree of purification of the virus and, accordingly, with improved safety and immunogenicity, the manufacturing process of which is more technological and economical.

Технический результат достигается за счетThe technical result is achieved due to

а) наработки вируссодержащей суспензии с использованием рекомбинантного штамма А/А51аиаК0/6:2/2009, полученного в НИИПББ КН МОН РК методом обратной генетики из эпизоотического вируса А/с1йсксп/АПапа/6/05 (Η5Ν1) и высокорепродуктивного штамма А/РК/8/34 (Η1Ν1). Вакцинный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов НИИПББ КН МОН РК под № Μ-12-09/Ό от 19.10.09 г. и имеет паспорт международного образца, позволяющий его использовать для приготовления пандемической вакцины против гриппа А/И5Ш.a) the production of a virus-containing suspension using a recombinant strain A / A51aiaK0 / 6: 2/2009 obtained in NIIPBB KN MES RK by reverse genetics from the epizootic virus A / s1ysksp / APapa / 6/05 (Η5Ν1) and highly reproductive strain A / RK / 8/34 (Η1Ν1). The vaccine strain was deposited in the collection of microorganisms of NIIPBB KN MON of the Republic of Kazakhstan under No. Μ-12-09 / Ό of 10.19.09 and has an international passport allowing it to be used for the preparation of a pandemic vaccine against influenza A / I5Sh.

б) применения оптимального режима формалиновой инактивации, который осуще ствляется до этапа очистки вируса. Такой метод инактивации вируса с последующей очисткой обеспечивает минимальное содержание остаточного формалина в вакцине,b) application of the optimal regime of formalin inactivation, which is carried out before the stage of virus purification. This method of inactivation of the virus with subsequent purification ensures a minimum residual formalin content in the vaccine,

в) комбинированного метода очистки с сочетанием хроматографической очистки и концентрирования и ультрафильтрацией в тангенциальном потоке с последующей стерилизующей фильтрацией, позволяющей получить антигены вируса с высокой степенью очистки.c) a combined purification method with a combination of chromatographic purification and concentration and ultrafiltration in a tangential flow followed by sterilizing filtration, which allows to obtain virus antigens with a high degree of purification.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.Information confirming the possibility of carrying out the invention.

Далее описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Представленные ниже варианты осуществления описаны в интересах лучшего понимания изобретения, и понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается следующим описанием. Поэтому очевидно, что специалисты в данной области могут модифицировать любой способ осуществления, который целесообразен в пределах объема настоящего изобретения, при рассмотрении представленного здесь описания.The following describes preferred embodiments of the present invention. The following embodiments are described in the interest of a better understanding of the invention, and it is understood that the scope of the present invention is not limited to the following description. Therefore, it is obvious that specialists in this field can modify any method of implementation that is appropriate within the scope of the present invention, when considering the description presented here.

Способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против пандемического гриппа А/И5Ш заключается в том, что рекомбинантный вирус А/А51аиаК0/6:2/2009 культивируют в развивающихся куриных эмбрионах, наработанную вирусную суспензию осветляют (например, через фильтры), инактивируют формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 37±1°С в течение 24 ч, далее при 5±1°С в течение 48 ч, соблюдая режим постоянного перемешивания.The method for producing the inactivated all-virion hydroxide-aluminum vaccine against pandemic influenza A / I5Sh is that the recombinant virus A / A51aiaK0 / 6: 2/2009 is cultivated in developing chicken embryos, the produced virus suspension is clarified (for example, through filters), and formalin is inactivated at a final concentration 0.05% initially at 37 ± 1 ° C for 24 hours, then at 5 ± 1 ° C for 48 hours, observing the constant mixing mode.

Очистку и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводят поэтапно, вначале осветляют путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 2,0/1,2 мкм, после чего подвергаются процессу очистки и концентрирования посредством комплексного метода, включающего ультрафильтрацию/диафильтрацию (20-30-кратное концентрирование, кассеты 300 кД, диализ против 10-ти объемов 1М №С1 в 0,05М фосфатном буфере, рН 7,3) и гельфильтрацию (сефароза СЬ-6В). Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде, объединяют в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов А1+3 1,0 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивают гомогенизатором при 3000 об/мин. Для повышения степени сорбции антигена на гидроокиси алюминия полученную смесь оставляют на 24 ч с постоянным перемешиванием (60-80 об/мин) при температуре 2-8°С. Показатель полноты сорбции антигена на гидроокиси алюминия при соблюдении вышеуказанного режима составления превышает 90%. После окончания срока инкубации смесь фасуют во флаконы нужного объема и контролируют качество на соответствие нормативному документу.Purification and concentration of the inactivated virus suspension is carried out in stages, first clarified by filtration through membrane filters with a pore diameter of 2.0 / 1.2 μm, after which they are subjected to a purification and concentration process using an integrated method including ultrafiltration / diafiltration (20-30 times concentration , 300 kD cassettes, dialysis against 10 volumes of 1M No. C1 in 0.05M phosphate buffer, pH 7.3) and gel filtration (Sepharose C6-6B). Next, the purified viral concentrate in whole form or diluted to vaccine parameters is combined under aseptic conditions with a working solution of aluminum hydroxide (A1 + 3 ion content 1.0 mg / ml) in a 1: 1 ratio, mixed with a homogenizer at 3000 rpm. To increase the degree of sorption of antigen on aluminum hydroxide, the resulting mixture was left for 24 hours with constant stirring (60-80 rpm) at a temperature of 2-8 ° C. The completeness of sorption of antigen on aluminum hydroxide, subject to the above compilation regime, exceeds 90%. After the end of the incubation period, the mixture is Packed in bottles of the right volume and control the quality for compliance with the regulatory document.

Анализ полученных соединений и их специфических свойств осуществляли с использованием электронной микроскопии, что позволило оценить наличие взвеси вирионов в достаточно высокой концентрации, структурно-морфологическую характеристику и степень очистки вакцинного препарата, показать хорошую дисперсность вакцины - вирусные частицы не образуют агрегатов. Доля целых (неразрушенных) частиц составляет более 95%, что свидетельствует о сохранности вирионов. В вакцине нативная антигенная структура вирусных частиц сохраняется.The analysis of the obtained compounds and their specific properties was carried out using electron microscopy, which made it possible to assess the presence of a suspension of virions in a sufficiently high concentration, structural and morphological characteristics and the degree of purification of the vaccine preparation, to show good dispersion of the vaccine - virus particles do not form aggregates. The fraction of whole (undestructed) particles is more than 95%, which indicates the safety of virions. In the vaccine, the native antigenic structure of the viral particles is preserved.

Инактивированная сорбированная на гидроокиси алюминия вакцина из рекомбинантного штаммаInactivated sorbed on aluminum hydroxide vaccine from a recombinant strain

- 3 023361- 3 023361

Л/Л81апаКО/6:2/2009 является жидкой формой и предназначена для парентерального введения (внутримышечно или подкожно). Вводимое количество зависит от подвергаемого профилактике субъекта, в том числе, например, от способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, и если необходимо, продуцировать клеточно-опосредованный иммунный ответ.L / L81apaKO / 6: 2/2009 is a liquid form and is intended for parenteral administration (intramuscularly or subcutaneously). The amount administered depends on the subject being prevented, including, for example, the ability of an individual's immune system to synthesize antibodies and, if necessary, produce a cell-mediated immune response.

Оценка безопасности и иммуногенности вакцины проводилась путем исследования реакции иммунной системы и организма в целом на лабораторных животных и волонтерах.The safety and immunogenicity of the vaccine was assessed by examining the response of the immune system and the body as a whole to laboratory animals and volunteers.

Изобретение выполнимо в условиях научно-производственных объединений при наличии рекомбинантного штамма Л/Л81апаКО/6:2/2009 вируса гриппа, соответствующего технологического оборудования и соблюдении предлагаемого режима приготовления вакцины.The invention is feasible in conditions of scientific and industrial associations in the presence of a recombinant strain L / L81apaKO / 6: 2/2009 of the influenza virus, appropriate technological equipment and compliance with the proposed regimen for the preparation of the vaccine.

Эффективность и воспроизводимость предлагаемого способа получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против пандемического гриппа Α/Η5Ν1 из рекомбинантного штамма А/А81апаК0/6:2/2009 вируса гриппа подтверждена при приготовлении трех экспериментальных серий препарата в НИИПББ КН МОН РК, соответственно составлен и утвержден в установленном порядке отчет о валидации технологического процесса изготовления вакцины (торговое название Ка/Пиуас® Α/Η5Ν1) - гриппозной аллантоисной цельновирионной адсорбированной инактивированной.The effectiveness and reproducibility of the proposed method for the production of inactivated all-virion hydroxide-aluminum vaccine against pandemic influenza Α / Η5Ν1 from the recombinant strain A / A81apaK0 / 6: 2/2009 of the influenza virus was confirmed in the preparation of three experimental series of the drug in NIIPBB KN MES RK, respectively, the procedure was drawn up and approved in accordance with the established procedure Validation report of the vaccine manufacturing process (trade name Ka / Piuas® Α / Η5Ν1) - influenza allantoic whole virion adsorbed -activated.

На базе Национального центра экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники МЗ РК г.Алматы, НИИ гриппа СЗО РАМН г.Санкт-Петербург, Института токсикологии ФМБА г.Санкт-Петербург, Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича г.Москва, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии г.Санкт-Петербург успешно проведены доклинические испытания безопасности и специфической активности экспериментальных серий вакцины Ка/Лиуас®.On the basis of the National Center for Expertise in Medicinal Products, Medical Devices and Medical Equipment of the Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, the Research Institute of Influenza, SZO RAMS, St. Petersburg, the Institute of Toxicology, FMBA of St. Petersburg, the State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Preparations named after L. BUT. Tarasevich of Moscow, St. Petersburg State Chemical Pharmaceutical Academy of St. Petersburg successfully conducted preclinical trials of the safety and specific activity of the experimental Ka / Liuas® vaccine series.

Положительные результаты доклинических исследований вакцины КаШиуас® позволили в дальнейшем провести I и II фазы клинических испытаний безопасности и иммуногенности на добровольцах в возрасте от 18 до 60 лет. Испытания были проведены на клинической базе НИИ гриппа СЗО РАМН и НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.The positive results of preclinical studies of the KaShiuas® vaccine made it possible to conduct phase I and II clinical trials of safety and immunogenicity in volunteers aged 18 to 60 years. Tests were conducted on the clinical basis of the Research Institute of Influenza, SZO RAMS and the Research Institute of Vaccines and Serums named after I.I. Mechnikov RAMS.

Результаты клинических испытаний показали, что препарат обладает выраженной иммуногенностью, соответствующей европейским требованиям СРМР ЕМЕА и критериям Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека МУ 3.33.1758-03, предъявляемым к инактивированным гриппозным вакцинам, а также хорошей переносимостью, низкой реактогенностью и безопасностью.The results of clinical trials showed that the drug has a pronounced immunogenicity that meets the European requirements of the CPEMP EMEA and the criteria of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being MU 3.33.1758-03 for inactivated influenza vaccines, as well as good tolerance and low reactogenicity and security.

Вакцина КаШиуас® получила положительную оценку Национального Консультативного Комитета по иммунизации РК, что послужило основанием для ее регистрации и использования в широкой противоэпидемиологической практике.The KaShiuas® vaccine was positively evaluated by the National Advisory Committee on Immunization of the Republic of Kazakhstan, which served as the basis for its registration and use in wide anti-epidemiological practice.

Примеры использования предложенного способа.Examples of the use of the proposed method.

Далее настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры, при этом примеры приведены лишь для иллюстрации и не имеют в виду ограничение объема иллюстрации. Предполагаются изменения формы и замена элементов на эквиваленты, когда обстоятельства могут предполагать или увеличивать целесообразность. Хотя здесь были использованы специфические термины, они были использованы для целей описания, но не для целей ограничения изобретения.Further, the present invention is described with reference to the following examples, the examples are for illustration only and do not mean limiting the scope of illustration. Changes in form and replacement of elements with equivalents are contemplated, when circumstances may suggest or increase expediency. Although specific terms were used herein, they were used for the purpose of description, but not for the purpose of limiting the invention.

Пример 1. Получение вакцины.Example 1. Obtaining a vaccine.

Рекомбинантный вирус А/А81апаК0/6:2/2009 культивировали в 10-11 суточных куриных эмбрионах при температуре 33±1°С в течение 72 ч, наработанную вирусную суспензию осветляли через предварительные фильтры, инактивировали формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 37±1°С в течение 24 ч, далее при 5±1°С в течение 48 ч, соблюдая режим постоянного перемешивания. Очистку и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводили поэтапно, вначале осветляли через мембранные фильтры с диаметром пор 2,0/1,2 мкм, далее концентрировали на ультрафильтрационной установке Мййроге® РеШсоп®са88ейе ууЧст (20-30-кратное концентри рование, кассеты 300 кД, диализ против 10-ти объемов 1М №С1 в 0,05М фосфатном буфере, рН 7,3) с диафильтрацией. Полученный вирусный концентрат дополнительно очищали с помощью гельфильтрации на колонках с сефарозой СБ-6В и стерилизовали через каскад мембранных фильтров. Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде объединяли в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов А1+3 1 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивали в течение 3 мин при 3000 об/мин гомогенизатором Т25 Ъакю иЬ-ΤΚΑ-ΤϋΚΚΑΧ, 1КА (Германия). Полученную смесь инкубировали в течение 24 ч при постоянном перемешивании (60-80 об/мин) с помощью спиннера ТесЬпе (Франция). После окончания срока инкубации смесь фасовали во флаконы.Recombinant virus A / A81apaK0 / 6: 2/2009 was cultured in 10-11 day old chicken embryos at a temperature of 33 ± 1 ° C for 72 hours, the produced virus suspension was clarified through preliminary filters, inactivated with formalin at a final concentration of 0.05% initially at 37 ± 1 ° С for 24 hours, then at 5 ± 1 ° С for 48 hours, observing the constant mixing mode. The inactivated viral suspension was purified and concentrated in stages, first clarified through membrane filters with a pore diameter of 2.0 / 1.2 μm, then concentrated on an Myuroge® ReShop®s88eye uuChst ultrafiltration unit (20-30-fold concentration, 300 kD cassettes, dialysis against 10 volumes of 1M No. C1 in 0.05M phosphate buffer, pH 7.3) with diafiltration. The resulting viral concentrate was further purified by gel filtration on SB-6B Sepharose columns and sterilized through a cascade of membrane filters. Next, the purified virus concentrate in whole or diluted to vaccine parameters was combined under aseptic conditions with a working solution of aluminum hydroxide (content of ions A1 + 3 1 mg / ml) in a 1: 1 ratio, stirred for 3 min at 3000 rpm with a T25 baku homogenizer b-ΤΚΑ-ΤϋΚΚΑΧ, 1KA (Germany). The resulting mixture was incubated for 24 hours with constant stirring (60-80 rpm) using a Spinner Spinner (France). After the end of the incubation period, the mixture was Packed in bottles.

Пример 2. Готовая форма лекарственного препарата.Example 2. The finished form of the drug.

Вакцинный препарат Ка/Лиуас® является жидкой формой и предназначен для внутримышечного введения. Состав вакцинного препарата Ка/Лиуас® приведен в табл.The vaccine preparation Ka / Liuas® is a liquid form and is intended for intramuscular administration. The composition of the vaccine preparation Ka / Liuas® are given in table.

- 4 023361- 4 023361

ТаблицаTable

Состав вакцинного препарата Ка/Лцуас®The composition of the vaccine Ka / Lzuas®

Компоненты Components Назначение Appointment Концентрация на дозу 0,5 мл Concentration at a dose of 0.5 ml А/А51апаК.С/6:2/2009 A / A51apa.C / 6: 2/2009 Активный ингредиент Active ingredient НА эквивалентный 7,5 мкг ON equivalent 7.5 mcg Гидроокись алюминия Aluminum hydroxide Адьювант Adjuvant 0,25 мг 0.25 mg Мертиолят Merthiolate Консервант Preservative 50 мкг 50 mcg КН2РО4 KN 2 RO 4 Компонент буфера Buffer component 10 тМ 10 tM К2НРО4 K 2 NRA 4 Компонент буфера Buffer component 10 тМ 10 tM ИаС1 IAs1 Компонент буфера Buffer component 150 тМ 150 tm

Препарат выпускают по 2,5 мл (5 доз) во флаконах из нейтрального стекла марки с герметически укупоренными резиновыми пробками и обкатанными металлическими колпачками. Флаконы помещают по 10 штук в коробки из картона коробочного или укладывают непосредственно в групповую коробку или в ящик фанерный посылочный.The drug is released in 2.5 ml (5 doses) in neutral brand glass bottles with hermetically sealed rubber stoppers and rolled-in metal caps. Vials are placed in pieces of 10 in boxes of cardboard boxed or placed directly in a group box or in a plywood parcel box.

Пример 3. Результаты контроля качества экспериментальной серии вакцины Ка/Лиуас®.Example 3. The results of quality control of the experimental series of vaccines Ka / Liuas®.

Описание: прозрачная жидкость с рыхлым осадком. После встряхивания в течение 1-2 мин образовывается гомогенная суспензия беловато-серого цвета.Description: clear liquid with loose sediment. After shaking for 1-2 minutes, a homogeneous suspension of a whitish-gray color forms.

Идентификация: отмечается задержка гемагглютинации в реакции с типоспецифической сывороткой и отсутствует задержка гемагглютинации с сыворотками других типов и подтипов вируса гриппа в РТГА.Identification: there is a delay in hemagglutination in the reaction with type-specific serum and there is no delay in hemagglutination with serums of other types and subtypes of influenza virus in rtga.

Извлекаемый объем: 2,5 мл рН 7,1Recoverable volume: 2.5 ml pH 7.1

Стерильность: стерильнаSterility: sterile

Бактериальные эндотоксины: менее 200 МЕ/млBacterial endotoxins: less than 200 IU / ml

Специфическая активность: весовое содержание гемагглютинина 14,4 мкг/млSpecific activity: weight content of hemagglutinin 14.4 μg / ml

Овальбумин: 0,3 мкг/дозаOvalbumin: 0.3 mcg / dose

Тиомерсал: 99 мкг/млThiomersal: 99 mcg / ml

Алюминий (А1+3): 0,49 мг/млAluminum (A1 + 3 ): 0.49 mg / ml

Формальдегид: менее 0,2 мг/млFormaldehyde: less than 0.2 mg / ml

Специфическая безопасность: живой вирус отсутствуетSpecific safety: no live virus

Пример 4. Доклиническое изучение безопасности и специфической активности вакцины.Example 4. Preclinical study of the safety and specific activity of the vaccine.

Доклиническое изучение безопасности, иммуногенной активности и протективного действия вакцины Ка/Лиуас® проводилось на базе РГП на ПХВ Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники МЗ РК, Научно-исследовательского института гриппа СЗО РАМН (Россия), Института токсикологии ФМБА (Россия), Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича (Россия), Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (Россия). При этом препарат оценивался по следующим параметрам:The preclinical study of the safety, immunogenic activity, and protective effect of the Ka / Liuas® vaccine was carried out on the basis of the RSE at the PCV National Center for the Examination of Medicines, Medical Devices and Medical Equipment of the Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, the Research Institute of Influenza, SZO RAMS (Russia), Institute of Toxicology FMBA ( Russia), State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Preparations named after L.A. Tarasevich (Russia), St. Petersburg State Chemical Pharmaceutical Academy (Russia). In this case, the drug was evaluated according to the following parameters:

острая токсичность;acute toxicity;

подострая токсичность (влияние вакцины на массу тела, потребление корма и воды, на ректальную температуру, двигательную и исследовательскую активность, сердечно-сосудистую деятельность, морфологические показатели периферической крови, биохимические показатели крови белых крыс);subacute toxicity (the effect of the vaccine on body weight, feed and water intake, rectal temperature, motor and research activity, cardiovascular activity, peripheral blood morphological parameters, white rat blood biochemical parameters);

аллергенность (реакция общей анафилаксии, реакция непрямой дегрануляции тучных клеток, реакция иммунных комплексов, конъюнктивальная проба на морских свинках);allergenicity (reaction of general anaphylaxis, reaction of indirect mast cell degranulation, reaction of immune complexes, conjunctival test in guinea pigs);

влияние на иммунную систему (определение фагоцитарной активности макрофагов, определение титра гемагглютининов в сыворотке крови мышей, определение влияния вакцины на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа на мышах, определение числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей);effect on the immune system (determination of macrophage phagocytic activity, determination of hemagglutinin titer in the blood serum of mice, determination of the effect of the vaccine on the severity of the delayed-type hypersensitivity reaction in mice, determination of the number of antibody-forming cells (AOKs) in the spleen of mice);

пирогенность (температурная реакция кроликов на введение полуфабриката вакцины, определение бактериальных эндотоксинов);pyrogenicity (temperature reaction of rabbits to the introduction of a semi-finished vaccine, determination of bacterial endotoxins);

иммуногенность и протективное действие вакцины.immunogenicity and protective effect of the vaccine.

По результатам доклинического изучения безопасности, иммуногенной активности и протективного действия иммунобиологического препарата Ка/Лиуас® можно сделать следующие выводы:Based on the results of a preclinical study of safety, immunogenic activity and protective effect of the Ka / Liuas® immunobiological preparation, the following conclusions can be drawn:

состояние животных после острого введения вакцины свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцин в дозах, превышающих прививочную дозу для человека в десятки раз. Результаты токсикометрии: данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные некропсии позволяют отнести вакцину Ка/Лиуас® к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ;the state of animals after acute administration of the vaccine indicates good tolerance and harmlessness of vaccines in doses exceeding the vaccination dose for humans by tens of times. Toxicometry results: observational data on experimental animals within 14 days after acute administration, as well as necropsy data, make the Ka / Liuas® vaccine class V practically non-toxic drug substances;

применение вакцин внутримышечно в двукратной прививочной дозе у крыс не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцины Ка/Лиуас®;the use of vaccines intramuscularly in a double vaccination dose in rats does not affect the appearance, general condition and behavior of animals, does not adversely affect blood biochemical parameters and basic physiological functions of the body, does not cause pathological changes, which indicates good tolerance and harmlessness of the Ka vaccine / Liuas®;

при внутримышечном введении вакцинного препарата в исследованных дозах ни у одного живот- 5 023361 ного не были выявлены признаки даже умеренного шока. Показано отсутствие аллергенных свойств в непрямой реакции дегрануляции тучных клеток, в реакции иммунных комплексов и в конъюнктивальной пробе на морских свинках. Эти данные позволяют заключить, что вакцина Ка/Лиуас® не обладает аллергенными свойствами;with intramuscular administration of the vaccine in the studied doses, no signs of even moderate shock were detected in any animal. The absence of allergenic properties in the indirect mast cell degranulation reaction, in the reaction of immune complexes and in the conjunctival test in guinea pigs was shown. These data suggest that the Ka / Liuas® vaccine does not have allergenic properties;

проведенные экспериментальные доклинические исследования пирогенности полуфабриката вакцины Ка/Лиуас® показали, что введение препарата не оказывает пирогенного действия на организм теплокровных лабораторных животных;conducted experimental preclinical studies of the pyrogenicity of the semi-finished Ka / Liuas® vaccine showed that the administration of the drug does not have a pyrogenic effect on the body of warm-blooded laboratory animals;

проведенный анализ по определению содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛреактива показал, что концентрация бактериальных эндотоксинов в полуфабрикате вакцины Ка/Лиуас® соответствует 150 ЕЭ/мл (5 ЕЭ/мкг), что в 4 раза меньше расчетного предельного содержания бактериальных эндотоксинов (20 ЕЭ/мкг). При пересчете на вводимую дозу исследуемой вакцины 0,5 мл с содержанием гемагглютинина 15 мкг концентрация бактериальных эндотоксинов составит 36 ЕЭ/0,5 мл (1,2 ЕЭ/мкг);An analysis to determine the content of bacterial endotoxins using the LAL reagent showed that the concentration of bacterial endotoxins in the semi-finished product of the Ka / Liuas® vaccine corresponds to 150 IU / ml (5 IU / μg), which is 4 times less than the calculated maximum content of bacterial endotoxins (20 IU / μg ) When converted to the administered dose of the studied vaccine, 0.5 ml with a hemagglutinin content of 15 μg, the concentration of bacterial endotoxins will be 36 U / 0.5 ml (1.2 U / μg);

все испытанные экспериментальные серии вакцины Ка/Лиуас® после двукратного внутрибрюшинного введения беспородным мышам в дозах 2,5, 5 и 10 мкг ГА на мышь индуцировали выработку антигемагглютинирующих антител в диапазоне от 1:20 до 1:640. Среднегеометрический уровень антител имел дозозависимый характер и зависел от наличия адъюванта в составе вакцинного препарата. Между показателями титров антител, сформировавшихся в результате иммунизации мышей вакциной с антигенной нагрузкой 10, 5 и 2,5 мкг/мышь, достоверные различия выявлены не были (Р>0,05). Исследованный вакцинный препарат Ка/Лиуас® обладал высокой степенью протективной активности, предупреждая при контрольном заражении развитие клинических признаков заболевания, генерализацию инфекционного процесса и гибель привитых животных.all tested experimental Ka / Liuas® vaccine series after double intraperitoneal administration to outbred mice at doses of 2.5, 5, and 10 μg HA per mouse induced the production of antihemagglutinating antibodies in the range from 1:20 to 1: 640. The geometric mean antibody level was dose dependent and depended on the presence of an adjuvant in the vaccine formulation. No significant differences were found between antibody titer values resulting from immunization of mice with a vaccine with an antigen load of 10, 5, and 2.5 μg / mouse (P> 0.05). The studied Ka / Liuas® vaccine preparation possessed a high degree of protective activity, preventing the development of clinical signs of the disease, generalization of the infection process and the death of vaccinated animals during control infection.

Пример 5. Рандомизированное слепое плацебо-контролируемое исследование I фазы по двукратному с увеличением дозы применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Ка/Лиуас®) у добровольцев в возрасте 18-60 лет.Example 5. A randomized, blind, placebo-controlled phase I study of a twice-dose-increasing use of the inactivated whole-virion influenza vaccine with aluminum (Ka / Liuas®) in volunteers aged 18-60 years.

Было проведено рандомизированное слепое плацебо-контролируемое исследование I фазы по двукратному с увеличением дозы применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Ка/Лиуас®) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. Вакцинация добровольцев препаратом Ка/Лиуас® осуществлялась в режиме двух уровней доз (содержание гемагглютинина 7,5 мкг и 15 мкг в дозе). Всего в исследование было включено 34 здоровых добровольца (12 человек для вакцинации вакциной в дозе 7,5 мкг НА, 11 человек - вакциной в дозе 15 мкг НА/дозу), которые методом случайной выборки (метод рандомизации) были распределены в соотношении 2:1 на получающих вакцину или плацебо (11 человек).A randomized, blind, placebo-controlled phase I study was conducted in a two-dose dose of the inactivated whole-virion influenza vaccine with aluminum (Ka / Liuas®) in volunteers aged 18-60 years. Vaccination of volunteers with Ka / Liuas® was carried out in two dose levels (hemagglutinin content of 7.5 μg and 15 μg in the dose). A total of 34 healthy volunteers were included in the study (12 people for vaccination with a dose of 7.5 μg HA, 11 people with a vaccine at a dose of 15 μg HA / dose), which were randomly allocated (randomization method) in a 2: 1 ratio receiving vaccine or placebo (11 people).

Общая продолжительность участия каждого добровольца в исследовании составила 42±3 дня. Исследование включало стадию скрининга, 1 визит исходного уровня (первая вакцинация), визиты 2-7 (наблюдение за добровольцами в течение 6 дней после первой вакцинации), визит 8 (вторая вакцинация), визиты 9-14 (наблюдение за добровольцами в течение 6 дней после второй вакцинации) и окончательный 15 визит на 42-й день исследования. Промежуток между скрининговым визитом и визитом исходного уровня составил не более 14 дней, между исходным визитом и окончательным визитом - 42±3 дня.The total duration of participation of each volunteer in the study was 42 ± 3 days. The study included a screening stage, 1 baseline visit (first vaccination), 2-7 visits (monitoring volunteers for 6 days after the first vaccination), 8 visits (second vaccination), 9-14 visits (monitoring 6 days for volunteers) after the second vaccination) and the final 15 visit on the 42nd day of the study. The interval between the screening visit and the baseline visit was no more than 14 days, between the initial visit and the final visit - 42 ± 3 days.

Результаты - выводы.Results - conclusions.

Безопасность вакцины.Vaccine safety.

В ходе исследования серьезных нежелательных явлений и нежелательных явлений сильной и средней степени выраженности отмечено не было.During the study of serious adverse events and adverse events of strong and moderate severity was not noted.

У добровольцев, привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 и 15 мкг НА, нежелательные явления, связанные с вакцинацией, были представлены местными побочными реакциями слабой степени выраженности (в 95% случаев - боль в месте инъекции), имели транзиторный характер (до 3-х дней) и исчезали без применения лекарственных средств.In volunteers vaccinated with the Ka / Liuas® vaccine at a dose of 7.5 and 15 μg HA, adverse events associated with vaccination were represented by local adverse reactions of mild severity (in 95% of cases, pain at the injection site) had a transient character ( up to 3 days) and disappeared without the use of drugs.

Среди добровольцев, привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 15 мкг НА, была отмечена не требующая применения лекарственных средств одна системная реакция слабой степени выраженности.Among volunteers vaccinated with the Ka / Liuas® vaccine at a dose of 15 μg of HA, one systemic reaction of a low degree of severity was noted that did not require the use of drugs.

Наблюдались дозозависимые различия по частоте возникновения местных поствакцинальных реакций; существенных различий по частоте возникновения НА после первой и после второй вакцинаций отмечено не было.There were dose-dependent differences in the incidence of local post-vaccination reactions; There were no significant differences in the incidence of HA after the first and after the second vaccination.

Отклонений результатов клинико-лабораторных обследований добровольцев на 7-й, 21-й, 28-й и 42й дни исследования от первоначальных показателей зарегистрировано не было вне зависимости от дозы вакцины.Deviations of the results of clinical and laboratory examinations of volunteers on the 7th, 21st, 28th and 42nd days of the study from the initial indicators were not recorded regardless of the dose of the vaccine.

Иммуногенная активность вакцины.Immunogenic activity of the vaccine.

Оценка иммуногенной активности вакцины Ка/Лиуас® при однократном введении по данным РТГА (с лошадиными эритроцитами и обработкой сывороток ΚΌΕ) через 21 день после вакцинации показала, что в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 66,7%; кратность прироста титров антител составила 3,4; уровень серопротекции 16,7%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 16,8. После двух вакцина- 6 023361 ций в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА было отмечено увеличение всех показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность прироста титров антител достигли 28,0 и 5,7 соответственно; уровень серопротекции достиг 66,7%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 75%. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) после первой вакцинации доля лиц с 4кратными сероконверсиями составила 90,9%; кратность прироста титров антител составила 8,0; уровень серопротекции -72,7%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 40,0. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 15 мкг НА также было отмечено увеличение большинства показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность прироста титров антител достигли 54,4 и 10,9 соответственно; уровень серопротекции достиг 90,9%, доля лиц с 4кратными сероконверсиями составила 90,9%.Evaluation of the immunogenic activity of the Ka / Liuas® vaccine with a single administration according to the rtga (with horse red blood cells and serum treatment обработ) 21 days after vaccination showed that in the group of Ka / Liuas® vaccines vaccinated at a dose of 7.5 μg, the proportion of people with 4 multiple seroconversions amounted to 66.7%; the increase in antibody titers was 3.4; seroprotection level 16.7%, geometric mean titers (CHT) of antibodies to the influenza virus Α / Η5Ν1 - 16.8. After two vaccinations - 6 023361 in the group of vaccines vaccinated with Ka / Liuas® at a dose of 7.5 μg HA, an increase in all indicators of the immunogenic activity of the vaccine was noted: GHT and the rate of increase in antibody titers reached 28.0 and 5.7, respectively; the level of seroprotection reached 66.7%, the proportion of people with 4-fold seroconversion was 75%. When using the vaccine in a high dose (15 μg HA) after the first vaccination, the proportion of people with 4-fold seroconversions was 90.9%; the rate of increase in antibody titers was 8.0; seroprotection level -72.7%, geometric mean titers (CHT) of antibodies to the influenza virus Α / Η5Ν1 - 40.0. After two vaccinations in the group of vaccines vaccinated with Ka / Liuas® vaccine at a dose of 15 mcg HA, an increase in most indicators of the immunogenic activity of the vaccine was also noted: GHT and the rate of increase in antibody titers reached 54.4 and 10.9, respectively; the level of seroprotection reached 90.9%, the proportion of people with 4-fold seroconversion was 90.9%.

Оценка иммуногенной активности вакцины по данным РМН показала, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 50%; кратность прироста титров антител составила 4,2; уровень серопротекции - 25%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 25,2. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА СГТ и кратность прироста титров антител достигли 53,4 и 9,0 соответственно; уровень серопротекции составил 50%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями достигла 100%. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) после первой вакцинации доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 72,7%; кратность прироста титров антител составила 9,1; уровень серопротекции - 54,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 54,8. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 15 мкг НА также было отмечено увеличение всех показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность при роста титров антител достигли 117,6 и 18,7 соответственно; уровень серопротекции достиг 90,9%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 100%.Evaluation of the immunogenic activity of the vaccine according to the RMN showed that 21 days after vaccination in the group of vaccines vaccinated with Ka / Liuas® at a dose of 7.5 μg HA, the proportion of people with 4-fold seroconversions was 50%; the increase in antibody titers was 4.2; seroprotection level - 25%, geometric mean titers (CHT) of antibodies to the influenza virus Α / Η5Ν1 - 25.2. After two vaccinations in the group of vaccines vaccinated with Ka / Liuas® at a dose of 7.5 μg, on AHT and the multiplicity of increase in antibody titers reached 53.4 and 9.0, respectively; the level of seroprotection was 50%, the proportion of people with 4-fold seroconversion reached 100%. When using the vaccine in a high dose (15 μg HA) after the first vaccination, the proportion of people with 4-fold seroconversions was 72.7%; the increase in antibody titers was 9.1; the level of seroprotection is 54.5%, the geometric mean titers (CHT) of antibodies to the influenza virus Α / Η5Ν1 is 54.8. After two vaccinations in the group of vaccines vaccinated with Ka / Liuas® vaccine at a dose of 15 μg HA, an increase in all indicators of the immunogenic activity of the vaccine was also noted: GHT and the multiplicity with an increase in antibody titers reached 117.6 and 18.7, respectively; the level of seroprotection reached 90.9%, the proportion of people with 4-fold seroconversion was 100%.

Заключение.Conclusion

Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины Ка/Лиуас® в дозах 7,5 мкг и 15 мкг НА при одно- и двукратной внутримышечной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет свидетельствует о хорошей переносимости, низкой реактогенности и безопасности вакцины. Показана выраженная иммуногенная активность вакцины в обеих дозах в отношении вируса гриппа Α/Η5Ν1 при одно- и двукратном введении. Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение II фазы клинических исследований вакцины Ка/Лиуас® с целью выбора оптимальной дозы препарата (7,5 или 15 мкг гемагглютинина (НА) на 1 человека) при использовании однократной схемы введения вакцины добровольцам в возрасте от 18 до 60 лет.The study of the reactogenicity, safety and immunogenicity of the Ka / Liuas® vaccine in doses of 7.5 μg and 15 μg of HA with single and double intramuscular immunization of volunteers aged 18 to 60 years indicates good tolerability, low reactogenicity and safety of the vaccine. The expressed immunogenic activity of the vaccine in both doses against the influenza virus Α / Η5Ν1 with single and double administration was shown. The results allow us to recommend a phase II clinical study of the Ka / Liuas® vaccine in order to select the optimal dose of the drug (7.5 or 15 μg of hemagglutinin (HA) per 1 person) using a single vaccine administration scheme for volunteers aged 18 to 60 years.

Пример 6. Рандомизированное слепое исследование II фазы по однократному применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Ка/Лиуас®) у добровольцев в возрасте 18-60 лет.Example 6. A randomized, blind, phase II study of a single use of the inactivated whole-virion influenza vaccine with aluminum (Ka / Liuas®) in volunteers aged 18-60 years.

Было проведено рандомизированное слепое исследование II фазы по однократному применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Ка/Лиуас®) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. В исследование были включены только те добровольцы, у которых по данным РТГА выявлены титры антител 1:10 к подтипу вируса гриппа Α/Η5Ν1 и которые по данным ИФА были серонегативны к ВИЧ, гепатиту В и С. Вакцинация добровольцев препаратом Ка/Лиуас® осуществлялась в режиме двух уровней доз (содержание гемагглютинина 7,5 мкг или 15 мкг в дозе). Всего в исследование было включено 80 здоровых добровольцев, которые методом случайной выборки (метод рандомизации) были распределены в соотношении 1:1 (40 человек для вакцинации вакциной в дозе 7,5 мкг НА, 40 человек - вакциной в дозе 15 мкг НА/дозу).A randomized, blind, phase II study was conducted on a single use of the inactivated whole-virion influenza vaccine with aluminum (Ka / Liuas®) in volunteers aged 18-60 years. The study included only those volunteers who, according to rtga, revealed titers of antibodies of 1:10 to the subtype of the influenza virus Α / Η5Ν1 and which according to ELISA were seronegative for HIV, hepatitis B and C. Vaccination of volunteers with Ka / Liuas® was carried out in a regimen of two dose levels (hemagglutinin content of 7.5 micrograms or 15 micrograms per dose). A total of 80 healthy volunteers were included in the study, which were randomly distributed (randomization method) 1: 1 (40 people for vaccination with a vaccine at a dose of 7.5 μg HA, 40 people with a vaccine at a dose of 15 μg HA / dose) .

Введение вакцины производилось в 1-й день исследования. Активное наблюдение за добровольцами проводилось в течение 7 дней после вакцинаций (в день вакцинации и в последующие 6 дней). В дальнейшем, начиная от 7-го (вечер) до 21-го дня исследования (завершение исследования), добровольцы вели дневники самонаблюдения, в которых записывали появление любых симптомов, а также всех принимаемых лекарственных препаратов.The vaccine was administered on the 1st day of the study. Active monitoring of volunteers was carried out within 7 days after vaccination (on the day of vaccination and the next 6 days). Later, from the 7th (evening) to the 21st day of the study (completion of the study), volunteers kept self-observation diaries in which they recorded the appearance of any symptoms, as well as all medications taken.

Результаты.Results.

Реактогенностъ и безопасность.Reactogenicity and safety.

В ходе исследования нежелательных явлений сильной и средней степени выраженности отмечено не было. Местные реакции слабой степени выраженности в виде боли в месте введения вакцины были отмечены в обеих группах у 25 из 80 привитых добровольцев (31%), не сопровождались развитием гиперемии или инфильтратов, имели транзиторный характер (не более 2-х дней) и исчезали без применения лекарственных средств. Различий между группами в частоте возникновения реакций отмечено не было. Системные реакции слабой степени выраженности, не требующие применения лекарственных средств, были отмечены у одного добровольца, привитого вакциной Казфлювак в дозе 7.5 мкг НА, и у двух добровольцев, привитых вакциной в дозе 15 мкг НА. Отклонений результатов клинико-лабораторных обследований добровольцев на 7-й и 21-й дни исследования от первоначальных показателей, включая уровни !βΕ. зарегистрировано не было вне зависимости от дозы вакцины. Не было выявлено негативного влия- 7 023361 ния вакцинации на данные ЭКГ исследования - после вакцинации они оставались на уровне первоначальных значений. Ни в одном случае возникновения нежелательного явления не требовалось проведения дополнительной терапии, ни один из добровольцев не был исключен из исследования в связи с возникновением НЯ. Серьезных нежелательных явлений в ходе исследования отмечено не было.During the study, undesirable phenomena of strong and moderate severity were not noted. Local mild reactions in the form of pain at the injection site were observed in both groups in 25 of 80 vaccinated volunteers (31%), were not accompanied by the development of hyperemia or infiltrates, had a transient character (no more than 2 days), and disappeared without application medicines. There were no differences between groups in the frequency of occurrence of reactions. Mild systemic reactions that do not require the use of drugs were observed in one volunteer vaccinated with Kazfluvac vaccine at a dose of 7.5 μg HA, and in two volunteers vaccinated with a vaccine at a dose of 15 μg HA. Deviations of the results of clinical and laboratory examinations of volunteers on the 7th and 21st days of the study from the initial indicators, including levels! ΒΕ. it was not registered regardless of the dose of the vaccine. No negative impact of vaccination on ECG data was found - after vaccination they remained at the level of the initial values. In no case of the occurrence of an adverse event was it necessary to conduct additional therapy, not one of the volunteers was excluded from the study in connection with the occurrence of AE. No serious adverse events were noted during the study.

Иммуногенностъ.Immunogenicity.

Оценка иммуногенной активности вакцины Ка/Лиуас® при однократном введении по данным РТГА (с лошадиными эритроцитами и обработкой сывороток ΚΌΕ) через 21 день после вакцинации показала, что в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 55%; кратность прироста титров антител составила 3,4; уровень серопротекции 52,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 17,1. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) по данным РТГА наблюдалось увеличение всех изученных показателей: доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 70%; кратность прироста титров антител составила 4,68, уровень серопротекции - 57,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 23,4.Evaluation of the immunogenic activity of the Ka / Liuas® vaccine with a single administration according to the rtga (with horse red blood cells and serum treatment обработ) 21 days after vaccination showed that in the group of Ka / Liuas® vaccines vaccinated at a dose of 7.5 μg, the proportion of people with 4 multiple seroconversions amounted to 55%; the increase in antibody titers was 3.4; seroprotection level 52.5%, geometric mean titers (CHT) of antibodies to the influenza virus Α / Η5Ν1 - 17.1. When using the vaccine in a high dose (15 μg HA) according to RTGA, an increase was observed in all the studied parameters: the proportion of people with 4-fold seroconversions was 70%; the multiplicity of the increase in antibody titers was 4.68, the seroprotection level was 57.5%, and the geometric mean titers (CHT) of antibodies to the Α / Η5Ν1 influenza virus were 23.4.

Результаты, полученные при постановке реакции микронейтрализации (РМН), были сопоставимы с результатами РТГ А и показали, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 55%; кратность прироста титров антител составила 4,2; уровень серопротекции - 40%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 24,2. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) по данных РМН наблюдалось увеличение всех изученных показателей иммуногенной активности вакцины: доля лиц с 4кратными сероконверсиями составила 67,5%; кратность прироста титров антител составила 7,6; уровень серопротекции - 55%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 42,87.The results obtained in the formulation of the microneutralization reaction (PMN) were comparable with the results of RTG A and showed that 21 days after vaccination in the group of vaccines vaccinated with Ka / Liuas® at a dose of 7.5 μg HA, the proportion of people with 4-fold seroconversions was 55 %; the increase in antibody titers was 4.2; seroprotection level - 40%, geometric mean titers (CHT) of antibodies to the influenza virus Α / Η5Ν1 - 24.2. When using the vaccine in a high dose (15 μg HA) according to the RMN, an increase was observed in all studied indicators of the immunogenic activity of the vaccine: the proportion of people with 4-fold seroconversions was 67.5%; the rate of increase in antibody titers was 7.6; the level of seroprotection is 55%, the geometric mean titers (CHT) of antibodies to the influenza virus Α / Η5Ν1 is 42.87.

Оценка выработки антител по данным реакции микронейтрализации к гетерологичному штамму вируса гриппа Α/Η5Ν1 показала, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 35% (14 из 40 человек), а в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 15 мкг НА - 52,5% (21 из 40 человек).Evaluation of antibody production according to the microneutralization reaction to the heterologous strain of influenza virus Α / Η5Ν1 showed that 21 days after vaccination in the group of vaccines vaccinated with Ka / Liuas® at a dose of 7.5 μg, the proportion of people with 4-fold seroconversions was 35% (14 from 40 people), and in the Ka / Liuas® vaccine group at a dose of 15 mcg HA, 52.5% (21 out of 40 people).

Заключение.Conclusion

Изучение иммуногенной активности, реактогенности и безопасности вакцины Ка/Лиуас® в дозах 7,5 мкг и 15 мкг НА при однократной внутримышечной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет свидетельствует о хорошей переносимости, низкой реактогенности и безопасности вакцины, а также достаточной иммуногенной активности вакцины в отношении вируса гриппа Α/Η5Ν1. Полученные результаты позволяют рекомендовать вакцину Ка/Лиуас® в дозе 7.5 мкг НА/дозу для государственной регистрации в качестве профилактического средства защиты населения в возрасте от 18 до 60 лет от гриппа А подтипа в Η5Ν1.A study of the immunogenic activity, reactogenicity and safety of the Ka / Liuas® vaccine in doses of 7.5 μg and 15 μg of HA with a single intramuscular immunization of volunteers aged 18 to 60 years indicates good tolerance, low reactogenicity and safety of the vaccine, as well as sufficient immunogenic activity Α / Η5Ν1 influenza vaccine. The results allow us to recommend the Ka / Liuas® vaccine at a dose of 7.5 μg HA / dose for state registration as a preventive measure to protect populations aged 18 to 60 from influenza A subtype at Η5Ν1.

Claims (1)

Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против гриппа Α/Η5Ν1, включающий культивирование рекомбинантного вируса в куриных эмбрионах, инактивацию осветленной вируссодержащей аллантоисной жидкости формальдегидом, комбинированную схему очистки и концентрирования инактивированного вируса и добавление адъюванта гидроокиси алюминия (А1+3) в концентрации 0,25 мг/мл, отличающийся тем, что используют рекомбинантный штамм Α/Α8ΐаηаΚΟ/6:2/2009, депонированный в коллекции микроорганизмов НИИПББ КН МОН РК под номером Μ-12-09/Ό, который инактивируют до очистки формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 37±1°С в течение 24 ч, далее при 5±1°С в течение 48 ч, очищают и концентрируют с помощью последовательных технологических операций ультра/диафильтрации в тангенциальном потоке, гельфильтрации и стерилизующей фильтрации через каскад мембранных фильтров.A method for producing an inactivated Α / Η5Ν1 influenza vaccine whole-virion adsorbed on aluminum hydroxide, comprising cultivating a recombinant virus in chicken embryos, inactivating a clarified virus-containing allantoic fluid with formaldehyde, a combined scheme for the purification and concentration of an inactivated virus, and adding aluminum hydroxide concentration adjuvant 3 + 1 + hydroxide 3 25 mg / ml, characterized in that they use the recombinant strain Α / Α8ΐаηаΚΟ / 6: 2/2009, deposited in the collection of microorganisms NIIPB KN MON RK under the number Μ-12-09 / Ό, which is inactivated before purification with formalin at a final concentration of 0.05% at first at 37 ± 1 ° C for 24 hours, then at 5 ± 1 ° C for 48 hours, clean and concentrated using sequential technological steps of ultra / diafiltration in a tangential flow, gel filtration and sterilizing filtration through a cascade of membrane filters.
EA201300554A 2013-04-08 2013-04-08 Process for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide sorbed vaccine against a/h5n1 pandemic influenza EA023361B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201300554A EA023361B1 (en) 2013-04-08 2013-04-08 Process for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide sorbed vaccine against a/h5n1 pandemic influenza

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201300554A EA023361B1 (en) 2013-04-08 2013-04-08 Process for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide sorbed vaccine against a/h5n1 pandemic influenza

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300554A1 EA201300554A1 (en) 2014-10-30
EA023361B1 true EA023361B1 (en) 2016-05-31

Family

ID=51794641

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300554A EA023361B1 (en) 2013-04-08 2013-04-08 Process for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide sorbed vaccine against a/h5n1 pandemic influenza

Country Status (1)

Country Link
EA (1) EA023361B1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011074928A1 (en) * 2009-11-18 2011-06-23 "Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан" A recombinant a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d flu virus strain produced by a reverse genetics method from a highly pathogenic donor strain a/chicken/astana/6/05 (h5n1) and a highly reproductive donor strain a/puerto rico/8/34 (h1n1) from the orthomyxoviridae family of the genus influenza virus type a which is deposited in the microorganism collection of the science committee at the ministry of education and science of the republic of kazakhstan state enterprise subsidiary of the scientific research institute for biological safety problems at the republican state enterprise of the national centre for biotechnology of the republic of kazakhstan and can be used in biotechnology for the production of diagnostic and vaccine preparations against a/h5n1 flu

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011074928A1 (en) * 2009-11-18 2011-06-23 "Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан" A recombinant a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d flu virus strain produced by a reverse genetics method from a highly pathogenic donor strain a/chicken/astana/6/05 (h5n1) and a highly reproductive donor strain a/puerto rico/8/34 (h1n1) from the orthomyxoviridae family of the genus influenza virus type a which is deposited in the microorganism collection of the science committee at the ministry of education and science of the republic of kazakhstan state enterprise subsidiary of the scientific research institute for biological safety problems at the republican state enterprise of the national centre for biotechnology of the republic of kazakhstan and can be used in biotechnology for the production of diagnostic and vaccine preparations against a/h5n1 flu

Also Published As

Publication number Publication date
EA201300554A1 (en) 2014-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4522809A (en) Process for obtaining lipid envelope virus sub-units, notably antigens for use as vaccines, the products obtained and their applications
US6048537A (en) Method for preparing an influenza virus, antigens obtained and applications thereof
RU2710239C1 (en) Method of producing antigen or antigens for production of influenza vaccine and a vaccine based on it
CN104888212A (en) Influenza virus subunit vaccine and preparation method thereof
RU2754398C1 (en) Method for obtaining a tetravalent vaccine for the prevention of influenza
KR101518473B1 (en) Immunogloblin y complex composition for vaccinating or curing canine viral infectious diseases and production method thereof
WO2009004641A2 (en) Adaptation of pitman moore strain of rabies virus to primary chick embryo fibroblast cell cultures
CN107537032A (en) A kind of tetravalence influenza virus subunit vaccine and preparation method thereof
CN107537030A (en) A kind of trivalent flu subunit viral vaccine and preparation method thereof
EA023361B1 (en) Process for preparing inactivated intact virion aluminium hydroxide sorbed vaccine against a/h5n1 pandemic influenza
WO2011154976A2 (en) Improved influenza vaccine
US6921543B2 (en) Immunomodulatory preparation
CN109432413A (en) A kind of russian spring-summer encephalitis virus inactivated vaccine and preparation method thereof
US11890338B2 (en) Inactivated whole-virus influenza vaccine and method for preparing same
RU2546861C1 (en) Influenza vaccine
CN1194005C (en) Producing influenza killed vaccine by Sepharose 4FF column chromatography technology
RU2804948C2 (en) Pentavalent subunit vaccine against respiratory infections and method of its preparation
EA043807B1 (en) METHOD FOR OBTAINING ANTIGEN OR ANTIGENS FOR PRODUCTION OF ANTI-FLU VACCINE AND A VACCINE BASED ON IT
EP3017040B1 (en) Method for preparing virosomes
RU2740751C1 (en) Method of producing tetravalent subunit influenza vaccine
JP4642114B2 (en) Precipitated inactivated influenza vaccine and method for producing the same
RU2741003C1 (en) Method for production of tetravalent subunit vaccine against influenza without adjuvants
JP3752264B2 (en) Mixed vaccine
RU2652889C1 (en) Method of manufacturing the vaccine inactivated emulsion against murrain and emulsion inactivated vaccine against murrain
RU2445117C2 (en) Method for preparing combined bivalent, tissue-culture, inactivated, concentrated, purified vaccine for preventing hemorrhagic fever and renal syndrome

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM