EA023361B1 - Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1 - Google Patents
Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1 Download PDFInfo
- Publication number
- EA023361B1 EA023361B1 EA201300554A EA201300554A EA023361B1 EA 023361 B1 EA023361 B1 EA 023361B1 EA 201300554 A EA201300554 A EA 201300554A EA 201300554 A EA201300554 A EA 201300554A EA 023361 B1 EA023361 B1 EA 023361B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vaccine
- influenza
- virus
- dose
- concentration
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против пандемического гриппа A/H5N1 из рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009, полученного методом обратной генетики в НИИПББ КН МОН РК, для разработки пандемической вакцины. Сущность изобретения заключается в том, что для получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа A/H5N1 применяется оптимальный (щадящий) режим инактивации штамма A/AstanaRG/6:2/2009 формалином в концентрации 0,05%, далее очищается и концентрируется при помощи хроматографических и фильтрационных методов и добавляется адъювант - гидроокись алюминия. Изобретение обеспечивает получение пандемической вакцины для профилактики гриппа A/H5N1 с высокой степенью очистки вируса, и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является более технологичным и экономичным.
Description
Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к способу получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа Α/Η5Ν1.
Известен способ приготовления вакцины инактивированной цельновирионной вакцины против пандемического гриппа Α/Η5Ν1 [ИиНей δΟιΚ5 РаГепГ Аррйсайоп РиЬйеайои, РиЬ. иитЬег: υδ 2009/0060950 А1, Вах1ег 1пГегпайопа1 1пс. МеГйой Гог Ргойисйоп Уйа1 Уассшек]. В соответствии с данным способом два диких штамма А/У1еГпат1203/2004 и А/1пйопейа/05/2005 культивируются в перевиваемой культуре клеток Уего (клетки почки африканской зеленой мартышки). Накопленный вирусный материал подвергается инактивации, сначала посредством обработки формалином (в конечной концентрации 0,92 г/л при температуре 32±2°С в течение 24 ч) для обезвреживания внеклеточного вируса, а затем ультрафиолетового облучения (20 циклов со скоростью 240 л с помощью установки УГОЕСО У18А с мощностью ультрафиолетовых ламп 110В), так как в питательной среде культуры клеток Уего имеется много органических компонентов, способных адсорбировать ультрафиолетовые сигналы. Инактивированный вирусный материал далее очищается и концентрируется с помощью изопикнического проточного центрифугирования в линейном градиенте сахарозы (на лабораторной центрифуге КК-6, 35000 об/мин). Полученный при этом пиковый пул вируса для недопущения агрегирования вирусных частиц трижды обрабатывается под высоким давлением (800 бар) на гомогенизаторе Νδ 1001Ь Рапйа (Νί-го δоаνί δ.ρ.Α.). После чего для разрушения клеточной ДНК к гомогенизированной суспензии добавляется бензоназа (нуклеаза) в конечной концентрации 3 ед./мл. Полученная смесь под давлением фильтруется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и инкубируется при 32°С в течение ночи. После окончания времени инкубации суспензия подвергается ультрафильтрации (30 кд, фильтрационная площадь 0,1 м2) и последующей диафильтрации против 10-ти объемов трис-буфера. Далее снова проводится инактивация вируса формальдегидом в конечной концентрации 0,025% при комнатной температуре в течение 24 ч. Остаточное содержание формальдегида также удаляется посредством ультрафильтрации (мембраны с диаметром пор 30 кд) и диафильтрации против 5-ти объемов трис-буфера. Далее проводится микрофильтрация материала через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, при этом вирусный материал предварительно обрабатывается под высоким давлением (800 бар) на гомогенизаторе Νδ 1001Ь Рапйа для уменьшения потери вируса.
Полученный таким образом моновалентный полуфабрикат гриппозной вакцины содержит в среднем 74,6 мкг/мл вирусного гемагглютинина (выход 38%), протеины культуры клеток Уего - 4,7 мкг/мл (уменьшение на 75%), общий белок - 385 мкг/мл (уменьшилось на 50%), клеточное ДНК - 0,27 мкг.
Клинические испытания (ΙΙΙ-фаза) данной вакцины на волонтерах в возрасте от 18 до 60 лет показали ее эффективность в режиме двукратной вакцинации с препаратом, содержащим гемагглютинин 7,5 мкг/доза. При этом процент сероконверсии на 42 сутки после вакцинации составил 73% [Ейгйсй Η4.. Мийег М., Ой Н.М., ТатЬуай Р.А., Фоикйайаг С., МопГотой Е., Р15йег Ό., Веге/ик О., РгйзсЬ δ., Боте Ва5еШ А., Уагйап Ν., ВоЬго\'5ку К., Раν1оνа В.О., РойаЬаиег Е.М., К15Гпег О., Ваггей Р.К; ВахГег Η5Ν1 Рапйетю Iиί1иеиζа Уассше Сйшса1 δΐийу Теат. А сйшса1 1па1 оГ а \у1ю1е-\аги5 Η5Ν1 \'ассте йегАей Ггот се11 сийиге. Ν Еп§1 1 Мей. 2008 1ип 12; 358(24):2573-84].
Необходимо отметить, что данный способ получения вакцины инактивированной цельновирионной вакцины против пандемического гриппа А/Н5Ш с успехом применяется компанией Вах1ег 1п1егпайопа1 1пс. (США), однако следует отметить, что вследствие использования в качестве субстрата для культивирования вирусов гриппа перевиваемой культуры клеток Уего, которая может содержать в себе онкогенные факторы, технологический процесс получения препарата, а именно этап очистки вируса по сравнению с технологиями, основанными на куриных эмбрионах, значительно усложнен. Более того, в процессе производства вирусный материал трижды подвергается этапу инактивации с помощью как химических, так и физических факторов, что безусловно сказывается на иммуногенности конечного препарата. Следует также отметить, что значительной проблемой для производителя является то, что все штаммы, рекомендуемые ВОЗ для производства пандемических гриппозных вакцин, не адаптированы к культурам клеток, вследствие чего выход вируса незначительный. Данное обстоятельство побуждает производителя накапливать непомерно большие объемы вирусного материала. В целом, процесс получения данной вакцины по вышеуказанному способу в технологическом отношении сложен и к тому же весьма дорогостоящий, поскольку для ее производства используются дикие штаммы, требующие обеспечение высокого уровня биологической безопасности на предприятии.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа А/Н5Ш [ИшГей δ!Οθ5 РаГепГ, РаГепГ, № υδ 7316813 В2, διηίΙΙιΚΠικ Веесйат Рйагта ОтЬн & Со КО 1пПиеп/а Уассше Сотро5111оп|, основанный на использовании куриных эмбрионов в качестве субстрата для культивирования вируса гриппа. Согласно данному способу куриные эмбрионы 9-11-суточного возраста заражаются штаммом А/У1еГпат/1194/2004 вируса птичьего гриппа. Инфицированные эмбрионы инкубируются при оптимальной температуре в течение 48-96 ч. По истечении срока инкубации куриные эмбрионы подвергаются умерщвлению путем охлаждения при температуре 2-8°С в течение 12-60 ч и ис- 1 023361 пользуют для сбора аллантоисной жидкости. Очистку вирусной суспензии от куриных белков проводят с помощью последующих технологических операций:
осветление путем низкоскоростного центрифугирования (4000-14000 д);
адсорбция путем добавления в осветленную суспензию геля СаНРО4, содержащего 0,5 моль/л Ыа2НРО4 и 0,5 моль/л СаС12 в конечной концентрации, из расчета от 1,5 до 3,5 г на литр вирусного материала. После 8-часового осаждения сливается надосадочная жидкость, а осадок, содержащий вирусы гриппа, ресуспендируют 0,26 моль/л раствором ΕΩ-ΤΛ-Να2 в зависимости от содержания СаНРО4;
фильтрация ресуспендированного осадка через фильтры с диаметром пор 6 мкм; изопикническое проточное центрифугирование вирусного концентрата в линейном градиенте сахарозы (0,55%), содержащем 100 мкг/мл тиомерсала - 8-15 л в час. К концу центрифугирования содержание ротора с помощью рефрактометра делится на четыре фракции: 1) 55-52% сахарозы; 2) 52-38% сахарозы; 3) 38-20% сахарозы; 4) 20-0% сахарозы. Для приготовления вакцины используются фракции 2 и 3. Фракция 3 для снижения концентрации сахарозы до 6% промывается буферным раствором с помощью диафильтрации. После чего фракции 2 и 3 собираются в один пул, разводятся буферным раствором до получения конечного объема 40 л. Полученный продукт называется моновалентный цельновирионный вирусный концентрат.
Центрифугирование в градиенте сахарозы с диоксихолатом натрия.
Полученный материал снова подвергается проточному центрифугированию в линейном градиенте сахарозы (0,55%), содержащем 0,7-1,5% натрия диоксихолата - 8-15 л в час. Центрифугирование проводится на ультрацентрифуге ΕΝΙ-Магк II (ротор К3). К концу центрифугирования содержание ротора делят на три фракции, при этом фракцию 2 (47-18%) используют для дальнейшей работы.
Стерильная фильтрация.
Материал с расщепленным вирусом фильтруется через мембранные фильтры с диметром пор 0,2 мкм. Перед фильтрованием материал разводится 5-кратно буферным раствором.
Инактивация вируса.
Фильтрованный моновалентный материал инкубируется при температуре 22±2°С в течение 84 ч. Для снижения концентрации общего белка в материале до 250 мкг/мл (максимум) он разводится с фосфатным буфером. Далее в суспензию вносят формальдегид в конечной концентрации 50 мкг/мл, смесь инкубируют при температуре 20±2°С в течение 72 ч.
Ультрафильтрация.
Инактивированный расщепленный вирусный материал концентрируется не менее чем 2 раза на ультрафильтрационной установке с целлюлозно-ацетатными мембранами (20 кД М\УСО). а затем промывается фосфатно-солевым буфером.
Заключительная стерилизующая фильтрация.
Материал после ультрафильтрации фильтруется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. После чего фильтры промываются фосфатно-солевым буферным раствором. Концентрация общего белка в фильтрованном материале не должна превышать 500 мкг/мл. Конечный моновалентный полуфабрикат вакцины хранится при температуре 2-8° С в течение 18 месяцев.
Для приготовления готового препарата расщепленный моновалентный полуфабрикат вакцины объединяется в соотношении 1:1 с адъювантом А1(ОН)3 на буферном растворе [дистиллированная вода - 0,8 л, №С1 - 7,699 г, КС1 - 0,2 г, МдС12х6Н2О - 0.1 г, №2НРО4х12Н2О - 2.6 г, КН2РО4 - 0.373 г] и сорбируется в соответствии с оптимальным режимом.
Полученный таким образом готовый препарат вакцины соответствует следующей спецификации: общий белок <600 мкг/100 мкг НА; овальбумин <2 мкг/100 мкг НА; сахароза <0,4 мг/100 мкг НА; эндотоксин <200 МЕ/100 мкг НА; А1(ОН)3 - 0,38 мг/мл; живой вирус отсутствует; стерильна.
Оценка иммуногенной активности (ΙΙ-фаза клинических испытаний) данной вакцины на волонтерах в возрасте от 18 до 16 лет при двукратном введении показала, что в группе привитых вакциной в дозе 3,8, 7,5, 15,0, 27 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 67, 63, 71, 90% соответственно; кратность прироста титров антител составила 10,5, 9,1, 12,4, 32,4; уровень серопротекции - 69, 63, 71, 90% соответственно [Ьегоих-КоеЦ I., ВегпЬагй К., Оегагй Р., Игате М., Напоп Ε., с1 а1. (2008) Вгоай С1айе 2 Сго88-Кеасйуе 1ттипИу 1пйисей Ьу ап ЛйщуаШей С1айе 1 ιΉ5Ν1 Рапйеш1С 1пГ1иеп/а Уассше. РЬо8 О№ 3(2): е1665. Йо1:10.1371/)оигпа1.ропе.0001665].
Следует отметить, что данный способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа ΑΉ5Ν1 налажен на производственных предприятиях компании ЗтЪЬКИпе ВеесЬат РЬагта ОтЬН & Со КО (Нидерланды) и позволяет получать продукцию, полностью отвечающую требованиям Европейской фармакопеи. Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что технологический процесс производства, а именно этап очистки и концентрирования вируса основан на зональной центрифужной технологии, требующей дорогостоящего оборудования и не менее дешевого обслуживания. Данное обстоятельство является значительным барьером в использовании данной технологии в странах со слаборазвитой экономикой, но не менее остро нуждающихся в качественных противогриппозных вакцинах.
- 2 023361
Сущность изобретения состоит в том, что применяется оптимальный режим инактивации формалином в концентрации 0,05%, проводимой до этапа хроматографической очистки и концентрирования с помощью последовательных технологических операций микрофильтрации, ультра/диафильтрации и гельфильтрации, стерилизующей фильтрации с использованием нового рекомбинантного штамма А/А51аиаКС/6:2/2009, полученного методом обратной генетики в НИИПББ КН МОН РК, что обеспечивает получение антигена с высокой степенью очистки с минимальным содержанием остаточного формалина в препарате для повышения безопасности и иммуногенности приготовляемой пандемической вакцины, полностью соответствующей требованиям Государственной фармакопеи Республики Казахстан и Европейской фармакопеи.
В основу настоящего изобретения положена задача повышения технологичности процесса получения вакцины, расширения технологических возможностей за счет использования более щадящего метода инактивации, повышения производительности метода очистки и концентрирования, повышения безопасности и иммуногенности полученной таким способом вакцины.
Техническим результатом предложенного способа является получение пандемической вакцины для профилактики птичьего гриппа Α/Η5Ν1 с высокой степенью очистки вируса и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является более технологичным и экономичным.
Технический результат достигается за счет
а) наработки вируссодержащей суспензии с использованием рекомбинантного штамма А/А51аиаК0/6:2/2009, полученного в НИИПББ КН МОН РК методом обратной генетики из эпизоотического вируса А/с1йсксп/АПапа/6/05 (Η5Ν1) и высокорепродуктивного штамма А/РК/8/34 (Η1Ν1). Вакцинный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов НИИПББ КН МОН РК под № Μ-12-09/Ό от 19.10.09 г. и имеет паспорт международного образца, позволяющий его использовать для приготовления пандемической вакцины против гриппа А/И5Ш.
б) применения оптимального режима формалиновой инактивации, который осуще ствляется до этапа очистки вируса. Такой метод инактивации вируса с последующей очисткой обеспечивает минимальное содержание остаточного формалина в вакцине,
в) комбинированного метода очистки с сочетанием хроматографической очистки и концентрирования и ультрафильтрацией в тангенциальном потоке с последующей стерилизующей фильтрацией, позволяющей получить антигены вируса с высокой степенью очистки.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Далее описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Представленные ниже варианты осуществления описаны в интересах лучшего понимания изобретения, и понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается следующим описанием. Поэтому очевидно, что специалисты в данной области могут модифицировать любой способ осуществления, который целесообразен в пределах объема настоящего изобретения, при рассмотрении представленного здесь описания.
Способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против пандемического гриппа А/И5Ш заключается в том, что рекомбинантный вирус А/А51аиаК0/6:2/2009 культивируют в развивающихся куриных эмбрионах, наработанную вирусную суспензию осветляют (например, через фильтры), инактивируют формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 37±1°С в течение 24 ч, далее при 5±1°С в течение 48 ч, соблюдая режим постоянного перемешивания.
Очистку и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводят поэтапно, вначале осветляют путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 2,0/1,2 мкм, после чего подвергаются процессу очистки и концентрирования посредством комплексного метода, включающего ультрафильтрацию/диафильтрацию (20-30-кратное концентрирование, кассеты 300 кД, диализ против 10-ти объемов 1М №С1 в 0,05М фосфатном буфере, рН 7,3) и гельфильтрацию (сефароза СЬ-6В). Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде, объединяют в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов А1+3 1,0 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивают гомогенизатором при 3000 об/мин. Для повышения степени сорбции антигена на гидроокиси алюминия полученную смесь оставляют на 24 ч с постоянным перемешиванием (60-80 об/мин) при температуре 2-8°С. Показатель полноты сорбции антигена на гидроокиси алюминия при соблюдении вышеуказанного режима составления превышает 90%. После окончания срока инкубации смесь фасуют во флаконы нужного объема и контролируют качество на соответствие нормативному документу.
Анализ полученных соединений и их специфических свойств осуществляли с использованием электронной микроскопии, что позволило оценить наличие взвеси вирионов в достаточно высокой концентрации, структурно-морфологическую характеристику и степень очистки вакцинного препарата, показать хорошую дисперсность вакцины - вирусные частицы не образуют агрегатов. Доля целых (неразрушенных) частиц составляет более 95%, что свидетельствует о сохранности вирионов. В вакцине нативная антигенная структура вирусных частиц сохраняется.
Инактивированная сорбированная на гидроокиси алюминия вакцина из рекомбинантного штамма
- 3 023361
Л/Л81апаКО/6:2/2009 является жидкой формой и предназначена для парентерального введения (внутримышечно или подкожно). Вводимое количество зависит от подвергаемого профилактике субъекта, в том числе, например, от способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, и если необходимо, продуцировать клеточно-опосредованный иммунный ответ.
Оценка безопасности и иммуногенности вакцины проводилась путем исследования реакции иммунной системы и организма в целом на лабораторных животных и волонтерах.
Изобретение выполнимо в условиях научно-производственных объединений при наличии рекомбинантного штамма Л/Л81апаКО/6:2/2009 вируса гриппа, соответствующего технологического оборудования и соблюдении предлагаемого режима приготовления вакцины.
Эффективность и воспроизводимость предлагаемого способа получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против пандемического гриппа Α/Η5Ν1 из рекомбинантного штамма А/А81апаК0/6:2/2009 вируса гриппа подтверждена при приготовлении трех экспериментальных серий препарата в НИИПББ КН МОН РК, соответственно составлен и утвержден в установленном порядке отчет о валидации технологического процесса изготовления вакцины (торговое название Ка/Пиуас® Α/Η5Ν1) - гриппозной аллантоисной цельновирионной адсорбированной инактивированной.
На базе Национального центра экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники МЗ РК г.Алматы, НИИ гриппа СЗО РАМН г.Санкт-Петербург, Института токсикологии ФМБА г.Санкт-Петербург, Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича г.Москва, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии г.Санкт-Петербург успешно проведены доклинические испытания безопасности и специфической активности экспериментальных серий вакцины Ка/Лиуас®.
Положительные результаты доклинических исследований вакцины КаШиуас® позволили в дальнейшем провести I и II фазы клинических испытаний безопасности и иммуногенности на добровольцах в возрасте от 18 до 60 лет. Испытания были проведены на клинической базе НИИ гриппа СЗО РАМН и НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Результаты клинических испытаний показали, что препарат обладает выраженной иммуногенностью, соответствующей европейским требованиям СРМР ЕМЕА и критериям Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека МУ 3.33.1758-03, предъявляемым к инактивированным гриппозным вакцинам, а также хорошей переносимостью, низкой реактогенностью и безопасностью.
Вакцина КаШиуас® получила положительную оценку Национального Консультативного Комитета по иммунизации РК, что послужило основанием для ее регистрации и использования в широкой противоэпидемиологической практике.
Примеры использования предложенного способа.
Далее настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры, при этом примеры приведены лишь для иллюстрации и не имеют в виду ограничение объема иллюстрации. Предполагаются изменения формы и замена элементов на эквиваленты, когда обстоятельства могут предполагать или увеличивать целесообразность. Хотя здесь были использованы специфические термины, они были использованы для целей описания, но не для целей ограничения изобретения.
Пример 1. Получение вакцины.
Рекомбинантный вирус А/А81апаК0/6:2/2009 культивировали в 10-11 суточных куриных эмбрионах при температуре 33±1°С в течение 72 ч, наработанную вирусную суспензию осветляли через предварительные фильтры, инактивировали формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 37±1°С в течение 24 ч, далее при 5±1°С в течение 48 ч, соблюдая режим постоянного перемешивания. Очистку и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводили поэтапно, вначале осветляли через мембранные фильтры с диаметром пор 2,0/1,2 мкм, далее концентрировали на ультрафильтрационной установке Мййроге® РеШсоп®са88ейе ууЧст (20-30-кратное концентри рование, кассеты 300 кД, диализ против 10-ти объемов 1М №С1 в 0,05М фосфатном буфере, рН 7,3) с диафильтрацией. Полученный вирусный концентрат дополнительно очищали с помощью гельфильтрации на колонках с сефарозой СБ-6В и стерилизовали через каскад мембранных фильтров. Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде объединяли в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов А1+3 1 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивали в течение 3 мин при 3000 об/мин гомогенизатором Т25 Ъакю иЬ-ΤΚΑ-ΤϋΚΚΑΧ, 1КА (Германия). Полученную смесь инкубировали в течение 24 ч при постоянном перемешивании (60-80 об/мин) с помощью спиннера ТесЬпе (Франция). После окончания срока инкубации смесь фасовали во флаконы.
Пример 2. Готовая форма лекарственного препарата.
Вакцинный препарат Ка/Лиуас® является жидкой формой и предназначен для внутримышечного введения. Состав вакцинного препарата Ка/Лиуас® приведен в табл.
- 4 023361
Таблица
Состав вакцинного препарата Ка/Лцуас®
Компоненты | Назначение | Концентрация на дозу 0,5 мл |
А/А51апаК.С/6:2/2009 | Активный ингредиент | НА эквивалентный 7,5 мкг |
Гидроокись алюминия | Адьювант | 0,25 мг |
Мертиолят | Консервант | 50 мкг |
КН2РО4 | Компонент буфера | 10 тМ |
К2НРО4 | Компонент буфера | 10 тМ |
ИаС1 | Компонент буфера | 150 тМ |
Препарат выпускают по 2,5 мл (5 доз) во флаконах из нейтрального стекла марки с герметически укупоренными резиновыми пробками и обкатанными металлическими колпачками. Флаконы помещают по 10 штук в коробки из картона коробочного или укладывают непосредственно в групповую коробку или в ящик фанерный посылочный.
Пример 3. Результаты контроля качества экспериментальной серии вакцины Ка/Лиуас®.
Описание: прозрачная жидкость с рыхлым осадком. После встряхивания в течение 1-2 мин образовывается гомогенная суспензия беловато-серого цвета.
Идентификация: отмечается задержка гемагглютинации в реакции с типоспецифической сывороткой и отсутствует задержка гемагглютинации с сыворотками других типов и подтипов вируса гриппа в РТГА.
Извлекаемый объем: 2,5 мл рН 7,1
Стерильность: стерильна
Бактериальные эндотоксины: менее 200 МЕ/мл
Специфическая активность: весовое содержание гемагглютинина 14,4 мкг/мл
Овальбумин: 0,3 мкг/доза
Тиомерсал: 99 мкг/мл
Алюминий (А1+3): 0,49 мг/мл
Формальдегид: менее 0,2 мг/мл
Специфическая безопасность: живой вирус отсутствует
Пример 4. Доклиническое изучение безопасности и специфической активности вакцины.
Доклиническое изучение безопасности, иммуногенной активности и протективного действия вакцины Ка/Лиуас® проводилось на базе РГП на ПХВ Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники МЗ РК, Научно-исследовательского института гриппа СЗО РАМН (Россия), Института токсикологии ФМБА (Россия), Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича (Россия), Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (Россия). При этом препарат оценивался по следующим параметрам:
острая токсичность;
подострая токсичность (влияние вакцины на массу тела, потребление корма и воды, на ректальную температуру, двигательную и исследовательскую активность, сердечно-сосудистую деятельность, морфологические показатели периферической крови, биохимические показатели крови белых крыс);
аллергенность (реакция общей анафилаксии, реакция непрямой дегрануляции тучных клеток, реакция иммунных комплексов, конъюнктивальная проба на морских свинках);
влияние на иммунную систему (определение фагоцитарной активности макрофагов, определение титра гемагглютининов в сыворотке крови мышей, определение влияния вакцины на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа на мышах, определение числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей);
пирогенность (температурная реакция кроликов на введение полуфабриката вакцины, определение бактериальных эндотоксинов);
иммуногенность и протективное действие вакцины.
По результатам доклинического изучения безопасности, иммуногенной активности и протективного действия иммунобиологического препарата Ка/Лиуас® можно сделать следующие выводы:
состояние животных после острого введения вакцины свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцин в дозах, превышающих прививочную дозу для человека в десятки раз. Результаты токсикометрии: данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные некропсии позволяют отнести вакцину Ка/Лиуас® к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ;
применение вакцин внутримышечно в двукратной прививочной дозе у крыс не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцины Ка/Лиуас®;
при внутримышечном введении вакцинного препарата в исследованных дозах ни у одного живот- 5 023361 ного не были выявлены признаки даже умеренного шока. Показано отсутствие аллергенных свойств в непрямой реакции дегрануляции тучных клеток, в реакции иммунных комплексов и в конъюнктивальной пробе на морских свинках. Эти данные позволяют заключить, что вакцина Ка/Лиуас® не обладает аллергенными свойствами;
проведенные экспериментальные доклинические исследования пирогенности полуфабриката вакцины Ка/Лиуас® показали, что введение препарата не оказывает пирогенного действия на организм теплокровных лабораторных животных;
проведенный анализ по определению содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛреактива показал, что концентрация бактериальных эндотоксинов в полуфабрикате вакцины Ка/Лиуас® соответствует 150 ЕЭ/мл (5 ЕЭ/мкг), что в 4 раза меньше расчетного предельного содержания бактериальных эндотоксинов (20 ЕЭ/мкг). При пересчете на вводимую дозу исследуемой вакцины 0,5 мл с содержанием гемагглютинина 15 мкг концентрация бактериальных эндотоксинов составит 36 ЕЭ/0,5 мл (1,2 ЕЭ/мкг);
все испытанные экспериментальные серии вакцины Ка/Лиуас® после двукратного внутрибрюшинного введения беспородным мышам в дозах 2,5, 5 и 10 мкг ГА на мышь индуцировали выработку антигемагглютинирующих антител в диапазоне от 1:20 до 1:640. Среднегеометрический уровень антител имел дозозависимый характер и зависел от наличия адъюванта в составе вакцинного препарата. Между показателями титров антител, сформировавшихся в результате иммунизации мышей вакциной с антигенной нагрузкой 10, 5 и 2,5 мкг/мышь, достоверные различия выявлены не были (Р>0,05). Исследованный вакцинный препарат Ка/Лиуас® обладал высокой степенью протективной активности, предупреждая при контрольном заражении развитие клинических признаков заболевания, генерализацию инфекционного процесса и гибель привитых животных.
Пример 5. Рандомизированное слепое плацебо-контролируемое исследование I фазы по двукратному с увеличением дозы применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Ка/Лиуас®) у добровольцев в возрасте 18-60 лет.
Было проведено рандомизированное слепое плацебо-контролируемое исследование I фазы по двукратному с увеличением дозы применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Ка/Лиуас®) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. Вакцинация добровольцев препаратом Ка/Лиуас® осуществлялась в режиме двух уровней доз (содержание гемагглютинина 7,5 мкг и 15 мкг в дозе). Всего в исследование было включено 34 здоровых добровольца (12 человек для вакцинации вакциной в дозе 7,5 мкг НА, 11 человек - вакциной в дозе 15 мкг НА/дозу), которые методом случайной выборки (метод рандомизации) были распределены в соотношении 2:1 на получающих вакцину или плацебо (11 человек).
Общая продолжительность участия каждого добровольца в исследовании составила 42±3 дня. Исследование включало стадию скрининга, 1 визит исходного уровня (первая вакцинация), визиты 2-7 (наблюдение за добровольцами в течение 6 дней после первой вакцинации), визит 8 (вторая вакцинация), визиты 9-14 (наблюдение за добровольцами в течение 6 дней после второй вакцинации) и окончательный 15 визит на 42-й день исследования. Промежуток между скрининговым визитом и визитом исходного уровня составил не более 14 дней, между исходным визитом и окончательным визитом - 42±3 дня.
Результаты - выводы.
Безопасность вакцины.
В ходе исследования серьезных нежелательных явлений и нежелательных явлений сильной и средней степени выраженности отмечено не было.
У добровольцев, привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 и 15 мкг НА, нежелательные явления, связанные с вакцинацией, были представлены местными побочными реакциями слабой степени выраженности (в 95% случаев - боль в месте инъекции), имели транзиторный характер (до 3-х дней) и исчезали без применения лекарственных средств.
Среди добровольцев, привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 15 мкг НА, была отмечена не требующая применения лекарственных средств одна системная реакция слабой степени выраженности.
Наблюдались дозозависимые различия по частоте возникновения местных поствакцинальных реакций; существенных различий по частоте возникновения НА после первой и после второй вакцинаций отмечено не было.
Отклонений результатов клинико-лабораторных обследований добровольцев на 7-й, 21-й, 28-й и 42й дни исследования от первоначальных показателей зарегистрировано не было вне зависимости от дозы вакцины.
Иммуногенная активность вакцины.
Оценка иммуногенной активности вакцины Ка/Лиуас® при однократном введении по данным РТГА (с лошадиными эритроцитами и обработкой сывороток ΚΌΕ) через 21 день после вакцинации показала, что в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 66,7%; кратность прироста титров антител составила 3,4; уровень серопротекции 16,7%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 16,8. После двух вакцина- 6 023361 ций в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА было отмечено увеличение всех показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность прироста титров антител достигли 28,0 и 5,7 соответственно; уровень серопротекции достиг 66,7%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 75%. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) после первой вакцинации доля лиц с 4кратными сероконверсиями составила 90,9%; кратность прироста титров антител составила 8,0; уровень серопротекции -72,7%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 40,0. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 15 мкг НА также было отмечено увеличение большинства показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность прироста титров антител достигли 54,4 и 10,9 соответственно; уровень серопротекции достиг 90,9%, доля лиц с 4кратными сероконверсиями составила 90,9%.
Оценка иммуногенной активности вакцины по данным РМН показала, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 50%; кратность прироста титров антител составила 4,2; уровень серопротекции - 25%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 25,2. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА СГТ и кратность прироста титров антител достигли 53,4 и 9,0 соответственно; уровень серопротекции составил 50%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями достигла 100%. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) после первой вакцинации доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 72,7%; кратность прироста титров антител составила 9,1; уровень серопротекции - 54,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 54,8. После двух вакцинаций в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 15 мкг НА также было отмечено увеличение всех показателей иммуногенной активности вакцины: СГТ и кратность при роста титров антител достигли 117,6 и 18,7 соответственно; уровень серопротекции достиг 90,9%, доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 100%.
Заключение.
Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины Ка/Лиуас® в дозах 7,5 мкг и 15 мкг НА при одно- и двукратной внутримышечной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет свидетельствует о хорошей переносимости, низкой реактогенности и безопасности вакцины. Показана выраженная иммуногенная активность вакцины в обеих дозах в отношении вируса гриппа Α/Η5Ν1 при одно- и двукратном введении. Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение II фазы клинических исследований вакцины Ка/Лиуас® с целью выбора оптимальной дозы препарата (7,5 или 15 мкг гемагглютинина (НА) на 1 человека) при использовании однократной схемы введения вакцины добровольцам в возрасте от 18 до 60 лет.
Пример 6. Рандомизированное слепое исследование II фазы по однократному применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Ка/Лиуас®) у добровольцев в возрасте 18-60 лет.
Было проведено рандомизированное слепое исследование II фазы по однократному применению вакцины гриппозной инактивированной цельновирионной с алюминием (Ка/Лиуас®) у добровольцев в возрасте 18-60 лет. В исследование были включены только те добровольцы, у которых по данным РТГА выявлены титры антител 1:10 к подтипу вируса гриппа Α/Η5Ν1 и которые по данным ИФА были серонегативны к ВИЧ, гепатиту В и С. Вакцинация добровольцев препаратом Ка/Лиуас® осуществлялась в режиме двух уровней доз (содержание гемагглютинина 7,5 мкг или 15 мкг в дозе). Всего в исследование было включено 80 здоровых добровольцев, которые методом случайной выборки (метод рандомизации) были распределены в соотношении 1:1 (40 человек для вакцинации вакциной в дозе 7,5 мкг НА, 40 человек - вакциной в дозе 15 мкг НА/дозу).
Введение вакцины производилось в 1-й день исследования. Активное наблюдение за добровольцами проводилось в течение 7 дней после вакцинаций (в день вакцинации и в последующие 6 дней). В дальнейшем, начиная от 7-го (вечер) до 21-го дня исследования (завершение исследования), добровольцы вели дневники самонаблюдения, в которых записывали появление любых симптомов, а также всех принимаемых лекарственных препаратов.
Результаты.
Реактогенностъ и безопасность.
В ходе исследования нежелательных явлений сильной и средней степени выраженности отмечено не было. Местные реакции слабой степени выраженности в виде боли в месте введения вакцины были отмечены в обеих группах у 25 из 80 привитых добровольцев (31%), не сопровождались развитием гиперемии или инфильтратов, имели транзиторный характер (не более 2-х дней) и исчезали без применения лекарственных средств. Различий между группами в частоте возникновения реакций отмечено не было. Системные реакции слабой степени выраженности, не требующие применения лекарственных средств, были отмечены у одного добровольца, привитого вакциной Казфлювак в дозе 7.5 мкг НА, и у двух добровольцев, привитых вакциной в дозе 15 мкг НА. Отклонений результатов клинико-лабораторных обследований добровольцев на 7-й и 21-й дни исследования от первоначальных показателей, включая уровни !βΕ. зарегистрировано не было вне зависимости от дозы вакцины. Не было выявлено негативного влия- 7 023361 ния вакцинации на данные ЭКГ исследования - после вакцинации они оставались на уровне первоначальных значений. Ни в одном случае возникновения нежелательного явления не требовалось проведения дополнительной терапии, ни один из добровольцев не был исключен из исследования в связи с возникновением НЯ. Серьезных нежелательных явлений в ходе исследования отмечено не было.
Иммуногенностъ.
Оценка иммуногенной активности вакцины Ка/Лиуас® при однократном введении по данным РТГА (с лошадиными эритроцитами и обработкой сывороток ΚΌΕ) через 21 день после вакцинации показала, что в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 55%; кратность прироста титров антител составила 3,4; уровень серопротекции 52,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 17,1. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) по данным РТГА наблюдалось увеличение всех изученных показателей: доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 70%; кратность прироста титров антител составила 4,68, уровень серопротекции - 57,5%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 23,4.
Результаты, полученные при постановке реакции микронейтрализации (РМН), были сопоставимы с результатами РТГ А и показали, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 55%; кратность прироста титров антител составила 4,2; уровень серопротекции - 40%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 24,2. При использовании вакцины в высокой дозе (15 мкг НА) по данных РМН наблюдалось увеличение всех изученных показателей иммуногенной активности вакцины: доля лиц с 4кратными сероконверсиями составила 67,5%; кратность прироста титров антител составила 7,6; уровень серопротекции - 55%, среднегеометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа Α/Η5Ν1 - 42,87.
Оценка выработки антител по данным реакции микронейтрализации к гетерологичному штамму вируса гриппа Α/Η5Ν1 показала, что через 21 день после вакцинации в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 7,5 мкг НА доля лиц с 4-кратными сероконверсиями составила 35% (14 из 40 человек), а в группе привитых вакциной Ка/Лиуас® в дозе 15 мкг НА - 52,5% (21 из 40 человек).
Заключение.
Изучение иммуногенной активности, реактогенности и безопасности вакцины Ка/Лиуас® в дозах 7,5 мкг и 15 мкг НА при однократной внутримышечной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет свидетельствует о хорошей переносимости, низкой реактогенности и безопасности вакцины, а также достаточной иммуногенной активности вакцины в отношении вируса гриппа Α/Η5Ν1. Полученные результаты позволяют рекомендовать вакцину Ка/Лиуас® в дозе 7.5 мкг НА/дозу для государственной регистрации в качестве профилактического средства защиты населения в возрасте от 18 до 60 лет от гриппа А подтипа в Η5Ν1.
Claims (1)
- Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против гриппа Α/Η5Ν1, включающий культивирование рекомбинантного вируса в куриных эмбрионах, инактивацию осветленной вируссодержащей аллантоисной жидкости формальдегидом, комбинированную схему очистки и концентрирования инактивированного вируса и добавление адъюванта гидроокиси алюминия (А1+3) в концентрации 0,25 мг/мл, отличающийся тем, что используют рекомбинантный штамм Α/Α8ΐаηаΚΟ/6:2/2009, депонированный в коллекции микроорганизмов НИИПББ КН МОН РК под номером Μ-12-09/Ό, который инактивируют до очистки формалином в конечной концентрации 0,05% вначале при 37±1°С в течение 24 ч, далее при 5±1°С в течение 48 ч, очищают и концентрируют с помощью последовательных технологических операций ультра/диафильтрации в тангенциальном потоке, гельфильтрации и стерилизующей фильтрации через каскад мембранных фильтров.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EA201300554A EA023361B1 (ru) | 2013-04-08 | 2013-04-08 | Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EA201300554A EA023361B1 (ru) | 2013-04-08 | 2013-04-08 | Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201300554A1 EA201300554A1 (ru) | 2014-10-30 |
EA023361B1 true EA023361B1 (ru) | 2016-05-31 |
Family
ID=51794641
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201300554A EA023361B1 (ru) | 2013-04-08 | 2013-04-08 | Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
EA (1) | EA023361B1 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011074928A1 (ru) * | 2009-11-18 | 2011-06-23 | "Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан" | Рекомбинантный штамм a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора а/сhiсkеn/аstаnа/ 6/05 (h5n1) и высокорепродуктивного штамма-донора а/рuеrtо rico/8/34 (h1n1), семейства оrthоmyхоviridае рода influеnzаvirus типа а, депонированный в коллекции микроорганизмов дгп ниипбб ргп нцб pk kh moh pk, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа a/h5n1 |
-
2013
- 2013-04-08 EA EA201300554A patent/EA023361B1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011074928A1 (ru) * | 2009-11-18 | 2011-06-23 | "Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан" | Рекомбинантный штамм a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора а/сhiсkеn/аstаnа/ 6/05 (h5n1) и высокорепродуктивного штамма-донора а/рuеrtо rico/8/34 (h1n1), семейства оrthоmyхоviridае рода influеnzаvirus типа а, депонированный в коллекции микроорганизмов дгп ниипбб ргп нцб pk kh moh pk, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа a/h5n1 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EA201300554A1 (ru) | 2014-10-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4522809A (en) | Process for obtaining lipid envelope virus sub-units, notably antigens for use as vaccines, the products obtained and their applications | |
US6048537A (en) | Method for preparing an influenza virus, antigens obtained and applications thereof | |
RU2710239C1 (ru) | Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе | |
Turmagambetova et al. | Adjuvant activity of saponins from Kazakhstani plants on the immune responses to subunit influenza vaccine | |
CN104888212A (zh) | 一种流感病毒亚单位疫苗及其制备方法 | |
WO2009004641A2 (en) | Adaptation of pitman moore strain of rabies virus to primary chick embryo fibroblast cell cultures | |
CN107537032A (zh) | 一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法 | |
RU2754398C1 (ru) | Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа | |
CN107537030A (zh) | 一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法 | |
EA023361B1 (ru) | Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1 | |
KR101518473B1 (ko) | 애완견의 바이러스성 전염병 예방 및 치료용 복합 난황 항체 조성물 및 그 제조방법 | |
US6921543B2 (en) | Immunomodulatory preparation | |
CN109432413A (zh) | 一种森林脑炎病毒灭活疫苗及其制备方法 | |
US11890338B2 (en) | Inactivated whole-virus influenza vaccine and method for preparing same | |
RU2546861C1 (ru) | Вакцина против гриппа | |
CN1194005C (zh) | 利用Sepharose4FF柱层析技术生产流行性感冒灭活疫苗 | |
RU2804948C2 (ru) | Пентавалентная субъединичная вакцина против респираторных инфекций и способ ее получения | |
EA043807B1 (ru) | Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе | |
EP3017040B1 (en) | Method for preparing virosomes | |
RU2740751C1 (ru) | Способ получения тетравалентной субъединичной противогриппозной вакцины | |
RU2741003C1 (ru) | Способ производства четырехвалентной субъединичной вакцины против гриппа без адъювантов | |
JP3752264B2 (ja) | 混合ワクチン | |
RU2652889C1 (ru) | Способ изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура и вакцина инактивированная эмульсионная против ящура | |
RU2445117C2 (ru) | Способ получения комбинированной бивалентной, культуральной, инактивированной, концентрированной, очищенной вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом | |
RU2279473C1 (ru) | Штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота для изготовления вакцинных и диагностических препаратов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |