WO2011074928A1 - Рекомбинантный штамм a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора а/сhiсkеn/аstаnа/ 6/05 (h5n1) и высокорепродуктивного штамма-донора а/рuеrtо rico/8/34 (h1n1), семейства оrthоmyхоviridае рода influеnzаvirus типа а, депонированный в коллекции микроорганизмов дгп ниипбб ргп нцб pk kh moh pk, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа a/h5n1 - Google Patents

Рекомбинантный штамм a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора а/сhiсkеn/аstаnа/ 6/05 (h5n1) и высокорепродуктивного штамма-донора а/рuеrtо rico/8/34 (h1n1), семейства оrthоmyхоviridае рода influеnzаvirus типа а, депонированный в коллекции микроорганизмов дгп ниипбб ргп нцб pk kh moh pk, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа a/h5n1 Download PDF

Info

Publication number
WO2011074928A1
WO2011074928A1 PCT/KZ2010/000007 KZ2010000007W WO2011074928A1 WO 2011074928 A1 WO2011074928 A1 WO 2011074928A1 KZ 2010000007 W KZ2010000007 W KZ 2010000007W WO 2011074928 A1 WO2011074928 A1 WO 2011074928A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
biotechnology
kazakhstan
republic
flu
Prior art date
Application number
PCT/KZ2010/000007
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Сейдигапбар Мамадалиевич МАМАДАЛИЕВ
Олег Иванович КИСИЛЕВ
Нурлан Тамамбаевич САНДЫБАЕВ
Берик Мухитович ХАЙРУЛЛИН
Людмила Марковна ЦЫБАЛОВА
Михаил Павлович ГРУДИНИН
Мурагбай МАМБЕТАЛИЕВ
Жайлаубай Кыдырбаевич КЫДЫРБАЕВ
Кайсар Казыбаевич ТАБЫНОВ
Виталий Михайлович СТРОЧКОВ
Кайрат Казыбаевич ТАБЫНОВ
Original Assignee
"Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by "Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан" filed Critical "Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан"
Priority to EP10837924.9A priority Critical patent/EP2535405A4/de
Publication of WO2011074928A1 publication Critical patent/WO2011074928A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology, in particular to genetic engineering, and is a constructed i n vitro new topical recombinant strain of influenza virus used for the production of diagnostic and vaccine preparations against influenza A / H5N! .
  • NEBSC code number 05/160 obtained by the reverse genetics method from strains A / Vietnam / 1 1 94/2004 (H5N 1) and A / PR / 8/34 (H 1N1) used to produce the vaccine against influenza A / H5N 1 [John M. Wood, James S. Robertson. Reference viruses for seasonal and pandemic influenza vaccine preparation. Influenza 2007; 1: 5-9.].
  • the disadvantage of this recombinant strain is its highly pathogenic donor strain A / Vietnam / 1 194/2004 (H5N1), which belongs to the 1st clade of the influenza A / H5N 1 virus according to the WHO classification, which is far from the recommended new vaccines candidate strains A / Bar headed goose / Quinghai / l ⁇ / 2005-like virus, A / turkey / Turkey / l / 2005-like virus, A / whooping swan / Mongolia / 244/05-like virus obtained by the reverse genetics method.
  • H5N1 highly pathogenic donor strain A / Vietnam / 1 194/2004
  • H5N1 a recombinant strain of influenza virus A / chicken / Kurgan / 5/05 NS1-81 / 6: 2 (H5N1) [Kiselev O.I., Blinov V.M., Pisareva MM, et. al. Molecular genetic characterization of H5N1 influenza virus strains isolated from poultry in the Kurgan region in 2005 // J. Mol. Biol.
  • the proposed recombinant strain A / AstanaRG / 6: 2/2009 of the influenza virus is different in that it contains a highly reproductive strain of the donor A / Puerto Rico / 8/34 (H 1 N 1), while the prototype used IVR donor strain 1 1 6 (reassortant of A / Puerto Rico / 8/34 and A / New Caledonia / 20/99 viruses).
  • the aim of the present invention was the construction in vitro of a new topical recombinant strain of influenza virus that is closest to the representative strains of Clyde 2.2 recommended by WHO for the production of diagnostic and vaccine preparations against influenza A / H5N 1 virus with low virulence and high reproductive activity feature in the cultivation system.
  • the present invention includes a recombinant strain, the set of essential features of which provides the following technical results.
  • Recombinant strain A / AstanaRG / 6 2/2009 of the influenza virus, obtained by reverse genetics from the highly pathogenic donor strain A / chicken / Astana / 6/05 (H5N 1) and the highly productive donor strain A / Puerto Rico / 8 / 34 (H 1 N 1).
  • the donor strain A / chicken / Astana / 6/05 (H5N 1) was isolated in
  • the highly pathogenic strain A / chicken / Astana / 6/05 (H5N 1) was selected as a donor of hemagglutinin surface proteins (modification of the proteolytic cleavage site) and neuraminidase.
  • the donor strain A / Puerto Rico / 8/34 (H 1 N 1) of the influenza virus is recommended by WHO for the construction of recombinant influenza strains by reverse genetics, as it has high reproductive properties in the cultivation system (chicken embryos).
  • PB2, PB 1, PA, NP, M, and NS were selected as a donor of internal proteins.
  • primers were selected that allowed amplification of the sequence of segments. Initially, the influenza virus cDNA was generated using the universal primer UNI-12.
  • composition of the reaction mixture for operating the complete segments of HA and NA was as follows:
  • the total volume of the reaction mixture was 50 cells.
  • the amplification products were analyzed on a 1% agarose gel on TBE buffer.
  • PCR products obtained using primers having at their 5'-end sites g for restriction enzyme digestion with BsmBl were used.
  • the plasmid pHW2000 and PCR products were cut with this restriction enzyme in order to obtain sticky ends.
  • Ligation was performed using the Quick Link Ligation, Sigma kit according to the manufacturer's instructions.
  • a mixture of ligated plasmids was used to transform competent XL-Blue MRF cells using the heat shock technique, which was carried out at 42 ° C for 45 sec.
  • the resulting mixture of transformed cells was plated on E1tri plates with LB + agapom + ampicillin + I PTG + xGal medium. Incubated overnight at 36 ° C. The selection of transformants was carried out according to the method of "white-blue colonies".
  • pHW2000 is a bidirectional expression plasmid and does not require additional expression plasmids.
  • the obtained plasmids pHW_PB2, pHW PB 1, pHW_PA, pHW_NP, pHW NA, pHW HA, pHW M and pHW NS were transfected into Vero cells (European cell collection - cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK, 1 34 passage, DMEM / F 12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine) using Lipofectamine 2000.
  • a mixture of plasmids was prepared for transfection, which contains 1 ⁇ g of each plasmid with inserts (a total of 8 plasmids) and we added Opti-MEM medium to a final volume of 50 ⁇ l for each transfection DNA.
  • a master mix of Lipofectamine 2000 was prepared. For this, in a 50 ml conical tube we mix 250 ⁇ l of Opti-MEM medium with 12 ⁇ l of Lipofectamine 2000, carefully mix by pipetting and incubate at room temperature for 10 minutes. To each transfection DNA sample, 262 ⁇ l of a mixture of Lipofectamine 2000 with Opti-MEM medium was added. stirred by pipetting and left at room temperature for 30 minutes.
  • Transfected cells were seeded in 6-well plates. 1.2 ml of a resuspended Vero cell culture was added to each plate of the plate and a mixture of DNA with Lipofectamine 2000 (about 320 ⁇ l) was added. The plates were incubated for 8-12 hours at 37 ° C. After 1-6 hours, the medium was carefully removed from each well of the plate, and 1.5 ml of MEM medium and 1.5 ⁇ l of trypsin (1 mg / ml) were added to each well.
  • the recombinant strain A / AstanaRG / 6: 2/2009 of the influenza virus produced plaques on MDCK cells only in the presence of trypsin.
  • the results of this test confirmed the presence of a trypsin-dependent phenotype characteristic of low pathogenic influenza viruses.
  • the virus recovered by two passages on developing chicken SPF embryos is designated as the recombinant strain A / AstanaRG / 6: 2/2009 of the influenza virus. 6. Sequencing of the genes of the recombinant strain A / AstanaRG / 6: 2/2009
  • NA segment completely corresponds to the wild-type sequence of strain A / chicken / Astana / 6/05 (H5Nl).
  • the HA segment has a sequence that coincides with the sequence of the modified segment.
  • a / AstanaRG / 6: 2/2009 on 42-day-old chickens was 0.00.
  • the strain is classified as a low pathogenic variant of the influenza virus, since its IVP is ⁇ 1, 2.
  • the biological activity of the produced recombinant strain A / AstanaRG / 6: 2/2009 after lyophilization with 6.5% peptone at a final concentration was 7.75 lg EID 50 / cm 3 with a hemagglutinating activity of 1: 256
  • a / AstanaRG / 6: 2/2009 influenza virus against bacterial and fungal microorganisms As a result of the screening of the inoculum strain A / AstanaRG / 6: 2/2009, no plasmid DNA was detected.
  • a / AstanaRG / 6: 2/2009 long-term storage of influenza virus For this purpose, the biological activity and hemagglutinating titer of the virus were stored monthly for 6 months. melting at a temperature of minus 20 ° C. It was established that all series of the recombinant strain A / AstanaRG / 6: 2/2009 of the influenza virus retain their initial biological and hemagglutinating activity.
  • the resulting recombinant strain A / AstanaRG / 6: 2/2009 of the influenza virus was deposited in the Microorganism Collection of the Subsidiary State Enterprise of the Research Institute of Biological Safety of the Republican State Enterprise of the National Center for Biotechnology of the Republic of Ukraine Committee of Science of the Ministry of Education and Science of the Republic Ukraine (DGP NIIPBB NTsB RK KN MON RK) with registration number M-1 2-09 / D and is stored in a lyophilized form with a protective environment - 6.5% peptone in a ratio of 1: 1 (pH 7.2-7.6), at minus 40-70 ° ⁇ in ampoules ⁇ -6 under vacuum.
  • the viability of the recombinant strain in a stable state is maintained by annual refreshment in 10-1 1-day-old developing chicken embryos.
  • the activity of the recombinant strain A / AstanaRG / 6: 2/2009 of the influenza virus in serological reactions is 1: 2-1: 4 in the RPD, 1: 60-1: 80 in ⁇ , 1: 1,280 in the ELISA.
  • Fig. 1 Phylogenetic tree according to the gene of HA strains of influenza viruses H5N 1. Phylogenetic analysis was carried out using the “nearest neighbors” method using the nucleotide sequences of the genes of representative clyde 2.2 clones, selected by WHO as promising vaccine candidates (according to sequences deposited in the international GenBank database before 2007).
  • Fig. 3 Alignment of the nucleotide sequences of HA - strains of the influenza virus A7chicken / Astana / 6/05 (H5 l) and A / AstanaRG / 6: 2/2009 of different passive levels

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 M-12-09/D вируса гриппа получен методом обратной генетики из штаммов A/chicken/Astana/6/05 (H5N1) и А/Рuеrtо Rico/8/34 (H1N1) семейства Оrthоmухоviridае рода Influеnzаvirus типа А. Штамм, обладающий низкой вирулентностью и высокой репродуктивной активностью, применяют для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа A/H5N1 Активность рекомбинантного штамма A/AstanaRG/5:3/2009 вируса гриппа в серологических реакциях составляет 1:2-1:4 в РДП, 1:60-1:80 в РТГА и 1:1280 в ИФА.

Description

Рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 M-12-09/D ви- руса гриппа, полученный методом обра гной генетики из высокопатогенного штамма-донора A/chicken/Astana/ 6/05 (H5N1) и высокорепродуктивного штамма-донора A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), семейства Orthomyxoviridae рода Influen- zavirus типа А, депонированный в Коллекции микроорганиз- мов ДГП НИИПББ РГП НЦБ РК КН МОН РК, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вак- цинных препаратов против гриппа A/H5N1 Изобретение относится к области биотехнологии, в частно- сти к генной инженерии, и представляет собой сконструирован- ный in vitro новый актуальный рекомбинантный штамм вируса гриппа, используемый для производства диагностических и вак- цинных препаратов против гриппа A/H5N ! .
Известен рекомбинантный штамм вируса гриппа NIBRG- 14
(NIBSC, code number 05/160) полученный методом обратной ге- нетики из штаммов A/Vietnam/ 1 1 94/2004 (H5N 1 ) и A/PR/8/34 (H 1N1 ) используемый для производства вакцины против гриппа A/H5N 1 [John М. Wood, James S. Robertson. Reference viruses for seasonal and pandemic influenza vaccine preparation. Influenza 2007; 1 : 5-9.]. Недостатком этого рекомбинантного штамма является входящий в его состав высокопатогенный ш тамм-донор А/ Vietnam/ 1 194/2004 (H5N1 ), который относится к 1 клайду ви- руса гриппа A/H5N 1 по классификации ВОЗ являющиеся дале- ким от рекомендованных новых вакцинных штаммов- кандидатов A/Bar headed goose/Quinghai/l Α/2005-like virus, A/turkey/Turkey/l/2005-like virus, A/whooping swan/Mongolia/244/05-like virus полученных методом обратной генетики.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является рекомбинантный штамм вируса гриппа А/курица/Курган/5/05 NS1-81/6:2 (H5N1 ) [Kiselev O.I., Blinov V.M., Pisareva М.М., et. al. Molecular genetic characterization of H5N1 influenza virus strains isolated from poultry in the Kurgan re- gion in 2005 // J. Mol. Biol. (N.Y.) 42 ( 1 ), 70-78 (2008)], получен- ный методом обратной генетики из штаммов А/курица/Курган/5/05 (H5N1 ) и IVR 1 16 (реассортант вирусов A/Puerto Pvico/8/34 и A/New Caledonia/20/99), который относится к клайду 2.2 вируса гриппа A/H5N1 и по классификации ВОЗ близок к рекомендованным новым вакцинным кандида там А/Ваг headed goose/Quinghai/1 Α/2005-like virus, А/turkey/Turkey/ 1 /2005- like virus, A/whooping swan/Mongolia/244/05-like virus полученных методом обратной генетики
(http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/ recom- men dationvaccine.pdf). Недостатки э того ш тамма в цитируемой литературе не указываю тся.
По сравнению с прототипом предлагаемый рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа отличается тем, что в его составе имеется высокорепродуктивный штамм-донор A/Puerto Rico/8/34 (H 1 N 1 ), тогда как в прототипе использован штамм-донор IVR 1 1 6 (реассортант вирусов A/Puerto Rico/8/34 и A/New Caledonia/20/99). Целью настоящего изобретения являлось конструирова- ние in vitro нового актуального рекомбинантного штамма вируса гриппа, наиболее близкого к репрезентативным штаммам клайда 2.2, рекомендованных ВОЗ для производства диагностических и вакцинных препаратов против вируса гриппа A/H5N 1 , обладаю- щего низкой вирулентностью и высокой репродуктивной актив- ностью в системе культивирования.
Предлагаемое изобретение включает рекомбинантный штамм, совокупность существенных признаков которого, обеспе- чивает получение следующих технических результатов.
Рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа, получен методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора A/chicken/Astana/6/05 (H5N 1 ) и высокорепродук- тивного штамма-донора A/Puerto Rico/8/34 (H 1 N 1 ).
Штамм-донор A/chicken/Astana/6/05 (H5N 1 ) был выделен в
Акмолинской области Республики Казахстан в 2005 году и явля- ется высокопатогенным штаммом с антигенной формулой H5N 1 . Филогенетический анализ гемагглютинина показал его принад- лежность к клайду 2.2, представители которого рекомендованы ВОЗ при отборе кандидатов для разработки препандемических вакцин против гриппа A/H5N1 (Приложение А).
В связи с этим высокопатогенный штамм A/chicken/Astana/6/05 (H5N 1 ) был выбран в качестве донора по- верхностных белков гемагглютинина (модификация сайта проте- олитического расщепления) и нейраминидазы. Штамм-донор A/Puerto Rico/8/34 (H 1 N 1 ) вируса гриппа pe- комендован ВОЗ для конструирования рекомбинантных штаммов гриппа методом обратной генетики, так как отличается высокими репродуктивными свойствами в системе культивирования (кури- ные эмбрионы). В связи с этим выбран в качестве донора внут- ренних белков РВ2, РВ 1 , PA, NP, М и NS.
Для конструирования рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа использованы 8 плазмид, ка- ждая из которых содержала один из:
- шести внутренних генов (РВ2, РВ 1 , A, NP, М и NS), полу- ченных от штамма-донора A/Puerto Rico/8/34 (H I N T);
- двух поверхностных белков (НА и NA), полученных от штамма-донора A/chicken/Astana/6/05(H5Nl ).
Конструирование рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа состоит их следующих эта- пов (Приложение Б):
1. Амплификация полноразмерных сегментов НА и NA штам- ма A/chicken/Astana/6/05(H5N l ).
Для получения полноразмерных сегментов гемагглютинина и нейраминидазы были подобраны праймеры, позволяющие ам- плифицировать последовательности сегментов. Первоначально проводили наработку кДНК вируса гриппа с помощью универ- сального праймера UNI- 12.
Состав реакционной смеси для наработки полных сегментов НА и NA был следующий:
Вода - 33,5 мкл 1 Ox буфер - 5 мкл
MgC - 3 мкл
dNTP - 1 мкл
прямой праймер - 2,5 мкл
обратный праймер - 2,5 мкл
Enzyme mix - 0,5 мкл
кДНК - 2 мкл
Общий объем реакционной смеси составлял 50 кл.
Температурно-временной режим амплификации:
94°С - 4 мин
94°С - 20 сек
56°С - 30 сек I 30 циклов
72°С - 4 мин
72°С - 7 мин
Анализ продуктов амплификации проводили в 1 % агарозном геле на буфере ТВЕ.
Так как штамм A/chicken/Astana/6/05 (H5 1 ) является высо- копатогенным и имеет сайт про геолитического расщепления ге- магглютинина с мотивом повторяющихся аминокислот, то необ- ходимо было внести мутацию в этот участок путем удаления это- го мотива RRRK. Кроме того, для предотвращения возможности восстановления мотива повторяющихся основных аминокислот за счет соскальзывания полимеразы, были введены замены G— *Т и К— >Т (Приложение В)
В результате, мотив повторяющихся основных аминокислот высокопатогенного штамма A/chicken/Astana/6/05 (H5N 1 ) был заменен на последовательность TETR/GLF, которая характерна для низкопатогенных штаммов Ы5 вируса гриппа.
2. Клонирование НА, NA, РВ 1 , РВ2, PA, NP, М и NS в плазми- ду pHW2000
Полноразмерные последовательности сегментов НА, NA от штамма A/chicken/Astana/6/05(H5N l ) и сегменты от штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1 ) РВ 1 , PB2, PA, NP, M, NS были клони- рованы в двунаправленную экспрессионную плазмиду pHW2000.
Для клонирования использовали ПЦР-продукты наработан- ные с помощью праймеров, имеющих на своем 5'- конце сай г для расщепления рестриктазой BsmBl. Для клонирования плазмиду pHW2000 и ПЦР-продукты разрезали данной рестриктазой с це- лью получения липких концов. Лигирование проводили с исполь- зованием набора Quick Link Ligation, Sigma, по инструкции изго- товителя.
3. Наработка плазмид
Смесью лигированных плазмид трансформировали компе- тентные клетки XL-Blue MRF с использованием методики "heat- shock", который проводили при 42°С в течение 45 сек.
Полученную смесь трансформированных клеток высевали на чашки Е1етри со средой LB+aгapoм+aмπициллин+I PTG+xGal. Инкубировали в течение ночи при температуре 36°С. Отбор трансформантов проводили по методу "бело-синих колоний".
Отбирали отдельные колонии и пересевали на жидкую среду с ампициллином. Трансформированные бактерии выращивали в течение ночи в небольшом объеме жидкой питательной среды. Во всех случаях бактериальная ростовая среда состояла из пита- тельного бульона LB с ампициллином. Плазмидную ДНК выде- ляли с использованием набора Qiagen plasmid Midi kit.
4. Трансфекция клеток Vero
pHW2000 является двунаправленной экспрессионной плаз- мидой и не требует дополнительных экспрессионных плазмид. Для получения рекомбинантного штамма A/Astana G/6:2/20()9 вируса гриппа наработанные плазмиды pHW_PB2, pHW РВ 1 , pHW_PA, pHW_NP, pHW NA, pHW HA, pHW M и pHW NS трансфецировали в клетки Vero (Европейская коллекция клеточ- ных культур, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Великобритания, 1 34 пассаж, среда DMEM/F 12 с добавлением 1 0% фетальной бычьей сыворотки и 2 mM L-glutamine) с использованием Lipofectamine 2000.
Для трансфекции готовили смесь плазмид, которая содержит по 1 мкг каждой плазмиды со вставками (всего 8 плазмид) и до- бавляем среду Opti-MEM до конечного объема 50 мкл для каждой ДНК трансфекции.
Далее готовили мастер-микс смесь Lipofectamine 2000. Для этого в конической 50 мл пробирке смешиваем 250 мкл среды Opti-MEM с 12 мкл Lipofectamine 2000, ос торожно перемешиваем пипетированием и инкубируем при комнатной температуре в те- чение 10 мин. К каждому образцу ДНК для трансфекции добав- ляли по 262 мкл смеси Lipofectamine 2000 со средой Opti-MEM, перемешивали пипетированием и оставляли при комнатной тем- пературе на 30 мин.
Трансфецированные клетки сеяли в 6-луночные планшеты. В каждую ячейку планшета добавляли по 1 ,25 мл ресуспендиро- ванной культуры клеток Vero и вносили смесь ДНК с Lipofec- tamine 2000 (около 320 мкл). Планшеты инкубировали в течение 8- 12 часов при температуре 37°С. Через 1 6 часов осторожно уби- рали среду из каждой лунки планшета и к каждой лунке добавля- ли по 1 ,5 мл среды MEM и по 1 ,5 мкл трипсина (1 мг/мл).
Через 2 дня после развития цитопатического эффекта соби- рали супернатант и использовали его для проведения теста бляш- кообразования и для заражения куриных эмбрионов.
В тесте бляшкообразования рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6: 2/2009 вируса гриппа продуцировал бляшки на клетках MDCK только в присутствии трипсина. Результаты дан- ного теста подтвердили наличие трипсинозависимого фенотипа, характерного для низкопатогенных вирусов гриппа.
5. Наработка рекомбинантного штамма в развивающихся ку- риных эмбрионах
Культуральным вариантом полученного рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа заражали куриные эмбрионы при температуре инкубирования (33±0,5)°С. Восста- новленный двумя пассажами на развивающихся куриных SPF- эмбрионах вирус обозначен как рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6: 2/2009 вируса гриппа. 6. Секвенирование генов рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009
С целью определения соответствия нуклео гидного сос тава сегментов рекомбинантного штамма к исходному, было проведе- но секвенирование генов НА и NA рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа.
В результате секвенирования и анализа нуклеотидных по- следовательностей было показано, ч то сегмен т NA полностью соответствует последовательности дикого типа штамма A/chicken/Astana/6/05(H5Nl ).
Сегмент НА имеет последовательность, совпадающую с по- следовательностью модифицированног о сегмента.
Для подтверждения стабильности модифицированной после- довательности гена НА было проведено 5 дополнительных пас- сажей рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа на куриных эмбрионах. Секвенирование последователь- ности гена, кодирующего НА подтвердили наличие модификации в сайте расщепления гена гемагглютинина (Приложение Г).
Проведенные исследования показали, что рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа в процессе пассиро- вания (5 пассажей) на куриных эмбрионах проявляет стабильные свойства. Как видно из данных, представленных в приложении Г, нуклеотидные последовательности модифицированного участка гена гемагглютинина, как у исходного рекомбинантного штамма, так и у штамма, прошедшего различные пассажи полностью идентичны. В приложении Г также показано наличие последова- тельности основных аминокислот в сайте разрезания гемагглю- тинина у дикого штамма A/chicken/Astana/6/05(H5Nl ), в то же время отсутствующего у рекомбинантного штамма.
7. Паспортизация рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа
7.1 Проверка безвредности рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009
Безвредность полученного рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа было подтверждено в сле- дующих лабораторных тестах: интравенозный индекс патогенно- сти на цыплятах, в тесте патогенности для белых лабораторных мышей и куриных эмбрионов.
Интравенозный индекс патогенности вируса
A/AstanaRG/6:2/2009 на 42-суточных цыплятах составил 0,00. Штамм отнесен к низкопатогенному вариан ту вируса гриппа, так как его ИВИП составляет <1 ,2.
В тесте патогенности на 2-3 недельных белых мышах было установлено, что рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа апатогенен для белых мышей по сравнению с ис- ходным диким штаммом A/chicken/Astana/06/05 (H5N 1 ).
В тесте патогенности на куриных эмбрионах было показано, что рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа способен расти до высоких титров, не вызывая гибели куриных эмбрионов.
7.2 Антигенный анализ рекомбинантного ш тамма Антигенное анализ рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 с штаммом-донором A/chicken/Astana/6/05 (H5N1 ) подтверждено в ΡΊΤΑ. В результате пос тановки РТГА ус- тановлено, что рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 со- ответствует по антигенной структуре дикого штамма A/chicken/Astana/6/05 (H5N 1 ).
7.3 Определение биологической активности рекомбииантно- го штамма
Биологическая активность наработанного рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6: 2/2009 после лиофилизации с 6,5% пепто- ном в конечной концентрации составила 7,75 lg ЭИД50/см3 с ге- магглютинирующей активностью 1 :256
7.4 Стерильность рекомбинантного штамма
Тесты на бактериальную и грибковую контаминацию пока- зали стерильность рекомбинантного штамма
A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа в отношении бактериальных и грибковых микроорганизмов. В резуль тате проведенного скри- нинга посевного штамма A/AstanaRG/6:2/2009, нал ичие плазмид- ной ДНК не обнаружена.
7.5 Стабильность сохранения основных биологических свойств рекомбинантного штамма
Проверяли стабильность сохранения основных биологиче- ских свойств 3-х серий рекомбинантного ш тамма
A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа при долгосрочном хранении. С этой целью ежемесячно в течение 6 месяцев проверяли биоло- гическую активность и гемагглютинирующий титр вируса, хра- нящего при температуре минус 20°С. Установлено, что все серии рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса грип па сохраняют свою исходную биологическую и гемагглютинирую- щую активность.
Полученный рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа депонирован в Коллекции микроорганизмов До- чернего государственного предприятия Научно- исследовательского института проблем биологической безопас- ности Республиканского государс твенного предприятия Нацио- нального центра биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (ДГП НИИПББ НЦБ РК КН МОН РК) с регистрационным но е- ром M-1 2-09/D и хранится в лиофилизированном виде с защит- ной средой - 6,5% пептон в соотношении 1 : 1 (рН 7,2-7,6), при минус 40-70°С в ампулах ШПБ-6 под вакуумом. Жизнеспособ- ность рекомбинантного штамма в стабильном состоянии поддер- живается путем ежегодного освежения на 10- 1 1 -суточных разви- вающихся куриных эмбрионах. Активность рекомбинантного штамма A/AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа в серологических ре- акциях составляет 1 :2- 1 :4 в РДП, 1 :60- 1 :80 в ΡΊΤΑ, 1 : 1 280 в ИФА. ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение
Figure imgf000015_0001
■A/chicken/NKR/5/05
0.005
Рис.1. Филогенетическое дерево по гену НА штаммов вирусов гриппа H5N 1 . Филогенетический анализ осуществляли методом «ближайших соседей» с использованием нуклеотидных последо- вательностей генов репрезентативных ш таммов клайда 2.2., вы- бранных ВОЗ в качестве перспективных вакцинных кандидатов (по последовательностям, депонированн м в международной ба- зе данных GenBank до 2007 г.).
Приложение Б Схема 1. Получение рекомбинантного штамма
A AstanaRG/6:2/2009 вируса гриппа
Figure imgf000016_0001
1 1риложение В
NTPQGERRRKKRGLFGAI NJPQTET GLFGAI
Рис. 2. Модификация сайта расщепления гемагглютинина
Приложение Г
Figure imgf000018_0001
Рис. 3. Выравнивание ну леотидных последовательностей HA - штаммов ви- руса гриппа A7chicken/Astana/6/05(H5 l ) и A/AstanaRG/6:2/2009 различного пассажного уровня

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 M- 12-09/D ви- руса гриппа, полученный методом обратной генетики из высоко- патогенного штамма- донора A/chicken/Astana/6/05 (H5N 1 ) и вы- сокорепродуктивного штамма-донора A/Puerto Rico/8/34 (H lN l ), семейства Orthomyxoviridae рода Iniluenzavirus типа А, депони- рованный в Коллекции микроорганизмов ДГП ЫИИПББ РГП НЦБ РК КН МОН РК, применяемый в биотехнологии для произ- водства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа A/H5N1 , обладающего низкой вирулентностью и высокой репро- дуктивной активностью в сис теме культивирования.
PCT/KZ2010/000007 2009-11-18 2010-04-23 Рекомбинантный штамм a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора а/сhiсkеn/аstаnа/ 6/05 (h5n1) и высокорепродуктивного штамма-донора а/рuеrtо rico/8/34 (h1n1), семейства оrthоmyхоviridае рода influеnzаvirus типа а, депонированный в коллекции микроорганизмов дгп ниипбб ргп нцб pk kh moh pk, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа a/h5n1 WO2011074928A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10837924.9A EP2535405A4 (de) 2009-11-18 2010-04-23 Durch reverse genetik aus einem hoch pathogenen donatorstrang von a/chicken/astana/6/05 (h5n1) entwickelter rekombinanter a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d-grippevirusstrang und hoch reproduktiver donatorstrang a/puerto rico/8/34 (h1n1) aus der familie orthomyxoviridae des influenza-virus typ a zur aufbewahrung in der mikroorganismensammlung des wissenschaftlichen komitees des ministeriums für erziehung und wissenschaft der republik kasachstan sowie einem staatlichen unternehmen des wissenschaftlichen forschungsinstituts für biologische sicherheitsprobleme

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KZ20091370 2009-11-18
KZ2009/1370.1 2009-11-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011074928A1 true WO2011074928A1 (ru) 2011-06-23

Family

ID=44167504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KZ2010/000007 WO2011074928A1 (ru) 2009-11-18 2010-04-23 Рекомбинантный штамм a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора а/сhiсkеn/аstаnа/ 6/05 (h5n1) и высокорепродуктивного штамма-донора а/рuеrtо rico/8/34 (h1n1), семейства оrthоmyхоviridае рода influеnzаvirus типа а, депонированный в коллекции микроорганизмов дгп ниипбб ргп нцб pk kh moh pk, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа a/h5n1

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP2535405A4 (ru)
WO (1) WO2011074928A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA023361B1 (ru) * 2013-04-08 2016-05-31 Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014200325A2 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 The Republican Government Enterprise On The Basis Of Economic Control Rights "Research Institute For Biological Safety Problems" Of The Sience Committee Of The Ministery Of Education And Science Of The Republic Of Kazakhstan Consortium of the recombinant influenza a viruses flu-ns1-124- l7/l12-h5n1, flu-ns1-124-omp16-h5n1, flu-ns1-124-l7/l12-h1n1 and flu-ns1- 124-omp16-h1n1, family ortomyxoviridae, genus influenzavirus, expressing brucella immunodominant proteins destined to generate a vaccine against brucellosis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2266329C1 (ru) * 2004-03-15 2005-12-20 Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Российской Академии медицинских наук (ГУ НИИЭМ РАМН) Штамм вируса гриппа в/60/гонконг/01/22 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
RU2285723C2 (ru) * 2004-12-23 2006-10-20 ГУ "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" РАМН (ГУ НИИЭМ РАМН) Штамм вируса гриппа а/17/ вайоминг/03/8(h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
RU2361917C1 (ru) * 2008-02-20 2009-07-20 Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Штамм вируса гриппа птиц a/chicken/kurgan/05/2005 субтип h5n1 для изучения активности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2266329C1 (ru) * 2004-03-15 2005-12-20 Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Российской Академии медицинских наук (ГУ НИИЭМ РАМН) Штамм вируса гриппа в/60/гонконг/01/22 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
RU2285723C2 (ru) * 2004-12-23 2006-10-20 ГУ "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" РАМН (ГУ НИИЭМ РАМН) Штамм вируса гриппа а/17/ вайоминг/03/8(h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
RU2361917C1 (ru) * 2008-02-20 2009-07-20 Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Штамм вируса гриппа птиц a/chicken/kurgan/05/2005 субтип h5n1 для изучения активности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INFLUENZA, vol. 1, 2007, pages 5 - 9
KISELEV 0.1.; BLINOV V.M.; PISAREVA M.M.: "Molecular genetic characterization of H5N1 influenza virus strains isolated from poultry in the Kurgan region in 2005", J. MOL. BIOL. (N.Y., vol. 42, no. 1, 2008, pages 70 - 78, XP055068337, DOI: doi:10.1134/S002689330801010X
See also references of EP2535405A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA023361B1 (ru) * 2013-04-08 2016-05-31 Республиканское Государственное Предприятие На Праве Хозяйственного Ведения "Научно-Исследовательский Институт Проблем Биологической Безопасности" Комитета Науки Министерства Образования И Науки Республики Казахстан Способ получения инактивированной цельновирионной сорбированной на гидроокиси алюминия вакцины против пандемического гриппа a/h5n1

Also Published As

Publication number Publication date
EP2535405A1 (de) 2012-12-19
EP2535405A4 (de) 2013-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101272487B1 (ko) 인플루엔자 바이러스의 구제
US11510974B2 (en) Mutant virus, preparation method therefor and application thereof
ES2523587T3 (es) Virus influenza B que tienen alteraciones en el polipéptido hemaglutinina
KR20080024212A (ko) 개의 세포에서 네거티브 센스 바이러스 ｒｎａ를발현시키기 위한 방법 및 조성물
CN102149405A (zh) 流感血凝素和神经氨酸酶变体
JP2007520214A (ja) インフルエンザウイルス作製のための多重プラスミド系
CN108913701B (zh) 一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法
JP2015119730A5 (ru)
Lugovtsev et al. Generation of the influenza B viruses with improved growth phenotype by substitution of specific amino acids of hemagglutinin
US8956626B2 (en) Modified viral strains and method for improving the production of vaccine seeds of influenza virus
JP2018064493A (ja) Ｍｄｃｋ細胞を用いたインフルエンザウイルスの増殖方法
WO2011074928A1 (ru) Рекомбинантный штамм a/astanarg/6:2/2009 m-12-09/d вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора а/сhiсkеn/аstаnа/ 6/05 (h5n1) и высокорепродуктивного штамма-донора а/рuеrtо rico/8/34 (h1n1), семейства оrthоmyхоviridае рода influеnzаvirus типа а, депонированный в коллекции микроорганизмов дгп ниипбб ргп нцб pk kh moh pk, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа a/h5n1
CN110106193B (zh) 一种具有低受体结合活性的高致病性h7n9禽流感病毒抗原及其制备方法
Park et al. Seroprevalence of mumps in healthcare workers in South Korea
CN110520525B (zh) 流感工作病毒种苗与制备、增加其感染力及制备疫苗方法
MX2015001499A (es) Produccion de virus infecciosos de influenza.
CN110106192B (zh) 一种具有低受体结合活性的高致病性h7n9禽流感病毒抗原及其制备方法
WO2011074929A1 (ru) Рекомбинантный штамм a/astanarg/5:3/2009 m-13-09/d вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора а/сhiсkеn/аstаnа/ 6/05 (h5n1) и высокоренродуктивного штамма-донора а/рuеrtо rico/8/34 (h1n1), семейства оrthоmухоviridае рода influеzаvirus типа а, депонированный в коллекции микроорганизмов дгп ниипбб ргп нцб pk kh moh pk, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов прот ив гриппа a/h5n1
KR101426407B1 (ko) 고생산성, 고면역원성, 및 무병원성 인플루엔자 바이러스 제작용 재조합 발현 벡터
Liu et al. Construction and comparison of different source neuraminidase candidate vaccine strains for human infection with Eurasian avian-like influenza H1N1 virus
Said et al. Molecular changes associated with adaptation of equine influenza H3N8 virus in embryonated chicken eggs
WO2010046335A1 (en) Production of influenza virus by reverse genetics in per.c6 cells under serum free conditions
Wysocka et al. Class I H-2d-restricted cytotoxic T lymphocytes recognize the neuraminidase glycoprotein of influenza virus subtype N1
Suphaphiphat et al. Antigenic characterization of influenza viruses produced using synthetic DNA and novel backbones
Wibowo et al. Molecular study on the pathogenicity of Avian Influenza Virus

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10837924

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010837924

Country of ref document: EP