EA023053B1 - Поливалентные антитела - Google Patents

Поливалентные антитела Download PDF

Info

Publication number
EA023053B1
EA023053B1 EA201200725A EA201200725A EA023053B1 EA 023053 B1 EA023053 B1 EA 023053B1 EA 201200725 A EA201200725 A EA 201200725A EA 201200725 A EA201200725 A EA 201200725A EA 023053 B1 EA023053 B1 EA 023053B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fusion protein
present
variable domain
recombinant fusion
cysteine
Prior art date
Application number
EA201200725A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201200725A1 (ru
Inventor
Дейвид Пол Хамфрис
Сэм Филип Хейвуд
Аластэр Дейвид Гриффитс Лосон
Original Assignee
Юсб Фарма С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Юсб Фарма С.А. filed Critical Юсб Фарма С.А.
Publication of EA201200725A1 publication Critical patent/EA201200725A1/ru
Publication of EA023053B1 publication Critical patent/EA023053B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

В изобретении описан гибридный белок поливалентного антитела, включающий тяжелую цепь, содержащую последовательно с N-конца вариабельный домен номинально V1, область C1 и дополнительный вариабельный домен номинально V2, легкую цепь, включающую последовательно с N-конца вариабельный домен номинально V1, домен CL и вариабельный домен номинально V2, причем указанные тяжелую и легкую цепи выравнивают для обеспечения первого сайта связывания, сформированного первой вариабельной доменной парой V1 и V1, и второго сайта связывания, сформированного второй вариабельной доменной парой V2 и V2, причем имеется дисульфидная связь внутри вариабельной доменной пары, формирующей сайт связывания, и указанный гибридный белок конъюгирован с полимером ПЭГ.

Description

Изобретение относится к антителам с двумя сайтами связывания антигена, в которых, например, стерическое препятствие вокруг каждого сайта минимизировано таким образом, что на сродство к антигену-мишени или антигенам-мишеням формат не оказывает вредного воздействия.
Поливалентные антитела известны. Однако даже несмотря на то, что основная концепция была разработана несколько лет назад, имелись практические препятствия, связанные с применением данной технологии, и поэтому она не получила широкого применения в разработке способов получения фармацевтических биологических продуктов.
Неприродные/ненативные форматы антител могут быть сложны для экспрессии, и может быть существенно повышена цена продуктов до неприемлемого уровня. Такие форматы могут повысить иммуногенность или понизить стабильность ίη νίνο по сравнению со стандартным антителом или фрагментом и/или могут проявлять нежелательную фармакокинетику.
В частности проблемы, связанные с получением гомогенных продуктов, касались неприродных форматов. Например, если имеется одна перестановка в комбинировании мономерных компонентов, в результате могут сформироваться смеси. Таким образом, могут потребоваться тщательно разработанные способы очистки для выделения требуемых/целевых продуктов с удовлетворительными уровнями очистки.
Исследования велись в разных направлениях, например, используя короткие линкеры при получении биспецифических антител, при этом добиваясь соответствующей димеризации. Однако установлено, что ориентация вариабельных доменов может влиять на экспрессию формата и формирование сайтов активного связывания.
Один из подходов к осуществлению сборки в требуемом положении или ориентации называется методом выступ-во-впадину, по которому крупная впадина интродуцируется в домен УН, например, в некоторых антителах, заменяя валин 137 на крупный остаток фенилаланин и замещая лейцин 45 на триптофан. Комплементарная впадина может быть интродуцирована, например, в домен УЬ, в некоторых антителах, за счет мутации фенилаланина 98, а именно его замещения на метионин, и триптофана 87 на аланин. Однако сниженное антигенсвязывающее действие наблюдают для некоторых конструкций.
В настоящем изобретении положение СЬ в легкой цепи и СН1 в тяжелой цепи обеспечивает правильную ориентацию цепей.
Таким образом, предусматривают рекомбинантный гибридный белок, включающий тяжелую цепь, включающую последовательно с Ν-конца вариабельный домен номинально УН1, область СН1 и дополнительный вариабельный домен номинально УН2, легкую цепь, включающую последовательно с Ν-конца вариабельный домен номинально Уь1, домен СЬ и вариабельный домен номинально Уъ2, причем указанные тяжелую и легкую цепи выравнивают для обеспечения первого сайта связывания, сформированного первой вариабельной доменной парой УН1 и Уъ1, и второго сайта связывания, сформированного второй вариабельной доменной парой УН2 и Уъ2, причем имеется дисульфидная связь внутри вариабельной доменной пары, формирующей сайт связывания, например, между УН1 и УЪ1 и/или УН2 и Уъ2, и указанный гибридный белок конъюгирован с полимером ПЭГ.
Рекомбинантный гибридный белок, предусмотренный в настоящем изобретении, также преимущественно обладает периодом полураспада, сходным с периодом полураспада целого антитела, и, следовательно, предположительно применим для лечения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает различные форматы гибридных антител по настоящему описанию; фиг. 2А - различные форматы известных фрагментов антител;
фиг. 2Б - одну возможную сборку для димерного формата по настоящему изобретению;
фиг. 3 - аминокислотную последовательность легкой цепи для антитела 4Ό5;
фиг. 4 - аминокислотную последовательность тяжелой цепи для антитела 4Ό5;
фиг. 5 - конструкцию А26РаЬ-(3хС48)-б5Рг645 с положениями мутаций Су8 на поверхности, отмеченными жирным шрифтом;
фиг. 6 - невосстановленный гель ПЭГелированных мутантов А26РаЬ-(3хС48)-05ру645. 8182 и 8163.
Тяжелая цепь, применяемая в настоящем изобретении, является цепью, которая включает домен
СН1.
Обычно тяжелая цепь не включает фрагмент Ре, т.е. фрагмент СН2 и/или СН3.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь включает только один домен СН1.
УН1 и УН2, применяемые в настоящем изобретении, предназначены для ссылки на то обстоятельство, что вариабельные области локализованы в тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению. Это само по себе не свидетельствует о происхождении вариабельной области как таковой.
УЬ1 и Уъ2, применяемые в настоящем изобретении, предназначены для ссылки на то обстоятельство, что вариабельные области локализованы в легкой цепи антитела по настоящему изобретению. Это само по себе не свидетельствует о происхождении вариабельной области как таковой.
Легкая цепь, применяемая в настоящем изобретении, включает домен СЬ. В одном из вариантов
- 1 023053 осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает только один домен СЬ.
Сборка по настоящему изобретению СЬ в качестве фрагмента константной области в легкой цепи и домена СН1 в качестве фрагмента константной области в тяжелой цепи предположительно минимизирует несоответствующую димеризацию.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему описанию включает шарнир, например, в качестве линкера, к вариабельному домену.
Шарнир может быть присоединен к С-концу домена СН1 в соответствующем положении, установленном в антителе полной длины, и может формировать связь между СН1 и УН2. В таком варианте осуществления настоящего изобретения линкер также может быть предусмотрен в легкой цепи таким образом, что Уь2 соответствующим образом помещен в пару с УН2 в тяжелой цепи. Линкер, применяемый в легкой цепи, может быть идентичным, сходным или полностью отличным от шарнирного линкера, применяемого в тяжелой цепи.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает шарнир, например, присоединенный к С-концу домена СЬ, и связывающий домен СЬ с V,,2. В этом варианте осуществления настоящего изобретения линкер может потребоваться в тяжелой цепи для того, чтобы обеспечить соответствующим доменам ν72 и Уф2 соответствующее спаривание для формирования активного сайта. Линкер в тяжелой цепи может быть идентичным, сходным или полностью отличным от линкера, применяемого в легкой цепи.
Примеры соответствующих шарниров приведены ниже.
Вариабельные домены предусмотрены в каждой цепи таким образом, что они заранее формируют определенные пары с соответствующим/должным связыванием с антигеном-мишенью.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара обладает сродством в отношении антигена-мишени, составляющим 100 нм или менее, например 50 нм или менее, в особенности 1 нм или менее.
Соответствующие вариабельные доменные пары могут быть идентифицированы с помощью какихлибо возможных средств, например, включая выработку антител у хозяев, с последующим скринингом В-клеток. Другие соответствующие пары могут быть идентифицированы с помощью фагового дисплея.
Методы фагового дисплея известны в данной области и включают методы, описанные Вппктап и др., 1. 1ттипо1. Мебюбк. 182, 1995, сс. 41-50; Атек и др., I. 1ттипо1. Мебюбк. 184, 1995, сс. 177-186; Ке1беЬогоидб и др. Еиг. I. 1ттипо1., 24, 1994, сс. 952-958; Ретыс и др., Оепе, 187, 1997, сс. 9-18; Вибоп и др., Абуапсек т 1ттипо1оду, 57, 1994, сс. 191-280; АО 90/02809; АО 91/10737; АО 92/01047; АО 92/18619; АО 93/11236; АО 95/15982; АО 95/20401; И8 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908;5516637;5780225;5658727;5733743;5969108.
Трансгенные мыши или другие организмы, включая других млекопитающих, могут применяться для выработки гуманизированных антител.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельной доменной парой (или каждой вариабельной доменной парой) является родственная пара.
Понятие родственной пары, применяемое в настоящем изобретении, относится к природной паре вариабельных доменов, т.е. выделенных из одного антитела или из клеток, экспрессирующих антитело.
В одном из примеров родственной парой является комплементарная пара νΉ/νΈ, которая связывает антиген совместно, т.е. они составляют комплементарную пару ν^νΗ
Обычно родственной парой может быть пара ν^νΕ производная от того же антитела.
В одном из примеров родственной парой является пара вариабельных доменов, выделенных в качестве пары из библиотеки пар, например библиотеки фагового дисплея ЬаЬ.
В одном примере пара ν^νΣ является моноспецифической.
Названия первого и второго сайтов связывания приводятся условно (относительно друг друга) и номинальные метки приводят для сайтов связывания для того, чтобы отличать один от другого. Если один сайт связывания обозначен первым, другой считается вторым.
Первая и вторая родственные пары также метятся относительно друг друга, чтобы номинально различать эти пары. Пара, которая в настоящем изобретении обозначается первой парой, не определяется по положению в молекуле.
Вариабельные домены могут быть оптимизированы и/или гуманизированы. Оптимизированные/гуманизированные вариабельные домены, происходящие от родственной пары, по-прежнему могут рассматриваться в качестве родственной пары после оптимизации/гуманизирования.
В контексте настоящего изобретения СЬ обозначает часть константной области в легкой цепи, которая может быть природной константной областью легкой цепи.
Каждый вариабельный домен может прямо соединяться через линкер с константным доменом в значимой цепи.
В контексте настоящего изобретения понятие непосредственно связанный с относится к непрерывной аминокислотной последовательности, которая не прерывается, т.е. связана непосредственно через пептидную связь, например, непосредственно с последовательностью вариабельного домена, или, наоборот, фрагмент константной области не соединяется через линкер. Инсерция неприродного пептид- 2 023053 ного линкера в аминокислотную последовательность разрывает последовательность, и таким образом последовательность, содержащая неприродный пептидный линкер, не рассматривается в качестве гибридизированной со значимыми частями непосредственно, что соответствует настоящему описанию. Добавление природного пептидного линкера также может рассматриваться в качестве прерывания аминокислотной последовательности, она не может считаться частью последовательности одного или нескольких значимых компонентов, например, вариабельного домена или фрагмента константной области (например, домена СЬ или домена Сн1).
νΗ1 обычно может быть соединен непосредственно с Сн1.
УЬ1 обычно может быть соединен непосредственно с СЬ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ун1 Сн1 и УД СЬ вместе формируют РаЬ или РаЬ'.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислота в νΗ2 (например, с его Ν-конца) непосредственно связана с аминокислотой в Сн1 пептидной связью (например, с С-конца Сн1 ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислота в Ун2 (например, с его Ν-конца) опосредованно связана с Сн1 линкером (например, с С-конца фрагмента Сн1).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислота в домене УД (например, с его Ν-конца) непосредственно связана с аминокислотой в СЬ пептидной связью (например, с Сконца СЬ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислота в домене УД (например, с его Ν-конца) опосредованно связана с СЬ линкером (например, с С-конца СЬ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Ун1 в тяжелой цепи является вариабельным доменом из тяжелой цепи. Т.е. этот домен происходит от тяжелой цепи природного антитела или его значимого фрагмента или происходит от другого источника, например фагового дисплея, и обладает свойствами вариабельного домена, производного от тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Ун1 в тяжелой цепи является вариабельным доменом из легкой цепи. Т.е. этот домен происходит от легкой цепи природного антитела или его значимого фрагмента или происходит от другого источника, например, фагового дисплея, и обладает свойствами вариабельного домена, производного от легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ун2 в тяжелой цепи является вариабельным доменом из тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ун2 в тяжелой цепи является вариабельным доменом из легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УД в легкой цепи является вариабельным доменом из тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УД в легкой цепи является вариабельным доменом из легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УД в легкой цепи является вариабельным доменом из тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УД в легкой цепи является вариабельным доменом из легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ун1 является вариабельным доменом из легкой цепи, и Ун2 является вариабельным доменом из легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ун1 является вариабельным доменом из тяжелой цепи, и Ун2 является вариабельным доменом из тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ун1 является вариабельным доменом из легкой цепи, и Ун2 является вариабельным доменом из тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ун1 является вариабельным доменом из тяжелой цепи, и Ун2 является вариабельным доменом из легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УД является вариабельным доменом из легкой цепи, и УД является вариабельным доменом из легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УЬ1 является вариабельным доменом из тяжелой цепи, и УД является вариабельным доменом из тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УД является вариабельным доменом из легкой цепи, и УД является вариабельным доменом из тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УЬ1 является вариабельным доменом из тяжелой цепи, и УД является вариабельным доменом из легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая вариабельная доменная пара связывает тот же эпитоп, что и вторая вариабельная доменная пара.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему изобретению активно связывает антиген-мишень.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая вариабельная доменная пара связывает тот же антиген, что и вторая вариабельная доменная пара, например, первая вариабельная до- 3 023053 менная пара и вторая вариабельная доменная пара связывают разные эпитопы на одном антигене.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему описанию является моноспецифическим. Понятие моноспецифичности в настоящем изобретении относится к тому обстоятельству, что все сайты связывания связывают один и тот же антигенмишень.
В одном из объектов настоящего изобретения все сайты связывания связывают один и тот же эпитоп (эпитопы) указанного антигена.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере два сайта связывания связывают разные эпитопы на антигене-мишени.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая вариабельная доменная пара связывает другой/отличный антиген относительно второй вариабельной доменной пары.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему описанию является биспецифическим, например два сайта связывания специфически связывают разные или отличающиеся антигена.
В контексте настоящего изобретения понятие специфического связывания относится к антителам, обладающим высоким сродством в отношении антигена-мишени (т.е. антигенов, в отношении которых антитела специфичны), которые связывают антигены, в отношении которых они неспецифичны на низком уровне или с намного меньшим сродством (или совсем не связывают). Методы измерения сродства известны специалистам в данной области, и к ним относится, например, метод В1Асоге.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельные домены по меньшей мере одной вариабельной доменной пары, например родственной пары, связаны дисульфидной связью.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения имеется дисульфидная связь между вариабельными доменами, которые формируют первый сайт связывания, например, в первой родственной паре.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения имеется дисульфидная связь между вариабельными доменами, которые формируют второй сайт связывания, например, во второй родственной паре.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения имеется дисульфидная связь между УЬ1 и νΗ1, например, при отсутствии дисульфидной связи между Уъ2 и νΗ2.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения имеется дисульфидная связь между V! 2 и νΗ2, например, при отсутствии дисульфидной связи между ν22 и ν22.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения имеется дисульфидная связь между вариабельными доменами, которые формируют первый сайт связывания, и дополнительно имеется дисульфидная связь между вариабельными доменами, которые формируют второй сайт связывания.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дисульфидная связь находится между (если не указано иначе, в приведенном ниже перечне применяют нумерацию по КаЬа!). При любых обстоятельствах ссылки на нумерацию по КаЬа! соответствуют нумерации, описанной КаЬа! и др. в кн.: 'Ъесщепсек о£ РгоЮнъ о£ 1ттипо1од1са1 1п1егеь1, 1987, Министерство здравоохранения и социальных услуг США, Национальный институт здравоохранения, США.
νΗ37 + \Ъ95С см., например, 2Ьи и др., Рго!еш §с1епсе 6, 1997, сс. 781-788;
νΗ44 + \Ы00 см., например, КеЬег и др., ВюсНетМгу 33, 1994, сс. 5451-5459, или КеЬег и др., 1оигпа1 о£ Вю1одюа1 СНетМгу. 269(28), 1994, сс. 18327-18331, или Кц)адора1 и др., Рго!еш Епдшеегтд, 10(12), 1997, сс. 1453-1459;
νΗ44 + \Ъ105 см., например, Ьио и др., I ВюсЬет. 118, 1995, сс. 825-831; νΗ45 + \Ъ87 см., например, 2Ьи и др., Рго1еш §аепсе 6, 1997, сс. 781-788; νΗ55 + \Ъ101 см., например, Уоипд и др., РЕВ§ ЬеЬегк 377, 1995, сс. 135-139; νΗ100 + \Ъ50 см., например, С1осккЬиЬег и др., ВюсЬетэкЬу 29, 1990, сс. 1362-1367;
ОД100Ь + \Е49;
νΗ98 + νΣ46 см., например, 2Ьи и др., Рго1еш §аепсе 6, 1997, сс. 781-788; νΗ101 \Е46;
νΗ105 + νΣ43 см., например, Вгшктапп и др., Ргос. ЫаЬ. Асай. 8сЬ И8А 90, 1993, сс. 7538-7542, 1ипд и др., РгоЮнъ 19, 1994, сс. 35-47;
νΗ106 + АЪ57 см., например, Уоипд и др., РЕВ§ ЬеЬегк 377, 1995, сс. 135-139.
Перечисленные выше аминокислотные пары находятся в положении, благоприятном для замещения цистеинами таким образом, что могут быть сформированы дисульфидные связи. Цистеины могут быть сконструированы в этих положениях известными методами.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара (ΥΉ/νΕ) по настоящему изобретению может быть связана дисульфидной связью между двумя остатками цистеина, одним в νΗ и одним в АЪ, причем положение пары остатков цистеина выбрано из группы, состоящей из νΗ37 и νΣ95, νΗ44 и νΣ100, νΗ44 и νΣ105, νΗ45 и νΣ87, νΗ100 и νΣ50, ’УШ00Ь и \Ε49. νΗ98 и \Ε46. νΗ101 и \Ε46. νΗ105 и νΣ43 и νΗ106 и νΣ57.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара
- 4 023053 (УН/УЪ) по настоящему изобретению может быть связана дисульфидной связью между двумя остатками цистеина, одним в АН и одним в УЪ, которые находятся вне областей СЭР, причем положение пары остатков цистеина выбрано из группы, состоящей из УН37 и УЪ95, УН44 и УЪ100, УН44 и УЪ105, УН45 и УЪ87, УН100 и УЪ50, УН98 и УЪ46, УН105 и УЪ43 и УН106 и УЪ57.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара (УН/УЪ) по настоящему изобретению может быть связана дисульфидной связью между двумя остатками цистеина, одним в УН и одним в УЪ, которые находятся вне областей СОК, причем положение пары остатков цистеина выбрано из группы, состоящей из УН37 и УЬ95, УН44 и УЪ105, УН45 и УЪ87, УН100 и УЪ50, УН98 и УЪ46, УН105 и УЪ43 и УН106 и УЬ57.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара (УН/УЪ) по настоящему изобретению может быть связана дисульфидной связью между двумя остатками цистеина, причем остаток цистеина в УН находится в положении 44 и остаток цистеина в УЪ находится в положении 100.
Обычно пары цистеина сконструированы в таких положениях в УН и УЪ, что в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара (УН/УЪ) по настоящему изобретению может быть связана дисульфидной связью между двумя сконструированными остатками цистеина, одним в УН и одним в УЪ, причем положение пары сконструированных остатков цистеина выбрано из группы, состоящей из положений УН37 и УЪ95, УН44 и УЪ100, УН44 и УЪ105, УН45 и УЪ87, УН100 и УЪ50, УН100Ъ и УЪ49, УН98 и УЪ46, УН101 и УЪ46, УН105 и УЪ43 и УН106 и УЪ57.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара (УН/УЪ) по настоящему изобретению может быть связана дисульфидной связью между двумя сконструированными остатками цистеина, одним в УН и одним в УЪ, которые находятся вне областей СОК, причем положение пары сконструированных остатков цистеина выбрано из группы, состоящей из положений УН37 и УЪ95, УН44 и УЪ100, УН44 и УЪ105, УН45 и УЪ87, УН100 и УЪ50, УН98 и УЪ46, УН105 и УЪ43 и УН106 и УЪ57.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара (УН/УЪ) связана дисульфидной связью между двумя сконструированными остатками цистеина, одним в УН и одним в УЪ, которые находятся вне областей СОК, причем положение пары сконструированных остатков цистеина выбрано из группы, состоящей из УН37 и УЪ95, УН44 и УЪ105, УН45 и УЪ87, УН100 и УЪ50, УН98 и УЪ46, УН105 и УЪ43 и УН106 и УЪ57.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариабельная доменная пара (УН/УЪ) связана дисульфидной связью между двумя сконструированными остатками цистеина, причем сконструированный остаток цистеина в УН находится в положении 44 и сконструированный остаток цистеина в УЪ находится в положении 100.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения УН1 гибридизирован непосредственно с СН1 , а УЬ1 гибридизирован непосредственно с СЪ, и имеется дисульфидная связь между УН2 и Уъ2.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения одна или несколько дисульфидных связей между вариабельными областями одного или нескольких сайтов связывания обладают стабилизирующим эффектом и, например, поддерживают экспрессию и/или минимизируют нежелательную димеризацию.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения имеется дисульфидная связь между вариабельными доменами в первой родственной паре и/или между вариабельными доменами во второй родственной паре и дисульфидная связь между фрагментами константной области, например, фрагментами СН1 и СЪ.
Какой-либо из форматов, предусмотренных в настоящем изобретении, может быть предусмотрен с дисульфидной связью между константными доменами или без нее.
Домен СЪ является производным от каппа- или лямбда-цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения СЪ является сКарра.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения природная дисульфидная связь находится между СН1 и СЪ. Природным положением межцепочечного цистеина, формирующего связь, является положение 214 в сКарра и сЪатЪБа человека (нумерация по КаЪа!, 4-е издание, 1987).
Точное положение цистеина, формирующего связь, или межцепочечного цистеина, в СН1 зависит от определенного фактически применяемого домена. Таким образом, например, в гамма-1 человека природное положение межцепочечного цистеина, формирующего дисульфидную связь, находится в положении 233 (нумерация по КаЪа!, 4-е издание, 1987). Известно положение формирующего связь цистеина для других изотипов человека, например, гамма 2, 3, 4, 1дМ и 1§И, например 127.
Различные межцепочечные дисульфидные связи и их утрата представлены на фиг. 2А.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему описанию имеет дисульфидную связь в положении, эквивалентном соответствующему природному положению СН1 и СЪ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения константная область, включающая СН1 или СЪ, имеет дисульфидную связь, которая занимает неприродное положение. Она может быть
- 5 023053 сконструирована в молекуле путем интродукции цистеина (цистеинов) в аминокислотную цепь в нужных положениях. Такая неприродная дисульфидная связь является дополнительной связью или связью, заменяющей природную дисульфидную связь, имеющуюся между СН1 и СЬ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения отсутствует природная дисульфидная связь между СН1 и СЬ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полностью отсутствуют межцепочечные дисульфидные связи между СН1 и СЬ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каждый фрагмент константной области гибридизирован по меньшей мере с одним вариабельным доменом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каждый фрагмент константной области также связан через пептид, например искусственный/неприродный линкер, например, через последовательность в табл. 1 и/или 2, с вариабельным доменом, например с доменом, который не является родственной парой для гибридизируемого с ним вариабельного домена.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фрагмент константной области, например в тяжелой цепи, включает домен СН1. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фрагмент константной области состоит из домена СН1 .
Домен СН1 может быть производным от 1§Л, 1§ϋ, 1дЕ, 1§С (например, 1§С1, 1§С2, 1§О3, 1§О4) или 1дМ доменов человека и их изотипов.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает домен СЬ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения константная область в легкой цепи состоит из домена СЬ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с Ν-конца тяжелая цепь собрана следующим образом: вариабельный домен УН1 (часть первой родственной пары), СН1, вариабельный домен УН2 (часть второй родственной пары). При такой сборке СН1 может, например, гибридизироваться с вариабельным доменом УЬ1 из первой родственной пары и связываться через пептид с вариабельным доменом второй родственной пары.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с Ν-конца легкая цепь собрана следующим образом: УЬ1 (часть первой родственной пары), СЬ, Уь2 (часть второй родственной пары), например, домен СЬ может быть гибридизирован с УЬ1 первой родственной пары и связан через пептид с Уъ2 второй родственной пары.
Примеры соответствующих пептидных линкеров приведены ниже, например, в табл. 1.
Таблица 1. Гибкие линкерные последовательности
8Е0 ЮНО: Последовательности
1 8ООООЗЕ
2 υκτΗΤδ
3 (5)00008
4 (5)0000500008
5 (8)000050000800008
6 (8)00008000080000800008
7 (8)0000800005000080000800008
8 АААС8С-СА5А8
9 АААО5О-ХО0О8-ОА5А8
10 АААО5О-ХООО5ХООО5 -ОА5А8
11 ААА08С- ХООО8ХООО5ХОСС8-ОА8АЗ
12 АААС5С- ХСОО5ХОО05ХООС5ХСОС8ОА5А8
13 АААО8О-Х8-ОА8А8
14 ΡΟΟΝΚΟΤΤΤΤΚΚΡΑΤΤΤΟ88ΡΟΡΤ08ΗΥ
15 АТТТО88РОРТ
16 АТТТ08
17 08
18 ΕΡ5ΟΡΙ3ΤΙΝ5ΡΡ5ΚΕ3ΗΚ3Ρ
19 ΟΤνΑΑΡδνΡΙΡΡΡδϋ
20 οοαοίΑΡδΜνοοοοδ
21 οαοακνΕΟΑΟΟοοοδ
22 οοοοδΜΚδΗϋοοοοδ
23 οοοοΝυπνοοοοδ
24 οοοοννρδίροοοοδ
25 ОСЕК81РОСОО5
26 КРЬ8УКРРРРРОРР5УКР
27 ΥΡΚ5ΙΥΙΚΚΚΗΡ5Ρ5ΕΤΤ
28 ТР8НЬ8Н1ЬР5РО1-,РТР14
29 ΚΡνδΡΡΤΡΡΒΧδΝδΨΙΛΆ
30 8ΡΑΑΗΡΡΚ8ΙΡΚΡΟΡΙΚΤ
31 АРСР8АР8НК8ЬР8КАРС
32 ΡΚΝδΙΗΡίΗΡίΧνΑΡίΟΑ
33 МРБЬЗОУЬОУКУЬЗРРОЬ
34 ЗРОУР8Р1ЛЪТЬРРНР8Ь
35 ΝΡδΕΝΡΡδΥίΗΚΑΡδΚΙδ
36 ЕР\УКТ8ЬЬР8ЬРЬКККР
37 РРЬРАКСРУОЬЬ5К8ГРР
38 νΡΡΑΡννδΕΚδΑΗΑΚΡΡΥ
39 ЕК.РТРРКУК5УТССРТР-
40 ΡΝνΑΗνΕΡΕΕΤνΡΜϋΝΕΚ
41 ΟΝΡΕ,ίΡΕΟΑΚδΡΑνΚΤΡΡ
(8) является необязательным в последовательностях с 3 по 7. Линкеры, применяемые в настоящем описании, могут включать линкер, показанный в табл. 1.
- 6 023053
К примерам жестких линкеров для применения в гибридных белках по настоящему описанию относятся пептидные последовательности ОЛРЛРЛЛРЛРЛ (8ЕО ГО N0:42), РРРР (8Е0 ГО N0:43) и РРР.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептидный линкер включает альбуминсвязывающий пептид.
Примеры альбуминсвязывающих пептидов представлены в \У0 2007/106120 и включают
Таблица 2
5Б0 Ю N0: Последовательности
45 ОЬСЬЫЖССИУ
46 01СЬРК\У<ЗСЬ\У
47 МЕО1си>кжзсиусо
48 0КЬМЕО1СЬРЮ¥СС1ЛУЕПОЕ
49 Осысысьрклуосиускзу
50 οουοϋκχρκννοοι,νοκδνκ
51 ЕОКХРЮУОСЫУЕОО
52 ΚίΜΕϋΙίΧΡΚνΟϋΙ,ΨΕΟΟ
53 МЕ01СЬРК\У0СЪ№Е00
54 МЕО1СЬРРУ/ОСЬ%ТО
55 КЪМЕО1СЬАЮУОСЬМЕОО
56 ЕУК.8РСТЮ¥РАЕК$СКРЬКС
57 ΚΑΡΕδΡνΟΥΨΕΤΙΟΡΕΚδΕΡ
58 ΕΜΌΥΡΡΟΙΟΨΜ
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер обладает эффекторной функцией.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридные белки по настоящему описанию димеризованы для создания молекулы, обозначаемой в настоящем изобретении (РаЪТу)2. Димеризация, например, может быть через формирование дисульфидной связи между двумя растворимыми доступными целевыми цистеинами на каждом из двух гибридных белков по настоящему описанию (т.е. РаЪ-άδΡν), или за счет химического перекрестного связывания целевых цистеинов, лизинов, частей молекул сахаров или неприродных аминокислот на каждой из двух молекул РаЪ-Ρν.
Если требуется формирование меж-РаЪ-Ρν дисульфидной связи (формирование межцепочечной связи), только один линкер в составе РаЪ-Ρν содержит цистеин или цистеины. Т.е. если линкер между СЬ и Уъ2 содержит один или несколько цистеинов, линкер между СН1 и νΗ2 обычно может быть лишен цистеинов.
Если линкер между СН1 и νΗ2 содержит один или несколько цистеинов, то линкер между СЬ и У22 обычно может быть лишен цистеинов.
Линкеры могут содержать от 1 до 8 цистеинов и могут состоять из какой-либо пептидной последовательности, содержащей 1 -8 цистеинов.
Соответствующие пептидные последовательности показаны в табл. 1-3, а также при необходимости могут конструироваться последовательности, содержащие от 1 до 8 цистеинов.
Шарниры могут применяться в качестве линкеров для индукции димеризации, поскольку они обладают природной гибкостью и их вторичная структура достаточна для того, чтобы индуцировать эффективную и стабильную дисульфидную связь. В частности могут применяться природные шарниры или модифицированные шарниры какого-либо класса или изотипа, если они содержат от 1 до 8 остатков цистеина.
Если природная или модифицированная последовательность шарнирного линкера между СЬ и Уъ2 действительно содержит один или несколько цистеинов, линкер между СН1 и νΗ2 обычно может быть лишен цистеинов.
Если шарнирный линкер между СН1 и νΗ2 действительно содержит один или несколько цистеинов, линкер между СЬ и Уъ2 обычно лишен цистеинов.
В другом варианте меж-РаЪ-Ρν димеризация может быть индуцирована конструированием целевых остатков на какой-либо растворимой или доступной на поверхности области Уъ1, УН1, сКарра, сЬатЪйа, СН1 , Уъ2 или νΗ2. Сходным образом целевые остатки могут быть сконструированы с Сконца полипептидов или легкой цепи, или тяжелой цепи, например, после У 2 после νΗ2. Эти целевые остатки предпочтительно могут быть остатками цистеина сразу после последних остатков Уъ2 или УН2 или в линкере, шарнире или спейсерной области полипептида.
Если целевые остатки связаны химическим перекрестным линкером, длина, состав, действие или гетерофункциональность могут варьировать для точной настройки доступности антигена, функциональной авидности, периода полураспада в сыворотке, свойств очистки или свойств для хранения и переработки. Химический перекрестный линкер частично может состоять из полиэтиленгликоля или может содержать дополнительные реакционноспособные группы для добавления третьей специфичности или действующего агента.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему изобретению димеризуют, используя полимер, например ПЭГ, таким образом, что одна цепь в первом гибридном белке конъюгирована с полипептидом, например, антителом или фрагментом, для формирования гетеродимера.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему
- 7 023053 изобретению димеризуют, используя полимер, со вторым гибридным белком по настоящему описанию для формирования гетеродимера или гомодимера.
Фиг. 2Б показывает пример формата связанного с помощью ПЭГ димера, включающего два белка по настоящему описанию. Линкер ПЭГ связывает СН1 в одном гибридном белке и СН1 во втором гибридном белке. Однако шарнирная область может быть инкорпорирована с соответствующими свойствами для конъюгации с линкерной молекулой ПЭГ. В другом варианте домен СЬ может быть применен для конъюгации с ПЭГ.
Положение дисульфидной связи между одной или несколькими вариабельными доменами парами может быть в каких-либо положениях, описанных в настоящем изобретении.
Также может быть предусмотрен формат, содержащий или не содержащий дисульфидную связь между константными областями, примеры которых более подробно рассмотрены выше.
Шарниры могут быть природными шарнирами или модифицированными шарнирами. Могут применяться модифицированные шарниры, например, представленные в табл. 3.
Ряд модифицированных шарнирных областей уже был описан, например, в патентах υδ 5677425, И8 6642356, ХО 9915549, ХО 2005003170, ХО 2005003169, ХО 2005003170, ХО 9825971 и ХО 2005003171, а также в тех, которые приводятся в настоящем изобретении в виде ссылок. Примерами шарниров также являются те шарниры, которые представлены в табл. 3.
Таблица 3. Последовательности шарнирных линкеров
$Ё0 Ю ΝΟ: δΕΟϋΕΝΟΕ
59 ОКТНТСХХ
60 ИКТНТСРРСРА
61 ОКТНТСРРСРАТСРРСРА
62 ОКТНТСРРСРАТСРРСРАТСРРСРА
63 ОКТНТСРРСРАСКРТЬУНЗЬУМЗОТАСТСУ
64 ПКТНТСРРСРАОКРТНУКУЗУУМАЕУООТСУ
65 ОКТНТССУЕСРРСРА
66 ГЖТНТСРКСРЕРК8СОТРРРСРКСРА
67 ОКТНТСР8СРА
68 октнтзхх
69 ОКТНТСРРЗРА
70 ОКТНТ8РРСРА
71 ПКТНТЗРРЗРА
72 ОКТНТСРРСРАТСРР8РА
73 ОКТНТСРРСРАТЗРРСРА
74 ОКТНТСРРЗРАТСРРСРА
75 ОКТНТЗРРСРАТСРРСРА
76 ОКТНТСРРСРАТ5РР5РА
77 ОКТНТСРР5РАТСРР5РА
78 ОКТНТЗРРСРАТСРР5РА
79 ОКТНТЗРРЗРАТСРРСРА
80 ОКТНТЗРРСРАТ5РРСРА
81 ОКТНТСРРЗРАТЗРРСРА
82 ϋΚΤΗΤ8ΡΡ8ΡΑΤ8ΡΡ8ΡΑ
83 ОКТНТСРРЗРАТ5РР8РА
84 ОКТНТ8РРСРАТЗРР5РА
85 ОКТНТЗРРЗРАТСРРЗРА
86 ПКТНТЗРРЗРАТЗРРСРА
87 ОКТНТСРРСРАТСРРСРАТСРР5РА
- 8 023053
88 ОКТНТСРРСРАТСРРСРАТЗРРСРА
89 ОКТНТСРРСРАТСРР8РАТСРРСРА
90 ОКТНТСРРСРАТЗРРСРАТСРРСРА
91 ОКТНТСРРЗРАТСРРСРАТСРРСРА
92 ОКТНТЗРРСРАТСРРСРАТСРРСРА
93 ОКТНТСРРСРАТСРРСРАТЗРРЗРА
94 йКТНТСРРСРАТСРРЗ Р АТСРРЗР А
95 ОКТНТСРРСРАТЗРРСРАТСРРЗРА
96 ОКТНТСРР5РАТСРРСРАТСРР5РА
97 ОКТНТЗРРСРАТСРРСРАТСРРЗРА
98 ОКТНТСРРСРАТСРРЗРАТЗРРСРА
99 ЦКТНТСРРСРАТЗРРСРАТЗРРСРА
100 ОКТНТСРР8РАТСРРСРАТ8РРСРА
101 ОКТНТЗРРСРАТСРРСРАТЗРРСРА
102 ЙКТНТСРРСРАТЗРРЗРАТСРРСРА
103 ЙКТНТСРРЗРАТСРРЗРАТСРРСРА
104 ОКТНТЗРРСРАТСРРЗРАТСРРСРА
105 ЙКТНТСР РЗР АТ5РРСР АТСРРСР А
106 ЙКТНТЗРРСРАТЗРРСРАТСРРСРА
107 РКТНТЗРРЗРАТСРРСРАТСРРСРА
108 ОКТНТСРРСРАТСРРЗРАТЗРРЗРА
109 ОКТНТСРРСРАТЗРРСРАТЗРРЗРА
110 ЙКТНТСРРЗРАТСРРСРАТЗРРЗРА
111 ЙКТНТЗРРСРАТСРРСРАТЗРРЗРА
112 ОКТНТСРРСРАТ8РР8РАТСРР5РА
113 ОК.ТНТСРР8РАТСРР5Р АТСРРЗР А
114 ОКТНТ8РРСРАТСРР8РАТСРРЗРА
115 ЙКТНТСРРЗР АТЗРРСР АТСРР ЗР А
116 ОКТНТЗ РРСРАТЗРРСР АТСРР5РА
117 ОКТНТ8РРЗРАТ8РРСРАТСРРСРА
118 ОКТНТ5РР8РАТСРРЗРАТСРРСРА
119 ОКТНТЗ РР8РАТСРРСРАТ8 РРСРА
120 ОКТНТ5РР8РАТСРРСРАТСРР5РА
121 ОКТНТСРРЗРАТЗРРЗРАТСРРСРА
122 ОКТНТСРРЗРАТЗРРСРА ТЗ РРСРА
123 ϋΚΤΙ 1ТСРР8Р АТСРР ЗРАТЗРРЗРА
124 ОКТНТСРР5РАТЗРР5РАТСРР5РА
125 ОКТНТ8РР8РАТЗРРСРАТСРР5РА
126 ОКТНТ8РРЗРАТ8РР8РАТСРРСРА
127 РКТНТЗРРЗРАТЗРРСРАТЗРРСРА
128 ОКТНТЗРР5РАТЗРРСРАТСРР5РА
129 ОКТНТСРРЗРАТЗРРЗРАТЗРРСРА
130 ОКТНТСРРЗРАТЗРРЗРАТЗРРЗРА
131 ЭКТНТЗРРЗРАТЗРРЗРАТЗРРСРА
132 ОКТНТЗРРСРАТЗРРЗРАТ5РР8РА
133 ОКТНТЗРРЗРАТСРРЗРАТЗРРЗРА
134 ОКТНТЗРРЗРАТЗРРСРАТЗРРЗРА
135 ОКТНТ5РР8РАТ8РРЗРАТСРРЗРА
136 ОКТНТ8РРЗРАТ8РРЗРАТ8РР8РА
137 ОКТНТСРРСРАСКРТЬУЫ ЗЬУМ 5ОТАСТ8 Υ
138 ОКТНТСРРЗРАСКРТЬУНЗЬУМЗОТАОТСУ
139 ОКТНТЗРРСРАСКРТЬУНЗЬУМЗОТАОТСУ
140 ОКТНТСРРЗРАОКРТЬУНЗЬУМЗОТАОТЗУ
141 ΏΚΤΗΤ5ΡΡ3 Р ΑΟΚΡΤίΥΝ ЗЬУМ ЗОТАСТСУ
- 9 023053
142 ОКТНТ8РРСРАСКРТЬУМ8ЬУМЗОТАСТ8У
143 ОКТНТЗРРЗРАОКРТЬУЦЗЬУМЗОТАОТЗУ
1441 ОКТНТСРРСРАОКРТНУЦУЗУУМАЕУЦОТЗУ
145 ОКТНТСРРЗРАОКРТНУЫУЗУУМАЕУОСТСУ
146 ОКТНТ8РРСРАОКРТНУМУ8УУМАЕУОСТСУ
147 ЦКТНТСРРЗРАОКРТНУЫУЗУУМАЕУООТЗУ
148 ЦКТНТЗРРСРАОКРТНУЦУЗУУМАЕУООТЗУ
149 ОКТНТ8РРЗРАСКРТНУЫУ8УУМАЕУООТСУ
150 ОКТНТ8РР5РАОКРТНУМУ5УУМАЕУООТ5У
151 ЦКТНТССУЕСРР8РА
152 ЦКТНТССУЕЗРРСРА
153 ЦКТНТСЗУЕСРРСРА
154 ЦКТНТЗСУЕСРРСРА
155 ЦКТНТССУЕЗРРЗРА
156 ЦКТНТСЗУЕСРРЗРА
157 ЦКТНТЗСУЕСРРЗРА
158 ЦКТНТС8УЕЗРРСРА
159 ЦКТНТЗ 8УЕСРРСРА
160 ОКТНТСЗУЕЗРР8РА
161 ЦКТНТ58 УЕСРР8РА
162 ЦКТНТ38УЕ8РРСРА
163 ЦКТНТ88УЕ5РРЗРА
164 ЦКТНТСРКСРЕРК8СОТРРРСРК5РА
165 ЦКТНТСРКСРЕРК8СЦТРРР8РКСРА
166 ЦКТНТСРКСРЕРК85ЦТРРРСРКСРА
167 Ц КТНТСРК8Р ЕРКЗСЦТРРРСРКСРА
168 Ц КТНТЗРКСРЕРКЗСЦТРРРСРКСРА
169 ЦКТНТСРКСРЕРК8СЦТРРР5РК5РА
170 ЦКТНТСРКСРЕРКЗЗОТРРРСРКЗРА
171 ЦКТНТСРК8РЕРК5СЦТРРРСРК5РА
172 ЦКТНТЗРКСРЕРКЗСЦТРРРСРКЗРА
173 ЦКТНТСРКСРЕРК88ЦТРРРЗРК8РА
174 ЦКТНТСРК5РЕРКЗСЦТРРР5РК8РА
175 ЦКТНТЗРКСРЕРК5СЦТРРР8РК8РА
176 ОКТНТСРК8РЕРК38ЦТРРРСРК8РА
177 ЦКТНТЗРК.СРЕРК85ЦТРРРСРК.8РА
178 ЦКТНТЗРКЗРЕРК5СЦТРРРСРК5РА
179 ЦКТНТСРКЗРЕРКЗЗЦТРРРЗРКСРА
180 ЦКТНТЗРКСРЕРКЗЗЦТРРРЗРКСРА
181 ЦКТНТ8РК8РЕРК38ПТРРРСРКСРА
,82 ЦКТНТСРК8РЕРКЗ ЗОТРРРЗРК.ЗР А
183 ЦКТНТЗРК8РЕРК8 5ЦТРРРСРК5Р А
184 ЦКТНТ8РК8РЕРКЗСОТРРР8РК8РА
185 ЦКТНТЗРКСРЕРК85ЦТРРР8РК.5РА
186 ЦКТНТЗРКЗРЕРКЗЗЦТРРРЗРК8РА
187 ЦКТНТСР83РА
,88 ЦКТНТ5РЗСРА
,89 ЦКТНТЗРЗЗРА
X означает какую-либо аминокислоту, например XX может означать АА. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему описанию не содержит шарнира.
В настоящем изобретении высказывают предположение, что путем обеспечения вариабельных доменов в качестве родственных пар в итоговых конструкциях оптимизируют и поддерживают антигенсвязывающие свойства сайта связывания, сформированного родственной парой.
Полагают, что дисульфидные мостики в родственных парах полезны, поскольку способствуют стабилизации формата.
Было признано, что одно или несколько аминокислотных замещений, добавлений и/или делеций может быть произведено в вариабельных доменах антител, предусмотренных в настоящем изобретении, без существенного изменения способности антитела связывать целевой антиген и без изменения его нейтрализующего действия. Действие каких-либо аминокислотных замещений, добавлений и/или делеций может быть легко проверено специалистом в данной области, например, путем использования анализов ίη νίίτο, например, анализа В1Асоге.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения отсутствует межцепочечная дисульфидная связь между легкой цепью и тяжелой цепью, и один или два цистеина, которые не могут нормально формировать связь (межцепочечных цистеинов), конъюгированы с полимером. Один межцепочечный цистеин может быть избирательно конъюгирован методами генной инженерии для замещения соответствующего межцепочечного цистеина другой аминокислотой, например серином.
Оба межцепочечных цистеина могут быть конъюгированы с полимером за счет применения соответствующих сильно восстанавливающих агентов. Различные сборки межцепочечных цистеинов или их утрата показаны на фиг. 2А.
Домен каппа или лямбда может быть модифицирован химической конъюгацией с соответствующим
- 10 023053 полимером.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сКарра человека в гибридном белке по настоящему изобретению включает с С-конца последовательность, выбранную из δΡΝΚΟΕΟ (δΕΟ ΙΌ N0:190); δΡΝΚΟΟδ (δΕΟ ΙΌ N0:191); δΡΝΚΟΕδ (δΕΟ ΙΌ N0:192); δΡΝΟΟΕδ (δΕΟ ΙΌ N0:193); δΡΟΚΟΕδ (δΕΟ ΙΌ N0:194); и δСNΚОΕδ (δΕΟ ΙΌ N0:195).
Один или несколько цистеинов на С-конце сКарра, например, непосредственно описанных выше, могут применяться для конъюгации с полимером ПЭГ.
Соответствующие положения в сКарра для конъюгации включают:
1. верхний домен сКарра, который примерно равно отстоит от УЬ1 и Уъ2 в гибридном белке по настоящему описанию, например О1и143, О1и199 и/или Уа1110 (линейный, нумерация по КаЬа!;
2. средний домен сКарра, который удален от всех мобильных и гибких мотивов, которые могут потребоваться для эффективного связывания антигена, например Ьу8145 и/или О1и147, (линейный, нумерация по КаЬа!); и/или
3. нижний домен сКарра, например Ьу8190, Άδη210, Агд211 и/или О1и213 (линейный, нумерация по КаЬа!).
Эти аминокислоты при необходимости могут быть замещены, например, цистеином, используя известные методы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок включает последовательность
КТ9ААРЗУР1РРРЗПЕ(ЗЬКЗСТАЗУУСЬЫП1Р¥РКЕАКУ0ИКУПИА:Ы25155СИ50ЕЗУ ТВСПЗКОЗТУЗЬЗЗТЬТЬЗКАПУЕКНКУ¥АСЕУТНОСЬ3202й20ЭРУТКЗРЫЕОЕС (8Е<Э ГО N0:196) например, в сКарра, в частности в положении 108-214 (нумерация по КаЬа!) в аминокислотной последовательности.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения СН1 человека в гибридном белке настоящего изобретения включает с С-конца последовательность, выбранную из гаС, и
КШ
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок включает последовательность
3120АЗТК13РЗУРРЬАРЗЗКЗТ3159СеТААЬС!СЬУКО¥РРЕРУТУЗИИ3152САЪТЗеУН
222
ТГРАУЬОЗЗОЬУЗЬЗЗУУТУРЗЗЗЬСТОТУЮтШНКРЗЫТКУБККУ ЕРКЗС (ЗЕС^Ю N0:197).
Аминокислота δ120, выделенная жирным шрифтом, не является частью генетического/экзонного определения домена СН1 , но рассматривается в виде части структурного локтя.
Подчеркнутая последовательность является не частью генетического/экзонного определения домена СН1, а частью расположенного выше шарнира, например, в СН1, в частности в положении 121-218 (нумерация по КаЬа!) в аминокислотной последовательности.
К соответствующим положениям в СН1 для конъюгации относятся:
1. верхний домен СН1, который примерно равно отстоит от УН1 и УН2 В гибридных белках по настоящему описанию, например Αδπ211 (216) и/или ТЬг123 (Αδη 216 и/или ТЬг 116 по нумерации КаЬа!);
2. средний домен СН1, который удален от всех мобильных и гибких мотивов, которые могут потребоваться для эффективного связывания антигена, например 8сг163 и/или 8сг127 (8сг163 и/или 8сг120 по нумерации КаЬа!); и/или
3. нижний домен СН1, например Ьу8136, 8сг137 и/или 8сг222 (Ьу8129, 8сг130, 8сг232 по нумерации КаЬа!).
Аминокислоты могут быть замещены согласно необходимости, например, цистеином, используя известные методы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соответствующим образом сконструированным цистеином по настоящему изобретению является природный остаток в данном положении аминокислоты, который замещен остатком цистеина.
Внедрение сконструированных цистеинов может осуществляться каким-либо известным в данной области методом. К таким методам относятся, но ими перечень не ограничивается, ПЦР протяженный перекрывающийся мутагенез, сайт-направленный мутагенез или кассетный мутагенез (см. общую информацию в кн.: δатЬ^οοк и др. Мо1еси1аг Скопищ А ЬаЬога!огу Мапиа1, 1989, изд-во Со14 8рг1п§ НагЬоиг ЬаЬога!огу Рге55. Со14 8рг1п§ НагЬоиг, Нью-Йорк; в кн.: АшЬе1 и др. Сиггеп! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1993, изд-во Огеепе РиЫЫипд & ХУПеу-ЬНегхаепсе, Нью-Йорк). Наборы для сайт- 11 023053 направленного мутагенеза коммерчески доступны, например набор для сайт-направленного мутагенеза ОшкСЬапде® (фирма §!га!адеп, Ьа 1о11а, Калифорния). Кассетный мутагенез может проводиться на основе работы \Уе115 и др., Оепе, 34, 1985, сс. 315-323. В другом варианте мутанты могут быть получены полным генным синтезом путем отжига, лигирования и ПЦР амплификации, а также клонирования перекрывающихся олигонуклеотидов.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок не содержит цистеинов в областях СН1 и/или СЬ для конъюгации с полимером.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения область νΗ1 гибридизирована с областью СН1 и аминокислотная последовательность, соединяющая их, в настоящем изобретении называется локтем. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный локоть содержит один или несколько, например один, конъюгированный с ним полимер ПЭГ, например конъюгированный в положении, равноудаленном между νΗ1 и νΗ2, например конъюгированный с остатками Тйг123 (ТЬг 116 по классификации КаЬа!), и/или §119 (§ег 112 по классификации КаЬа1), и/или §122 (§ег115 по классификации КаЬа!). Предусмотрена дисульфидная связь, например, путем инжиниринга цистеина или цистеинов в соответствующих положениях в молекуле для обеспечения субстрата для конъюгации с ней полимера ПЭГ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения область V® гибридизирована с областью СЬ, и аминокислотная последовательность, соединяющая их, в настоящем изобретении называется локтем. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный локоть содержит один или несколько, например один, конъюгированный с ним полимер ПЭГ, например конъюгированный в положении, равноудаленном между V® и ν72. например конъюгированный с остатками Ьу§107, Агд108 и/или ТЬг109 (линейный, нумерация по КаЬа!). Выше обсуждалось, что цистеины могут быть предусмотрены при необходимости для конъюгации.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЭГ конъюгируют с остатком, который пространственно близок областям, предрасположенным к агрегированию. Преимущественно ПЭГелирование, близкое к таким областям, может существенно маскировать целевую область от межмолекулярных взаимодействий в концентрациях в растворе, приемлемых для терапевтических доз. В легкой цепи конъюгация может быть, например, по положениям ТЬг109 или С1п199 (линейный, нумерация по КаЬа!), или около них, например, для отрицания ν;·ι1Α1;·ι-Α1;·ιΡ·Υ5 пятна, и/или Ьу§149 или А§п152 (линейный, нумерация по КаЬа!), например, для отрицания единичного Ьеи пятна. В тяжелой цепи конъюгация может быть, например, по положениям С1п178 (С1п 179 по классификации КаЬа!), или §ег180 (§ег182 по классификации КаЬа!), или С1у181 (С1у 183 по классификации КаЬа!), или около них рассматривают Vа1^у8-Ту^ пятно.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула ПЭГ присоединена к доступной для растворителя реакционноспособной и/или представленной на поверхности/доступной аминокислоте, например, к цистеину.
Представленный на поверхности цистеин (свободный цистеин) в контексте настоящего изобретения означает цистеин, который при нахождении гибридного белка в конформации природной укладки доступен для конъюгации с ним эффекторной молекулы, например, молекулы ПЭГ. Представленный на поверхности цистеин является цистеином, обнаруженным в гидрофильной части антитела или его фрагмента. Примеры конструирования свободных цистеинов данного типа также предусмотрены в и§ 7521541.
К соответствующим аминокислотам в легкой цепи антитела 4Ό5 (последовательность показана на фиг. 3), которые могут быть заменены на цистеин, относятся серин (§): 7, 9, 10, 12, 14, 26, 56, 60, 63, 67, 76, 77, 114, 121, 127, 156, 159, 168, 171, 202, 203, треонин (Т): 5, 20, 22, 31, 69, 72, 74, 129, 197, 206, глицин (С): 16, 41, 57, 68, 128, 143, 157, 200, 212, аспартат (Ό): 17, 28, 70, 122, 151, 167, 170, аргинин (К): 18, 24, 61, 211, глутамин (Ц): 27, 79, 147, 160, 195, 199, аспарагин (Ν): 30, 152, 158, 210, аланин (А): 34, 153, лизин (К): 39, 42, 126, 145, 149, 169, глутамат (Е): 55, 81, 123, 161, 213.
Указанные выше номера представляют первичную последовательность антител, нумерованных согласно показанному в файле банка данных белков по кристаллической структуре, 1ΡνΕ. Эти номера также соответствуют нумерации по КаЬа!. Настоящее изобретение также относится к замещению соответствующих аминокислот (используя нумерацию КаЬа!) в других антителах или фрагментах, включенных в гибридные белки по настоящему изобретению.
Соответственно в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений §7, §9, §10, §12, §14, §26, §56, §60, §63,
- 12 023053
867, §76, §77, 8114, 8121, §127, §156, 8159, 8168, §171, §202, 8203, Т5, Т20, Т22, Т31, Т69, Т72, Т74, Т129, Т197, Т206, 016, 041, 057, 068, 0128, 0143, 0157, 0200, 0212, Ό17, Ό28, Ό70, Ό122, Ό151, Ό167, Ό170, К.18, К24, К61, К211, 927, 979, 9147, 9160, 9195, 9199, N30, N152, N158, N210, А34, А153, К39, К42, К126, К145, К149, К169, Е55, Е81, Е123, Е161 и Е213.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 87, 89, 810, 812, 814, 826, 856, 860, 863, 867, 876, 877, 8114, 8121, 8127, 8156, 8159, 8168, 8171, 8202, 8203, Т5, Т20, Т22, Т31, Т69, Т72, Т74, Т109, Т129, Т197, Т206, 016, 041, 057, 068, 0128, 0143, 0157, 0200, 0212, Ό17, Ό28, Ό70, Ό122, Ό151, Ό167, Ό170, К18, К24, К61, К.108, К211, 927, 979, 9147, 9160, 9195, 9199, N30, N152, N158, N210, А34, А153, К39, К42, К107, К126, К145, К149, К169, К190, Е55, Е81, Е123, Е143, Е161 и Е213.
К другим соответствующим остаткам, описанным в литературе, относятся остатки, описанные в \У0 2006/034488 и \У0 2008/038024. Соответственно в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цистеин сконструирован в легкой цепи гибридного белка, например
У15 замещен на С,
А43 замещен на С,
У110 замещен на С,
8114 замещен на С,
8121 замещен на С,
8127 замещен на С,
А144 замещен на С,
А153 замещен на С,
N158 замещен на С,
8168 замещен на С,
У205 замещен на С,
8171 замещен на С,
8156 замещен на С,
8202 замещен на С и/или
8203 замещен на С.
Приведенная выше нумерация соотносится с последовательностью легкой цепи, показанной на фиг. 3, но настоящее описание также распространяется на соответствующие положения по нумерации КаЬа! в других легких цепях.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цистеин сконструирован в легкой цепи гибридного белка, например
8171 замещен на С,
8156 замещен на С,
8202 замещен на С и/или
8203 замещен на С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 87, 89, 810, 812, 814, 826, 856, 860, 863, 867, 876, 877, 8114, 8121, 8127, 8156, 8159, 8168, 8171, 8202, 8203, Т5, Т20, Т22, Т31, Т69, Т72, Т74, Т109, Т129, Т197, Т206, У15, У110, У205, 016, 041, 057, 068, 0128, 0143, 0157, 0200, 0212, Ό17, Ό28, Ό70, Ό122, Ό151, Ό167, Ό170, К18, К24, К61, К108, К211, 927, 979, 9147, 9160, 9195, 9199, N30, N152, N158, N210, А34, А43, А144, А153, К39, К42, К107, К126, К145, К149, К169, К190, Е55, Е81, Е123, Е143, Е161 и Е213.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 87, 89, 810, 812, 814, 826, 856, 860, 863, 867, 876, 877, 8159, Т5, Т20, Т22, Т31, Т69, Т72, Т74, Т109, Т129, Т197, Т206, 016, 041, 057, 068, 0128, 0143, 0157, 0200, 0212, Ό17, Ό28, Ό70, Ό122, Ό151, Ό167, Ό170, К18, К24, К61, К108, К211, 927, 979, 9147, 9160, 9195, 9199, N30, N152, N210, А34, К39, К42, К107, К126, К145, К149, К169, К190, Е55, Е81, Е123, Е143, Е161 и Е213.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цистеин конструируют в константной области легкой цепи гибридного белка, СЬ, например
Т109 замещен на С,
Е143 замещен на С,
К145 замещен на С,
К149 замещен на С и/или
N210 замещен на С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цистеин конструируют в вариабельной области легкой цепи гибридного белка, например
877 в 8Е9 ГО N0:44 замещен на С и/или
- 13 023053
К107 в §Е0 ΙΌ N1:44 замещен на С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений §77, К107, Т109, Е143, К145, К149 и N210.
Все остатки, установленные выше в настоящем изобретении, производны от 1дО1, но настоящее описание также распространяется на соответствующие положения по нумерации КаЬаГ в других легких цепях от антител других классов и изотипов.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 34, 39, 41, 42, 43, 55, 56, 57, 60, 61, 63, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 81, 107, 108, 109, 110, 114, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 143, 144, 145, 147, 149, 151, 152, 153, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 167, 168, 169, 170, 171, 190, 195, 197, 199, 200, 202, 203, 205, 206, 210, 211, 212 и 213, пронумерованных по системе нумерации КаЬаб
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 34, 39, 41, 42, 55, 56, 57, 60, 61, 63, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 81, 107, 108, 109, 122, 123, 126, 128, 129, 143, 145, 147, 149, 151, 152, 157, 159, 160, 161, 167, 169, 170, 190, 195, 197, 199, 200, 206, 210, 211, 212 и 213, пронумерованных по системе нумерации КаЬаб
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 77, 107, 109, 143, 145, 149 и 210, пронумерованных по системе нумерации КаЬаб
Соответствующие аминокислоты в тяжелой цепи антитела 4Ό5 (последовательности, показанной на фиг. 4), которые могут быть замещены цистеином, включают серин (§): 7, 17, 21, 63, 71, 86, 119, 120, 122, 127, 134, 135, 137, 139, 160, 163, 168, 179, 180, 193, 194, 195, 210, 222 треонин (Т): 58, 69, 123, 138, 167, 198, 200, глицин (О): 8, 9, 10, 15, 16, 26, 66, 100, 101, 103, 140, 141, 164, 169, 181, 197, аспартат (Ό): 62, 73, 102, 215, аргинин (К): 59, 67, 87, глутамин (0): 3, 13, 112, 155, 199, 219, аспарагин (Ν): 84, 211, аланин (А): 88, 121, 165, лизин (К): 43, 65, 124, 136, 208, 213, 217, глутамат (Е): 89.
Указанные выше номера представляют первичную последовательность антител, нумерованных согласно показанному в файле банка данных белков по кристаллической структуре, ΓΡνΕ. Настоящее описание также распространяется на замещение соответствующих аминокислот (используя нумерацию по КаЬаГ) в других антителах или фрагментах, включенных в гибридные белки по настоящему изобретению.
Нумерация положений эквивалентной последовательности по КаЬаГ в тяжелой цепи следующая: серин (§): 7, 17, 21, 62, 70, 82Ь, 112, 113, 115, 120, 127, 128, 130, 134, 156, 163,168, 180, 182, 195, 196,
197, 215, 232, треонин (Т): 57, 68, 116, 133, 167, 200, 205, глицин (О): 8, 9, 10, 15, 16, 26, 65, 96, 97, 99, 135, 136, 164, 169, 183, 199, аспартат (Ό): 61, 72, 98, 220, аргинин (К): 58, 66, 86, глутамин (О): 3, 13, 105, 203, аспарагин (Ν): 82а, 216, аланин(А): 84, 114, 165, лизин (К): 43, 64, 117, 129, 213, 218, 222, глютамат (Е): 85.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений §7, §17, §21, §62, §70, §82Ь, §112, §113, §115, §120, §127, §128, §130, §134, §156, §163, §168, §180, §182, §195, §196, §197, §215, §232, Т57, Т68, Т116, Т133, Т167, Т200, Т205, О8, О9, О10, О15, О16, О26, О65, О96, О97, О99, О135, О136, О164, О169, О183, О199, Ό61, Ό72, Ό98, Ό220, К58, К66, К86, Р3, Р13, Ц105, Р203, \82а. N216, А84, А114, А165, К43, К64, К117, К129, К213, К218, К222 и Е85.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цис- 14 023053 теина выбрано из группы, состоящей из положений §7, §17, §21, §62, §70, §82Ь, §112, §113, §115, §120, §127, §128, §130, §134, §156, §163, §168, §180, §182, §195, §196, §197, §215, §232, Т57, Т68, Т116, Т133, Т167, Т200, Т205, С8, 09, 010, 015, 016, 026, 065, 096, 097, 099, 0135, 0136, 0164, 0169, 0183, 0199, Ό61, Ό72, Ό98, Ό220, К58, К66, К86, Р3, Р13, р105, р179, Р203, Ν82μ N216, А84, А114, А165, К43, К64, К117, К129, К213, К218, К222 и Е85.
Другие соответствующие остатки описаны в литературе, в том числе в \νθ 2006/034488 и \νθ 2008/038024. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цистеин сконструирован в тяжелой цепи гибридного белка, например
А40 замещен на С,
Ь86 замещен на С,
А88 замещен на С, §119 замещен на С, §120 замещен на С,
А121 замещен на С, §122 замещен на С,
А175 замещен на С,
У176 замещен на С, и/или §179 замещен на С.
Приведенная выше нумерация соотносится с последовательностью тяжелой цепи, показанной на фиг. 4, но настоящее описание также распространяется на соответствующие положения по КаЬа1 в других тяжелых цепях.
Эквивалентные положения по классификации КаЬа1 следующие:
А40 замещен на С,
Ь82с замещен на С,
А84 замещен на С, §112 замещен на С, §113 замещен на С,
А114 замещен на С, §115 замещен на С,
А176 замещен на С,
У177 замещен на С, и/или §180 замещен на С.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений §7, §17, §21, §62, §70, §82Ь, §112, §113, §115, §120, §127, §128, §130, §134, §156, §163, §168, §180, §182, §195, §196, §197, §215, §232, Т57, Т68, Т116, Т133, Т167, Т200, Т205, 08, 09, 010, 015, 016, 026, 065, 096, 097, 099, 0135, 0136, 0164, 0169, 0183, 0199, Ό61, Ό72, Ό98, Ό220, К58, К66, К86, Р3, Р13, р105, р179, Р203, Ν82^ Ν216, А40, А84, А114, А165, А176, У177, Ь82с, К43, К64, К117, К129, К213, К218,К222 и Е85.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений §7, §17, §21, §62, §70, §82Ь, §120, §127, §128, §130, §134, §156, §163, §168, §182, §195, §196, §197, §215, §232, Т57, Т68, Т116, Т133, Т167, Т200, Т205, 08, 09, 010, 015, 016, 026, 065, 096, 097, 099, 0135, 0136, 0164, 0169, 0183, 0199, Ό61, Ό72, Ό98, Ό220, К58, К66, К86, Р3, Р13, р105, р179, Р203, Ν82μ Ν216, А165, К43, К64, К117, К129, К213, К218, К222 и Е85.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цистеин сконструирован в константной области тяжелой цепи гибридного белка СН1, например
Т116 замещен на С, §163 замещен на С, §182 замещен на С, и/или
Ν216 замещен на С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цистеин сконструирован в вариабельном домене тяжелой цепи гибридного белка, Ун, например §82Ь в §ЕД ГО ΝΟ:227 замещен на С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений §82Ь, Т116, §163, §182 и Ν216.
Все остатки, указанные выше в настоящем изобретении, производны от 1д01, но сущность настоящего изобретения также распространяются на соответствующие положения по нумерации КаЬа1 в других тяжелых цепях от антител других классов и изотипов.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь белка
- 15 023053 гибридного антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 3, 7, 8, 9, 10, 13, 15, 16, 17, 21, 26, 40, 43, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 66, 68, 70, 72, 82а, 82Ь, 82с, 84, 85, 86, 96, 97, 98, 99, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 120, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 156, 163, 164, 165, 167, 168, 169, 176, 177, 179, 180, 182, 183, 195, 196, 197, 199, 200, 203, 205, 213, 215, 216, 218, 220, 222 и 232, пронумерованных по системе нумерации КаЬаГ
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 3, 7, 8, 9, 10, 13, 15, 16, 17, 21, 26, 43, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 66, 68, 70, 72, 82а, 82Ь, 85, 86, 96, 97, 98, 99, 105, 116, 117, 120, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 156, 163, 164, 165, 167, 168, 169, 179, 182, 183, 195, 196, 197, 199, 200, 203, 205, 213, 215, 216, 218, 220, 222 и 232, пронумерованных по системе нумерации КаЬаГ
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь гибридного белка антитела включает сконструированный цистеин, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 82Ь, 116, 163, 182 и 216, пронумерованных по системе нумерации КаЬаГ
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантный гибридный белок по настоящему изобретению ПЭГелирован через сконструированный цистеин в тяжелой цепи в положении 163 и/или 182.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок включает свободный цистеин, к которому присоединена молекула ПЭГ или к которой молекула ПЭГ может быть присоединена. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок или его часть включает одну или несколько последовательностей, выбранных из
ЬУТУС8А8ТКСР8 (81Т) ГО N0:198),
ЬУТУ8СА8ТКСР8 (81Т) ГО N0:199),
ЬУТУ88С8ТКОР8, (81Т) ГО N0:200) и/или
НТРРСУЬР88ОЬ¥8 (81Т) ГО N0:201).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен со сконструированным цистеином гибридный белок, который включает свободный цистеин и необязательно включает последовательность, выбранную из одной или нескольких из следующих последовательностей:
ЗЬЗАЗССОКУТ (ЗЕО ГО N0:202)
0КРОКСРКШ (ЗЕО ГО N0:203)
Е1КК.ТСААРЗУ (ЗЕО ГО N0:204)
ТСААРСУР1РРР (ЗЕО Ю N0:205)
РТРРРСОЕОЬК (ЗЕО ГО N0:206)
ОЕОЬКССТАЗУ (ЗЕО Ю N0:207)
РУРКЕСКУОЗУК (ЗЕО ГО N0:208)
λνκνοΝΟίΟδΟΝ (ЗЕО Ю N0:209)
АЬОЗОСЗОЕЗУ (ЗЕО ГО N0:210)
νΤΕφϋΟΚϋδΤΥ (ЗЕО Ю N0:211)
ОЬЗБРСТКЗРК (ЗЕО Ю N0:212)
ΝλΥΙΚΟΟΡΟΝΚ (ЗЕО Ю N0:213)
ЦЧЗСТТЕОТАТ (ЗЕО Ю N0:214)
ООСТЬУТУЗАСЗТКОРЗУРРЬ (ЗЕО ГО N0:215)
НТРРСУЬОЗЗОЬУЗ (ЗЕО ГО N0:216)
НТРРАСЬОЗЗСЬУЗ (ЗЕО Ю N0:217)
РЬЗУЗСООКТУ (ЗЕО Ю N0:218)
ΟΚΡΟΝΟΡΚΙΛΙ (ЗЕО Ю N0:219)
Е1ККТСРРРЗУ (ЗЕО ГО N0:220)
Р¥РКЕСКУО^К (ЗЕО Ю N0:221)
УТЕООСКГОЗТУ (8Е0 ГО N0:222)
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена легкая цепь, включающая последовательность
0 4 ·'.·
Р1£МТ95Р55Ь5А5УСРКУТ ’ОКАРКЬЫΥ3Α2
ГЕЕЗС\'рЖк.РеСЗКЗСТррТЪТ13БЬдРЕ1'ЕЦРА.ТУУС(20НУТГРРТРС01,,)иСТКи,Е 1кктВ8йр5уг1Ррр 12 врваькзетр.зуусшмнру14 ” ркеакуоикурнаьовсиб О160Е 3 УТЕ0Р5КР5Т Υ 5 ЬЗЗТЬТ1 °Ь ΒΚΑΡΥΕΚΗΚ УУАСЕУТНОс '' ‘ ЪВБРУТ КЗ РЫК ЕЕС’·'4
- 16 023053 (31.(.) ιη N0.223)
Обозначен ня подчерки ванне доступная с поверхности боковая цепь д во й 11 ое η о;ц ι е р к и в а н и с остатки, доступные для замещения цнетенном жирный шрифт области определенного практического интереса для конъюгации {удалены от областей С 1)К и внещинх/гибких петель) курсив области чрезвычайного практического интереса (около или среди остатков области СОК) светлое затенение темное затенение но)-ружейные воинутрь/педостуиные области остатки СН1 с «предрасположенностью к агрегнро нанню»
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают тяжелую цепь, включающую последовательность
ЕУеЬУЕЗОСС-ЬУОРСОВЬДТ/ 3 СААЗагМТКЛТУГНМУЕОА'1 сРВКСЬЕИУАЕI У ΡΤΝσΥΤΒ У6 “ар 5 УКОКЕТТЗАРТЗА'УГАУ8 ДеМИВЬКАБРТАУУУСЗР.ИС1 “ аОСР'г ДМРУИ<ЗОаТЬУТУВВ12°АВТКаРВУРРЬАР53КЗТЗе1 'СТААЬССЬУКРУРРЕРУТУ 310аМЫЗВАЬТЗСУНТГРйЮО5 31В0ВЬЙЗЬЗЗУУТУРВВЗЫЗТОТ2°0УТСЫУИНКРЗН τκνρκκνΕΡ2 2 ~ кзе (ЗПр Ю N0:224)
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полимер ПЭГ конъюгирован по положению в нижнем вариабельном домене легкой цепи, например, УЬ1 и/или Уъ2, соответствующим образом удаленных от областей СЭВ. и расположенных около/в смежном положении с областью локтя, но не кодируемых в ней, например §ет12, §ет14, О1и79 или 01и81, например, таким образом, что связывание молекулы никоим образом не ухудшается, а также не оказывает на него вредного воздействия. Нумерация этих остатков в легкой цепи та же и приведена по нумерации КаЪаС
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полимер ПЭГ конъюгирован по положению в нижнем вариабельном домене тяжелой цепи, например νΗ1 и/или νΗ2, соответствующим образом удаленных от областей СЭР и расположенных около/в смежном положении с областью локтя, но не кодируемых в ней, например 01и13 (01и13 по нумерации КаЪаГ) или О1и89 (О1и85 по нумерации КаЪаГ), таким образом, что связывание молекулы никоим образом не ухудшается, а также не оказывает на него вредного воздействия.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь включает последовательность §Е0 ГО N0:225 и/или 227.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает последовательность 8Е0 ГО N0:228 и/или 44.
Во всех вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгация полимера ПЭГ с объектом не ослабляет связывания/сродства гибридного белка по настоящему изобретению, а также не оказывает на него вредного воздействия.
К соответствующим примерам относятся полиалкиленовый полимер, например, поли(этиленгликоль) или особенно метоксиполи(этиленгликоль) или его производное, и особенно с молекулярной массой в диапазоне примерно от 15 до примерно 40 кДа. К другим соответствующим полимерам относятся, например, крахмалы, сложные гликоформы, например, Ν-01ιιε№·ιε и другие, например исследуемые полимеры, в том числе те, которые основаны на аминокислотах, например поли-00008, полиглутамате и полиаспартате (8сЬ1арзсйу и др., 2007; ЛШаш и др., 1997; Ζιιηίηο и др., 1982); которые основаны на углеводах, например окисленном декстране, карбометильном декстране, крахмале и полисиаловой кислоте (Радпап и др., 1990; Ваибуз и др., 1998; ОгедопгТз и др., 2000); и полностью синтетических полимерах, например поли(№винилпирролидоне), поли^-акрилоилморфолине), полиоксиэтилированном глицерине, гидроксипропилметакрилатамиде, полиметакрилате, дендримерах типа Ъоте бе и ПЭГ (Капеба и др., 2004; СаПсеЕ и др., 1999; §оисек и др., 2002).
Размер полимера может варьировать в соответствие с необходимостью, но обычно его средняя молекулярная масса может составлять от 500 до 80 кДа, например от 5 до 50 кДа, например от 20 до 40 кДа. Размер полимера может быть, в частности, выбран на основе предполагаемого применения продукта, например, исходя из способности откладываться в определенных тканях, например опухолях, или исходя из способности к более длительному периоду полураспада в кровяном русле (см. обзор СЬартап, Абуапсеб Эгид ЭеЬуегу Веу1е№3, 54, 2002, сс. 531-545). Таким образом, например, если продукт должен покинуть кровяное русло и проникнуть в ткани, например, для применения в лечении опухоли, может быть полезным применение низкомолекулярного полимера, например, с молекулярной массой около 5 кДа.
- 17 023053
Для тех случаев применения, когда продукт сохраняется в кровяном русле, может быть полезным применение высокомолекулярного полимера, например, с молекулярной массой в диапазоне от 20 до 40 кДа.
Молекулы ПЭГ могут быть присоединены через какую-либо доступную аминокислотную цепь или концевую аминокислотную функциональную группу, расположенную во фрагменте антитела, например какую-либо свободную амино, имино, тиольную, гидроксильную или карбоксильную группу. Такие аминокислоты могут естественным образом содержаться во фрагменте антитела или могут быть сконструированы во фрагменте, используя методы рекомбинации ДНК (см., например, И8 5219996, И8 5667425, \νϋ 98/25971). В одном из примеров молекулой антитела по настоящему изобретению является модифицированный фрагмент РаЪ, в котором модификацией является добавление к С-концу его тяжелой цепи одной или нескольких аминокислот для осуществления присоединения эффекторной молекулы. Соответствующим образом присоединенные аминокислоты формируют модифицированную шарнирную область, содержащую один или несколько остатков цистеина, к которым эффекторная молекула может быть присоединена. Множественные сайты могут применяться для присоединения двух или нескольких молекул ПЭГ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фрагмент РаЪ или РаЪ' ПЭГелированы одной или двумя молекулами ПЭГ.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула ПЭГ связана с цистеином 171 в легкой цепи, например см. патент νΟ 2008/038024, включенный в настоящее изобретение в виде ссылки.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фрагмент РаЪ или РаЪ' ПЭГелированы через растворимый или доступный на поверхности цистеин.
Соответствующим образом молекулы ПЭГ ковалентно связаны через тиольную группу по меньшей мере одного остатка цистеина, расположенного в гибридном белке. Каждая молекула полимера, присоединенная к гибридному белку, может быть ковалентно связана с атомом серы остатка цистеина, расположенного в белке. Ковалентная связь обычно является дисульфидной связью или, в частности, связью серы-углерода. Если тиольную группу применяют в качестве точки присоединения соответствующим образом активированных молекул ПЭГ, могут применяться, например, тиольные селективные производные, например малеимиды и производные цистеина. Активированная молекула ПЭГ может применяться в качестве исходного материала для получения молекул, содержащих гибридный с полимером белок, согласно описанному выше. Активированная молекула ПЭГ может быть каким-либо полимером, содержащим тиольную реакционноспособную группу, например α-галогенкарбоновую кислоту или сложный эфир, например иодоацетамид, имид, например малеимид, винилсульфон или дисульфид. Такие исходные материалы могут быть приобретены на коммерческой основе (например, от фирмы №к1аг, США; фирмы Νίρροη Οϊΐδ аиБ Ра15 (ΝΟΡ), Япония; фирмы Эг КеББу, Великобритания; фирмы 1еиКет, Китай; фирмы Раи Л81а Βίο, Китай; фирмы §ииВю, Южная Когеа; фирмы ВюуесБа, США) или могут быть получены из коммерчески доступных исходных материалов, используя обычные химические методы. Определенные молекулы ПЭГ включают 20К метокси-ПЭГ-амин и 20К метокси-ПЭГ-Ν-гидрокси сукцимидный сложный эфир (например, от фирмы Νίρροη Οϊΐδ аиБ Ра15 (ΝΟΡ), Япония; фирмы Эг КеББу, Великобритания; фирмы •ТеиКет, Китай; фирмы Раи Л51а Βίο, Китай; фирмы §ииВю, Южная Когеа; фирмы Карр Ро1утеге, Германия).
Эффекторные молекулы, например молекулы ПЭГ, могут быть присоединены к гибридным белкам с помощью разных методов, в том числе через альдегидные сахара или чаще через какую-либо доступную аминокислотную цепь или концевую аминокислотную функциональную группу, расположенную во фрагменте антитела, например какую-либо свободную амино, имино, тиольную, гидроксильную или карбоксильную группу. Сайт присоединения эффекторных молекул может быть или случайной, или сайт-специфичной.
Случайное присоединение часто происходит через аминокислоты, например лизин, и в результате образуются эффекторные молекулы, например молекулы ПЭГ, присоединяемые к ряду сайтов через фрагмент антитела в зависимости от положений лизинов. Хотя в некоторых случаях это было успешно, точное расположение и число эффекторных молекул, например присоединенных молекул ПЭГ, не поддается контролю, что может привести к потере активности, например, если присоединено слишком мало молекул и/или утрачено сродство, если, например, они взаимодействуют с сайтом связывания антигена (СЪартаи, ЛБуаисеБ Эгид ЭеПуегу Кеу1е^5, 54, 2002, сс. 531-545). В результате контролируемое сайтспецифическое присоединение эффекторных молекул, например, молекул ПЭГ, обычно является методом выбора.
Сайт-специфичное присоединение эффекторных молекул, например, молекул ПЭГ, наиболее часто достигается по остаткам цистеина, поскольку такие остатки относительно редки во фрагментах антитела. Шарниры антител являются обычно применяемыми областями для сайт-специфичного присоединения, поскольку содержат остатки цистеина и отдалены от других областей гибридного белка, предположительно участвующих в связывании антигена. Соответствующие шарниры или содержатся во фрагменте естественным образом, или могут быть созданы, используя методы рекомбинации ДНК (см., например И8 5677425; νΟ 98/25971; Ρόοη§ и др., СуФкше, 16, 2001, сс. 106-119; СЪартаи и др., №йиге Βΐο^^οΐ- 18 023053 оду, 17, 1999, сс. 780-783). В другом варианте или дополнительно сайт-специфичные цистеины также могут быть сконструированы во фрагменте антитела, например, для создания представленного на поверхности цистеина (цистеинов) для присоединения эффекторных молекул (Ь§ 5219996).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему изобретению включает шарнир в качестве линкера между СЬ и V® спейсером, по длине примерно соответствующим длине шарнира.
Описаны методы, в которых нативные и сконструированные цистеины применяют для сайтспецифичного присоединения эффекторных молекул, например, молекул ПЭГ (см. \УО 2005003169, \УО 2005003170 и \УО 2005003171). Во всех этих фрагментах нативная межцепочечная дисульфидная связь между константными областями тяжелой и легкой цепи (СН1 и СЬ) отсутствует или из-за того, что межцепочечные цистеины применяют в качестве сайта присоединения эффекторных молекул, или в связи с тем, что межцепочечные цистеины замещены другой аминокислотой, чтобы избежать присоединения эффекторной молекулы к таким цистеинам. Такие фрагменты также могут включать сконструированные цистеины для применения в качестве сайтов присоединения эффекторных молекул. В одном из примеров такие сконструированные цистеины представляют пару сконструированных цистеинов, которые формируют дисульфидную связь между константными областями тяжелой и легкой цепи исходного материала фрагмента антитела; указанная дисульфидная связь утрачена, однако однократно эффекторные молекулы присоединяются к таким цистеинам.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены конъюгаты молекул ПЭГ и гибридного белка, в которых тяжелые и легкие цепи фрагментов антител связаны сконструированной межцепочечной дисульфидной связью, которая не является нативной межцепочечной дисульфидной связью. Такая сконструированная межцепочечная дисульфидная связь сохраняется при присоединении эффекторной молекулы, даже при использовании сильных восстанавливающих агентов. Также предусмотрены сайты на границе раздела легкой цепи:тяжелой цепи, где пары цистеинов могут быть успешно сконструированы для внедрения дисульфидной связи, которая достаточно погружена, при этом в значительной степени недоступна для восстанавливающих агентов и эффекторных молекул, примеры погруженных дисульфидов представлены в \УО 2007010231.
Особое преимущество таких фрагментов заключается в том, что дисульфидная связь между сконструированными межцепочечными цистеинами остается интактной при присоединении эффекторной молекулы.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения согласно настоящему изобретению предусматривают гибридный белок, к которому присоединяется одна или несколько эффекторных молекул, отличающийся тем, что нативная межцепочечная дисульфидная связь между константными областями тяжелой цепи (СН1) и легкой цепи (СЬ) отсутствует и константные области тяжелой цепи (СН1) и легкой цепи (СЬ) связаны межцепочечной дисульфидной связью между парой сконструированных цистеинов, одним в константной области легкой цепи (СЬ) и другим в константной области тяжелой цепи (СН1).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЭГ конъюгирован с доступным на поверхности цистеином.
Понятие нативная межцепочечная дисульфидная связь в контексте настоящего изобретения относится к межцепочечной дисульфидной связи, которая имеется между цистеинами в константных областях тяжелой и легкой цепи, кодируемых в гене природного антитела зародышевой линии. В частности нативные межцепочечные цистеины являются цистеином в константной области легкой цепи (СЬ) и цистеином в первой константной области тяжелой цепи (СН1), которые связаны друг с другом дисульфидом в природных антителах. Примеры таких цистеинов обычно могут быть обнаружены в положении 214 легкой цепи и в положении 233 тяжелой цепи 1дС1 человека, в положении 127 тяжелой цепи 1дМ, 1дЕ, 1дС2, 1дС3, 1дС4 человека и в положении 128 тяжелой цепи 1дЬ и 1дА2В человека, установленных по нумерации, описанной КаЬа! и др. в кн.: §ециепсе5 о£ Рго!еш8 о£ 1штцпо1од1са1 1п!еге§!, 1987, Министерства здравоохранения и социальных услуг США, Национальный институт здравоохранения, США. Следует отметить, что точное положение этих цистеинов может варьировать относительно положения в природных антителах, если проведена какая-либо модификация, например, делеция, инсерция и/или замена во фрагменте антитела.
Таким образом, в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения отсутствует нативная межцепочечная дисульфидная связь. Нативная межцепочечная дисульфидная связь может отсутствовать, поскольку присоединена одна или несколько эффекторных молекул.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения нативная межцепочечная дисульфидная связь отсутствует во фрагментах антитела по настоящему изобретению, поскольку межцепочечные цистеины замещены другой аминокислотой, например серином.
Во фрагментах антител по настоящему изобретению константные области тяжелой и легкой цепи связаны межцепочечной дисульфидной связью между сконструированными цистеинами в легкой и/или тяжелой цепи.
Гибридные белки по настоящему изобретению соответствующим образом обладают связывающим
- 19 023053 'Уп и 90Υ, Ьи177 сродством, особенно выражаемым в пикомолях. Сродство можно измерить, используя какие-либо соответствующие методы, известные в данной области, включая В1Асоге. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула антитела по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 100 пМ или меньше. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 50 пМ или меньше. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 40 пМ или меньше. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему изобретению обладает связывающим сродством, составляющим примерно 30 пМ или меньше. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гибридный белок по настоящему изобретению полностью является белком человека или гуманизированным белком и обладает связывающим сродством примерно 100 пМ или меньше.
При необходимости гибридный белок по настоящему изобретению может быть конъюгирован с одной или несколькими дополнительными эффекторными молекулами. Следует отметить, что эффекторная молекула может включать одну эффекторную молекулу, или две, или несколько таких молекул, связанных таким образом, что они формируют одну часть молекулы, которая может быть присоединена к антителам по настоящему изобретению. Если необходимо получить фрагмент антитела, связанный с эффекторной молекулой, он может быть получен стандартными химическими методами или методами рекомбинации ДНК, причем фрагмент антитела связан или непосредственно, или через соединяющий агент с эффекторной молекулой. Методы конъюгации таких эффекторных молекул с антителами известны в данной области (см. НеШкгош и др. в кн.: СоШгоИей Эгид Оебуегу, 1987, 2-е изд., под ред. КоЫизои и др., сс. 623-653; ТЫогре и др., 1ттипо1. Кеу., 62, 1982, сс. 119-158, ОиЪо\ус1йк и др., РЫагтасо1оду и ТЫегареиДск, 83, 1999, сс. 67-123). К определенным химическим методам относятся, например, те, которые описаны в ХО 93/06231, ХО 92/22583, ХО 89/00195, ХО 89/01476 и ХО 03031581. В другом варианте, если эффекторной молекулой является белок или полипептид, связь может быть осуществлена, используя методы рекомбинантной ДНК, например, описанные в ХО 86/01533 и ЕР 0392745.
В контексте настоящего изобретения к понятию эффекторая молекула относятся, например, антинеопластические агенты, лекарственные средства, токсины, биологически активные белки, например ферменты, другие антитела или фрагменты антител, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например, ДНК, РНК и их фрагменты, радионуклиды, особенно радиоактивный иод, радиоизотопы, хелатированные металлы, наночастицы и репортерные группы, например флуоресцентные соединения или соединения, которые могут быть выявлены методами ЯМР или спектроскопией электронного спинового резонанса.
К примерам эффекторных молекул могут относиться цитотоксины или цитотоксические агенты, включая какие-либо агенты, которые губительны (т.е. убивают) для клеток. Примерами являются комбрестатины, доластатины, эпотилоны, стауроспорин, мейтансиноиды, спонгистатины, ризоксин, галихондрины, роридины, гемиастероины, таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидий бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхитин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи.
К эффекторным молекулам также могут относиться, но ими перечень не ограничивается, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ΒδΝυ) и ломустин (ССNυ), циклофосфамид, бусульфан, дибромоманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цисдихлордиамин платина (II) (с18-Й1сЫогоЙ1атте р1аИпит (II) - ΌΌΡ) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее называвшийся дауномицином) и доксирубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее называвшийся актиномицином), блеомицин, митрамицин, антрамицин (аикЫтатусш АМС), калихиамицины или доукармицины) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).
К другим эффекторным молекулам могут относиться хелатированные радионуклиды, например висмут , калифорнии , иридии и вольфрам /рений ; или лекарственные средства, например, но ими перечень не ограничивается, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы I, таксоиды и сурамин.
К другим эффекторным молекулам относятся белки, пептиды и ферменты. К соответствующим ферментам относятся, но ими не ограничиваются, протеолитические ферменты, гидролазы, лиазы, изомеразы, трансферазы. К соответствующим белкам, полипептидам и пептидам относятся, но ими не ограничиваются, иммуноглобулины, токсины, например, абрин, рицин А, экзотоксин псевдомонад или дифтерийный токсин, белки, например инсулин, фактор некроза опухоли, α-интерферон, β-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста или тканевый активатор плазминогена, антитромботический агент или антиангиогенный агент, например ангиостатин или эндостатин, или модификатор биологического ответа, например лимфокин, интерлейкин-1 (ΓΕ-1), интерлейкин-2 (ГЕ-2), гранулоцитарныймакрофагальный колониестимулирующий фактор (дтапи1осу!е тасгорЫаде со1опу 8Йти1аДпд ГасЮг - СМ- 20 023053
С8Р), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (дгапи1осу!е со1опу кРти1айпд ГасЮг-О-С8Р), фактор роста нервов (пегуе дгоЩЬ ГасЮг -ΝΟΡ) или другие факторы роста, и иммуноглобулины.
К другим эффекторным молекулам могут относиться выявляемые вещества, применимые, например, в диагностике. К примерам выявляемых веществ относятся различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные нуклиды, металлы с позитронной эмиссией (для применения в позитрон-эмиссионной томографии) и ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов. См. в целом И8 4741900 по ионам металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами для применения в диагностике. К соответствующим ферментам относятся пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза; к соответствующим простетическим группам относятся стрептавидин, авидин и биотин; к соответствующим флуоресцентным материалам относятся умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеина, дансил хлорид и фикоэритрин; соответствующим люминесцентным материалом является люминол; к соответствующим биолюминесцентным материалам относятся люцифераза, люциферин и экворин; и к соответствующим радионуклидам отно„ „ 125т 131т сятся I, I, ш1п и 99Тс.
В другом примере эффекторная молекула может повысить период полураспада антитела ш У1уо и/или снизить иммуногенность антитела и/или повысить доставку антитела через эпителиальный барьер в иммунную систему. К примерам соответствующих эффекторных молекул этого типа относятся полимеры, альбумин, альбуминсвязывающие белки или альбуминсвязывающие соединения, например, описанные в \УО 05/117984.
Если эффекторной молекулой может быть полимер, он может быть синтетическим или природным полимером, например, полимером полиалкиленом, полиалкениленом или полиоксиалкиленом с необязательно замещенной прямой или разветвленной цепью или разветвленным или неразветвленным полисахаридом, например, гомо- или гетерополисахаридом.
К специфическим заместителям, которые могут содержаться в указанных выше синтетических полимерах, относятся одна или несколько гидрокси-, метил- или метоксигрупп.
К специфическим примерам синтетических полимеров относятся необязательно замещенные прямые или разветвленные цепи из поли(пропиленгликоля), поливинилового спирта) или их производных, особенно необязательно замещенного поли(этиленгликоля), например, метоксиполи(этиленгликоля) или его производных.
К специфическим природным полимерам относятся лактоза, амилоза, декстран, гликоген или их производные.
Понятие производные в контексте настоящего изобретения относится к реакционноспособным производным, например тиол-селективным реакционноспособным группам, например малеимидам и др. Реакционноспособная группа может быть связана прямо или через сегмент линкера с полимером. Следует подчеркнуть, что остаток такой группы в некоторых случаях может формировать часть продукта в качестве связывающей группы между гибридным белком и полимером.
Настоящее изобретение также предусматривает выделенную ДНК, кодирующую антитело, описанное в настоящем изобретении, или фрагмент его тяжелой или легкой цепи.
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают вектор, включающий указанную ДНК.
Основные методы, с помощью которых эти векторы могут быть сконструированы, методы трансфекции и методы культивирования известны специалистам в данной области. В этом отношении с информацией можно ознакомиться в кн.: Сиггеп! РгоЮсок ш Мо1еси1аг Вю1о§у, 1999, под ред. Р.М. АикиЬе1, изд-во \УПеу ПИегкаепсе, Нью-Йорк, и в руководстве Маниатиса издательства Со1й §рппд Ήа^Ьо^ РиЬНкЫпд.
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают клетку-хозяина, включающую указанный вектор и/или ДНК.
Какая-либо соответствующая система клетки-хозяина/вектора может применяться для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулу гибридного белка по настоящему изобретению. Могут применяться бактериальные, например Е.соП, и другие микробные системы, или также могут применяться эукариотические системы клеток-хозяев, например млекопитающих. К соответствующим клеткам-хозяевам млекопитающих относятся клетки СНО, клетки миеломы или гибридомы.
Настоящее изобретение также предусматривает способ получения молекул гибридного белка по настоящему изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор (и/или ДНК) по настоящему изобретению в условиях, пригодных для проведения экспрессии белка с ДНК, кодирующей молекулу антитела по настоящему изобретению, и выделение молекулы антитела.
Для получения продуктов, включающих и тяжелые, и легкие цепи, линия клеток может быть трансфецирована двумя векторами: первым вектором, кодирующим полипептид легкой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид тяжелой цепи. В другом варианте может применяться один вектор, включающий последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.
Молекулы гибридных белков по настоящему описанию экспрессируются клетками-хозяевами на хороших уровнях. Таким образом, свойства молекул гибридных белков оптимизированы и способствуют
- 21 023053 коммерческой переработке.
Молекулы гибридных белков по настоящему описанию применимы для лечения и/или профилактики патологического состояния.
Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает молекулы гибридных белков для применения в лечении, для введения их терапевтически эффективных количеств. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы гибридных белков вводят в виде фармацевтического состава, включающего фармацевтически приемлемый эксципиент.
Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую или диагностическую композицию, включающую молекулы гибридного белка по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими из фармацевтически приемлемых эксципиентов, растворителей или носителей. Таким образом, предусматривают применение молекул гибридных белков по настоящему изобретению для получения лекарственного средства. Композиция обычно может поставляться в качестве части стерильной фармацевтической композиции, которая может в норме включать фрмацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый адъювант.
Настоящее изобретение также предусматривает способ получения фармацевтической или диагностической композиции, включающей добавление и перемешивание молекул гибридного белка по настоящему изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями.
Молекула гибридного белка может быть единственным действующим ингредиентом в фармацевтической или диагностической композиции или может дополняться другими действующими ингредиентами, включая другие ингредиенты антител, например, анти-ΤΝΡ, анти-ГЬ-Щ, анти-Т-клетки, анти-ΙΡΝγ или анти-ЛПС антитела, или ингредиентами, не относящимися к антителам, например ксантинами. К другим действующим ингредиентам относятся антитела, способные индуцировать устойчивость, например анти-СЭ3 или анти-СЭ4 антитела.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекулу гибридного белка или композицию по настоящему изобретению применяют в комбинации с другим агентом фармацевтического действия, например кортикостероидом (например, флутиказоном пропионатом) и/или бета-2-агонистом (например, сальбутамолом, салметеролом или формотеролом) или ингибиторами роста и пролиферации клеток (например, с рапамицином, циклофосфамидом, метотрексатом) или в другом варианте ингибитором С.'Э28 и /или СЭ40. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибитор является низкомолекулярное соединение. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитором является антитело, специфичное в отношении мишени.
Фармацевтические композиции соответствующим образом включают терапевтически эффективное количество антитела по настоящему изобретению. В контексте настоящего изобретения понятие терапевтически эффективное количество относится к количеству терапевтического агента, необходимому для лечения, облегчения или предупреждения целевого заболевания или состояния, или для проявления выявляемого терапевтического или профилактического эффекта. Для какого-либо антитела терапевтически эффективное количество может быть установлено первоначально или в культуре клеток, или на животных моделях, обычно на грызунах, кроликах, собаках, свиньях или приматах. Животные модели также можно использовать для определения диапазона соответствующей концентрации и способа введения. Такая информация затем может применяться для определения доз и способов для введения людям.
Тщательно установленное терапевтически эффективное количество для человека зависит от тяжести заболевания, общего состояния здоровья субъекта, возраста, массы тела и пола субъекта, питания, времени и частоты введения, комбинации (комбинаций) лекарственных средств, реакционной чувствительности и устойчивости/ответа на лечение. Это количество может быть определено путем обычного эксперимента и определяется практикующими врачами. Обычно терапевтически эффективное количество может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, например от 0,1 до 20 мг/кг. Фармацевтические композиции могут быть представлены в отдельных дозированных формах, содержащих предварительно установленное количество действующего агента по настоящему изобретению на дозу.
Композиции могут вводиться пациенту отдельно или в комбинации (например, одновременно, последовательно или раздельно) с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.
Доза, в которой молекулу гибридного белка по настоящему изобретению вводят в зависимости от природы состояния, подвергаемого лечению, степени имеющегося воспаления и от того, применяют ли молекулу антитела профилактически или для лечения имеющегося состояния.
Частота дозирования может зависеть от периода полураспада молекулы антитела и длительности ее действия. Если у молекулы антитела период полураспада короткий (например, от 2 до 10 ч), может потребоваться введение одной или нескольких доз в сутки. В другом варианте, если молекула антитела имеет длительный период полураспада (например, от 2 до 15 суток), может потребоваться введение дозы раз в сутки, раз в неделю или даже один раз каждые 1 или 2 месяца.
Фармацевтически приемлемый носитель сам не должен индуцировать выработку антител, вредных для индивидуума, получающего композицию и не должен быть токсичным. Соответствующие носители
- 22 023053 могут быть крупными, медленно метаболизируемыми макромолекулами, например белками, полипептидами, липосомами, полисахаридами, полимолочными кислотами, полигликолиевыми кислотами, полимерными аминокислотами, аминокислотными сополимерами и инактивированными вирусными частицами.
Могут применяться фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, например гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты или соли органических кислот, например ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, например воду, физраствор, глицерин и этанол. Дополнительно, вспомогательные вещества, например агенты увлажнения, или эмульгаторы, или рН буферные вещества могут содержаться в таких композициях. Такие носители позволяют перерабатывать фармацевтические композиции в таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, гидросмеси и суспензии для проглатывания пациентом.
К соответствующим формам для введения относятся формы, пригодные для парентерального введения, например, путем инъекции или инфузии, например болюсной инъекцией или непрерывной инфузией. Если продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может быть в форме суспензии, раствора или эмульсии в масле или водном растворителе, и он может содержать агенты для переработки, например суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В другом варианте молекула антитела может быть в сухой форме, предназначенной для восстановления перед применением с соответствующей стерильной жидкостью.
Будучи переработанными, композиции по настоящему изобретению могут быть непосредственно введены субъекту. Субъектами, подвергаемыми лечению, могут быть животные. Однако в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения композиции адаптированы для введения людям.
Соответствующим образом в составах по настоящему описанию рН итогового состава отличается от величины изоэлектрической точки антитела или фрагмента, например, если величина рН состава равна 7, тогда величина ρΐ от 8-9 или выше может быть соответствующей величиной. Хотя нет теоретического обоснования, предполагают, что это может в конечном счете обеспечить итоговый состав с улучшенной стабильностью, например антитело или фрагмент остается в растворе.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут вводиться каким-либо из способов, включая, но ими не ограничиваясь, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, подоболочечный, внутрижелудочковый, чрезкожный (например, см. \УО 98/20734), подкожный, внутрибрюшинный, интраназальный, энтеральный, местный, подъязычный, внутривлагалищный или ректальный способ введения. Обычно терапевтические композиции могут быть получены в виде инъекционных средств, или в виде жидких растворов, или в виде суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы для растворения или приготовления суспензии в жидком растворителе перед инъекцией.
Непосредственная доставка композиций обычно может осуществляться инъекцией, введенной подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно, или вводится в межклеточное пространство тканей. Композиции также могут вводиться в рану. Дозирование при лечении может быть по схеме однократного дозирования или по схеме многократного дозирования.
Следует учесть, что действующим ингредиентом в композиции может быть молекула гибридного белка. В этом случае она может быть разрушена в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композицию вводят через желудочно-кишечный тракт, в ней должны быть агенты, которые защищают антитело от разрушения, но высвобождают антитело, когда оно всасывается из желудочно-кишечного тракта.
В кн.: Кеш1п§1ои'8 РЬагтасеиЬса1 Баеисек, 1991, изд-во Маек РиЪБкЫпд Сотрапу, Нью-Джерси, можно ознакомиться с подробным анализом фармацевтически приемлемых носителей.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав предусмотрен в качестве состава для местного введения, в том числе для ингаляции. Соответствующие препараты для ингаляции включают порошки для ингаляции, дозируемые аэрозоли, содержащие газы-вытеснители, или растворы для ингаляции, не содержащие газов-вытеснителей. Порошки для ингаляции по настоящему изобретению, содержащие действующее вещество, могут состоять исключительно из указанных выше действующих веществ с физиологически приемлемым эксципиентом.
Порошки для ингаляции могут включать моносахариды, например, глюкозу или арабинозу), дисахариды (например, лактозу, сахарозу, мальтозу), олиго- и полисахариды (например, декстраны), полиспирты (например, сорбит, манит, ксилит), соли (например, натрий хлорид, кальций карбонат) или их смеси. Моно- или дисахариды применяют соответствующим образом, лактозу или глюкозу, особенно, но не исключительно, применяют в форме их гидратов.
Частицы для отложения в легких должны иметь размер менее 10 мкм, например 1-9 мкм, например от 0,1 до 5 мкм, в частности от 1 до 5 мкм. Размер частиц действующего ингредиента (например, антитела или фрагмента) имеет особо важное значение.
- 23 023053
Газы-вытеснители, которые могут применяться для получения аэрозолей для ингаляции, известны в данной области. Соответствующие газы-вытеснители выбирают из углеводородов, например, п-пропана, п-бутана или изобутана, и галогенсодержащих углеводородов, например хлорированных и/или фторированных производных метана, этана, пропана, бутана, циклопропана или циклобутана. Указанные выше газы-вытеснители могут применяться отдельно или в виде их смесей.
Особенно применимыми газами-вытеснителями являются галогенированные алканные производные, выбранные из Т011, Т012, Т0134а и Т0227. Из указанных выше галогенированных углеводородов, Т0134а (1,1,1,2-тетрафторэтана) и Т0227 (1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропана) и их смеси особенно применимы.
Аэрозоли, содержащие газы-вытеснители для ингаляции, также могут содержать другие ингредиенты, например сопутствующие растворители, стабилизаторы, поверхностно-активные агенты (сурфактанты), антиоксиданты, смазывающие агенты и средства для коррекции рН. Все эти ингредиенты известны в данной области.
Аэрозоли, содержащие газы-вытеснители для ингаляции по настоящему изобретению, могут содержать до 5 мас.% действующего вещества. Аэрозоли по настоящему изобретению содержат, например, 0,002-5, 0,01-3, 0,015-2, 0,1-2,0,5-2 или 0,5-1 мас.% действующего ингредиента.
В другом варианте местное введение в легкие также может быть введением состава жидкого раствора или суспензии, например, с помощью устройства, например небулайзера, например, соединенного с компрессором небулайзера (например, небулайзера Рап ЬС-М Р1ий(Р), соединенного с компрессором Рап Май1ег(Р) фирмы Рап РсйриаЮгу ЕсциртсШ. 1пс., Ричмонд, Вирджиния).
Молекулы гибридного белка по настоящему изобретению могут доставляться диспергированными в растворителе, например, в форме раствора или суспензии. Белок может быть суспендирован в соответствующем физиологическом растворе, например в физрастворе или другом фармакологически приемлемом растворителе или буферном растворе. Известные в данной области буферные растворы могут содержать от 0,05 до 0,15 мг динатриевого эдитата, от 8,0 до 9,0 мг №С1, от 0,15 до 0,25 мг полисорбата, от 0,25 до 0,30 мг безводной лимонной кислоты и от 0,45 до 0,55 мг натрия цитрата в 1 мл воды таким образом, чтобы достичь величины рН примерно от 4,0 до 5,0. Суспензия может содержать, например, лиофилизированное антитело.
Составы терапевтических суспензий или растворов также могут содержать один или несколько эксципиентов. Эксципиенты хорошо известны в данной области и к ним относятся буферы (например, цитратный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевина, спирты, аскорбиновая кислота, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), ЕИТА, натрий хлорид, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии могут быть включены в липосомы или биоразрушаемые микросферы. Состав обычно получают практически в стерильной форме, используя стерильный процесс производства.
Такой процесс может включать получение и стерилизацию путем фильтрации буферного растворителя/раствора, применяемого для состава, асептическая суспензия антитела в стерильном буферном растворе растворителя и помещение состава в стерильные резервуары методами, известными специалистам в данной области.
Состав для распыления по настоящему описанию может быть применим, например, в качестве отдельных единиц дозирования (например, в пластиковых запечатанных контейнерах или ампулах), упакованных в пакеты из фольги. Каждая ампула содержит единичную дозу в объеме, например, в 2 мл, растворителя/буферного раствора.
Предусматривают, чтобы молекула гибридного белка по настоящему изобретению была приспособлена для доставки путем распыления.
Материалы, включенные в настоящее описание, дополнительно поясняют сущность настоящего изобретения.
В тех случаях, когда это технически осуществимо, варианты осуществления настоящего изобретения могут комбинироваться.
Варианты осуществления настоящего изобретения описаны в качестве вариантов, включающих определенные свойства/элементы. Сущность настоящего изобретения также распространяется на отдельные варианты осуществления настоящего изобретения, в значительной степени состоящие из указанных свойств/элементов или включающие их.
Настоящее изобретение дополнительно описывают с помощью иллюстраций, приводимых только в приведенных ниже примерах, которые относятся к прилагаемым фигурам.
Фиг. 1 показывает различные форматы гибридных белков по настоящему описанию; фиг. 2А - различные известные форматы фрагментов антител;
фиг. 2Б - одну возможную сборку для димерного формата, соответствующую настоящему изобретению;
фиг. 3 - аминокислотную последовательность легкой цепи антитела 4Ό5; фиг. 4 - аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела 4Ό5;
фиг. 5 - конструкцию А26РаЬ-(3х04§)-бйРу645 с положениями мутаций поверхностных цистеинов
- 24 023053 (Суз), показанных жирным шрифтом;
фиг. 6 - гель без восстановления ПЭГелированных мутантов Л26РаЬ-(3х048)-Й8ру645, 8182 и 8163.
Примеры
РаЬ-άδΡν.
Гибриды антител в формате РаЬ-άδΡν получают согласно описанию, представленному в \У0 2010/035012. Конструкция РаЬ-άδΡν включает вариабельные области из антитела ОХ-40, обозначаемые А26, которые описаны в \У0 2010/096418 и представлены на фиг. 5 (8ЕЦ ГО N08: 225 и 228), и последовательностей вариабельной области антитела против сывороточного альбумина человека, обозначаемого 645 согласно описанному в \У0 2010/035012 и представленному на фиг. 5 8ЕЦ ГО N0: 227 и 44. Форматом является А26ΡаЬ-άδ645Ρν.
Определенные остатки в РаЬ-άδΡν А26-645 выбирают для интродукции остатков цистеина в качестве точек ПЭГелирования. Выбранные мутации имеются и в тяжелой, и в легкой цепи, а также и в РаЬ, и в Ρν. Были предприняты усилия по удалению остатков из областей СОК и каких-либо других структурно важных мотивов для ограничения воздействия на выработку белка, его укладку, сродство и стабильность.
Выбранные остатки показаны на фиг. 5 и в табл. 4. На фиг. 5 специфические остатки пронумерованы и выделены жирным шрифтом.
Таблица 4
Мутации 5 и 13 произведены в качестве контролей, в которых один из двух остатков цистеина, который участвует в межцепочечной дисульфидной связи, в результате мутации заменен на серин, а другой остаток оставлен в качестве сайта для ПЭГелирования.
Мутагенез гибридной конструкции РаЬ-άδΡν.
Сайт-направленный мутагенез по каждому положению в табл. 4, пронумерованному по системе нумерации КаЬа!, в ΡаЬ-άδΡν А26-645 проводят следующим образом: вектор, кодирующий ΡаЬ-άδΡν А26645, подвергают сайт-направленному мутагенезу, используя стандартный метод перекрывающейся ПЦР. Вкратце, два мутагенных олигонуклеотида применяют наряду с двумя фланкирующими олигонуклеотидами для выработки двух мутантных продуктов ПЦР в двух разных реакциях ПЦР. Небольшой объем (обычно примерно 1 мкл) сырца продукта перекрывающейся ПЦР из каждой реакции применяют в качестве матрицы в 3-й сборке ПЦР, используя те же два фланкирующих олигонуклеотида. В результате получают последовательность мутантной ДНК полной длины, которую клонируют рестрикцией/лигированием в плазмиде экспрессии перед контролем путем секвенирования ДНК.
Конструкция гибридных плазмид ΡаЬ-άδΡν для экспрессии в клетках млекопитающих.
Каждый мутант тяжелой цепи ΡаЬ-άδΡν клонируют в векторе экспрессии млекопитающих под контролем промотора НСМУ-М1Е и полиА последовательности 8У40Е. Их спаривают со схожим вектором, содержащим соответствующую ΡаЬ-άδΡν легкую цепь для экспрессии в клетках млекопитающих (см. ниже).
Экспрессия в клетках млекопитающих ΡаЬ-άδΡν.
Клетки НЕК293 трансфецируют плазмидами тяжелой и легкой цепей, используя реагент для трансфекции 293ГесЬп фирмы ЬиДгодеп по инструкциям производителя. Вкратце, 2 мкг плазмиды тяжелой цепи + 2 мкг плазмиды легкой цепи инкубируют с 10 мкл 293ГесЬп + 340 мкл среды 0рйтет в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем смесь добавляют к 5х10 клеткам НЕК293 в суспензии и инкубируют в течение 4 суток при перемешивании при 37°С.
Очистка с белком 0.
Суспензии после экспрессии в клетках млекопитающих осветляют центрифугированием и супернатанты концентрируют до 2 мл, используя концентраторы для отсечения центрифугированием соединений с молекулярной массой 10 кДа. Сконцентрированные супернатанты центрифугируют в режиме 16000 д в течение 10 мин для удаления какого-либо осадка и затем 1,8 мл загружают в колонки НГГгар Рго1еш-0 объемом 1 мл (фирма 0Е НеаЙЬсаге) со скоростью 1 мл/мин. Колонки промывают 20 мМ фосфатом, 40 мМ №С1 рН 7,4 и связанный материал элюируют с помощью 0,1 М глицина/НС1 рН 2,7. Пик элюции (2,5 мл) собирают и величину рН доводят до ~рН7 с помощью 100 мкл 2 М Тпз/НС1 рН 8,5.
- 25 023053
Элюаты с установленной величиной рН диализируют в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), используя концентраторы для отсечения центрифугированием соединений с молекулярной массой 10 кДа, и концентрируют до ~500 мкл.
Все конструкции РаЬ-άδΡν, за исключением ТЬг109Су8 и А8п216Су8, экспрессируются довольно хорошо. Последовательности ДНК обоих слабо экспрессирующих мутантов были проверены, поскольку с этими последовательностями не было осложнений до тех пор, пока у обоих мутантов не показано очень низкой продуктивности, ни ТЬг109Су8 в легкой цепи, ни А8п211Су8 в тяжелой цепи, в дальнейшем не исследуют.
Анализ В1асоге.
Связывающее сродство и кинетические параметры по взаимодействиям конструкций РаЬ-άδΡν определяют методом поверхностного плазмонного резонанса (АнгГасе р1актоп гезопапсе - δΡΚ) на приборе В1асоге 3000, используя сенсорные чипы СМ5 и подвижный буфер НВ8ШР (10 мМ 4ΕΡΕδ (рН 7,4), 150 мМ №С1, 3 мМ Ε^ТΑ, 0,05 об.% поверхностно активного вещества Р20). Образцы РаЬ-άδΡν захватываются поверхностью сенсорного чипа, используя или козий фрагмент РаЬ, специфичный в отношении Р(аЬ')2 человека (фирма 1аскзоп Нпишпойекеагск 109-006-097), или самостоятельно полученное моноклональное антитело против СН1 человека. Ковалентная иммобилизация захваченного антитела достигается стандартными химическими методами присоединения амина.
Каждый цикл исследования состоит, во-первых, из захвата конструкции РаЬ-άδΡν, применяя инъекцию длительностью 1 мин, перед фазой ассоциации, состоящей из инъекции антигена длительностью 3 мин, после чего диссоциацию подвергают мониторингу в течение 20 мин. После каждого цикла захваченную поверхность регенерируют с помощью 2x1 мин инъекций 40 мМ НС1, затем в течение 30 с 5 мМ №ЮН. Применяют следующие скорости тока: 10 мкл/мин для захвата, 30 мкл/мин для фаз ассоциации и диссоциации и 10 мкл/мин для регенерации.
Для кинетических исследований титруют антиген, пустую проточную кювету используют для вычитания контроля, а инъекции только буфера учитывают для вычитания шума инструмента и сдвига.
Кинетические параметры определяют путем одновременной общей наладки получаемых сенсограмм по стандартной модели связывания 1:1, используя программное обеспечение В1асоге 3000 Ενа1иайоп зойтеаге.
Таблица 5. Сродство мутантов А26-645 в отношении Н8А и Ох40
ка (1/мсек) кд (1/сек) Κϋ (М) Κϋ (нМ)
0x40 А2б-645стандарт 4.52Е+05 1.49Е-04 3.28Е-10 0,33
А26-645 Суз2148егК 4.37Е+05 1,22Е-04 2.78Е-10 0,28
А26-645 Аяп21 ОСуз К 4,83Е+05 1Д1Е-04 2,29Е-10 0,23
А26-645 8ег171Суз К 4,77Е+05 9,24 Е-05 1.94Е-10 0,19
А26-645 Ьу5149Суз К 4,65Е+05 1.07Е-04 2,31Е-10 0,23
ка(1/мсек) кд (1/сек) Κϋ (М) Κϋ (нМ)
А26-645 Ьуз145Су5 К 4.57Е+05 1Д0Е-04 2,41Е-10 0,24
А26-645 О1и143Суз К 4,77Е+05 1.55Е-04 3.25Е-10 0,33
А26-645 ЬузЮ7Суз К 5Д5Е+05 1.20Е-04 2,34Е-10 0,23
А26-645 Зег77Суз К 4,70Е+05 1.17Е-04 2.48Е-10 0,25
А26-645 Суз2335ег Н 4.61Е+05 Ι.24Ε-04 2,70Е-10 0,27
А26-645 8ег180Суз Н 4,37Е+05 1.08Е-04 2,47Е-10 0,25
А26-645 8ег163Суз Н 5.50Е+05 1.46Е-04 2,65Е-10 0,27
А26-645 Тйг116Суз Н 5,40Е+05 1.46Е-04 2.70Е-10 0,27
А26-645 8ег82ЬСуз Н 4.73Е+05 1,17 Е-04 2.47Е-10 0,25
А26-645стандарт* 4ДЗЕ+05 1,91 Е-04 4.63Е-10 0,46
ка (1/мсек) ка (1/сек) Κϋ (М) Κϋ (нМ)
СО я А26-645стандарт 1,03Е+05 4,21 Е-04 4Д1Е-09 4,11
А26-645 Суз2143егК 1.66Е+05 2.82Е-04 1.70Е-09 1,70
А26-645 Азп210Суз К 1,78Е+05 2.84Е-04 1,60Е-09 1,60
А26-645 8ег171СузК 1.25Е+05 2.57Е-04 2.06Е-09 2,06
А26-645 Ьуз149Суз К 1,45Е+05 2.50Е-04 1.72Е-09 1,72
А26-645 Ьуз145Суз К 1.37Е+05 2,59Е-04 1,89Е-09 1,89
А26-645 О1и143СузК 1.53Е+05 3.37Е-04 2,20Е-09 2,20
А26-645 Ьуз!07Суз К 1.50Е+05 3.42Е-04 2.28Е-09 2,28
А26-645 8ег77Суз К 1.02Е+05 2,82Е-04 2,75Е-09 2,75
А26-645 Суз2338ег Н 1.57Е+05 2.75Е-04 1.76Е-09 1,76
А26-645 8ег182Суз Н 2Д0Е+05 4,11 Е-04 1.95Е-09 1,95
А26-645 8ег163Суз Н 2,161+05 7,22Е-04 3,34Е-09 3,34
А26-645 ТЬг116Суз Н 1.88Е+05 3,51 Е-04 1.87Е-09 1,87
А26-645 8ег82ЬСуз Н 2.36Е+05 2.57Е-04 1.09Е-09 1,09
А26-645стандарт * 1.29Е+05 4,61 Е-04 3.57Е-09 3,57
Восстановление и ПЭГелирование конструкции ΡаЬ-ά8Ρν-Су8.
Очищенную белком О конструкцию РаЬ-άδΡν, содержащую интродуцированные сайты ПЭГелирования по цистеину по положению 8182С или 8163С в СН1 в 0,1 М фосфате, 2 мМ Ε^ТΑ, рН6, восстанавливают путем добавления 100 мМ β-меркаптоэтиламина фМЕА) в 0,1 М фосфате, 2 мМ Ε^ТΑ, рН6, до
- 26 023053 конечной концентрации 1 мМ. Реакции восстановления инкубируют в течение 1 ч при температуре окружающей среды до начала фракционирования с помощью §Е-НРЬС на колонке 8ерйасгу1-200 10/30 в изократическом градиенте 0,1 М фосфата, 2 мМ ΕΌΤΑ рН6. Фракцию объемом 500 мкл, содержащую основное количество мономера РаЪ-άδΡν, выявляют и делят на две части. К одной части добавляют 5 мкл 150 мг/мл δϋΝΒΚΙΟΗΤ МЕ-200МА ПЭГ (фирма ΝΟΡ) в 0,1 М фосфате, 2 мМ ΕΌΤΑ рН6, молекулярной массой 20 кДа, малеимид активный ПЭГ. К другой части добавляют 5 мкл 100 мМ Ν-этилмалеимида ^ЭМ) в 0,1 М фосфате, 2 мМ ΕΌΤΑ рН6. Все образцы инкубируют в течение ночи при температуре окружающей среды. Образцы анализируют в невосстанавливающем геле 4-20% акрилимид Τήδ/глицин. Гель окрашивают серебром, используя набор Ο\ν1 ЗГОег δΐηίη по инструкциям производителя. См. фиг. 6.
Фиг. 6.
А = 3182С СН1 +ПЭГ
Б = 3163С СН1 +ПЭГ
Β = 3182С СН1 -\Э\1
Дорожка В на фиг. 6 показывает, что восстановление не разрушает внутренние или внешние дисульфидные связи в РаЪ-άδΡν. После фореза имеется только одна полоса в том же положении, что и точно связанная дисульфидом конструкция РаЪ-άδΡν при сравнении со стандартом, который не претерпевает восстановления и NЭМ кэппирования (данные не представлены). На дорожках А и Б имеется по две полосы, из которых нижняя соответствует точно связанной дисульфидом конструкции РаЪ-άδΡν, а нижняя является ПЭГелированной точно связанной дисульфидом конструкцией РаЪ-άδΡν. Сдвиг в геле означает добавление молекулы ПЭГ массой 20 кДа. При применении малеимидной химии эти данные показывают сайт-специфическое ПЭГелирование РаЪ-άδΡν по внедренному сайту ПЭГелирования по цистеину в положениях 3182С и 3163С на СН1.

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Рекомбинантный гибридный белок, включающий тяжелую цепь,состоящую из последовательно с Ν-конца вариабельного домена номинально УН1, области СН1 и дополнительного вариабельного домена номинально УН2, легкую цепь, состоящую из последовательно с Ν-конца вариабельного домена номинально Уь1, домена СЬ и вариабельного домена номинально Уъ2, причем указанные тяжелую и легкую цепи выравнивают для обеспечения первого сайта связывания, сформированного первой вариабельной доменной парой УН1 и Уь1, и второго сайта связывания, сформированного второй вариабельной доменной парой УН2 и Уъ2, при этом имеется дисульфидная связь внутри второй вариабельной доменной пары УН2 и Уъ2, и указанный гибридный белок конъюгирован с одной или двумя молекулами ПЭГ.
  2. 2. Рекомбинантный гибридный белок по п.1, в котором имеется дисульфидная связь внутри первой вариабельной доменной пары УН1 и Уь1.
  3. 3. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1, 2, в котором аминокислота в УН2 непосредственно связана с аминокислотой в СН1 пептидной связью.
  4. 4. Рекомбинантный гибридный белок по п.1, в котором УН2 связан с СН1 опосредованно с помощью линкера.
  5. 5. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-4, в котором аминокислота в Уъ2 непосредственно связана с аминокислотой в СЬ пептидной связью.
  6. 6. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-4, в котором Уъ2 связан с СЬ опосредованно с помощью линкера.
  7. 7. Рекомбинантный гибридный белок по п.4 или 6, в котором линкер имеет последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ ΝΟ:226.
  8. 8. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-7, в котором рекомбинантный гибридный белок ПЭГелирован через растворимый доступный цистеин.
  9. 9. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-7, причем рекомбинантный гибридный белок ПЭГелирован через межцепочечный цистеин в СН1 и/или СЬ.
  10. 10. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-7, который ПЭГелирован по сконструированному цистеину в легкой цепи, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 34, 39, 41, 42, 43, 55, 56, 57, 60, 61, 63, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 81, 107, 108, 109, 110, 114, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 143, 144, 145, 147, 149, 151, 152, 153, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 167, 168, 169, 170, 171, 190, 195, 197, 199, 200, 202, 203, 205, 206, 210, 211, 212 и 213, пронумерованных по системе нумерации КаЪа!, такой, например, как рекомбинантный гибридный белок, который ПЭГелирован по сконструированному цистеину в легкой цепи, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 77, 107, 109, 143, 145, 149 и 210, пронумерованных по системе нумерации КаЪаБ
  11. 11. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-10, который ПЭГелирован по сконструи- 27 023053 рованному цистеину в тяжелой цепи, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 3, 7, 8, 9, 10, 13, 15, 16, 17, 21, 26, 40, 43, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 66, 68, 70, 72, 82а, 82Ъ, 82с, 84, 85, 86, 96, 97, 98, 99, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 120, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 156, 163, 164, 165, 167, 168, 169, 176, 177, 179, 180, 182, 183, 195, 196, 197, 199, 200, 203, 205, 213, 215, 216, 218, 220, 222 и 232, пронумерованных по системе нумерации КаЬак такой, например, как рекомбинантный гибридный белок, который ПЭГелирован по сконструированному цистеину в тяжелой цепи, причем положение указанного сконструированного цистеина выбрано из группы, состоящей из положений 82Ъ, 116, 163, 182 и 216, пронумерованных по системе нумерации КаЪаГ
  12. 12. Рекомбинантный гибридный белок по любому из пп.1-11, в котором молекулы ПЭГ имеют молекулярную массу в диапазоне от 5000 до 80000 Да.
  13. 13. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-12, в котором домен УН1 в тяжелой цепи является вариабельным доменом из тяжелой цепи или вариабельным доменом из легкой цепи, домен УН2 в тяжелой цепи является вариабельным доменом из тяжелой цепи или вариабельным доменом из легкой цепи; и УЬ1 в легкой цепи является вариабельным доменом из легкой цепи или тяжелой цепи, и домен У[ 2 в легкой цепи является вариабельным доменом из легкой цепи или тяжелой цепи.
  14. 14. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-13, в котором домен УН2 является вариабельным доменом из тяжелой цепи и домен Уъ2 является вариабельным доменом из легкой цепи.
  15. 15. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-14, в котором вторая вариабельная доменная пара связана дисульфидной связью между двумя остатками цистеина, одним в домене УН2 и одним в домене Уъ2, причем положение двух остатков цистеина выбрано из группы, состоящей из положений УН37 и УЬ95, УН44 и УЪ100, УН44 и УЬ105, УН45 и УЪ87, УН100 и УЪ50, УН100Ъ и УЪ49, УН98 и УЪ46, УН101 и УЪ46, УН105 и УЪ43 и УН106 и УЪ57, так, например, в котором цистеин домена УН2 находится в положении 44 и цистеин домена Уъ2 находится в положении 100.
  16. 16. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-15, в котором каждая из двух вариабельных доменных пар является родственной парой.
  17. 17. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-16, в котором две вариабельные доменные пары, каждая из которых комплементарна паре УН/УЪ, совместно связывают антиген.
  18. 18. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-17, в котором домены СН1 и СЬ производны от 1дО1.
  19. 19. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-18, являющийся димеризованным, где димеризация выбрана из:
    а) димеризация непосредственно через дисульфидную связь и
    б) димеризация через химический линкер, например через линкер ПЭГ или через пептидный линкер.
  20. 20. Рекомбинантный гибридный белок по п.19, который димеризуется через растворимые доступные цистеины.
  21. 21. Рекомбинантный гибридный белок по одному из пп.1-20, являющийся биспецифичным или моноспецифичным.
EA201200725A 2009-11-17 2010-11-17 Поливалентные антитела EA023053B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0920127.8A GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-11-17 Antibodies
PCT/GB2010/002120 WO2011061492A2 (en) 2009-11-17 2010-11-17 Multivalent antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201200725A1 EA201200725A1 (ru) 2012-12-28
EA023053B1 true EA023053B1 (ru) 2016-04-29

Family

ID=41509519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201200725A EA023053B1 (ru) 2009-11-17 2010-11-17 Поливалентные антитела

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20130066054A1 (ru)
EP (1) EP2501721B1 (ru)
JP (2) JP2013510897A (ru)
CN (2) CN106243227A (ru)
BR (1) BR112012011704A2 (ru)
CA (1) CA2780242A1 (ru)
EA (1) EA023053B1 (ru)
GB (1) GB0920127D0 (ru)
WO (1) WO2011061492A2 (ru)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2398498T (pt) * 2009-02-17 2018-12-03 Ucb Biopharma Sprl Moléculas de anticorpo tendo especificidade para ox40 humano
WO2011030107A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies
US9000130B2 (en) 2010-06-08 2015-04-07 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP2596114A4 (en) * 2010-07-14 2014-01-08 Amgen Inc IMMUNOGLOBULIN WITH DOMAIN INSERTION
US10208349B2 (en) 2011-01-07 2019-02-19 Ucb Biopharma Sprl Lipocalin 2 as a biomarker for IL-17 inhibitor therapy efficacy
GB201100282D0 (en) 2011-01-07 2011-02-23 Ucb Pharma Sa Biological methods
CN103384682B (zh) 2011-01-14 2017-04-12 Ucb医药有限公司 结合il‑17a和il‑17f的抗体分子
SI2776466T1 (sl) 2011-11-11 2017-12-29 Ucb Biopharma Sprl Protitelesa, ki se vežejo na albumin in njihovi vezavni fragmenti
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
AU2013339038B2 (en) * 2012-11-05 2017-12-21 Zenyaku Kogyo Kabushikikaisha Antibody and antibody composition production method
GB201223276D0 (en) * 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
MY169117A (en) 2012-12-21 2019-02-18 Bioalliance Cv Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof
KR102626525B1 (ko) * 2013-02-08 2024-01-19 노파르티스 아게 면역접합체의 제조를 위한 항체의 변형에 사용되는 특정 부위
GB201315487D0 (en) 2013-08-30 2013-10-16 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB201320066D0 (en) 2013-11-13 2013-12-25 Ucb Pharma Sa Biological products
KR102056963B1 (ko) 2013-12-30 2019-12-17 에피맙 바이오테라퓨틱스 인코포레이티드 Fabs-인-탠덤 면역글로불린 및 이의 용도
CN106456725B9 (zh) * 2014-02-11 2022-08-09 西雅图基因公司 蛋白质的选择性还原
CA2940451A1 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
TW201625315A (zh) * 2014-06-20 2016-07-16 台醫國際股份有限公司 Ｈｅｒ２抗體－藥物共軛物
US9950077B2 (en) 2014-06-20 2018-04-24 Bioalliance C.V. Anti-folate receptor alpha (FRA) antibody-drug conjugates and methods of using thereof
BR112016030740A2 (pt) 2014-07-01 2018-02-20 Pfizer Inc. diacorpos heterodiméricos biespecíficos e seus usos
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
AR101846A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados
CN107108724A (zh) 2014-09-12 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 半胱氨酸改造抗体和缀合物
AU2015317653A1 (en) 2014-09-17 2017-04-06 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
AR103172A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novartis Ag Reducción selectiva de residuos de cisteina en anticuerpos il-17
GB201506870D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201506869D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
AU2016269065B2 (en) 2015-05-27 2022-06-02 Ucb Biopharma Sprl Method for the treatment of neurological disease
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
AU2016347471B2 (en) 2015-10-27 2023-08-03 UCB Biopharma SRL Methods of treatment using anti-IL-17A/F antibodies
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
CN109071674B (zh) * 2015-10-30 2022-08-05 豪夫迈·罗氏有限公司 铰链修饰的抗体片段和其制备方法
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2017096361A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-stabilized fabs
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CA3010601A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Bioalliance C.V. Tetravalent anti-psgl-1 antibodies and uses thereof
IL260937B2 (en) 2016-02-06 2024-07-01 Epimab Biotherapeutics Inc FABS antibodies one by one and their uses
GB201602414D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Nascient Ltd Biological materials and uses thereof
WO2018183366A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 Syndax Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies of csf-1r or csf-1 antibodies and a t-cell engaging therapy
JP7537874B2 (ja) 2017-05-19 2024-08-21 シンダックス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 併用療法
US20200165347A1 (en) 2017-06-30 2020-05-28 Aslan Pharmaceuticals Pte Ltd Method of treatment using il-13r antibody
EP3788079A4 (en) 2018-05-03 2022-12-21 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. HIGH AFFINITY ANTIBODIES AGAINST PD-1 AND LAG-3 AND B-SPECIFIC BINDING PROTEINS PRODUCED FROM THEM
CN110551216B (zh) * 2018-05-31 2022-11-18 信达生物制药(苏州)有限公司 多价抗ox40抗体及其用途
MX2021004351A (es) 2018-10-16 2021-05-31 UCB Biopharma SRL Metodo para el tratamiento de miastenia grave.
GB201817311D0 (en) 2018-10-24 2018-12-05 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201817309D0 (en) 2018-10-24 2018-12-05 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201919061D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibody
GB201919062D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Antibody
GB201919058D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibodies
GB202001447D0 (en) 2020-02-03 2020-03-18 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
ES2975410T3 (es) 2020-02-13 2024-07-05 UCB Biopharma SRL Anticuerpos biespecíficos que se unen a HVEM y CD9
EP4103608A1 (en) 2020-02-13 2022-12-21 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9 and cd137
EP4103609A1 (en) 2020-02-13 2022-12-21 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9 and cd7
WO2021160269A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 UCB Biopharma SRL Anti cd44-ctla4 bispecific antibodies
WO2021160268A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9
CN115667298A (zh) 2020-03-27 2023-01-31 Ucb生物制药有限责任公司 自主凸起结构域肽
KR20230087552A (ko) 2020-10-15 2023-06-16 유씨비 바이오파마 에스알엘 Cd45를 다량체화하는 결합 분자
EP4237081A1 (en) 2020-11-02 2023-09-06 UCB Biopharma SRL Use of anti-trem1 neutralizing antibodies for the treatment of motor neuron neurodegenerative disorders
WO2022122654A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 UCB Biopharma SRL Multi-specific antibodies and antibody combinations
GB202111905D0 (en) 2021-08-19 2021-10-06 UCB Biopharma SRL Antibodies
WO2024050354A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Washington University Alphavirus antigen binding antibodies and uses thereof
WO2024115393A1 (en) 2022-11-28 2024-06-06 UCB Biopharma SRL Treatment of fibromyalgia

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998037200A2 (en) * 1997-02-21 1998-08-27 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-il-8 monoclonal antibodies
WO2004081026A2 (en) * 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides
WO2006034488A2 (en) * 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2008038024A1 (en) * 2006-09-29 2008-04-03 Ucb Pharma S.A. Altered antibodies
WO2009018386A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
WO2010035012A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP1997891A1 (en) 1988-09-02 2008-12-03 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5747654A (en) * 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
CA2288992C (en) * 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
GB9720054D0 (en) 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB9812545D0 (en) * 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US20060228364A1 (en) 1999-12-24 2006-10-12 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
DE10122140A1 (de) * 2001-05-08 2002-11-28 Apotech Res & Dev Ltd Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
US7053202B2 (en) * 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
WO2005003169A2 (en) 2003-07-01 2005-01-13 Celltech R & D Limited Modified antibody fab fragments
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0513852D0 (en) * 2005-07-06 2005-08-10 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0514779D0 (en) 2005-07-19 2005-08-24 Celltech R&D Ltd Biological products
PL2446904T3 (pl) * 2006-05-30 2015-10-30 Genentech Inc Przeciwciała anty-CD22, ich immunokoniugaty oraz ich zastosowania
EP2535349A1 (en) * 2007-09-26 2012-12-19 UCB Pharma S.A. Dual specificity antibody fusions
PT2398498T (pt) 2009-02-17 2018-12-03 Ucb Biopharma Sprl Moléculas de anticorpo tendo especificidade para ox40 humano

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998037200A2 (en) * 1997-02-21 1998-08-27 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-il-8 monoclonal antibodies
WO2004081026A2 (en) * 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides
WO2006034488A2 (en) * 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2008038024A1 (en) * 2006-09-29 2008-04-03 Ucb Pharma S.A. Altered antibodies
WO2009018386A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
WO2010035012A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLICK STEPHANIE K.A. ET AL. "Certolizumab pegol: in Crohn's disease", BIODRUGS: CLINICAL IMMUNOTHERAPEUTICS, BIOPHARMACEUTICALS AND GENE THERAPY 2007 LNKD-PUBMED:17516714, vol. 21, no. 3, 2007, pages 195-201; DIS, XP009147825, ISSN: 1173-8804 the whole document *
CHAPMAN ANDREW P. "PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: A review", ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, ELSEVIER BV, AMSTERDAM, NL, vol. 54, no. 4, 17 June 2002 (2002-06-17), pages 531-545, XP002300924, ISSN: 0169-409X, DOI: DOI:10.1016/S0169-409X(02)00026-l the whole document *
MELMED GIL Y. ET AL. "Certolizumab pegol", NATURE REVIEWS. DRUG DISCOVERY, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 7, no. 8, 1 August 2008 (2008-08-01), pages 641-642, XP009147828, ISSN: 1474-1784 the whole document *
NATARAJAN A. ET AL. "CHARACTERIZATION OF SITE-SPECIFIC SCFV PEGYLATION FOR TUMOR-TARGETING PHARMACEUTICALS", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, ACS, WASHINGTON, DC, US, vol. 16, no. 1, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 113-121, XP008048580, ISSN: 1043-1802, DOI: DOI:10.1021/BC0498121 abstract; figures; table 1 *
TON N.C. ET AL. "Phase I evaluation of CDP791, a PEGylated di-Fab' conjugate that binds vascular endothelial growth factor receptor 2", CLINICAL CANCER RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH 1 DEC 2007 LNKD-PUBMED:18056191, vol. 13, no. 23, 1 December 2007 (2007-12-01), pages 7113-7118, XP009147881, ISSN: 1078-0432 abstract; pg. 7114, left-hand col. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011061492A3 (en) 2011-07-28
EP2501721A2 (en) 2012-09-26
BR112012011704A2 (pt) 2016-03-01
JP2013510897A (ja) 2013-03-28
EP2501721B1 (en) 2017-11-15
US20130066054A1 (en) 2013-03-14
EA201200725A1 (ru) 2012-12-28
CA2780242A1 (en) 2011-05-26
GB0920127D0 (en) 2009-12-30
CN106243227A (zh) 2016-12-21
JP2016094486A (ja) 2016-05-26
WO2011061492A2 (en) 2011-05-26
CN102639561A (zh) 2012-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023053B1 (ru) Поливалентные антитела
US20220267476A1 (en) Multispecific antibody constructs
US10421816B2 (en) Multivalent antibodies
EP2523972B1 (en) Threevalent antibodies
CN105026431B (zh) 单接头FabFv抗体和制备其的方法
EP3161008B1 (en) Multi-specific antibody constructs
ES2717883T3 (es) Moléculas de DVD-LG estabilizadas con disulfuro
MX2013014789A (es) Proteinas solubles para utilizarse como productos terapeuticos.
US20150274810A1 (en) Disulfide Stabilised Antibodies and Fragments Thereof
EA032222B1 (ru) Молекулы антител, обладающие связывающей специфичностью в отношении il-13 человека
WO2011061246A2 (en) Multivalent antibodies
RU2784673C2 (ru) Конструкции полиспецифических антител

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU