EA021886B1

EA021886B1 - Выделенная фракция мастиковой смолы

Info

Publication number: EA021886B1
Application number: EA201190168A
Authority: EA
Inventors: Задик Хазан
Original assignee: Редженера Фарма Лтд.
Priority date: 2009-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2015-09-30
Also published as: AU2010220056A1; US8956601B2; EP2403505B8; WO2010100650A2; US20160287654A1; CN106619700A; CA2754564A1; AU2010220056B2; BRPI1013223A2; EP2403505A2; CN102413833B; US10251923B2; EP2403505B1; EA201492259A1; WO2010100650A3; ES2617875T3; PL2403505T3; CA2974805C; DK2403505T3; CA2974805A1

Abstract

Изобретение относится к выделенной фракции мастиковой смолы, характеризующейся тем, что фракция растворима по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе, выбранном из спирта и простого эфира, и по меньшей мере в одном неполярном органическом растворителе, выбранном из ациклического или циклического насыщенного или ненасыщенного алифатического углеводорода, или ароматического углеводорода, или их комбинаций, и, по существу, не содержит соединений, растворимых в указанном полярном органическом растворителе, но не растворимых в указанном неполярном органическом растворителе. Выделенная фракция мастиковой смолы используется для лечения нарушения неврологической функции, включающего ослабление функции, выбранной из группы, состоящей из когнитивной функции, сенсорной функции, двигательной функции и комбинации указанных функций.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к терапевтическим применениям мастиковой смолы и соединениям, обнаруженным в указанной смоле, включая полимер мирцена. В частности, настоящее изобретение относится к способам лечения нарушения неврологической функции при помощи композиций, содержащих полимер мирцена.

Уровень техники

Поиски новых лекарственных субстанций, полученных из растений и растительных продуктов, для различных терапевтических применений велись, начиная с античности, и продолжаются до настоящего времени. Одним из таких источников является мастика, также известная как мастиковая смола или смола мастикового дерева, которая представляет собой древесную смолу, полученную в виде выделений из Р181ас1а 1еШ1кснк Ь., входящего в семейство АпасагЛасеае. В античном Средиземноморье мастику применяли при желудочно-кишечных расстройствах, таких как гастралгия, диспепсия и пептическая язва. Было показано, что пероральное введение мастики пациентам-людям, страдающим язвой двенадцатиперстной кишки, и подопытным крысам с индуцированными язвами желудка и двенадцатиперстной кишки имеет терапевтический эффект (А1-НаЬЬа1 е1 а1. (1984) С1т. Ехр. РЬагтасор. РЬукю 11(5):541-4; 8аИ е1 а1. (1986) 1. Е1ЬпорЬаттасо1. 15(3):271-8). Хотя сообщалось, что мастика обладает ίη νΐίτο бактерицидным действием на НеПсоЬас1ег ру1оп - этиологический агент, вызывающий язвенную болезнь (Магопе е1 а1. (2001) ί. СЬетоШет 13:611-614), в других сообщениях было указано, что мастика не проявляет антибактериальной активности при введении пациентам-людям, зараженным Н. ру1оп (ВеЬЬ е1 а1. (2003) ί. АпйшютоЬ СЬетоШет 52:522-23), или экспериментально зараженным мышам (ЬоидЬПп е1 а1. (2003) ί. АпйшютоЬ СЬетоШет 51:367-371).

В патенте Греции № СК 1003541 описано противомикробное и противогрибковое действие хиосского мастикового масла, экстрагированного из листьев, ветвей и плодов РСнОа 1епйксик \'аг. СЫа. В патенте Греции № СК 1003868 описано применение продукта, полученного из РСшОа 1епОксик \'аг. СЫа, в качестве антиоксиданта, в качестве вещества, вызывающего заживление ран, и в качестве цитостатического агента.

В опубликованной заявке на патент США № 2005/0238740 описано, что некоторые фракции, экстрагированные из мастиковой смолы, проявляют антимикробную и антипролиферативную активность. Согласно указанному описанию первый экстракт (названный суммарной фракцией или цельным экстрактом) содержит все соединения мастиковой смолы, кроме полимерной смолы; второй экстракт представляет собой кислую фракцию, содержащую все тритерпеновые кислоты из суммарной фракции; и третий экстракт представляет собой нейтральную фракцию, содержащую все остальные терпены из суммарной фракции. Дополнительно описано эфирное масло, полученное путем перегонки, которое содержит монотерпены, включая β-мирцен. В указанной заявке описаны фармацевтические составы, содержащие любую из указанных выше суммарной, кислой или нейтральной фракций, возможно в сочетании с эфирным маслом или синтетическими эквивалентами эфирного масла, или содержащие выделенные компоненты или их синтетические эквиваленты, а также применение указанных соединений в способах лечения микробных инфекций, включая Н. ру1оп, РторюшЬаЫегшт, §1арЬу1ососсик, Ркеиботопак, и гиперпролиферации клеток. РагаксЬок е1 а1. (2007), где в число авторов входили некоторые из авторов указанной выше заявки на патент, было предложено получение суммарного экстракта мастики, не содержащего полимера (ТМЕХУР), полученного путем экстрагирования полярным растворителем сырой мастики и удаления из полученного экстракта нерастворимого полимера поли-β-мирцена, и кислой и нейтральной фракций, выделенных из ТМЕХУР (РагаксЬок е1 а1. (2007) АпйтютоЬ АдеЫк СЬетоЫет 51(2):551-559). Согласно указанному документу введение ТМЕХУР мышам, зараженным Н. ру1оп, в течение 3 месяцев приводило к 30-кратному уменьшению бактериальной колонизации, по большей части приписываемому конкретному соединению, выделенному в чистом виде из кислой фракции. Авторы указывают, что ТМЕХУР получали, поскольку предполагали, что высокое процентное содержание поли-β-мирцена в препаратах сырой мастики, применявшихся в предшествующих исследованиях, препятствует возможной активности ш νί\Ό при пероральном введении. Далее авторы сообщают, что удаление поли-β-мирцена обеспечивает получение компонента с улучшенной терапевтической активностью в отношении Н. ру1оп.

В заявке на патент ЕР № 1520585 описано применение продукта, полученного из растения рода Р1к1ааа, для производства лекарственного средства для лечения или предотвращения рака. Согласно указанной заявке эфирные масла, полученные перегонкой из листьев, веток, плодов, орехов и цветов различных видов РСШаа, содержат широкий ряд мономерных терпеновых соединений в различных соотношениях, в том числе и β-мирцен. Далее, в указанной заявке описаны эфирные масла, проявляющие противоопухолевую активность в отношении линий клеток определенных типов опухолей, таких как аденокарциномы кишечника и яичников, и то, что борнилацетат представлял собой единственное соединение, у которого была обнаружена противораковая активность.

В публикации международной заявки на патент νθ 2005/112967 описано выделение из мастики противоракового вещества, имеющего антипролиферативное действие, которое было обнаружено в растворимой фракции, полученной путем суспендирования мастики в растворителе, выбранном из неки- 1 021886 слотного алифатического углеводорода, водного раствора, содержащего по меньшей мере 25% водорастворимого некислотного алифатического углеводорода, или их комбинаций, и удаления нерастворимой фракции. Далее, в указанной заявке описан способ лечения раковых клеток, включающий введение фармацевтически эффективного количества фракции мастиковой смолы, ингибирующей рост раковых клеток. Согласно указанной заявке противораковое соединение эффективно в отношении различных типов раковых клеток, включая раковые клетки кишечника человека.

Уап бет Вегд е! а1. (1998) описывают выделение и очистку полимерной фракции мастики при помощи экстракции и эксклюзионной хроматографии (Уап бег Ветд е! а1. (1998) Те1гаЬебгоп Ьей 3:2645-2648). Согласно указанному описанию полимер имеет широкое молекулярно-массовое распределение, т.е. от 20000 до 100000 Да, состоит из мономерных звеньев с молекулярной массой 136 Да и имеет структуру 1,4-поли-в-мирцена, содержащего цис- и транс-конфигурации в соотношении 3:1. Авторы утверждают, что их описание является первым сообщением об обнаруженном в природе полимере монотерпена.

Ватта е1 а1. (2007) описывают экстракцию и анализ методом газовой хроматографии эфирного масла, полученного из Р. 1епЙ8СИ8 Ь. (Ватта е! а1. (2007) 1. Адпс Рооб СЬет. 55(17):7093-7098). Согласно указанному описанию всего было идентифицировано 45 соединений, включая β-мирцен в качестве одного из главных компонентов. Магпег е! а1. (1991) описывают идентификацию различных тритерпеноидов из мастиковой смолы Р. 1епЙ8СИ8 (Магпег е! а1. (1991) РЬу!осЬет18йу, 30, 3709-3712).

В патенте США № 5506406 описано мастиковое масло, полученное путем растворения мастики в масле или жире и помещенное в мягкую капсулу, которая, возможно, дополнительно содержит амфипатическое вещество, такое как хитин или хитозан. Согласно указанному описанию капсула эффективна для устранения и ингибирования Н. ру1оп и для уменьшения запаха кала.

В патенте США № 5637290 описан продукт для гигиены полости рта, содержащий комбинацию зубной пасты и ингредиента, выбранного из природной мастики, экстрагированного мастикового масла и синтетических агентов мастикового масла. Также описано применение мастик для включения в лосьон для загара, продукты для волос и косметические средства.

В патенте США № 6623728 описаны композиции косметической эмульсии для ухода за кожей, содержащие примерно от 0,001 мас.%, примерно до 10 мас.% солюбилизированной мастиковой смолы; летучий смешиваемый с водой растворитель и косметически приемлемую несущую среду. Согласно указанному описанию эмульсия предпочтительно представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, а предпочтительные растворители включают этанол, метанол, пропанол, изопропиловый спирт и смеси указанных соединений. Согласно указанному описанию те же типы растворителей применяют для получения солюбилизированной мастиковой смолы.

В патенте США № 6811769 описана композиция для перорального введения, содержащая масляный экстракт мастики, такой как экстракт, полученный с применением оливкового масла или пальмового масла; и противовоспалительное средство, такое как глицирризиновая кислота. Согласно указанному описанию композиция обладает антибактериальным действием по отношению к бактериям, связанным с заболеваниями периодонта, и по отношению к бактериям, связанным с кариесом.

В патенте США № 7294651 описано применение изопреноидных соединений, в том числе терпеновых соединений, для ингибирования выработки экзобелков грамположительных бактерий, таких как токсин синдрома токсического шока-1, выделяемый 8. аигеив. Согласно указанному описанию подходящие терпены могут быть циклическими или ациклическими, насыщенными или ненасыщенными, и в том числе также включают политерпены. Также описано применение указанных соединений для получения композиций, которые можно включить в состав водных растворов, таких как вагинальные моющие составы.

В патенте США № 4564718 описано получение полимеров, содержащих на концах цепи функциональные группы, называемых жидкие каучуки, которые имеют температуру стеклования существенно ниже комнатной температуры, путем полимеризации терпена или кислородсодержащего производного терпена, содержащего двойную связь или сопряженную двойную связь, способную к полимеризации, при помощи инициатора, обеспечивающего выбранные концевые функциональные группы. Согласно указанному описанию полимеры предпочтительно имеют молекулярную массу от 500 до 20000 и для получения указанных полимеров предпочтительны ациклические монотерпены, в том числе β-мирцен. В указанном патенте описано получение полимера мирцена молекулярной массой примерно 2000 и примерно 4000. Дополнительно в указанном патенте описано, что полимеры согласно указанному изобретению могут дополнительно взаимодействовать с другими реагентами с образованием эластомеров, герметиков или клеев, или их можно применять в качестве агентов, упрочняющих каучуки. Дополнительно описано получение из мирцена полимирцена с гидроксильными концевыми группами и применение указанного соединения для получения полиуретанового эластомера.

В статье Ые^тагк е! а1. 1. Ро1утег 8с1 26, 71-77 (1988) описан синтез полимирцена, имеющего наблюдаемую молекулярную массу 87000 и расчетную молекулярную массу 46000.

В патенте США № 4374957 описан клейкий термопластический эластомерный линейный трехблочный полимер, соответствующий формуле А-В-А, где А представляет собой неэластичный линейный го- 2 021886 мополимерный блок моновинильного ароматического углеводорода, имеющий среднюю молекулярную массу от 10000 до 60000 и температуру стеклования выше 70°С, а В представляет собой эластомерный гомополимерный блок мирцена, имеющий среднюю молекулярную массу от 50000 до 200000 и температуру стеклования ниже примерно -40°С.

В патенте США № 5759569 описаны биоразлагаемые, способные подвергаться компостированию изделия, по меньшей мере, частично содержащие определенные трансполимеры, причем указанные полимеры имеют среднемассовую молекулярную массу по меньшей мере примерно 20000 и получены путем полимеризации мономерного компонента, содержащего (1) примерно от 70 до 100 мол.% 1,3-диенов, в том числе β-мирцена; и (2) примерно до 30 мол.% других совместимых сомономеров. Согласно указанному описанию указанные изделия включают, в том числе, упаковочные материалы; одноразовые впитывающие изделия (например, подгузники, гигиенические салфетки); предметы одежды, такие как защитная спецодежда, операционные салфетки, операционные халаты, операционные простыни; тканые, вязаные и нетканые материалы; хирургические губки, аппликаторы тампонов, одноразовые шприцы и контейнеры.

В патентах США №№ 7232872 и 7214750 описан процесс полимеризации, включающий приведение в контакт одного или нескольких мономеров, в том числе мирцена, одной или нескольких кислот Льюиса, одного или нескольких инициаторов, и разбавителя, содержащего один или несколько фторированных углеводородов, в реакторе.

В заявке на патент США № 2007/0179260 и в патенте США № 7417103 описаны полимеры на основе 3,4-изопрена с высокой региорегулярностью и способ получения указанных полимеров. Согласно указанным описаниям среднечисленная молекулярная масса полимера составляет от 5000 до 6000000 и полимер может также содержать звенья 1,4-изопренов, таких как мирцен. Согласно указанному описанию полимер подходит для применения в качестве пластического материала благодаря его механической и термической стойкости.

В известном уровне техники не описано применение мастиковой смолы или фракций мастиковой смолы для лечения неврологических состояний. Известный уровень техники не описывает или не предполагает применения какой-либо выделенной фракции мастиковой смолы для лечения неврологических состояний. Известный уровень техники также не описывает или не предполагает наличия преимуществ при применении выделенной фракции полимера мирцена, - ни полученной из мастики, ни синтезированной химически, - в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции или для терапевтического применения.

Краткое описание изобретения

Согласно настоящему изобретению предложены композиции, обладающие нейропротективными и нейрорегенеративными свойствами, и способы применения указанных композиций для лечения ряда неврологических заболеваний и нарушений. В частности, композиции, содержащие выделенные фракции, экстрагированные из мастиковой смолы, описаны в настоящем изобретении как имеющие нейропротективную активность и подходящие для применения для стимулирования дифференцировки и созревания нервных клеток и других типов клеток.

Настоящее изобретение частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что выделенные фракции мастиковой смолы проявляют нейропротективную и нейрорегенеративную биологическую активность, которую можно использовать для различных терапевтических применений. Конкретнее, композиции, содержащие указанные выделенные фракции, обладают активностью, индуцирующей дифференцировку клеток различных типов, включая типы нервных клеток. Активность в отношении индуцирования дифференцировки наблюдалась на многочисленных линиях дифференцировки клеток, включая различные типы клеток из эктодермальных, мезодермальных и эндодермальных линий дифференцировки.

Новые способы и виды лечения согласно настоящему изобретению можно осуществить на практике с применением любой из выделенных фракций и экстрактов мастиковой смолы, известных в данной области техники. Однако в настоящем изобретении дополнительно указано, что некоторые выбранные фракции, содержащие компоненты мастиковой смолы с более высокой молекулярной массой, особенно предпочтительны для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению.

Известно, что экстракты мастиковой смолы содержат полимерные формы монотерпенового соединения, известного как мирцен. Таким образом, впервые описано, что выделенная фракция мастиковой смолы, содержащая полимер мирцена, может применяться в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для лечения нейродегенеративных нарушений. Заболевания, которые поддаются лечению композициями согласно настоящему изобретению, включают различные типы деменции, включая без ограничения болезнь Альцгеймера, инсульт и болезнь Паркинсона. Также впервые описано, что выделенные фракции полимера мирцена, полученные из растительных источников или синтезированные химически, можно применять в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для лечения нейродегенеративных нарушений, а также для лечения повреждений тканей.

Идея настоящего изобретения проиллюстрирована примерами как выделенных фракций мастиковой смолы, включающих полимер мирцена, так и химически синтезированного полимера мирцена, соот- 3 021886 ветствующего полимеру, выделенному из мастиковой смолы. Настоящее изобретение особенно неожиданно и удивительно на фоне известного уровня техники, где описано применение фракций экстракта мастиковой смолы, из которых был удален полимер мирцена, для различных терапевтических показаний. Кроме того, в известном уровне техники утверждают, что полимерные фракции, полученные из мастики, не подходят для терапевтического применения и что присутствие полимера мирцена в терапевтических композициях действительно подавляет благоприятное биологическое действие и биодоступность активных соединений. Следовательно, в известном уровне техники терапевтическое действие мастиковой смолы приписывают различным низкомолекулярным терпеновым молекулам, в том числе мономеру мирцена и низшим олигомерным формам мирцена. Однако авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, в противоположность известным из уровня техники взглядам, что некоторые низкомолекулярные терпены, присутствующие в экстрактах мастиковой смолы, действительно препятствуют и блокируют активность фракций и композиций согласно настоящему изобретению в отношении индуцирования дифференцировки клеток. Таким образом, в настоящем изобретении описано, что новая биологоческая активность фракций и композиций согласно настоящему изобретению подавляется в присутствии некоторых мономерных и низших олигомерных форм различных терпенов.

Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией или механизмом действия, отметим, что активность композиций, содержащих полимер мирцена, в отношении индуцирования дифференцировки нервных клеток, как описано в настоящем изобретении, делает настоящее изобретение полезным для образования новых межнейронных связей и преодоления нарушения межнейронного взаимодействия в головном мозге и нервной ткани, пораженных патологиями, связанными с нарушением образования синапсов. Указанная патология лежит в основе многих патологий нервной системы, включая, например, болезнь Альцгеймера. Дополнительно настоящее изобретение можно применять для обращения побочных эффектов различных лекарственных средств, действующих на нервную систему, таких как анестетики. Дополнительно настоящее изобретение подходит для омоложения широкого ряда клеток и тканей.

В настоящем описании полимер мирцена включает полимерные формы мирцена, имеющие степень полимеризации по меньшей мере 6. Полимер мирцена включает, без ограничения, полимер βмирцена, (поли-в-мирцен), полимер α-мирцена (поли-а-мирцен), гомополимеры и гетерополимеры указанных соединений (также известные как сополимеры), содержащие субъединицы мирцена. Также включены геометрические изомеры, оптические изомеры и диастереомеры полимерных соединений мирцена.

В настоящем описании β-мирцен относится к 7-метил-3-метилен-1,6-октадиену, а α-мирцен относится к структурному изомеру указанного соединения 2-метил-6-метилен-1,7-октадиену.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена выделенная фракция мастиковой смолы, характеризующаяся тем, что фракция растворима по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе, выбранном из спирта и простого эфира, и по меньшей мере в одном неполярном органическом растворителе, выбранном из ациклического или циклического насыщенного или ненасыщенного алифатического углеводорода или ароматического углеводорода или их комбинаций, и, по существу, не содержит соединений, растворимых в указанном полярном органическим растворителе, но не растворимых в указанном неполярном органическом растворителе, для лечения нарушения неврологической функции, включающего ослабление функции, выбранной из группы, состоящей из когнитивной функции, сенсорной функции, двигательной функции и комбинации указанных функций.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция содержит полимер β-мирцена (поли-β-мирцен).

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция содержит от 0,01 до 25 мас.% полимера β-мирцена от общей массы фракции.

Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена выбран из группы, состоящей из полимера β-мирцена (полиф-мирцена), полимера α-мирцена (поли-а-мирцена), сополимеров мирцена и комбинаций указанных полимеров.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция характеризуется тем, что полиф-мирцен выбран из группы, состоящей из цис-1,4-полиф-мирцена, транс-1,4-поли-βмирцена, 3,4-полиф-мирцена, 1,2-полиф-мирцена и комбинаций указанных полимеров; или полимер мирцена представляет собой цис-1,4-полиф-мирцен, предпочтительно выделенная фракция мастиковой смолы содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-полиф-мирцена; или выделенная фракция содержит смесь цис-1,4-полиф-мирцена и транс-1,4-поли-β-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 75 мас.% цис-1,4-полиф-мирцена; или выделенная фракция содержит по меньшей мере 75 мас.% цисПД-полиф-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне от 1000 до 20000, причем предпочтительно среднечисленная молекулярная масса выделенной фракции находится в диапазоне от по меньшей мере 5000 до 20000 или выделенная фракция содержит менее 5% мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее 6.

Согласно конкретному варианту реализации нарушение неврологической функции связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из травмы, сосудистой деменции, старческой деменции,

- 4 021886 болезни Альцгеймера, амиотрофического бокового склероза (АБС), рассеянного склероза, болезни Паркинсона и инсульта; и фракция находится в форме, пригодной для перорального, топического, парентерального или трансдермального введения; или выделенная мастиковая смола находится в форме, пригодной для внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрикожного, внутрибрюшинного, внутриартериального, внутримозгового, интрацеребровентрикулярного, внутрикостного и интратекального введения; или фракция находится в форме, пригодной для топического нанесения, выбранного из дермального, вагинального, ректального, ингаляционного, интраназального, окулярного, аурикулярного и буккального нанесения; или полимер мирцена представляет собой продукт химического синтеза или получен из растительного источника.

Согласно конкретному варианту реализации полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из спирта, простого эфира и комбинаций указанных соединений, предпочтительно из группы, состоящей из метанола, этанола, пропанола, изопропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, вторбутанола, трет-бутанола, 1-пентанола, 2-пентанола, 3-пентанола, неопентанола, 3-метил-1-бутанола, 2метил-1-бутанола, 3-метил-2-бутанола, 2-метил-2-бутанола, этиленгликоля, этиленгликоля монометилового эфира, диэтилового эфира, метилэтилового эфира, этилпропилового эфира, метилпропилового эфира, 1,2-диметоксиэтана, тетрагидрофурана, дигидрофурана, фурана, пирана, дигидропирана, тетрагидропирана и комбинаций указанных соединений; или неполярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из ациклических или циклических насыщенных или ненасыщенных алифатических углеводородов и ароматических углеводородов и комбинаций указанных соединений, предпочтительно из группы, состоящей из пентанов, гексаны, гептанов, октанов, нонанов, деканов, циклопентана, циклогексана, циклогептана, бензола, толуола, ксилола или их изомеров или смесей; или выделенная фракция, по существу, не содержит мономерных терпеновых соединений.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция растворима по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе, выбранном из спирта и простого эфира и по меньшей мере одном неполярном органическом растворителе, выбранном из ациклического или циклического насыщенного или ненасыщенного алифатического углеводорода или ароматического углеводорода или их комбинации, и, по существу, не содержит соединений, растворимых в указанном полярном органическом растворителе, но не растворимых в указанном неполярном органическом растворителе, для индуцирования дифференцировки нейрональных типов клеток.

Согласно конкретному варианту реализации указанный полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из спирта, простого эфира и комбинаций указанных соединений, предпочтительно из группы, состоящей из метанола, этанола, пропанола, изопропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, втор-бутанола, трет-бутанола, 1-пентанола, 2-пентанола, 3-пентанола, неопентанола, 3-метил-1-бутанола, 2-метил-1-бутанола, 3-метил-2-бутанола, 2-метил-2-бутанола, этиленгликоля, этиленгликоля монометилового эфира, диэтилового эфира, метилэтилового эфира, этилпропилового эфира, метилпропилового эфира, 1,2-диметоксиэтана, тетрагидрофурана, дигидрофурана, фурана, пирана, дигидропирана, тетрагидропирана и комбинаций указанных соединений; или неполярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из ациклических или циклических насыщенных или ненасыщенных алифатических углеводородов и ароматических углеводородов и комбинаций указанных соединений, предпочтительно из группы, состоящей из пентанов, гексанов, гептанов, октанов, нонанов, деканов, циклопентана, циклогексана, циклогептана, бензола, толуола, ксилола и их изомеров и смесей; или фракция находится в форме, пригодной для перорального, топического, парентерального и трансдермального введения.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция находится в составе композиции, содержащей от 0,01 до 25 мас.% полимера мирцена или полимера β-мирцена соответственно от общей массы композиции.

Согласно конкретному варианту реализации поли-в-мирцен выбран из группы, состоящей из цис1,4-поли-в-мирцена, транс- 1,4-поли-в-мирцена, 3,4-поли-в-мирцена, 1,2-поли-в-мирцена и комбинаций указанных полимеров, предпочтительно полимер мирцена содержит цис-1,4-поли-в-мирцен, предпочтительно выделенная фракция мастиковой смолы содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена; или выделенная фракция содержит смесь цис-1,4-поли-в-мирцена и транс-1,4-поли-в-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 75 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена; или выделенная фракция содержит по меньшей мере 75 мас.%, цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечис- 5 021886 ленной молекулярной массой в диапазоне от 1000 до 20000, предпочтительно среднечисленная молекулярная масса выделенной фракции находится в диапазоне от по меньшей мере 5000 до 20000.

Согласно конкретному варианту реализации выделенную фракцию мастиковой смолы получают при помощи процесса, включающего стадию воздействия на мастиковую смолу по меньшей мере одним полярным органическим растворителем и выделения фракции, растворимой в указанном полярном органическом растворителе. Согласно конкретному варианту реализации выделенную фракцию мастиковой смолы получают при помощи процесса, включающего стадию воздействия на мастиковую смолу по меньшей мере одним неполярным органическим растворителем и выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе.

Согласно конкретному варианту реализации выделенную фракцию мастиковой смолы получают при помощи процесса, включающего стадии:

(a) обработки мастиковой смолы полярным органическим растворителем;

(b) выделения фракции, растворимой в указанном полярном органическом растворителе;

(c) возможно, удаления указанного органического растворителя;

(ά) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), неполярным органическим растворителем, (е) выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе; и (ί) возможно, удаления указанного неполярного органического растворителя, причем стадии (ά)-(ί) могут предшествовать стадиям (а)-(с).

Полярные органические растворители, подходящие для получения экстрактов, применимых в способах согласно настоящему изобретению, включают спирты, простые эфиры, сложные эфиры, амиды, альдегиды, кетоны, нитрилы и комбинации указанных соединений. Конкретными примерами полярных органических растворителей являются метанол, этанол, пропанол, изопропанол, 1-бутанол, 2-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, 1-пентанол, 2-пентанол, 3-пентанол, неопентанол, 3-метил-1-бутанол, 2метил-1-бутанол, 3-метил-2-бутанол, 2-метил-2-бутанол, этиленгликоль, этиленгликоля монометиловый эфир, диэтиловый эфир, метилэтиловый эфир, этилпропиловый эфир, метилпропиловый эфир, 1,2диметоксиэтан, тетрагидрофуран, дигидрофуран, фуран, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, ацетальдегид, метилформиат, этилформиат, этилпропионат, метилпропионат, дихлорметан, хлороформ, диметилформамид, ацетамид, диметилацетамид, Ν-метилпирролидон, ацетон, этилметилкетон, диэтилкетон, ацетонитрил, пропионитрил и комбинации указанных соединений.

Неполярные растворители, подходящие для осуществления настоящего изобретения, включают ациклические или циклические насыщенные или ненасыщенные алифатические углеводороды и ароматические углеводороды, например С5-С10 алканы, С5-С10 циклоалканы, С6-С14 ароматические углеводороды и комбинации указанных соединений. Каждый из указанных выше углеводородов может содержать в качестве заместителей один или несколько галогенов, например С7-С14 перфторалканы. Конкретными примерами неполярных органических растворителей являются пентаны, гексаны, гептаны, октаны, нонаны, деканы, циклопентан, циклогексан, циклогептан, бензол, толуол, ксилол, изомеры и смеси указанных соединений.

Согласно конкретному варианту реализации способ получения выделенной фракции мастиковой смолы дополнительно включает распределение по размеру растворимой фракции, полученной после стадии (с) или стадии (ί). Согласно конкретному варианту реализации распределение по размеру включает эксклюзионную хроматографию. Согласно конкретному варианту реализации стадии (с) или (ί) включают удаление растворителя при помощи средств, выбранных из группы, состоящей из ротационного выпаривания, применения высокого вакуума и комбинации указанных средств. Согласно конкретному варианту реализации стадии (а)-(с) осуществляют перед стадиями (ά)-(ί). Согласно конкретному варианту реализации стадии (ά)-(ί) осуществляют перед стадиями (а)-(с). Согласно конкретному варианту реализации полярный органический растворитель содержит этанол, а неполярный органический растворитель содержит гексан. Согласно конкретному варианту реализации стадии (а)-(с) и стадии (ά)-(ί), каждые независимо, осуществляют для ряда циклов.

Согласно конкретному варианту реализации мастиковую смолу получают из видов Р|51ас1а. выбранных из группы, состоящей из Р. 1епЙ8си8, Р. айаийса, Р. ра1е8Йиа, Р. каройае, Р. 1егеЬш1йи8, Р. уета и Р. иНедегпта.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция мастиковой смолы содержит полимер мирцена.

Согласно конкретному варианту реализации композиция содержит примерно от 0,01 примерно до 12 мас.% полимера мирцена от общей массы композиции.

Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена выбран из группы, состоящей из полимера β-мирцена (поли-в-мирцен), полимера α-мирцена (поли-а-мирцен), сополимеров мирцена и комбинаций указанных соединений. Согласно конкретному варианту реализации поли-в-мирцен выбран из группы, состоящей из 1,4-поли-в-мирцена, 3,4-поли-в-мирцена, 1,2-поли-в-мирцена и комбинации указанных соединений. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена содержит изомер

- 6 021886 мирцена, выбранный из группы, состоящей из цис-изомера, транс-изомера и комбинации указанных соединений. Согласно конкретному варианту реализации 1,4-поли-в-мирцен выбран из группы, состоящей из цис-1,4-поли-в-мирцена, транс-1,4-поли-в-мирцена и комбинации указанных соединений. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена содержит цис-1,4-поли-в-мирцен. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет циклическую структуру. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет разветвленную структуру.

Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет степень полимеризации в диапазоне по меньшей мере примерно от 6 примерно до 1800. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет примерно по меньшей мере 10. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет примерно по меньшей мере 15. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет примерно по меньшей мере 25. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет примерно по меньшей мере 35. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации находится в диапазоне примерно от 6 примерно до 30. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации находится в диапазоне примерно от 30 примерно до 500, например в диапазоне примерно от 35 примерно до 150.

Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.

Следует понимать, что композиция может содержать различающиеся по молекулярной массе фракции полимера мирцена, например, в диапазоне от по меньшей мере примерно 800 до примерно 100000 или различные комбинации указанных фракций. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет коэффициент полидисперсности менее 5.

Согласно конкретным вариантам реализации полимер мирцена, применяемый согласно некоторым способам согласно настоящему изобретению, представляет собой продукт химического синтеза. Согласно конкретному варианту реализации химический синтез включает применение мономера мирцена в качестве субстрата. Согласно конкретному варианту реализации субстрат представляет собой β-мирцен. Согласно конкретному варианту реализации субстрат β-мирцен получен из растения.

Согласно конкретному варианту реализации продукт химического синтеза содержит цис-1,4-полиβ-мирцен. Согласно конкретному варианту реализации химический синтез представляет собой реакцию анионной полимеризации. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена, полученный в результате химического синтеза, растворен в гидрофобном носителе, таком как по меньшей мере одно растительное масло.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена получена из природного источника. Согласно конкретному варианту реализации природный источник представляет собой растение, относящееся к семейству АпасагФасеае. Согласно конкретному варианту реализации растение относится к роду, выбранному из группы, состоящей из РМааа. Ршик, Рюеа, Лпврегю. АЫек, Ьайх, АпйггЫпиш, ВоктеШа, Сйгик и Супига. Согласно конкретному варианту реализации растение представляет собой вид РЫаша, выбранный из группы, состоящей из Р. 1епйксик, Р. айапйса, Р. ра1екйпа, Р. каройае, Р. 1егеЫп1Ьик, Р. уега и Р. йИедеггипа.

Согласно конкретному варианту реализации растение представляет собой РЫаша 1епОксик Ь. Согласно конкретному варианту реализации природный источник представляет собой растительный материал, выбранный из группы, состоящей из смолы, листьев, веток, корней, цветов, семян, почек, коры, орехов и корней. Согласно конкретному варианту реализации природный источник представляет собой растение, относящееся к роду, выбранному из группы, состоящей из Оштит, Ьаигик и Ьауепйи1а.

Согласно конкретному варианту реализации выделенную фракцию полимера мирцена получают при помощи процесса, включающего стадии:

(a) осуществления контакта растительного материала по меньшей мере с одним полярным органическим растворителем;

(й) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), неполярным органическим растворителем;

(е) выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе;

(ί) возможно, удаления указанного неполярного органического растворителя;

причем стадии (й)-(1) могут предшествовать стадиям (а)-(с), причем стадии (а)-(с) и стадии (й)-(1), каждые независимо, выполняют в виде ряда циклов; получая, таким образом, выделенную фракцию полимера мирцена.

Согласно конкретным вариантам реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере примерно 80 мас.%. Согласно конкретным вариантам реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере примерно 85 мас.%. Согласно конкретным вариантам реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере примерно 90 мас.%, или по меньшей мере примерно 93 мас.%, или по меньшей мере примерно 95 мас.%, или по меньшей мере примерно 97 мас.%, или по меньшей мере примерно 98 мас.% или по

- 7 021886 меньшей мере примерно 99 мас.%.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере 80 мас.% и полимер мирцена имеет степень полимеризации по меньшей мере 6.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере 90 мас.% и полимер мирцена имеет степень полимеризации по меньшей мере 10.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит смесь цис-1,4-поли-в-мирцена и транс-1,4-поли-в-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 50 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой по меньшей мере 800, или по меньшей мере 1000, или по меньшей мере 5000 или по меньшей мере 10000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 80 мас.% цис-1,4поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 800 примерно до 5000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 1000 примерно до 10000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 10000 примерно до 20000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 20000 примерно до 30000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 30000 примерно до 50000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 50000 примерно до 80000.

Согласно конкретным вариантам реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.% и более предпочтительно менее примерно 5 мас.% терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и не растворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретным вариантам реализации композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и не растворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретным вариантам реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.% и более предпочтительно менее примерно 5 мас.% мономерных терпеновых соединений. Согласно конкретным вариантам реализации композиция, по существу, не содержит мономеров мирцена.

Как указано в настоящем изобретении, терпеновые соединения включают мономерные и олигомерные формы терпеновых соединений, включая соединения, различным образом относимые к монотерпенам, дитерпенам, сесквитерпенам, тритерпенам и тетратерпенам, включая соответствующие кислотные, альдегидные и спиртовые формы. Согласно конкретному варианту реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.% и более предпочтительно менее примерно 5 мас.% монотерпенового соединения, выбранного из группы, состоящей из β-мирцена, α-мирцена, цис-а-оцимена, дигидромирцена, лимонена, а-пинена, β-пинена и комбинаций указанных соединений.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена получена из растения и композиция, по существу, не содержит мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации меньше примерно 6. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена получена из растения и композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе и не растворимых по меньшей мере в одном неполярном органическом растворителе.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена представляет собой продукт химического синтеза и композиция, по существу, не содержит мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее примерно 6. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена представляет собой продукт химического синтеза и композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и не растворимых в неполярном органическом растворителе.

Согласно конкретному варианту реализации фармацевтически приемлемый носитель содержит гидрофобный носитель. Согласно конкретному варианту реализации фармацевтически приемлемый гидрофобный носитель содержит по меньшей мере одно масло. Согласно конкретному варианту реализации

- 8 021886 масло выбирают из группы, состоящей из растительного масла, минерального масла и комбинаций указанных масел. Согласно конкретному варианту реализации растительное масло выбирают из группы, состоящей из миндального масла, масла канолы, кокосового масла, кукурузного масла, хлопкового масла, масла виноградной косточки, оливкового масла, арахисового масла, шафранового масла, кунжутного масла, соевого масла и комбинации указанных масел. Согласно конкретному варианту реализации минеральное масло представляет собой светлое минеральное масло. Согласно конкретному варианту реализации гидрофобный носитель содержит по меньшей мере один воск. Согласно конкретному варианту реализации гидрофобный носитель содержит комбинацию по меньшей мере одного масла и по меньшей мере одного воска.

Следует однозначно понимать, что объем настоящего изобретения охватывает более короткие и более длинные формы полимеров мирцена, включая синтетические и полусинтетические формы, включая сополимеры мирцена, и производные, несущие в качестве заместителей различные функциональные группы и конъюгированные с различными добавочными молекулами, известные в данной области техники, при условии, что указанные варианты и модификации сохраняют терапевтические свойства полимера мирцена в отношении способов согласно настоящему изобретению.

Другие задачи, особенности и преимущества настоящего изобретения станут ясны из последующего описания и чертежей.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана эксклюзионная хроматография экстракта мастиковой смолы с использованием детекторов δΕΌΕΧ и ФДМ (с фотодиодной матрицей);

на фиг. 2 показаны низкомолекулярная (фиг. 2А) и высокомолекулярная (фиг. 2В) фракции экстракта мастиковой смолы, полученные при помощи препаративной эксклюзионной хроматографии;

на фиг. 3 показан спектр ¹Н-ЯМР высокомолекулярной фракции, полученной при помощи препаративной эксклюзионной хроматографии экстракта мастиковой смолы;

на фиг. 4 показан спектр ¹³С-ЯМР высокомолекулярной фракции, полученной при помощи препаративной эксклюзионной хроматографии экстракта мастиковой смолы;

на фиг. 5 показана аналитическая эксклюзионная хроматография высокомолекулярного (фиг. 5А) и низкомолекулярного (фиг. 5В) продуктов, полученных в процессе химического синтеза полимера мирцена;

на фиг. 6 показан спектр ¹Н-ЯМР синтезированного 1,4-поли-в-мирцена; на фиг. 7 показан спектр ¹³С-ЯМР синтезированного 1,4-поли-в-мирцен;

на фиг. 8 показано действие КРЬ-1 на клетки ΑΚΡΕ-19; на фиг. 8А - контрольные культуры, обработанные масляной несущей средой; на фиг. 8В - исследуемые культуры через 48 ч после введения ΒΡΗ-1 (0,1%; 1 мг/мл) и инкубирования; на фиг. 8С - исследуемые культуры через 48 ч после введения КРЬ-1 (0,25%; 2,5 мг/мл) и инкубирования; на фиг. 8Ό - исследуемые культуры через 72 ч после введения КРЬ-1 (0,25%; 2,5 мг/мл) и инкубирования;

на фиг. 9 показан иммунофлуоресцентный анализ дифференцированных клеток ΑΚΡΕ-19 до (левая сторона) и через 72 ч (правая) инкубирования в присутствии КРЬ-1, показана экспрессия β-3-тубулина (ТиВВЗ), активно регулируемого связанного с цитоскелетом белка (Агс/АгдЗ.1) и нейронального пентраксина-ΙΙ (ΝΡΤΧ2) после воздействия;

на фиг. 10 показано действие КРЬ-1 на пролиферацию клеток ΑΚΡΕ-19, наблюдаемую при помощи теста, оценивающего суммарное содержание белка;

на фиг. 11 показаны клетки ΑΚΡΕ-19 на различных стадиях дифференцировки; на фиг. 11А - стадия дифференцировки 3; на фиг. 11В - стадия дифференцировки 4; на фиг. 11С - стадия дифференцировки 5;

на фиг. 12 показано действие КРЬ-1 на клетки меланомы человека; на фиг. 12А - контрольные клетки, обработанные масляной несущей средой; на фиг. 12В - клетки, получавшие воздействие КРЬ-1 (5 мкл) через 48 ч инкубирования; на фиг. 12С - клетки, получавшие воздействие КРЬ-1 (2 мкл) через 48 ч инкубирования; на фиг. 12Ό - клетки, получавшие воздействие КРЬ-1 (5 мкл) через 72 ч инкубирования;

на фиг. 13 показано действие химически синтезированного полимера мирцена на клетки КРЬ-1; на фиг. 13А - дифференцировка, индуцированная фракцией 18.1; на фиг. 13В - дифференцировка, индуцированная фракцией 18.2;

на фиг. 14 показана регенерация шерсти у старого самца собаки породы золотистый ретривер, пораженного кожным заболеванием, связанным с алопецией, после лечения КРЬ-1; на фиг. 14А - до лечения; на фиг. 14В - после 2 недель лечения;

на фиг. 15 показано действие КРЬ-1 на заживление умышленно нанесенных ран у мышей в эксперименте, показанное как размер раны (мм²) в различные моменты времени после нанесения раны мышам, получавшим лечение КРЬ-1 путем п/к инъекции (группа А, серые столбики), топически (группа В, черные столбики), и мышам, получавшим только несущую среду (группа С, пустые столбики);

на фиг. 16 показано действие КРЬ-1 на восстановление после мозговой гипоперфузии в модели сосудистой деменции на крысах по оценке в тесте на водяном лабиринте Морриса. Восстановление животных, получавших КРЬ-1 (группа А; столбики с перекрестной штриховкой), животных, получавших несу- 9 021886 щую среду (группа В; столбики с горизонтальной штриховкой) и контрольных животных, получавших плацебо (закрашенные столбики), исследовали на частоту обнаружения платформы (фиг. 16А); время, проведенное в области платформы (фиг. 16В); латентность обнаружения платформы (фиг. 16С); частоту нахождения в зоне 1 (фиг. 16Ό); время, проведенное в светлой части (фиг. 16Е); латентность обнаружения платформы (фиг. 16Р) и скорость (фиг. 160);

на фиг. 17 показано действие РРН-1 на набор массы;

на фиг. 17А показан набор массы у животных после мозговой гипоперфузии в модели сосудистой деменции на крысах. Животные в группе В (получавшие РРН-1; обозначены треугольниками) восстанавливали массу значительно быстрее, чем животные в группе А (получавшие несущую среду; обозначены квадратами);

на фиг. 17В показан набор массы у мышей с ожирением (оЬ/оЬ) после лечения РРН-1, или путем подкожного введения (группа А; обозначены ромбами), или путем топического введения (группа В; обозначены квадратами), или получавших только несущую среду (группа С; обозначены треугольниками). Мыши в группах В и С набрали 10,2 и 9,1% соответственно. Скорость набора массы во всех группах, выраженная как тангенс угла наклона, была сходной (р=0,07 (А от В), 0,08 (А от С) и 0,43 (В от С));

на фиг. 18 показано действие РРН-1 на восстановление после инсульта, вызванного временной окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА) в модели на крысах;

на фиг. 18А показана нервно-мышечная оценка (№иго8соге) в различные моменты времени, указанных в днях (й), после ОСМА у крыс, получавших РРН-1 (группа А) или несущую среду (группа В). Значительные отличия наблюдались только в группе А от дня 8 до дня 14 и от дня 8 до дня 28;

на фиг. 18В показаны результаты шагового теста в различные моменты времени после ОСМА у крыс, получавших РРН-1 (группа А; черные столбики) или несущую среду (группа В; пустые столбики). Значительные различия между двумя группами наблюдались только на 28 день;

на фиг. 18С показаны результаты теста на удаление пластыря в различные моменты времени, указанные в днях (й), после ОСМА у крыс, получавших РРН-1 (группа А) или несущую среду (группа В). Значительные отличия наблюдались только в группе А между днем 2 и другими днями;

на фиг. 19 показано среднее число выживших ганглиозных клеток сетчатки (РОС) после аксотомии зрительного нерва у крыс, получавших РРН-1, и контрольных крыс;

на фиг. 20 показан вестерн-блоттинг анализ экспрессирования 8ЕМА3 (фиг. 20А) и каспазы-3 (фиг. 20В) в отслоившейся сетчатке (ОС) и неповрежденной сетчатке (контроль) животных, получавших РРН-1 или несущую среду после отслоения сетчатки.

Подробное описание изобретения

Согласно настоящему изобретению предложены композиции, обладающие нейропротективными и нейрорегенеративными свойствами, и способы применения указанных композиций для лечения ряда неврологических заболеваний и нарушений. Конкретнее, в настоящем изобретении описаны композиции, содержащие выделенные фракции, экстрагированные из мастиковой смолы, имеющие нейропротективное действие и которые можно применять для стимуляции дифференцировки и созревания типов нервных клеток и других типов клеток.

Кроме того, было обнаружено, что полимер мирцена является основным компонентом указанных экстрактов мастиковой смолы. Химический синтез и биологическое исследование полимера мирцена подтвердило, что указанное соединение демонстрирует указанные выше нейропротективные и нейрорегенеративные свойства. Кроме того, указанные открытия оказались весьма неожиданными с учетом того, что в известном уровне техники считалось, что полимерная фракция, полученная из мастики, не имеет терапевтической пользы и фактически подавляет некоторые биологические действия, приписываемые препаратам сырой мастики и экстрактам мастики.

В настоящем изобретении впервые описано, что в отношении различных действий по стимулированию и индуцированию регенерации клеток выделенную фракцию мастиковой смолы согласно настоящему описанию можно применять в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для ряда терапевтических показаний, относящихся к нарушению неврологической функции, и состояний, требующих восстановления тканей. При контакте с клетками как человека, так и других субъектов композиция индуцирует дифференцировку клеток в широком спектре тканей, категорий клеток и линий дифференцировки клеток, включая кожу, эндотелий, слизистые мембраны, кости, сухожилия и хрящ. Кроме того, действие фармацевтической композиции на дифференцировку клеток можно использовать для стимуляции внедрения ίη νίνο медицинских устройств, имплантатов и трансплантатов органов.

Определения.

В настоящем описании термины мастика, мастиковая смола, смола мастикового дерева и мастиковая камедь применяют взаимозаменяемо для указания на смолу дерева (также известную как живица), полученную в виде выделений дерева, относящегося к семейству АпасагФасеае. Деревья рода Рй1ас1а, прежде всего РМааа 1ей18си8 Ь., и особенно культурный сорт Р. 1ей18си8 Ь. су. С1йа (выращиваемый на греческом острове Хиос) известны своим высоким урожаем мастики. Другие разновидности включают Р. 1ей18си8 Ь. уаг. етагщшЦа Епд1. и Р. 1ей18си8 Ь. уаг. 1аНГоПа Со88. Дополнительные виды РМаОа включают, например, Р. айапйса, Р. ра1е§Нпа, Р. каройае, Р. ЮгеЬиШпщ Р. уега и Р. иНедегпта.

- 10 021886

В настоящем описании термин полимер относится к соединению или смеси соединений, содержащих повторяющиеся звенья (также называемые мономерами) одинаковой химической структуры, причем мономеры соединены между собой ковалентными связями. Примером мономера, который может образовывать полимер, является терпен, например монотерпен, такой как мирцен. Полимеры могут иметь различные степени полимеризации и таким образом включать полимерные формы с различной длиной цепи. Полимеры включают гомополимеры и гетерополимеры (также известные как сополимеры) и могут иметь различные изомерные и диастереомерные конфигурации.

В настоящем описании термины полимер мирцена и полимирцен взаимозаменяемо относятся к полимеру, образованному мономерами мирцена. Полимер мирцена включает полимерные формы, имеющие различные степени полимеризации, и предпочтительно полимеры мирцена, имеющие степень полимеризации по меньшей мере 6. Настоящее изобретение включает, без ограничения, полимер β-мирцена (поли-в-мирцен), полимер α-мирцена (поли-а-мирцен), гомополимеры указанных соединений, гетерополимеры (также известные как сополимеры), содержащие мономеры мирцена, непосредственно или опосредованно связанные ковалентно с гетерологичными мономерами, транс- и цис-изомеры указанных соединений, Ό- и Ь-энантиомеры указанных соединений или комбинации указанных соединений. Полимер мирцена может быть получен из природного источника, в частности из мастики, или может представлять собой продукт реакции химического синтеза.

В настоящем описании термин выделенная фракция мастиковой смолы относится к фракции, полученной после экстракции мастиковой смолы при помощи по меньшей мере одного полярного или неполярного органического растворителя или комбинации указанных растворителей. Выделенная фракция согласно настоящему изобретению в общем случае растворима в полярном или неполярном органическом растворителе или одновременно в обоих типах растворителей.

В настоящем описании термин выделенная фракция полимера мирцена относится к препарату полимера мирцена, имеющего заданную молекулярную массу или молекулярную массу в заданном диапазоне, который отделен от остальных химических компонентов, присутствующих в источнике, из которого выделен полимер мирцена, в частности химической реакционной смеси или растительном экстракте.

В настоящем описании термин степень чистоты относится к содержанию определенного химического соединения в препарате, выраженному в процентах по массе определенного химического соединения по отношению к остальным химическим соединениям в препарате.

В настоящем описании гомополимер относится к полимеру, полученному из одного типа мономера. Например, полимер мирцена представляет собой гомополимер, если он получен только из мономеров мирцена, например β-мирцена. Гомополимер также может представлять собой смесь полимеров, полученных из одного и того же мономера, но имеющих различную степень полимеризации, т.е. длину цепи. Соответственно полимер мирцена может включать ряд соединений с различной длиной цепи и соответственно с различной молекулярной массой. Кроме того, гомополимер может содержать мономеры, имеющие различные изомерные конфигурации, например β-мирцен и а-мирцен.

В настоящем описании гетерополимер и сополимер относятся к полимеру, полученному более чем из одного типа мономера. Так, например, сополимер мирцена получен из мономеров мирцена в дополнение к гетерологичному типу мономера, не являющегося мирценом. Сополимеры включают чередующиеся сополимеры, периодические сополимеры, случайные сополимеры, блок-сополимеры и статистические сополимеры, известные в данной области техники.

В настоящем описании степень сополимеризации относится к числу мономеров или мономерных звеньев, ковалентно соединенных между собой с образованием полимера, например к числу мономеров мирцена в полимерном соединении мирцена.

В настоящем описании среднемассовая молекулярная масса относится к средней молекулярной массе полимера, имеющего молекулы с различными длинами цепи, выраженной уравнением ₇ Σ^ где N представляет собой число молекул с молекулярной массой М₁. Среднемассовую молекулярную массу можно определить, например, по светорассеянию, рассеянию нейтронов на малых углах, рассеянию рентгеновских лучей или скорости осаждения.

В настоящем описании среднечисленная молекулярная масса относится к средней молекулярной массе полимера, имеющего молекулы с различными длинами цепи, выраженной уравнением где N представляет собой число молекул с молекулярной массой М₁. Среднечисленную молекулярную массу можно определить, например, при помощи гельпроникающей хроматографии (также известной как эксклюзионная хроматография) или вискозиметрии.

Термины коэффициент полидисперсности и молекулярное распределение в настоящем описании взаимозаменяемо относятся к отношению сред немассовой молекулярной массы к среднечисленной

- 11 021886 молекулярной массе.

В настоящем описании терпеновые соединения относятся к углеводородам, содержащим изопрен, и родственным кислородсодержащим соединениям, таким как спирты, альдегиды или кетоны (терпеноиды). Звено изопрена (СН₂=С(СНз)-СН=СН₂) представляет собой основную структурную единицу таких соединений. Терпеновые углеводороды в целом имеют молекулярную формулу (С₅Н₈)_П и включают монотерпены, сесквитерпены, дитерпены, тритерпены и тетратерпены, соответственно содержащие 2, 3, 4, 6 и 8 изопреновых звеньев. Терпены можно дополнительно разделить на ациклические или циклические.

Примеры монотерпенов включают мирцен, лимонен и пинен, которые соответственно представляют собой примеры ациклических, моноциклических и бициклических монотерпенов. Примеры сесквитерпенов включают неролидол и фарнезол. Примеры дитерпенов включают кафестол и фитол. Примерами тритерпена и тератерпена являются сквален и каротин соответственно.

В настоящем описании по существу, не содержит обозначает препарат или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, в общем случае содержащие менее 3% указанного вещества, предпочтительно менее 1% и наиболее предпочтительно менее 0,5%.

В настоящем описании терапевтически эффективное количество относится к такому количеству фармацевтического ингредиента, которое, по существу, индуцирует, стимулирует или приводит к желаемому терапевтическому действию.

В настоящем описании фармацевтически приемлемый носитель относится к разбавителю или несущей среде, применяемым для улучшения доставки и/или фармакокинетических свойств фармацевтического ингредиента, в состав с которым они входят, но сами по себе не оказывают терапевтического действия и не индуцируют или не вызывают какого-либо нежелательного или неблагоприятного действия или побочной реакции у субъекта.

В настоящем описании фармацевтически приемлемый гидрофобный носитель относится к гидрофобному неполярному разбавителю или несущей среде, в которых растворен или суспендирован полимер мирцена.

В настоящем описании дифференцировка клеток относится к процессу, в котором менее специализированная клетка превращается в более специализированную клетку. Дифференцировка клеток может быть установлена на основании изменений любой из ряда характеристик клетки, включая, без ограничения, размер, форму, внешний вид органелл, мембранный потенциал, метаболическую активность и восприимчивость к сигналам. Конкретная степень может быть приписана типу клеток для описания степени дифференцировки.

В настоящем описании нарушение неврологической функции относится к отклонению или ослаблению по меньшей мере одной из сенсорной, когнитивной или двигательной функции по сравнению с предшествующим значением функции или активности и/или по сравнению с индивидуумами без нарушений, соответствующими принятым критериям.

Указанные в настоящем описании числовые значения следует понимать как указанное значение ±10%.

Выделенные фракции мастиковой смолы и полимера мирцена.

В настоящем изобретении применяют выделенные фракции, содержащие полимер мирцена. Фракция может быть из растительного источника, в частности мастиковой смолы, или может быть продуктом химического синтеза. Полимер мирцена для применения в настоящем изобретении представляет собой полимерное соединение или смесь полимеров с различными молекулярными массами, образованных звеньями мирцена. Подходящие растительные источники полимера мирцена включают растения, относящиеся к семейству АпасатФасеае или к другому семейству растений. Виды растений, из которых можно получить продукт полимера мирцена, включают, без ограничения, виды, относящиеся к родам РМаста, Ршц8, Рюеа, Лнирегиз. АЫек, Ьапх, Остит, Ьаигик и Ьауепйи1а. Подходящие виды РМаста включают, без ограничения, Р. 1епЙ8си8, Р. аНапйса, Р. ра1е8Йпа, Р. каройае, Р. 1егеЫп1йи8, Р. уета и Р. 1п1е«егпта. Полимер мирцена можно получить из любой части растения, включая, например, смолу, листья, ветки, ягоды и семена. Выделенную фракцию полимера мирцена легко можно получить из мастиковой смолы, хотя можно применять и другие части и продукты растения. Различные способы получения и характеризации выделенной фракции, содержащей полимер мирцена, из мастиковой смолы приведены в качестве примеров в примерах 1 и 2 настоящего изобретения. Коммерческие препараты мастики поставляет, например, Иге СЫок Оит Макйс Сго\уег5 А^оааПоп или О. Ва1й\уш & Со., и.К.

Как вариант, полимер мирцена может быть получен химически как синтетический эквивалент существующего в природе полимера, такого как цис-1,4-поли-в-мирцен, или может представлять собой не существующий в природе полимер мирцена, такой как полимер α-мирцена. Настоящее изобретение не ограничивает процесс, при помощи которого можно получить полимер мирцена, природный, синтетический или полусинтетический.

Предполагают, что полимер мирцена может представлять собой продукт синтеза, полученный при помощи химического процесса с использованием в качестве субстрата мономерной формы монотерпенового мирцена. Субстрат мономера мирцена может быть выделен из растения или может быть химиче- 12 021886 ским или ферментативным путем получен из предшественника терпена, как это известно в данной области техники. Например, мономер β-мирцена, выделенный из растительного источника, можно впоследствии подвергнуть полимеризации с образованием полимера β-мирцена при помощи химического процесса. Если субстрат мирцена получен из природного источника, полученный продукт может упоминаться как полусинтетический продукт. Химические процессы полимеризации β-мирцена описаны, например, в патентах США №№ 4564718; 5759569; 7232872 и 7214750 и в статьях Ые^тагк е1 а1. (1988) 1. Ро1утег δει. 26, 71-77 (1988) и Са\У5е е1 а1. (1986) 1оита1 о£ Аррйей Ро1утег §с1епсе, νοί. 31, 1963-1975.

В подходящем процессе химического синтеза применяют реакцию анионной полимеризации, например реакцию, включающую применение по меньшей мере одного алканового или циклоалканового растворителя и по меньшей мере одного алкилщелочного металла. Например, алкилщелочной металл может представлять собой бутиллитий, а алкановый растворитель может представлять собой гексан или циклоалкановый растворитель может представлять собой циклогексан. Алкановый растворитель и инициатор алкилщелочной металл могут присутствовать в реакционной смеси в соотношении по меньшей мере 20:1. Реакцию анионной полимеризации можно останавливать при помощи таких соединений, как вода, спирт, молекулярный кислород и диоксид углерода.

Процесс синтеза 1,4-поли-в-мирцена согласно настоящему описанию (пример 3) особенно подходит для обеспечения различных биологических активностей полимера, таких как стимуляция дифференцировки клеток. Известно, что мономер β-мирцена обнаружен в различных растениях, включая деревья родов Ршик, Рюеа, Штрегик, АЫек и Ьапх и цветы родов АпйггЫпит, Вок^еШа, Сйгик и Супига.

Выделенную фракцию полимера мирцена можно получить в виде очищенного продукта реакции химического синтеза, как описано в примере 3 настоящего изобретения. Химически синтезированный полимер мирцена можно отделить от непрореагировавшего субстрата и других реагентов, проанализировать и дополнительно фракционировать согласно молекулярной массе при помощи известных в данной области техники способов анализа и разделения. Указанные способы включают способы, разделяющие молекулы исходя из их размера, заряда или гидрофобности, включая, например, эксклюзионную хроматографию (8ЕС), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газожидкостную хроматографию (ГЖХ) и комбинации указанных способов.

Способы анализа для определения точной химической структуры полученного полимера включают ядерный магнитный резонанс (например, ¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР), вискозиметрию, различные массспектрометрические способы (например, ΜΑΕΌΙ-ΤΟΡ), комбинированные способы, такие как жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС), методики светорассеяния, такие, например, как рассеивание лазерного излучения с кратными углами (МАЬЬЗ), анализ на общее содержание углерода, спектрофотометрия в УФ и видимом диапазоне, ИК и Фурье-ИК спектрофотометрия и другие способы, известные в данной области техники. Те же способы и подходы можно применять для очистки и характеризации полимеров мирцена, выделенных из растений, как показано в примере 2 настоящего описания.

Согласно особенно предпочтительному варианту реализации фракция полимера мирцена, являющегося продуктом химического синтеза, по существу, не должна содержать мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее 6. Также предпочтительно, чтобы выделенный продукт, по существу, не содержал мономерных терпеновых соединений, растворимых в полярных органических растворителях.

Аналогичные способы можно применять для получения выделенных фракций мастиковой смолы и выделенных фракций полимера мирцена, если полимер мирцена получен из растительного источника, например, такого как мастиковая смола. Для общего описания собранный растительный материал, например мастиковую смолу, объединяют в подходящем сосуде с подходящим растворителем, обычно с полярным растворителем. Подходящие полярные растворители включают, например, спирты, простые эфиры, сложные эфиры, амиды, альдегиды, кетоны, нитрилы и комбинации указанных соединений. Конкретными примерами полярных органических растворителей являются метанол, этанол, пропанол, изопропанол, 1-бутанол, 2-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, 1-пентанол, 2-пентанол, 3-пентанол, неопентанол, 3-метил-1-бутанол, 2-метил-1-бутанол, 3-метил-2-бутанол, 2-метил-2-бутанол, этиленгликоль, этиленгликоля монометиловый эфир, диэтиловый эфир, метилэтиловый эфир, этилпропиловый эфир, метилпропиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, тетрагидрофуран, дигидрофуран, фуран, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, ацетальдегид, метилформиат, этилформиат, этилпропионат, метилпропионат, дихлорметан, хлороформ, диметилформамид, ацетамид, диметилацетамид, Ν-метилпирролидон, ацетон, этилметилкетон, диэтилкетон, ацетонитрил, пропионитрил и комбинации указанных соединений.

Мастиковую смолу и растворитель предпочтительно объединяют так, чтобы растворитель присутствовал в большом избытке, например 10:1 или 20:1. Смесь можно периодически или постоянно перемешивать в течение промежутка времени от нескольких минут до нескольких часов. Растворитель можно декантировать без какой-либо обработки, или, возможно, смесь можно сначала подвергнуть центрифугированию на низкой скорости, например от 100 до 2000 об/мин, как известно в данной области техники. Нерастворимый материал отделяют от экстракта и добавляют к нерастворимому материалу свежую али- 13 021886 квоту растворителя, таким образом повторяют процесс экстракции и растворения в виде ряда циклов для получения настолько большого количества компонентов, растворимых в полярном растворителе, насколько это возможно. После последней стадии растворения экстракты, содержащие материал, растворимый в полярном растворителе, объединяют и выпаривают полярный растворитель (например, при помощи ротационного испарения, известного в данной области техники) с образованием материала, растворимого в полярном растворителе, также называемого черновым или экстрактом первой стадии.

Материал экстракта первой стадии объединяют с неполярным органическим растворителем и проводят экстракцию путем встряхивания в течение 1 ч. Подходящие неполярные растворители включают ациклические или циклические насыщенные или ненасыщенные алифатические углеводороды и ароматические углеводороды, например С5-С10 алканы, С5-С10 циклоалканы, С6-С14 ароматические углеводороды и комбинации указанных соединений. Каждый из указанных выше углеводородов может содержать в качестве заместителей один или несколько атомов галогена, например С7-С14 перфторалканы. Конкретными примерами неполярных органических растворителей являются пентаны, гексаны, гептаны, октаны, нонаны, деканы, циклопентан, циклогексан, циклогептан, бензол, толуол, ксилол, изомеры и смеси указанных соединений.

Материалы, оставшиеся нерастворенными или выпавшие в осадок в присутствии неполярного растворителя, отделяют и отбрасывают. Затем получают фракцию, растворимую в неполярном растворителе, путем выпаривания неполярного растворителя (например, путем ротационного выпаривания). Полученная фракция, которую можно называть очищенной или экстрактом второй стадии, соответствует выделенной фракции мастиковой смолы, характеризующейся тем, что она растворима как в полярном растворителе, так и в неполярном растворителе, в то время как материалы, растворимые в полярном растворителе, но не растворимые в неполярном растворителе, были удалены. Указанная особенность отличает выделенные фракции согласно настоящему изобретению от экстрактов мастиковой смолы известного уровня техники, поскольку последние в общем случае содержат широкий спектр соединений, растворимых только в полярных растворителях. Согласно идеям настоящего изобретения такие соединения влияют на благотворное биологическое действие выделенных фракций согласно настоящему изобретению.

Экстракт второй стадии можно дополнительно высушить, например, в высоком вакууме (например, <0,01 мбар в течение нескольких дней) для удаления остатков растворителя и другого летучего материала, взвесить и объединить с подходящим неполярным органическим растворителем или другим носителем для обеспечения растворения. В примерах 1 и 2 настоящего изобретения описаны такие выделенные фракции, содержащие полимер мирцена. Полученные фракции, содержащие полимер мирцена, можно применять непосредственно, или дополнительно очищать, характеризовать и/или фракционировать при помощи перечисленных выше средств, известных в данной области техники.

Согласно конкретным вариантам реализации выделенные фракции согласно настоящему изобретению получают при помощи процесса, включающего стадии:

(c) возможно, удаления указанного полярного органического растворителя;

(б) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), неполярным органическим растворителем;

(ί) возможно, удаления указанного неполярного органического растворителя, причем стадии (ά)-(ί) могут предшествовать стадиям (а)-(с).

Процесс может дополнительно включать фракционирование растворимой фракции, полученной после стадии (с) или стадии (ί), например, при помощи эксклюзионной хроматографии или другого известного в данной области техники способа.

Процесс может дополнительно включать удаление растворителя после любой из стадий (с) или (ί) или обеих указанных стадий. Удаление растворителя можно осуществить при помощи любых известных в данной области средств, например ротационного испарения, применения высокого вакуума и комбинации указанных средств. Согласно конкретному варианту реализации стадии (а)-(с) выполняют перед стадиями (б)-(£) или наоборот. Согласно конкретному варианту реализации полярный органический растворитель содержит этанол, а неполярный органический растворитель содержит гексан. Как легко поймет опытный специалист в данной области техники, стадии (а)-(с) и стадии (ά)-(ί) можно, каждые независимо, осуществлять в виде ряда циклов для оптимизации процесса экстракции и степени очистки продукта.

Для получения композиции для терапевтического применения можно применять подходящие носители, такие как гидрофобные носители, включая фармацевтически приемлемые масла, возможно, в комбинации с восками, согласно настоящему описанию.

Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации композиции, содержащие фракции, выделенные из мастиковой смолы, согласно настоящему описанию должны содержать менее примерно 20 мас.% мономерных и олигомерных терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, не растворимых в неполярном органическом растворителе, причем выше- 14 021886 указанные растворители относятся к растворителям, использованным при получении фракции. Более предпочтительно выделенные фракции содержат менее примерно 5 мас.% таких терпеновых соединений. Еще более предпочтительно выделенные фракции, по существу, не содержат таких терпеновых соединений. Ингибирующее действие фракций, содержащих такие низкомолекулярные соединения, на биологическую активность полимера мирцена, показано в качестве примера в примере 8 настоящего описания.

Согласно другому конкретному варианту реализации выделенная фракция, содержащая полимер мирцена, получена из растения и, по существу, не содержит мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее 6. Согласно другому конкретному варианту реализации выделенная фракция, содержащая полимер мирцена, получена из растения и, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, не растворимых в неполярном органическом растворителе.

Следует понимать, что полимер мирцена может иметь не единственную молекулярную массу, но, напротив, распределение молекулярных масс, представляющее совокупность молекул полимера мирцена с различной длиной цепи, т.е. степенью полимеризации.

Не существует конкретного верхнего предела молекулярной массы или степени полимеризации полимера мирцена. Согласно одному в настоящее время предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения степень полимеризации составляет по меньшей мере примерно 6. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет по меньшей мере примерно 10. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет по меньшей мере примерно 25. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет по меньшей мере примерно 35. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет степень полимеризации в диапазоне от по меньшей мере примерно 6 до примерно 1800. Подходящие типичные диапазоны включают примерно от 30 примерно до 500, или примерно от 35 примерно до 150.

Среднечисленная молекулярная масса полимера мирцена предпочтительно составляет по меньшей мере примерно 800. Более предпочтительно среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 1000, как, например, по меньшей мере 2000 или по меньшей мере 3000 и еще более предпочтительно среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 5000. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу в диапазоне примерно от по меньшей мере 800 до примерно 100000. Согласно конкретным вариантам реализации среднечисленная молекулярная масса находится в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из: от по меньшей мере примерно 800 до примерно 5000; от по меньшей мере примерно 800 до примерно 15000; от примерно 5000 до примерно 15000; от примерно 5000 до примерно 20000; от примерно 15000 до примерно 30000; от примерно 25000 до примерно 40000; от примерно 35000 до примерно 50000; от примерно 45000 до примерно 60000; от примерно 55000 до примерно 70000; от примерно 65000 до примерно 80000; от примерно 75000 до примерно 90000; от примерно 85000 до примерно 100000; и комбинаций указанных диапазонов. Согласно конкретному варианту реализации среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 5000. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000. Следует понимать, что композиция может содержать фракции полимера мирцена с различной молекулярной массой, например, в диапазоне от по меньшей мере примерно 5000 до примерно 20000, а также в диапазоне от примерно 25000 до примерно 40000. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет молекулярное распределение менее 5.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция состоит, по существу, из полимера мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 5000 до примерно 20000.

Молекулярная масса полимерного продукта может быть выражена рядом способов, известных в данной области техники, например среднечисленная молекулярная масса или среднемассовая молекулярная масса. Молекулярную массу можно определить при помощи ряда средств, таких как светорассеяние, рассеяние лазерного излучения с кратными углами (МАЬЬ8), малоугловое нейтронное рассеяние, рентгеновское рассеяние, скорость седиментации, вискозиметрия (уравнение Марка-Хувинка), массспектрометрия (например, МАЬИ1-ТОР) и гельпроникающая хроматография.

Полимер мирцена может существовать в виде различных геометрических изомеров, полученных в результате расположения заместителей относительно двойной углерод-углеродной связи. Такие изомеры обозначают как цис- или транс-конфигурацию (также называемые соответственно Ζ- или Еконфигурацией), причем цис- (или Ζ) обозначает заместители с одной и той же стороны двойной углерод-углеродной связи, а транс- (или Е) обозначает заместители с противоположных сторон двойной углерод-углеродной связи. Различные геометрические изомеры и смеси указанных изомеров включены в объем настоящего изобретения.

Продукт полимера мирцена может содержать один или несколько асимметрических атомов углерода и может благодаря этому проявлять оптическую изомерию и/или диастереомерию. Все стереоизомеры и диастереомеры включены в объем настоящего изобретения как в виде отдельного изомера, так и в виде смеси стереохимических изомерных форм. Различные стереоизомеры и диастереомеры можно разделить при помощи обычных методик, например хроматографии или дробной кристаллизации. Как вариант,

- 15 021886 выбранные оптические изомеры можно получить путем взаимодействия соответствующих оптически активных исходных материалов в условиях, не вызывающих рацемизации или эпимеризации, или путем получения производных, например, с участием гомохиральной кислоты, с последующим разделением диастереомерных производных обычными способами.

Подходящие формы полимера мирцена включают полимер β-мирцена (поли-в-мирцен), включая

1.4- поли-в-мирцен, 3,4-поли-в-мирцен, 1,2-поли-в-мирцен, цис-1,4-поли-в-мирцен, транс-1,4-поли-вмирцен, полимер α-мирцена (поли-а-мирцен) или комбинации указанных соединений. Выделение и характеризация 1,4-поли-в-мирцена из мастики описаны, например, в Уап дег Вегд с1 а1. (1998) Те1гаНедгоп Ье« 3:2645-2648.

Согласно конкретным вариантам реализации полимер мирцена имеет линейную структуру, разветвленную структуру или циклическую структуру.

Выделенная фракция полимера мирцена согласно настоящему изобретению имеет степень чистоты по меньшей мере 90%, такую как по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%. Как понятно в данной области техники, желательна степень чистоты настолько высокая, насколько это возможно, в том числе, чтобы гарантировать соответствие требованиям органов регулирования здравоохранения. Однако следует понимать, что фракция полимера мирцена может содержать молекулы полимера с различными молекулярными массами, такими как в пределах узкого или широкого диапазона, без снижения определенной степени чистоты. Кроме того, выделенная фракция полимера мирцена может содержать различные описанные выше структурные изомеры полимера мирцена без снижения определенной степени чистоты. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцен. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит смесь цис-1,4-поли-в-мирцена и транс-1,4-поли-в-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 80 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцен. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-вмирцен со среднечисленной молекулярной массой по меньшей мере 800. Среднечисленная молекулярная масса может составлять по меньшей мере 1000. Средняя молекулярная масса может составлять по меньшей мере 2000. Среднечисленная молекулярная масса может составлять по меньшей мере 3000. Среднечисленная молекулярная масса может составлять по меньшей мере 5000. Среднечисленная молекулярная масса может составлять по меньшей мере 10000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцен со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 800 примерно до 5000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис1.4- поли-в-мирцен со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 1000 примерно до 10000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцен со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 10000 примерно до 20000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцен со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена состоит, по существу, из цис-1,4-поли-вмирцен со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере 90% и полимер мирцена имеет степень полимеризации по меньшей мере 10.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцен со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 20000 примерно до 30000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90% цис-1,4-поли-в-мирцен со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 30000 примерно до 50000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-вмирцен со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 50000 примерно до 80000.

Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации выделенная фракция полимера мирцена, по существу, очищена от терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, не растворимых в неполярном органическом растворителе. В частности, композиция должна содержать менее примерно 10 мас.%, более предпочтительно менее примерно 5 мас.% и наиболее предпочтительно менее примерно 3 мас.% терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, не растворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретным вариантам реализации композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, не растворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретным вариантам реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.%, более предпочтительно менее примерно 5 мас.% и наиболее предпочтительно менее примерно 3 мас.% мономерных терпеновых соединений. Согласно конкретному варианту реализации

- 16 021886 композиция, по существу, не содержит мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее примерно 5. Согласно конкретному варианту реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.%, более предпочтительно менее примерно 5 мас.% и наиболее предпочтительно менее примерно 3 мас.% терпеновых соединений, выбранных из группы, состоящей из β-мирцена, амирцена, цис-а-оцимена, дигидромирцена, лимонена, а-пинена, β-пинена и комбинаций указанных соединений.

Фармацевтические композиции.

Композиция для применения согласно настоящему изобретению содержит терапевтически эффективное количество выделенной фракции полимера и фармацевтически приемлемый гидрофобный носитель.

Подходящий гидрофобный носитель содержит по меньшей мере одно масло, такое как, например, минеральное масло, растительное масло или комбинацию указанных масел.

Термин минеральное масло относится к прозрачной бесцветной жидкости практически без запаха и вкуса, полученной при перегонке нефти. Указанную жидкость можно также называть белое масло, белое минеральное масло, жидкий вазелин, жидкий парафин или жидкое парафиновое масло. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения минеральное масло представляет собой светлое минеральное масло, коммерчески доступный продукт, который можно получить или в виде продукта качества ΝΡ (Национальный Формуляр), или в виде продукта качества И8Р (Фармакопея США). Для настоящего изобретения минеральное масло предпочтительно не содержит ароматических или ненасыщенных соединений.

Подходящие растительные масла включают, без ограничения, миндальное масло, масло канолы, кокосовое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло виноградной косточки, оливковое масло, арахисовое масло, шафрановое масло, кунжутное масло, соевое масло или комбинации указанных масел. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения минеральное масло представляет собой светлое минеральное масло.

Фармацевтически приемлемый носитель может как вариант или дополнительно содержать походящий заменитель масла. Заменители масла включают алканы, содержащие по меньшей мере 10 атомов углерода (например, изогексадекан), сложные эфиры бензоата, алифатические сложные эфиры, некомедоногенные сложные эфиры, летучие кремнийорганические соединения (например, циклометикон) и летучие заместители кремнийорганических соединений. Примеры сложных эфиров бензоата включают С₁₂С₁₅ алкилбензоат, изостеарилбензоат, 2-этилгексилбензоат, дипропиленгликольбензоат, октилдодецилбензоат, стеарилбензоат и бегенилбензоат. Примеры алифатических сложных эфиров включают С₁₂С₁₅ алкилоктаноат и диоктилмалеат. Примеры некомедоногенных сложных эфиров включают изононилизононаноат, изодецилизононаноат, диизостеарил димер дилинолеат, арахидилпропионат и изотридецилизононаноат. Примеры летучих заменителей кремнийорганических соединений включают изогексилдеканоат, октилизононаноат, изононилоктаноат и диэтиленгликольдиоктаноат.

Циклометикон представляет собой парообразующее кремнийорганическое соединение, которое можно включить в носитель для содействия изготовлению композиции, поддающейся введению при помощи дозатора спрея. Кроме того, благодаря своему парообразующему свойству, циклометикон может помогать сохранять и удерживать состав на поверхности, на которую он нанесен, например, на области раны.

Гидрофобный носитель может дополнительно содержать по меньшей мере один воск. Воски включают, например, пчелиный воск, растительные воски, воски сахарного тростника, минеральные воски и синтетические воски. Растительные воски включают, например, карнаубский воск, канделильский воск, воск урикури и воск жожоба. Минеральные воски включают, например, парафиновый воск, горный воск, микрокристаллический воск и озокериты. Синтетические воски включают, например, полиэтиленовые воски.

Фармацевтическую композицию можно изготовить в виде рецептуры любой из ряда форм, как, например, капсулы (включая мягкую желатиновую капсулу), таблетки, липосомы, суппозитории, суспензии, мази, растворы, эмульсии или микроэмульсии, пленки, цементы, порошки, клеи, аэрозоли, спреи и гели.

Для получения фармацевтической композиции полимер мирцена можно подходящим образом включить в рецептуру комплексов включения, наноэмульсий, микроэмульсий, порошков и липосом. Согласно конкретному варианту реализации комплекс включения содержит по меньшей мере один циклодекстрин. Согласно конкретному варианту реализации циклодекстрины содержат гидроксипропил-βциклодекстрин. Согласно конкретному варианту реализации наноэмульсия содержит капельки со средним размером частиц менее 800 нм. Согласно конкретному варианту реализации капельки имеют средний размер частиц менее 500 нм. Согласно конкретному варианту реализации капельки имеют средний размер частиц менее 200 нм. Согласно конкретному варианту реализации порошки представляют собой порошки, высушенные распылением. Согласно конкретному варианту реализации липосомы содержат многослойные липосомы. Согласно конкретному варианту реализации микроэмульсия содержит неионо- 17 021886 генное поверхностно-активное вещество. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, полигидроксилированные касторовые масла, сложные эфиры полиоксиэтиленированного сорбитана и жирных кислот (полисорбаты), полоксамер, производное витамина Е, алкиловые простые эфиры полиоксиэтилена, полиоксиэтиленстеараты, насыщенные полигликолизированные глицериды или комбинации указанных соединений.

Различные составы полимера мирцена и препараты, содержащие указанные составы, описаны в примерах 17-21 настоящего изобретения. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить при помощи любых средств, подходящих для указанной задачи. Например, введение возможно посредством перорального, парентерального, топического или трансдермального путей. Парентеральное введение включает внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный, внтурибрюшинный, внутриартериальный, внутриматочный, внутриуретральный, внутрисердечный, внутримозговой, интрацеребровентрикулярный, внутрипочечный, внутрипеченочный, внутрисухожильный, внутрикостный и интратекальный пути введения. Топическое введение включает нанесение посредством путей, выбранных из дермального, вагинального, ректального, ингаляционного, интраназального, окулярного, аурикулярного и трансбуккального. Введение может дополнительно включать методику или средства, такие как электропорация или воздействие ультразвукового излучения, способствующие введению, например, трансдермально. Другие методики, которые можно применять, включают, например, радиочастотное воздействие или применение распыления под давлением.

Вводимая дозировка будет зависеть от возраста, состояния здоровья и массы субъекта, применения одновременного лечения, при его наличии, частоты лечения и природы желательного действия. Количество полимера мирцена согласно настоящему изобретению в любой дозированной форме включает терапевтически эффективное количество, которое может зависеть от субъекта реципиента, пути и частоты введения.

В общем, полимер мирцена или выделенная фракция мастиковой смолы, присутствующие в фармацевтической композиции, могут обычно находиться в диапазоне примерно от 0,01 примерно до 25 мас.%, как, например, примерно от 0,01 примерно до 12 мас.% от общей массы композиции. Для топического применения процентное содержание полимера мирцена или выделенной фракции мастиковой смолы в композиции может находиться в диапазоне примерно от 0,05 примерно до 2,5%. Для введения посредством инъекции процентное содержание полимера мирцена или выделенной фракции мастиковой смолы в композиции может находиться в диапазоне примерно от 0,1 примерно до 7%. Для перорального введения процентное содержание полимера мирцена или выделенной фракции мастиковой смолы в композиции может находиться в диапазоне примерно от 0,005 примерно до 7%.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно производить способом, который сам по себе известен любому опытному специалисту в данной области техники, например при помощи обычных процессов смешивания, гранулирования, дражирования, заключения в мягкие капсулы, растворения, экстрагирования или лиофилизации. Согласно предпочтительным вариантам реализации составы являются неводными и/или не содержат полярных растворителей в непосредственном контакте с активным ингредиентом полимера мирцена с тем, чтобы избежать потери биологической активности активного ингредиента. Так, фармацевтические композиции для перорального применения можно получить путем смешивания активных соединений с твердыми или полутвердыми формообразующими агентами и подходящими консервантами и/или антиокислителями. Возможно, полученную смесь можно размолоть и переработать. Полученную смесь гранул можно применять после добавления подходящих вспомогательных веществ, при необходимости, для изготовления таблеток, мягких капсул или ядер драже.

Подходящие формообразующие агенты включают, в частности, наполнители, такие как сахариды, например лактоза или сахароза, маннит или сорбит; препараты целлюлозы и/или фосфата кальция, например трикальцийфосфат или гидрофосфат кальция; а также связующие вещества, такие как крахмальная паста, с использованием, например, кукурузного крахмала, пшеничного крахмала, рисового крахмала, картофельного крахмала, желатина, трагаканта, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, натрия карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидона. При желании можно добавить дезинтегрирующие агенты, такие как вышеуказанные крахмалы, а также карбоксиметилкрахмал, сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту, или соли альгиновой кислоты, такие как альгинат натрия. Вспомогательными являются агенты, регулирующие сыпучесть, и смазывающие вещества, например двуокись кремния, тальк, стеариновую кислоту или соли стеариновой кислоты, такие как стеарат магния или стеарат кальция, и/или полиэтиленгликоль. Ядра драже снабжают подходящими покрытиями, которые, при желании, устойчивы к желудочному соку, для чего можно применять концентрированные растворы сахаридов, которые, возможно, могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лака и походящие органические растворители или смеси растворителей. Для получения покрытий, устойчивых к желудочному соку, применяют растворы подходящих препаратов целлюлозы, таких как фталат ацетилцеллюлозы или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы. Красящие вещества или пигменты можно вводить в покрытия для таблеток или драже, например, дли идентификации или с целью указания на комбинации доз активных соединений.

- 18 021886

Другие фармацевтические композиции для перорального применения включают твердые составные капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, изготовленные из желатина с пластификатором, таким как глицерин или сорбит. Составные капсулы могут содержать активные соединения в форме гранул, которые могут быть смешаны с наполнителями, такими как лактоза; связующими, такими как крахмалы; и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, возможно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения предпочтительно растворяют или суспендируют в подходящих жидкостях, таких как жирные масла или жидкий парафин. Дополнительно могут быть добавлены стабилизаторы.

Другие фармацевтические композиции для перорального применения включают пленку, выполненную с возможностью прилипания к слизистой оболочке полости рта, как описано, например, в патентах США №№ 4713243; 5948430; 6177096; 6284264; 6592887 и 6709671.

Фармацевтические композиции в форме суппозиториев состоят из комбинации активного соединения (соединений) с основой суппозитория. Подходящие основы суппозиториев включают, например, природные или синтетические триглицериды, полиэтиленгликоли или парафиновые углеводороды.

Составы для парентерального введения включают суспензии и дисперсии микрочастиц активных соединений в зависимости от обстоятельств. Согласно конкретному варианту реализации можно вводить масляные суспензии путем инъекций. Подходящие липофильные растворители или несущие среды включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например этилолеат, триглицериды, полиэтиленгликоль-400, Кремофор или циклодекстрины. Суспензии для инъекций могут содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Возможно, суспензия может также содержать стабилизаторы.

Фармацевтические композиции можно также приготовить с использованием липосом, содержащих активные ингредиенты. Как известно в данной области техники, липосомы, в общем, получают из фосфолипидов или других липидных веществ. Липосомы образованы моно- или мультиламеллярными гидратированными жидкими кристаллами, диспергированными в водной несущей среде. Можно применять любой нетоксичный, физиологически приемлемый и метаболизируемый липид, способный к образованию липосом. В общем, предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины) как природные, так и синтетические. Способы создания липосом известны в данной области техники, например способы, описанные в РгезсоИ, Εά., МеШойз ίη Се11 Вю1оду, Уо1ите XIV, Асайетю Рге88, №\у Уогк, Ν.Υ. (1976) и в патенте США № 7048943.

Составы для топического введения включают мази. Походящие носители включают растительные или минеральные масла, вазелин, жиры или масла с разветвленной цепью, животные жиры и воски. Предпочтительными носителями являются носители, в которых растворим активный ингредиент. Также можно включить стабилизаторы, увлажнители и антиокислители, а также при желании агенты, придающие цвет или запах. Составы мазей можно приготовить, например, путем смешивания раствора активного ингредиента в растительном масле с теплым мягким парафином, и оставляя полученную смесь остыть.

Фармацевтическая композиция может содержать микроэмульсию или эмульсию типа масло-в-воде для облегчения для указанного состава перорального, парентерального или топического применения. Такие эмульсии/микроэмульсии, в общем, содержат липиды, поверхностно-активные вещества, возможно, увлажнители и воду. Подходящие липиды включают липиды, в общем известные как подходящие для создания эмульсий/микроэмульсий типа масло-в-воде, например сложные эфиры глицеридов и жирных кислот. Подходящие поверхностно-активные вещества включают поверхностно-активные вещества, в общем, известные как подходящие для создания эмульсий/микроэмульсий типа масло-в-воде, в которых в качестве масляного компонента эмульсии применяют липиды. Предпочтительными могут быть неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как, например, этоксилированное касторовое масло, фосфолипиды и блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида. Подходящие увлажнители, в случае их применения, включают, например, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Составы фармацевтических композиций можно приготовить в виде геля, такого как гидрогель, образованного гельобразующим полимером, таким как каррагинан, ксантановая камедь, камедь карайи, гуммиарабик, камедь рожкового дерева, гуаровая камедь. Гидрогель можно комбинировать с эмульсией типа масло-в-воде, содержащей активный ингредиент.

Состав фармацевтической композиции можно приготовить в виде цемента, такого как цементы, содержащие полиметилметакрилат (ПММА) или фосфат кальция, применяемые в ортопедической хирургии.

Состав фармацевтической композиции можно приготовить в виде порошка, в частности как порошки, применяемые для трансдермального применения с использованием радиочастотного воздействия, описанные, например, в патентах США №№ 6074688 и 6319541 и в АО 2006/003659.

Состав фармацевтической композиции можно приготовить в виде клея, такого как клеи, содержащие октоцианоакрилат, применяемые для закрытия ран.

Согласно конкретному варианту реализации фармацевтическая композиция, по существу, не содержит мономерных и низкомолекулярных терпеновых соединений, включая, например, соединения,

- 19 021886 относимые к монотерпенам, дитерпенам, сесквитерпенам, тритерпенам, тетратерпенам. Примеры терпеновых соединений включают β-мирцен, α-мирцен, цис-а-оцимен, дигидромирцен, лимонен, а-пинен, βпинен, тирукаллол, бетулональ, мастикадиеноновая кислота, мастикадиеноловая кислота, изомастикадиеноновая кислота, изомастикадиеноловая кислота, олеаноловая кислота и олеаноновая кислота.

Терапевтические применения.

Согласно настоящему изобретению предложены терапевтические применения и способы лечения нарушения неврологической функции и индуцирования или стимуляции регенерации тканей. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенную фракцию мастиковой смолы или выделенную фракцию полимера мирцена согласно настоящему описанию.

Стадия введения композиции может включать любой приемлемый путь, включая пероральный, топический, парентеральный и трансдермальный. Парентеральное введение включает внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный, внтурибрюшинный, внутриартериальный, внутриматочный, внутриуретральный, внутрисердечный, внутримозговой, интрацеребровентрикулярный, внутрипочечный, внутрипеченочный, внутрисухожильный, внутрикостный и интратекальный пути введения. Топическое введение включает нанесение посредством путей, выбранных из дермального, вагинального, ректального, ингаляционного, интраназального, окулярного, аурикулярного и трансбуккального.

Согласно конкретным вариантам реализации стадия введения включает осуществление контакта клеток конкретного типа, конкретной линии дифференцировки или находящихся на конкретной стадии дифференцировки с композицией. Клетки могут принадлежать к любому из множества типов клеток, включая, в частности, нервные клетки, нейрональные клетки, клетки эндотелия, клетки эпителия и стволовые клетки указанных линий дифференцировки клеток. Далее, клетки могут принадлежать к любой линии дифференцировки клеток, например эктодермальной, мезодермальной, эндодермальной линиям дифференцировки или к стволовым клеткам указанных линий дифференцировки. Согласно различным вариантам реализации стадия осуществления контакта клеток проводится ίη νΐνο, ех νΐνο или ίη νίΐτο.

Способ лечения нарушения неврологической функции согласно настоящему описанию имеет особые преимущества для субъектов, страдающих от нейродегенеративных состояний и заболеваний, включающих, в частности, травму, сосудистую деменцию, старческую деменцию, болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (АБС), рассеянный склероз (МС), инсульт и болезнь Паркинсона. В других случаях способ можно выгодно применять у субъектов, страдающих нарушением неврологической функции, вызванной инфекцией (например, вирусной, бактериальной, грибковой, паразитической) или иммунологическим нарушением. Согласно конкретному варианту реализации нарушение неврологической функции вызвано воздействием лекарственного средства, такого как анестетик. Нарушение неврологической функции также может быть связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного расстройства, депрессии, ожирения, анорексии и кахексии.

Способы индуцирования или стимуляции регенерации тканей согласно настоящему описанию имеют особые преимущества для субъектов с повреждениями тканей, которые, например, могут быть связаны или являться результатом повреждения или поражения. Способы индуцирования или стимуляции регенерации тканей можно применять у субъектов, страдающих от повреждения или поражения, выбранного из группы, состоящей из инфаркта миокарда, легочной эмболии, церебрального инфаркта, окклюзионного поражения периферических артерий, грыжи, инфаркта селезенки, венозной язвы, аксотомии, отслойки сетчатки, раны (например, ожога, укуса, обморожения, колотой раны, осколочной раны, контузии, инфицированной раны или хирургической раны), инфекции и хирургического вмешательства.

Примеры способов согласно настоящему изобретению приведены в примерах настоящего описания. В примере 4 описано, что выделенная фракция полимера мирцена (полученная из мастики Р181ааа) индуцирует дифференцировку клеток пигментного эпителия сетчатки.

В примере 5 описано, что полимер мирцена сокращает восстановление после анестезии у экспериментальных животных.

В примере 6 описано, что та же фракция обладает активностью, индуцирующей дифференцировку линий опухолевых клеток меланомы и нейробластомы.

В примере 7 описано, что химически синтезированный полимер мирцена с молекулярной массой в различных диапазонах индуцирует дифференцировку клеток пигментного эпителия сетчатки.

В примере 8 описано, что низкомолекулярные соединения мастики, выделенные из полимера мирцена в процессе получения указанного полимера по причине растворимости указанных соединений только в полярном растворителе согласно настоящему изобретению, влияют, уменьшают и препятствуют дифференцировке клеток, вызванной активностью, проявляемой полимером мирцена.

В примерах 9-11 описано, что настоящее изобретение можно применять при лечении ран у субъектов, относящихся и не относящихся к млекопитающим.

В примере 12 описано, что композиция, содержащая полимер мирцена согласно настоящему изобретению, оказывает облегчающее действие в модели сосудистой деменции на животных.

В примере 13 описано, что настоящее изобретение можно применять для стимуляции аппетита у субъектов, страдающих различными нарушениями, приводящими к потере аппетита или патологическо- 20 021886 му набору массы в результате ожирения.

В примере 14 описано, что композиции, содержащие полимер мирцена согласно настоящему изобретению, оказывают облегчающее действие в модели инсульта на животных.

В примере 15 описано, что композиции, содержащие полимер мирцена согласно настоящему изобретению, оказывают облегчающее действие в модели повреждения/травмы зрительного нерва на животных.

В примере 16 описано, что композиции, содержащие полимер мирцена согласно настоящему изобретению, оказывают облегчающее действие в модели отслойки сетчатки на животных и обеспечивают явление заживления ран без шрамов.

Стадию осуществления контакта клеток можно проводить ш νίΐΓΟ или ех νίνο. В частности, клетки, или орган или ткань, полученные из клеток, предназначенные для имплантации или трансплантации субъекту, можно обработать согласно настоящему изобретению. Например, клеточные эксплантаты, или клетки, или ткани, выращенные и поддерживаемые в культуре, можно привести в контакт с композицией. Клетки могут происходить, например, от стволовых клеток аутологичного или гомологичного донора и могут быть предназначены для регенерации органа и/или имплантации реципиенту. В других случаях клетки происходят от гетерологичного донора и предназначены для имплантации или трансплантации реципиенту. Согласно конкретному варианту реализации клетки представляют собой клетки органа или ткани от гетерологичного донора, предназначенные для имплантации или трансплантации реципиенту. Согласно конкретному варианту реализации клетки представляют собой клетки, секретирующие растворимые факторы.

Способ можно осуществлять до или после имплантации медицинского устройства субъекту. Медицинские устройства включают, без ограничения, протез, искусственный орган или компонент искусственного органа, клапан, катетер, трубку, стент, искусственную мембрану, ритмоводитель, сенсор, эндоскоп, устройство для получения изображения, насос, проволоку и имплантат. Имплантаты включают, без ограничения, сердечный имплантат, кохлеарный имплантат, черепной имплантат, зубной имплантат, челюстно-лицевой имплантат, имплантат органа, ортопедический имплантат, сосудистый имплантат, внутрисуставной имплантат и имплантат груди.

Согласно конкретному варианту реализации медицинское устройство представляет собой имплантат органа, который может в некоторых случаях содержать аутологичные клетки субъекта.

Согласно конкретному варианту реализации стадия осуществления контакта включает средства, выбранные из группы, состоящей из электропорации, ультразвукового воздействия, радиочастотного воздействия, распыления под давлением и комбинации указанных средств.

Согласно конкретному варианту реализации стадия осуществления контакта включает установление контакта между тканевой жидкостью и композицией. Это может быть особенно выгодно для повреждений, окруженных тканевой жидкостью. Контакт между тканевой жидкостью и композицией можно осуществлять при помощи прокалывания и/или препарации кожи иглой, микроиглой или устройством, включающим множество игл или микроигл. Указанные иглы или микроиглы предпочтительно не полые и могут быть расположены во множестве, например, на гребне или щеткоподобном приспособлении.

Способ согласно настоящему изобретению подходит для применения у человека, прочих млекопитающих, рыб и птиц.

Изделия.

Способ согласно настоящему описанию может включать применение изделий, включающих композицию, содержащую полимер мирцена согласно настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция может находиться в виде покрытия изделия или может содержаться внутри сосуда, являющегося составной частью изделия. Фармацевтическая композиция выгодно присутствует в качестве покрытия на устройствах, вводимых в организм и предназначенных для встраивания в организм, например имплантат. Таким образом, фармацевтическая композиция может способствовать закрытию имплантата тканью благодаря активности полимера мирцена, индуцирующего дифференцировку клеток.

Фармацевтическая композиция может быть выгодно включена на поверхность или внутрь изделий, применяемых при лечении ран или восстановлении тканей, например повязку или бинт. Фармацевтическая композиция может таким образом стимулировать заживление раны благодаря активности полимера мирцена, индуцирующего дифференцировку клеток.

В других случаях фармацевтическая композиция может быть включена в устройство для доставки, такое как игла, устройство для инъекций или дозатор спрея, из которого композицию вводят в участок организма, нуждающийся в лечении, например в область раны.

Изделия включают, без ограничения, изделие из ткани, подгузник, повязку на рану, медицинское устройство, иглу, микроиглу, устройство для инъекций или распылитель спрея. Согласно конкретному варианту реализации изделие включает множество микроигл. Медицинские устройства и импланты такие, как описано выше в настоящем изобретении.

Следующие примеры представлены, чтобы более полно проиллюстрировать некоторые варианты реализации настоящего изобретения. Их, однако, не следует никоим образом рассматривать как ограни- 21 021886 чивающие широту объема изобретения. Опытный специалист в данной области техники легко может разработать множество вариантов и модификаций принципов, изложенных в настоящем описании, не выходя за рамки объема настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение выделенной фракции мастиковой смолы из растительных источников.

Способ 1. Мастиковую смолу (10 г) объединяли с абсолютным этанолом (200 мл) и оставляли полученную смесь стоять в течение ночи. Полученную смесь встряхивали, давали отстояться крупным нерастворимым частицам в течение 20 мин и переносили этанол в новую колбу. Остаток встряхивали со свежей порцией абсолютного этанола (150 мл) в течение 10 мин. Полученную этанольную фракцию объединяли с первой фракцией. Процедуру повторяли еще с одной порцией 150 мл абсолютного этанола, которую объединяли с первыми двумя фракциями этанола. Вслед за этим этанол удаляли в вакууме при помощи ротационного испарителя (температура водяной бани 30°С). К полученному остатку добавляли гексан (300 мл) и периодически встряхивали полученную смесь в течение 2 ч. После отстаивания в течение ночи в закрытой колбе для полного растворения растворимого материала и осаждения любого нерастворимого материала прозрачный раствор в гексане переносили в чистую предварительно взвешенную колбу и удаляли гексан при помощи ротационного испарителя. К полученной выделенной фракции немедленно добавляли выбранное количество масла и встряхивали полученную смесь до образования однородной смеси.

Способ 2. Мастиковую смолу (10 г) объединяли с абсолютным метанолом (300 мл) и оставляли полученную смесь стоять в течение ночи. Полученную смесь встряхивали, давали отстояться крупным нерастворимым частицам в течение 20 мин и переносили растворимую в метаноле фракцию в новую колбу. Остаток встряхивали со свежей порцией абсолютного метанола (200 мл) в течение 10 мин. Полученную растворимую в метаноле фракцию объединяли с первой растворимой в метаноле фракцией. Процедуру повторяли еще с одной порцией 200 мл абсолютного метанола, полученную растворимую в метаноле фракцию объединяли с первыми двумя растворимыми в метаноле фракциями. Вслед за этим метанол удаляли в вакууме при помощи ротационного испарителя (температура водяной бани 30°С). К полученному остатку добавляли гексан (300 мл) и периодически встряхивали полученную смесь в течение 2 ч. После отстаивания в течение ночи в закрытой колбе для полного растворения растворимого материала и осаждения любого нерастворимого материала прозрачный раствор в гексане переносили в чистую предварительно взвешенную колбу и удаляли гексан при помощи ротационного испарителя. К полученной выделенной фракции немедленно добавляли выбранное количество масла и встряхивали полученную смесь в закрытой колбе до образования однородной смеси.

Способ 3. Мастиковую смолу (5 г) измельчали пестиком в ступке и объединяли с гексаном (200 мл). Полученную смесь встряхивали каждые 30 мин на протяжении 8 ч и после этого оставляли стоять в течение ночи. Растворимую в гексане фракцию отделяли от нерастворимого материала и переносили в чистую колбу. Удаляли из растворимой в гексане фракции гексан при помощи ротационного испарителя. Затем полученный остаток выдерживали в системе с высоким вакуумом (< 0,01 мбар) в течение по меньшей мере 24 ч для удаления дополнительных летучих материалов. Затем к полученному остатку добавляли абсолютный этанол (100 мл) и полученную смесь периодически встряхивали в течение 1 ч. Растворимую в этаноле фракцию переносили в чистую колбу и повторяли экстракцию с использованием еще двух порций по 100 мл абсолютного этанола. Растворимые в этаноле фракции объединяли и оставляли в течение ночи для осаждения любого нерастворимого материала.

Прозрачный этанольный раствор переносили в чистую предварительно взвешенную колбу и удаляли этанол в вакууме. К полученному остатку немедленно добавляли выбранное количество масла и встряхивали полученную смесь до образования однородной смеси.

Способ 4. Листья, мягкие веточки, плоды и ягоды деревьев РМааа 1епЙ8си8 Ь., Р. айапйса или Р. ра1е8Йпа собирали, очищали и измельчали. Растворение в этаноле или в метаноле вначале проводили, по существу, как описано в способах 1 и 2, а последующие растворения проводили с использованием комбинации этанола или метанола с растительным маслом на протяжении ряда циклов.

Способ 5. Листья (30 г) РМааа 1епЙ8си8 Ь. собирали, очищали, нарезали ножом на мелкие кусочки и помещали в кухонный комбайн. Добавляли оливковое масло (10 мл) и измельчали. Извлекали всю смесь и помещали в стеклянный стакан. Добавляли 200 мл этанола (96%) и нагревали полученную смесь при 65°С в течение 20 мин. Всю смесь помещали в марлю и отжимали жидкость. Верхнюю этанольную фазу отбирали пипеткой и выбрасывали. Остаток этанола можно удалить из масляной фазы путем выпаривания.

Способ 6. Ягоды (25 г) Ьаигик поЬШк (собранные в мае или июне) промывали этанолом (96%, 200 мл) в течение 30 с. Этанол и ягоды удаляли и к полученному остатку добавляли оливковое масло. Давали осесть любому нерастворимому материалу и отделяли прозрачный масляный раствор.

Способ 7. Для каждого препарата применяли приблизительно 10 г выделений смолы, собранной с деревьев РМааа 1епйксик Ь., Р. айапйса или Р. ра1екйпа в области Зихрон-Яаков, Израиль. Смолу объединяли с 30 мл метанола в подходящем стеклянном сосуде и периодически интенсивно встряхивали в течение периода времени от 30 мин до 2 ч. Часть смолы растворялась, в то время как нерастворимый матери- 22 021886 ал оседал на дно сосуда. Верхний слой жидкости декантировали, добавляли дополнительные аликвоты метанола, как описано выше, и повторяли процесс встряхивания и декантации. Оставшийся нерастворимый материал затем погружали в дистиллированную воду на время от 30 с до 1 мин, получая в результате молочно-белую жидкость с оставшимся нерастворимым материалом. После нескольких чередующихся быстрых циклов обработки водой и метанолом оставшийся нерастворимый материал высушивали на воздухе и взвешивали. Обычно из 10 г исходной смолы получали 1-3 г нерастворимого материала. Аналогичные результаты были получены при применении в качестве растворителя этанола вместо метанола. Растворение конечной фракции нерастворимого материала проводили немедленно после высушивания путем добавления растительного масла, обычно оливкового масла или масла виноградной косточки, в количестве, достаточном для получения раствора выбранной концентрации, обычно 1 или 10%.

Способ 8. Для каждого препарата применяли приблизительно 10 г или (ί) выделений смолы, собранной с коры деревьев Р181ас1а 1еиЙ8си8 Ь или Р. ραίοδίίηα. растущих в области горы Кармель, Израиль, или (ίί) коммерчески полученной хиосской мастики (поставляемой, например, Ше СШоз Оит МазОс Сго\\ег5 ЛззоааИоп или О. Ва1Ф\Ф & Со.). Смолу измельчали в ступке, переносили в стеклянный стакан и добавляли 100 мл этанола (98%). После встряхивания в течение нескольких минут этанол декантировали, оставляя уменьшенную по причине удаления растворенного материала массу смолы. Добавляли дополнительное количество этанола и быстро повторяли стадии встряхивания, декантации и добавления растворителя в течение ряда циклов, причем каждый из циклов занимал от 5 до 30 мин. Нерастворимый материал, оставшийся после последнего цикла (обычно составлявший от 20 до 33 мас.% от коммерческого исходного материала или от 10 до 25 мас.% от исходного материала собранной смолы) растворяли в одном из следующих масел: оливковом масле, арахисовом масле, масле виноградной косточки, кунжутном масле, хлопковом масле или соевом масле, получая конечную концентрацию от 8 до 10 мас.%.

Способ 9. Измельченную мастику (~10 г) объединяли с 100 мл метанола. После встряхивания в течение нескольких минут метанол декантировали, оставляя уменьшенную по причине удаления растворенного материала массу нерастворимого белого материала. Добавляли дополнительное количество метанола и быстро повторяли стадии встряхивания, декантации и добавления растворителя в течение ряда циклов. Нерастворимый материал, оставшийся после последнего цикла (обычно составлявший от 20 до 30 мас.% от исходного материала) растворяли в оливковом масле. Процесс растворения обычно включал нагревание оливкового масла до 45°С и осторожное перемешивание в стакане.

Способ 10. Измельченную мастику (~10 г) объединяли с 25 мл соевого масла и 100 мл метанола в стеклянном стакане. Проводили перемешивание при помощи магнитной мешалки в течение 2 ч. Декантировали растворитель и добавляли свежий метанол с последующим перемешиванием в течение 1 ч. Растворитель декантировали с последующим выпариванием в вакууме для удаления оставшегося растворителя.

Способ 11. Измельченную мастику (~10 г) объединяли с 100 мл этанола (96%) в стеклянном стакане. Проводили перемешивание при помощи магнитной мешалки в течение 10 мин. Декантировали растворители и добавляли дополнительное количество этанола с последующим перемешиванием в течение 5 мин и декантацией растворителя. Стадии добавления растворителя, перемешивания и декантации повторяли 4 раза. Затем к нерастворимому белому материалу добавляли гексан (100 мл) с последующим периодическим встряхиванием до растворения материала. Небольшую пробу высушивали и взвешивали для определения концентрации. Основную часть гексанового раствора вносили в калиброванную колонку для эксклюзионной хроматографии и отбрасывали фракцию, имеющую молекулярную массу менее 1500. Фракцию с молекулярной массой выше 1500 смешивали с 20 г густой парафиновой мази. Смесь гомогенизировали путем повторного смешивания и удаляли гексан путем выпаривания в вакууме.

Указанную методику можно также осуществить путем смешивания парафинов и восков, имеющих увеличенную молекулярную массу для получения более твердого продукта.

Термин КРЬ-1 в настоящем описании относится к выделенной фракции, полученной, как описано в любом из вышеуказанных способов, с последующим растворением в подходящем масле, воске или комбинации указанных веществ.

КРЬ-1 применяли непосредственно для опытов с культурой клеток ίη νίΙΐΌ или для воздействия на подопытных животных, обычно в конечной концентрации в диапазоне от 0,025 до 5% в конкретном масле или смеси масел, как определено в настоящем описании. Кроме того, как показано в примере 2, определено, что основным компонентом КРЬ-1 является 1,4-поли-в-мирцен с молекулярной массой в диапазоне от 5000 до 20000.

Пример 2. Определение химических характеристик полимера мирцена, выделенного из растительных источников

Обзор.

Мастиковую смолу из Р|81ас1а 1еШ18си8 Ь. экстрагировали по способу 1 или 2 для получения выбранной фракции (называемой РРН-1). которую анализировали при помощи эксклюзионной хроматографии (δΕΟ) для определения молекулярно-массового распределения. Химическую структуру РРН-1 анализировали при помощи ядерного магнитного резонанса (ЯМР) после препаративного фракционирования δΕΟ.

- 23 021886

Было обнаружено, что РРН-1 содержит легкую фракцию с молекулярной массой ниже 1000 и тяжелую полимерную фракцию с молекулярной массой в диапазоне от 5000 до 20000. По данным анализа ЯМР (¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР) преобладающее соединение в тяжелой фракции имеет структуру, соответствующую структуре 1,4-поли-в-мирцена.

Препаративное разделение проводили с использованием этилацетата и тетрагидрофурана (ТГФ) в качестве элюентов. В обоих случаях наблюдали, что тяжелая фракция полимера проявляет разнообразные выгодные биологические действия, включая индуцирование дифференцировки клеток, как описано в примерах 4 и 6. Напротив, легкая фракция показала токсичность в экспериментах на эффективность ш νίίΐΌ с использованием клеток пигментного эпителия сетчатки. Было обнаружено, что для сохранения активности полимерной фракции очень важно предохранить ее от окисления или реакций поперечной сшивки путем разбавления ее гидрофобным растворителем, предпочтительно маслом, возможно в комбинации с воском.

Способы.

Мастиковую смолу (10 г) объединяли с абсолютным этанолом (200 мл) и оставляли полученную смесь стоять в течение ночи. Полученную смесь встряхивали, давали отстояться крупным нерастворимым частицам в течение 20 мин и переносили этанол в новую колбу. Остаток встряхивали со свежей порцией абсолютного этанола (150 мл) в течение 10 мин. Полученную этанольную фракцию объединяли с первой фракцией. Процедуру повторяли еще с одной порцией 150 мл абсолютного этанола, которую объединяли с первыми двумя фракциями этанола. Вслед за этим этанол удаляли в вакууме при помощи ротационного испарителя (температура водяной бани 30°С). К полученному остатку добавляли гексан (300 мл) и периодически встряхивали полученную смесь в течение 2 ч. После отстаивания в течение ночи в закрытой колбе для полного осаждения любого нерастворимого материала прозрачный раствор в гексане переносили в чистую колбу и применяли для аналитического и препаративного разделения.

Макромолекулы разделяли при помощи эксклюзионной хроматографии (8ЕС) на основании их вытеснения из неподвижной фазы. В 8ЕС соединения с наивысшей молекулярной массой полностью вытесняются из пор набивки и таким образом элюируются первыми. Молекулярные массы исследуемых полимерных соединений можно оценить при помощи 8ЕС исходя из сравнения со стандартной кривой, построенной для соединений с известной молекулярной массой, например полистирольных стандартов. Однако молекулярная масса полимера, определенная на основании такого сравнения, может быть подвержена допустимой погрешности метода по меньшей мере около 10-15%, поскольку взаимосвязь между гидродинамическим объемом и молекулярной массой не одинакова для различных полимеров, благодаря чему можно провести только оценочное определение.

Для аналитической 8ЕС применяли колонку РЬде1 (7,5x300 мм 5 μ 10³ А°) и калибровали по полистирольным стандартам с молекулярными массами 1000, 2000, 5000, 10000, 30000 и 70000. Все применяемые растворители (гексан, этилацетат, тетрагидрофуран (ТГФ), дихлорметан (ДХМ) и ацетон) имели аналитическое качество для жидкостной хроматографии. Было обнаружено, что для аналитических целей оптимальным является ТГФ. Применяли хроматографический прибор ТЬеттоРЫптдап Т8Р, снабженный или детектором на диодной матрице, или детектором ЕБ-80 (испарительный детектор рассеяния света), применяли расход 1 мл/мин, рабочее время 15 мин и 100% ТГФ в качестве подвижной фазы.

Препаративную 8ЕС проводили при следующих условиях.

1. Условия для ТГФ:

колонка: РЬде1: 25x300 мм 5 μ 10³А°, подвижная фаза: гексан 60% /ТГФ 40% расход 11 мл/мин, разделение повторяли 12 раз по 1 мл экстракта в каждой и собирали две фракции: 1) содержащая высокие МТО (молекулярные массы); 2) содержащая низкие МТО.

2. Условия для ДХМ:

колонка: РЬде1: 25x300 мм 5 μ А°, подвижная фаза: гексан 70%/ДХМ 30% расход 11 мл/мин, разделение повторяли 12 раз по 1 мл экстракта в каждой и собирали две фракции: 1) содержащая высокие МТО; 2) содержащая низкие МТО.

Для каждого опыта препаративной 8ЕС колонку калибровали по полистирольным стандартам с молекулярными массами 1000, 2000, 5000, 10000, 30000 и 70000.

Фракции, собранные для двух указанных различных подвижных фаз, делили пополам, одну половину выпаривали досуха при помощи испарителя и добавляли 3 мл масла. Ко второй половине добавляли 3 мл масла и затем выпаривали органический растворитель. Полученные образцы анализировали на биологическую активность.

Материал с высокой МТО, элюированный ТГФ, анализировали при помощи ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР на 300 и 75 МГц соответственно.

- 24 021886

Результаты.

Аналитическая 8ЕС.

На фиг. 1 показана аналитическая хроматограмма 8ЕС, полученная с использованием детектора ФДМ (тонкая линия) и детектора ΕΕ8Ό-8ΕΌΕΧ (жирная линия). Фракцию, соответствующую молекулярной массе в диапазоне примерно от 60000 до 5000 (элюирование через 5-7 мин), детектировали только на детекторе ΕΕ8Ό. Оба детектора указывали на присутствие фракции с молекулярной массой в диапазоне <1000.

Препаративная 8ЕС.

На фиг. 2 показаны высокомолекулярная (фиг. 2В) и низкомолекулярная (фиг. 2А) фракции, полученные путем препаративной 8ЕС. Высокомолекулярная фракция была получена при помощи 8ЕС в ДХМ/гексане, тогда как низкомолекулярная фракция была получена при помощи 8ЕС в ТГФ/гексане. В табл. 1 обобщены данные о фракциях, полученных при помощи препаративной 8ЕС и различных систем растворителей.

Таблица 1

Фракции, собранные из препаративных колонок с использованием различных элюентов и способов выпаривания

№ Фракции	Диапазон молекулярной массы	Элюент / способ выпаривания
19-1	Тяжелая	ТГФ/гексан выпаривание с маслом
19-2	Легкая
19-3	Тяжелая	ТГФ/гексан выпаривание без масла
19-4	Легкая
19-5	Тяжелая	ДХМ/гексан выпаривание с маслом
19-6	Легкая
19-7	Тяжелая	ДХМ/гексан выпаривание без масла
19-8	Легкая

Анализ ЯМР.

На фиг. 3 показан спектр 'Н-ЯМР. полученный для высокомолекулярного материала из препаративной 8ЕС в гексане 60%/ТГФ 40%. На фиг. 4 показан спектр ¹³С-ЯМР, полученный для высокомолекулярного материала из препаративной 8ЕС в гексане 50%/ТГФ 50%.

Анализ ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР показал, что 1,4-полимерный β-мирцен является основным компонентом высокомолекулярной фракции, полученной путем препаративной 8ЕС материала, нерастворимого в полярном растворителе (КРЬ-1) из мастики.

Пример 3. Химический синтез 1,4-полимерного β-мирцена.

Получали синтетические препараты 1,4-полимерного β-мирцена с различными молекулярными массами при помощи способов, в целом основанных на методиках, описанных в Ые^тагк с1 а1. (1988) Л. Ро1ут 8с1. 26:71-77.

Способы.

Следующие реагенты помещали в 3-горлую колбу объемом 250 мл, снабженную холодильником: βмирцен, гексан и втор-бутиллитий в циклогексане, все в атмосфере азота, в количествах, показанных в табл. 2. Объем гексана, применяемого в каждой реакции, в общем случае по меньшей мере чем в 20-25 раз превышал объем инициатора бутиллития. Каждую реакционную смесь нагревали до 80°С и перемешивали примерно в течение 1 ч. Для оценки концентрации полимера отбирали небольшую аликвоту раствора (несколько мл) и выпаривали досуха.

Из некоторых реакционных смесей после реакции удаляли литий путем разбавления конечной смеси избытком гексана и двукратной промывки водой. Органическую фазу отделяли и высушивали над сульфатом натрия.

Для применения в тестах на биологическую активность и определения молекулярной массы готовили 10% раствор синтезированного полимера в оливковом масле путем добавления оливкового масла до конечной концентрации 10% (без гексана) и выпаривания растворителя гексана. Кажущуюся молекулярную массу определяли при помощи 8ЕС и рассчитывали на основании калибровочной кривой, полученной по полистирольным стандартам с молекулярными массами 2000, 5000, 10000, 30000 и 70000. Условия 8ЕС были следующие:

колонка: РЬ§е1: 7,5x300 мм 5μ 10³ А°, подвижная фаза: 100% ТГФ, расход 1 мл/мин,

Детектор: ЕЬ80.

- 25 021886

Результаты.

Ожидаемые и вычисленные молекулярные массы полимерного β-мирцена, полученного в различных условиях реакции, представлены в табл. 2.

Таблица 2

Количества реагентов и молекулярная масса продукта химически синтезированного полимера мирцена

Расчетная МУУ	Ожидаемая Μνν	β-мирцен (моль)	втор-бутиллитий (моль)	втор- бутиллитий (мл)	Реакция
3816,05	2381	0,0735	0,00420	3	1
7007,32	3571	0,0735	0,00280	2	2
11400,54	7143	0,0735	0,00140	1	3
27153,13	14286	0,0735	0,00070	0,5	4
46034,97	28571	0,0735	0,00035	0,25	5
2845,24	1786	0,0735	0,00560	4	6

Как показано в табл. 2, в различных условиях реакции получали полимер мирцена с расчетными молекулярными массами в диапазоне примерно от 3000 до 46000. Продукты можно обозначить как относящиеся к диапазону высоко молекулярного полимера мирцена, т.е. от <20000 примерно до 50000, и низко молекулярного полимера мирцена, т.е. от <3000 до ~11000. Типичные аналитические профили 8ЕС для высоко и низко молекулярного полимера β-мирцена показаны на фиг. 5А и 5В соответственно.

Продукты реакции, промытые водой, показали практически идентичные результаты в аналитической 8ЕС.

На фиг. 6 показан типичный спектр 'Н-ЯМР продукта полимеризации β-мирцена. На фиг. 7 показан типичный спектр ¹³С-ЯМР продукта полимеризации β-мирцена.

Анализ ¹ Н-ЯМР ¹³С-ЯМР показал, что продукт реакции полимеризации имеет структуру, соответствующую структуре 1,4-поли-β-мирцена.

Реакция синтеза, использованная для получения полимера β-мирцена, протекает по механизму анионной полимеризации (известной как реакция Михаэля).

Для успешного инициирования свободная энергия стадии инициирования должна быть благоприятной. Следовательно, необходимо подбирать мономер и инициатор соответствующей силы, чтобы первое присоединение являлось нисходящим. Типичной анионной реакцией является полимеризация стирола с использованием бутиллития, С₄Н₉Е1 в инертном растворителе, таком как н-гексан. При проведении в подходящих условиях не происходит обрыва реакции анионной полимеризации. Для прекращения развития обычно вводят такое соединение, как вода, спирт, молекулярный кислород или диоксид углерода, быстро реагирующее с карбанионами на концах цепей.

Анионная полимеризация дает очень узкое молекулярно-массовое распределение, поскольку отсутствуют процессы передачи цепи. Если растворитель особо чистый, цепи полимера остаются активными даже после расхода всего мономера.

Степень полимеризации выражают как [М] и - -—[I] где М - мономер;

I - инициатор.

Как указано выше, бутиллитий является подходящим инициатором анионной полимеризации для изопренсодержащих молекул, таких как терпены. Поэтому его применяли в синтезе 1,4-полимирценов согласно настоящему изобретению.

Хотя вышеописанная методика в целом была описана в известном уровне техники (см., например, Ые^татк е! а1. (1988) I. Ро1ут 8с1. 26:71-77), важными модификациями, описанными в настоящем изобретении, были разработка высокого разбавления гексаном и конечная стадия замены растворителя на масло для получения полимера, сохраняющего свою биологическую активность с высокой эффективностью.

Пример 4. КРЬ-1 индуцирует нейронально-подобную дифференцировку в культурах клеток пигментного эпителия сетчатки.

Обзор.

Настоящее изобретение направлено на индуцирование дифференцировки и созревания клеток и имеет прямое применение для регенерации функциональной ткани, в частности нейрональной ткани. Результаты наших экспериментов показали, что КРЬ-1 индуцирует дифференцировку клеток пигментного эпителия сетчатки, эпителиальной ткани нейронального происхождения, в морфологические нейро- 26 021886 нальные клетки, производящие аксоны, дендриты и соединения между клетками, известные как синапсы. Морфологическая дифференцировка в клетках, обработанных КРЬ-1, сопровождается экспрессией бе ηονο нейрон-специфического дифференцировочного антигена β3 тубулина. Индуцирование дифференцировки нейрональных клеток строго предполагает, что КРЬ-1 вызывает дифференцировку нейрональных стволовых клеток в функциональные нейроны. Современные принципы патологии деменции и болезни Альцгеймера утверждают, что недостаточность включает неспособность нейронов образовывать функциональные синаптические соединения (см., например, Клтига К., ОЬпо М. ПпраитеШк ш гето1е тетогу кШЫПхабоп ргесебе Ырросатра1 купарбс апб содпббе Габигек ш 5ХРАИ А1/Ьеппег тоике тобе1. №игоЬю1 Ик. 2008 Μν. 5).

Соответственно эксперименты согласно настоящему описанию поддерживают применение выделенной фракции мастиковой смолы, описанной в примере 1, а также полимера мирцена в качестве активной молекулы КРЬ-1, в качестве терапевтического воздействия, вызывающего нейрорегенерацию при нейродегенеративных заболеваниях, таких как деменция и болезнь Альцгеймера.

Синтетический полимер мирцена также входит в объем настоящего изобретения и подходит для применения в способах терапии согласно настоящему изобретению.

Клетки пигментного эпителия сетчатки (КРЕ).

Исследования, нацеленные на изучение действия КРЬ-1 на различные линии клеток, взятые у человека, привели к применению клеток АКРЕ-19, линии доброкачественных клеток пигментного эпителия сетчатки человека.

Клетки пигментного эпителия сетчатки (КРЕ) представляют собой один слой шестиугольных пигментированных эпителиальных клеток нейронального происхождения, образующих внешний слой клеток в сетчатке глаза и прикрепленных к нижележащей сосудистой оболочке глаза. Функции КРЕ включают поддержку, питание и защиту нижележащих фоторецепторов нейроретины.

Клетки КРЕ участвуют в фагоцитозе внешнего сегмента клеток фоторецепторов, в цикле витамина А, в котором они осуществляют изомеризацию полностью-транс-ретинола в 11-цис-ретиналь и снабжают фоторецепторы Ό-глюкозой, аминокислотами и аскорбиновой кислотой.

Хотя ш νί\Ό ПЭМ пигментированы, клетки АКРЕ-19 не образуют меланин и не пигментированы. В культуре клетки растут в виде веретенообразных и полигональных клеток.

Способы.

Клетки АКРЕ-19 (полученные из Американской типовой коллекции клеточных культур - Атепсап Туре Сибите СоПесиоп, АТСС) высевали на 96-луночные плоскодонные культуральные микропланшеты (СокГат) в концентрации 2-5х10³ клеток на лунку (1-2,5х10⁴ клеток/мл) в среде для выращивания, содержащей ИМЕМ:Нат Р-12, 1:1, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 200 мМ глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки оставляли прикрепиться к поверхности планшетов в течение ночи перед воздействием КРЬ-1.

КРЬ-1 готовили, по существу, как описано в примере 1 способе 1, получая 10% раствор в носителе, состоящем из масла виноградной косточки, оливкового масла, хлопкового масла, Мудбо1® 810 или Му§1ю1® 812. Препарат добавляли к культурам в объеме 0,5, 2, 5 и 20 мкл. Указанные объемы, введенные в общий объем сред образца, равный 200 мкл, соответствовали конечным концентрациям КРЬ-1 0,025, 0,1, 0,25 и 1% соответственно. Масляный носитель служил в качестве контроля по несущей среде и вносился в контрольные культуры в тех же объемах.

Культуры инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 72 ч. Затем среду удаляли, промывали культуры дважды фосфатным солевым буферным раствором (ФСБ), фиксировали абсолютным метанолом в течение 10 мин и окрашивали реагентами Нетасо1ог® (ВоеЬбпдет МаппЬеш), окрашивающим клетки способом, аналогичным окраске по Гимзе, и допускающим применение в количественном определении выживаемости клеток (см. Кебаб, Υ. А со1обтебтс тютобГет аккау Гог ГЬе диапбГабоп оГ суГокше асб\бу оп абЬегепГ се11к ш бккие сибиге. ί. 1ттипо1. МеГЬобк 146, 155-161, 1992). Краситель вымывали 20% 8И8 и определяли количественно на считывающем устройстве ЕЫ8А на длине волны 630 нм (оценивали образцы в трех повторениях). Для определения экспрессии β-3-тубулина клетки высевали на стерильные стеклянные покровные стекла, погруженные в 6-луночные микропланшеты в концентрации 10⁵ клеток/лунку в среде, состоящей из смеси 1: 1 минимальной поддерживающей среды по Дульбекко (ИМЕМ) и среды Нат Р12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и пенициллином (100 ед/мл), стрептомицином (100 мкг/мл) и глутамином (2 мМ). Клетки оставляли прикрепиться к покровным стеклам в течение ночи, вводили в культуры 7% КРЬ-1 в оливковом масле (или только оливковое масло для контрольных препаратов) в объеме 25 мкл/мл среды и инкубировали при 37°С 5% СО₂ в течение 72 ч. Затем клетки промывали 2Х ФСБ и фиксировали 4% параформальдегидом. Для определения экспрессирования белка β-3-тубулина в клетках покровные стекла окрашивали моноклональным первым антителом мыши, направленным на β-3-тубулин человека, с последующим вторичным меченым Р1ТС (флуоресцеин изотиоцианат) 1§С к белку мыши. Ядра клеток противоокрашивали при помощи ИАР1 (4',6-диамидино-2фенилиндол). Опытные и контрольные препараты исследовали при помощи конфокального микроскопа.

- 27 021886

Результаты.

Неожиданно было обнаружено, что воздействие КРЬ-1 на клетки КРЕ АКРЕ-19 индуцирует резкие морфологические изменения, определенно являющиеся характеристиками нейродифференцировки. Морфологические изменения не наблюдались в контрольных культурах, обработанных только масляным носителем, и подобные результаты наблюдались в опытных культурах, обработанных КРЬ-1, вне зависимости от масла, применявшегося в качестве носителя активного соединения. Морфологические изменения также были связаны с приостановкой пролиферации клеток, дополнительно поддерживая вывод, что КРЬ-1 индуцирует нейродифференцировку.

Контрольные культуры, получавшие масло, демонстрировали типичные веретеновидные и полигональные формы роста, характерные для клеток КРЕ АКРЕ-19 (фиг. 8А). Через 48 ч инкубирования в культуре клетки обработанные КРЬ-1 (0,1%; 1 мг/мл) изменили форму и развили толстые, густо окрашиваемые очень длинные единичные выросты, напоминающие аксоны нейрональных клеток (фиг. 8В). Через 48 ч инкубирования клетки, обработанные КРЬ-1 (0,25%; 2,5 мг/мл), показали большее число более тонких длинных выростов, напоминающих дендриты (фиг. 8С). Через 72 ч инкубирования с КРЬ-1 тонкие длинные выросты образовали соединения с подобными выростами соседних клеток, образовав сеть соединенных между собой клеток, потенциально способных обмениваться информацией между собой (фиг. 8Ό). Подобные сети обычно наблюдаются между нейронами в центральной нервной системе и способны передавать и обрабатывать информацию.

В то время как контрольные клетки пролиферировали на протяжении 72-часового периода инкубации, клетки, обработанные КРЬ-1, быстро прекращали пролиферацию и плотность клеток оставалась разреженной, дополнительно поддерживая мнение о дифференцировке клеток.

При применении неактивных препаратов КРЬ-1, не индуцирующих дифференцировку, как описано выше, клетки АКРЕ-19 начинали производить большое количество гранул меланина, указанные культуры продолжали пролиферировать, и плотность клеток возрастала до смыкания.

Воздействие КРЬ-1 (5% в хлопковом масле) на клетки АКРЕ-19 показало в результате экспрессию нейрональных маркеров и маркеров синаптогенеза β-3-тубулина (ΤυΒΒ3), дифференцировочного маркера нейронального типа, Агс/Агд3.1, связанного с синаптической пластичностью; и нейронального пентраксина II (ΝΓΤΧ2), нейронального немедленно-раннего гена, действующего на возбуждающий синаптогенез. Иммунофлуоресцентный анализ дифференцированных клеток АКРЕ-19 показал, что через 72 ч инкубирования с КРЬ-1 клетки окрашиваются положительно на β3ΤυΒ, Агс/Аг§3.1 и ΝΓΤΧ2 (фиг. 9, правые изображения), в то время как до обработки не наблюдалось экспрессии или наблюдалась небольшая экспрессия указанных маркеров (фиг. 9, левые изображения).

Далее были получены данные, что воздействие КРЬ-1 на клетки АКРЕ-19 ведет к прекращению их репликации. Клетки обрабатывали КРЬ-1 в течение 72 ч и общее содержание белка (связанное с общим числом клеток, присутствующих в культуре) сравнивали с необработанными контрольными клетками АКРЕ-19. Как показано на фиг. 10, культуры, обработанные КРЬ-1, имели значительно более низкое содержание белка по сравнению с контрольными культурами, подтверждая, что пролиферация клеток была, по существу, остановлена.

Балльная система оценки эффективности КРЬ-1 для индуцирования дифференцировки клеток.

Исходя из приведенных выше результатов была разработана балльная система оценки эффективности КРЬ-1 для индуцирования дифференцировки в культуре клеток, с клетками, высеянными в концентрации 2х 10³ на лунку. Баллы и соответствующие им описания приведены в табл. 3.

Таблица 3

Балл	Описание действия на дифференцировку
0	Действие отсутствует. Клетки пролиферируют, культуры становятся сомкнутыми, и клетки сохраняют свою типичную веретенообразную и полигональную морфологию.
1	Клетки производят пигментированную грануляцию, но продолжают пролиферировать.
2	Менее 10 % клеток подвергаются морфологическим изменениям, давая удлиненные дендритоподобные выросты
3	Примерно 10 - 30 % клеток демонстрируют удлиненные выросты. Пролиферация клеток уменьшается по сравнению с контрольными клетками.
4	Более 30 % клеток образуют удлиненные дендритоподобные выросты, образующие соединения между соседними клетками, а также толстые аксоноподобные удлинения.
5	Вся культура клеток подвергается дифференцировке. Клетки остаются разреженными, и все клетки подвергаются морфологическим изменениям, которые завершаются образованием удлиненных дендритоподобных выростов, аксоноподобных структур и межклеточных соединений.

Типичные примеры культур клеток с оценками 3-5 представлены на фиг. 11А-11С соответственно.

- 28 021886

Пример 5. КРй-1 сокращает период восстановления после анестезии.

Становится все более очевидно, что анестезия связана с повреждением нейронов и необходимы безопасные и эффективные способы нейрозащиты в отношении указанного повреждения.

Способы.

Мыши С57В1/6, по 8 в группе, получали инъекции КРй-1 посредством подкожного пути введения три раза в течение 7 дней (через день) по 0,05 мл 3% раствора в масле виноградной косточки в дозировке 30 мг/кг. Затем мышей подвергали воздействию сублетальной дозы (120 мг/кг) кетамина, вводимого мышам. Контрольная группа получала 0,05 мл масла виноградной косточки в качестве несущей среды.

Результаты.

После анестезии мыши, получавшие КРй-1, восстанавливались значительно быстрее, как показывала их полная подвижность, в то время как контрольные животные были еще неподвижны. Восстановление в контрольной группе, определяемое по возможности появления подвижности, занимало на 3 мин больше у контрольной группы по сравнению с группой, получавшей КРй-1. Полученные наблюдения показывают, что активный ингредиент полимер мирцена в КРй-1 сокращает период восстановления после анестезии и может применяться для нейропротекции в отношении побочных эффектов, связанных с анестезирующими лекарственными средствами.

Пример 6. КРй-1 индуцирует дифференцировку клеток с последующей гибелью клеток в линиях опухолевых клеток.

Изучали действие КРй-1 на две линии клеток меланомы и три линии клеток нейробластомы. Как линия клеток меланомы человека 5151, так и линия клеток меланомы мыши В16Р10 пролиферируют в культуре клеток недифференцируемым образом и не образуют меланин. Линии клеток нейробластомы человека Ьаи-1, Ьап-5 и 8Υ5Υ пролиферируют в культуре в виде веретенообразных клеток и не проявляют дифференцировочной морфологии.

Способы.

Клетки высевали в концентрации 2х10³ клеток на лунку в 96-луночные плоскодонные микропланшеты (СоЧаг) и культивировали в 200 мкл среды ΌΜΕΜ (среды Дульбекко), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 200 мМ Ь-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все реактивы от ОШсо-ВКР). После прикрепления в течение ночи к культуре клеток добавляли КРй-1 (из 10% раствора в масле виноградной косточки) для получения конечных концентраций 0,025, 0,1, 0,25 и 0,5% и продолжали инкубирование в течение 48 и 72 ч. Несущую среду масло виноградной косточки применяли в качестве контроля. Через 72 ч клетки фиксировали метанолом и окрашивали реактивами Нетасо1ог® (Восйтшдег Маппйшт).

Результаты.

Было обнаружено, что воздействие КРй-1 на клетки меланомы индуцирует образование меланина через 24-48 ч, как показано на фиг. 12В и фиг. 12С, по сравнению с клетками, получавшими контроль на фиг. 12А. Дальнейшее воздействие КРй-1 вызывало прекращение репликации, как показывала уменьшающаяся плотность клеток, например, на фиг. 12Ό. Через 72 ч в культурах, инкубировавшихся с каждой из четырех концентраций КРй-1, наблюдалась гибель клеток.

После обработки КРй-1 (конечная концентрация 0,025%) линий клеток нейробластомы Ьап-1, Ьап-5 и 8Υ5Υ клетки начали развивать дендритоподобные выросты и пролиферация клеток прекратилась. Более высокие концентрации КРй-1 вызывали гибель клеток во всей культуре. Таким образом, воздействие КРй-1 индуцировало морфологические нейроноподобные признаки дифференцировки с последующей гибелью клеток.

После воздействия на линии клеток нейробластомы Ьап-1, Ьап-5 и 8Υ5Υ выделенной фракцией полимирцена (конечная концентрация 0,025%) клетки начали развивать дендритоподобные выросты и пролиферация клеток прекратилась. Более высокие концентрации КРй-1 вызывали гибель клеток во всей культуре. Таким образом, воздействие КРй-1 индуцировало морфологические нейроноподобные признаки дифференцировки с последующей гибелью клеток.

Выводы.

Полимер мирцена, активный компонент КРй-1, связан с индуцированием дифференцировки различных линий клеток, полученных из злокачественных опухолей меланомы и нейробластомы.

Блок на конечной стадии дифференцировки считают основным путем в сохранении пролиферации клеток при раке. Преодоление указанного блока уже доказало свою эффективность в качестве эффективного метода терапии некоторых видов рака (например, ретиноиды при лечении острого промиелоцитарного лейкоза) и в настоящее время известно как таргетная терапия. Таргетная терапия не убивает раковые клетки, но изменяет их поведение, в первую очередь, индуцируя дифференцировку. Соответственно можно уменьшить агрессивность многих видов рака.

Согласно настоящему описанию обнаружено, что полимер мирцена, активный ингредиент КРй-1, преодолевает блок в дифференцировке опухолевых клеток, как показывает образование дендритов нейрональных клеток в линии клеток нейробластомы и индуцирование образования меланина в линии клеток меланомы. В обоих случаях описанные изменения связывают с прекращением пролиферации клеток

- 29 021886 и гибелью клеток.

Пример 7. Химически синтезированный полимер мирцена индуцирует дифференцировку клеток в культурах клеток пигментного эпителия сетчатки.

Опыты проводили для определения, индуцируют ли синтетические полимеры мирцена в двух различных диапазонах молекулярных масс нейродифференцировку в клетках АКРЕ-19.

Способы.

Клетки ЛКРЕ-19 высевали на плоскодонные 96-луночные культуральные микропланшеты (ВЮИЕ) в концентрациях 5х10³ клеток на лунку (2,5х10⁴ клеток/мл) в среде для выращивания, состоящей из ЭМЕМ:Нат Р-12, 1:1, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 200 мм глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки оставляли прикрепиться к поверхностям планшета в течение ночи перед воздействием фракций химически синтезированного полимера мирцена.

Выделенные фракции химически синтезированного полимера мирцена с различными молекулярными массами исследовали на активность в тесте на дифференцировку клеток КРЕ. Применяли описанную в примере 3 фракцию 18-1 (молекулярная масса в диапазоне примерно 50000 Да) и фракцию 18-2 (молекулярная масса в диапазоне примерно 20000 Да), для каждой фракции готовили КРй-1 в концентрации 10% в оливковом масле. Каждый из препаратов добавляли к культурам клеток АКРЕ-19, применяя объемы 0,5, 2, 5 и 20 мкл, соответствующие конечным концентрациям 0,025, 0,1, 0,25 и 1% соответственно. Оливковое масло служило контролем по несущей среде и применялось в контрольных культурах в тех же объемах. Культуры инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 72 ч. Затем удаляли среду, промывали культуру дважды фосфатным солевым буферным раствором (ФСБ), фиксировали абсолютным метанолом в течение 10 мин и окрашивали реактивами Нетасо1ог®.

Результаты.

Показано, что обе фракции 18-1 и 18-2 имеют активность при индуцировании нейродифференцировки в клетках АКРЕ-19 (фиг. 13 и табл. 4). Оптимальная активность наблюдалась для фракции 18-1 в концентрации 0,25% (как показано на фиг. 13А), в то время как концентрация 0,1% была отчасти эффективной, а концентрация 0,025% не имела эффекта (табл. 4). Эффект фракции 18-2 показан на фиг. 13В.

Таблица 4

Эффекты фракций 18-1 и 18-2 на дифференцировку клеток АКРЕ-19

Фракция	Объем (мкл)	Результаты
18-1	0,5	Высокая плотность клеток. Дифференцировки нет.
	2	Высокая плотность. Дифференцированные
		слетки.
	5 20	Более низкая плотность. Дифференцированные слетки. Длинные аксоны с межклеточными уединениями Гибель клеток
18-2	0,5	Низкая плотность. Несколько полностью цифференцированных клеток.
	2	Клетки дифференцированы, но аксоны короче и иенее распространены, чем для 18-1
	5-20	Г ибель клеток
ВР6-1	0,5	Дифференцированные клетки в группах. Цлинные аксоны.
	2	Дифференцированные клетки с более низкой плотностью. Длинные аксоны.
	5-20	Г ибель клеток
Масляная несущая среда	0,5-20	Очень высокая плотность клеток. Дифференцировки нет

Выводы.

Полученные результаты подкрепляют вывод, что КРй-1 в составе выделенной фракции мастиковой смолы обладает активностью, индуцирующей дифференцировку нейрональных клеток.

Полученные результаты также подкрепляют вывод, что полимер мирцена как выделенный из растительного источника, так и химически синтезированный, обладает активностью, индуцирующей дифференцировку нейрональных клеток.

- 30 021886

Пример 8. Индуцирующее дифференцировку действие КРН-1 блокируется фракцией, растворимой в полярном растворителе, присутствующей в мастиковой смоле.

Обзор.

Мастиковая смола и различные соединения, идентифицированные в ее составе, были связаны с множеством благоприятных биологических и терапевтических активностей. Различные описания в известном уровне техники показывают, что биологическая активность связана с фракцией, полученной путем экстрагирования мастики полярным растворителем и выделения материала, растворимого в полярном растворителе. Напротив, КРН-1 представляет собой фракцию, которая была выделена из мастиковой смолы исходя из ее растворимости как в полярных органических растворителях и в неполярных органических растворителях, в то время как соединения, растворимые только в полярных органических растворителях, но не растворимые в неполярных органических растворителях, удаляли (последние в настоящем описании обозначены как фракция 8Р). Основным компонентом КРН-1 является полимер мирцена, как показано в примере 2. Однако указанному соединению ранее не были приписаны благоприятные эффекты, но, напротив, признавали его негативное влияние на пероральное введение и биодоступность активных соединений, присутствующих в мастиковой смоле. Фракция 8Р соответствует описанным в имеющемся уровне техники фракциям, которым приписывали наличие различных благоприятных биологических активностей. Задачей настоящего исследования было оценить действие 8Р на эффект дифференцировки клеток, оказываемый КРН-1. В настоящем изобретении описано, что соединения, присутствующие в 8Р, влияют и блокируют эффекты дифференцировки клеток, индуцируемые КРН-1.

Способы.

Мастиковую смолу обрабатывали для получения КРН-1, по существу, как описано в способе 1 примера 1, с использованием этанола в качестве полярного растворителя. Растворимую в этаноле фракцию декантировали с нерастворимого материала для получения фракции 8Р. Смеси КРН-1 и фракции 8Р в различных пропорциях готовили следующим образом:

Смесь	НРМ-1 (%)	Фракция ЗР <%)
АО	95	5
А1	90	10
А2	80	20
АЗ	70	30
А4	50	50
А5	25	75

Кроме того, цельную мастику, растворенную в масле (подогретом до 60°С), готовили для получения препарата ТС.

Результаты исследования, приведенные в табл. 5, показывают, что фракции, богатые КРН-1 (АО и А1) эффективно индуцировали дифференцировку АКРЕ-19. Морфологические изменения, наблюдаемые в указанных культурах, были аналогичны изменениям, показанным на фиг. 8В и 8С. По мере увеличения пропорции фракции 8Р в смесях увеличивалась гибель клеток, при этом не наблюдалось дифференцировки клеток. Клетки в культуре, обработанной только 8Р, погибали во всех изученных дозах, а фракция ТС оказывала только незначительный эффект.

Полученные результаты показывают, что в сильную активность, индуцирующую нейродифференцировку, вносят вклад только полимеры в КРН-1, тогда как полярная фракция 8Р вызывает только гибель клеток.

- 31 021886

Таблица 5

Эффекты смесей РРН-1 и §Р на дифференцировку клеток

Фракция	Объем (мкл)	Результаты
АО	0,5 2 5-20	Высокая плотность клеток. Дифференцированные клетки. Более низкая плотность клеток. Дифференцированные тетки с длинными аксонами. Гибель клеток.
А1	0,5 2 5	Высокая плотность клеток. Менее дифференцированные (летки, чем в АО. Дифференцировка. Низкая плотность клеток. Дифференцированные клетки с длинными аксонами
	20	Гибель клеток.
А2	0,5 2 20	Низкая плотность клеток. Дифференцировка. Частично дифференцированные клетки (только короткие дендриты), связанные с гибелью клеток. Гибель клеток.
АЗ	0,5	Единичная, частичная дифференцировка. Высокая плотность клеток (пролиферация клеток).
	2-20	Г ибель клеток.
А4	0,5 2-20	Гибель клеток, токсичность. Гибель клеток.
А5	0,5-20	Гибель клеток.
КРИ-1	2 5	Дифференцированные клетки с межклеточными соединениями и длинными аксонами. Дифференцировка и длинные аксоны.
	20	Гибель клеток.
ЗР	0,5-20	Г ибель клеток.
ТС	0.5	Незначительные эффекты
	2	Г ибель клеток.
Несущая среда	0,5-20	Высокая плотность

Пример 9. Заживление ран у собак.

Старый самец собаки породы золотистый ретривер имел открытую хроническую рану на ноге в течение более 6 месяцев. Поражение кожи было связано с алопецией (выпадением шерсти) и депигментацией шерсти в прилегающей области. Собака получала несколько циклов топического лечения РРН-1. После первого применения наблюдался временный отек с опуханием в течение 16-20 ч. Это сопровождалось образованием Бе ηονο функциональной эпителиальной ткани (эпителизацией) и неоангиогенезом (новым образованием сети мелких сосудов) с нормальными границами тканей, благодаря быстрому и интенсивному образованию грануляционной ткани. Заживающая рана стягивалась внутрь к центру раны, позволяя предположить присутствие фибромиоцитов (мезодермального происхождения).

Рана полностью зажила примерно в течение 12 недель преимущественно с функциональной кожей и вновь выросшей шерстью. На фиг. 14 показана пораженная область до (фиг. 14А) и после (фиг. 14В) лечения РРН-1.

У другого пожилого самца собаки, страдающего алопецией, топическое лечение РРН-1 привело к новому росту шерсти до соединения с шерстью в прилегающей области.

У другой собаки наблюдалась опухоль челюсти (не индуцированная), части которой выдавались в ротовую полость. Выступающие части были иссечены хирургическим путем, тогда как части опухоли, внедренные в челюсть, удалить было невозможно. Опухоль была диагностирована как саркома. Состав, содержащий РРН-1 в масле виноградной косточки, наносили на пораженную область челюсти. Результатом лечения было практически полное излечение десен, закрывающих место хирургического вмешательства до такой степени, что шрама не осталось, и место хирургического вмешательства было больше неразличимо. Даже ожидаемый рецидив опухоли из частей, внедренных в челюсть, был предотвращен на длительный интервал в несколько недель. Лечение РРН-1 индуцировало необычайно быстрое заживление места хирургического вмешательства и полную регенерацию десен.

В обоих вышеописанных случаях заживление ран сопровождалось общим увеличением энергичности, психической ориентированности и физической активности собак, получавших лечение.

- 32 021886

Полученные результаты поддерживают применение полимера мирцена, активного компонента КРЬ1, для лечения ран, регенерации волосяных фолликулов и обратного развития неврологической дегенерации.

Пример 10. Заживление ран у рыб.

Золотая рыбка так же, как и декоративный карп (обе рыбы из семейства карповых) подвержены язвам наружного покрова, вызываемым бактериями, в частности Аеиготопак ЬуйгорЬЛа.

Золотых рыбок массой примерно 100 г каждая с выраженными бактериальными язвами разделяли на две группы в отдельных аквариумах, каждая группа состояла из четырех рыб. Каждый аквариум заполняли 100 л воды и обеспечивали аэрацию при помощи воздушного насоса. Группы распределяли случайным образом по массе и размеру ран (в диапазоне от 1-1,5 до 1-1,5 см). Каждая рыба получала внутримышечную инъекцию через интактный внешний покров в месте, приблизительно на 5 мм отстоящем от язвы, по 20 мкл или только масла виноградной косточки (контрольная группа) или 1% раствора КРЬ-1 в масле виноградной косточки (опытная группа).

У рыб в опытной группе началось прогрессирующее улучшение через 4 цикла лечения КРЬ-1 и наступило выздоровление в течение месяца. Рыбы в указанной группе остались живы на протяжении 6 недель исследования. Указанные рыбы также продемонстрировали активное и чувствительное поведение, включая активное плавание, поиск и хватание пищи, помещаемой на поверхность воды, и быстрое испуганное бегство в ответ на постукивание по стенке аквариума.

Напротив, среди рыб в контрольной группе не наблюдалось улучшения состояния язв. Рыбы были сонными, демонстрировали малоподвижное поведение у дна аквариума и не реагировали на стимуляцию. Все рыбы в указанной группе погибли к концу указанных шести недель.

Различия между указанными двумя группами были значительными по обоим параметрам: выживаемость рыб и заживление ран.

Пример 11. Действие КРЬ-1 на заживление ран с использованием модели на мышах В6.УЬероЬ/О1аЬкй.

Мышей В6.У-ЬероЬ/О1аНкй (оЬ/оЬ) (демонстрируют ожирение в возрасте 4 недель) применяли для оценки действия КРЬ-1 на заживление ран. Выполняли прокол кожи на всю толщину при помощи одноразового пробойника для биопсии (Ит-РиисЬ® ЭЕрокаЫе Вюрку РипсЬ, Ргет1ег) в дистальной части спины каждой из мышей. Прокол имел эллиптическую форму. Средняя длина прокола по длинной оси находилась в диапазоне от 5,1 до 5,3 мм. Средняя длина прокола по короткой оси находилась в диапазоне от 4,8 до 5,1 мм. КРЬ-1 (5%) в оливковом масле вводили путем подкожной инъекции в два места, окружающих рану, на расстоянии 3-5 мм от края раны (группа А, п=6) или топически на рану (группа В, п=6). Несущую среду наносили на раны мышей топически (группа С, п=6). После этого применяли КРЬ1 (5%) 3 раза в неделю, всего 7 раз в течение 16 дней исследования, в дозе объемом 20 мкл (инъекция) или в дозе объемом 50 мкл (топическое введение).

На фиг. 15 показано, что на 11 день после нанесения раны размер раны (площадь раны) значительно уменьшился у мышей, получавших КРЬ-1 (группа А) по сравнению с мышами, получавшими только несущую среду (р=0,005) (группа С). Скорость заживления ран на протяжении периода со дня 0 по день 11 после нанесения раны была значительно быстрее у мышей, получавших КРЬ-1, по сравнению с мышами, получавшими только несущую среду (р=0,034).

Пример 12. Действие КРЬ-1 на обратное развитие нейродегенеративных эффектов хронической мозговой гипоперфузии (сосудистой демениии) в модели на крысах.

Сосудистая деменция (СД) представляет собой подтип деменции, находящийся в обществах западного типа на втором месте по распространенности после болезни Альцгеймера. СД вызывает множество нейропсихиатрических и физических проблем и представляет собой значительное экономическое бремя. Изображения головного мозга выявили заметные изменения в коре головного мозга и белом веществе, и полагают, что указанные поражения являются главной патологией когнитивных нарушений у пациентов с сосудистой деменцией (см., например, Рагкак е1 а1., Е.хрептеп1а1 сегеЬга1 Ьурорейикюп шйисек \\ЬЬе тайег щиту апй тюгодйа1 асЬуаЬоп ш 1Ье га1 Ьгат. Ас1а ЫеигораШок 2004; 108:57-64; 5>1епке1 е1 а1., АЬЬе тайег 1екюп киЫурек апй содпЬАе йейсйк ш райейк \\ЙЬ тетогу шрйгтей. Эетей Сепай Содп ЭЕогй. 2008 26: 424-431).

Мозговые поражения можно экспериментально индуцировать в головном мозге крысы при помощи постоянной окклюзии обеих общих сонных артерий, что может оказать воздействие на когнитивную функцию. Указанная модель аналогична сосудистой деменции и методика эксперимента способна уменьшить кровоток в коре головного мозга и гиппокампе на 40-80% на протяжении нескольких месяцев, вызывая определенные расстройства научения. Поэтому указанную модель применяли для изучения влияния лечения КРЬ-1 на обратное развитие нарушений, вызванных поражениями сосудистой деменции.

Группу из 40 животных случайным образом распределяли по 3 группам, т.е. группа мнимого контроля без лечения, группа контроля по несущей среде и группа, получавшая КРЬ-1 (10-15 животных в группе). Десять микролитров КРЬ-1 (5% в хлопковом масле) или несущие среды вводили подкожно 2 раза в неделю, причем первую дозу вводили через 14 дней после индуцирования сосудистой деменции.

- 33 021886

Тест в водном лабиринте Морриса (ВЛМ) представляет собой тест, чувствительный к функции гиппокампа. Испытание в водном лабиринте проводят для оценки двух связанных с ОСА (общие сонные артерии) нарушений научения с использованием ранее описанного способа (АайпаЪе е1 а1., СПо51а/о1 81гоке. 2006; 37(6): 1539-1545). В круглый резервуар диаметром 160 см, заполненный водой на глубину 20 см, помещают круглую прозрачную акриловую платформу, верхняя поверхность которой находится на 3 см ниже уровня воды. Крыс выпускают мордой к стене и регистрируют время спасения на платформе как латентность спасения. Испытания проводили за 3 дня до окклюзии ОСА и в дни 14, 35, 56, 84 и 112 после окклюзии ОСА. В дни испытаний проводили по 6 попыток прохождения испытаний в день с интервалом между попытками 2 мин. Животных помещали в резервуар в одном из шести исходных положений. В каждой попытке прохождения испытания регистрировали время и длину пути, необходимые для спасения на скрытой платформе. Результаты шести попыток прохождения испытания усредняли, получая единственное репрезентативное значение, и указанные средние значения использовали для окончательного статистического анализа. Животным, нашедшим платформу, позволяли оставаться на платформе 30 с. Животных, не нашедших платформу в течение 90 с, осторожно направляли к платформе на 30 с в конце попытки.

Показатели животных, получавших РРН-1 (столбики с перекрестной штриховкой), животных, получавших несущую среду (пустые столбики), и животных в мнимом контроле (черные столбики) исследовали на частоту обнаружения платформы (фиг. 16А); время, проведенное в области платформы (фиг. 16В); латентность обнаружения платформы (фиг. 16С); частоту нахождения в зоне 1 (фиг. 16Ό); время, проведенное в светлой части (фиг. 16Е); латентность обнаружения платформы (фиг. 16Р) и скорость (фиг. 160). Все испытания показали значительно более высокие показатели в группе животных, получавших РРН-1, по сравнению по меньшей мере с одной контрольной группой.

Пример 13. Действие РРН-1 на патологическую регуляцию контроля массы (орексигенное действие и действие против ожирения).

Собаки с различными ранами, описанные в примере 9, также страдали потерей аппетита и не ели пищу, помещенную перед ними. После примерно 10 дней описанного лечения РРН-1 собаки постепенно восстановили интерес к пище и начали есть. В течение месяца собаки демонстрировали большой интерес к пище, и их аппетит был аналогичен аппетиту обычных здоровых собак.

Рыбы с язвами, описанные в примере 10, также страдали потерей аппетита. Контрольная группа продолжала игнорировать пищу, помещенную на воду, тогда как рыбы, получавшие РРН-1, реагировали охотно, с быстрым движением в ответ на подачу пищи.

Крысы, описанные в примере 12, также страдали от потери массы после хронической мозговой гипоперфузии. Через 35 дней лечения (56 день исследования) крысы, получавшие РРН-1 согласно описанию, восстанавливали массу значительно быстрее, чем животные, получавшие несущую среду (фиг. 17А).

Мыши, описанные в примере 11, в целом страдали ожирением в результате мутации гена лептина. На фиг. 17В показано, что подкожное введение РРН-1 мышам (группа А; символы ромбы) вызвало значительное снижение набора массы по сравнению с животными, получавшими несущую среду (группа С; символы треугольники), или с животными, получавшими топическое введение РРН-1 (группа В; символы квадраты). Мыши в группе А набрали 4,9% в течение 11 дней. Набор массы тела показан по сравнению с исходной (0 день) массой тела. Набор массы тела в группе А значительно ниже, чем средний набор массы тела мышей в группе В (величина р=0,02, Т-критерий, Ехсе1). Мыши в группе С были похожи (р=0,08) на мышей в группе В и набирали массу тела, значительно отличаясь (величина р=0,04) от мышей в группе А. Мыши групп В и С набрали 10,2 и 9,1% соответственно. Скорость набора массы тела во всех группах, выраженная как тангенс угла наклона, была близкой (р=0,07 (А от В), 0,08 (А от С) и 0,43 (В от С)).

Описанные выше наблюдения подтверждают вывод, что РРН-1 является регулятором патологического нарушения массы и может служить орексигенным (стимулирующим аппетит) агентом или агентом против ожирения.

Пример 14. Действие РРН-1 в модели инсульта, вызванного временной окклюзией средней мозговой артерии (ОМСА) на крысах.

В исследовании для оценки способности РРН-1 предотвращать или обращать развитие неврологического расстройства, являющегося результатом ишемии, применяли модель инсульта на крысах, вызванного временной окклюзией средней мозговой артерии (ОМСА), РРН-1 (5% в хлопковом масле) вводили подкожно в количестве 10 мкл, первое введение осуществляли через 3 ч после хирургической операции, а затем дважды в неделю до окончания исследования в день 28. Во время исследования тестировали неврологические, двигательные и соматосенсорные функции в комплексе поведенческих тестов.

На протяжении исследования не наблюдалось значимых различий между двумя группами в общем физиологическом состоянии, наборе массы тела или общих клинических симптомах.

Были заметны явные различия между группой, получавшей РРН-1, и группой контроля по несущей среде в восстановлении неврологической функции после инсульта в течение 28 дней после инсульта. В целом животные, получавшие РРН-1, демонстрировали ускоренное и улучшенное восстановление. Соматосенсорные функции были наиболее восприимчивы к лечению и показали значительный отклик уже на

- 34 021886 день после инсульта (фиг. 18А и 18С). Оценка №иго8соге показала, что значимые различия наблюдались только у крыс, получавших КРЬ-1 (группа А), между днем 8 и днем 14 и между днем 8 и днем 28 (фиг. 18А). Неврологическое восстановление, оцениваемое при помощи теста на удаление пластыря, было значимым только у крыс, получавших РРЬ-1 (группа А) между днем 2 и остальными днями (фиг. 18С). Улучшение двигательной функции, оцениваемое при помощи шагового теста, было значимым только у крыс, получавших КРЬ-1 (черные столбики), в день 28 (фиг. 18В).

Пример 15. Действие КРЬ-1 на ганглиозные клетки сетчатки (ГКС).

Аксотомию зрительного нерва проводили на правом глазу крыс под глубоким наркозом (19 крыс в группе). Опытная группа получала подкожную инъекцию РРЬ-1 (5% в хлопковом масле) в заднюю область шеи; 0,025 мл/инъекция, а контрольная группа получала аналогичную инъекцию такого же объема несущей среды. Первую инъекцию вводили всем животным непосредственно после хирургического вмешательства. Последующие инъекции (те же дозировка и способ введения) вводили дважды в неделю, каждые 3 или 4 дня.

Через четырнадцать дней после аксотомии в зрительный нерв, подвергшийся аксотомии, вводили флуоресцентный катаболический нейроиндикатор (Όί-Άβρ) для окрашивания выживших ганглиозных клеток сетчатки (ГКС), через 24 ч крыс умерщвляли в заполненной СО₂ камере и извлекали поврежденный правый глаз. Выделяли сетчатки, расправляли на предметном стекле и фиксировали заливочной средой на основе ксилола.

Цельные сетчатки изучали под флуоресцентным микроскопом. Окрашенные клетки подсчитывали вручную. Среднее число клеток ГКС в группе показано на фиг. 19, демонстрирующей значительно более высокое число клеток в опытной группе РРЬ-1.

Пример 16. Модель отслойки сетчатки (ОС).

Отслойку сетчатки (ОС) проводили на правом глазу у животных под глубоким наркозом (ксилазин 50 мг/кг и кетамин 35 мг/кг) с последующим расширением зрачков каплями тропикамид 0,5%. ОС индуцировали путем создания небольшого отверстия в сетчатке в области зубчатого края с последующей инъекцией под сетчатку 5 мкл солевого раствора при помощи шприца с иглой 300. При помощи указанной методики отслаивалась примерно половина площади сетчатки.

Крыс с ОС разделяли по двум экспериментальным группам, при этом опытная группа получала подкожную инъекцию в заднюю область шеи РРЬ-1 (5% в хлопковом масле; 0,025 мл/инъекция), а контрольная группа получала инъекцию такого же объема несущей среды. Первую инъекцию все животные получали непосредственно после хирургического вмешательства. Вторую инъекцию (те же доза и способ введения) вводили через 48 ч после хирургического вмешательства.

В день 3 и день 14 после ОС оперированных крыс умерщвляли в камере, заполненной СО₂. Извлекали поврежденный правый глаз и неповрежденный левый глаз. Выделяли сетчатки, замораживали в сухом льду и подвергали анализу методом вестерн-блоттинга или иммуногистохимическому анализу. Сетчатки левого глаза служили контролем в отсутствии операции.

Исследовали уровни экспрессии семафорина-3А (8ета3А), нейтрофилина-1 (ΝΈ1) и 0АР43, в качестве маркера апоптоза применяли каспазу-3 и исследовали морфологические изменения в клетках Мюллера и клетках микроглии.

8ета3А представляет собой ингибитор роста аксонов, который, как показано, участвует в гибели ганглиозных клеток сетчатки после повреждения зрительного нерва. Высокие уровни 8ета3А были отмечены в сетчатках после ОС по данным вестерн-блоттинг анализа (фиг. 20А). Лечение КРЬ-1 явно снизило уровни экспрессии 8ета3А как в контрольных неповрежденных сетчатках, так и в сетчатках с ОС (фиг. 20А). Образцы нормализовывали по экспрессии β-актина (нижняя полоса, фиг. 20А)

Иммуногистохимический анализ 20 мкм срезов сетчатки, инкубированных с антителом к 8ета3А и ядерным красителем 8у1о\ В1ие, показал, что экспрессия 8ета3А была явно выше в отслоенных сетчатках по сравнению с контрольными. Экспрессия 8ета3А в основном наблюдалась вокруг ганглиозных клеток сетчатки. Аналогично результатам, полученным при вестерн-блоттинг анализе, экспрессия 8ета3А была снижена у животных с ОС, получавших РРЬ-1.

ΝΈ1 представляет собой функциональный рецептор 8ета3А. Клетки, положительные по ΤυΝΕΗ указывающие на процессы апоптоза, явно наблюдались через 24 ч после отслойки сетчатки и увеличивались через 7 дней.

Каспаза-3 активировалась в ответ на ОС. Однако повышение каспазы-3 было значительно ослаблено у животных с ОС, получавших КРЬ-1 (фиг. 20В).

0АР43 представляет собой внутриклеточный белок, плотно соединенный с мембраной конусов роста. Он обычно экспрессируется в процессе синаптогенеза. В сетчатке 0АР43 экспрессирован в нейронах на ранней стадии эмбриогенеза, когда зрительный нерв еще удлиняется. В зрительном нерве крысы 0АР43 обнаружен как в аксонах, так и в телах клеток ГКС, но экспрессия исчезает в возрасте от 8 до 16 недель и обнаруживается вновь после ишемии или повреждения зрительного нерва.

Морфологические изменения в клетках Мюллера изучали путем окрашивания на глиофибриллярный кислый белок (ГФКБ). ГФКБ отмечает клетки Мюллера в сетчатке и обычно используется в качестве индикатора стресса. Метки ГФКБ в интактной контрольной сетчатке концентрировались в СГК (слой

- 35 021886 ганглиозный клеток). Иммуногистохимический анализ показал повышенные уровни ГФКБ в отслоенных сетчатках по сравнению с контрольными. Отслоенные сетчатки животных, получавших КРЬ-1, показали более высокие уровни ГФКБ.

Микроглиальная инвазия и активация считаются вредными или полезными для нейронов. Микроглиальная активация после острого повреждения ЦНС, в первую очередь, представляет собой реактивный и адаптивный ответ глиальных клеток, запускаемый поврежденными нейронами и предназначенный для облегчения первичного повреждения ткани и, как результат, содействия восстановлению и глиозу (глиальный шрам). Микроглия активируется в сетчатке обычно после повреждения, стимулируя и накапливая эндотелиальные клетки и фибробласты. Иммуногистохимический анализ срезов отслоенной и неповрежденной сетчаток, помеченных ΙΒ4 и окрашенных ядерным красителем Р1, показал присутствие активированных клеток микроглии только в отслоенных сетчатках. Однако в отслоенных сетчатках животных, получавших КРЬ-1, наблюдалась меньшая активация микроглии по сравнению с отслоенными сетчатками животных, получавших несущую среду.

Полученные результаты показали уменьшенное накопление активной микроглии в область вокруг поврежденного участка и поддержание бесшрамового механизма заживления ран.

Пример 17. Получение комплексов циклодекстрина с полимером мирцена.

Циклодекстрины благодаря их способности образовывать комплексы включения со многими лекарственными средствами могут существенно увеличивать растворимость в воде биофармацевтических препаратов, особенно относящихся к не растворимым в воде, как полимер мирцена. Циклодекстрины представляют собой растворимые в воде соединения, способные обратимо образовывать комплексы с плохо растворимыми в воде молекулами, с образованием растворимого молекулярного комплекса включения. Когда комплекс включения комбинации лекарственное средство-циклодекстрин разбавляют достаточно большим объемом воды или крови, он быстро диссоциирует, высвобождая изолированный фармакологически активный агент.

Комплексообразование полимера мирцена с β-НРСЭ (β-гидроксипропилциклодекстрин) будет проходить следующим образом:

a) растворение предварительно взвешенного полимера мирцена в минимальном количестве неполярного растворителя, такого как гексан, гептан и тому подобное;

b) добавление по каплям неполярного растворителя к порошку β-НРСЭ;

c) высушивание при 50-80°С до выпаривания неполярного растворителя; б) смешивание с необходимым количеством воды;

е) растворение при ультразвуковом воздействии и нагревании; ί) фильтрование через фильтр 0,2-0,45 мкм.

Пример 18. Получение наноэмульсии полимера мирцена.

Составы жидких наноэмульсий типа масло-в-воде готовили по методике эмульгирования при высоком давлении всех липидных ингредиентов и активного компонента полимера мирцена, растворенного в липидной масляной фазе и эмульгированного в водной фазе, намереваясь достигнуть образования стабильных сферических равномерно распределенных содержащих лекарственное средство липидных нанокапелек. Уменьшение размера нанокапелек эмульсии существенно для получения состава лекарственного средства с высокой стабильностью. Предпочтительные капельки наноэмульсии имеют средний размер капелек менее 1 мкм (обычно в диапазоне 0,1-0,2 мкм) и равномерно диспергированы в водной фазе. Уникальность большого внутреннего гидрофобного масляного ядра капелек наноэмульсии обеспечивает высокую солюбилизационную емкость по отношению к не растворимым в воде соединениям, таким как полимер мирцена.

1. Получение масляной фазы.

Масляная фаза состояла из 13% липоида Е-75, 0,026% аТФ-сукцината, пропилпарабена в качестве антиокислителя и 86,9% МЛ§1уо1® 810. Полимер мирцена, полученный, как описано в примере 1, растворяли в масляной фазе. Компоненты смешивали при умеренном нагревании до получения полностью однородного солюбилизированного раствора.

2. Получение водной фазы.

Водная фаза состояла из 0,1% ЭДТА, 0,5% Твин-80, 2,3% глицерина, метилпарабена в качестве консерванта и 97,1% воды. рН доводили до 7,4 при помощи 1 N раствора ΝαΟΗ.

3. Смешивание водной и масляной фазы.

Масляную фазу (3,7 г) нагревали и добавляли 70 мл водной фазы (предварительно нагретой). Смесь осторожно перемешивали в течение 10-15 мин при комнатной температуре.

4. Получение грубой эмульсии типа масло-в-воде.

Эмульсию типа масло-в-воде готовили при помощи дозатора среднего размера и гомогенизирующего устройства с большим усилием сдвига Ро1уГгои® на 20000 об/мин в течение 5 мин.

5. Доведение эмульсии до субмикронного диапазона при помощи гомогенизатора высокого давления ОаиЪи®.

Размер капелек эмульсии, полученных после стадии 4, уменьшали до субмикронного (наноразме- 36 021886 ра), подвергая эмульсию гомогенизации с высоким усилием сдвига при помощи гомогенизатора высокого давления 0аи1ш® М1сто1аЬ 70 под давлением 800 бар. Всего необходимо было 5-6 циклов для получения капелек гомогенной наноэмульсии со средним размером частиц менее 200 нм. Размер частиц определяли при помощи фотонно-корреляционной спектроскопии (ФКС) с использованием анализатора размера частиц Ν4ΜΌ (СоиНет® Е1сс1гошс5. ИК). Процесс считали завершенным, когда большинство частиц (> 90%) были менее 200 нм.

6. Стерильная фильтрация.

Фильтровали наноэмульсию в асептических условиях в стерильные флаконы с использованием стерильного фильтра 0,2 мкм РЕ8 и хранили при 40°С.

Пример 19. Получение высушенного распылением порошка полимера мирцена.

Обычный процесс получения продукта смеси полимер мирцена-липид представляет сбой непосредственное высушивание распылением состава, представляющего собой смесь дисперсии в неполярном растворителе, содержащем все липидные ингредиенты, и воды, содержащей гидрофильные компоненты, принимая во внимание рентабельность и соображения укрупнения масштаба. Выбранный способ высушивания распылением оптимизировали для получения мелкодисперсного сыпучего порошка. Полимер мирцена растворяли в липидной фазе, содержащей липидные ингредиенты - лецитин, трикаприн (триглицерид каприновой кислоты), токоферола сукцинат, и подогревали (~40°С) в неполярном растворителе до получения хорошей дисперсии. Дисперсию пирогенного диоксида кремния (СаЬ-О-811®) в воде (5%) готовили путем набухания порошка в очищенной воде. Полученную суспензию (предварительно нагретую до 40°С) затем медленно выливали в дисперсию липидов в неполярном растворителе и перемешивали полученную смесь при 40°С примерно в течение 1 ч до получения однородной дисперсии. Затем смесь высушивали распылением при помощи распылительной сушилки УатаЮ Ри1у18® ОА32. Условия высушивания распылением были следующие: расход 7 мл/мин, температура на входе 130°С, температура на выходе 70°С, расход высушивающего воздуха 0,5 м³/мин. Предполагали получить однородный сухой порошок, содержащий смесь полимера мирцена-липида.

Предполагали, что состав смеси полимера мирцена-липида, полученный путем процесса непосредственного высушивания распылением, покажет хорошую диспергируемость в воде, благодаря чему подойдет для получения твердых дозированных лекарственных форм, таких как твердые желатиновые капсулы или таблетки для улучшенной пероральной доставки полимера мирцена с потенциально хорошей биодоступностью при пероральном приеме.

Пример 20. Получение липосомных препаратов, содержащих полимер мирцена.

Липиды, содержащие растворенные полимеры мирцена, растворяли в 100 мл дихлорметана в круглодонной колбе и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре до получения прозрачного бесцветного раствора. Растворитель выпаривали при помощи ротационного испарителя при 39°С. Сначала колбу вращали со скоростью 4,5 об/мин в течение 5 мин при атмосферном давлении, после этого 10-30 мин (до полного испарения растворителя) в слабом вакууме и, наконец, 15 мин в полном вакууме. По окончании процесса выпаривания будет получена однородная пленка липида. Пленку липида растворят в 15 мл изотонического буферного раствора. Липосомы получали энергичным встряхиванием в течение 10-30 мин на многошпиндельном шейкере до получения однородной молочной дисперсии многослойной липосомы (МСЛ) и исчезновения видимых остатков липидной пленки. Для получения сбалансированного и однородного липосомного препарата колбу дополнительно встряхивали при 37°С в течение 30-90 мин при 270 об/мин.

Пример 21. Получение микроэмульсий, содержащих полимер мирцена.

Некоторые поверхностно-активные вещества, обычно применяемые парентерально, можно применять для получения микроэмульсий типа вода-в-масле и масло-в-воде, подходящих для инъекционного, перорального и топического применения. Фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, подходящие для создания микроэмульсий, представляют собой неионогенные поверхностноактивные вещества, включая полиоксил-40-гидрогенизированное касторовое масло (продаваемое под торговым наименованием Кремофор КН40®), полиоксил-35-гидрогенизированное касторовое масло (продаваемое под торговым наименованием Кремофор® ЕЬ), сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот (полисорбаты), полоксамеры (Р1иготс8®), витамин Е-ТРО8 1000 (УЕ-ТРО8 1000), алкиловые простые эфиры полиоксиэтилена, 8о1и1о1® Н8-15, Тада1®ТО, РедНсо1 6-олеат, полиоксиэтилена стеараты или насыщенные полигликолизированные глицериды, все из которых коммерчески доступны. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают полиоксил-40-гидрогенизированное касторовое масло (Кремофор® КН40®), полиоксил-35-гидрогенизированное касторовое масло (Кремофор® ЕЬ), сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот (полисорбаты), полоксамеры (Р1итоиЮ8®) и витамин Е-ТРО8 1000. Общее количество поверхностно-активного вещества, присутствующего в композиции, будет в общем случае составлять от 100 до 700 мг/г и предпочтительно примерно от 300 до 500 мг/г.

Получение микроэмульсий, содержащих полимер мирцена, можно осуществить путем растворения полимеров мирцена в подходящем количестве масла, такого как среднецепочечные триглицериды

- 37 021886 (М1§1уо1) в подходящем флаконе. Затем флакон закрывают. Флакон помещают на водяную баню примерно при 50-60°С и осторожно встряхивают до полного растворения лекарственного материала. Затем флакон охлаждают до комнатной температуры, добавляют соответствующее количество поверхностноактивного вещества (такого как Кремофор® ЕЬ или УЕ-ТРС8) с последующим добавлением смеси монои диглицеридов жирных кислот, если таковые входят в рецептуру. Затем флакон закрывают и помещают на водяную баню примерно при 50-60°С. Флакон осторожно встряхивают до получения однородного прозрачного раствора. Полученный раствор можно поместить в капсулы из ГПМЦ и хранить при комнатной температуре до перорального приема. Как вариант, порошки замещенных полимеров (таких как ГПМЦ) можно вводить в раствор при соответствующем перемешивании (т.е. помешивании, встряхивании) для получения однородной суспензии полимера. Затем полученную композицию можно поместить в капсулы из мягкого желатина или твердого желатина и хранить при комнатной температуре до перорального приема. Как вариант, состав микроэмульсии можно применять топически или профильтровать через мембраны 0,2 мкм для парентерального введения.

Микроэмульсии, содержащие полимеры мирцена, обладают хорошей диспергируемостью в воде и самоэмульгируются при разбавлении водной средой с образованием маленьких наноразмерных мицелл с улучшенной биодоступностью.

Предшествующее описание конкретных вариантов реализации будет настолько полно раскрывать основную сущность настоящего изобретения, что любой может, применяя современные знания, легко изменить и/или приспособить описанные конкретные варианты реализации для различных применений, не проводя излишних экспериментов и не отступая от родового понятия, и, следовательно, указанные адаптации и модификации должны и предназначены входить в объем значений и диапазон эквивалентов описанных вариантов реализации. Следует понимать, что фразеология или терминология, применяемые в настоящем описании, предназначены для описания, но не для ограничения. Средства, материалы и стадии для осуществления различных описанных функций могут иметь ряд альтернативных форм, не выходящих за рамки настоящего изобретения.

Claims

1. Выделенная фракция мастиковой смолы, характеризующаяся тем, что фракция растворима по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе, выбранном из спирта и простого эфира, и по меньшей мере в одном неполярном органическом растворителе, выбранном из ациклического или циклического насыщенного или ненасыщенного алифатического углеводорода, или ароматического углеводорода, или их комбинаций, и, по существу, не содержит соединений, растворимых в указанном полярном органическом растворителе, но не растворимых в указанном неполярном органическом растворителе, для лечения нарушения неврологической функции, включающего ослабление функции, выбранной из группы, состоящей из когнитивной функции, сенсорной функции, двигательной функции и комбинации указанных функций.

2. Выделенная фракция по п.1, отличающаяся тем, что содержит полимер мирцена, предпочтительно полимер β-мирцена (поли-β-мирцен).

3. Выделенная фракция по п.2, отличающаяся тем, что содержит от 0,01 до 25 мас.% полимера βмирцена от общей массы фракции.

4. Выделенная фракция по п.2 или 3, отличающаяся тем, что полимер мирцена выбран из группы, состоящей из полимера β-мирцена (поли^-мирцен), полимера α-мирцена (поли-а-мирцен), сополимеров мирцена и их комбинаций.

5. Выделенная фракция по любому из пп.2-4, характеризующаяся тем, что поли^-мирцен выбран из группы, состоящей из цис-1,4-поли-β-мирцена, транс-1,4-поли-βмирцена, 3,4-поли-β-мирцена, 1,2-поли-β-мирцена и их комбинаций; или полимер мирцена представляет собой цис-1,4-поли-β-мирцен, предпочтительно выделенная фракция мастиковой смолы содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-β-мирцена; или выделенная фракция содержит смесь цис-1,4-поли-β-мирцена и транс-1,4-поли-β-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 75 мас.% цис-1,4-поли-β-мирцена; или выделенная фракция содержит по меньшей мере 75 мас.% цис-1,4-поли-β-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне от 1000 до 20000, причем предпочтительно среднечисленная молекулярная масса выделенной фракции находится в диапазоне от по меньшей мере 5000 до 20000 или выделенная фракция содержит менее 5% мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее 6.

6. Выделенная фракция по п.1, где нарушение неврологической функции связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из травмы, сосудистой деменции, старческой деменции, болезни Альцгеймера, амиотрофического бокового склероза (АБС), рассеянного склероза, болезни Паркинсона и инсульта; и фракция находится в форме, пригодной для перорального, топического, парентерального или трансдермального введения; или

- 38 021886 выделенная мастиковая смола находится в форме, пригодной для внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрикожного, внутрибрюшинного, внутриартериального, внутримозгового, интрацеребровентрикулярного, внутрикостного и интратекального введения; или фракция находится в форме, пригодной для топического нанесения, выбранного из дермального, вагинального, ректального, ингаляционного, интраназального, окулярного, аурикулярного и буккального нанесения; или полимер мирцена представляет собой продукт химического синтеза или получен из растительного источника.

7. Выделенная фракция по п.1, отличающаяся тем, что полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из спирта, простого эфира и их комбинаций, предпочтительно из метанола, этанола, пропанола, изопропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, втор-бутанола, трет-бутанола, 1-пентанола, 2пентанола, 3-пентанола, неопентанола, 3-метил-1-бутанола, 2-метил-1-бутанола, 3-метил-2-бутанола, 2метил-2-бутанола, этиленгликоля, этиленгликоля монометилового эфира, диэтилового эфира, метилэтилового эфира, этилпропилового эфира, метилпропилового эфира, 1,2-диметоксиэтана, тетрагидрофурана, дигидрофурана, фурана, пирана, дигидропирана, тетрагидропирана и их комбинаций; или неполярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из ациклических или циклических насыщенных или ненасыщенных алифатических углеводородов и ароматических углеводородов и их комбинаций, предпочтительно из группы, состоящей из пентанов, гексанов, гептанов, октанов, нонанов, деканов, циклопентана, циклогексана, циклогептана, бензола, толуола, ксилола или их изомеров или смесей; или выделенная фракция, по существу, не содержит мономерных терпеновых соединений.

8. Выделенная фракция мастиковой смолы, отличающаяся тем, что фракция растворима по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе, выбранном из спирта и простого эфира, и по меньшей мере в одном неполярном органическом растворителе, выбранном из ациклического или циклического насыщенного или ненасыщенного алифатического углеводорода, или ароматического углеводорода, или их комбинации, и, по существу, не содержит соединений, растворимых в указанном полярном органическом растворителе, но не растворимых в указанном неполярном органическом растворителе, для индуцирования дифференцировки нейрональных типов клеток.

9. Выделенная фракция по п.8, характеризующаяся тем, что указанный полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из спирта, простого эфира и их комбинаций, предпочтительно из метанола, этанола, пропанола, изопропанола, 1-бутанола, 2бутанола, втор-бутанола, трет-бутанола, 1-пентанола, 2-пентанола, 3-пентанола, неопентанола, 3-метил1-бутанола, 2-метил-1-бутанола, 3-метил-2-бутанола, 2-метил-2-бутанола, этиленгликоля, этиленгликоля монометилового эфира, диэтилового эфира, метилэтилового эфира, этилпропилового эфира, метилпропилового эфира, 1,2-диметоксиэтана, тетрагидрофурана, дигидрофурана, фурана, пирана, дигидропирана, тетрагидропирана и их комбинаций; или неполярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из ациклических или циклических насыщенных или ненасыщенных алифатических углеводородов и ароматических углеводородов и их комбинаций, предпочтительно из пентанов, гексанов, гептанов, октанов, нонанов, деканов, циклопентана, циклогексана, циклогептана, бензола, толуола, ксилола и их изомеров и смесей; или фракция находится в форме, пригодной для перорального, топического, парентерального и трансдермального введения.

10. Выделенная фракция по п.8, отличающаяся тем, что содержит полимер мирцена, предпочтительно полимер β-мирцена (поли-в-мирцен).

11. Выделенная фракция по п.8 или 10, которая находится в составе композиции, содержащей от 0,01 до 25 мас.% полимера мирцена или полимера β-мирцена соответственно от общей массы композиции.

12. Выделенная фракция по п.10, характеризующаяся тем, что поли-в-мирцен выбран из группы, состоящей из цис-1,4-поли-в-мирцена, транс-1,4-поли-в-мирцена, 3,4-поли-в-мирцена, 1,2-поли-вмирцена и комбинаций указанных полимеров, предпочтительно полимер мирцена представляет собой цис-1,4-поли-в-мирцен, предпочтительно выделенная фракция мастиковой смолы содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена; или выделенная фракция содержит смесь цис-1,4-поли-в-мирцена и транс-1,4-поли-в-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 75 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена; или выделенная фракция содержит по меньшей мере 75 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне от 1000 до 20000, предпочтительно среднечисленная молекулярная масса выделенной фракции находится в диапазоне по меньшей мере от 5000 до 20000.