EA020169B1 - Гидратированные n-фуллерен-аминокислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе - Google Patents

Гидратированные n-фуллерен-аминокислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе Download PDF

Info

Publication number
EA020169B1
EA020169B1 EA201201455A EA201201455A EA020169B1 EA 020169 B1 EA020169 B1 EA 020169B1 EA 201201455 A EA201201455 A EA 201201455A EA 201201455 A EA201201455 A EA 201201455A EA 020169 B1 EA020169 B1 EA 020169B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fullerene
drug
animals
amino acids
dose
Prior art date
Application number
EA201201455A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201201455A1 (ru
Inventor
Лев Давидович РАСНЕЦОВ
Яков Юделевич ШВАРЦМАН
Ольга Николаевна СУВОРОВА
Original Assignee
Лев Давидович РАСНЕЦОВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Лев Давидович РАСНЕЦОВ filed Critical Лев Давидович РАСНЕЦОВ
Publication of EA201201455A1 publication Critical patent/EA201201455A1/ru
Publication of EA020169B1 publication Critical patent/EA020169B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C227/14—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton from compounds containing already amino and carboxyl groups or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C227/14—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton from compounds containing already amino and carboxyl groups or derivatives thereof
    • C07C227/18—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton from compounds containing already amino and carboxyl groups or derivatives thereof by reactions involving amino or carboxyl groups, e.g. hydrolysis of esters or amides, by formation of halides, salts or esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/14—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of carbon skeletons containing rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/46—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino or carboxyl groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C07C229/50—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino or carboxyl groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton with amino groups and carboxyl groups bound to carbon atoms being part of the same condensed ring system

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, а именно к новым гидратированным аминокислотным производным фуллерена Cобщей формулыгде C- фуллерен; n=5, 6, 7; х=8-10, а также к способу их получения и созданию фармацевтических композиций на их основе. Гидратированные N-фуллерен-аминокислоты образуются при взаимодействии фуллерена с 15-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот в среде органического ароматического растворителя при медленном добавлении к полученной суспензии межфазного катализатора при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделяют, после чего осуществляют обработку 0,8 М водных растворов калиевых солей фуллерен-аминокислот 0,1н. раствором органических или минеральных кислот с последующим центрифугированием, промывкой и высушиванием осадка. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью против вируса герпеса, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью, содержащая в качестве активного вещества гидратированные N-фуллерен-аминокислоты в эффективном количестве.

Description

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и касается новых гидратированных аминокислотных производных фуллерена С60 формулы (I), а также способа их получения и создание фармацевтических композиций на их основе.
Π Ϊ (рн2)п ноос
Предшествующий уровень техники
Возможность использования фуллеренов как биологически активных соединений вызвало интенсивное развитие химии функциональных производных фуллерена, особенно после того, как было показано, что ряд водорастворимых производных фуллерена проявляют высокую антивирусную активность (Райка К., Сопусгк РФ. Вютсдюа1 аррксайога οί Γιιποίίοηαΐίζοά Ги11сгспс-Ьаксд папота(спа1к. 1п(. 1. ИаиотеФсте, 2009, 4, 261-75, Ра(сп( И8 6204391, 2005, \Уа(сг ко1иЬ1с Ги11сгспск \νί(1ι ап(гупа1 аейуйу, К. Вакгу с! а1., МсФс1иа1 аррксайоп оГ Ги11сгспск. 1п(сгпайопа1 1оигиа1 оГ Напотсдссшс, 2007 (4) 639-649, Ζ. Ζ1π.ι, Ό.Ι. 8с1шк(сг, М. Тисксгтапп, Мо1сси1аг Эупат1ск 8(иду оГ (1с Соппссйоп Ьс(\\'ссп Р1ар С1октд апд Втдтд оГ Еи11сгсп-Ваксд 1п1пЬ1(огк оГ (Нс Н1У-1 Рго(сакс, Вюскстщру, 2003, ν. 42, 1326-1333).
Применение производных фуллерена в медицине основано на липофильных свойствах фуллеренового ядра, позволяющих фуллереновым производным проникать через клеточные мембраны, и способности фуллерена с высоким квантовым выходом генерировать синглетный кислород, расщепляющий ДНК. Эти свойства обеспечивают функциональным производным фуллерена проявление цитотоксических, антивирусных и других свойств (Всдгоу Ό., 8ιηί(1ι Ο.Ό., Оауапдс Н., Раккйс (гагарой оГ Ги11сгспск (кгоидк а 11р1д тстЬтапс. 1. Р1ук. СНст., В, 2008, ν. 112., р. 2078-84, О1ао К., КоЬсйк А.Е., Тгага1оса(юп оГ Ги11сгспс апд йк дспуаОуск асгокк а 11р1д Ьйауст, Иапо Ьсй., 2007, ν. 7, р. 614-9. №1ксп Ο.Ό. с( а1., 1п у|уо Ью1оду апд (охюо1оду оГ Ги11сгспск апд (Нс1г дсйуайуск, Ваис апд С11шса1 Р1агтасо1оду апд Тох1со1оду, 2008, ν. 103, р. 197-208).
Гидратированные формы фуллерена проявляют высокую биологическую активность как биоантиоксиданты, что обусловлено образованием активных структурных форм водных кластеров, координированных на сфере фуллерена (Апдпсукку 6.У., ВгикНкоу ν.Ι., ТукНопоу А.А., Сидкον 8.У. РссиНапйск оГ (1с ап(юх1дап( апд тадюртоксйус сГГсс(к оГ Нудга(сд С60 Ги11сгспс папо к(гис(игск ш νί(ΐΌ апд ш у|уо. Етсс Кад1са1 Вю1оду апд Мсдктс, 2009, ν. 47, р. 786-793).
Основной проблемой, затрудняющей биологические исследования фуллеренов и их производных и создания лечебных препаратов на их основе, является сложность введения фуллереновых систем в водные растворы.
Перспективным методом получения водорастворимых фуллереновых композиций является химическая модификация сферы фуллерена введением гидрофильных солюбилизирующих лигандов. В настоящее время получен большой ряд функционализированных фуллеренов, содержащих гидрофильные фрагменты как в боковой цепи присоединенных к фуллерену лигандов (детергентный тип комплексов), так и сферический тип производных, когда имеются полярные группы, распределенные по фуллереновой сфере (такой тип включает фуллеренолы, аминоаддукты).
Наиболее перспективными для использования являются аминокислотные производные фуллерена.
Неприродные аминокислоты алифатического ряда, содержащие 6 и более метиленовых групп, проявляют ряд особенностей, проявляющихся в процессах их гидратации и их биохимической активности. Спектральные исследования структуры воды в водных растворах аминокислот показывают, что увеличение числа метиленовых групп между амино- и карбоксильной группами приводит к увеличению деструкции водных кластеров. Исследования фармакологических свойств производных аминокислот широкого ряда К-(СН)пСООН показали более высокую активность систем с п больше и равным 6.
Производные фуллерена С60 сферического типа с аминокислотами, полученные по реакции нуклеофильного присоединения аминокислот по аминогруппе к сфере фуллерен, описаны в патентах РФ № 2196602, 2124022, 2236852, которые можно предложить в качестве аналогов настоящего изобретения.
В патенте РФ № 2196602 предложен способ ингибирования репродукции ВИЧ и ЦМВ-инфекций при помощи соединений на основе аминокислотных и дипептидных производных фуллерена. В качестве аминокислотного производного фуллерена использованы натриевые соли фуллерен-аминокапроновой и фуллерен-аминомасляной кислот.
В патенте РФ № 2124022 для получения фуллерен-аминокапроновой кислоты к раствору фуллерена в о-дихлорбензоле добавляют водный раствор калиевой соли аминокапроновой кислоты и 18-краун-6.
- 1 020169
Реакционную массу перемешивают 6-8 ч при 60°С. Затем растворители отгоняют, остаток обрабатывают насыщенным раствором хлористого калия и остаток фуллеренового производного промывают водой. Выход целевого продукта количественный. Полученная (моногидро)-Л-фуллерен-аминокапроновая кислота растворима в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, пиридине. В заявленном методе синтеза не определены условия выделения конечного продукта.
Основным недостатком полученных соединений, которые представляют собой продукты моноприсоединения, является их нерастворимость в воде. Другим недостатком изобретения является использование в их синтезе краун-эфира в качестве межфазного катализатора, который сложно отделять от получаемых продуктов реакции.
В патенте РФ № 2236852 защищается средство для ингибирования репродукции оболочечных вирусов, представляющее собой фуллеренполикарбоновые анионы общей формулы С60Нп[ИН(СН2)тС(О)О-]п, полученные в результате взаимодействия фуллерена с солью аминокислоты в среде органического растворителя в присутствии полиалкиленоксида.
Для получения этих соединений к раствору фуллерена в о-дихлорбензоле (толуоле или любом другом органическом растворителе) вносят аминокислоту в виде соли (калиевой или натриевой), затем добавляют солюбилизатор. Порядок внесения в реакционную среду аминокислоты и солюбилизатора не важен, можно вносить их в виде комплекса, предварительно смешав. В качестве солюбилизатора используют различные полиалкиленоксиды: полиэтиленгликоли мол. массы от 150 до 400 и выше 400 (например, ПЭГ-1500), а также полиэтиленгликоли, имеющие свободные концевые группы, но и с замещенными (например, диметиловый эфир полиэтиленгликоля мол. массы 500). Для увеличения скорости реакции добавляют любой сильный восстановитель (щелочные металлы). Соотношение фуллерена и аминокислоты увеличено более чем в 50 раз. Превращение в желаемую фармацевтически приемлемую соль, особенно натриевую или калиевую, выполнялась путем обработки кислоты подходящим основанием или путем добавления соли слабой летучей кислоты. В частности, нерастворимая в воде фуллеренполикарбоновая кислота превращается в более предпочтительные фармацевтически приемлемые соли, такие как натриевая соль, которые растворимы в воде. Добавление соли слабой летучей кислоты происходит путем обработки раствора солью щелочного металла и слабой летучей кислоты. При концентрировании раствора путем выпаривания или лиофилизации слабая кислота удаляется, а смесь фуллеренполикарбоновых кислот выделяется в виде смесей их солей щелочных металлов. Целевой продукт по данному изобретению характеризуется постоянством состава, содержание в целевом продукте основного вещества составляет всего 87,8%.
Основными недостатками фуллерен-аминокислотных производных, полученных представленным в патенте методом получения, является то, что данным способом получают смесь фуллеренкарбоксилатных анионов как солевых, так и кислотных форм. Получить индивидуальное соединение способом, описанным в патенте, не представляется возможным. Также фуллеренполиаминокислоты, полученные запатентованным способом, в кислотной форме практически нерастворимы в воде. Получить стабильную фармацевтическую композицию с фуллеренполикарбоновыми анионами не удалось, так как в процессе хранения соединения выпадают в осадок. Фуллеренполиаминокислоты оказывают влияние на лейкопоэз: вызывают сдвиг лейкоцитарной формулы и индуцируют появление молодых форм нейтрофилов - нейтрофильных метамиелоцитов у подопытных животных (крыс и кроликов). С точки зрения безопасности (безвредности) это свидетельствует о наличии у данных субстанций токсичности, вызывающей указанные изменения. Применение в синтезе большого избытка калиевой или натриевой солей аминокислот и больших избытков растворителей приводит к возникновению экологических проблем, связанных с утилизацией отходов производства, а также к удорожанию процесса производства. Использование щелочных металлов для увеличения скорости реакции является технологически невозможным при использовании хлорированных ароматических растворителей.
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемого технического решения является получение индивидуальных гидратированных соединений фуллерена С60 с аминокарбоновыми кислотами, обладающих активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью, не оказывающих токсического действия на организм; способ получения данных соединений и фармацевтические композиции, включающие данные соединения.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом: соединение, способ его получения и фармацевтические композиции, содержащие указанное соединение.
Поставленная задача решается индивидуальным гидратированным соединением фуллерена С60 с аминокарбоновыми кислотами общей формулы (I), характеризующееся тем, что на одну молекулу фуллерена приходится три ковалентно связанных аминокислотных фрагмента, имеющих в своей структуре активные центры гидратации, приводящие к образованию водорастворимых гидратов, и длинные углеводородные цепи, позволяющие удерживать молекулы воды во внутренней координационной сфере фуллереновых комплексов.
С60(Н)з{НН(СН2)пСООН}з-хН2О, (I)
- 2 020169 где С6о - фуллерен;
п=5-7;
х=8-10.
Указанная задача решается тем, что гидратированные фуллереновые производные аминокислот формулы (I), образуются при взаимодействии фуллерена с 15-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот в среде органического ароматического растворителя при медленном добавлении к полученной суспензии межфазного катализатора при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60-80°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделяют, после чего осуществляют обработку 0,8 М водных растворов калиевых солей фуллерен-аминокислот 0,1н. раствором органических или минеральных кислот с последующим центрифугированием, промывкой и высушиванием осадка.
Также согласно изобретению безводные калиевые соли аминокислот используют в мелкодисперсном состоянии, что позволяет повысить реакционную способность процесса, его эффективность и экономичность, а выделение твердого осадка калиевых солей фуллерен-аминокислот осуществляют фильтрованием, промывкой этиловым спиртом и высушиванием. В качестве межфазного катализатора используют метиловые эфиры полиэтиленоксидов молекулярной массы 200, 400, 500, как наиболее доступные и безопасные катализаторы.
Указанная задача решается также созданием фармацевтических композиций, содержащих в качестве активного вещества водорастворимые гидратированные фуллерен-аминокислоты формулы (I), обладающих активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью.
Фармацевтические композиции по предложенному техническому решению содержат соединение общей формулы (I) в количестве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных лекарственных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих соединения предложенного технического решения в качестве активного ингредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного, местного, интраназального и интраректального введения. Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, суппозиториев, эмульсий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.
Конкретный уровень дозировок и частота приема лекарства для каждого конкретного пациента будут зависеть от большого числа факторов, включая активность конкретного производного фуллерена, метаболическую стабильность и длительность действия, скорость выделения, возраст пациента, вес тела, общее состояние здоровья, пол, лекарственные комбинации, а также тяжесть заболевания у данного индивида, подвергаемого лечению.
Для орального применения в виде суспензий композиции готовят согласно методам, широко известным в области приготовления фармацевтических рецептур, и они могут содержать микрокристаллическую целлюлозу или ее производные для обеспечения массы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспендирующего агента, метилцеллюлозу в качестве усилителя вязкости и подслащивающие агенты и/или отдушки, известные в этой области. В форме таблеток такие композиции могут содержать микрокристаллическую целлюлозу, кальций фосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, расширители, дезинтеграторы, разбавители и смазывающие вещества, известные в данной области.
При применении в виде назальных аэрозолей или путем ингаляции такие композиции готовят методами, хорошо известными в области фармацевтических рецептур, и они могут выпускаться в виде растворов на физиологическом растворе с использованием бензойной кислоты или других подходящих консервантов, промоторов адсорбции для усиления биоприменимости и/или других солюбилизирующих или диспергирующих агентов, известных в данной области.
Растворы или суспензии для инъекций могут формироваться согласно известным методам с использованием нетоксичных, парентерально применимых разбавителей или растворителей, таких как маннит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлористого натрия или подходящих диспергирующих или смачивающих и суспендирующих агентов, таких как стерильные, мягкие, устойчивые масла, включая синтетические моно- или диглицериды, или жирные кислоты, включая олеиновую кислоту.
При ректальном применении в виде свечей такие композиции могут готовиться путем смешивания лекарства с таким нераздражающим эксципиентом, как масло какао, синтетические глицеридные сложные эфиры или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми веществами при обычных температурах, но сжижаются и/или растворяются в ректальной полости с выделением лекарства.
При местном применении в виде мазей, гелей, кремов, линиментов и т.д. такие композиции могут готовиться путем смешивания активных ингредиентов с приемлемой мазевой основой.
В качестве мазевой основы могут быть использованы жировые, углеводородные или гидрофильные основы, например вазелин, вазелиновое масло, парафин, воск, ланолин, полиэтиленгликоль и др.
- 3 020169
В качестве основы для гелей могут быть использованы метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипропилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и т.д.
Предложенное изобретение касается соединений, способа получения этих соединений и их фармацевтически приемлемых ассоциатов с полярными реагентами. Полученные соединения не оказывают влияния на лейкопоэз: не вызывают сдвига лейкоцитарной формулы и не индуцируют появление молодых форм нейтрофилов - нейтрофильных метамиелоцитов у подопытных животных (крыс и кроликов). С точки зрения безопасности (безвредности) это свидетельствует об отсутствии у данных соединений токсичности, вызывающей указанные изменения. Заявляемый способ позволяет получить различные по составу композиции на основе фуллерен-аминокислот в зависимости от соотношения реагентов и условий проведения процесса, а именно водорастворимые гидратированные фуллерен-аминокислоты общей формулы (I).
Способ основан на использовании в стадии синтеза оптимальных соотношений исходных реагентов, минимальных количеств органического растворителя и межфазного катализатора с последующим выделением заявляемых соединений с использованием концентрированных растворов органических и минеральных кислот, что приводит к количественному получению фуллерен-аминокислотных композиций определенного состава и возможности применения заявляемого способа для их промышленного синтеза, отличающегося эффективностью и экологичностью.
Технический результат предлагаемого технического решения состоит в получении устойчивых индивидуальных водорастворимых гидратированных соединений фуллерена С60 с аминокарбоновыми кислотами, не оказывающих токсического воздействия на организм. Разработан эффективный способ получения индивидуальных устойчивых гидратированных производных фуллерена, обладающих противовирусной, противоопухолевой и противопсориатической активностью.
Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Варианты осуществления изобретения
Пример 1. Получение гидрата Ы-фуллерен-(трис-8-аминокапроновой кислоты) (по номенклатуре ИЮПАК - гидрат Ы-фуллерен-(трис-6-аминогексановой кислоты) формулы
Х-Сбо(Н)з{ПН(СН2)5СООН}з-10 Н2О.
К раствору 60 г (0,08 моль) фуллерена С60 в 4,5 л о-дихлорбензола добавляют 204 г (1,2 моль) тонкоизмельченной безводной калийной соли ε-аминокапроновой кислоты. К полученной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 60°С прибавляют в течение 2 ч смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 500 в соотношении 5:1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 60°С в течение 5 ч до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают несколькими порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенную смесь калиевых солей фуллерен-аминогексановой кислоты и аминогексановой кислоты растворяют в 100 л дистиллированной воды. В раствор медленно при перемешивании добавляют 0,1н. раствор соляной кислоты до рН 5,1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта, затем водный слой декантируют. Осадок, представляющий собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, центрифугируют и промывают водой до рН 6. Осадок высушивают при температуре не выше 60°С в вакуумном сушильном шкафу.
Выход продукта количественный и составляет 115 г.
Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в воде, растворимое в смесях СН3СЫ:Н2О - 1:10 и ДМФА:Н2О - 1:100.
По данным термогравиметрического анализа полученное соединение содержит 10 моль Н2О. При температуре 350°С происходит интенсивное разрушение комплекса. Остаток после разложения содержит фуллерен и продукты его окисления.
ИК-спектр продукта (I) содержит полосы поглощения, характерные для Ν-замещенных аминокислот: группа -СООН- 1704 см-1, 1658 см-1, Ν-Н-валентные колебания 3400 см-1, Ν-Н-деформационные 1552 см-1, полосы поглощения С60-ПН-К- 1104 см-1, 930 см-1, 830 см-1.
Электронный спектр поглощения не содержит полосы поглощения свободного фуллерена.
Элементный анализ соединения показывает следующие соотношения элементов: %С=72,75; %Н=4,70; %Ν=2,32; рассчитано для брутто-формулы С78Н39О^310Н2О: %С=72,38, %Н=4,3, %Ν=3,24.
Количество карбоксильных групп в продукте определялось по реакциям с солями металлов и аминами. По реакции с азотнокислым серебром количественно выделен комплекс состава
С60(Н)з{КН(СН2)5СООАе}3Т0Н2О.
(найдено: %Ад=20.88. %С=57,80, %Ν=2,51, %Н=3,32; рассчитано для С^Н^О^ Ад3(10Н2О) %Ад=20,00, %С=57,88, %Ν=2,60, %Н=3,46).
По реакции с трис-амином получен водорастворимый комплекс состава
Сбо(Н)з{ΝΗ(ΟΗ2)ηΟΟΟ- ЫН3 +С(СН2ОН)3}з (найдено %С=64,88, %Н=4,56,%М=5,08, рассчитано для С.11 7О-,\6 10Н2О:%С=65,2, %Н=4,34, %Ν=5,10).
- 4 020169
Пример 2. Получение гидрата М-фуллерен-(трис-ш-аминоэнантовой кислоты) (по номенклатуре ИЮПАК - гидрат Ы-фуллерен-(трис-7-аминогептановой кислоты) формулы
Ν-θ60(Η)3{ΝΗ(ΟΗ2)6θΟΟΗ}3·8 Н2О.
К раствору 72 г (0,1 моль) фуллерена С60 в 4 л о-дихлорбензола добавляют 182 г (1,2 моль) тонкоизмельченной безводной калийной соли ω-аминоэнантовой кислоты. К полученной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 80°С прибавляют в течение 3 ч смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 500 в соотношении 5:1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 80°С в течение 8 ч до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают несколькими порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенную смесь калиевых солей фуллерен-аминоэнантовой и аминоэнантовой кислот растворяют в 120 л дистиллированной воды. В раствор медленно при перемешивании добавляют 0,1н. раствор соляной кислоты до рН 5,1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта, затем водный слой декантируют. Осадок, представляющий собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, центрифугируют и промывают водой до рН 6. Осадок высушивают при температуре не выше 60°С в вакуумном сушильном шкафу.
Выход продукта количественный и составляет 130 г.
Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в воде, растворимое в смесях СН3СЫ:Н2О - 1:10 и ДМФА:Н2О -1:100.
По данным термогравиметрического анализа полученное соединение содержит 8 моль Н2О. При температуре 450°С происходит интенсивное разрушение комплекса. Остаток после разложения содержит фуллерен и продукты его окисления.
ИК-спектр продукта содержит полосы поглощения, характерные для Ν-замещенных аминокислот: группа -СООН- 1707 см-1, 1650 см-1, Ν-Н-вал.колебания - 3400 см-1, Ν-Н-деформационные - 1552 см-1, полосы поглощения С60-ЛН-К.- 1104, 930, 830 см-1.
Электронный спектр поглощения содержит полосу поглощения при 260 нм.
Элементный анализ продукта показывает следующие соотношения элементов: %С=73,55; %Н=4,60; %Ν=3,18; рассчитанные значения для брутто-формулы С8|Н45О6М(8Н2О): %С=74,82, %Н=4,69, %Ν=3,23.
По реакции с азотнокислым серебром выделена серебряная соль фуллерен-аминокислоты, количественно доказывающая наличие трех аминокислотных фрагментов в составе полученного продукта.
Пример 3. Получение гидрата №фуллерен-(трис-8-аминооктановой кислоты) формулы Ν-06ο(Η)3{ΝΗ(αΗ2)7θΟΟΗ}3·10 Н2О.
Проводят аналогично примеру 1 только вместо тонкоизмельченной безводной калийной соли ε-аминокапроновой кислоты (ω-аминоэнантовой кислоты) используют калиевую соль аминооктановой кислоты. Анализ полученного соединения доказывает представляемый состав комплекса.
Была изучена противовирусная активность соединения в отношении ВИЧ, ВПГ, вируса гриппа, а также противоопухолевая активность. Соединение обладает высокой противоопухолевой и противовирусной активностью в отношении всех названных вирусов. Ниже приведены лучшие примеры осуществления изобретения. В приведенных ниже примерах соединение, полученное способом, описанным в примере 1, названо по тексту препарат № 1 (фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты гидрат).
Пример 4. Изучение активности фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты в отношении вируса иммунодефицита человека.
Исследования проводились в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва. В задачу исследований входило изучение активности препарата в отношении вируса иммунодефицита человека.
К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 ТЦИД50/клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% СО2 и 98% влажности в течение 4-5 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью красителя и световой микроскопии: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синцитийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).
Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой системе знаками + или - соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.
++++ -100%-ная гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение, +++ - 75%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок, ++ - 50%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок, + - 25%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок, +- - начало дегенерации,
- - отсутствие цитодеструкции.
Результаты исследования представлены в табл. 1, 2.
- 5 020169
Полученные данные (табл. 1, 2) показали, что препарат № 1 обладает противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека типа 1 в концентрации 1-10 мкг/мл. ЭК50 (50%эффективная концентрация) предлагаемого препарата 5,0 мкг/мл.
Пример 5. Изучение активности фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты в отношении вируса гриппа.
Исследования проводились в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва. В задачу исследований входило изучение противовирусной активности препарата в культуре клеток МОСК в отношении вируса гриппа А/ПУ-Мо8СО^/01/2009 (Η1Ν1)δ\\Ί.
Препарат разводили в диметилсульфоксиде (ДМСО) (5 мг субстанции + 0,5 мл ДМСО) с последующим добавлением 4,5 мл среды для культур клеток МЕМ, получая т.о. сток в концентрации 1,0 мг/мл. В последующем проводили разведения стоков средой МЕМ до рабочих концентраций 6,5-12,525,0-50,0-100 мкг/мл.
Определение противовирусной активности вещества проводили по снижению репродукции вируса гриппа в культуре клеток МОСК, выявляемой ИФА.
С этой целью клетки МДСК выращивали в 96-луночных планшетах до полного монослоя, отмывали от ростовой среды и вносили вещества в двукратной концентрации в 100 мкл среды МЕМ. Инфицирование вирусом в рабочей дозе 100-1000 ТЦИД50 проводили в двух режимах: через 2 ч после внесения веществ и одномоментно. Планшеты инкубировали в термостате с СО2 в течение 24 ч при 37°С. После инкубации среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в РВБ в течение 15 мин, хорошо высушивали и осуществляли постановку ИФА, проводя последовательно адсорбцию специфических реагентов моноклональных антител, конъюгата и субстрата (ортофенилендиамин). Реакцию учитывали по оптической плотности при 492 нМ на спектрофотометре фирмы Биоком. Каждое разведение вируса исследовали в 3 повторах, для которых вычисляли среднее значение оптической плотности (ОП). Процент ингибирования определяли, как отношение между разницей ОП опыта и ОП клеточного контроля, разделенное на разницу ОП вирусного контроля и ОП клеточного контроля, умноженное на 100%. На основании полученных данных определены значения минимальной концентрации вещества, вызывающей 50% ингибирование вирусной репродукции (МИК50).
Оценку подавления репродукции вируса гриппа Α(Η1Ν1) проводили в 3 опытах при разной множественности заражения. Результаты представлены в табл. 3 (протоколы 3 опытов) и табл. 4 (средние значения полученных результатов 3 опытов).
Как видно из табл. 4, наибольшую активность по снижению репродукции вируса гриппа в культуре клеток МОСК проявила серия препарата 1. Четко прослеживается зависимость степени репродукции и концентрации препарата: с повышением концентрации снижается репродукция вируса. Кроме того, значительных отличий в показателях при разных режимах инфицирования (через 2 ч после внесения препарата или одномоментно) не отмечено. При этом показатели минимальной ингибирующей репродукцию вируса в 2 раза концентрации (МИК50), составили в режиме внесения препарата за 2 ч - 9,5 мкг/мл и при одномоментном внесении - 12,5 мкг/мл. Расчет проведен при графическом построении полученных данных.
Таким образом, полученные результаты изучения активности разных серий препарата № 1 в отношении вируса гриппа А/11У-Мо5СО\у/01/2009 (Η1Ν1)§^1 выявили высокую активность подавления его репродукции в культуре клеток МОСК серией 1, при средней активности - серии 2. При этом режимы внесения препаратов за 2 ч до инфицирования или одновременно с инфицированием не влияли на их активность в культуре клеток МОСК.
Пример 6. Изучение противовирусной активности фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты на модели гриппозной пневмонии мышей.
Исследования выполнялись в центре химии лекарственных средств (ЦХЛС - ВНИХФИ), г. Москва.
В работе использовали препарат № 1 в виде темно-коричневого порошка. Для перорального применения готовили необходимые дозы препарата, растворяя навески в 1% растворе крахмала, сваренного на воде. Для внутрибришинного и внутримышечного применения навески препарата № 1 растворяли в 1,5% растворе диметилсульфоксида.
В работе был использован вирус гриппа А/Аичи/2/69 (Η3Ν2), адаптированный к мышам. Данный вирус широко используется для определения эффективности противовирусных препаратов на модели гриппозной пневмонии мышей и был получен из музея вирусных штаммов и клеточных культур ГУ НИИ вирусологии РАМН. Для подготовки инфицирующего материала мышей заражали интраназально аллантоисным вирусом, после проявления признаков болезни их забивали и в стерильных условиях получали гомогенат легочной ткани. Далее этот гомогенат использовали для заражения 10-дневных куриных эмбрионов, из которых получали аллантоисный вирус и после титрования на его мышах использовали для инфицирования животных.
Белых беспородных мышей (самки) массой 12-14 г получали из питомника Андреевка (Московская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария.
Предварительно взвешенные мыши (самки нелинейные, средний вес 12-14 г) инфицировались интраназально под легким эфирным наркозом вирусом гриппа А/Аичи/2/69 (Η3Ν2) (10ЛД50 в 100 мкл). В
- 6 020169 предварительном опыте было проведено определение ЛД50 путем титрования аллантоисного вируса на таких же мышах, которые затем использовались в основном опыте. Была использована следующая схема лечения исследуемым препаратом: за 24 ч до инфицирования, за 1 ч до инфицирования, через 24 ч и далее 1 раз в день через 24 ч в течение 5 дней. Для перорального введения использовали одноразовый инсулиновый шприц со специальной иглой (лаваж), каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Для внутрибрюшинного и внутримышечного лечения также каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Группа вирусного контроля представляла собой 10 мышей, инфицированных вирусом, но не леченных препаратами. Также в опыте было две группы по 10 неинфицированных мышей, которым вводили внутрибрюшинно и внутримышечно по 100 мкл 1,5% ΌΜ8Θ, который использовался в качестве растворителя препаратов. В остальных группах также изначально было по 10 животных. За леченными и контрольными животными велось ежедневное наблюдение, в первые 5 дней после инфицирования мыши взвешивались каждый день, далее - через день. Химиотерапевтическую активность препарата № 1 на модели гриппозной пневмонии мышей оценивали по трем критериям: показатель защиты от смертельной вирусной инфекции, увеличение средней продолжительности жизни и уменьшение снижение веса в группах животных, леченных препаратом по сравнению с контрольной группой.
Лечение препаратом № 1 было эффективно, уменьшая смертность мышей от гриппозной пневмонии и потерю их веса и увеличивая среднюю продолжительность жизни по сравнению с вирусным контролем. Эффективность данного лечения зависела от дозы препарата и способа лечения. Эффективность перорального лечения фуллерен-трис-аминокапроновой кислотой гидрат увеличивалась с увеличением дозы препарата. Пероральное лечение препаратом № 1 было эффективно, увеличивая среднюю продолжительность жизни в 1,6-1,7 раз. Наиболее эффективным по всем трем параметрам (показатель защиты от смертности, средняя продолжительность жизни и потеря веса) было лечение фуллерен-трисаминокапроновой кислотой гидрат внутримышечно, которое в дозах 100 и 200 мг/кг/день предотвращало гибель 70-80% зараженных животных и потерю их веса, а также увеличивало продолжительность их жизни почти в 2 раза.
Внутрибрюшинное лечение фуллерен-трис-аминокапроновой кислотой было эффективно только в дозах 50 и 100 мг/кг/день. Гибель животных, значительное снижение средней продолжительности жизни и веса мышей при внутрибрюшинном лечении их препаратом № 1 в дозе 200 мг/кг/день дают основание полагать, что данная доза при этом способе введения является токсичной для инфицированных мышей. Результаты представлены в табл. 5, 6.
Пример 7. Изучение протективной активности фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты при экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной вирусами различного происхождения.
Исследования выполнялись в научно-исследовательском институте гриппа, г. Санкт-Петербург.
В работе использовали препарат № 1 в виде черного мелкодсперсного порошка. Навески препарата были растворены в среде для клеточных культур Игла ΜΕΜ (БиолоТ, Санкт-Петербург, кат. № 1.3.3). Из полученного раствора были приготовлены серии разведений на среде ΜΕΜ для определения противовирусной активности образцов в опытах на животных.
В качестве референс-препаратов использовали Ремантадин (1-(1-адамантил)аминоэтил гидрохлорид, Λΐάποίι С11сш. Со., Μί1χν.,\νΐ, са1. № 39.059-3) и тамифлю (этил(3В,4В,58)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоксилат фосфат, НоГГшапп ЬаКосйе, Швейцария).
Вирусы.
В работе были использованы адаптированные к мышам вирусы гриппа следующих штаммов: А/8\\зпе/1976/31 (Η1Ν1) - свиного происхождения;
А/Риейо К1со/8/34 (Η1Ν1) - человеческого происхождения (ремантадин-устойчивый); А/Владивосток/2/09 (Η1Ν1) - человеческого происхождения (тамифлю-устойчивый).
Вирусы пассировали в аллантоисной полости 10-12-дневных куриных эмбрионов в течение 48 ч при 36°С. Штамм А/Владивосток/2/09 (Η1Ν1) предварительно адаптировали к мышам путем трех пар чередующихся пассажей на животных и в куриных эмбрионах.
Для заражения животных была использована вируссодержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционная активность вируса в заражающем материале была определена в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (Ат. 1. Ηγ§., 1938, 27:493-497).
Белых беспородных мышей (самки) массой 14-16 г получали из питомника Рапполово (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария НИИ гриппа РАМН. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животные находились под наблюдением 2 недели.
Исследуемые препараты вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл в следующих дозах: препарат № 1 - 300, 100 и 30 мг/кг, ремантадин - 50 мг/кг, тамифлю - 20 мг/кг веса животных. Препараты вводили по лечебно-профилактической схеме: за 24 и 1 ч до заражения и через 24, 48 и 72 ч после заражения. В качестве плацебо контрольной группе животных вводили физиологический фосфатный буфер.
- 7 020169
В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы.
Вирусы вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 1 и 10 ЕЭ50. В каждую группу наблюдения брали по 25 мышей. На 3 день после заражения 10 животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Из этих 10 легких 5 использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при -20°С до постановки соответствующих экспериментов), оставшиеся 5 фиксировали 10% формалином и использовали для гистологического анализа (см. ниже).
Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в течение 14 дней, т.е. срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных. Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (М, отношение числа павших за 14 дней животных к общему числу зараженных животных в группе), индекс защиты (ΙΡ, отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (ИЬ) из расчета 14 дней наблюдения.
Животных, выживших к 15 суткам после инфицирования, вскрывали и визуально оценивали обширность очагов постгриппозной пневмонии в легких. Размер очагов выражали в процентах от общей поверхности легких.
Клинические признаки заболевания были типичными для гриппозной инфекции и включали затрудненное дыхание, атаксию, тремор, а также снижение потребления корма и воды и, как следствие, веса животных.
Данные по динамике смертности животных в контрольных и опытных группах суммированы в табл. 7-9.
Как видно из представленных результатов, вирус гриппа вызывал летальную инфекцию у белых мышей, сопровождающуюся гибелью животных начиная с 3-4 суток после инфицирования в зависимости от дозы вируса. Такой показатель, как продолжительность жизни животных, был связан с использованной дозой вируса обратной зависимостью. Ремантадин, использованный в опыте как референспрепарат, оказывал при этой инфекции весьма умеренное протективное действие, что проявлялось некоторым снижением смертности в опытных группах по сравнению с контролем (индекс защиты 13-29%) и незначительным увеличением продолжительности жизни (на 1,1-1,6 суток в зависимости от дозы вируса). Полученные данные, таким образом, согласуются с ранее полученными результатами экспериментов ίη νίΐτο и ίη νίνο, свидетельствующих о нечувствительности использованного штамма вируса к ремантадину. Некоторый протективный эффект в этом случае можно объяснить антитоксическим действием препарата.
В то же время препарат сравнения тамифлю проявлял выраженный защитный эффект, как снижая смертность в группах мышей, получавших лечение (приблизительно на 70% по сравнению с контролем), так и увеличивая средний срок жизни животных (на 2-6 суток). Таким образом, использованный вирус оказался устойчив к ремантадину, однако чувствителен к тамифлю.
При анализе полученных данных было обнаружено, что исследованный образец препарата по своим протективным свойствам приближался к препарату сравнения - тамифлю (табл. 7).
Полученные результаты были подтверждены при использовании модели гриппозной пневмонии, вызванной двумя другими штаммами вируса гриппа. Данные этих опытов суммированы в табл. 8, 9.
Как видно из приведенных данных, активность химиопрепаратов в отношении использованных вирусов существенно различалась. Так, в отношении штамма гриппа А/Владивосток/2/09 этиотропный препарат тамифлю оказался неактивен. Таким образом, ранее полученные данные об устойчивости этого изолята к тамифлю были подтверждены в опытах на животных. В то же время активность исследуемого препарата против этого штамма оказалась весьма высокой, что, несомненно, следует рассматривать как преимущество препарата.
Показатель активности исследуемого препарата (индекс защиты - продление срока жизни) составил 21-72% и 0,8-4,4 суток в зависимости от использованного штамма, инфицирующей дозы вируса и дозы препарата.
Для исследования влияния препарата № 1 на репликативную активность вирусов гриппа в ткани легких инфицированных животных на 3 сутки после заражения из легких животных были приготовлены гомогенаты, в которых затем определяли инфекционный титр вируса в культуре клеток. Данные об уровне репликации модельных вирусов гриппа в организме животных приведены в табл. 10.
Как можно заключить из представленных результатов, все три использованные вируса были способны эффективно реплицироваться в легочной ткани мышей, достигая к 3 суткам титров 3,4-6,4 1ο§ιοΕΙΌ50/20 мг в зависимости от использованного штамма и инфицирующей дозы вируса. Применение химиопрепаратов - исследуемого препарата и препаратов сравнения - ограничивало размножение вируса в различной степени. Так, ремантадин не существенно (на 2-3 порядка) снижал инфекционную активность чувствительных вирусов Л/8\уте/1976/31 и А/Владивосток/2/09, однако не проявлял достоверной ингибирующей активности в отношении ремантадин-устойчивого штамма Л/Риейо Ρίοο/8/34. Тамифлю оказался активен против вирусов Л/8\\'ше/1976/31 и Л/РиетЮ Βίοο/8/34. В то же время при тестировании
- 8 020169 его на модели устойчивого штамма А/Владивосток/2/09 было обнаружено некоторое снижение инфекционных титров вируса, однако отличия от контроля были недостоверными.
Препарат исследования проявлял существенную ингибирующую активность против всех исследованных вирусов. Уровень ее не превышал, однако оказался сопоставим с активностью препаратов сравнения - ремантадина и тамифлю. При использовании вирусов, устойчивых к химиопрепаратам, активность исследуемого препарата была значительно выше, чем активность тамифлю против озельтамивирустойчивого штамма А/Владивосток/2/09 и чем активность ремантадина против ремантадин-устойчивого штамма Λ/ΡΡ/8/34.
При изучении особенностей морфогенеза экспериментальной гриппозной инфекции при лечебнопрофилактическом введении препарата № 1 в дозе 300 мг/кг было отмечено, что морфогенез инфекционного процесса в легких животных, получавших препарат, во многом отличался от морфологических изменений в легких контрольных животных. Основное отличие на 3 сутки после инфицирования касалось характера воспалительного экссудата, а именно то, что при одинаковой его интенсивности в нем практически не отмечалось клеток в стадии распада, характерных для острой стадии гриппозной пневмонии. Клеточный компонент экссудата был представлен исключительно интактными нейтрофилами, лимфоцитами и макрофагами. Кроме того, серозный и геморрагический компоненты экссудата были также выражены слабее. Клетки бронхиального эпителия выглядели более сохранными, чем у контрольных животных. Сами очаги воспаления занимали меньшую по сравнению с контролем площадь.
Те же тенденции отмечались и на стадии постгриппозной пневмонии. Очаги поражения легких были существенно ограничены в размерах, при морфологическом исследовании выявлялась умеренная метаплазия эпителия и инфильтрация интерстиции интактными нейтрофилами и круглоклеточными элементами. Следует отметить, что эффект препарата наблюдался при заражении животных любым из трех исследованных вирусов независимо от их чувствительности или устойчивости к препаратам сравнения.
Дополнительным критерием протективного действия препарата № 1 служила оценка размеров очагов хронических поражений легких у животных. Результаты этого теста приведены в табл. 11.
Как видно из приведенных результатов, все три вируса индуцировали формирование в легких стойких очагов хронических поражений, обнаруживаемых визуально у выживших животных на 15 сутки после инфицирования. Препараты сравнения ремантадин и тамифлю - достоверно снижали протяженность очагов постгриппозной пневмонии, вызванной чувствительными к ним вирусами, и были неактивны в случае устойчивых штаммов. В то же время препарат № 1 достоверно снижал этот показатель независимо от использованного вируса.
Таким образом, показано, что при изученных концентрациях (300-30 мг/кг) препарат № 1 проявляет дозозависимую протективную активность на использованных моделях. Эта активность проявлялась в следующих показателях:
6-200-кратное снижение инфекционных титров вируса в ткани легких инфицированных животных;
продление срока жизни зараженных животных (на 0,1-4,4 суток в зависимости от использованного штамма, дозы вируса, партии синтеза и дозы препарата);
снижение специфической смертности в группах опыта на 7-72% в зависимости от использованного штамма, дозы вируса, партии синтеза и дозы препарата;
снижение в 2-4 раза средней протяженности очагов хронической постгриппозной пневмонии.
По совокупности показателей протективная активность препарата № 1 при некоторых дозах оказалась сопоставима с активностью препарата сравнения - ремантадина.
Полученные данные свидетельствуют о наличии у препарата № 1 высокой противогриппозной активности, в том числе в отношении штаммов свиного происхождения, а также в отношении вирусов, устойчивых к применяемым в клинике противогриппозным препаратам: ремантадину и тамифлю.
Пример 8. Исследование противоопухолевой активности препарата фуллерен-трисаминокапроновой кислоты на моделях солидной и асцитной форм карциномы Эрлиха у белых мышей.
Задачами настоящего исследования являлись:
исследование эффекта препарата № 1 на динамику роста асцитной опухоли при внутрибрюшинном введении раковых клеток;
исследование действия препарата № 1 на динамику роста солидной опухоли, исследование влияния препаратов на морфологию и морфометрические показатели солидной формы карциномы Эрлиха;
исследование действия препарата № 1 на апоптотическую активность клеток асцитной формы карциномы Эрлиха.
В работе использовали водный раствор препарата № 1 в двух дозах - в концентрациях 30 и 10 мг/кг. Животным вводили подкожно 0,2 мл раствора каждой из концентраций за 24 ч до инокуляции и далее ежедневно в течение всего срока эксперимента. Конечные концентрации препарата составили 300 и 100 мг/кг веса.
В качестве препарата сравнения использовали цисплатин - противоопухолевый препарат, применяемый в практике онкологической терапии человека. Цисплатин вводили однократно на 2 сутки после перевивки опухоли, учитывая его высокую токсичность. Конечная концентрация цисплатина составила
- 9 020169 мг/кг веса.
Эксперименты проводились на белых беспородных мышах средним весом 20±3 г (животноводческая ферма Рапполово, Лен. область).
Клетки карциномы Эрлиха были получены из музея клеточных линий НИИ онкологии и культивированы в брюшной полости белых мышей. Для этого 0,2 мл клеточной суспензии вводили животным внутрибрюшинно. Через 7-10 дней после инокуляции животных умерщвляли, асцитную жидкость собирали через прокол брюшины, разводили физиологическим раствором в 10 раз и помещали на лед.
С целью моделирования солидной формы карциномы Эрлиха животным вводили подкожно в область правого бедра 0,2 мл клеточной суспензии в течение 40 мин после сбора асцитной жидкости, помещенной на лед. В ходе опыта в течение 28 дней, дважды в неделю начиная с 8 суток после инокуляции, проводили измерение опухолевых узелков при помощи микрометра. Размер опухоли вычисляли умножением половины длины узелка на квадрат ширины и выражали в мм3. Фиксировали также смертность животных в контрольных и опытных группах. На 29 день после перевивки животных умерщвляли.
Для изучения влияния препаратов на асцитную форму опухоли животным вводили внутрибрюшинно 0,2 мл клеточной суспензии в течение не более чем 40 мин после сбора исходной асцитной жидкости. В ходе опыта проводили контроль веса мышей как показателя накопления асцитной жидкости в брюшной полости. Наблюдение за животными осуществляли в течение 16 дней. На 17 день после перевивки животных умерщвляли.
Данные по динамике роста опухоли и смертности животных с асцитной формой корциномы в контрольной и опытных группах представлены в табл. 12.
Как видно из приведенных результатов, инокуляция опухолевых клеток в брюшную полость животных вызывала быстрое накопление в полости асцитной жидкости. Использование лечебных препаратов имело выраженный терапевтический эффект и приводило к торможению накопления асцита.
Лечение животных предлагаемым препаратом и препаратом сравнения - цисплатином - приводило к существенному торможению динамики увеличения веса животных. На поздних стадиях развития процесса эти различия достигали статистически значимых величин.
Влияние препарата на процессы апоптоза в клетках среднего размера и гранулярности асцитной формы карциномы Эрлиха у белых мышей приведены в табл. 13, 14.
Как следует из представленных результатов, лишь небольшая часть клеток в обеих опухолевых субпопуляциях находилась в стадии обратимого или необратимого апоптоза у контрольных животных. Применение цисплатина приводило к резкому возрастанию доли клеток в ранней стадии апоптоза среди иммунных клеток (табл. 13) и позднего апоптоза и некроза - среди опухолевых клеток (табл. 14).
Препарат № 1 действовал на уровне цисплатина: подобно препарату сравнения, он стимулировал ранний апоптоз в иммунных клетках и поздний апоптоз - в субпопуляции опухолевых клеток. Живых (Άην-7ΛΛΌ-) клеток опухоли при воздействии препарата практически не оставалось. По уровню индукции некроза в клетках опухоли он даже превосходил цисплатин (30,2% против 26,6% для цисплатина). Механизм противоопухолевого действия препарата № 1, как и действия цисплатина, заключался в индуцировании апоптотических процессов в опухолевых и иммунных клетках, составляющих асцит. Процесс апоптоза шел избирательно и достоверно быстрее в клетках опухоли, чем в нейтрофилах и лимфоцитах, находящихся в асцитной жидкости.
Результаты цитофлюорометрического анализа позволяют говорить об избирательности действия препарата сравнения - цисплатина - на клетки опухоли по сравнению с нормальными лейкоцитами, также присутствующими в составе асцитной жидкости. На одном и том же сроке после введения препарата нормальные клетки, составляющие фракцию среднего размера и гранулярности - нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты и др., - находились в стадии раннего апоптоза, а опухолевые клетки - позднего (необратимого) апоптоза или некроза.
Данные по динамике развития солидной опухоли под действием исследуемого препарата и препарата цисплатин в сравнении с контрольной группой животных представлены в табл. 15.
Как видно из представленных результатов, все использованные препараты в той или иной степени тормозили рост опухоли на протяжении всего опыта. В целом, наиболее выраженным противоопухолевым действием обладал цисплатин. Достоверное ингибирование роста опухоли отмечалось при его применении вплоть до 17 суток после перевивки.
В то же время обе серии препарата также проявляли дозозависимый антитуморогенный эффект. Достоверное снижение размеров опухоли и торможение ее роста отмечались до 8 суток эксперимента. В дальнейшем препараты также сдерживали рост опухоли на всех сроках исследования, хотя различия с контролем и не достигали статистической достоверности. В целом следует отметить препарат № 1 в дозе 100 мг/кг веса как наиболее близкий по эффективности к цисплатину практически на всех сроках эксперимента.
Полученные результаты не позволяют рассматривать препарат № 1 как ведущий препарат для направленной терапии онкологической патологии. Однако на основании этих данных можно говорить о нем как о перспективном для дальнейшей разработки средстве комплексной терапии для совместного применения с другими противоопухолевыми препаратами, в особенности при асцитных формах опухо
- 10 020169 лей.
Фармацевтические готовые формы предлагаемого препарата могут применяться орально, парентерально (включая подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутриягодичные инъекции или вливания), путем ингаляционного распыления или ректально для терапии или профилактики вирусных инфекций, таких как ВИЧ, герпес, грипп различного происхождения, а также в качестве противоопухолевых препаратов для проведения комплексной терапии.
Соединения смешивают с обычными фармацевтическими носителями и эксципиентами и используют в форме таблеток, капсул, свечей, мазей, эмульсий, растворов, спреев. Следует отметить, что для приготовления растворов, спреев, а также мягких лекарственных форм (мазей, свечей) соединения предварительно разводят в смеси ДМСО с водой.
Лечение инфекционных заболеваний путем воздействия фармацевтически приемлемых доз соединениями по формуле (I) осуществляется одновременно на несколько вирусов (в случае микст-инфекций) и затрагивает различные стадии репликации вируса. Показано, что лечение сопровождается снижением стрессового эффекта на введение препарата, усилением антиоксидантной защиты организма от инфекций, выведением из организма токсинов. Интоксикация организма характерна для течения ряда вирусных инфекций и обусловливает тяжесть заболевания.
Возможны сочетания соединений формулы (I) с другими антивирусными агентами, иммуномодуляторами, противоинфекционными агентами или вакцинами в различных комбинациях с любыми фармацевтическими составами, предназначенными для лечения.
Таблица1 Исследование цитотоксичности предлагаемого препарата на модели лимфобластоидных клеток человека
Условия опыта, концентрация, мкг/мл Жизнеспособность клеток,% Количество кле- ток х103/мл
Контроль клеток 96 833
Препарат № 1 0,5 95 633
1,0 94 599
5,0 96 530
10,0 92 500
100 70 433
Таблица 2 Исследование противовирусной активности препарата № 1 на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1
Условия опыта Концентрация, мкг/мл Жизнеспособность клеток, % Количество клеток х 103/мл ЦПЭ/син цитии (+)
Контроль клеток 0 96 833 0
Контроль вируса 0 20 83,5 4,0
Препарат № 1 0,5 27 133,2 4,0
1,0 75 320,4 2,0
5,0 92 480,0 0
10 95 529,3 0
- 11 020169
Таблица 3
Результаты изучения активности препарата № 1 в отношении вируса гриппа А/11У-Мо5СО\у/01/2()()9 (Η1Ν1)5\\Ί
Концентрации препаратов (мкг/мл) Внесение препарата Снижение (%) репродукции вируса гриппа в культуре клеток МОСК по отношению к контролю в присутствии серий предлагаемого препарата
6,25 за 2 часа до инфици- рования 24,0 - 80,0 - 0
одномоментно с инфицированием 54,0-21,0
12,5 за 2 часа до инфици- рования 45,0 - 100 - 6,0
одномоментно с ин- фицированием 78,0 -37,0
25,0 за 2 часа до инфици- рования 40,0- 100-43,0
одномоментно с ин- фицированием 88,0 -35,0
50,0 за 2 часа до инфици- рования 47,0 - 77,0 - 69,0
одномоментно с инфицированием 96,0 - 43,0
100,0 за 2 часа до инфици- рования 72,0 - 88,0 - 66,0
одномоментно с ин- фицированием 69,0 - 76,0
- 12 020169
Таблица 4
Результаты изучения активности препарата № 1 в отношении вируса гриппа А/ПУ-Мо8Соте/01/2009 (Η1Ν1)5\\Ί. средние показатели
Концентрации препаратов (мкг/мл) Внесение препарата Снижение (%) репродукции вируса гриппа в культуре клеток МОСК по отношению к контролю в присутствии серий предлагаемого препарата
6,25 за 2 часа до инфици- рования 35,0
одномоментно с ин- - фицированием 38,0
12,5 за 2 часа до инфици- рования 50,0
одномоментно с инфицированием 58,0
25,0 за 2 часа до инфици- рования 61,0
одномоментно с инфицированием 62,0
50,0 за 2 часа до инфици- рования 64,0
одномоментно с ин- фицированием 70,0
100,0 за 2 часа до инфици- рования 75,0
одномоментно с ин- фицированием 73
Таблица 5 Эффективность фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты гидрат на модели гриппозной инфекции у мышей
Доза препарата Данные на 16 день наблюдения Средняя продолжительность жизни (дни)**
Выживаемость абсолютная (выжившие/общее) Смертность (%) Показатель защиты от смертности (%)
Фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты гидрат перорально
100 мг/кг/день 5/10 50 40 10,4(2-7 д„ 1-9 д, 1-Юд.)
200 мг/кг/день 7/10 30 60 13,0 (1-7д, 1-10д, 1-Ид.)
Фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты гидрат внутримышечно
50 мг/кг/день 6/10 40 50 12,4 (1-7д, 1-9д, 2-11д.)
100 мг/кг/день 8/10 20 70 13,5 (1-8д, 1-9д.)
200 мг/кг/день 9/10 10 80 14,4(1-10д.)
1,5% раствор ОМ8О 10/10 0 >16
Фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты гидрат внутрибрюшинно
50 мг/кг/день 5/10 50 40 11,5 (1-5д,1-7д, 3-11д.)
100 мг/кг/день 5/10 50 40 11,0 (3-7д,1-8 д, 1-Ид.)
1,5% раствор ϋΜ8Ο 10/10 0 >16
Вирусный контроль (10Εϋ50) 1/10 90 7,3 (5-7д, 4-8 д.)
* Схема лечения: за 24 и 1 ч до заражения, далее через 24, 48, 72 и 96 ч после заражения.
** Среднюю продолжительность жизни определяли по формуле Σ£(4-1)/η, где £ - количество мышей, умерших на день 4 (выжившие мыши включены в £ и 4 в этом случае равно 16), η - количество мышей в группе.
- 13 020169
Таблица 6
Изменение веса животных, зараженных вирусом гриппа А/Аичи/2/69 и леченных препаратом № 1
Доза препарата Изменение веса в % по дням после инфицирования
1 день 2 день 3 день 4 день 5 день 7 день 9 день 11 день 13 день
Фуллерен-трис-аминокапроновая кислота перорально
100 мг/кг/день +12 +17 +23 +25 +24 +21 +23 +34 +44
200 мг/кг/день +15 +20 +23 +25 +24 +22 +25 +45 +57
Фуллерен-трис-аминокапроновая кислота внутримышечно
50 мг/кг/день +9 +14 +21 +26 +30 +27 +38 +64 +74
100 мг/кг/день +13 +17 +23 +28 +31 +39 +65 +71 +82
200 мг/кг/день +11 +20 +26 +35 +39 +43 +51 +62 +70
Фуллерен-трис-аминокапроновая кислота внутрибрюшинно
50 мг/кг/день +11 +17 +22 +25 +28 +35 +41 +67 +77
100 мг/кг/день +9 +15 +19 +21 +21 +27 +37 +50 +82
Вирусный контроль +18 +16 +9 +1 -8 +3 +56 +72 +74
Таблица 7
Протективная активность фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты на модели экспериментальной летальной гриппозной пневмонии, вызванной ремантадин-устойчивым вирусом гриппа А/Риейо Ктсо/8/34 (Η1Ν1)
Препарат, доза Доза ви- руса, Кол-во животных в группе Кол-во оставшихся в живых Средняя продолжительность жизни (СПЖ), сут. Смертность, % Индекс защиты, % Увеличе- ние спж, сут·
1 2 3 4 5 6 7 8
Препарат № 1, 300 мг/кг 10 14 8 11,3 42,9 49,4 3,2
1 15 12 13,7 20,0 57,1 1,3
Сумма доз 29 20 12,5 31,0 51,7 2,2
Препарат № 1, 100 мг/кг 10 15 6 11,3 60,0 29,1 3,2
1 15 12 13,9 20,0 57,1 1,6
Сумма доз 30 18 12,6 40,0 37,8 2,2
Препарат № 1, 30 мг/кг 10 15 4 10,4 73,3 13,3 2,3
1 14 9 13,3 35,7 23,5 1,0
Сумма доз 29 13 11,8 55,2 14,2 1,4
Реманта- дин 10 15 4 9,7 73,3 13,3 1,6
1 15 10 13,5 33,3 28,6 1,1
Сумма доз 30 14 11,6 53,3 17,0 1,2
Тамифлю 10 15 11 13,5 26,7 68,5 5,5
1 13 11 14,4 15,4 67,0 2,1
Сумма доз 28 22 13,9 21,4 66,7 3,6
Контроль вируса 10 13 2 8,1 84,6 — 0,0
1 15 8 12,3 46,7 ___ 0,0
Сумма доз 28 10 10,4 64,3 | — 0,0
- 14 020169
Таблица 8 Протективная активность фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты на модели экспериментальной летальной гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа А/8^1пе/1976/31 (Η1Ν1)
Препарат, доза Доза вируса, ЬОзо Кол-во животных в группе Кол-во оставшихся в живых Средняя продолжительность жизни (СПЖ), сут. Смерт ность, % Индекс защиты, % Увеличение СПЖ, сут.
1 2 3 4 5 6 7 8
Препарат К» 1, 300 мг/кг 10 14 8 11,0 42,9 53,8 4,4
1 14 11 13,6 21,4 59,8 3,0
Сумма доз 28 19 12,3 32,1 55,6 3,7
Препарат № Е 100 мг/кг 10 13 6 10,3 53,8 42,0 3,7
1 15 11 13,1 26,7 50,0 2,5
Сумма доз 28 17 11,8 39,3 45,7 3,1
Препарат № 1, 30 мг/кг 10 15 4 8,9 73,3 21,0 2,4
1 15 9 12,3 40,0 25,0 1,7
Сумма доз 30 13 10,6 56,7 21,7 1,9
Ремантадин 10 15 9 11,8 40,0 56,9 5,2
1 15 13 14,3 13,3 75,0 3,7
Сумма доз 30 22 13,1 26,7 63,2 4,4
Тамифлю 10 13 8 11,0 38,5 58,6 4,4
1 13 11 13,5 15,4 71,2 2,9
Сумма доз 26 19 12,2 26,9 62,8 3,6
Контроль ви- руса 10 14 1 6,6 92,9 ___ 0,0
1 15 7 10,6 53,3 — 0,0
Сумма доз 29 8 8,7 72,4 ... 0,0
Таблица 9 Протективная активность фуллерен-трис-аминокапроновой кислоты на модели экспериментальной летальной гриппозной пневмонии, вызванной озельтамивир-устойчивым вирусом гриппа А/Владивосток/02/09 (Η1Ν1)
Препарат, доза Доза виру- са, ЬО50 Кол-во животных в группе Кол-во оставшихся в живых Средняя продолжительность жизни (СПЖ), сут. Смертность, %- Индекс защиты, % Увеличение СПЖ, сут.
1 2 3 4 5 6 7 8
Препарат ЛЬ 1, 300 мг/кг 2 13 10 13,8 23,1 61,5 2,4
0,4 13 12 14,5 7,7 71,8 1,4
Сумма доз 26 22 14,2 15,4 64,1 1.8
Препарат К° 1, 100 мг/кг 2 12 8 13,3 33,3 44,4 1,9
0,4 10 8 14,0 20,0 26,7 0,8
Сумма доз 22 16 13,6 27,3 36,4 1,3
Препарат № 1, 30 мг/кг 2 12 7 13,2 41,7 30,6 1,8
0,4 13 И 14,2 15,4 43,6 1,0
Сумма доз 25 18 13,7 28,0 34,7 1,4
Тамифлю 2 10 5 11,7 50,0 16,7 0,3
0,4 9 7 13,4 22,2 18,5 0,3
Сумма доз 19 12 12,5 36,8 14,0 0,2
Ремантадин 2 13 12 14,6 7,7 87,2 3,2
0,4 13 13 15,0 0,0 100,0 1,8
Сумма доз 26 25 14,8 3,8 91,0 2,5
Контроль вируса 2 10 4 11,4 60,0 ... 0,0
0,4 11 8 13,2 27,3 ___ 0,0
Сумма доз 21 12 12,3 42,9 — 0,0
- 15 020169
Таблица 10
Инфекционная активность вирусов гриппа в ткани легких белых мышей в условиях применения химиопрепаратов
Препарат, доза Инфекционный титр вируса ((осдгЕГОзп/ЗО мг ткани) при дозе вируса (Ι,Οτχ)
А/8Мпе/1976/31 (Η1Ν1) Л/Риепо Κίοο/8/34 (Η1Ν1) А/Владивосток/2 /09 (Η1Ν1)
1 5 1 5 0,4 2
Препарат № 1, 300 мг/кг 3,7±0, 3 4,1±0, 2 3,2±0, 3 4,1±0, 2 1,8±0, 2 2,9±0, 2
Ремантадин 2,9±0, 2 3,4±0, 3 4,5±0, 2 5,1±0, 3 1,2±0, 2 2,0±0, 3
Тамифлю 3,1±0, 1 3,8±О, 3 2,2±0, 4 2,4±0, 3 2,5±0, 2 3,1±0, 3
Контроль вируса 6,0±0, 0 6,4±0, 2 4,9±0, 3 5,5±0, 2 3,4±0, 4 4,0±0, 3
* Отличия от контроля достоверны при р<0,05.
Таблица 11 Инфекционная активность вирусов гриппа в ткани легких белых мышей в условиях применения химиопрепаратов
Препарат Размер очагов хронической постгриппозной пневмонии (% от общей площади легких) при заражении вирусом (меньшая из использованных доз)
А/8Мпе/1976/31 (Η1Ν1) А/РиеПо Исо/8/34 (Η1Ν1) А/Владивост ок/2/09 (Η1Ν1)
Препарат № 1, 300 мг/кг 25±7 13±3 7±2
Ремантадин 16±5 32±7 10±2
Тамифлю 20±5 15±4 15±5
Контроль ви- руса 54±7 41±6 27±8
* Отличия от контроля достоверны при р<0,05.
Таблица 12
Динамика веса животных с асцитной формой карциномы Эрлиха при лечении препаратами
Срок после перевивки опухоли, сут. Вес животных (г)
Используемый препарат
Препарат № 1 Цисплатин Контроль без препаратов
1 18,6±2,3 19,1 ±2,5 19,2±2,7
3 18,8±2,2 19,3±2,7 19,3±2,7
5 18,8±1,9 19,4±2,5 19,5±2,8
8 19,4±1,7 19,8±2,2 20,0±2,7
10 19,9±1,7 20,7±2,4 20,8±2,7
13 20,4±1,5 21,4±1,5 21,9±2,6
15 20,4±1,4* 21,8±1,6 23,8±2,2
* Отличия от контроля без препарата на соответствующем сроке достоверны при р<0,05.
- 16 020169
Таблица 13
Препарат Процент клеток с фенотипом
ЛлУ’7Л.А1У (живые клетки) Р АпУ+ 7ΑΑϋ' (ранний апоптоз) Р Ал V' 7АА1)’ (поздний апоптоз) Р ЛпУУЛАГУ (некроз) Р
Препарат № 1 6,1+6,2 0, 0 0 31,1+10,4 0, 0 2 4,2+2,4 0, 1 7 0,4+0,4 0, и
Цисплатин 55,2+11,0 0, 0 0 41,1+11,3 0, 0 0 3,5+2,4 0, 0 7 0,1+0,2 0, 03
Контроль без препаратов 82,6=7.7 - 9,7+6,3 - 6,6+2,9 - 1,0+0,8 -
Таблица 14
Влияние препаратов на процессы апоптоза в клетках крупного размера и гранулярности асцитной формы карциномы Эрлиха у белых мышей
Препарат Процент клеток с фенотипом
АпУ7ААО’ (живые клетки) Р АпУ* 7 ААЛ'(ранний апоптоз) Р АпУ* 7ААГУ (поздний апоптоз) Р АпУ7ААЭ+ (некроз) Р
Препарат № 1 0,3+0,1 о, 0 0 0,1+0,1 0, 0 2 69,5+5,8 0, 0 0 30,2+5,9 0, 0 0
Цисплатин 0,4+0,2 о, 0 0 0,3+0,3 0, 0 2 72,8+10,9 о, 0 0 26,6+11,1 о, 0 1
Контроль без препаратов 89,6+7,3 3,6+2,8 - 6,7+4,8 - 0,2+0,2 -
Таблица 15
Динамика размера солидной опухоли карциномы Эрлиха у белых мышей при лечении исследуемыми препаратами
Препарат, доза (мг/кг веса) Размер опухоли (мм3), сутки после перевивки
8 13 17 21 24 28
Контроль 156,6 711,7 1250,3 1902,1 2296,5 2888,2
Препарат № 1, 300 72,7 416,3 1224,6 1703,4 2048,5 2525,7
Препарат № 1, 100 72,5 544,3 693,6 1250,8 1654,3 2239,8
Цисплатин 56,5 249,2 464,3 1071,9 1743,3 1269,4
* Отличия от контроля без препарата достоверны при р<0,05.
Пример 9. Исследование хронической токсичности фуллерен-(трис-аминокапроновой кислоты) гидрат на крысах при внутримышечном введении в течение 30 дней.
Эксперимент проводился в ФГУН Научно-исследовательском центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (ФГУН НИЦ ТБП ФМБА России), г. Серпухов.
Целью исследования явилась экспериментальная оценка уровня и характера возможного повреждающего действия фуллерен-(трис-аминокапроновой кислота) гидрат на организм крыс при внутримышечном введении в течение 30 дней.
Опыты проводили на крысах линии Вистар, приобретенных в питомнике ГУ НЦБТ РАМН (филиал Столбовая). Содержание животных соответствовало санитарным правилам, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., по устройству, оборудованию, содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Кормили животных натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. Животные прошли карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение 5 дней.
Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя.
Исследуемую субстанцию вводили крысам внутримышечно ежедневно в течение 30 дней в дозах 3, 9 или 20 мг/кг в виде растворов различных концентраций в 20% растворе диметилсульфоксида (ДМСО).
- 17 020169
Животным контрольных групп вводили 20% раствор ДМСО. Рабочие растворы субстанции и ДМСО готовили ежедневно непосредственно перед применением. Вводимые объемы доз корректировали с учетом индивидуальной массы тела животного после каждого взвешивания. Каждая доза испытана на 20 животных (10 самок и 10 самцов).
Для оценки токсического действия фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата, через 24 ч после окончания курса введения субстанции, половину животных из каждой группы вывели из эксперимента для проведения гематологических, биохимических и патоморфологических исследований. Вторую половину опытных животных вывели из эксперимента после периода отмены введения субстанции и провели аналогичные исследования.
В период введения субстанции и в течение 14 дней после ее отмены ежедневно оценивали общее состояние и клинические симптомы интоксикации животных. Общее состояние животных оценивали по их двигательной активности, потреблению корма и воды, состоянию шерсти и видимых слизистых оболочек, массе тела.
Гематологический анализ проводили с помощью полуавтоматического двухканального кондуктометрического счетчика клеток Нета-зсгееп 13 (НокрЕех П1адпо811С8, Италия), а также с помощью световой микроскопии.
Биохимические показатели сыворотки крови определяли с помощью полуавтоматического анализатора 81а1 Бах 3300.
Биохимические показатели мочи определяли с помощью полуавтоматического анализатора Цлзуз 1100.
Морфологическое состояние внутренних органов животных определяли визуально при патологоанатомическом вскрытии и микроскопическим изучением гистологических препаратов (парафиновые срезы 4-5 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином).
Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили методами вариационной статистики по критерию Стьюдента.
1. Результаты исследований.
1.1. Результаты клинического наблюдения.
Крысам ежедневно в течение месяца внутримышечно вводили фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат в дозах 3, 9 или 20 мг/кг. На всех дозах клинические симптомы отравления отсутствовали, общее состояние животных опытных и контрольных групп не различалось. Прирост массы тела крыс в течение всего опыта в экспериментальных группах достоверно не отличался от контроля (табл. 16).
Таблица 16 Масса тела крыс в период введения и отмены фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Дни наблюдения Контроль ДМСО фуллерен-(трис-аминокапроновой кислота) гидрат, мг/кг
3 9 20
Самцы (М ± ш)
0 196,6+3,3 193,6+3,4 196,6+4,2 193,4+4,1
7 231,8+4,4 224,6+5,2 233,6+7,4 227,0+5,0
14 271,4+5,3 255,6+6,9 270,4+10,6 266,6+5,7
21 291,0+5,3 273,6+7,6 290,0+14,4 288,2+6,8
28 314,4+5,9 291,2+9,5 307,6+15,9 306,6+8,1
35 336,0+10,2 307,2+14,9 346,4+13,7 333,6+8,7
42 342,8+13,2 315,6+16,8 360,4+12,1 349,6+9,5
Самцы (М ± т)
0 176,0+3,2 179,6+3,6 180,4+3,4 175,4+4,0
7 192,4+4,9 192,6+4,5 197,0+4,9 192,8+4,0
14 212,4+6,0 210,8+4,9 215,2+6,0 213,0+3,7
21 222,4+6,7 223,8+5,1 227,4+5,7 221,6+3,8
28 237,6+6,6 234,4+4,0 240,2+6,1 234,4+4,4
35 250,0+12,7 251,6+6,0 254,4+12,7 246,8+7,2
42 252,8+13,3 258,8+5,1 260,4+12,3 253,6+5,6
1.2. Результаты биохимического анализа сыворотки крови.
По окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата у самцов крыс показано достоверное снижение уровня мочевины на максимальной испытанной дозе (табл. 17). Показанные изменения концентрации холестерина на минимальной и средней дозе не связаны с действием исследуемой
- 18 020169 субстанции и не выходят за пределы физиологической нормы. У самок крыс показано незначительное, но достоверное повышение активности аланинаминотрансферазы на максимальной испытанной дозе. Выявленные изменения уровня глюкозы на минимальной дозе, концентрации общего белка и холестерина на средней дозе субстанции не имеют дозовой зависимости и не выходят за пределы физиологической нормы.
Таблица 17
Биохимические показатели сыворотки крови крыс по окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Параметр, ед. измерения Контроль (ДМСО) фуллерен-(трис-аминокапроновой кислота) гидрат, мг/кг
3 9 20
Самцы (М ± ш)
1 2 3 4 5
Общий бе- лок, г/л 95,6±9,59 86,88±5,28 102,1±34,65 82,08±9,28
Глюкоза, ммоль/л 6,28±0,29 6,88±О,73 6,4±1,02 7,0±1,26
Мочевина, ммоль/л 12,94±1,77 10,66±2,89 11,36±2,71 9,22±1,56*
Холестерин, ммоль/л 5,42±0,71 4,17±0,68* 3,88±0,75* 4,96±1,03
Билирубин, мкмоль/л 8,9б±2,84 9,98±1,67 9,16±1,4 8,76±1,54
Креатинин, мкмоль/л 75,36±8,81 85,58± 17,46 82,06±21,99 75,6±15,51
АлАТ, Е/л 15,52±3,17 17,12±1,2 14,62±4,22 14,04±3,01
- 19 020169
АсАГ, Е/л 28,56±5,94 25,18+3,95 29,34+3,8 24,44+5,48
Щелочная фосфотаза, Е/л 343±89 333+48 300+56 283+67
Самки (М ± т)
Общий бе- лок, г/л 79,0±7,18 81,64+11,03 68,94+2,97* 83,16+11,75
Глюкоза, ммоль/л 5,64±0,72 7,64+1,56* 6,36+0,67 6,46+0,51
Мочевина, ммоль/л 9,88±1,8 8,0+4,04 10,02+1,46 9,48+1,86
Холестерин, ммоль/л 3,бб±0,34 4,11+0,45 4,42+0,56* 4,16+0,88
Билирубин, мкмоль/л 7,52±2,86 10,96+2,14 9,46+2,26 7,18+0,95
Креатинин, мкмоль/л 70,1±16,19 56,44+3,3 52,46+5,77 53,78+8,31
АлАТ, Е/л 10,52±1,01 10,7+1,57 12,52+2,11 13,52+1,4*
АсАТ, Е/л 22,75±1,37 27,51+5,11 24,02+2,64 21,47+3,09
Щелочная фосфотаза, Е/л 227+191 143+47 159+28 248+107
* Статистически достоверно по ΐ-критерию Стьюдента.
Достоверное снижение концентрации креатинина на максимальной испытанной дозе показано по окончании периода отмены фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата у самцов и самок крыс. На этой же дозе показано изменение активности аспартатаминотрансферазы и у самцов, и у самок крыс, однако в случае самцов - это снижение активности, а у самок - повышение активности (табл. 18).
- 20 020169
Таблица 18
Биохимические показатели сыворотки крови крыс после отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Параметр, ед. измереНИЯ Контроль (ДМСО) фуллерен-(трис-аминокапроновой кислота) гидрат, мг/кг
3 9 20
Самцы (М ± ш)
1 2 3 4 5
Общий белок, г/л 70,08±7,11 67,20±7,60 68,06±7,27 66,58±2,67
Глюкоза, ммоль/л 6,04±0,5б 6,54±1,03 7,18±0,80* 6,40±0,93
Мочевина, ммоль/л 7,52±0,74 7,96±1,05 7,14±1,59 8,52±0,99
Холестерин, ммоль/л 4,70±0,88 4,06±0,25 4,25±0,72 4,57±0,54
Билирубин, мкмоль/л 15,72±7,74 20,32±5,19 16,06±2,72 17,30±2,11
Креатинин, мкмоль/л 57,46± 12,35 51,10±7,11 48,12±10,16 41,86±4,09*
АлАТ, Е/л 22,44±2,31 21,18±5,54 21,52±2,68 24,38±2,22
АсАТ, Е/л 19,53±2,04 18,18±1,39 18,08±2,64 1б,18±1,83*
Щелочная фосфотаза, Е/л 258±46 263±71 255±48 238±61
Самки (М ± т)
Общий белок, г/л 70,92± 10,67 71,12±6,66 78,48±8,94 72,76±8,11
Глюкоза, ммоль/л 6,82±1,32 7,62±0,69 6,78±0,97 6,90±1,23
Мочевина, ммоль/л 8,46±1,15 7,20±2,43 7,94±1,25 9,4±2,93
Холестерин, ммоль/л 4,49±0,95 4,2б±1,04 5,02±1,7 5,67±1,2
Билирубин, мкмоль/л 11,9±5,65 13,0±3,07 11,8±1,18 11,28±1,91
Креатинин, мкмоль/л 74,14± 18,21 63,76±16,67 55,84±9,94 50,26±5,04
АлАТ, Е/л 16,52±3,23 14,36±5,02 14,44±2,86 17,82±3,11
АсАТ, Е/л 14,29±2,5 16,84±1,27 17,68±2,87 18,41 ±2,85*
Щелочная фосфотаза, Е/л 219±58 168±54 218±44 221±36
* Статистически достоверно по ί-критерию Стьюдента.
Оценивая результаты анализа биохимических показателей сыворотки крови крыс, в период введения субстанции и после периода отмены введения, следует отметить, что величины вышеописанных изменений показателей сыворотки крови у самок и самцов крыс не выходят за пределы физиологического диапазона для вида животных.
1.3. Результаты гематологического анализа крови.
По окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата не выявлены изменения гематологических показателей, связанные с исследуемой субстанцией. Так, у самок крыс установлено незначительное снижение среднего объема эритроцита на средней дозе и некоторое увеличение доли ретикулоцитов на минимальной дозе (табл. 19). Данные изменения не выходят за границы физиологической нормы и не имеют дозовой зависимости.
- 21 020169
Таблица 19
Гематологические показатели крови крыс по окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Параметр, ед. измерения Контроль (ДМСО) фуллерен-(трис-аминокапроновой кислота) гидрат, мг/кг
3 | 9 1 20
Самцы (М ± ш)
1 2 3 4 5
Гемоглобин, моль/дм3 8,4+0,8 7,8+0,3 8,1+1,6 8,0+1,0
Эритроциты, млн/мм3 5,7+1,0 6,0+0,6 6,0+0,9 6,3+0,7
Гематокрит, % 32,3+7,1 35,4+3,4 35,0+5,3 35,3+4,3
Ср. объем эритр., мкм3 57,0+5,1 59,0+2,7 58,2+4,5 55,6+1,5
Ретикулоциты, % 3,8+0,8 4,0+0,6 3,8+0,9 4,4+0,8
Тромбоциты, тыс. 692,6+93,7 692,6+98, 2 699,8+181, 2 766,2+85, 1
Лейкоциты, тыс./мм3, в т.ч.: 22,9+4,1 22,8+1,5 24,6+5,2 23,3+3,8
Базофилы, % 0 0 0 0
Эозинофилы, % 0,8+1,1 0,8+1,1 1,0+1,2 0,8+1,1
Юные, % 0 0 0 0
Палочкоядерные, % 1,6+1,7 1,6+0,9 1,0+1,2 1,2+1,1
Сегментоядерные, % 24,4+3,6 28,4+7,8 21,5+4,4 24,4+3,8
Лимфоциты, % 67,6+5,0 64,8+5,8 71,0+2,6 68,0+5,1
Моноциты, % 5,6+2,2 4,8+2,3 5,5+1,9 5,6+0,9
Самки (М ± ш)
Гемоглобин, моль/дм3 8,0+0,2 7,7+0,6 7,8+0,9 8,1+1,0
Эритроциты, млн/мм3 5,4+0,6 6,0+0,8 6,3+0,7 6,3+0,8
Гематокрит, % 32,0+2,3 32,8+5,2 34,4+3,2 35,7+4,0
Ср. объем эритр., мкм3 59,6+3,1 57,8+5,0 55,0+1,9* 57,4+3,6
Ретикулоциты, % 5,1+0,5 6,6+0,5 * 4,9+0,3 4,8+0,3
Тромбоциты, тыс. 538,4+126, 8 439,0+104, 0 505,0+75, 7 542,4+91, 2
Лейкоциты, тыс./мм3, в т.ч.: 21,7+8,4 21,4+4,7 20,4+8,8 19,7+3,2
Базофилы, % 0 0 0 0
Эозинофилы, % 1,6+1,7 2,0+2,0 2,0+2,4 1,2+1,1
Юные, % 0 0 0 0
Палочкоядерные, % 2,0+1,4 1,2+1,1 0,8+1,1 1,6+0,9
Сегментоядерные, 21,2+5,0 20,8+5,4 18,8+5,0 18,4+3,6
* Статистически достоверно по ΐ-критерию Стьюдента.
Изучение гематологических показателей крыс по окончании периода отмены фуллерен-(трисаминокапроновая кислота) гидрата не выявило достоверных отличий между контрольными и опытными животными (табл. 20).
- 22 020169
Таблица 20
Гематологические показатели крови крыс после отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Параметр, Контроль (ДМСО) фуллерен-(трис-аминокапроновой кисло- та) гидрат, мг/кг
ед, измерения 3 9 Ί 20
Самцы (М ± т)
1 2 3 4 5
Гемоглобин, моль/дм3 7,9+0,7 8,3+3,7 7,9+0,3 7,4+0,8
Эритроциты, млн/мм3 6,3+0,6 6,5+1,2 6,4+0,5 6,3+0,8
Гематокрит, % 33,0+2,6 33,7+1,7 34,1+2,1 31,2+3,5
Ср. объем эритр., мкм3 52,8+2,5 52,0+1,6 53,4±4,6 50,4+1,5
Ретикулоциты, % 4,0+0,6 4,3+1,1 4,0+0,3 4,2+0,5
Тромбоциты, тыс. 496,6+48,9 445,6+55,8 479,8+43,8 447,0+86,9
Лейкоциты, тыс./мм3, в т.ч.: 22,5+3,6 22,0+6,8 19,6+2,5 24,8+6,2
Базофилы, % 0 0 0 0
Эозинофилы, % 0,8+1,1 0,8+1,1 0,8+1,1 0,8+1,1
Юные, % 0 0 0 0
Палочкоядерные, % 1,6+1,7 1,6+0,9 1,6+1,7 1,2+1,1
Сегментоядерные, % 24,4+3,6 28,4+7,8 21,6+3,8 24,4+3,8
Лимфоциты, % 67,6+5,0 64,8+5,8 71,0+2,2 68,0+5,1
Моноциты, % 5Д6±2?2 4,8+2,3 5,0+2,0 5,6+0,9
Самки (М ± т)
Гемоглобин, моль/дмэ 8,1+0,6 7,7+0,7 8,2+0,3 8,5+0,6
Эритроциты, млн/мм3 5,9+0,7 5,8+0,3 6,3+0,5 6,4+0,6
Гематокрит, % 31,7+3,8 32,3+3,2 32,9+2,0 32,9+2,2
Ср. объем эритр., мкм3 54,4+1,7 55,2+4,6 52,4+1,5 52,2+3,4
Ретикулоциты, % 4,6+0,6 4,4+0,5 4,3+0,5 4,5+0,4
Тромбоциты, тыс. 459,8+86,0 462,4+95,1 453,0+67,3 470,8+34,8
Лейкоциты, тыс./мм3, в т.ч.: 21,6+2,6 17,8+4,0 20,1+3,5 18,1+2,5
Базофилы, % 0 0 0 0
Эозинофилы, % 2,0+1,4 1,8+1,8 1,8+1,8 2,0+1,4
Юные, % 0 0 0 0
Палочкоядерные, % 1,4+1,3 1,6+1,7 1,2+1,1 1,4+1,3
Сегментоядерные, % 20,8+3,3 22,0+2,4 22,0+3,2 22,8+3,8
Лимфоциты, % 70,6+3,7 69,2+3,6 69,4+4,4 68,4+4,1
Моноциты, % 5,2+1,3 5,4+0,9 5,6+1,1 5,4+0,9
1.4. Результаты анализа мочи.
По окончании периода введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата выявлено повышение рН мочи в группе самцов на дозе 9 мг/кг (табл. 21). Уровень изменившегося показателя не выходит за рамки физиологической нормы, дозовая зависимость отсутствует.
После периода отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата в группе самок на дозе 20,0 мг/кг отмечено понижение относительной плотности мочи в сравнении с контрольной группой животных. В группах самцов в этот же период наблюдаются статистически достоверные изменения в сравнении с контрольной группой: при дозе 3,0 мг/кг - повышение показателя рН, при дозе 9,0 мг/кг повышение относительной плотности мочи. Оба показателя не выходят за границы физиологической нормы и не имеют дозовой зависимости (табл. 22).
- 23 020169
Таблица 21
Показатели мочи крыс по окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Доза (мг/кг) Относительная плотность рН Количество животных с показателем, выходящим за пределы нормы
Лейкоциты клУмкл Нитриты мкмоль/л Белок г/л Глюкоза ммоль/л Кетоновые тела ммоль/л Уробилиноген мкмоль/л Билирубин мкмоль/л Эритроциты КЛ./МКЛ
Самцы
0 1,023+0,005 6,3+0,4 2 1 4 0 4 . 2 1 5
3,0 1,024+0,005 6,3+0,7 3 3 5 0 4 4 1 5
9,0 1,016+0,006 6,9+0,2* 4 1 3 1 2 0 0 5
20,0 1,023+0,004 6,3+0,7 5 1 4 0 2 2 0 5
Самки
0 1,019+0,006 6,6+0,2 3 2 2 0 0 0 0 4
3,0 1,020+0,003 6,6+0,2 3 1 1 0 1 1 0 4
9,0 1,017+0,007 6,8+0,2 2 3 3 0 0 1 1 4
20,0 1,016+0,008 6,4+0,5 2 1 1 0 1 0 0 5
* Статистически достоверно по ΐ-критерию Стьюдента.
Таблица 22
Показатели мочи крыс после отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
1.5. Результаты патоморфологического исследования.
При патолого-анатомическом вскрытии, проведенном после окончания периода внутримышечного введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата при внешнем осмотре и исследовании, не было установлено различий между крысами подопытных и контрольных групп: шерстяной покров был гладкий, блестящий, кожа эластичная, подвижная, подкожная клетчатка умеренно выражена, видимые слизистые оболочки бледные, чистые, без изъязвлений и посторонних наложений, патологические выделения из естественных отверстий тела отсутствовали. При вскрытии грудной и брюшной полостей отмечалось анатомически правильное расположение внутренних органов. Макроскопически различимых признаков патологии внутренних органов не установлено. При рассечении скелетных мышц заднебедренной группы (место введения) у животных, получавших фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат во всех испытанных дозах, отмечали коричневатую окраску мышечной ткани, фасций и жировых прослоек. У животных контрольной группы такой окраски указанных тканей не было обнаружено.
При анализе массовых коэффициентов внутренних органов животных после периода внутримышечного введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата не было установлено различий между крысами подопытных и контрольной групп (табл. 23).
- 24 020169
Таблица 23
Массовые коэффициенты внутренних органов крыс после периода внутримышечного введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
До за, мг/ кг Массовые коэффициенты органов, г/кг массы тела животного
серд це лег- кие печень селезенка поч- ки тимус семенники
Самцы
0 4,3± 0,4 8,9±1, 3 36,5± 3,3 6,1±1,6 7,1± 0,2 1,8±0, 2 11,1±1, 0
3,0 4,0± 0,7 8,3±1, 7 35,8± 1,8 6,0±0,7 7,1± 0,7 1,6±0, 4 10,4±1, 3
9,0 3,8± 0,6 8,3±1, 4 36,6± 4,8 6,3±0,7 7,2± 0,3 1,3±0, 5 9,7±1,1
20, 0 4,3± 0,3 8,6±0, 3 39,8± 4,4 5,8±1,8 7,6± 0,4 1,4±0, 4 11,1±0, 9
Самки
0 3,8± 0,5 9,3±1, 0 39,9± 2,1 б,3±1,8 7,3± 0,5 2,2±0, 6 •
3,0 3,9± 0,7 9,4±1, 0 37,9± 2,5 6,7±1,0 7,8± 0,5 1,9±0, 3 -
9,0 3,8± 0,6 9,9±0, 7 39,8± 2,9 6,6±0,8 7,8± 0,5 1,6±0, 5 -
20, 0 3,8± 0,6 10,1± 1,5 43,0± 4,1 6,б±1,3 8,б± 0,8 1,6±0, 7 -
При микроскопическом исследовании проводили сравнительную оценку гистопатологической картины органов и тканей животных, получавших фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат в максимальной дозе, и крыс контрольной группы. При анализе в обеих группах были выявлены отдельные патологические изменения, которые обнаруживали в основном в легких, печени и почках (табл. 24). Степень обнаруженных изменений незначительно варьировала внутри групп, но в основном соответствовала слабой либо умеренной. Учитывая отсутствие какой-либо альтернативной или пролиферативной реакции в участках обнаруженных изменений в органах, а также большое количество случаев острого полнокровия кровеносных сосудов в них, наиболее вероятной причиной их появления является индивидуальная реакция животных на общую анестезию и ингаляцию углекислого газа при эвтаназии. Основываясь на примерно одинаковой частоте встречаемости установленных патологических изменений в подопытной и контрольной группах, можно сделать вывод об отсутствии их индуцирования исследуемой субстанцией. В связи с этим указанные изменения рассматривались как фоновые.
В месте введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата - скелетной мышце - были обнаружены изменения как воспалительного характера (небольшие очаги кровоизлияний, очаги сдавленных и отечных мышечных волокон, инфильтрация лимфоидными клетками пространства между отдельными мышечными волокнами и пучками волокон), так и регенеративного (участки рыхлой или плотной соединительной ткани с вновь образованными сосудами). Данные изменения оказались присущи и контрольной группе крыс. Описанная картина характерна для многократной повторяющейся травмы в результате внутримышечных инъекций, в данном исследовании - независимо от введенного вещества.
- 25 020169
Таблица 24 Результаты микроскопического анализа морфологических изменений в органах и тканях крыс после 30 дней внутримышечного введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Вещество Растворитель фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат
Доза (мг/кг) 0 20
Пол Самцы Самки Самцы Самки
Количество животных в труппе 5 5 5 5
Количество выживших 5 5 5 5
Орган/ ткань Морфологические изменения Животные с изменениями
Ияд. № Кол- во Инд. № Колво Инд. № Кол- во Инд. № Кол- во
Легкое Утолщение межальвеолярных перегородок (тотальное) 11,12 2 2,5 2 - - - -
Утолщение межальвеолярных перегородок (очаги) 14,15 2 4 1 72,74 2 61,62 2
Очаги инфильтрации межальвеолярных перегородок лимфоидными клетками, макрофагами 11 - - 72 1 61,62 2
Сужение просвета бронхов 11,12,13 14,15 5 2,4,5 3 74 1 - -
Полнокровие кровеносных сосудов 12,13, 14,15 4 1 72,73, 74,75 4 62,64 65 3
Полнокровие альвеолярных капилляров 12,13,14 15 4 - - 74,75 2 61 1
Перисосудистая лимфоидная инфильтрация 11,13 2 2 1 71 1 63,64 65 3
ί Печень 1 . . 1 Полнокровие синусоидных капилляров 11,12,13 14,15 5 2,3,4,5 4 71,72, 73,74, 75 5 61,63 64,65 4
Полнокровие венозных сосудов 11,12,13 14,15 5 2,3,4,5 4 71,72, 73,74, 75 5 61,63 64,65 4
Лимфоидная инфильтрация портальных трактов - - - - - - - -
Почка Мелкие очаги межканальцевой лимфоидной инфильтрации 12 1 1,2 2 - 61 1
Полнокровие венозных сосудов 11,12,13 3 3,5 2 71,72, 73 3 65 1
При патолого-анатомическом вскрытии после периода отмены введения фуллерен-(трисаминокапроновая кислота) гидрата при внешнем осмотре и исследовании не было выявлено различий между крысами подопытных и контрольных групп. Коричневого окрашивания тканей в месте предыдущих инъекций фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата не обнаружено. При статистическом анализе массовых коэффициентов органов не было установлено значимых различий между подопытными и контрольными животными (табл. 25).
- 26 020169
Таблица 25
Массовые коэффициенты внутренних органов крыс после периода отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Доза, за, мг/кг Массовые коэффициенты органов, г/кг массы тела животного
серд це лег- кие пе- чень селе- зенка ПОЧ- КИ тимус семенники
Самцы
0 3,9± 0,4 7,5±1,9 38,5±3 ,8 4,8±0, 6 6,5±0 ,5 1,7± 0,3 9,5±1,0
3,0 4,1± 0,4 7,1±0,5 32,2±1 ,8 5,2±0, 7 6,5±0 ,4 1,2± 0,4 9,7±1,2
9,0 4,0± 0,6 7,0±0,5 38,6±4 ,0 5,3±1, 1 7,1±0 ,4 1,6± 0,5 9,8±1,0
20,0 3,3± 0,4 7,8±0, 6 37,6±1 ,4 5,1±0, 6 7,0±0 ,6 1,3± 0,5 10,5±1, 5
Самки
0 3,7± 0,4 8,7±1, 8 35,0±4 ,2 5,5±1, 6 6,7±0 ,7 1,7± 0,4 -
3,0 3,5± 0,7 8,7±0, 7 33,9±3 ,9 4,7±0, 5 7,2±0 ,5 1,7± 0,3 -
9,0 4,1± 0,3 8,6±0, 7 36,9±2 ,0 5,7±1, 4 8,0±1 ,1 1,4± 0,4 -
20,0 3,8± 0,9 8,1±0, 9 38,2±3 ,8 5,6±0, 4 6,8±0 ,2 1,3± 0,3 -
При микроскопическом исследовании гистологических препаратов органов обнаруженные изменения по характеру и степени выраженности в основном соответствовали описанным после курса введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата, а также примерно в одинаковой степени были присущи животным подопытных и контрольной групп (табл. 26). Поэтому и в данном случае был сделан вывод об отсутствии индуцирования выявленных изменений исследуемой субстанцией.
В месте введения исследуемого и контрольного веществ - скелетной мышце - установлены однотипные для подопытных и контрольных животных изменения: немногочисленные тонкие вытянутые участки полностью сформированной плотной волокнистой соединительной ткани, расположенные либо вдоль мышечных волокон, либо под острым углом к ним. Такая морфологическая картина свидетельствует об отсутствии различий в скорости и характере процесса заживления в местах инъекций растворителя и фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата.
Таким образом, в результате проведенного патолого-анатомического исследования морфологических признаков, связанных с воздействием или отменой фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата, не установлено.
Таблица 26
Результаты микроскопического анализа морфологических изменений в органах и тканях крыс после периода отмены введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата
Вещество растворитель фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат
Доза (мг/кг) 0 20
Пол Самцы Самки Самцы Самки
Количество животных в группе 5 5 5 5
Количество выживших 5 5 5 5
Орган/ ткан ь Морфологические изменения Животные с изменениями
Инд. № К ол во Инд. № К ол во Инд. № К ол во Инд. № Кол -во
легкое Утолщение межальвеолярных перегородок (тотальное) 17,18,20 3 - - 79 1 - -
Утолщение межальвеолярных перегородок (очаги) 19 1 9 Ϊ 76,77,78, 80 4 66 1
Полнокровие сосудов 16,18,19 3 6,7,8,9, 5 76,77,78 3 66,67 5
,68,6
- 27 020169
9,70
Полнокровие альвеолярных капилляров 18,19 2 7,8,9 3 - - 66,70 2
Сужение просвета бронхов 17,18,19, 20 4 - - 78,79,80 3 - -
Участки эмфизематозного расширения альвеол 17,20 2 - - - - - -
Перисосудистая лимфоидная инфильтрация - - 8 1 - - 69 1
ле- Полнокровие синусоидных капилляров 16,17,18, 19,20 5 6,7,8,9, 10 5 76,77,78, 79,80 5 66,67 ,68,6 9,70 5
чень Полнокровие венозных сосудов 16,17,18, 19,20 5 6,7,8,9, 10 5 76,77,78, 79,80 5 66,67 ,68,6 9,70 5
поч- ка Мелкие очаги межканальцевой лимфоидной инфильтрации 16,17,18, 19 4 7,9,10 3 76,77,79, 80 4 70 1
Заключение.
На протяжении всего периода введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата крысам и периода отмены введения субстанции не было отмечено признаков изменения клинического состояния животных. Введение фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата не сказывалось на поведении, состоянии шерстяного покрова, видимых слизистых оболочек и приросте массы тела подопытных животных.
Длительное в течение 1 месяца внутримышечное введение фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата крысам не оказывало влияния на показатели периферической крови. Отмена введения исследуемой субстанции также не вызывала изменений показателей крови.
По окончании введения фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата у самцов крыс показано достоверное в пределах физиологической нормы снижение уровня мочевины на максимальной испытанной дозе (20 мг/кг), а у самок крыс показано незначительное, но достоверное повышение активности аланинаминотрансферазы. Снижение концентрации креатинина на максимальной испытанной дозе показано по окончании периода отмены исследуемой субстанции у самцов и самок крыс.
При анализе результатов исследования мочи крыс после периода отмены введения фуллерен-(трисаминокапроновая кислота) гидрата в группе самок на дозе 20 мг/кг отмечено понижение относительной плотности мочи в сравнении с контрольной группой животных.
В результате проведенного патолого-анатомического исследования не установлено признаков повреждающего действия фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата на организм крыс после 1 месяца внутримышечного введения в дозах 20 мг/кг массы тела.
Таким образом, в результате проведенного исследования не установлено существенных признаков повреждающего действия фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата на организм крыс как после 30 дней внутримышечного введения в дозах до 20 мг/кг тела, так и по окончании периода отмены.
Пример 10. Исследование острой токсичности фуллерен-(трис-аминокапроновой кислоты) гидрат на лабораторных животных при однократном внутримышечном введении.
Эксперимент проводился в ФГУН Научно-исследовательском центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (ФГУН НИЦ ТБП ФМБА России), г. Серпухов.
В задачи исследования входило определение переносимых и токсических доз, а также изучение характера возможного повреждающего действия на организм лабораторных животных субстанции при однократном внутримышечном введении.
Опыты проводили на белых беспородных мышах и крысах линии Вистар из питомника ГУ НЦБМТ РАМН. Содержание животных соответствовало санитарным правилам, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Кормили животных ай 11Ы1ит экструдированным комбикормом ПК-120-1, приготовленным по ГОСТ Р 50258-92. Животные прошли карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение не менее 10 дней.
Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя.
Растворы тестируемого вещества в 20% водном растворе ДМСО для введения животным готовили в асептических условиях ех (строга. Растворы фасовали в соответствующие промаркированные флаконы и до введения хранили при температуре 2-6°С не более 2 ч.
Субстанцию вводили мышам и крысам внутримышечно в дозах 5, 50 и 500 мг/кг. Максимальные испытанные дозы лимитированы максимально допустимыми объемами внутримышечного введения для мышей и крыс. Животным контрольных групп вводили 20% водный раствор в таком же объеме, как и
- 28 020169 максимальные дозы субстанции.
Вводимые объемы корректировали с учетом индивидуальной массы тела животного.
В период наблюдения (в течение 14 дней после введения) оценивали общее состояние животных по их двигательной активности, потреблению корма и воды, состоянию шерсти и слизистых оболочек, массе тела.
После окончания периода наблюдения проводили патолого-анатомическое вскрытие мышей и крыс, получавших субстанцию в дозе 500 мг/кг и контрольное вещество (растворитель). Умерщвление животных производили ингаляцией углекислого газа. Патологоанатомическое исследование осуществляли в течение 1 ч после эвтаназии животных. Морфологическое состояние внутренних органов животных определяли визуально при вскрытии.
Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили методами вариационной статистики по критерию Стьюдента.
Результаты исследований.
На всех испытанных дозах клинические симптомы отравления животных отсутствовали. В период наблюдения гибели не было, общее состояние животных опытных и контрольных групп не различалось. Животные охотно поедали корм, равномерно прибавляли в весе; статистически достоверных различий среднегрупповых значений массы тела животных подопытных групп относительно контрольных групп не выявлено (табл. 27, 28).
Таблица 27
Масса тела мышей
Доза субстанции, мг/кг Масса тела животных, г (Μ ± 3ϋ)
0 день 7 день 14 день
самцы
0 (растворитель) 22,7±1,4 24,3±1,5 25,9±1,7
5 23,0±2,9 24,1±2,9 25,4±2,5
50 22,4±2,1 23,7±2,4 25,4±2,5
500 22,6±2,2 24,2±1,8 26,2±1,8
самки
0 (растворитель) 19,1±1,5 20,8±1,3 23,3±1,3
5 19,1±2,0 20,6±2,0 22,8±2,0
50 18,6±1,5 19,9±1,7 21,9±1,8
500 18,9±1,0 20,7±0,7 22,8±1,1
Установлено, что ЛД50 субстанции при внутримышечном введении для мышей и крыс обоего пола превышает максимальную испытанную дозу - 500 мг/кг.
Таблица 28
Масса тела крыс
Доза субстанции, Масса тела животных, г (Μ ± 8ϋ)
мг/кг 0 день 7 день 14 день
самцы
0 (растворитель) 187±21,4 232±30,5 283±33,5
5 188±12,5 228±18,1 276±17,8
50 190±14,3 228±17,0 279±18,3
500 189±14,1 207±19,3 258±24,1
самки
0 (растворитель) 162±15,3 185±17,4 212±20,6
5 163±15,5 183±15,О 206±17,0
50 165±17,5 177±17,5 201±15,8
500 160±8,1 169±8,0 198±1О,3
Патологоанатомическое вскрытие мышей и крыс проводили через 14 дней после однократного внутримышечного введения субстанции. Поскольку ни в одной из групп животных, независимо от введенной дозы вещества, за период наблюдения гибели не было, некропсии подвергали только мышей и
- 29 020169 крыс, получивших субстанцию в максимальной дозе 500 мг/кг, а также животных контрольных групп. Умерщвление животных производили ингаляцией углекислого газа.
При внешнем осмотре мышей и крыс в подопытных и контрольных группах отмечали общую картину: шерстяной покров был гладкий, блестящий; кожа эластичная, подвижная, подкожная клетчатка умеренно выражена, видимые слизистые оболочки бледные, без изъязвлений и посторонних наложений, патологические выделения из естественных отверстий тела отсутствовали.
При патолого-анатомическом вскрытии также не установлено различий между мышами и крысами всех подопытных и контрольных групп. Органы грудной и брюшной полостей имели анатомически правильное расположение и нормальную макроструктуру; каких-либо патологических изменений обнаружено не было. В месте введения субстанции - мышца бедра - признаков повреждения не обнаружено.
Таким образом, в результате проведенного патоморфологического исследования не установлено признаков повреждающего действия субстанции при однократном внутримышечном введении мышам и крысам в дозах до 500 мг/кг.
Заключение.
Установлено, что все испытанные дозы субстанции не вызывали интоксикации и гибели подопытных животных. Значения ЛД50 фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрата для мышей и крыс превышают максимальную испытанную дозу - 500 мг/кг и, таким образом, превышают максимальную разовую терапевтическую для человека дозу (2,9 мг/кг) более чем в 170 раз. Различий видовой и половой чувствительности к субстанции в дозах до 170-кратных эквитерапевтических не установлено. Субстанция не обладает местным раздражающим действием при однократном внутримышечном введении.
Таким образом, фуллерен-(трис-аминокапроновая кислота) гидрат имеет высокий терапевтический индекс и не может вызывать острые отравления при случайной передозировке.

Claims (5)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Гидратированные Ν-фуллерен-аминокислоты общей формулы
    С60(Н)3 {ΝΗ(0Η2)ηΩΟΟΗ}3·χΗ2Ο? где С60 - фуллерен;
    п=5-7;
    х=8-10.
  2. 2. Способ получения соединения по п.1, характеризующийся тем, что фуллерен подвергают взаимодействию с 15-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот общей формулы ЫН2(СН2)пСООН, где п=5-7, в среде ароматического растворителя при медленном добавлении к полученной суспензии межфазного катализатора, при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60-80°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, представляющего собой калиевые соли полученных фуллереновых производных аминокислот, с его последующим выделением, растворением в воде для получения 0,8 М водного раствора, который обрабатывают 0,1н. раствором органической или минеральной кислоты с последующим центрифугированием, промывкой и высушиванием осадка.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что безводные калиевые соли аминокислот используют в мелкодисперсном состоянии, а выделение твердого осадка калиевых солей фуллереновых производных аминокислот осуществляют фильтрованием, промывкой этиловым спиртом и высушиванием.
  4. 4. Способ по любому из пп.2, 3, отличающийся тем, что в качестве межфазного катализатора используют метиловый эфир полиэтиленгликоля молекулярной массой 400 или 500.
  5. 5. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью против вируса герпеса, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью, содержащая в качестве активного вещества соединение по п.1 в эффективном количестве.
    Евразийская патентная организация, ЕАПВ
    Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA201201455A 2011-02-01 2012-02-06 Гидратированные n-фуллерен-аминокислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе EA020169B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011103541/04A RU2458046C1 (ru) 2011-02-01 2011-02-01 Гидратированные n-фуллерен-аминокислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе
PCT/RU2012/000063 WO2012105873A1 (ru) 2011-02-01 2012-02-06 Гидратированные ν-фуллерен-аминокислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201201455A1 EA201201455A1 (ru) 2013-03-29
EA020169B1 true EA020169B1 (ru) 2014-09-30

Family

ID=46602957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201201455A EA020169B1 (ru) 2011-02-01 2012-02-06 Гидратированные n-фуллерен-аминокислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9096492B2 (ru)
EP (1) EP2679574B1 (ru)
AP (1) AP4032A (ru)
AU (1) AU2012212708B2 (ru)
EA (1) EA020169B1 (ru)
IL (1) IL226737A (ru)
MX (1) MX347498B (ru)
RU (1) RU2458046C1 (ru)
UA (1) UA110033C2 (ru)
WO (1) WO2012105873A1 (ru)
ZA (1) ZA201303448B (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104971356A (zh) * 2014-04-09 2015-10-14 中国科学院化学研究所 一种生物医用材料及其制备方法与在药物运输中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2236852C1 (ru) * 2003-06-23 2004-09-27 Закрытое акционерное общество "ДЕСКО" Средство для ингибирования репродукции оболоченных вирусов, способ его получения, фармацевтическая композиция и способ ингибирования вирусных инфекций
RU2316320C1 (ru) * 2006-06-19 2008-02-10 Лев Давидович Раснецов Противовирусное средство

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5811460A (en) 1994-01-24 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Water soluble fullerenes with antiviral activity
RU2124022C1 (ru) 1997-04-10 1998-12-27 Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Фуллереновое производное гликопептида, обладающее адъювантной активностью
US20030027870A1 (en) * 2001-05-15 2003-02-06 Wilson Stephen R. Fullerene derivatives that modulate nitric oxide synthase and clamodulin activity
RU2196602C1 (ru) * 2002-01-22 2003-01-20 Закрытое акционерное общество "ДЕСКО" Средство для ингибирования вич и цмв-инфекций и способ их ингибирования

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2236852C1 (ru) * 2003-06-23 2004-09-27 Закрытое акционерное общество "ДЕСКО" Средство для ингибирования репродукции оболоченных вирусов, способ его получения, фармацевтическая композиция и способ ингибирования вирусных инфекций
RU2316320C1 (ru) * 2006-06-19 2008-02-10 Лев Давидович Раснецов Противовирусное средство

Also Published As

Publication number Publication date
EP2679574B1 (en) 2018-05-09
AP2013007073A0 (en) 2013-08-31
US20130165692A1 (en) 2013-06-27
UA110033C2 (uk) 2015-11-10
AP4032A (en) 2017-02-11
RU2458046C1 (ru) 2012-08-10
AU2012212708A1 (en) 2013-03-14
MX347498B (es) 2017-04-28
EP2679574A1 (en) 2014-01-01
MX2013008867A (es) 2014-03-05
EP2679574A4 (en) 2015-08-12
US9096492B2 (en) 2015-08-04
EA201201455A1 (ru) 2013-03-29
WO2012105873A1 (ru) 2012-08-09
IL226737A (en) 2015-02-26
ZA201303448B (en) 2014-01-29
AU2012212708B2 (en) 2014-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Moghaddam et al. Antioxidant, antihemolytic and nephroprotective activity of aqueous extract of Diospyros lotus seeds
JP2023500919A (ja) 関節炎の処置
CA3172535A1 (en) Cyclophilin inhibitors and uses thereof
CN108853106A (zh) 亚胺吩嗪类化合物作为狂犬病病毒抑制剂的用途
CN105237628A (zh) 一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽
EP3578566B1 (en) Biocidal peptide and preparation based thereon
CA2810515C (en) Hydrated n-fullerene amino acids, method for producing the latter, and pharmaceutical compositions on the basis thereof
EA020169B1 (ru) Гидратированные n-фуллерен-аминокислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе
TWI472519B (zh) 含正－亞丁基苯酞之醫藥組成物用於治療肝損傷及改善肝功能
CN114748466B (zh) Napyradiomycin类化合物在制备猪伪狂犬病病毒抑制剂中的应用
RU2458914C1 (ru) Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена c60, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе
RU2277908C1 (ru) Водорастворимое средство, обладающее противовирусной активностью, на основе соединения серебра с цистином и способ его получения
CN112843073A (zh) 瑞德西韦（Remdesivir）在制备抗牛副流感病毒3型药物中的应用
US3852454A (en) Treatment of rheumatoid arthritis
CN109550041B (zh) 奥利万星磷酸盐在制备防治牛传染性鼻气管炎药物中的应用
RU2798118C1 (ru) Способ получения инъекционной фармацевтической композиции для животных на основе метилурацила (диоксометилтетрагидропиримидина)
CN109646435B (zh) 厄他培南钠在制备防治牛传染性鼻气管炎药物中的应用
CN113318115B (zh) 美他环素在制备防治牛副流感病毒3型病毒感染药物中的应用
RU2118163C1 (ru) Лекарственное средство для лечения вирусных заболеваний
Islam et al. In vivo evaluation of analgesic activity of methanolic extract of Laportea interrupea (L.) leaves
OA16498A (en) Hydrated N-fullerene amino acids, method for producing the latter, and pharmaceutical compositions on the basis thereof.
RU2578473C2 (ru) Средство, обладающее противовоспалительной и антиоксидантной активностью
SU1542005A1 (ru) 5-Нитрофурфурилиденгидразид N-аллилантраниловой кислоты, про вл ющий противовоспалительную и противостафилококковую активность
RU2536824C1 (ru) Производные 5-амино-3-(2-аминопропил)-[1,2,4]тиадиазола, обладающие противораковой активностью
Jose et al. Evaluation of a Novel Thiadiazole Derivative for Anti Inflammatory Activity